Изучение лактогенных свойств гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в питательных средах и in vivo

Пенькова, Надежда Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение лактогенных свойств гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в питательных средах и in vivo
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение лактогенных свойств гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в питательных средах и in vivo"

004618946

На правах рукописи.

Пенькова Надежда Ивановна

ИЗУЧЕНИЕ ЛАКТОГЕННЫХ СВОЙСТВ ГИДРОЛИЗАТОВ ИЗ НЕТРАДИЦИОННОГО СЫРЬЯ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ И IN VIVO

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 ДЕК 2010

Ставрополь - 2010

004618946

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ставропольский государственный университет» и Южном научном центре Российской академии наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Тимченко Людмила Дмитриевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, доцент

Будыка Дмитрий Александрович;

кандидат биологических наук, доцент Виноградская Светлана Ефимовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ставропольская государственная

медицинская академия»

Защита диссертации состоится ^ а. ^ ^_2011 г.

в /Ц. ¿?£> часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автор еферат разослан / г иг _2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ржепаковский И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Лактобактерии относятся к большой группе микроорганизмов, широко распространенных в природе, способных расти в различных условиях окружающей среды (Банникова JI.A., 1987; Коршунов В.М., 2000; Batisal S., 2001; Gopal P., 2001; Ogawa M., 2001). Они являются важнейшими компонентами микробных сообществ различных биотопов окружающей среды и живого организма. Молочнокислые бактерии встречаются в почве, сосредотачивать вокруг корневой системы растений (Квасников Е.И., Сумневич М.Г., 1953; Богданов В.М., 1959). Их высевают из молока, молочных продуктов, кефирныхгрибков, муки, цветов, растений, ягод, фруктов и овощей (Богданов В.М., Пятницьша И.Н., 1959; Jly-ковникова Л.А., 1965; Банникова Л.А., 1970; Талачкене Р.И., 1970; ЧужоваЗ.П., 1970; Сагындыкова С.З., 1990).

Исследователи солидарны в мнении о том, что именно микробы молочнокислого брожения играют ведущую роль в обеспечении устойчивого микробиоценоза и, связанных с ним, многочисленных жизненно важных функций в организме человека, животных, птиц и даже насекомых (Банников;! Л.А., 1987; Коршунов В.М., 2000; Бухарина О.В., 2006; Хавкин А.И., 2006).

Нарушение качественного и количественного состава лактобактерии, вплоть до их полного исчезновения, является одним из общих признаков дисбактерио-за живой системы, независимо от его причин. Доказано, что недостаток лак-тофлоры является причиной снижения колонизационной резистентности кишечника другими микроорганизмами, в частности энтеро-бактериями, бифидо-бактериями и другими (Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г., 1979; Красноголовец В.Н., 1979; Пинегин Б.В., 1984; Барзашка-Попова С.Н., 1990; Гребенев А.Л., Мягкова Л.П., 1994; Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А., 2000; Петеико А.И., Ярошенко В .А., Кощаев А.Г., 2003; Овод A.C., 2005).

В связи с высокой метаболической активностью лактобактерии, их антагонистическими и антибиотическими свойствами, а также высокой адгезивностью по отношению к тканям организма, эти микроорганизмы все чаще рассматривают, как основной компонент лекарственных препаратов, БАД и пищевых продуктов, которые обладают пробиотическим, иммуномодулирующим и пре-биотическим действием (Конькова Н.К., 2002; Чистохина Л.П., 2004; Молохова Е.И. и др., 2006; Хавкин А.И., 2006).

Разработка таких препаратов и продуктов сопряжена, прежде всего, с выделением из различных биологических объектов и окружающей среды., идентификацией и поддержанием высокоактивных и стабильных культур молочнокислых бактерий, а также с созданием оптимальных условий для наращивания бакмассы в достаточном количестве. Успех этих манипуляций связан с процессом культивирования, определяющимся, прежде всего, качеством питательных сред. Лактобактерии являются ауксотрофными организмами и поэтому чрезвычайно требовательны к искусственным питательным средам (Стенаненко П.П., 2005). Несмотря на то, что для лабораторного и промышленного культивирования лактобактерий в микробиологии известны и широко используется целый ряд питательных сред на основе молока, дрожжевого гидролизата и печеночного экстракта, растительных объектов и др. (Аристовская Т.В.и др., 1962; Нетру-

сов А.И. и др., 2005; Дзержинская И .С., 2008), появились мнения о снижении их свойств, связанных с ухудшением качества сырьевых субстанций вследствие экологических, эпизоотических и антропогенных проблем (Панова Н.В., 2006; Waguespack М., 1986; Corrigan P.J., Seneviratna P., 1989). К недостаткам известных питательных сред можно отнести и краткий срок хранения основы, изготовленной из молочного сырья, (Конькова Н.К., 2002), а также технологические трудности и дополнительные затраты при изготовлении некоторых компонентов для таких сред, как MRS, среда с Твин-80 и другие (Банникова JI.A., 1975).

Вышеизложенное обусловливает необходимость изыскания новых доступных и экономически оправданных компонентов, использование которых позволит усовершенствовать имеющиеся и разработать новые эффективные питательные среды для молочнокислых бактерий, а также обусловит перспективы получения на их основе пребиотиков с лактогенным эффектом.

В связи с этим тематика исследований по изучению эффективности использования гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в питательных средах для культивирования лактобактерий представляется актуальной и своевременной.

Цель исследования: разработка новых гидролизатов на основе нетрадиционного сырья природного происхождения и изучение их лактогенных свойств.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Подобрать нетрадиционное сырье природного происхождения с учетом питательных потребностей лактобактерий.

2. Отработать технологию получения гидролизатов из используемого нетрадиционного сырья природного происхождения и изучить их физико-химические свойства.

3. Испытать новые гидролизаты в качестве стимулирующих компонентов питательных сред при культивировании лактобактерий.

4. Изучить влияние полученных гидролизатов на микрофлору кишечника, в том числе лавлхзгенный эффект, на белых крысах линии «Вистар».

5. Дать сравнительную оценку экономической эффективности разработанных питательных сред для культивирования лактобактерий.

Научная новизна исследования. Впервые теоретически и экспериментально обоснован выбор нетрадиционного сырья для получения гидролизатов с целью их использования в качестве стимулирующих добавок к питательным средам для культивирования лактобактерий.

Отработана модификация технологии получения новых гидролизатов из тибетского молочного гриба и каллизии душистой, заключающаяся в поэтапном добавлении набора ферментов, что позволило добиться высоких показателей качества (аминный азот и сухой остаток) и обусловило преимущества ферментативных гидролизатов над кислотными.

Впервые изучен химический состав трех ферментативных гидролизатов (ФГ) из тибетского молочного гриба (ТМГ), каллизии душистой (КД) и молок лососевых рыб (МНР) и доказано, что в них, в различных качественных и количественных отношениях, присутствуют многочисленные биологически активные

вещества (белки, углеводы, органические кислоты, микро- и макроэл ементы), необходимые для роста и развития лактобактерий.

Впервые на примере Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, Lactobacillus jermentum 90T-C4 и Lactobacillus acidophilus ЕР 317/402, при их культивировании на модификациях МРС-среды и агара Хотгингера, доказана возможность использования ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб в качестве стимуляторов роста и предложена рецептура питательных сред для лактобактерий.

Разработана новая питательная среда для культивирования лактобактерий на основе ферментативного гидролизата из капусты (ФГК) с использованием ферментативного гидролизата из колоний и молочного настоя тибетского молочного гриба (ФГКТМГМН) в качестве стимулирующего компонента.

Доказана экономическая эффективность применения новых питательных сред по сравнению с МРС-средой и агаром Хоттингера.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена положительными решениями о выдаче патентов на изобретения по заявкам № 2009140:531 «Питательная среда для культивирования лактобактерий» и № 2009149506 «Способ получения ферментативного гидролизата из капусты и питательная среда для культивирования лактобактерий на его основе». Результаты испытаний положены в основу патентного поиска по заявке № 2009120982 «Способ получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба и питательная среда на его основе для культивирования лактобактерий».

