Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии концентрирования и высушивания глубинных культур B. subtilis 3 и B. licheniformis 31 в производстве биоспорина

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии концентрирования и высушивания глубинных культур B. subtilis 3 и B. licheniformis 31 в производстве биоспорина"

На правах рукописи Для служебного пользования Экз.№ 025

ПЫЛАЕВ Сергей Анатольевич

£

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ И ВЫСУШИВАНИЯ ГЛУБИННЫХ КУЛЬТУР Ъ.БивТ1ШЪ и В.ПСНЕМГОШШЯ 31 В ПРОИЗВОДСТВЕ БИОСПОРИНА

03. 00. 07 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 2001 г.

Работа выполнена в в лаборатории контроля и индикации возбудителей бактерийных инфекций Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (г. Казань) и в отделе лечебных препаратов Центра военно-технических проблем биологической защиты научно-исследовательского института микробиологии МО РФ (г. Екатеринбург), (г. Екатеринбург).

Научные руководители: доктор ветеринарных наук - Садыков Н.С.

кандидат медицинских наук - Васильев П.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный

сотрудник Гильмутдинов Р.Я.

доктор медицинских наук, профессор Поздеев O.K.

Ведущая организация - Московская академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К.И. Скрябина

Защита состоится «30» июля 2001 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (г. Казань, Научный городок,2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института.

Автореферат разослан «>?/?..» июня 2001 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук

¿Я»

Степанов В.И.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. Рост в Российской Федерации острых килечных инфекций и дисбактериозов среди населения как следствие эпидемио-югического и экологического неблагополучия обуславливает необходимость эазработки и внедрения в медицинскую практику новых высокоэффективных ;редств и методов комплексной профилактики и лечения. Одним из подобных трепаратов, отвечающих современным требованиям, является пробиотик -шоспорин.

Биоспорин - новый комплексный пробиотик на основе двух видов иэробных спорообразующих бактерий. Предназначен для профилактики и ле-гения острых кишечных инфекций, вызываемых патогенными и условно-ттогенными микроорганизмами (сальмонеллами, шигеллами, энтеропатоген-шми штаммами кишечной палочки, протеем и Кандидами), в том числе и ан-"ибиотикоустойчивыми; для лиц перенесших ОКИ, при продолжении выделе-шя возбудителя или наличии дисфункции кишечника, для коррекции микрофлоры кишечника при дисбактериозах, возникших в результате антибиотико-ерапии и других причин, а также для профилактики и лечения диареи у сель-жохозяйственных животных.

До 1996 года данный препарат выпускался лишь на Украине Днепро-1етровским химфармзаводом в ограниченных количествах из-за несовершенства используемой технологии (поверхностный способ выращивания культур 3. .чиЬИИ.^ 3 и В. Искеп'фгтхя 31). В России биоспорин не производился.

Учитывая перспективность биоспорина и острую необходимость его шедрения в практику здравоохранения РФ, сотрудниками Центра военно-ехнических проблем НИИ микробиологии МО РФ (ЦВТП) были выполнены юисковые исследования по разработке принципиально новой отечественной ехнологии его выпуска.

В отличие от технологии разработчиков препарата, в которой преду-:мотрено выращивание бацилл на плотных питательных средах, сотрудниками {ВТП освоен прогрессивный и высокопроизводительный глубинный способ ;ультивирования микроорганизмов ВлиЫШя 3 и В.ИсЬет/огтгэ 31 - компоненте препарата биоспорин. Увеличение выхода биомассы, а также особенности лубинных культур, по сравнению с выращенными на плотных питательных редах, создали предпосылки для внедрения и аппаратурного оформления стада концентрирования, а также усовершенствования процессов приготовления табилизированной микробной суспензии и ее высушивания. Таким образом, еоретическое и экспериментальное обоснование технологии концентрирова-¡ия, приготовления стабилизированной микробной суспензии и высушивания лубинных культур В. яиЫШз ЗиЛ. \icheniformis 31 для получения лечебно-рофилактического препарата биоспорин представлялось актуальным.

-21.2. Цель работы. Целью настоящей работы явилось создание технологии производства препарата биоспорина, отвечающего требованиям ФС, с использованием процессов концентрирования и сублимационного высушивания глубинных культур В. яиЫШз 3 и В .Искет/огтЬ 31.

1.3. Задачи исследования:

- изучить лечебно-профилактическую эффективность биоспорина при кишечных инфекциях и дисбактериозах у людей и сельскохозяйственных животных;

- обосновать и выбрать технологическое оборудование и режимы его работы для концентрирования нативных культур и высушивания препарата биоспорина;

- определить композиционный состав защитной среды и стабилизированной микробной суспензии, порядок их приготовления и хранения.

1.4. Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка возможности использования сепарирования нативных культур В. зиЫШя 3 и В. Искет[огтЫ 31 с последующим внедрением в технологию производства препарата биоспорина.

Новыми являются данные о включении в композиционный состав препарата биоспорина сухого обезжиренного молока, а также режимов замораживания и высушивания стабилизированных микробных суспензий на основе глубинных культур В. бнЫШз 3 и В. ИсИаи/огт'и 31.

Показано, что биоспорин, приготовленный по разработанной технологии, обладает высокой лечебно-профилактической эффективностью при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах у людей и при диарее у сельскохозяйственных животных.

1.5. Практическая значимость работы.

