Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние физико-механических факторов на эффективность гидролиза сахаров и интенсивность сбраживания крахмалистого и лигноцеллюлозного сырья

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Влияние физико-механических факторов на эффективность гидролиза сахаров и интенсивность сбраживания крахмалистого и лигноцеллюлозного сырья"

на правах рукописи

ЗАХАРКИН ДЕНИС ОЛЕГОВИЧ

Влияние физико-механических факторов на эффективность гидролиза Сахаров и интенсивность сбраживания крахмалистого и лигноцеллюлозного сырья

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 НОЯ 2014

Саратов - 2014

005554316

005554316

Работа выполнена на базе кафедры биотехнологии, биоинженерии и биохимии и научно-образовательного центра «Нанобиотехнологии» факультета биотехнологии и биологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва»

Научный руководитель: Ревин Виктор Васильевич

доктор биологических наук, профессор

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет имени Н. П. Огарёва», факультет биотехнологии и биологии, декан

Официальные оппоненты: Королева Ольга Владимировна

доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, лаборатория молекулярных основ биотрансформаций, заведующая лабораторией

Синицын Аркадий Пантелеймонович

доктор химических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», химический факультет, кафедра химической энзимологии, лаборатория физико-химии ферментативной трансформации полимеров, заведующий лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет», г. Казань

Защита состоится «24» декабря 2014 г. в 11:00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук по адресу: 410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13. Тел./факс (8452)97-03-27, эл. почта secret@ibppm.sgu.ru

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ. Диссертация и автореферат диссертации размещены на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnw-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан « М » СК.ТЯ0Ь&. 2014 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета Д 002.146.01

доктор биологических наук Л. П. Антонюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Растительная биомасса представляет потенциальный интерес как дешевый возобновляемый источник сырья для получения этанола (Хвалин и др., 2006; Maryana et al., 2009). Существующая на сегодняшний день классическая схема производства этилового спирта из крахмалистого сырья характеризуется рядом продолжительных ресурсо- и энергоемких стадий. Это связанно с необходимостью перевода крахмала в растворимое и доступное для действия ферментов состояние (Яровенко, 2002; Ковалевский, 2006; Bai et al., 2008). В процессах биоконверсии лигноцеллюлозы стадией, сдерживающей внедрение данной технологии в производство, также является ферментативный гидролиз целлюлозы до глюкозы с последующим сбраживанием до этанола (Андреева, 2010; Morozova et al., 2010). Природная древесина и другие виды лигноцеллюлозы устойчивы к действию ферментов из-за кристаллической структуры целлюлозы, а также наличия в их составе лигнина и гемицеллюлоз, затрудняющих доступ ферментов к поверхности целлюлозных волокон (Teramoto et al., 2008; Taherzadeh et al., 2008; Болтов-ский, 2009; Reijnders et al., 2009).

В связи с вышеизложенным в последние годы интенсивно изучаются методы предварительного глубокого физико-механического диспергирования растительного сырья, что позволяет разрушить не только крупные клеточные конгломераты, но и вызвать частичную деградацию растительных полимеров до олигомеров, а при некоторых условиях - и мономеров (Wu et ai, 2007; Edwards et al., 2008). Полученные ультрадисперсные частицы становятся доступными для разрушения ферментами без дополнительных воздействий физическими или химическими факторами.

Целью работы было выявление влияния механоактивации, а также физических и биологических факторов на эффективность трансформации зернового и лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние способа, продолжительности и интенсивности механического воздействия на эффективность диспергирования растительного сырья и его химический состав.

2. Провести гидролиз ультрадисперсного сырья с использованием различных типов ферментов.

3. Проанализировать влияние физических факторов на биохимический состав и эффективность ферментативного гидролиза ультрадисперсного сырья.

4. Исследовать динамику потребления отдельных углеводов различными расами дрожжей Saccharomyces cerevisiae при культивировании на сусле из крахмалистого и лигноцеллюлозного сырья.

5. Выявить зависимость между способом предобработки сырья, эффективностью его гидролиза и сбраживанием различными расами дрожжей.

Научная новизна работы. Впервые разработаны методы комплексной физико-механической обработки растительного сырья с получением ультрадисперсных частиц размером не более 100 мкм. Доказано, что такое измельчение позволяет отказаться от энергоемких стадий разваривания (в случае крахмалистого сырья) или кислотного гидролиза (в случае лигноцеллюлозы). Показана возможность повышения эффективности ферментативного гидролиза и последующего сбраживания при совместном воздействии на сырье физико-механических, биохимических и биологических факторов.

Практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют повысить эффективность существующих технологических схем производства этилового спирта на стадии подготовки крахмалистого и лигноцеллюлозного сырья. Режим двустадийного измельчения сырья, исключение кислотного гидролиза и разваривания сырья позволит улучшить экологическую ситуацию на производстве на фоне снижения себестоимости продукции. На предлагаемую разработку подана заявка на патент РФ «Способ получения спирта» (ФИПС № 2013137026/10, авторы Ревин В.В., Атыкян Н.А., Захаркин Д.О.).

Связь работы с научными программами. Представленные результаты были получены в ходе исследований, проведенных в рамках научно-практических работ при поддержке: Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере У.М.Н.И.К. 2010-11 «Исследование факторов, влияющих на выход этилового спирта, получаемого при сбраживании из ультрадисперсного зернового сырья» (проект 12659 ГК 9580р/ 14210 от 01.08.2011), заказа-наряда Мин-обрнауки РФ г/б НИР 53/6-11 «Исследование механизмов ферментативного гидролиза и сбраживания наноразмерных частиц растительного сырья», гранта Правительства Республики Мордовия г/б НИР 53/12-11 «Разработка методов производства биоэтанола на основе наноструктурированной растительной биомассы».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены для обсуждения на Огаревских чтениях в Мордовском государственном университете им. Н.П. Огарева (Саранск, 2009-2013); на научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2009-2014); Международной научно-практической конференции «ЕвразияБио-2010», Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010), Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012), Международной научной конференции «European Biotechnology Congress 2014» (Лечче, Италия, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, в числе которых 3 статьи в российских научных журналах, рекомендованных ВАК.

Положения, выносимые на защиту.

1. Комбинирование физических и механических факторов воздействия на стадии предварительной подготовки сырья позволяет диспергировать растительные субстраты до микро- и наноразмерных частиц.