Впервые доказано положительное воздействие ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб на кишечную микрофлору экспериментальных животных, что выражается в увеличение числа лакто- и бифидобактерий и ингибирование роста условно-патогенных микроорганизмов. Определены перспективы их применения в качестве пребиотиков с характерным лактогенным эффектом.

Подтверждено непосредственное влияние всех гидролизатов на биологические свойства лактобактерий, обеспечивающие их антагонистический эффект, активность кислотообразования, устойчивость к поваренной соли и феноло-устойчивость.

Доказано, что максимальный лактогенный и пребиотический эффект наблюдается при использовании ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Полученные результаты могут быть использованы для наращивания бакмассы лаетобакте-рий на предприятиях микробиологической промышленности и в лабораторной деятельности микробиолога. По итогам испытания ферментативных гидролизатов из ТМГ, КД и КТМГМН разработана и утверждена на экспериментально-производственном уровне техническая документация, а также получен акт внедрения ФГТМГ и ФГКД в производство пробиотиков на предприятии «Микромир» совместно с ФГУ «Ставропольская межобластная ветеринарная лаборатория» на базе ОАО «Завод Лактобиотиков» г. Ставрополя.

Научные разработки используются в работе Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и научно-образовательного центра «Технологии живых систем, биологические материалы» Ставропольского государственного университета. Материалы диссертационной работы используются в научной деятельности и учебном процессе Ставропольского государственного университета, Ставропольского филиала Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, Ставропольской государственной медицинской академии, Северо-Кавказского государственного технического университета (Ставрополь) в качестве дополнений к учебным материалам по дисциплинам «Микробиология», «Биотехнология», «Частная микробиология», «Санитарная микробиология», «Биотехнология, промышленное и хозяйственное использование микроорганизмов».

Результаты изучения влияния ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб на микрофлору кишечника крыс могут быть использованы при разработке биологически активных добавок с пребиотическим эффектом к пище и корму для животных.

Апробации работы. Основные положения диссертационной работы доложены на четвертой и пятой ежегодной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2009; 2010 гг.); на 53-й, 54-й и 55-й научных конференциях «Университетская наука — региону» (Ставрополь, 2008; 2009; 2010 гг.); на X Международной научной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа» (Грозный, 2008 г.). Ферментативные гидролизаты из тибетского молочного гриба, каллизии душистой, а также новая капустная среда и биологически активная кормовая добавка ФГТМГ представлен на VII и VIII Международных специализированных выставках- «МИР БИОТЕХНОЛОГИИ 2009, 2010» (Москва) и на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2010 г.), где награждены 2 дипломами и 2 золотыми медалями.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Тибетский молочный гриб, каллизия душистая и молоки лососевых рыб являются альтернативным нетрадиционным сырьем для получения гидролизатов с физико-химическими свойствами, отвечающими питательным потребностям лактобактерий.

2. Экспериментально обоснована и разработана технология получения ферментативных гидролизатов из ТМГ, КД, которая обеспечивает высокие качественные показатели и биологическую полноценность за счет содержания аминокислот и небелковых субстанций сухого остатка.

3. Ферментативные гидролизаты из ТМГ, КД и МЛР целесообразно и экономически эффективно использовать в качестве стимулирующих компонентов новых и адаптированных питательных сред для культивирования лактобактерий.

4. Все полученные гидролизаты из нетрадиционного природного сырья оказывают в разной степени выраженное пребиотическое действие, в том числе за счет лактогенного эффекта.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 12 печатных работ, в том числе три из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензи-

руемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 31 рисунком, 18 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, главы результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и приложений. Список использованной литературы содержит 233 источника, в том числе 48 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И1МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в течение 2007-2010 гг. на кафедре общей биологии Ставропольского государственного университета (СГУ) и базовой кафедре иммунологии и микробиологии Южного научного центра РАН. Экспериментальная работа осуществлялась в три основных этапа.

На первом этапе проводили подбор нетрадиционного сырья природного происхождения, с учетом доступности и питательных потребностей лактобактерий, а также отработку технологии его гидролиза и оценку качества полученных гидролизатов. Сырьевыми объектами являлись природный симбионт (Medusomyces gysevii) - тибетский молочный гриб, декоративное растение -каллизия душистая (Callisia fragrans), культивируемые в условиях лаборатории, и молоки лососевых рыб (ТУ 9267-037-33620410-04).

При изучении гистологических характеристик ТМГ воспользовались методикой Сулейманова С. М. (2000), а также проводили общую структурную оценку ткани гриба (Автандилов Г.Г., 1990). Для идентификации микроорганизмов - составных компонентов симбионта, проводили микробиологические исследования путем высева молочного настоя на соответствующие питательные среда. Исследования биохимических свойств выделенных микроорганизмов проводили на базе СТАВНИПЧИ, а их идентификацию осуществляли с помощью определителя бактерий Берджи (Дж. Хоулт,1997) и определителя грибов (Д. Сг.ттон, 2001).

Гидролиз сырья проводили двумя классическими методами Козлова Ю.А. (1950): кислотным (КГ) и ферментативным (ФГ). Для ТМГ и КД использовали собственную модификацию ферментативного метода. Ферментативные гидро-лизаты из ТМГ, КД и МНР исследовали на содержание аминного азота в соответствии с ФС 42-3874-99; сухого остатка (Методические указания НУК 4.2. 2316-08, 2008); микро- и макроэлементов методом атомно-абсорбционной спек-трофотометрии на приборе AAC Perkin Elmer 2280 (США) (Ягодин Б А. и др., 1987); свободных аминокислот, углеводов и органических кислот мето дом тонкослойной хроматографии (Крешков А.П., 1970; Шаршунова М. и др., 1980; ТурковаЯ., 1982).

На втором этапе работы изучали влияние новых гидролизатов, используемых в качестве стимуляторов роста лактобактерий, в концентрациях 0,5; 1,0; 1,5; 2,0%, при добавлении к питательным средам. Для тестирования биологических свойств гидролизатов использовали 3 музейных тест-пггамма микроорганизмов, полученных из ГИСК имени Л.А. Тарасевича: Lbc. plantarum 8Р-АЗ, Lbc. fer-

mentum 90T-C4 и Lbc. acidophilus ЕР 317/402. Культуры лактобактерий выращивали на плотной МРС-среде с заменой дрожжевого автолизата на новые ферментативные гидролизаты из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб. Контролем служила классическая МРС-среда с дрожжевым автолвдатом. Также их выращивали на агаре Хоттингера, с добавлением ферментативного гидролизата из каллизии душистой. Контроль опыта осуществляли аналогичным высевом взвеси тест — штаммов на ту же среду, но без добавления гидролизата из каллизии душистой.

Культурально-морфологические свойства, выращенных микроорганизмов учитывали визуально, путем подсчета и измерения диаметра выросших колоний, а также при микроскопии мазков, приготовленных из суточных кулмур, выросших на плотных питательных средах и окрашенных по Граму. Биохимические свойства определяли по ферментативному расщеплению моносахаридов, полисахаридов, многоатомных спиртов с образованием альдегидов, органических кислот и газообразных продуктов (СОг, СН4, Н2) (Степаненко П.П., 2005). Фсж^)афирование лактобактерий в мазках, окрашенных по Граму, осуществляли при помощи комплекса визуализации изображения на базе микроскопа «Микмед-2» и цифровой фотокамеры «01ympus-5060».