Разработана технология приготовления препарата биоспорин в ампулах и флаконах из глубинных культур В. анЬИШ 3 и В. ИсИет/огт1$ 31, включающая в себя стадии концентрирования, приготовления стабилизированной микробной суспензии и сублимационного высушивания. Технология реализована на участке получения биоспорина на базе ЦВТП.

По результатам исследований разработаны:

-технологические инструкции получения концентрированной микробной суспензии, жидкой рецептурной массы и готовой лекарственной формы при получении препарата биоспорина;

-регламент производства биоспорина №580-96;

-фармакопейная статья ФС 42-3476-98;

-ТУ на биоспорин ветеринарный.

-31.6. Основные положения, выносимые на защиту.

На защиту выносится научное положение о том, что разработанная технология получения биоспорина, предусматривающая стадии концентрирования и высушивания глубинных культур В. subtilis 3 и В. licheniformis 31, позволяет получить препарат, обладающий высокой лечебно-профилактической эффективностью при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах у людей я при диарее у сельскохозяйственных животных.

1.7. Апробация и реализация результатов работы. Материалы работы положены на межучрежденческой научно-практической конференции "Перспективы использования пробиотика "Биоспорин" в практике здравоохранения я военно-медицинской службы" (Екатеринбург, 1997); на юбилейной конфе-эенции посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ "Диагностика и (течение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария" (Киров, 1998); на расширенном заседании лаборатории бактериальных инфекций ВНИВИ (г. Казань, 2000)

По результатам проведенных исследований создана аппаратурно-гехнологическая линия производства биоспорина, аттестована в контрольном институте, получен сертификат соответствия и лицензия на право производства, хранения и реализации препарата биоспорина.

1.8. Публикации результатов исследований. По теме диссертации опуб-таковано 6 печатных работ.

1.9. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 151 лранице машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования с обсуждением результатов исследований, выводами и фактическими рекомендациями. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 17 эисунками. Литературный указатель содержит 131 источник, включая работы отечественных и зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования использовали споровые и вегетатив-ше клетки непатогенных аэробных микроорганизмов Bacillus subtilis ВКПМ 3-2335(3) и Bacillus licheniformis ВКПМ В-2336 (31), депонированные во ВНИИ "Генетика". Данные микроорганизмы с 1991 года находятся официаль-го в коллекции Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ и систематиче-:ки репродуцируются. Указанные штаммы обладают типичными морфологи-гескими, кулмуральньши и биохимическими свойствами, характерными для (анных видов спорообразующих бацилл, и, кроме того, высоким антагонизмом по отношению к патогенным и условно-патогенным микробам.

Для определения антагонистической активности препарата использовались штаммы: Staphylococcus aureus 209; Candida albicans ИМВ 690; Shigella sonnei 5063; Salmonella typhimurium 55, полученные в ГИСК им. Л.А. Тарасе-вича.

В работе использованы питательные среды:

№4 и №4С - для выращивания В. subtilis 3; № 7 - для выращивания В. licheniformis 31; среда Гаузе №2 - для определения антагонистической активности; среда Эндо - для контроля отсутствия патогенных и условно патогенных бактерий кишечной группы; среда Сабуро - для контроля отсутствия грибов; среда с мочевиной - для контроля отсутствия бактерий рода Proteus', жел-точно-солевой агар Чистовича - для контроля отсутствия стафилококков.

В проведении клинических испытаний лечебно-профилактического действия препарата биоспорина в медицинской практике было задействовано 446 человек, при проведении доклинических испытаний по оценке лечебно-профилактического действия биоспорина при диарее сельскохозяйственных животных было задействовано 98 телят и 146 поросят.

В работе были использованы клинические, бактериологические, биохимические, гематологические, физико-химические методы исследований.

При исследованиях применялись глубинные культуры В. subtilis 3 и В. licheniformis 31, полученные в ферментерах БИОР-0,1 и БИОР-0,25 (табл.1).

В исследованиях применяли общепринятые в практике и описанные в ВФС 42-366ВС-92 методы определения биологических, физико-химических и других характеристик микроорганизмов, а также приготовленных на их основе биопрепаратов.

Концентрирование нативных культур (НК) проводили на сепараторах АСГ-ЗМБ, на корпусе которых смонтирован бокс для обеспечения ведения процесса в асептических условиях и на разделительных патронах из комплекта ультрафильтрационных установок УПЛ-0,6 и УПВ-6,0.

Высушивание биопрепаратов производили на полочных сушильных установках МАСС-5 и МАСС-25 (Россия).

Эвтектическую температуру изучаемых стабилизированных микробных суспензий (CMC) измеряли с помощью эвтектико-монитора из комплекта установки LZ-45.27 (Чехословакия).

Статистическая обработка полученных данных проведена с помощью стандартных программ: методом вариационной статистики с вычислением средних величин (М), ошибки средней (t), среднего квадратичного отклонения (Q), вычислением показателя достоверности различий (р), определяемых по таблице Стьюдента-Фишера. Расчеты проводились с помощью статистической программы на ПЭВМ. Набор и корректура текста, графические изображения выполнены с помощью программ Microsoft Word и Microsoft Excel в операционной системе Windows 95.

Таблица 1 - Обобщенные характеристики глубинных НК В.БиЫШв 3 и В.Искеп '^отт 31, полученных в ферментерах

БИОР-0,1 и БИОР-0,25 на ПС № 4, 4С и 7.