2. Ультрамалые размеры растительного сырья позволяют повысить эффективность ферментативного гидролиза и исключить стадию предварительного разваривания крахмалистого сырья или кислотного гидролиза лигноцеллюлозы, сократить время брожения.

3. Эффективность биоконверсии ультрадиспергированного сырья в этиловый спирт выше, чем при сбраживании измельченных по традиционной технологии субстратов (их частицы имеют размеры более 100 мкм).

4. Снижение энергозатрат на подготовку и гидролиз сырья, а также увеличение выхода спирта при сокращении времени брожения позволяет снизить себестоимость готовой продукции на 6-10 %.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 166 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, вы-

водов, списка использованной литературы и 10 приложений. Диссертационная работа включает 45 рисунков и 32 таблицы. Список цитируемой литературы включает 286 источников, в том числе 203 на иностранных языках.

Благодарность. Выражаю особую благодарность и признательность научному руководителю доктору биологических наук Ревину Виктору Васильевичу за внимание и помощь в подготовке диссертации, кандидату биологических наук Атыкян Нелли Альбертовне и всему коллективу кафедры биотехнологии, биоинженерии и биохимии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарёва за поддержку при выполнении диссертационного исследования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Глава 1. Обзор литературы

В главе представлены общая характеристика полисахаридов сырья и ферментов, используемых для их гидролиза, а также рассмотрены продуценты этанола и механизмы спиртового брожения. Приведены данные об особенностях строения природных полисахаридов и их взаимосвязи с остальными структурами сырья. Рассмотрены особенности строения ферментов и механизмы гидролиза полисахаридов целлюлозо- или крахмалсодержащего сырья. Представлен обзор работ, посвященных спиртовым дрожжам, рассматриваются их строение, свойства, механизмы действия основных ферментов, входящих в их состав, а также их роль в процессах получения этилового спирта. Рассмотрены микроорганизмы, имеющие потенциальное значение для получения биоэтанола из различных видов сырья. Приведены современные представления об особенностях химизма процесса брожения. Проанализированы существующие и перспективные технологии производства этанола.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Объекты исследования - зерновое и лигноцеллюлозное сырье, измельченное на ножевых мельницах и/или варио-планетарной шаровой мельнице РМ100 (РМ400) («Retsch», Германия) до ультрадисперсных частиц, а также сусло, приготовленное на их основе, и полученные из него бражка и спирт-сырец.

Подготовка сырья. Подготовка сырья заключалась в его очистке от сопутствующих примесей и разделении на фракции (по размеру). При обработке лигно-целлюлозного сырья отделяли сучки и крупную щепу для повторного дробления. Отделяли щуплые и невызревшие зерна. Анализировали влажность и содержание гидролизуемых веществ. Осуществляли усреднение влажности избыточно влажного сырья методом конвекционного нагрева в вентилируемых сухожаровых шкафах.

Помол сырья. Помол осуществляли по одностадийной и двустадийной схеме. Предварительный (грубый) помол зернового и лигноцеллюлозного сырья осуществляли с помощью ножевых мельниц различной конструкции. Ультрадисперсный помол осуществляли на варио-планетарной шаровой мельнице РМ100 (в ряде

экспериментов - РМ400). Измельчение проводили помолочными элементами при частоте вращения помолочного тела < 600 или < 400 об"'.

Предобработка сырья. В работе рассмотрены 3 различных варианта предобработки лигноцеллюлозного сырья: гамма-облучение, тепловая и УЗ-обработка. Изучено влияние облучения опилок различной степени дисперсности гамма-излучением дозой до 2 кГр.

Проведен ряд исследований по предобработке ультрадисперсных частиц опилок ультразвуком. Для этого использовались следующие приборы:

1. УЗ-установка UM-4 - выходная мощность 40 Вт, рабочая частота 25 кГц, продолжительность обработки до 60 мин. Изучено влияние излучения на эффективность последующего гидролиза, исследована долговременная обработка.

2. Установка УЗГ17-2,0/22 - выходная мощность до 2,0 кВт, частота механического резонанса 22±1,65 кГц, продолжительность обработки до 10 мин. Изучено действие рециркуляционной обработки на структуру сырья и эффективность его последующего гидролиза, проведено моделирование предобработки в производственных условиях.

3. Установка УЗГ2-4М - выходная мощность до 6 кВт, в эксперименте 4,5±0,5 кВт, частота резонанса 16,8 - 19,2/20,5 - 23,5 кГц, продолжительность обработки до 25 мин. Изучено влияние УЗ предобработки на эффективность гидролиза.

В качестве контроля использовались ультрадисперсные опилки, не подвергнутые предварительной обработке.

Приготовление сусла. В зависимости от постановки эксперимента осахари-вание сырья осуществляли в различных условиях. Для крахмалистого сырья норма внесения ферментных препаратов составляла: амилаза - 1,0-2,0 ед. акт/г крахмала; глюкоамилаза - 5,5-6,2 ед. акт/г крахмала; целлюлаза - 0,075-0,15 ед. акт/г сырья вне зависимости от температурных условий. Продолжительность гидролиза была до 2 часов при последовательном внесении ферментов, до 60 мин - при одновременном.

При гидролизе лигноцеллюлозного сырья норма внесения составляла: для целлюлаз - до 225 ед. акт/г сырья, целлобиаз - 100 ед. акт/г сырья. Продолжительность гидролиза до 48 часов.

Сбраживание сусла и отгонка спирта. Сбраживание сусла сухими дрожжами S. cerevisiae, вносимыми в количестве 0,1% от объема замеса. Температура брожения составляла: для расы Angel- 28°С, для расы Ethanol Red- 32°С. Сусло обогащалось нитратом калия (для расы Angel) или нитратом аммония (для расы Ethanol Red), которые вносились в количестве 0,1 г/л. Сбраживание производилось в течение 66-72 часов для сусла из крахмалистого сырья и 72-96 часов для лигноцеллюлозного. Отгонка спирта производилась по ГОСТ 3639-79.

Методы анализа. В работе применены следующие методы анализа.