На третьем этапе работы изучали влияние гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб на микробиоценоз кишечника белых лабораторных крыс линии Вистар. В процессе исследования формировали 3 рабочие группы животных (п=150), массой 180-220 г, которым выпаивали ферментативные гидролизаты из ТМГ (1 группа), КД (2 группа) и MJIP (3 группа), в течение 10 дней в дозе 1 мл на крысу. У крыс каждой группы проводили микробиологические исследования фекалий после естественной дефекации, по общепринятой методике Кузько Н.В. (1996), полученных, до начала выпаивания им гидролизатов (контроль) и после него. Полученные результаты указывали для всех микроорганизмов при определении границ нормативных показателей в КОЕ/г.

Влияние гидролизатов на биологические свойства лактобактерий, выделенных их фекалий крыс, оценивали путем изучения активности кислотообразова-ния титрометрическим методом (Лянная A.M., 1975); устойчивости молочнокислых бактерий к поваренной соли и к фенолу (Банникова Л.А., 1975); антагонистической активности - с помощью метода отсроченного антагонизма в агаре по P. Muriana и Т. Klaenhammer (1987).

Результаты экспериментов подвергали вариационно-статистической обработке с помощью программы Primer of Biostatistics (Version 4.03).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика сырья и отработка технологии гидролиза

ТМГ является сложной биологической субстанцией - микробным симбионтом, состоящим из нескольких бактериальных компонентов: представители молочнокислых палочек (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus divergens), уксуснокислые бактерии (Acetobacter pasteu-rianus, Gluconobacter oxydans), а также два вида дрожжей (Saccharomyces sere-

visiae, Candida tibetica). В этой ассоциации лактобактерии преобладают над другими микроорганизмами (Блинов Н.П., Ларина О.Г., 1999).

На морфологическом уровне установлено, что тело ТМГ представлено базо-фильной матрицей с гетерогенными участками разной плотности. В толще матрицы имеются пустоты. Темные участки сформированы, преимущественно, из массивных скоплений микроорганизмов, среди которых четко различаются три основных вида: первый - палочки различной длины, собранные в цепочки; второй - мелкие кокки, иногда собранные попарно или цепочкой; микроорганизмы третьего вида — крупные, дрожжеподобные клетки. Количество всех микроорганизмов может варьироваться в зависимости от условий культивирования симбионта. Светлые участки матрицы — бесструктурная масса, похожая на слизь, метаболического происхождения. Очевидно, матрица, вырабатываемая всеми сочленами ассоциации, обладает мощными факторами роста и обеспечивает развитие и устойчивость каждого отдельного вида микроорганизмов.

Микробиологическими методами в ТМГ нами выделены и идентифицированы следующие виды микроорганизмов: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Acetobacter pasteurianus, Saccharomyces serevisiae. Палочковидные формы бактерий составляют подавляющее большинство и находятся в любом участке среза, а дрожжевидные клетки сосредоточены преимущественно по периферии.

Содружество всех микроорганизмов этого симбионта обеспечивает высокую их устойчивость, даже в неадекватных условиях культивирования. Так, в промежуточных экспериментах подтверждено, что сквашивание молока ТМГ происходит даже в условиях холодильника, накопление в настое лактобактерий, входящих в состав этого естественного симбионта, остается достаточно высоким, а культуральные и морфологические свойства их не изменяются.

В молочном настое ТМГ обнаружены: витамины (Вь В2, В12, РР, El5, A, D), лизин солянокислый, пролин, валин, треонин, фенилаланин, микро- и макроэлементы (кальций, железо, йод, цинк), фолиевая кислота, ферменты, кислоты, белки и полисахариды (Буторина О., 2006; Афанасьева О.В., 2007). Таким образом, состав тела и молочного настоя ТМГ качественно соответствует физиологическим потребностям молочнокислых бактерий, что обусловливает целесообразность использования его в качестве сырья для гидролиза.

Как известно, растительное сырье редко используется при приготовлении питательных сред для культивирования молочнокислых бактерий, в то время как в них можно обнаружить такие питательные вещества, как флавоноиды, фито-гормоны, дубильные вещества, гликозиды, алкалоиды, а также уникальные вещества органического происхождения — биогенные стимуляторы (Кородецкий А., 2007). Важнейшим качеством питательных сред, приготовленных из растительных субстратов, является их экономические преимущества. Особый интерес, на наш взгляд, представляет каллизия душистая (лат. CalHsia fragrans. По данным ряда авторов (Нестерова Д.В., 2004; Кедрова М., 2006; Кородецкий А., 2007) эта растительная субстанция имеет уникательный состав. Так, в каллизии обнаружены: каратиноиды, аскорбиновая кислота, флавоноиды (кверцетин, кемпферол), пектины, эфирные масла, дубильные вещества, катехины, витамины (С, В2, В15, РР), микро- и макроэлементы (калий, кальций, железо, марганец,

ванадий, никель, медь, цинк, галлий, бром, стронций, рубидий, цирконий, свинец, ypaii, торий). Некоторые из этих веществ содержатся только в растительном сырье (Максютина Н.П., 1987; Корзунова А.Н., 2004; Шульпикова Ю.О,, 2004; Неумывакин И.П., 2005). Таким образом каплизия душистая является одним из немногих комнатных растений, позволяющих рассчитывать на универсальность продукта ее гидролиза, за счет содержания многочисленных уникальных элементов, необходимых для роста и развития лактобактерий.

Важной составной частью молок лососевых рыб являются белки - высокомолекулярные азотистые органические вещества, расщепляющиеся в процессе гидролиза на низкомолекулярные вещества, которые необходимы для роста молочнокислых бактерий. На поздних стадиях сперматогенеза у лососевых и родственных им рыб в ядрах клеток семенников появляется протамины - спермос-пецифические белки с низким молекулярным весом и с большим содержанием аргинина, который является фактором роста лактобактерий. (Лавровская Н.Ф., 1973). Молоки лососевых рыб содержат до 16,3% белка, в большом количестве фосфор, натрий, магний, калий, железо. Также они богаты витаминами Вь В2, В|2, РР, С, в том числе и жирорастворимыми, содержат жирные кислоты омега-3 (Крупицын В.В., 2004).

Для каждого вида сырьевого субстрата подбирали свой метод гидролиза. Технологический процесс приготовления гидролизатов состоял из трех стадий: подготовительной, основной и заключительной.

На подготовительной стадии проводили выращивание тибетского молочного гриба и коллизии душистой в экологически чистых условиях лаборатории.

Отбор молок лососевых рыб осуществлялся из снулой рыбы, с учетом их массы и целостности, с последующей их заморозкой. Условия низкой температуры обеспечивают повышение биологической активности ткани за счет концентрации биогенных стимуляторов, накопление которых происходит с момента извлечения рыбы из воды до непосредственной заморозки.

Основной стадией является отработка технологии приготовления гидролизатов из тибетского молочного гриба и каллизии душистой.

Измерения показателя аминного азота в процессе гидролиза ТМГ и КД классическим методом (только с поджелудочной железой), проведенные в первой серии экспериметов, свидетельствовали о том, что на 3, 6 и 9 сутки увеличение данного показателя нестабильно или вообще отсутствует. Поэтому ферментативный гидролиз в дальнейшем проводили в собственной модификации, заключающейся в поэтапном добавлении поджелудочной железы КРС и панкреатина: в первые сутки использовали поджелудочную железу крупного рогатого скота (КРС) (10%), к концу вторых и пятых - панкреатин (25 ЕД на 200 мл), а к концу восьмых - поджелудочную железу КРС (2,5%).

Результаты ежедневного измерения аминного азота в процессе ферментативного гидролиза ТМГ (рис. 1) и КД (рис. 2), свидетельствуют о продолжающемся процессе гидролиза до 12 суток, что позволило получить гидролизаты с высокими показателями качества.