Шифр ПС Количест во серий Характеристика конечных НК

рН, ед. рН Содержание сухих веществ, % Оптическая плотность, ед. ОП Оптическая концентрация (по счету в камере Горяева), млрд.кл.«см"3 Биологическая концентрация, млрд.кл..см"3 Количество зрелых спор (по мазку, окрашенному по Цилю-Нильсену), %

В. янЬШи 3 в БИОР-0,25

№4 5 5,80+0,20 2,13+0,23 3,19+0,58 2,16+0,09 1,20+0,20 55+5

№ 4С 3 8,35+0,10 5,16+0,17 17,15+3,85 7,80+1,33 6,59+1,61 70+5

В. Искет/о^ 31 в БИОР-0,1

№7 5 6,70±0,30 1,9+0,52 7,45+2,88 5,64+1,02 4,96+1,11 55+5

Требования проекта регламента к НК В. яиЫШх 3 В. ИсИет/огт!.? 31 5,6, не менее 6,86+0,6 — 2,0, не менее 3,0, не менее 2,0, не менее 2,0, не менее 1,0, не менее 1,0, не менее 50,0, не менее 50,0, не менее

-62.2. Результаты исследований

2.2.1. Разработка стадии концентрирования в производстве биоспорина

В процессе исследований оценивалась возможность применения сепарирования для разделения НК В. яиЫШя 3 и В. ИсИет/огт'я 31.

Для выбора оптимальных режимов сгущения НК бактерий В. йиЫШз 3 и В. Искет[огти 31 на сепараторе АСГ-ЗМБ были проведены следующие исследования.

Поставлен ряд экспериментов по концентрированию НК с составлением материального баланса. Данные проведенных исследований представлены на рис. 1.

о X

02

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

79,2

ТГГ

"52^"

Л1_

"Зтв-

-45,2-

■-< 1 Ш-

Среда №4

Среда №4С

□ выход по БК

□ потери, связанные с гибелью и неучтенные потери

□ унос с фугатом и остатки в аппарате и трубопроводах

Рисунок 1 - Влияние среды выращивания на эффективность сепарирования

Среда №7 Среда выращивания

На основании приведенных данных можно сделать вывод, что сепарирование НК, полученной на среде №4С, будет осуществляться с большими потерями, следовательно, оно нетехнологично и экономически невыгодно. Между тем необходимо отметить, что культура В.зиЫШз 3, выращенная на среде №4С, без концентрирования может быть использована

для получения одно- и двухдозного препарата биоспорина, так как при высокой активности данная НК имеет и высокое содержание сухих веществ (СО), что позволяет непосредственно из НК готовить стабилизированную микробную суспензию (CMC).

Таким образом установили, что концентрированию подлежат НК B.subtilis 3 и В. licheniformis 31, выращенные на ПС №4 и ПС №7.

Определен порядок подготовки глубинных культур непосредственно для сепарирования.

В экспериментах было установлено, что при температуре выращивания 37°С через 30-36 часов происходит максимальное спорообразование с последующим волнообразным изменением концентрации спор. Учитывая, что глубинные культуры на завершающей стадии выращивания имеют температуру (37+1 )°С, для снижения скорости всех метаболических процессов в клетках, тем самым замедления возможного прорастания зрелых, а тем более незрелых спор, "сдвига" развития НК в сторону спорообразования, после ряда экспериментов по глубинному выращиванию культур В. subtilis 3 и В. licheniformis 31 пришли к выводу, что целесообразно осуществлять постепенное их захолажи-вание до температуры (12+3)°С, когда практически удается остановить развитие культуры и избежать вторичного роста.

Однако температура НК при определенных условиях может оказывать влияние на качество разделения. Влияние температуры на эффективность раз-целения оценивали по качеству разделения в интервале температур от '12+3)°С до (30+3)°С. В рассмотренном диапазоне температура не оказывает влияние на эффективность работы сепаратора АСГ-ЗМБ. Поэтому более чем эправдано рекомендованное нами их охлаждение для стабилизации качества эиокомпонента и уменьшения отрицательного влияния на бактерии разогрева эарабана сепаратора.

Экспериментально при концентрировании устанавливали скорость потока НК и продолжительность заполнения барабана сепаратора, обеспечивающие эффективность сепарирования. Дня этого была проанализирована взаимосвязь эффективности разделения от расхода НК, подаваемой на концен-грирование.

Полученные данные о влиянии расхода НК на эффективность разделения представлены в таблице 2. Из таблицы видно, что наибольшая эффективность разделения достигается при производительности менее 30 дм'.ч"1. Незначительное снижение наблюдается при 35 дм3. ч"\ дальнейшее повышение скорости подачи НК приводит к ухудшению процесса разделения.

Таблица 2 - Эффективность разделения глубинных НК В. БиЫШз 3 и

В. licheniformis 31, выращенных на ПС №4 и №7

Номер серии Эффективность разделения (Ф), доли... при разных скоростях подачи НК, дм3.ч"'

10 20 25 30 35 45 50 55 60

1S 0,95+0,02 0,93+0,02 0,94+0,02 0,92+0,03 0,90+0,04 0,76+0,04 0,71+0,04 0,66+0,05 0,60+0,05

2S 0,95+0,02 0,95+0,02 0,95+0,02 0,93+0,03 0,89+0,05 0,78+0,04 0,74+0,06 0,69+0,05 0,59+0,05

3S 0,95+0,03 0,96+0,02 0,94+0,03 0,94+0,03 0,89+0,02 0,77+0,03 0,71±0,03 0,68+0,06 0,61±0,06

1L 0,95±0,02 0,95+0,03 0,94+0,05 0,93+0,04 0,91+0,05 0,76+0,04 0,64±0,04 0,65+0,05 0,59±0,06

2L 0,95+0,03 0,95+0,02 0,94+0,02 0,93+0,04 0,91 ±0,03 0,76+0,04 0,61±0,03 0,63+0,04 0,56±0,04

3L Примем 0,96+0,03 ание: обоз! 0,95+0,03 чачения "S 0,95+0,03 " и "L" пр 0,94+0,02 1НЯГЫ С001 0,90+0,04 ветственн 0,71 ±0,03 0 для В. SU 0,68±0,03 btilis ЗкВ 0,61+0,04 . lichenifot 0,54±0,04 mis 31.