Определение условной крахмалистости по ГОСТ Р 52934 - 2008. Определение степени осахаривания сусла по йодной пробе (Eblinger, 2009). Определение концентрации сухих веществ сусла (Рухлядева и др., 1979; Eblinger, 2009). Определение размеров ультрадисперсных частиц (УДЧ) методом лазерно-интерференционной микроскопии (НИМ) (Brazhe et al., 2009). Метод анализа размера частиц на SALD-3101(«Shimadzu», Япония) (Webb, 2000). Микроскопирование на сканирующем электронном микроскопе (SEM) (Zhang et al., 2006). Определение легкогидролизуе-мых полисахаридов (Костюкевич, 2010). Определение Сахаров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Сычев, 2013) - использованы хроматограф LC20 Prominence («Shimadzu», Япония) (анализ moho-, ди- и трисахаридов) с

б

рефрактометрическим детектором RID 1 OA и колонками «SupelcoSilPb» и «Supel-coGel LC-NH2» и хроматограф 1100 («AgilentTechnologies», США) (анализ декстринов) с электрохимическим детектором ESA Coulochem III 5040 и колонкой «CarboPak РА 100». Определение восстанавливающих Сахаров {по Шомоди-Нельсону) (ГОСТ 9.801 - 82, Dotsenko et al., 2012). Антроновый метод определения Сахаров (по Моррису - Роэ) (ГОСТ Р 51135 - 98). Определение содержания спирта в бражке (ГОСТ 3639 - 79). Количественное определение Сахаров по реакции с пикриновой кислотой (по Крезелиусу - Зейферту) (Kadimaliev et al., 2004). Определение Сахаров глюкозоксидазно-пероксидазным методом (по методикам к наборам реактивов «Фотоглюкоза» и «Глюкоза-ФС»). Метод определения целлюлозы в опилках (Костюкевич, 2010). Определялась амилолитическая, глюкоамилазная и целлюлазная (по КМЦ) активность использованных ферментов.

Полученные экспериментальные данные подвергали статистической обработке с использованием электронных таблиц Microsoft Excel 2013 и пакета программ STATPLUS и Statistica 8. Сравнение вариантов опытов проводили при 5% уровне значимости по /-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Изучение влияния способа предобработки крахмалистого сырья на эффективность его ферментативного гидролиза

3.1. Влияние продолжительности физико-механической обработки зернового сырья на эффективность его измельчения и распределение частиц по размерам в ультрадисперсной фракции

Рассмотрено влияние механических и физических факторов на эффективность разрушения отдельных компонентов крахмалистого сырья на примере озимой пшеницы. Образцы различной степени измельчения анализировались методами ЛИМ, лазерной дифракции (Рисунок 1) и сканирующей электронной микроскопии.

Рисунок 1

0 5 1 5 10 50 100 ?ии шик лиии

: Размер частиц (мкм)

- Диаграммы анализа размера частиц, полученных при различных видах измельчения пшеницы

Как видно из рисунка 1, при одностадийном грубом помоле основная фракция частиц имеет размеры от 20 до 120 мкм, а при двустадийном - от 400 нм до 50 мкм. При этом с увеличением степени помола начинаются процессы агрегирования с образованием более крупных структур из ультраизмельченных частиц. Такие агрегаты при последующем суспендировании в водных растворах образуют довольно устойчивые золи, что позволяет осуществлять более эффективный процесс ферментативного гидролиза.

Таким образом, для получения ультрадисперсных частиц наиболее эффективна двустадийная схема помола.

3.2. Влияние продолжительности механико-ферментативной обработки зернового сырья на эффективность его гидролиза мезофильными мультиэнзимными препаратами

На этом этапе работы проведено сравнение процессов ферментативного гидролиза крахмала различных видов злаковых культур. Как видно из таблицы 1, выявлено, что, несмотря на разницу в условной крахмалистое™ сырья, крахмал пшеницы за единицу времени гидролизуется эффективнее по сравнению с рожью и ячменем.

Таблица 1 - Сравнение динамики накопления глюкозы при ферментативном гидролизе сусла из различных источников крахмалистого сырья

Источник сырья Накопление глюкозы в зависимости от продолжительности помола, мг/мл

10 мин 20 мин 30 мин

Пшеница 64,3±2,9 82,5±3,8 87,6±3,8

Рожь 55,2±2,7 69,2±3,1 72,1 ±3,4

Ячмень 62,1±3,0 76,8±3,5 81,4±3,9

Далее мы исследовали изменение формы частиц в процессе ферментативного гидролиза. На рисунке 2а показано, что при суспендировании частиц в водной среде в течение 30 мин при температуре > 60°С происходило их набухание. Анализ на ЛИМ, представленный на рисунке 26 показал, что добавление в полученную суспензию амилолитических ферментов приводило за 30-60 мин к уменьшению размера частиц за счет гидролиза крахмала. Однако полного их растворения при действии только амилолитических ферментов не происходило. Поэтому оставшиеся частицы в следующем варианте опыта подвергали обработке протеазами и целлю-лазами, что, как видно из рисунков 2в,г, привело к дальнейшему уменьшению размера частиц. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективном гидролизе ультрадисперсных частиц зернового сырья при низкотемпературных условиях.

На следующем этапе исследовалось влияние степени измельчения сырья на эффективность ферментативного гидролиза крахмала мезофильными ферментами при 60°С. Выявлено, что с увеличением степени помола сырья в полученном из него сусле возрастает количество мальтодекстринов, мальтозы и глюкозы. Однако следует отметить, что сверхинтенсивное разрушение сырья в течение длительного времени (в эксперименте - 20 мин помола при 600 об"1) вызывает снижение выхода глюкозы в процессе гидролиза.

в г

а- 20 мин нахождения в буфере при 60°С; 6-60 мин гидролиза амилолитическими ферментами; в - 60 мин гидролиза амилолитическими и протеолитическими ферментами; г - 60 мин гидролиза амилолитическими и целлюлолитическими ферментами

Рисунок 2 - Зх-мерные модели ультрадисперсных частиц зернового материала, измельченного в течение 20 мин при 600 об"1 на РМ100 после помола на ЛЗМ-1М 300 сек

З.З.Влияние продолжительности механико-ферментативного воздействия и условий обработки зернового сырья на эффективность его гидролиза термостабильными мультиэнзимными препаратами

Для изучения влияния продолжительности механической обработки на эффективность гидролиза сырья в условиях варьирования температуры была проведена серия опытов с термостабильными амилазами. Использовалось ступенчатое внесение ферментов с поэтапным понижением температуры от 100 до 60 °С. Как видно из рисунка 3, при равной степени измельчения и ступенчатом внесении ферментов наиболее эффективно гидролизуется крахмал после предварительной водно-тепловой обработки. По эффективности этот режим сходен с высокотемпературным амилолизом без разваривания, но из-за меньшей доступности субстрата и различий в реологических свойствах замеса, накапливается меньшее количество глюкозы.