С учетом вышеизложенных результатов о положительных свойствах гидро-лизата на основе колоний ТМГ и имеющихся литературных сведений о богатом

химическом составе молочного настоя этого симбионта (Буторнна О., 2006; Афанасьева О.В., 2007), а также об успешном использовании гидролизованного молока в питательных средах (Аристовская Т.В., 1962; Нетрусов А.И., 2005), мы сочли возможным приготовить еще один вариант гидролизата на основе объединения этих двух субстанций. Это позволило существенно снизить его себестоимость. Использована методика приготовления ферметатавного гидролизата с заменой воды на молочный настой ТМГ. Полученный гидролизат имеет показатель аминного азота 512,4 мг%, а показатель сухого остатка 7,25%.

Сутки

Рис. 1. Динамика аминного азота в процессе ферментативного гидролиза ТМГ.

Сутки

Рис.2. Динамика аминного азота в процессе ферментативного гидролиза К Д.

Гидролизат на основе комплекса «колонии ТМГ+молочный настой» использован нами при моделировании нового варианта питательной среды для культивирования лактобактерий на основе растительного сырья (капусты).

Основой для получения ферментативного гидролизата из молок лососевых рыб явились рекомендации Тимченко Л.Д., Ткаченко И Н., Ржепаковского И.В.и Ва-

кулина В.Н., изложенные в патенте № 2352134 «Способ получения гидролизата из молок лососевых рыб» (2009).

Физико-химические показатели, отражающие как уровень глубины расщепления белка, так и степень сохранности других многочисленных составных компонентов в гидролизатах представлены в таблице 1.

Таблица 1

Физико-химические показатели гидролизатов из нетрадиционного

сырья природного происхождения

Наименование гидролизата Кол-во серий Цвет гидролизата Аминный азот, % Абсолютный показатель аминного азота, мг/% Сухой остаток, %

ФГТМГ 10 темно-коричневый 0,4984±0,0008 498,4±0,8 8,515±0,109

КГТМГ 10 светло-коричневый 0,3202±0,0042 320,2±4,2 3,365±0,081

ФГКД 10 желтый 0,0888±0,0001 88,8±0,1 4,510±0,195

КГКД 10 бледно-розовый 0,00400±0,0015 40,0±1,5 1,316±0,063

ФГМЛР 10 оранжевый 0,2406±0,0002 240,6±0,2 3,160±0,153

При этом все показатели ФГТМГ достоверно выше(Р<0,001), чем у других гидролизатов. В КГКД показатели как аминного азота, так и сухого остатка самые низкие, поэтому мы отказались от его дальнейшей экспериментальной апробации. Несмотря на достаточно высокие показатели аминного азота и сухого остатка в, КГТМГ, в дальнейших экспериментах его также не использовали. Это связано с высоким уровнем его кислотности, требующим доведения рН до оптимального уровня путем добавления значительного количества подщелачивающих растворов, что приводит к существенному разбавлению и снижению качества гидролизатов. В связи с вышеизложенным дальнейшим исследования мы подвергли только ФГТМГ, ФГКД и ФГМЛР.

Общее количество микро- и макроэлементов, было наибольшим в ФГКД. Цинк, железо, калий и кальций содержали все гидролизаты. Медь, никель, хром и марганец были обнаружены только в гидролизате из каллизии душистой. Наибольшие показатели количества цинка, железа, калия и кальция были отмечены в ФГКД. Натрий и магний были обнаружены только в гидролизате из молок лососевых рыб. В ФГТМГ отмечалось наличие йода. Таким образом, превосходящим по количеству цинка, железа, калия и кальция следует отметить ФГКД а наименьшее количество этих элементов было в ФГМЛР.

По результатам качественного исследования в этих же пробах установлено, что в ФГТМГ находятся лактоза, сахароза, янтарная кислота, метионин, БЬ-валин, ОЬ-треонин; в ФГКД — глюкоза, аскорбиновая и янтарная кислоты, триптофан, цистин; в ФГМЛР - глюкоза, лактоза, аскорбиновая и щавелевая кислоты, аспарагиновая кислота, БЬ-валин, БЬ-треонин, триптофан, гистидин солянокислый, лизин солянокислый.

Еще одним вариантом дешевого сырья, которое использовалось нами для приготовления гидролизатов, является капуста, которая по литературным источникам имеет богатый состав (Путырский И.Н., Прохоров В.Н., Родионов П.А., 2004). Приготовлен ферментативный гидролизат из капусты, имеющий следующие характеристики: показатель аминного азота 97,3 мг% и показатель сухого остатка 1,5%. Данный гидролизат также использован в качестве основы одного из вариантов питательной среды для культивирования лактобактерий.

Применение гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в качестве компонента питательных сред для лактобактерий при культивировании in vitro

При выборе базовых рецептур питательных сред целенаправленно были взяты, рецептура питательной среды специально предназначенной для культивирования молочнокислых микроорганизмов (MPC-среда) и рецептура питательной среды универсального назначения (агар Хоттингера), на которой лактобак-терии растут несколько хуже.

В процессе работы, для удобства, всем моделируемым питательным средам были присвоены номера от одного до пяти. Среда № 1 — модификация МРС-среды с ФГТМГ; среда № 2 - модификация MPC-среды с ФГКД; среда № 3 -модификация MPC - среды с ФГМЛР; среда № 4 - модификация агара Хоттингера с ФГКД; среда № 5 - капустная среда с ФГКТМГМН, рецептуры, которых представлены в таблице 2.

При отработке оптимальной дозы гидролизатов к питательным средам №№ 1-4 стимуляторы роста апробировали в различных концентрациях: 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0% к общему объему среды, а в капустной питательной среде — только две концентрации стимулирующего компонента 1,0 и 2,0%. В качестве контроля питательных сред №№ 1-3 использовали MPC-среду, для среды № 4 — агар Хоттингера, а результаты культивирования на капустной среде сопоставляли с двумя вышеуказанными контролями.

Установлено, что питательная среда № 1 со стимулятором роста ФГТМГ в концентрациях 0,5-2,0% обеспечивает прирост различной интенсивности всех тестовых микроорганизмов. Ни в одном из вариантов питательной среды № 1 не отмечено отрицательного воздействия на культивируемые микроорганизмы, не изменяются их классические характеристики (культуральные, морфологические, биохимические). Оптимальной концентрацией ФГТМГ в питательной среде №1 является 2,0%, для всех культивируемых тест-штаммов лактобактерий. У Lbc. acidophilus ЕР 317/402 (рис. 3) и Lbc. fermentum 90Т-С4 она способствует самому интенсивному наращиванию объема бактериальной массы (при сплошном росте, а у Lbc. plantarum 8Р-А J на 41 % превышает интенсивность роста на классической МРС-среде.

Питательная среда № 2 со стимулятором роста ФГКД во всех концентрациях от 0,5 до 2,0% является пригодной для всех культивируемых тест-штаммов микроорганизмов. Установлено, что добавление 1% ФГКД к общему объему среды № 2 является наиболее эффективной концентрацией стимулирующего компонента для всех трех культивируемых микроорганизмов, что отмечается

по увеличению числа выросших колоний: у Lbc. plantarum 8Р-АЗ на 65%, Lbc. fermentum 90Т-С4 на 32% и Lbc. acidophilus ЕР 317/402 на 57%.