Производительность (30+5) дм3.ч"' для НК, подаваемой на сепарирование, является оптимальной для сепаратора АСГ-ЗМБ для В. subtilis 3 и В. licheniformis 31.

Для производства препарата биоспорин в ампулах или флаконах концентрация живых микроорганизмов в концентрированной микробной суспензии (KMC) должна быть на уровне (50+10) млрд.кл..см"3, общая концентрация микроорганизмов будет составлять при этом (100+20) млрд.кл..см"3. Данная концентрация в KMC обеспечит получение препарата биоспорина от 1 до 10 доз в укупорке, биоспорина ветеринарного, а также приготовление различных форм препарата (таблетки, суппозитории, мази и т.д.). Используя выбранные режимы сепарирования, был осуществлен ряд экспериментов на сепараторах АСГ - 3МБ. Характеристики приготовленных KMC приведены в табл. 3.

Таблица 3 - Биологические и физико-химические характеристики KMC

B.subtilis 3 и В. licheniformis 31, полученных методом машинного концентрирования на сепараторах АСГ-ЗМБ

Наименование микроорганиз- Кол и -ч ест- Среднее значение показателя качества исходных продуктов

ма во серий культур Общая концентрация, млрд. КЛ..СМ"3 Биологи ч е-ская концентрация, млрд. к л.. с м"3 Термоустой-ч и- вость, % Содержание сухих веществ, % Посторонняя микрофлора

KMC B.subtilis 3 3 94,1+7,4 49,7 + 8,4 66+1 1 12,3 + 2,4 Отсутствует

KMC B.licheniformis31 3 104,3 + 1 1,7 47,2 + 6,3 74 + 20 8,4+1,6 Отсутствует

Требования, к KMC 100+20 50+1 0 25, не более Не допускается л

Отработанные режимы машинного концентрирования глубинных культур В. subtilis 3 и В. licheniformis 31 на сепараторе АСГ-ЗМБ содержат следующие параметры:

скорость подачи НК, дм3*ч"' - (30+5);

температура НК, °С - (12+3);

время накопления биомассы в барабане сепаратора - расчетное.

Получаемые сепарированием KMC антагонистически активных бацилл должны при этом отвечать следующим требованиям:

общая концентрация клеток (по счету) млрд.кл..см"3 - (100+20); концентрация живых клеток (БК) млрд.кл..см"3 - (50+10); содержание сухих веществ (СО), % -25,не более;

посторонняя микрофлора - отсутствует.

Технологические параметры сепарирования и требования к получаемой KMC включены в регламент производства биоспорина и технологические инструкции.

-102.2.3. Разработка стадии высушивания в производстве препарата биоспорина

Особенностью выращивания культуры В. subtilis 3 на среде №4 глубинным способом является невысокое содержание сухих веществ, образование пигмента и выделение его в культуральную жидкость, из-за чего цвет и внешний вид препарата после высушивания не соответствовал требованиям ФС, что сказывалось на товарном виде готового препарата. Как показал опыт применения защитной среды высушивания (СВ), использованной в производстве биоспорина из поверхностно-выращенных культур, при высушивании препарата из глубинных НК В. subtilis 3 и B.licheniformis 31, ее компонентный состав не в полной мере обеспечивал технологичность процесса сублимации и способствовал увеличению брака готового препарата по внешнему виду. В связи с этим экспериментально-аналитическим способом была произведена оценка возможности осветления суспензии и стабилизации «таблетки» высушенного препарата. Проведены исследования о возможности включения в состав СВ сухого обезжиренного молока (СОМ), широко используемого при лиофилиза-ции различных бактерий. Обладая определенной буферностью, данный компонент СВ способствует стабилизации реакции среды в диапазоне, близком к нейтральной (7,0 ед. рН) и, в конечном счете, предотвращению денатурацион-ных изменений субклеточных структур про- и эукариотов при пониженных температурах. Кроме того, включение в состав СВ обрата молока обеспечит предпочтительные условия для формирования "таблетки" и ее сохранения при сушке. При выборе концентрации (СОМ) необходимый эффект достигался уже при 0,003 г в одной дозе препарата. Таким образом, в стандартную среду высушивания, содержащую сахарозу и желатин, дополнительно ввели сухое обезжиренное молоко.