Далее был поставлен ряд экспериментов по изучению влияния степени дисперсности сырья на эффективность гидролиза крахмала при одновременном и последовательном внесении термостабильных мультиферментных комплексов. Выявили, что динамика накопления глюкозы аналогична в обоих вариантах, но конечная ее концентрация была выше при одновременном внесении энзимных комплек-

9

____

сов по сравнению с последовательным. Это связано с различиями в механизмах разрушения углеводов сырья: поскольку лимитировалось количество вносимой глюкоамилазы до 5,5-6,2 ед. акт/г крахмала, то, по-видимому, этого количества оказалось недостаточно, чтобы расщепить все олигосахара, образовавшиеся под действием термостабильной амилазы на первом этапе. С другой стороны, активность одиночной амилазы снижалась по мере накопления в сусле мальтозы, чего не происходит при гидролизе сырья комплексом ферментов.

мгУ

120 100 80 60 40 20 0

Рисунок 3 - Влияние температурного режима водно-ферментативной обработки на эффективность высвобождения продуктов гидролиза крахмала при последовательном внесении термостабильных ферментов

Наибольшим выходом глюкозы характеризовалась проба с двустадийным помолом (домол на варио-планетарной мельнице при 400 об"1) по сравнению с пробами с одностадийным помолом и помолом большей интенсивности. Разница в накоплении глюкозы при гидролизе образцов с двустадийным помолом и одностадийным измельчением на ножевой мельнице составляет примерно 31%.

Дополнительно проведено исследование содержания в полученном сусле водорастворимых мальтодекстринов, состоящих из 2-14 остатков глюкозы. Выявлено, что в сусле из сырья с высокой степенью измельчения по сравнению с грубым помолом накапливаются преимущественно короткоцепочечные мальтодекстрины, содержащие от 2 до 5 остатков глюкозы.

Таким образом, многостадийное измельчение позволяет эффективно диспергировать зерновой материал до ультрадисперсных частиц (УДЧ), подавляющая часть которых имеет остроугольную форму. Полученные УДЧ достаточно полно гидролизуются в мягких условиях при единовременном внесении мезофильных ферментов, либо при 80°С в случае последовательного внесения термостабильных ферментов. При использовании последних накопление мальтодекстринов в сусле из сырья с различной степени помола происходит практически на одном уровне, в то время как выход глюкозы возрастает с увеличением доли УДЧ.

л

кхШтт

Мальто-

Мальто- Мальтоза триоза декстрины

Условия гидролиза: п 37 °С

а 60 °С

И 80 °С

И 80 °С (после разваривания)

Глюкоза

Глава 4. Изучение влияния способа предобработки лигноцеллюлозного субстрата на эффективность его ферментативного гидролиза

4.1. Влияние продолжительности физико-механической обработки лигноцеллюлозного сырья на эффективность его измельчения и распределение частиц по размерам в ультрадисперсной фракции

На следующем этапе проводили серию экспериментов с использованием лигноцеллюлозного сырья. Так же, как и с крахмалистым сырьем, разрабатывали схемы получения и ферментативного гидролиза ультрадисперсных частиц с целью накопления в сусле максимально возможного количества сбраживаемых Сахаров.

В первой серии опытов изучали влияние влажности сырья на размер частиц при помоле древесины сосны.

На рисунке 4 представлено распределение частиц по размеру (исходная влажность 12,5% и после термического высушивания с 7,5% влажностью). Из представленных данных, полученных методом лазерной дифракции, можно заключить, что уменьшение влажности в древесине не оказывает существенного влияния на эффективность помола и, как следствие, на размер частиц.

Рисунок 4 - Диаграммы анализа размера частиц, полученных при различных видах измельчения древесины сосны в течение 30 мин на шаровой мельнице РМ400

Измерения, проведенные методами ЛИМ, показали, что предварительное подсушивание лигноцеллюлозного сырья также не меняет и геометрию полученных из него ультрадисперсных частиц. Частицы размером от 1 до 20 мкм были представлены в основном остроугольными осколками, пример которых приведен на рисунке 5а.

Известно, что одним из эффективных способов воздействия, разрыхляющих структуру субстрата, а, следовательно, увеличивающих их доступность для ферментативного гидролиза, является ультразвук (СЪеша! е1 а1., 2011). Поэтому в следующих сериях опытов была проведена УЗ-предобработка замесов различной интенсивности и продолжительности воздействия. Проведенные нами исследования

И

показали, что ультразвук низкой интенсивности практически не влиял на геометрию частиц, однако более мощное воздействие (80 Вт на 1 г замеса) приводило к увеличению числа ультрадисперсных фракций, при этом, как видно из рисунка 56 возрастала и иссеченность их поверхности. Дальнейшее повышение интенсивности УЗ-воздействия повышало количество УДЧ незначительно.

а б

Рисунок 5 - Зх-мерные модели УДЧ помола древесины сосны, измельченной

на шаровой мельнице РМ400 в течение 30 мин при 380 об"1 и обработанной ультразвуком (80 Вт/г замеса) в течение 0 (а), 5 (б) мин

4.2. Влияние продолжительности механико-ферментативной обработки и способа предобработки лигноцеллюлозного сырья на эффективность его гидролиза мезофильными мультиэнзимными препаратами

На следующем этапе работы было исследовано влияние продолжительности помола березовых и сосновых опилок на эффективность их ферментативного гидролиза. Использовали высокоактивные ферменты на основе рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum 221-151 (белок 834±33 мг/г, активности: по КМЦ - 14,9±0,6 ед/мг белка, по Д-Глюкану - 19,9±0,8 ед/мг белка, по МКЦ -0,54±0,02 ед/мг белка, по ксилану - 15,0±0,6 ед/мг белка, по целлобиозе -0,73±0,03 ед/мг белка, по и-НФГ - 1,25±0,05 ед/мг белка) и P. verruculosum F10 (белок - 738±30 мг/г, активности: по КМЦ - 4,9±0,2 ед/мг белка, по ^-Глюкану -10,4±0,4 ед/мг белка, по МКЦ - 0,2±0,01 ед/мг белка, по ксилану - 3,2±0,2 ед/мг белка, по целлобиозе - 111,4±5 ед/мг белка, по л-НФГ - 55,3±2,2 ед/мг белка). При постановке эксперимента норматив внесения ферментов брался из расчета: целлю-лазы - 2, 5, 10 мг белка на 1 г субстрата, целлобиазы - 5 мг белка на 1 г субстрата. Данные по выходу Сахаров к 48 ч гидролиза представлены на рисунке 6.

Проведенные эксперименты показали, что во всех вариантах опытов наблюдается накопление глюкозы и редуцирующих Сахаров (PC). Однако максимальное увеличение их количества происходит в серии опытов, в которых осуществлялся в течение 48 ч ферментативный гидролиз соснового сырья, измельченного при 400 об" в течение 40 мин. Наибольший выход глюкозы отмечен к концу гидролиза при внесении целлюлаз в количестве 10 мг белка (204±21 ед. акт. по КМЦ на 1 г помола опилок). При использовании УДЧ березы сахара тоже высвобождаются однако их конечная концентрация на 45% меньше, по сравнению с сосновыми УДЧ. Разница в накоплении сбраживаемых Сахаров, по-видимому, связана с осо-

12

бенностями химического состава и структурой исследуемых субстратов. Нами установлено, что содержание целлюлозы в УДЧ сосны составляло 43,5%, а в УДЧ березы-32,1 %.

Количество фермента

березы 40 мин сосны 40 мин березы 40 мин сосны 40 мин

помола помола помола помола

Высвобождение глюкозы I Высвобождение РС

Рисунок 6 - Изменение содержания глюкозы и редуцирующих Сахаров в гидролизате УДЧ соснового и березового субстрата в зависимости от количества внесенных целлюлаз, мг/мл

В ряде источников (Завэпег е/ а/., 2008; Карага^, 2009) обосновано применение соломы злаков в качестве сырья для получения биоэтанола. В частности, у нее низкая себестоимость, поскольку она является отходом сельскохозяйственного производства. В связи с этим в следующей серии экспериментов исследовалось влияние степени дисперсности сырья и концентрации ферментов на эффективность гидролиза целлюлозы соломы. Поскольку данный субстрат озоляется при помоле, сократили время диспергирования до 20 мин.

Проанализировав результаты гидролиза, можно отметить, что увеличение продолжительности помола и количества вносимых ферментов приводит к увеличению высвобождения как РС, так и глюкозы. Эффективность гидролиза варьировала в зависимости от степени измельчения - каждые 5 мин дополнительного помола повышали ее на 7-10% в зависимости от вида соломы. Повышение дозы фермента в 5 раз увеличивало и выход Сахаров для всех субстратов от 20 до 27% в зависимости от продолжительности диспергирования. С точки зрения расходов при масштабировании разрабатываемой схемы этот прирост недостаточен, поэтому остановились на варианте внесения целлюлазы в количестве 5 мг белка (102±15 ед. акт по КМЦ) на 1 г субстрата. Как видно из рисунков 7 и 8, при оптимизированных условиях наибольшим накоплением глюкозы (13,24±0,23 мг/мл) характеризуется ультрадиспергированная солома ржи, поэтому она может быть использована в качестве перспективного субстрата для получения этанола.

Рисунок 7 - Влияние концентрации целлюлолитических ферментов на накопление глюкозы в сусле из соломы и древесины сосны грубого помола

^ Количество фермента

1КТ по КМЦ

_______________г субстрата):

1 15 г а

120,5

5

Солома озимой пшеницы Солома ржи Солома ячменя Опилки древесины сосны

П 102

И 204

Рисунок 8 - Влияние концентрации целлюлолитических ферментов на накопление глюкозы в сусле из УДЧ соломы и древесины сосны (20 мин помола на РМ400 при 380 об"')

13 12 11 ю

9 8 7 6 5

Солома озимой пшеницы Солома ржи

Количество фермента (ед. акт. по КМЦ субстрата):

В 20,5

s 102

Солома ячменя Опилки древесины сосны

И 204

Подобрав оптимальный субстрат, далее провели серию экспериментов по отработке различных вариантов их предварительной обработки ультразвуком с использованием различных типов УЗ-генераторов и времени воздействия. Наибольшая эффективность ферментативного гидролиза, как следует из данных на рисунке 9, была получена в эксперименте с использованием генератора УЗГ2—4M, при этом выход глюкозы составил 35,47 мг/мл (61 % от теоретически возможного максимума). Полученные результаты сопоставимы с данными исследований других авторов (Sinitsyn et al., 2005; Alvira et al., 2010).

Известно, что одно из самых мощных воздействий на органические молекулы оказывает гамма-облучение, которое вызывает разрывы межмолекулярных связей (Mojovic et al, 2007) и к этому направлению большой интерес проявляют исследователи многих стран (Wang et al, 2012). Поэтому при поиске эффективных вариантов воздействия в следующей серии экспериментов проводили опыты с облучением различной дозой. Установлено, что облучение опилок грубого и ультрадисперсного помола в дозе 2 кГр в 2 раза увеличивает эффективность ферментативного гидролиза. В тоже время снижение дозы облучения до 1 кГр повышает выход продуктов гидролиза лишь на 25,5%.

Продолжительность

грубый помол УДЧ 30 мин УДЧ 45 мин УДЧ 60 мин помола помола помола

Рисунок 9 - Изменение содержания глюкозы в сусле из УДЧ сосны, в зависимости от степени дисперсности сырья и продолжительности УЗ-обработки

Из проведенных экспериментов можно заключить, что для увеличения эффективности ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного сырья необходимо использовать его в ультрадисперсной форме и при воздействии УЗ или гамма-облучения.

Глава 5. Изучение процессов сбраживания осахаренного зернового и лигноцеллюлозного субстратов

5.1. Изучение динамики и эффективности сбраживания зернового субстрата

Как известно, дрожжи - самый распространенный промышленный продуцент для получения спирта. При этом дрожжи способны сбраживать преимущественно гексозы в моно- и олигосахаридной (не более 4-6 остатков глюкозы) форме (Querol, 2006; Satyanarayana et al., 2009). Поэтому в ранее проведенных экспериментах были подобраны оптимальные варианты предварительной подготовки субстратов, позволяющие повысить эффективность ферментативного гидролиза и получать сусла с высоким выходом сбраживаемых Сахаров.

В первой части нашей работы было установлено, что наибольшее количество сбраживаемых Сахаров содержало сусло из УДЧ зерна (30 мин помола, 400 об"'), приготовленное с использованием термостабильных ферментов. Поэтому дальнейшее сбраживание проводили именно с этими пробами в присутствии дрожжей S. cerevisiae расы Angel. Исследования методом ВЭЖХ показали, что в течение первых 3-х часов брожения происходит резкая убыль Сахаров и в первую очередь глюкозы. В этих же условиях наблюдается постепенная убыль мальтозы и мальто-декстринов. Концентрация пентоз и менее усваиваемых гексоз практически не изменяется. Параллельно с убылью гексоз начинается и накопление спирта (после

2-го ч брожения) и за первые сутки его накапливается до 35% от суммарного выхода. К этому времени практически полностью расходуются мальтоза и мальто-декстрины. После 36 ч культивирования содержание глюкозы снижается на 80% от начального ее содержания в бражке, а накопление спирта составляет уже свыше 50% от конечной величины. Наиболее быстро концентрация глюкозы и других гек-соз убывает после 48 ч брожения. Содержание пентоз в ходе всего брожения не изменяется.

При исследовании зависимости накопления спирта от начального содержания Сахаров в сусле выявлено, что накопление спирта прямо пропорционально количеству высвобожденной глюкозы и остаточных мальтодекстринов в сусле. Полученные нами данные по выходу спирта ниже теоретически возможных, что объясняется большим расходом Сахаров на активацию при периодической схеме брожения и низкой устойчивостью данной расы к его содержанию в бражке (Satyanarayana et al, 2009). Следует отметить, что наибольшее накопление этанола (7,85±0,23 об. %), показанное на рисунке 10, характерно для сброженного сусла, осахаренного при 80°С без разваривания. Предположительно это связано с тем фактом, что разваривание приводит к образованию соединений, угнетающих метаболизм дрожжей (Vertes et al., 2010).

Условия гидролиза сусла:

®37°С

П60°С

Я 80°С

а 80°С (после разваривания)

Рисунок 10 - Содержание спирта в бражке, полученной при 72 часовом брожении дрожжами S. сerevisiae расы Angel

Таким образом, исследовав динамику сбраживания пшеницы, установили, что наибольшее накопление спирта происходит при переработке сырья, не подвергавшегося развариванию.

На следующем этапе сравнивали между собой различные зерновые культуры, гидролизованные в мягких условиях. Как было показано ранее, наибольший выход сбраживаемых Сахаров наблюдался при ферментативном гидролизе пшеницы, тем не менее ряд авторов (Бутковский и др., 1999; Сумина, 2009) указывает на высокий потенциал использования ржи. Кроме того, мы сравнили эффективность накопления спирта различными расами дрожжей, а именно - Ethanol Red и рассмотренной ранее Angel. Как видно из полученных данных, представленных на рисунке 11, использование штамма Ethanol Red и пшеницы в качестве сырья позволяет добиться большего выхода спирта с единицы массы по сравнению с рожью, что согласуется и с литературными данными (Зуева, 2008).

■ 5. cerevisiae Angel OS. cerevisiae Ethanol Red

Рисунок 11 - Влияние источника сырья 30-ти минутного помола на накопление спирта в браге, полученной при 72-часовом брожении дрожжами различных рас 5. сегеушае

Пшеница

Рожь

5.2. Изучение эффективности сбраживания лигноцеллюлозного субстрата

На следующем этапе исследования использовали предварительно обработанное по оптимизированной схеме ультрадисперсное лигноцеллюлозное сырье. Поскольку оно является более «бедным», в том числе и по содержанию глюкозы, дрожжи медленнее растут. В связи с этим были проведены исследования ряда штаммов дрожжей по скорости накопления биомассы и конечного продукта на оптимизированном сусле из лигноцеллюлозного сырья, и был выбран S. cerevisiae Ethanol Red.

Учитывая тот факт, что «выход» этилового спирта зависит от количества свободных Сахаров в сусле и что наибольшим выходом глюкозы в процессе гидролиза характеризовались ультрадиспергированные опилки, подвергнутые интенсивной УЗ-обработке, то для постановки эксперимента по сбраживанию использовалось сусло из УДЧ опилок сосны, обработанных дозой УЗ-воздействия 300 Вт/г в течение 20 мин. Длительность помола варьировала от 30 до 60 мин. В качестве контроля выступали варианты с образцами грубого помола и УДЧ, не подвергнутые УЗ-воздействию. Как видно из таблицы 2 предварительное УЗ-облучение увеличивает выход спирта во всех вариантах.

Таблица 2 - Влияние УЗ-воздействия и длительности помола УДЧ древесины сосны на накопление спирта при проведении брожения дрожжами S. cerevisiae расы Ethanol Red

Продолжительность УЗ-воздействия на УДЧ опилок Содержание спирта в зависимости от продолжительности фактического помола, об. %

30 мин 60 мин Грубый помол

УЗ 300 Вт/г 20 мин 2,91±0,15 3,11±0,23 1,09±0,10

Контроль без обработки 2,07±0,09 2,18±0,11 0,79±0,08

Для подтверждения полученной зависимости между степенью помола сырья и эффективностью его сбраживания, мы провели эксперимент с лигноцеллюлозными образцами сокращенного времени диспергирования. Кроме того, как было показано на рисунках 7 и 8, при кратковременном помоле и последующем гидролизе сусло из ржаной соломы содержит больше сбраживаемых Сахаров, чем УДЧ древесины сосны. В данном опыте аналогично предыдущим, мы вносили в сусло S. cerevisiae расы Ethanol Red. На рисунке 12 показано, что накопление спирта при сбраживании сусла из соломы к 72 часу брожения было на 10% выше, чем при сбраживании сусла из древесины сосны; кроме того, в первом варианте до 72 часа продолжались визуально наблюдаемые процессы брожения. Это обусловлено более интенсивной активацией дрожжей при высокой концентрации сбраживаемых Сахаров и доступных азотистых веществ, а также низкой концентрации веществ, инги-бирующих дрожжевой метаболизм (Karhumaa et al., 2009).

Обработка сырья:

иТОЛЬКО

грубый гюмол

60 ч брожения 72 ч брожения Бражка из ржаной соломы

60 ч брожения 72 ч брожения Бражка из древесины сосны

В 20 минут помола

Рисунок 12 - Изменение накопления спирта в бражке в зависимости от вида предварительной обработки сырья (сбраживание дрожжами S. cerevisiae расы Ethanol Red 72 ч)

Опираясь на данные, полученные в ходе изучения динамики убыли концентрации простых Сахаров в сусле и эффективности его сбраживания, можно подтвердить вывод, что с точки зрения накопления спирта крахмалистое сырье (особенно пшеница) является более выгодным по сравнению с лигноцеллюлозным (Vertes et al., 2010). При этом накопление спирта в анаэробных условиях зависит как от содержания моносахаридов в сусле, так и от чувствительности дрожжей к ингибирующим факторам, в частности к спирту.

Заключение

К настоящему времени существует несколько технологических схем производства этилового спирта (Wu et al., 2007; Зуева и др., 2008). Несмотря на ряд принципиальных различий, схему производства можно свести к следующим этапам: подготовке сырья и вспомогательных материалов к осахариванию, гидролизу сырья, культивированию микроорганизмов и последующему сбраживанию спиртового сусла. Процессы брожения завершаются отделением этанола и его очисткой.

При моделировании различных условий обработки и сравнении их с существующими биотехнологическими схемами нами были внесены изменения на этапе подготовки сырья. Ультрадиспергирование субстрата увеличит доступность его для действия ферментов и повысит количество сбраживаемых Сахаров в сусле. Вначале сырье необходимо измельчить до частиц размером не более 0,7 мм (при помощи вальцовых или промышленных ножевых мельниц). Далее провести ультраизмельчение на промышленных шаровых мельницах. Конечный помол должен содержать не менее 15% частиц размером от 1 до Юмкм. Следующим этапом выступает смешивание полученного помола с заранее подогретой до 60°С и подкисленной до pH 4,5 водой в соотношении 1:3-3,5 (с учетом условной крахмалисто-сти). В затор вносят высокоактивные ферменты. Продолжительность гидролиза выбирается исходя из условий внесения ферментов, их активности и выбранных технологических условий. По окончании гидролиза, полученное сусло перекачивается в бродильный чан, охлаждается до температуры 30±2°С и смешивается с предварительно активированными дрожжами. Сбраживание проводится в течение 60-66 часов (в зависимости от расы дрожжей и схемы подготовки сусла). Готовый продукт отделяется ректификацией.

Также будет отличаться схема производства этилового спирта из лигноцел-люлозного сырья. Наиболее крупная фракция (горбыль, обрезь, крупные ветки и т.д.) первоначально превращается в щепу и стружку на древощепильных станках. Полученная стружка после усреднения влажности до значений не выше 15%, измельчается с использованием шаровых мельниц или диспергаторов на основе жерновов. Полученный помол не должен содержать фракции с размером частиц более 100 мкм. Он может быть дополнительно активирован гамма-излучением с.дозой не более 2 кГр/кг сырья. Далее помол необходимо смешивать с подогретой и подкисленной до pH 5-5,5 водой в соотношении 1:5-7. Замес может быть активирован УЗ-обработкой мощностью не менее 80(оптимально - 250-300) Вт/г при условии продолжительности обработки от 3-х минут. Данная стадия позволит интенсивно перемешать сырье, стерилизует его и подготовит к ферментативному гидролизу. В замес вносятся высокоактивные ферменты из соотношения целлюлазы - до 150 ед. акт (по КМЦ) и целлобиазы - 100 ед. акт на 1 г сырья. Кроме того, фермент должен обладать ксиланазной, /?-глюканазной и другими активностями. В данных условиях гидролиз продлится 24 часа и позволит высвободить не менее 60% сбраживаемых Сахаров от теоретически возможного количества. В сусло вносят предварительно активированные дрожжи. Продолжительность брожения составляет 96-120 ч. Основные требования к применяемому штамму - возможность усваивать широкий спектр гексоз и пентоз при устойчивости к ингибирующим веществам. Готовый продукт отделяется ректификацией.

Расчет себестоимости показывает, что производство этилового спирта из зернового сырья по разработанной технологической схеме (21,5 руб/л) обходится в среднем на 10% дешевле по сравнению с классической производственной схемой. Себестоимость биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья (11,8 руб/л) соизмерима с данными, указанными в публикациях (Gonzales et al., 2012). Таким образом, внедрение технологии позволит снизить себестоимость выпускаемой продукции, а что касается технологии получения этанола из древесного сырья, то в этом случае ключевым положительным моментом является отказ от кислотного гидролиза, что приводит к снижению экологической нагрузки на природную среду.

выводы

1. Предложены технологические подходы к диспергированию растительного сырья, позволяющие интенсифицировать последующий ферментативный гидролиз. Оптимальным вариантом ультраизмельчения зернового и лигноцеллюлозного сырья является двустадийное. На первой ступени оно проводится в течение 5 мин на ножевой мельнице при 15000 об"1. На второй -на варио-планетарной шаровой мельнице в течение 20 мин при 600 об'1 для зернового и 60 мин при 400 об"'для лигноцеллюлозного сырья.

2. Ультрадисперсные размеры частиц крахмалистого сырья позволяют отказаться от энергозатратной стадии разваривания и осуществлять гидролиз с последовательным внесением термостабильной амилазы (выдержка при 80°С 30 мин), а затем остальных ферментов (выдержка 60 мин при 60°С).

3. Ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного сырья наиболее эффективно протекает в варианте с предварительной УЗ-обработкой ультрадисперсного сырья в течение 20 мин при мощности 300 Вт/г с последующем внесением целлюлаз с активностью не менее 185 ед. по КМЦ на 1 г сырья. Это позволяет получить выход глюкозы до 61% от теоретически возможного.

4. Наибольшее накопление этилового спирта происходит при сбраживании осахаренного зерна пшеницы высокой степени дисперсности дрожжами S. cerevisiae расы Ethanol Red. Активация дрожжей и синтез ими спирта происходит преимущественно за счет потребления образовавшихся на стадии ферментативного гидролиза Сахаров.

5. Разработанный способ увеличения выхода Сахаров из зернового и лигноцеллюлозного сырья, а также оптимизация условий брожения с использованием различных рас дрожжей позволяют уменьшить длительность всего технологического процесса и снизить себестоимость готового продукта.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Драгунова Ю.Е. Влияние концентрации различного вида источников азотного питания на выход пищевого этилового спирта из ультрадисперсного зернового сырья / Ю.Е. Драгунова, Д.О. Захаркин, В.В. Ерастова // Научно-технический вестник Поволжья. - 2010. — №1. - С. 55-59.

2. Захаркин Д.О. Исследование влияния степени дисперсности помола пшеничного зерна на накопление Сахаров в сусле / Д.О. Захаркин, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Вестник Уральской медицинской академической науки. - № 4/1 (38). -2011.-С. 196-197.

3. Шутова В.В. Эффективность ферментативного гидролиза полисахаридов ультрадисперсных частиц лигноцеллюлозного сырья в зависимости от их размера /

B.В. Шутова, А.И. Юсипович, Е.Ю. Паршина, Д.О. Захаркин, В.В. Ревин // Прикл. биохим. и микробиол. - 2012. - Т.48, №3. - С. 346-352.

Публикации в сборниках научных и научно-практических конференций:

1. Драгунова Ю.Е. Влияние способов проведения ферментации на выход спирта / Ю.Е. Драгунова, Д.О. Захаркин, М.А. Романова, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Биотехнология: экология крупных городов: Материалы междунар. науч.-прак. конф. (15-17 марта 2010 г., Москва) - М.: Экспо-биохим-технологии, 2010. -

C. 512-513.

2. Драгунова Ю.Е. Влияние температуры брожения и степени измельчения на выход спирта / Ю.Е. Драгунова, Д.О. Захаркин, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Евразия Био-2010: Матер, второго междунар. конгресса (13-15 апреля 2010 г., Москва) -М.: Копирнг, 2010. - С. 75.

3. Захаркин Д.О. Влияние измельчения и состава углеводного сырья на спиртовое сусло / Д.О. Захаркин, Ю.Е. Драгунова, A.B. Ключников, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Биология - наука XXI века: Материалы 14-ой Пущинской междунар. школы-конф. молодых ученых (19-23 апреля 2010 г., Пущино). - Пущино: Пущино,

2010.-С.244.

4. Захаркин Д.О. Влияние измельчения и состава углеводного сырья на спиртовое сусло / Д.О. Захаркин, Ю.Е. Драгунова, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Биотехнология начала III тысячелетия: Материалы междунар. науч. конф. (Саранск, 26-28 мая 2010 г.) - Саранск : Мордовия-Экспо, 2010. - С.77-78.

5. Захаркин Д.О. Температурные условия гидролиза как основополагающий фактор повышения концентрации глюкозы в спиртовом сусле из наноструктуриро-ванного зерна / Д.О. Захаркин, Ю.Е. Драгунова // Казанская наука. - 2010. - №8, вып.1. - С. 113-116.

6. Захаркин Д.О. Влияние измельчения и состава углеводного сырья на спиртовое сусло / Д.О. Захаркин, A.C. Кондратьева, В.В. Ревин // XXXVIII Огаревские чтения: Материалы науч.конф. : в 3 ч. ч.2: Естественные и технические науки. -Саранск : Изд-во Мордов. ун-та, 2010,- С. 7-8.

7. Захаркин Д.О. Влияние степени измельчения зернового сырья на накопление дрожжевой биомассы при культивировании на недоосахаренном сусле / Д.О. Захаркин, A.B. Долотказина, Л.Н. Белова, Е.А. Левина, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Сборник трудов биологического факультета. - Саранск : Мордовия - Экспо,

2011. - С.10-11.

8. Драгунова Ю.Е. Влияние температуры и pH активационной среды на выход спирта из ультрадисперсного сырья / Ю.Е. Драгунова, Д.О. Захаркин, A.B. Ключников, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // XXXIX Огаревские чтения: Материалы науч. конф. :в 3 ч. 4.2: Естественные науки. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2011.-С.78-81.

9. Захаркин Д.О. Влияние степени измельчения ультрадисперсного зернового сырья на накопление моносахаридов в спиртовом сусле / Д.О. Захаркин, В.В. Ревин, Ю.Е. Драгунова, A.B. Ключников // XXXIX Огаревские чтения: Материалы науч. конф. :в Зч. ч.2: Естественные науки. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2011-С. 93-94.

10. Захаркин Д.О. Влияние степени диспергирования зернового сырья и температуры на эффективность ферментативного гидролиза / Д.О. Захаркин, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Биология - наука XXI века: Матер, междунар. конф. (Москва, 24 мая 2012 г.). - М.: МАКС Пресс, 2012. - С. 282-283.

11. Захаркин Д.О. Влияние СВЧ обработки механо-активированной древесины сосны на эффективность протекания ферментативного гидролиза / Д.О. Захаркин, C.B. Барашкин, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Биология - наука XXI века: Матер, междунар. конф. (Москва, 24 мая 2012 г.). - М.: МАКС Пресс, 2012. - С. 284-285.

12. Захаркин Д.О. Изучение влияния микроволнового излучения на эффективность механического измельчения лигноцеллюлозных материалов / Д.О. Захаркин, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Достижения и перспективы развития биотехнологии: Матер, междунар. конф. (Саранск, 3-5 окт. 2012 г.). - Саранск: Мордовия - Экспо, 2012.-С.139.

13. Захаркин Д.О. Изучение влияния микроволнового излучения на эффективность ферментативного гидролиза ультрадисперсной древесины сосны / Д.О. Захаркин, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Достижения и перспективы развития биотехнологии: Матер, междунар. конф. (Саранск, 3-5 окт. 2012 г.). - Саранск: Мордовия -Экспо, 2012.-С.140.

14. Захаркин Д.О. Изучение влияния ультразвуковой обработки ультрадисперсных опилок сосны на эффективность их ферментативного гидролиза / Д.О. Захаркин, H.A. Атыкян, В.В. Ревин // Достижения и перспективы развития биотехнологии: Матер, междунар. конф. (Саранск, 3-5 окт. 2012 г.). - Саранск: Мордовия -Экспо, 2012.-С.141.

15. Захаркин Д.О. Влияние степени измельчения ультрадисперсного зернового сырья на накопление моносахаридов в спиртовом сусле / Д.О. Захаркин, В.В. Ревин, Ю.Е. Драгунова, H.A. Атыкян И Матер. XVI науч.-практич. конф. молодых ученых, аспирантов и студентов Мордов. гос. ун-та им. Н.П. Огарева: в 6 ч. ч.З: Естественные науки. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2013. - С.23-25.

16. Захаркин Д.О. Влияние выбора источника крахмалистого сырья на накопление глюкозы в спиртовом сусле из ультрадисперсного зернового сырья / Д.О. Захаркин, В.В. Ревин // Матер. XVI науч.-практич. конф. молодых ученых, аспирантов и студентов Мордов. гос. ун-та им. Н.П. Огарева: в 6 ч. ч.З: Естественные науки. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2013. - С.28-30.

17. Revin V.V. Study of the effect of wood ultrafine particles size on their enzymatic hydrolysis efficiency / V.V. Revin, N.A. Atykyan, D.O. Zakharkin, V.V. Shutova, M.Yu. Yazykova//Journal of Biotechnology. -2014.-Vol. 185. -P.S123-S124.

Подписано в печать 24.10.14. Объем 1,25 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 1438. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24