Таблица 2

Рабочие варианты рецептуры моделируемых питательных сред №№1-5

Компоненты питательных сред Количество компонентов (г/л)

среда № 1 среда № 2 среда № 3 среда № 4 среда № 5

пептон из казеина 10,0 10,0 10,0 - 10,0

мясной экстракт 10,0 10,0 10,0 -

глюкоза 20,0 20,0 20,0 2,0 20,0

к2нро4 5,0 5,0 5,0 -

диаммониум цитрат 2,0 2,0 2,0 -

ацетат натрия _5,0 5,0 5,0 - 5,0

Мя804х7Н20 5,0 5,0 5,0 - 0,2

Мп804*4Н20 0,2 0,2 0,2 -

твин-80 1,0 1,0 1,0 -

Агар 15,0 15,0 15,0 10,0 8,5

дрожжевой жстракт - - - - 20,0

ферментативный гидролизат говяжьего мяса - - - 30,0 -

ферментативный гидролизат капусты 700,0

цитрат натрия 2,0

липоевая кислота 0,05

печеночная вода 0,1

ФГТМГ 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 - - - -

ФГКД - 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 - 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 -

ФГМЛР - - 5,0; 10,0; 15,0; 20,0 - -

ФГКТМГМН - - - - 10,0; 20,0

дистиллированная вода остальное остальное остальное остальное остальное

Добавление ФГМЛР в минимальной концентрации (0,5%), не оказало явного ростостимулирующего эффекта на Lbc. plantarum 8Р-АЗ, Lbc. fermentum 90T-C4 и Lbc. acidophilus ЕР 317/402 по сравнению с контролем. Питательная среда № 3 с концентрацией стимулирующего компонента 2,0% является наиболее оптимальной для всех культивируемых молочнокислых бактерий. Количество колоний увеличивается у Lbc. plantarum 8Р-АЗ на 28%, у Lbc. fermentum 90Т-С4 на 31% и Lbc. acidophilus ЕР 317/402 на 51%, по сравнению с МРС-средой.

Добавление ФГКД к питательной среде № 4, даже в минимальных концентрациях (0,5 и 1,0%) стимулятора роста оказало высокий лактостимулирующий эффект для всех культивируемых тест-штаммов. Это особенно выражено при культивировании Lbc. plantarum 8Р-АЗ и Lbc. fermentum 90Т-С4, на питательной среде № 4 с ФГКД - 1,0%. Однако, оптимальной концентрацией стимулирующего компонента в питательной среде № 4 является концентрация 2,0%. Количество колоний Lbc. plantarum 8Р-АЗ увеличивается на 68%, Lbc. fermentum 90Т-С4 на 125% и Lbc. acidophilus ЕР 317/402 на 90%, при сравнении с количеством колоний этих же микроорганизмов, выросших на агаре Хоттингера.

При выращивании Lbc. plantarum 8Р-АЗ, Lbc. fermentum 90T-C4 и Lbc. acidophilus ЕР 317/402 на питательной среде № 5 со стимулятором в концентрации 1,0%, образуются типичные для данных микроорганизмов колонии. При повышении концентрации ФГКТМГМН до 2,0% внешний вид колоний остается неизменным, однако количество увеличивается у Lbc. plantarum 8Р-АЗ и Lbc. acidophilus ЕР 317/402 на 6,2, а у Lbc. fermentum 90Т-С4 на 5,2 колоний.

При сопоставлении количества и диаметра колоний, выросших на новой капустной среде № 5 с 2,0% ФГКТМГМН и на МРС-среде не установлено достоверных различий по количеству колоний, а по диаметру - видно явное превосходство колоний, выросших на среде № 5.

Культуральные, морфологические (рис. 4) и биохимические свойства лакто-бактерий, выращенных на всех питательных средах №№ 1-5 не изменяются и соответствуют классическим характеристикам этих микроорганизмов, что ттро-демонстрованно на примере лактолбактерий, выращенных на капустной среде.

Lbc. plantarum 8Р-АЗ - прямые палочки (0,8-1,2 мкм) Lbc. fermentum 90T-C4 - толстые вариабельные палочки (0,5-0,9 мкм). Lbc. acidophilus ЕР 317/402 -палочки (0,4-2,3 мкм), с закругленными концами.

г ЫЧ^^Ш ■ ,>..X :-•-: < ' Г • ' *t\>J "S» Vgj-W. - i ' ' v k s > - I "' ' l'\ -' * , ■ / ,* , ' » "i T",, ■ Г r<~* >K V' A ••itv-»'" ""'Xl V vt :>. " "ft ■ 4. , Л*- - . - » "Ч • \ ■ ' ■, * >„.*- J \ . \ -! к ( '■ '■■ ' ■ ' - * S» у t • * S5 ."Sr> ' • Л v t РГ* >; V •? *V « f . " f Iti V

Рис. 4. Морфологические свойства лактобактерий, выращенных на среде № 5.

В связи с вышеописанными качественными проявлениями, отражающими преимущества того или иного из разрабатываемых вариантов питательных сред, на основе наиболее оптимальных из них, предложена окончательная рецептура пяти новых питательных сред для культивирования лактобактерий.

Применение гидролизатов из нетрадиционного сырья природного пронсхождния для коррекции микробиоценоза кишечника у экспериментальных животных

Результаты исследования применения ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб представлены в таблице 3.

Таблица 3

Микрофлора кишечника белых крыс до и после выпаивания ФГТМГ, ФГКД и ФГМЛР, п=150

ФГТМГ ФГКД ФГМЛР

Микрофлора до приме- после при- до приме- после при- до приме- после при-

нения менения нения менения нения менения

КОЕ/г/% КОЕ/г/% КОЕ/г/% КОЕ/г/% КОЕ/г/% КОЕ/г/%

Бифидобактерия 10'/30 104 / 60 105/10 10'/50 104/ 50 10'/50 104/ 50 104/10 105/ 70 106/ 10 10'/60 104 / 40 104/30 105 / 70

Лакгобациллы 10'/60 10'/50 10'/50 104/ 10 10'/60 10'/30

104/40 104/ 50 104 / 50 105 / 70 106/20 104 / 40 104/ 50 105 / 20

Общее количе- 287,0x10"/ 282x10"/ 282x10"/ 301x10"/ 311x10"/ 301x10"/

ство кишечной 100 100 100 100 100 100

палочки

Кишечная па- 71,75x10"/ не обнару- не обнару- не обнару- не обнару- не обнару-

лочка со слабо- 10 жено жено жено жено жено

выраженными ферментными

свойствами

Эпидермальный 10'/30 10'/30 10'/30 10'/10 104/40 10'/20

стафилококк 104/ 10

Грибы 10'/50 10'/30 10'/30 Ю'/20 10'/80 10'/10

рода Кандида 10* /50 104/70 104/ 70 104/20 Ю3/40

Протей (vulgaris) 10'/30 104/20 10'/20 103/1(Г 10'/60 не обнаружено 10'/10 не обнаружено

Энтерококки 104/10 не обнару- не обнару- не обнару- не обнару- не обнару-

жено жено жено жено жено

Примечание: % - процент встречаемости у животных.

Микробный состав кишечника белых крыс, содержащихся в условиях вивария до применения ферментативных гидролизатов нестабилен, что позволяет предполагать у некоторых из них наличие дефицитного дисбактериоза. Проведенные исследования микрофлоры кишечника крыс, после применения ФГТМГ, ФГКД и ФГМЛР подтверждают их положительное влияние на нее. При этом после выпаивания ФГТМГ количество лакто- и бифидобактерий увеличивается у всех подопытных животных. У двадцати крыс после выпаивания

ФГКД наблюдалось увеличение суммарного количества лактобактерий на один порядок, у двадцати пяти — на два порядка и у пяти — на три порядка. При выпаивании ФГМЛР количество лактобактерий увеличивается у 90% экспериментальных животных. Сопутствующее изучение состава других микроорганизмов в кишечнике экспериментальных животных свидетельствуют о том, что ФГ дополнительно способствует снижению роста и встречаемости факультативно-анаэробных микроорганизмов (эшерихии, стафилококки, дрожжеподобные грибы рода Кандида). В связи с этим все ферментативные гидролизаты можно рекомендовать для дальнейшего изучения в качестве пребиотика.

Учитывая полученные результаты о пребиотическом действии всех используемых гидролизатов, мы сочли целесообразным изучить биологические свойства лактобактерий, выделенных из фекалий крыс, тем самым подтвердить приоритетность лактостимулирующего воздействия стимуляторов. Такие исследования провели на лактобактериях, выделенных у 15 крыс (по 5 крыс из каждой группы) до и после выпаивания.