Экспериментально была подобрана среда высушивания следующего состава (на одну дозу препарата): сахароза - 0,020 г; желатин - 0,006 г;

сухое обезжиренное молоко - 0,003 г. В этой связи, в группе экспериментов с приготовлением CMC и получением при стандартных режимах сушки в ампулах и флаконах подтвердили возможность и целесообразность включения СОМ и в состав СВ при получении биоспорина. Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4 - Оценка влияния дополнительного включения в состав среды высушивания сухого обезжиренного молока на свойства экспериментальных образцов биоспорина, изготовленного из глубинных культур микроорганизмов В. зиЬШя 3 и В. ИсЪет[оппЬ 31

Образцы фепарата Качество "таблетки" после сушки Величина брака по внешнему виду, % Влия ние на параметры процесса сушки Содержание живых микроорганизмов в дозе, млрд. клеток Безвредность для белых мышей Антагонистическая активность

на момент приготовления после хранения на момент приготовления после хранения на момент приготовления после хранения

¡иоспорин с ¡(¡пользованием тандартной СВ контр.) + + - 30-35 Нет 5,410,8 1,6 ±0,4 1,9+1,1 0,3 ±0,3 безвр еден безвр еден соответствует соответствует

>иоспорин с юпользованием совершенство-анной СВ включающей :ом 1,003 г на .озу) Примечания: 1 Обозначения лах (флаконах) и 2 Представлень 3 В числителе В.Искеп1/огт1 4 Определение требованиями 5 Хранение + + + "+" И "о внешн средни приведе 31. безвред ВФС42 течени менее 5 ' приняты ему виду е результа Ш ВСЛИЧ1 гости и а! -366ВС-92 3 лет в а» Нет для опи цвету, <| ты потр 1НЫ для ггагонис иФС 4 лпулах и 6,4+1,3 1,8 ±0,5 сания обо орме и т.п ем сериям микроорг тической 2-3476-98. флаконах 2,9+1,2 0,6 ±0,4 бщающих препарате анизма В. активносл безвр еден харакге в. subtilis и осуще безвр еден 5ИСГИК " 3, а в з ствляли соответствует таблеток" наменател в соответ соответствует в ампу-е - для 1ТВИИ с

В дальнейших исследованиях по отработке режимов замораживания и высушивания использовали CMC, приготовленные со средой высушивания, содержащей сухое обезжиренное молоко.

В соответствии с требованиями фармакопейной статьи препарат должен представлять собой лиофилизированную смесь бактерий В. зиЫШя 3 и Я \icheniformis 31. Эксперименты по выбору режимов замораживания и высушивания стабилизированной микробной суспензии проводили на установках МАСС-5 и МАСС-25.

В опытах по изучению влияния скорости предварительного замораживания на жизнеспособность бактерий В. зиЫШэ 3 и В. \ichen\formis 31 после

лиофилизации испытывали замораживание со скоростью 1, 5 и 10°С в минуту. Выбор скорости определялся ее практической достижимостью для типового оснащения сушильными установками экспериментально-приозводственной базы участка высушивания. Данные скорости замораживания считаются медленными и способствуют формированию определенной кристаллической структуры в замороженных образцах, не препятствующей удалению водяных паров при сублимации. Влияние скорости замораживания оценивалось после последующего высушивания образцов препарата. Высушивание проводили в одинаковых условиях. Данные проведенных исследований представлены в табл. 5.

Таблица 5 - Влияние скорости замораживания на выживаемость бактерий

В. йиЬаПх 3 и В. ИсИгп1[отт 31 после лиофилизации

Наименование микроорганизма Скорость замораживания, °С.мин"'

1 5 10

БК, млрд. кл.см"3 Выживаемость, % БК, млрд. кл.см"3 Выживаемость, % БК, млрд. кл.см"3 Выживаемость, %

Исходная После сушки Исходная После сушки Исходная После сушки

В. зиЫШ$ 3 8,8±1,0 8,7+0,3 98,8 7,2+0,8 7,15+1,2 99,3 1,7+0,1 1,68+0,1 98,8

В. НсИет/огт15 31 Примечание: привс живан 2,6+0,1 •дены сред ия. 2,4+1,0 нне даш 92,3 ше пот 2,9+0,8 оем сери 2,7+1,0 ям препар 93,1 ата для 1,9+0,4 саждой с 1,8+0,3 корости з< 94,7 мора-

В проведенных опытах предварительное замораживание со скоростью 1, 5 и 10 °С в минуту не влияло на выживаемость бактерий после высушивания. Это свидетельствует о высокой криорезистентности бактерий В. зиЫШз 3 и В. ИсЬеп1[отт 31 и незначительном характере криовоздействия.

Определение эвтектических зон показало, что температура предварительного замораживания должна быть не выше минус 34°С. Выдержка при данной температуре в течение 6 часов обеспечивала полное затвердевание стабилизированной микробной суспензии. Экспериментально был выбран режим подвода тепла на участке сублимации. При максимальной загрузке сублиматора это достигалось нагревом полок до минус 18°С в течение (20+2) часов. Для удаления оставшейся влаги до уровня не более 3,5% производили нагрев материала до максимальной температуры 30°С и выдерживали при этой температуре в течение (10+2) часов. Лабораторные исследования показали, что данная температура не оказывала значительного инактивирующего воздействия на культуры В. эиЫШз 3 и В. Искет]Ъгти 31 в течение продолжительного времени.

По окончании высушивания ампулы и флаконы заполняли очищенным воздухом или аргоном. Таким образом, был выбран режим замораживания и сублимационного высушивания на установках МАСС-5 и МАСС-25 (рис. 2), в соответствии с которым были приготовлены установочные партии препарата биоспорин (табл. 6). По всем изучаемым свойствам биоспорин соответствует требованиям фармакопейной статьи.