Установлено, что наиболее выраженной биологической активностью по всем исследуемым показателям обладают культуры, выделенные у крыс после выпаивания им ФГТМГ и ФГКД. После выпаивания крысам ФГМЛР несколько меньше повысились антагонистические свойства, активность кислотообразова-ния и фенолоустойчивость лактобактерий, а устойчивость к поваренной соли не изменилась по сравнению с теми же показателями до применения гидролизата. Таким образом, все гидролизаты оказывают непосредственное действие на лактобактерий, усиливая спектр их биологических свойств.

Сравнительная оценка экономической эффективности применения новых питательных сред с агаром Хоттингера и МРС-с;редой

Экономическая эффективность применения питательных сред №№ 1-5, подсчитанная по коэффициенту рентабельности, выше, чем при использовании как МРС-среды, так и агара Хоттингера. Модификация МРС-среды с ФГТМГ на 36% выше экономической эффективности МРС-среды и на 64% — агара Хоттингера; модификация МРС-среды с ФГКД на 43% и 89%; модификация МРС-среды с ФГМЛР на 30% и 71%; модификация агара Хоттингера с ФГКД на 21% и 38% и капустная среда с ФГТМГ и его молочного настоя на 48% и 140%.

ВЫВОДЫ

1. Аналитические и собственные сведения о составе микробного симбионта \fedusomyces gy.se VI растения СаИ'ша (гад'ат и молок лососевых рыб свидетельствуют о наличии в них комплекса биологически активных веществ, соответствующих питательным потребностям молочнокислых бактерий, что позволяет рассматривать эти нетрадиционные сырьевые объекты в качестве альтернативных традиционным для получения лаетостимулирующих компонентов питательных сред.

2. Экспериментально обоснована и отработана технология получения ферментативных гидролизатов из растения СаИта /га^апя, а также симбионта \iedusomyces gysevii самостоятельно и в комбинации с его молочным настоем, заключающаяся в увеличении продолжительности гидролиза за счет поэтапно-

го чередования набора ферментов, что обеспечило более высокие показатели качества (аминный азот и сухой остаток) ферментативных гидролизатов по сравнению с кислотными, изготовленными из этого же сырья.

3. Среди ферментативных гидролизатов максимальными показателями амин-ного азота и сухого остатка отличается гидролизат из ТМГ, а также из колоний и молочного настоя ТМГ. ФГМЛР занимает промежуточное положение, а в ФГКД, при минимальном уровне аминного азота, отмечен достаточно высокий уровень сухого остатка, что свидетельствует о наличии биологически активных веществ небелковой природы.

4. В ферментативных гидролизатах ТМГ, КД и MJIP обнаружены отдельные элементы и их комбинации, которые обусловливают широкий набор биохимических реакций, лежащих в основе питательных потребностей изученных культур лактобактерий.

5. Питательные среды, смоделированные, с использованием ферментативных гидролизатов (ФГТМГ, ФГКД, ФГМЛР) в качестве стимуляторов роста микроорганизмов, обеспечили интенсивный прирост количества и диаметра колоний лактобактерий, в сравнении с специально предназначенной для культивирования молочнокислых микроорганизмов (МРС-среда), а также с питательной средой универсального назначения (агар Хотгингера). Наилучшими ростовыми качествами, при сохранении морфологических, культуральных, биохимических и тинкториальных свойств, обладали модификация МРС-среды со стимулятором роста из тибетского молочного гриба, модификация МРС-среды с ферментативным гидролизатом из каллизии душистой и модификация агара Хотгингера с ФГКД, что подтверждается количеством и диаметром выросших колоний Lbc. planlarum 8Р-АЗ, Lbc. fermentum 90T-C4 и Lbc. acidophilus ЕР 317/402.

6. Новая капустная среда, приготовленная с использованием в качестве основы ферментативного гидролизата капусты и стимулирующего компонента - ФГ колоний ТМГ и его молочного настоя (1:1) обеспечивает прирост бактериальной массы Lbc. plantarum 8Р-АЗ, Lbc. fermentum 90T-C4 и Lbc. acidophilus ЕР 317/402. Это подтверждается увеличением диаметра колоний в два раза по сравнению с диаметром колоний лактобактерий на МРС-среде, при сохранении культуральных, морфологических, биохимических и тинкториальных свойств, выращенных микроорганизмов.

7. Экономическая эффективность применения пяти новых питательных сред подсчитанная по коэффициенту рентабельности, выше, чем при использовании МРС-среды и агара Хотгингера, что обусловливает широкие перспективы их производственного и лабораторного использования.

8. Экспериментально установлен выраженный пребиотический, в том числе лакгогенный эффект ФГТМГ, ФГКД и ФГМЛР на микрофлору кишечника (при приросте числа лактобактерий на 50%). Все гидролизаты оказывают непосредственное воздействие на молочнокислые бактерии, повышая активность кисло-тообразования, фенолоустойчивость и устойчивость к поваренной соли, чем обеспечивает высокий антагонистический эффект по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам: Staphylococcus epidermidis, грибам рода Candida, Escherichia coli, Proteus vulgaris.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Модифицированная технология получения ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба и каллизии душистой, может использоваться в микробиологическом и биотехнологическом производстве, с целью изготовления гидролизатов с высокими показателями качества и экономически выгодными характеристиками.

2. Новые ферментативные гидролизаты из нетрадиционного сырья природного происхождения (ФГТМГ, ФГКД, ФГМЛР) могут быть использованы в качестве стимулирующих компонентов, как при добавлении к новым питательным средам, так и с целью улучшения качества уже имеющихся питательных сред для культивирования лактобактерий.

3. Рецептуры новых питательных сред могут быть использованы в лабораторной практике, в диагностических и научных целях для быстрого выявления и идентификации молочнокислых микроорганизмов, для поддержания архивных штаммов, а также на предприятиях микробиологической промышленности, нуждающихся в больших объемах питательных сред и их высоком качестве, необходимом для наращивания бактериальной массы лактобактерий.

4. Результаты влияния ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб на микрофлору кишечника крыс являются основанием для дальнейшего их испытания с целью использования в качестве эффективных препаратов для коррекции микробиоценоза кишечника животных.

5. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций, ведении лабораторно — практических занятий по курсу микробиологии, биотехнологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тимченко, Л.Д. Состояние микробиоценоза кишечника у собак в группах риска по дисбактериозу, анализ причин и его распространение в городе Ставрополе / Л.Д. Тимченко, H.H. Гандрабурова, Н.И. Пенькова // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Матер, регион, конф. -Ставрополь, 2008. - С. 175-179.

2. Пенькова, Н.И. Микробиоценоз кишечника белых крыс при несбалансированном кормлении в лабораторных условиях / Н.И. Пенькова, Г'.Н. Блажнова // Биологическое разнообразие Кавказа: Матер. X Международной конф. (Грозный, 2008)-Назрань, 2008. - С. 350-351.

3. Пенькова, Н.И. Оценка качества ферментативных гидролизатов на основе нетрадиционного сырья / Н.И. Пенькова // Университетская наука — региону: Матер. 54-й научно-практ. конф. / Сб. труд, молодых ученых. - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2009. - С. 117-118.

4. Тимченко, Л.Д. Моделирование новой капустной среды на основе гидролизатов из капусты и тибетского молочного гриба при выращивании лактобактерий / Л.Д. Тимченко, Н.И. Пенькова, Л.С. Катунина // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сб. научн. тр. — Ставрополь: Изд-во СевКавГТУ, 2009. - Вып. 6. - С. 154-159.

5. Тимченко, Л.Д. Эффективность добавления гидролизата из каллизии душистой в питательной среде - агаре Хотгингера при культивировании лакто-бактерий / Л.Д. Тимченко, Н.И. Пенькова // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Матер, научн. конф. «Университетская наука -региону». - Ставрополь: СГУ, 2009. - С. 74-77.

6. Пенькова, НЛ. Разработка технологии гидролиза симбионта «Тибетский молочный гриб» и перспективы применения гидролизата / Н.И. Пенькова // V Ежегодная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН: Тез. докладов. - Ростов н/Д: Изд-во ЮНЦ РАН, 2009. - С. 36-37.

7. Пенькова, Н.И. Изучение влияния ферментативного гидролизата на основе субстанции «Тибетский молочный гриб» на лактофлору кишечника белых крыс / Н.И. Пенькова, А.П. Пономаренко, Г.Н. Блажнова // V Ежегодная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН: Тез. докладов. - Ростов н/Д: Изд-во ЮНЦ РАН, 2009. - С. 37-38.

8. Пенькова, Н.И. Оценка лактогенных свойств ферментативных гидролизатов из каллизии душистой и молок лососевых рыб / Н.И. Пенькова // VI Ежегодная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН: Тез. докладов. - Ростов н/Д: Изд-во ЮНЦ РАН, 2010. - С. 35-36.

9. Тимченко, Л.Д. Влияние кислотного гидролизата из тибетского молочного гриба (ТМГ) на иммунологические показатели организма белых крыс / Л.Д. Тимченко, Н.И. Пенькова, А.П. Пономаренко, Т.Н. Блажнова, И.Е. Бе-логлазова II Международный журнал по иммунореабилитации: XIV Между-нар. конгресс реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Тель-Авив, Израиль, 17-20 октября2009).-2009.-Т. 11. -№ 1.-С. 138.

10. Тимченко, Л.Д. Влияние новых ферментативных гидролизатов из нетрадиционного сырья: природного происхождения на рост лакгобактерий in vivo и in vitro / Л.Д. Тимченко, НЛ. Пенькова // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». - 2009. - № 3. - С. 60-65.

11. Тимченко, Л.Д. Сравнительный анализ традиционных питательных сред и новая капустная среда для культивирования лакгобактерий / Л.Д. Тимченко, Н.И. Пенькова, Л.С. Катунина // Вестник Московского государственного областного университета серия «Естественные науки». - 2010. - № 2. — С. 51-55.

12. Тимченко, Л.Д. Лактогенные свойства гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения / Л.Д. Тимченко, Н.И. Пенькова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сб. научн. тр. - Ставрополь: Изд-во СевКавГТУ, 2010. - Вып. 8. - С. 95-99.

Пенькова Надежда Ивановна

Подписано в печать 26.11.10 Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 1,16 Уч.-изд.л. 1,21

Бумага офсетная_Тираж 130 экз._ Заказ 499

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пенькова, Надежда Ивановна

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ПРИКЛАДНАЯ РОЛЬ И

ОСОБЕННОСТИ ВЫРАЩИВАНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 11'

1.1. Характеристика и биологическая роль лактобактерий, как составных компонентов природных и искусственных микробиосистем 11 1.1.1. Характеристика отдельных штаммов лактобактерий и их прикладное значение в биотехнологии и пищевой промышленности

1.2. Закономерности и проблемы культивирования лактобактерий

1.3. Гидролизаты как компонент питательных сред.

Принципиальный подход к приготовлению гидролизатов

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. ЛАКТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА НОВЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ НА ОСНОВЕ НЕТРАДИЦИОННОГО СЫРЬЯ

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ)

3.1. Характеристика сырья и отработка технологии гидролиза

3.2. Применение гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в качестве компонента питательных сред для лактобактерий при культивировании-in vitro

3.3. Применение гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения для коррекции микробиоценоза кишечника у экспериментальных животных

3.4. Сравнительная оценка экономической эффективности применения новых питательных сред с агаром-Хоттингера и МРС-средой

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫВОДЫ '

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение лактогенных свойств гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в питательных средах и in vivo"

Актуальность исследования. Лактобактерии относятся к большой группе микроорганизмов, широко распространенных в природе, способных расти в различных условиях окружающей среды (Банникова J1.A., 1987; Коршунов В.М., 2000; Batisal S., 2001; Gopal P., 2001; Ogawa M., 2001). Они являются важнейшими компонентами микробных сообществ различных биотопов окружающей среды и живого организма. Молочнокислые бактерии встречаются в почве, сосредотачиваясь вокруг корневой системы растений (Квасников Е.И., Сумневич М.Г., 1953; Богданов В.М., 1959). Их высевают из молока, молочных продуктов, кефирных грибков, муки, цветов, растений, ягод, фруктов и овощей (Богданов В.М., Пятницына И.Н., 1959; Луковникова Л.А., 1965; Банникова Л.А., 1970; Талачкене Р.И., 1970; Чужова З.П., 1970; Сагындыкова С.З., 1990).

Исследователи солидарны в мнении о том, что именно микробы молочнокислого брожения играют ведущую роль в обеспечении устойчивого микробиоценоза и, связанных с ним, многочисленных жизненно важных функций в организме человека, животных, птиц и даже насекомых (Банникова Л.А., 1987; Коршунов В.М., 2000; Бухарина О.В., 2006; Хавкин А.И., 2006).

Нарушение качественного и количественного состава лактобактерий, вплоть до их полного исчезновения, является одним из общих признаков дисбактериоза живой системы, независимо от его причин. Доказано, что недостаток лактофлоры является причиной снижения колонизационной резистентности кишечника другими микроорганизмами, в частности энтеро-бактериями, бифидобактериями и другими (Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г., 1979; Красноголовец В.Н., 1979; Пинегин Б.В., 1984; Барзашка-Попова С.Н., 1990; Гребенев А.Л., Мягкова Л.П., 1994; Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А., 2000; Петенко А.И., Ярошенко В.А., Кощаев А.Г., 2003; Овод A.C., 2005).

В связи с высокой метаболической активностью лактобактерий,. их антагонистическими и антибиотическими свойствами,, а также высокой адге-зивностью по отношению к тканям организма, эти микроорганизмы все чаще рассматривают, как: основной компонент лекарственных препаратов,. Б АД и пищевых продуктов, которые обладают пробиотическим, иммуномодули-рующим и пребиотическим действием (Конькова Н.К., 2002; Чистохина Л.П., 2004; Молохова Е.И: и др., 2006; Хавкин А.И., 2006).

Разработка, таких препаратов и продуктов сопряжена, прежде всего, с. выделением из различных биологических объектов И: окружающей среды,, идентификацией и поддержанием высокоактивных и стабильных культура молочнокислых бактерий, а также с созданием оптимальных условий для наращивания бакмассы. в достаточном количестве. Успех этих манипуляций связан с процессом культивирования; определяющимся^ прежде всего, качеством питательных сред. Лактобактерии; являются ауксотрофными организмами и поэтому чрезвычайно требовательны- к искусственным; питательным, средам (Степаненко И:Ш,; 2005). Несмотря- на то, что для лабораторного и промышленного культивирования лактобактерий в, микробиологии известны и широко используется; целый ряд; питательных сред на основе молока, дрожжевого гидролизата и печеночного экстракта, растительных объектов и др. (Аристовская Т.В.и др:, 1962; Нетрусов» А.И. и др;,. 2005; Дзержинская И.С., 2008), появились мнения о снижении их свойств;, связанных с ухудшением качества сырьевых субстанций, вследствие экологических, эпизоотических и антропогенных проблем (Панова; HIB., . 2006; Waguespack М:, 1986; Corrigan Р:J., Seneviratna PI, 1989). К недостаткам известных питательных сред можно отнести и краткий срок хранения, основы, изготовленной из молочного сырья; (Конькова Н:К., 2002), а также технологические трудности и дополнительные затраты, при- изготовлении- некоторых компонентов для таких сред, как MRS, среда'с Твин-80 и другие (Банникова Л. А., 1975);

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

4. Изучить влияние полученных гидролизатов на микрофлору кишечника, в том числе лактогенный эффект, на белых крысах линии «Вистар».