1Л

<4 Ш N Я «" го Л

«- « О) «•>

М СУ (М ГЧ С* 1*>--

* ва ь а

а

- - темпергпура поверхности полки; —О- - температура материала

Рисунок 2 - Режим сублимационного высушивания биоспорина Таким образом, на основании проведенных исследований рекомендован следующий режим сублимационного высушивания препарата биоспорина в ампулах (флаконах):

температура замораживания,°С выдержка, ч

температура материала в период сублимации, °С максимальная температура материала, °С выдержка при максимальной температуре, ч давление в сублиматоре, Па температура десублиматора, °С

минус 34, не выше; 6;

минус (28+2); (30+3); (10+2); 30, не более; минус 40, не выше.

Таблица 6 - Показатели качества биоспорина во флаконах

Наименование показателей Требования ВФС Серии препарата биоспорина

однодоз-ный пятидоз-ный десятидоз-ный

Внешний вид Пористая масса, цвет которой варьирует от светло-серого до эежевого Пористая масса светло-серого цвета Пористая масса светло-серого цвета Пористая масса светло-серого цвета

Количество жизнеспособных бацилл в дозе: В. subtilis 3 В. licheniformis 31 (1-8).109 (0,1-2,0).109 5,1+0,7 1,7+0,3 4,9+0,7 1,6+0,3 5,7+0,9 1,7±0,4

Растворимость, мин 2, не более 1,0 1,0 1,0

pH, ед.рН 6,5+1,0 6,2+0,3 6,1+0,2 6,2+0,2

Массовая доля влаги, % 3,5; не более 2,4+0,4 2,1+0,2 2,2+0,4

Контаминация посторонними бактериями Не допускается Отсутствует Отсутствует Отсутствует

Антагонистическая активность препарата (зона угнетения роста тест-культуры), мм Shigella sonnei Salmonella typhi-murium Staphyl ococcus aureus Candida albicans 10, не менее 10, не менее 15, не менее 12, не менее 12+1 12+1 28+3 27+4 13+2 13+1 33+2 27+3 17+1 13+1 31+2 34+3

Безвредность для белых мышей Примечание: привел Безвреден ены данные по тре Безвреден м сериям биос Безвреден порина Безвреден

Разработанная технология концентрирования и высушивания глубинных бактериальных культур В. зиЫШз 3 и В. Ис1геп$огт'и 31 обеспечивают возможность выпуска пробиотика с характеристиками, отвечающими требованиям ВФС 42-366ВС-92. Препарат при этом не уступает по своим свойствам и характеристикам биоспорину, производимому на Днепропетровском хим-фармзаводе на основе выращенных поверхностным методом бактерий.

-152.2.2. Испытания препарата биоспорин, приготовленного по разработанной технологии

Доклиническая оценка безопасности производственных штаммов и препаратов была проведена в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича в соответствии с руководящими документами РД 42-28-8-89 (доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения).

Проведенные исследования показали, что биоспорин и производственные штаммы не вызывают у белых мышей во внутренних органах и ЦНС изменений, указывающих на наличие токсического действия при введении доз, даже значительно превышающих человеческие. Важно отметить, что для биоспорина и производственных штаммов не удалось установить LD50: препарат в дозах, значительно превышающих дозы для человека (более 10 млрд. клеток), не вызывал гибели животных.

Согласно общепринятым правилам, при изменении технологии изготовления препарата должна быть подтверждена его эффективность в кинических условиях.

Оценка лечебно-профилактической эффективности биоспорина проводилась по Программе, утвержденной заместителем председателя Федеральной комиссии по медицинским иммунобиологическим препаратам и дезинфекционным средствам совместно сотрудниками НИИ Военной медицины МО РФ и Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ.

Согласно утвержденной Программе профилактическая эффективность биоспорина изучена на 400 практически здоровых людях. Препарат принимали per os по схеме: 1 и 2 дозы через день в течение 6 суток.

Профилактическую эффективность оценивали на основании сравнения показателей заболеваемости в испытуемых группах в течение 2-х месяцев от начала приема препаратов.

Анализ полученных данных показал, что биоспорин, полученный по новой технологии, и коммерческий препараг в одинаковой степени защищали чюдей от заболевания ОРВИ, ангиной, ОКИ в течение 1 месяца независимо от зводимой дозы: полное отсутствие заболевших в опытных группах против 610% в контрольных группах. Через 2 мес. после окончания курса профилакти-1еского применения испытуемых препаратов заболеваемость перечисленными гнфекциями регистрировалась как в опытных, так и в контрольных группах табл. 7).

Таблица 7 — Изучение профилактической эффективности биоспорина

Вид пре- Схема [Соличесг- Срок Абсолютное число забо- Относи-

парата при- 50 обсле- наблю- леваний тельное

мене- цуемых дения, ОКИ ОРВИ анги- число

ния человек мес. ной И.З., %

Биоспо- 1 100 1 0 0 0 0

рин (опытный) 2 3 5 5 13

2 100 1 0 0 0 0

2 1 3 1 5

Биоспорин 2 100 1 0 0 0 0

(коммер- 2 3 3 1 7

ческий)

Плацебо 1 100 1 3 3 4 10

2 7 9 8 24

2 100 1 3 2 4 9

2 8 7 8 23

Контроль 1 200 1 4 4 4 6

2 5 6 6 9

Одновременно с профилактической эффективностью изучали влияние биоспорина на неспецифическое звено иммуногенеза (рис. 3 и табл. 8).

<=( 0.55 и к

5 0.5 X п о

5 °'45

£ 0.4 о О

£ 0,35

а <

0,25'

0,21

кИк

V /*

5 10 15 2

•миелопероксидаза, биоспорин -Е, схема № 1 •миелопероксидаза, биоспорин - Е, схема № 2 й миелопероксидаза, биоспорин - Д. схема № 2 - - 5 - контроль (плацебо), схема № 1

Рисунок 3 - Влияние перорального применения биоспорина на секрецию гранулярными лейкоцитами крови человека миелопероксидаз

25 зо

Продолжительность, сут.

Состояние иммунной системы оценивалось по следующим критериям:

• поглотительная функция фагоцитов крови;

• уровень в лейкоцитах крови миелопероксидаз, неспецифических эстераз;

• концентрация в сыворотке крови лизоцима, бета-лизинов и интерферона.

Таблица 8 - Влияние профилактического применения биоспорина на

фагоцитарную активность и секреторную функцию _ гранулярных лейкоцитов периферической крови_

Схема применения Срок обследования, сутки Индекс переваривания, усл. ед. Величина исследованных параметров X ± ш

НЭ, усл. ед Бета-лизины, % Лизоцим, мкг-см"3 Интерферон, ед -см"3

1 доза через день(6 дней) Фон 7 14 28 1,12 ±0,12 1,82 ±0,14* 1,86 ±0,28* 1,40 ±0,22 1.18 ±0,03 1,33 ±0,04* 1,45 ±0,04* 1.19 ± 0,05 77,8 ± 14,2 100,0 ± 10,8 100,0± 11,2 96,8 ± 11,4 6,75 ±2,12 8,12 ±2,86 10,4 ± 1,12* 7,25 ± 1,83 6,0 ± 1,7 8,3 ± 1,2 9,9 ± 2,2 9,8 ±2,1

2 дозы через день(6 дней) Фон 7 14 28 1,18 ±0,14 2,02 ± 0,34* 2,12 ±0,36* 1,65 ±0,26* 1,22 ±0,04 1,36 ±0,04* 1,55 ±0,05* 1,10 ±0,09 80,8 ± 13,6 100,0 ± 11,5 95,6 ± 10,8 95,4 ± 11,7 5,45 ±2,21 6,25 ± 1,88 9,75 ±0,75* 7,75 ±1,13 4,4 ± 0,7 7,0 ± 1,3 8,6 ± 1,1 9,3 ± 2,0

1лацебо: доза через день Фон 7 14 28 1,18 ± 0,12 1.25 ±0,14 1,23 ±0,18 1.26 ±0,12 1,18 ±0,03 1,23 ±0,04 1,23 ±0,06 1,19± 0,07 82,0 ±10,1 87,3 ±11,4 85,8 ±10,6 90,2 ± 12,7 5,15 ± 1,82 5,25 ± 1,22 6,28 ±1,73 6,75 ±1,75 5,0 ±2,8 5,4 ±3,6 5,2 ±3,1 5,6 ±2,0

1римечания: 1 Знаком "*" обозначены достоверные различия показателей с контролем при р<0,05 2 Каждая из групп испытуемых состояла из 20 здоровых человек в возрасте 18-20 лег.

Лечебную эффективность испытуемых серий биоспорина изучали на юльных с бактериологически подтвержденной дизентерией Флекснера 2а (по 10 больных в группах, принимавших новый или коммерческий биоспорин, и !6 больных в контрольной группе, которым проводили общепринятую тера-шю). Оба варианта препарата назначали по 2 дозы 2 раза в сутки в течение 8 ¡уток. Лечебную эффективность оценивали по клинике течения заболевания, ю бактериологическому контролю и влиянию препаратов на неспецифическое вено иммуногенеза. Под влиянием биоспорина у больных через 1-2 суток от гачала приема обоих препаратов уменьшились объективные жалобы, через 2-3 :уток исчезли боли в кишечнике, нормализовалась частота стула, улучшился шпетит. В контрольной группе существенных изменений в эти сроки не на-¡людали.

На основании бактериологического контроля было выявлено, что к моменту выписки (12-16 сутки) полной нормализации микрофлоры не наблюдаюсь у больных ни в опытной, ни в контрольной группах. Тем не менее, у юльных опытной группы показатели содержания бифидобактерий, лактобак-ерий, энтерококков, бактероидов и эшерихий коли к концу лечения были на -2 порядка выше по сравнению с больными контрольной группы.

Таким образом, результаты исследования свидетельствовали о высокой эффективности препарата биоспорин, изготовленного по разработанной технологии.

Также изучалась лечебная и профилактическая эффективность при диареи у телят и поросят. Исследования проводились совместно с ЦЛБМ при Московской сельскохозяйственной академии в совхозе имени "1 Мая" Балаши-хинского района Московской области и репродуктивного отделения агрофирмы "Белая дача" Люберецкого района Московской обл., а также сотрудниками лаборатории бактерийных инфекций Всероссийского НИВИ. Препарат биоспорин, приготовленный по разработанной технологии, в опытных группах телят и поросят показал высокую профилактическую и терапевтическую эффективность.

Применение препарата биоспорина обеспечивает 80-100% эффективность у телят в профилактической группе в дозе 40-50 млрд. клеток при двукратном использовании препарата в течение 6 дней подряд; доза 50-60 млрд. клеток дольным диареей телятам обеспечивала 100% лечебную эффективность.

Для профилактики диареи у поросят-сосунов достаточно применения биоспорина однократно в течение 3 дней подряд в концентрации 5 млрд. клеток, у поросят-отьемышей в дозе 12,5 млрд. клеток при том же режиме. При лечении диареи у поросят препарат биоспорин следует использовать 2 раза в день в течение 6 дней подряд в дозе 12,5-25 млрд. клеток, при этом достигается профилактическая эффективность 90-100% и лечебная - 100%.

Необходимо отметить, что диарея телят и поросят после применения биоспорина протекали доброкачественно, гибели животных не отмечено по сравнению с контрольными животными.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение, что новый препарат биоспорин, полученный по новой технологии эффективен и в ветеринарной практике при профилактике и лечении диарей молодняка сельскохозяйственных животных.

По результатам исследования разработаны технические условия на производство биоспорина ветеринарного.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология концентрирования и высушивания глубинных культур В.яиЫШя 3 и В. Искеп\[опт$ 31 в производстве биоспорина. 2. Определены основные требования к нативной культуре, подаваемой на концентрирование, и режим сепарирования при получении концентрированной микробной суспензии: для концентрирования необходимо использовать культуру с температурой (12±3)°С, скорость ее подачи должна составлять (30+5) дм3«ч"'.

-193. Разработана и внедрена новая среда высушивания, включающая в ;ебя сухое обезжиренное молоко из расчета 0,003 г на одну дозу препарата 5иоспорин. Включение в состав среды высушивания сухого обезжиренного иолока положительно сказывается на выживаемости дегидратируемых бакте-эий, снижении технологического брака по внешнему виду после сублимаци-знного высушивания с (30-35)% до менее 5% и не ухудшает качества готового эиоспорина.

4. Определены эвтектические характеристики стабилизированной никробной суспензии на основе глубинных культур В. яиЫШх 3 и В. '¡сИеп1/огт1х 31 (температура эвтектики равна минус (32±2)°С). На основании юлученных данных выбран режим замораживания суспензии до температуры к выше минус 34°С с выдержкой при данной температуре 6 часов. При суб-шмации температура материала равна минус (28+2)°С, максимальная темпе-)атура материала - не выше 30°С, давление системы - не выше ЗОПа, температура конденсации - не выше минус 40°С.

5. Биоспорин, приготовленный по разработанной технологии, облада-:т высокой (в 100% случаев) лечебно-профилактической эффективностью при >стрых кишечных инфекциях и дисбактериозах у людей.

6. Применение препарата биоспорин в 80-100 % обеспечивает поло-кительный эффект при профилактике и лечении диареи телят, и в 90-100 % -три профилактике и лечении диареи поросят. При этом лечебно-фофилактическая доза для телят составляет от 40 до 60 млрд. клеток, для по-)осят - от 12,5 до 25 млрд. клеток.

7. Результаты проведенных исследований реализованы в регламенте фоизводства №580-96, фармакопейной статье ФС 42-3476-98 и Технических 'словиях на биоспорин ветеринарный.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При производстве препарата биоспорин из бактерий В. впЫНи 3 и 1.НсЬет/огт1з 31, полученных методом глубинного культивирования, реко-1ендуется применять стадии концентрирования, подготовки культур к обез-оживанию и лиофилизации по разработанной технологии;

2. Рекомендуется использовать препарат биоспорин, приготовленный по сработанной технологии, для профилактики и лечения острых кишечных [нфекций и дисбактериозов у людей, а также для профилактики и лечения ;иарей у сельскохозяйственных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Разработка экспериментально-производственной технологии выпуска нового лечебно-профилактического препарата биоспорин. Отчет о НИР./ ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководители В.А. Филин, И.А. Поберий. - 1995. - Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-64ДСП.

2. А.О. Смирнов, А.Т. Харечко, Н.В. Садовой, Н.В. Литусов, В.А. Филин, И.А. Поберий, А.Н. Доронин, С.А. Пылаев, A.C. Туманов. Разработка технологии получения таблеточной формы препарата биоспорин// Биотехнология,- 1996- №11.

3. А.Т. Харечко, А.Н. Доронин, И.А. Поберий, В.А. Филин, А.О. Смирнов, С.А. Пылаев. Разработка технологии и создание аппара-турно-технологической линии по выпуску биоспорина в различных лекарственных формах в Центре ВТП БЗ. / Сборник материалов научно-практической конференции "Перспективы использования эубиотика "Биоспорин" в практике здравоохранения и военно-медицинской службы". - Екатеринбург, 1997.

4. А.Т. Харечко, И.А. Поберий, Н.В. Литусов, А.О. Смирнов, С.А. Пылаев, Н.В. Федорова, В.И. Сабурова. Разработка отечественной технологии получения биоспорина и организация его серийного выпуска в различных лекарственных формах. / Материалы юбилейной конференции посвященной 70-летию НИИМ МО РФ "Диагностика и лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария". - Киров, 1998.

5. Разработка экспериментально-производственной технологии выпуска нового препарата биоспорин в различных видах готовых лекарственных форм. Отчет о НИР. / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководители Н.В. Литусов, В.А. Филин. - 1998. - Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-272 ДСП.

6. Усовершенствование процессов приготовления биоспорина в различных лекарственных формах в условиях его серийного выпуска и увеличение мощности производства. Отчет о НИР. / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководители Н.В. Литусов, В.А. Филин. - 1998. -Арх. ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-267 ДСП.