Впервые изучен химический состав трех ферментативных гидролизатов (ФГ) из тибетского молочного гриба (ТМГ), каллизии душистой (КД) и молок лососевых рыб (MJIP) и доказано, что в них, в различных качественных и количественных отношениях, присутствуют многочисленные биологически активные вещества (белки, углеводы, органические кислоты, микро- и макроэлементы), необходимые для роста и развития лактобактерий.

Впервые на примере Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, Lactobacillus fer-mentum 90T-C4 к Lactobacillus acidophilus EP 317-402, при их культивировании на модификациях МРС-среды и агара Хоттингера, доказана возможность использования ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб в качестве стимуляторов роста и предложена рецептура питательных сред для лактобактерий.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена положительными решениями о выдаче патентов на изобретения по заявкам № 2009140531 «Питательная среда для культивирования лактобактерий» и № 2009149506 «Способ получения ферментативного гидролизата из капусты и питательная среда для культивирования лактобактерий на его основе». Результаты испытаний положены в основу патентного поиска по заявке № 2009120982 «Способ получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба и питательная среда на его основе для культивирования лактобактерий».

Впервые доказано положительное воздействие ферментативных гидро-лизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб на кишечную микрофлору экспериментальных животных, что выражается в увеличение числа лакто- и бифидобактерий и ингибирование роста условно-патогенных микроорганизмов. Определены перспективы их применения в качестве пребиотиков с характерным лактогенным эффектом.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Полученные результаты могут быть использованы для наращивания бакмассы лактобактерий на предприятиях микробиологической промышленности и в лабораторной деятельности микробиолога. По итогам испытания ферментативных гидролизатов из ТМГ, КД и КТМГМН разработана и утверждена на экспериментально-производственном уровне техническая документация, а также получен акт внедрения ФГТМГ и ФГКД в производство пробиотиков на предприятии «Микромир» совместно с ФГУ «Ставропольская межобластная ветеринарная лаборатория» на базе ОАО «Завод Лактобиотиков» г. Ставрополя.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на четвертой и пятой ежегодной' конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра- РАН (Ростов-на-Дону, 2009; 2010 гг.); на 53-й, 54-й и 55-й научных конференциях «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2008; 2009; 2010 гг.); на X Международной научной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа» (Грозный, 2008 г.). Ферментативные гидролизаты из тибетского молочного гриба, каллизии душистой, а также новая капустная среда и биологически активная кормовая добавка ФГТМГ представлен на VII и VIII Международных специализированных выставках «МИР БИОТЕХНОЛОГИИ 2009, 2010» (Москва) и на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2010 г.), где награждены двумя дипломами и двумя золотыми медалями.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Тибетский молочный гриб, каллизия душистая и молоки лососевых рыб являются альтернативным нетрадиционным сырьем для получения гидролизатов' с физико-химическими свойствами, отвечающими питательным потребностям лактобактерий.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 12 печатных работ, в том числе три из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Пенькова, Надежда Ивановна

выводы

1. Аналитические и собственные сведения о составе микробного симбионта Мескяотусез gysevii, растения СаЯ/ям /га§уат и молок лососевых рыб свидетельствуют о наличии в них комплекса биологически активных веществ, соответствующих питательным потребностям молочнокислых бактерий, что позволяет рассматривать эти нетрадиционные сырьевые объекты в качестве альтернативных традиционным для получения лактостимулирую-щих компонентов питательных сред.

2. Экспериментально обоснована и отработана технология получения ферментативных гидролизатов из растения СаИша fragrans, а также симбионта Мейтотусеъ gysevu самостоятельно и в комбинации с его молочным настоем, заключающаяся в увеличении продолжительности гидролиза за счет поэтапного чередования набора ферментов, что обеспечило более высокие показатели качества (аминный азот и сухой остаток) ферментативных гидролизатов по сравнению с кислотными, изготовленными из этого же сырья.

3. Среди ферментативных гидролизатов максимальными показателями аминного азота и сухого остатка отличается гидролизат из ТМГ, а также из колоний и молочного настоя ТМГ. ФГМЛР занимает промежуточное положение, а в ФГКД, при минимальном уровне аминного азота, отмечен достаточно высокий уровень сухого остатка, что свидетельствует о наличии биологически активных веществ небелковой природы.

4. В ферментативных гидролизатах ТМГ, КД и МЛР обнаружены отдельные элементы и их комбинации, которые обусловливают широкий набор биохимических реакций, лежащих в основе питательных потребностей изученных культур лактобактерий.

5. Питательные среды, смоделированные, с использованием ферментативных гидролизатов (ФГТМГ, ФГКД, ФГМЛР) в качестве стимуляторов роста микроорганизмов, обеспечили интенсивный прирост количества и диаметра колоний лактобактерий, в сравнении с специально предназначенной для культивирования молочнокислых микроорганизмов (МРС-среда), а также с питательной средой универсального назначения (агар Хоттингера). Наилучшими ростовыми качествами, при сохранении морфологических, культу-ральных, биохимических и тинкториальных свойств, обладали модификация МРС-среды со стимулятором роста из тибетского молочного гриба, модификация МРС-среды с ферментативным гидролизатом из каллизии душистой и модификация агара Хоттингера с ФГКД, что подтверждается количеством и диаметром выросших колоний Lbc. plantarum 8Р-АЗ, Lbc. fermentum 90T-C4 и Lbc. acidophilus EP 317/402.

6. Новая капустная среда, приготовленная с использованием в качестве основы ферментативного гидролизата капусты и стимулирующего компонента - ФГ колоний ТМГ и его молочного настоя (1:1) обеспечивает прирост бактериальной массы Lbc. plantarum 8Р-АЗ, Lbc. fermentum 90T-C4 и Lbc. acidophilus EP 317/402. Это подтверждается увеличением диаметра колоний в два раза по сравнению с диаметром колоний лактобактерий на МРС-среде, при сохранении культуральных, морфологических, биохимических и тинкториальных свойств, выращенных микроорганизмов.

7. Экономическая эффективность применения пяти новых питательных сред подсчитанная по коэффициенту рентабельности, выше, чем при использовании МРС-среды и агара Хоттингера, что обусловливает широкие перспективы их производственного и лабораторного использования.

8. Экспериментально установлен выраженный пребиотический, в том числе лактогенный эффект ФГТМГ, ФГКД и ФГМЛР на микрофлору кишечника (при приросте числа лактобактерий на 50%). Все гидролизаты оказывают непосредственное воздействие на молочнокислые бактерии, повышая активность кислотообразования, фенолоустойчивость и устойчивость к поваренной соли, чем обеспечивает высокий антагонистический эффект по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам: Staphylococcus epidermidis, грибам рода Candida, Escherichia coli, Proteus vulgaris.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Модифицированная технология получения ферментативных гидроли-затов из тибетского молочного гриба и каллизии душистой, может использоваться в микробиологическом и биотехнологическом производстве, с целью изготовления гидролизатов с высокими показателями качества и экономически выгодными характеристиками.

2. Новые ферментативные гидролизаты из нетрадиционного сырья природного происхождения (ФГТМГ, ФГКД, ФГМЛР) могут быть использованы в качестве стимулирующих компонентов, как при разработке новых питательных сред, так и с целью улучшения качества уже имеющихся питательных сред для культивирования лактобактерий.

4. Результаты влияния ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб на микрофлору кишечника крыс являются основанием для дальнейшего испытания с целью использования в качестве эффективных препаратов для коррекции микробиоценоза кишечника животных.

Информация о работе

Пенькова, Надежда Ивановна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Изучение лактогенных свойств гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в питательных средах и in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение лактогенных свойств гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в питательных средах и in vivo - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы