Биоконверсия непищевого целлюлозосодержащего сырья: энергетических растений и отходов АПК

Макарова, Екатерина Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биоконверсия непищевого целлюлозосодержащего сырья: энергетических растений и отходов АПК
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биоконверсия непищевого целлюлозосодержащего сырья: энергетических растений и отходов АПК"

На правах рукописи ъ/Сшг.^

Макарова Екатерина Ивановна

БИОКОНВЕРСИЯ НЕПИЩЕВОГО ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ: ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ И ОТХОДОВ АПК

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук

2 5 ФЬВ 2015

Щелково-2015

005559481

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения Российской академии наук (ИПХЭТ СО РАН)

Научный руководитель: Будаева Вера Владимировна, кандидат химических

наук, доцент, заведующая лабораторией биоконверсии

Официальные оппоненты: Гернет Марина Васильевна, доктор технических наук,

логии»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Защита состоится 17 апреля 2015 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Бнокомбината, д. 17, ФГБНУ ВНИТИБП; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ ВНИТИБП и на сайте vvww.vnitibp.com.

Автореферат разослан ¿¿»февраля 2015 г.н размещен на сайте ФГБНУ ВНИТИБП www.vnitibp.com и на официальном сайте Министерства образования и науки РФ http://vvww.vak.ed.gov.ni.

Ученый секретарь диссертационного совета.

ИПХЭТ СО РАН

профессор, заведующая лабораторией брожения и санитарии пивоварения ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пивобезалкогольной и винодельческой промышленности»

Серба Елена Михайловна, кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник отдела биосинтетических и биокаталитических нанотехнологнй ферментов, дрожжей, органических кислот и биологически ак-

тивных добавок ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехно-

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время существенно возросла мировая потребность в энергии, вызванная ограниченностью и высокой ценой на ископаемые ресурсы, а также проблемами изменения глобального климата. Основным источником для производства биотоплива являются легкоперерабатываемые крахмало- и сахаро-содержащие источники - это так называемое «биотопливо первого поколения», которое, к сожалению, конкурирует с пищевым сектором мировой экономики. Возможность использования для производства биотоплива целлюлозосодержащего сырья с ежегодным мировым воспроизводством порядка 200 млрд. т на планете открывает новые горизонты для «биотоплива второго поколения».

В связи с несовершенством существующих технологий и высокой себестоимостью производства бноэтанола из лигноцеллюлозных источников возникает необходимость разработки универсального способа переработки растительного сырья в доброкачественные гидролизаты - питательную среду для микробиологического синтеза этанола и других продуктов.

Несмотря на известные успехи гидролизной промышленности в России (этанол из древесины через химический гидролиз) в 1950-1990-е гг. перечисленные виды сырья не были исследованы в качестве источников получения этанола по схеме «лигно-целлюлоза - химический гидролиз - гидролизат - сбраживание - этанол». Переход от традиционного химического способа гидролиза растительного сырья к ферментативному обусловлен преимуществами последнего: более мягкие условия процесса, экономия энергии, получение биологически доброкачественных гндролизатов, не содержащих примесей, способных оказывать негативное влияние на процессы жизнедеятельности микроорганизмов при последующей переработке гидролнзатов. Однако ферментативный гидролиз отличается высокой специфичностью и чувствительностью процесса, то есть зависимостью от параметров проведения процесса, специфичности ферментных препаратов, а также природы и способа подготовки субстрата. В настоящее время основными направлениями биотехнологической переработки растительного сырья в полезные продукты микробиологического синтеза являются как создание комплексных высокоэффективных биокатализаторов, так и выбор эффективного способа предварительной обработки сырья.

В силу своей доступности и низкой стоимости перспективными источниками получения таких гидролнзатов являются энергетические культуры и отходы АПК. Мискантус - яркий представитель энергетических культу р. Растение является многолетним злаком и, начиная с третьего года культивирования, может ежегодно продуцировать на одном поле на протяжении 15-20 лет 10-15 т/га/год сухой биомассы в Сибири, что соответствует 4-6 т/га чистой целлюлозы. Плодовые оболочки овса - реальные отходы АПК (ЗАО «Бийский элеватор»), которые составляют 28 % от всей массы зерна. Зерноперерабатывающие заводы со средней производительностью сталкиваются с проблемой их утилизации, только в Алтайском крае при переработке 1,5 млн т

овса образуется 375000 кг плодовых оболочек. Высокое содержание целлюлозы в плодовых оболочках овса (до 35 %), доступность и низкая стоимость определяет возможность их применения в качестве субстрата для последующей биоконверсии.

Основываясь на вышеперечисленном, можно заключить, что исследования, направленные на разработку технологии биоконверсии целлюлозосодержащего сырья (на модели мискантуса и плодовых оболочек овса), включающего в себя разработку высокоэффективной мультиэнзимной композиции из доступных ферментных препаратов, определение оптимальных параметров гидролиза, выбор способа предварительной обработки сырья являются актуальными и перспективными.

Степень разработанности темы. Опубликованные литературные данные подтверждают целесообразность переработки различных видов целлюлозосодержащего сырья в биоэтанол и другие полезные продукты микробиологического синтеза, в частности, биобутанол, бактериальную целлюлозу, молочную кислоту и др. В этой области успешно работают в России и за рубежом А.П. Синицын, A.A. Клесов, М.Л. Рабинович, С.Д. Варфоломеев, М.В. Гернет, М.Я. Иоелович, N. Brosse, A. Ra-gauskas и другие исследователи (1980-2015 гг.). Однако отсутствует информация об исследованиях ферментолиза российского мискантуса и таких отходов сельскохозяйственного производства, как плодовые оболочки овса.

Цель диссертационной работы - разработка технологии биоконверсии непищевого целлюлозосодержащего сырья на модели энергетических растений (мискантуса) и реальных отходов зернопереработки (плодовых оболочек овса).

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать мультиэнзимную композицию из ферментных препаратов, обеспечивающую максимальную степень конверсии выбранных видов сырья и продуктов их предварительной обработки;

2. Определить оптимальные параметры ферментативного гидролиза исследуемых субстратов;

3. Разработать методику оценки реакционной способности к ферментативному гидролизу целлюлозосодержащих субстратов;

4. Исследовать зависимость конечной концентрации и выхода редуцирующих веществ от начальной концентрации субстрата при ферментативном гидролизе образцов целлюлозы мискантуса и плодовых оболочек овса, полученных различными способами;

5. Описать кинетику процессов ферментативного гидролиза образцов целлюлозы мискантуса и плодовых оболочек овса;

6. Исследовать ферментативный гидролиз образца целлюлозы мискантуса в водной среде и оценить возможность использования полученного водного гидролизата как питательной среды для получения продуктов микробиологического синтеза путем его сбраживания в этанол;

7. Оценить зависимость реакционной способности к ферментативному гидролизу от физико-химических характеристик субстратов на примере продуктов химической переработки мискантуса;

8. Оценить зависимость реакционной способности к ферментативному гидролизу субстратов от способа предварительной обработки сырья на примере мисканту са и плодовых оболочек овса.

Связь работы с научными программами. Диссертация выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ ИПХЭТ СО РАН междисциплинарного интеграционного проекта № 73 «Научные основы технологий выращивания и переработки нового внда целлюлозосодержащего сырья - Мискантуса китайского»

2010-2011 гг.; проектуV.40.2.1 «Разработка физико-химических основ технологии получения полупродуктов и биотоплив из недревесного растительного сырья»,

2011-2012 гг.; проекту 5 «Химическое обогащение возобновляемого «концентрированного» целлюлозосодержащего сырья» Программы 3 Президиума РАН, 2011-2014 гг.; совместному интеграционномупроекту № 11 фундаментальных исследовании ИПХЭТ СО РАН и ИХ Коми НЦ УрО РАН «Химическая, механохнмнческая и ферментативная деструкция целлюлозосодержащего сырья для получения цепных продуктов», 2012-2014 гг.; технологическому проекту «Технологическое оборудование для комплексной переработки растительного сырья в целлюлозосодержащне продукты и исходные компоненты для химического синтеза и биотопливо», 2013-2014 гг. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 13-03-98001 «Фундаментальные исследования гндротропной целлюлозы: способ получения, характеристики, химическая модификация и ферментативный гидролиз», 2013-2014 гг.

Научная новизна. Научно обоснована и экспериментально разработана технология биоконверсии непищевого целлюлозосодержащего сырья для получения гндро-лизатов, используемых в биотехнологической промышленности.

Разработан состав мультиэнзимной композиции из комплекса целлюлазных, ксиланазных и (5-глюканазных ферментов, который по сравнению с индивидуальными препаратами приводит к увеличению выхода редуцирующих веществ от массы субстрата при гидролизе сырья на 7-9 %, при гидролизе целлюлозы на 10-24 %.

Применение математических методов планирования эксперимента позволило определить оптимальные параметры ферментативного гидролиза исследуемых субстратов с использованием подобранной мультиэнзимной композиции.

Подтверждена возможность использования гидролизата в качестве питательной среды для микробиологического синтеза: сбраживанием водного гидролизата целлюлозы мискантуса получен этанол с высоким выходом спирта.

Установлено отсутствие корреляции между реакционной способностью к ферментативному гидролизу и физико-химическими характеристиками продуктов химической переработки мискантуса: субстраты с высокими значениями степени полимеризации (1000) и степени кристалличности (65-72 %) целлюлозы при гидролизе обес-

печивают выход редуцирующих веществ от массового содержания гидролизуемых компонентов в субстрате 91-93 9с. Обнаружено отсутствие ингибирующего действия кислотонерастворимого лигнина в составе лигноцеллюлозного материала на ферментные препараты: субстрат с массовой долей лигнина 9 % обеспечивает выход редуцирующих веществ от массового содержания гидролизуемых компонентов в субстрате 92 9с.

Произведена сравнительная оценка реакционной способности к ферментативному гидролизу субстратов, полученных из мискантуса и плодовых оболочек овса различными способами: шдротермобарической обработкой, гидротропной варкой, обработкой разбавленным раствором кислоты или щелочи, и установлено, что максимальный выход редуцирующих веществ от массового содержания гидролизуемых компонентов в субстрате (92-100 9с) обеспечивает обработка разбавленным раствором кислоты или щелочи.

Новизна исследований подтверждена патентом РФ № 2533921 «Способ предварительной обработки целлюлозосодержащего сырья для ферментативного гидролиза».

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана и апробирована на различных субстратах методика оценки реакционной способности к ферментативному гидролизу целлюлозосодержащих продуктов.

Разработана технология биоконверсии мискантуса и плодовых оболочек овса, заключающаяся в обработке в одну стадию сырья разбавленным раствором азотной кислоты или щелочи и ферментолизе полученного субстрата при установленных параметрах процесса (температура (45+2) °С, рН (4,6+0,3)) с использованием разработанной высокоэффективной мультиэнзимной композиции.

Интегрирование технологии ферментативного гидролиза в комплексную схему переработки недревесного сырья в полезные продукты на опытно-промышленном производстве ИПХЭТ СО РАН подтверждено актом внедрения.

Результаты исследований включены в методическое положение, утвержденное директором ИПХЭТ СО РАН, д.х.н. C.B. Сысолятиным.

Результаты исследования и методология могут быть использованы разработчиками и производителями биологической промышленности, а также в качестве учебного пособия студентов по специальности «Биотехнология».

Степень достоверности результатов работы подтверждается соответствием теоретических данных с полученными результатами экспериментальных исследований и производственных испытаний. Экспериментальные данные, выводы и рекомендации основаны на общепринятых теоретических закономерностях, не противоречат и согласуются с известными концепциями, с достоверностью 95 %.

Положения, выносимые на защиту:

- оптимизированные параметры ферментативного гидролиза мискантуса, плодовых оболочек овса и продуктов их предварительной обработки с использованием разработанной мультиэнзимной композиции;

- ферментолнз образцов целлюлозы прн различных начальных концентрациях субстрата;

- эффективность применения ферментативного водного гидролизата целлюлозы мискантуса в качестве питательной среды для микробиологического синтеза биоэтанола;

- зависимости реакционной способности к фермептолизу субстратов от их физико-химических характеристик и способа предварительной обработки сырья;

- технология ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья: мискантуса и плодовых оболочек овса.

Апробация работы. Основные положения и научные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийских и международных конференциях: Минск (2011, 2013), Саранск (2012), Москва (2012), Барнаул (2012, 2014), Омск (2012), Сыктывкар (2012, 2013), Калининград (2013), Архангельск (2014).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 27 научных работах, в том числе 15 статьях в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнаукн РФ, 1 патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы включающего 156 источников и приложения. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста и содержит 40 рисунков, 40 таблиц.

Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы и разработке основных положений диссертации, выносимых на защиту, постановке целей и задач исследований, реше......поставленных задач, планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении результатов и нспользовапин их в практике. Результаты диссертационной работы являются совокупностью научных исследований, проведенных в ИПХЭТ СО РАН лично автором и при его непосредственном участии в качестве ответственного исполнителя.

Благодарности. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники ИПХЭТ СО РАН A.A. Кухленко, С.С. Орлов, Е.А. Скиба, И.Н. Павлов, В.Н. Золотухин - за что выражаю им сердечную благодарность.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнялась в Лаборатории биоконверсии ИПХЭТ СО РАН. Технология биоконверсии целлюлозосодержащего сырья на модели мискантуса и плодовых оболочек овса апробирована на опытно-промышленном производстве ИПХЭТ СО РАН.

2.1. Состояние вопроса по литературным источникам

Проведен анализ основных отечественных и зарубежных источников для получения целлюлозосодержащих субстратов и последующего ферментативного гидролиза. Описан состав растительного сырья и ферментативный гидролиз его компонентов. Рассмотрены различные способы предварительной обработки целлюлозосодержащего сырья и установлено, что в настоящее время наиболее широкое применение имеют такие способы как обработка разбавленными растворами кислоты или щелочи, гидро-термобарическая обработка. Проанализированы факторы, оказывающие влияние на эффективность ферментативного гидролиза. Проведенный анализ литературы позволил определить цель и задачи исследования ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих субстратов.

2.2 Объекты н методы исследования

Приведены применяемые в работе сырье, реактивы, оборудование, методики анализа субстратов, ферментативных гндролизатов, а также методики проведения экспериментов.

Объекты исследования представитель энергетических растений - мискантус сорта Сорановскпй и реальные отходы переработки злаков - плодовые оболочки овса (ПОО).

Для биоконверсни целлюлозосодержащих субстратов в работе использовались коммерческие ферментные препараты отечественного и зарубежного производства: «Целлолюкс-А» (ООО ПО «Сиббиофарм», Россия) - препарат «А», «БрюзаймЕЮХ» («Polfa Tarchomin Pharmaceutical», Польша) - препарат «Б», «Рапидаза ЦР» («DSM Food Specialties Beverage ingredients», Нидерланды) - препарат «В» и «Целлюксил» («August Topfer&Co.», Германия) - препарат «Г».

Образцы целлюлозы из мискантуса и ПОО получены на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН азотнокислым (AC) (HNO3, NaOH) и комбинированным (КС) (NaOH, HNO3) способами; лигноцеллюлозные материалы - одностадийной обработкой сырья HNO3, волокнистые продукты - NaOH.

Гидротермобарическая обработка сырья проводилась с вариацией условий, давление (МПа)/продолжителыюсть (с): мискантус -1,5/300; 1,5/600; 2,0/1200; 2,5/600; ПОО - 1,5/600 в реакторе высокого давления. Часть твердой фазы после взрыва, так называемый волокнистый материал, направлялась на облагораживание (обработка 2,0 %-ным раствором NaOH и Н2О2) с получением целлюлозы.

Гндротропная варка сырья осуществлялась обработкой 35 %-ным раствором бензоата натрия с модулем 1:10, при температуре в камере 160-180 °С, давлении 1,0 МПа в течение 3-5 ч науниверсалыюй термобарической установке.

Для ферментативного гидролиза субстратов в конические колбы вместимостью 0,5 дм3 вносилась навеска субстрата, ацетатный буфер с растворенными в нем ферментными препаратами. Продолжительность гидролиза 72 ч. Перемешивание осу-

ществлялось на горизонтальной перемешивающей платформе при фиксированной температуре с частотой колебаний 150 мин"1.

Состав и характеристики исследуемых субстратов и ферментативных гидролиза-тов определялись по общепринятым, регламентируемым ГОСТами, и специальным методам для анализа растительного сырья. Определялись массовые доли: целлюлозы по Кюршнеру обработкой спиртоазотной смесью (Оболенская и др., 1991), а-целлюлозы - обработкой 17,5 % раствором гидроксида натрия (ГОСТ 6840-78), кислотонерастворимого лигнина - методом Комарова (Оболенская и др., 1991), пен-тозанов - отгонкой фурфурола (ГОСТ 10820-75), золы - методом сжигания (ГОСТ 18461-93). Степень полимеризации целлюлозы в субстратах определялась по вязкости растворов в кадоксене (ГОСТ 25438-82).Объемная доля спирта в бражках определялась ареометрическим методом (ГОСТ 3639-79). Анализ этанола выполнялся методом газо-жидкостной хроматографии (ГОСТ 51786-2001).

Рентгеноструктурный анализ проводился на дифрактометре«ДРОН-ЗМ»в геометрии на отражение FeKa излучении с монохроматизацией падающих лучей кристаллом пиролитического графита. Степень кристалличности целлюлозы рассчитывалась но методу Руланда.

Концентрация редуцирующих веществ (РВ) в пересчете на глюкозу в ферментативных гидролизатах определялась на спектрофотометре «UNICOUV-2804» с использованием реактива на основе 3,5-динитросалициловой кислоты. Концентрация пентоз в пересчете па ксилозу определяласьспектрофотометрическим методом с использованием железоорсинового реактива, основанным на отгонке фурфурола при кипячении гидролнзата с раствором соляной кислоты.

Сбраживание водных гидролизатов осуществлялось после фильтрования и па-стернзащш при 100 °С без выдерживания в инкубаторе «Unimax 1010» в анаэробных условиях при температуре 28 °С и рН=4,5 в течение 3 суток с помощью штамма дрожжей Saccharomyces cercvisica Y-1693 (ФГУП «ГосНИИгенетнка», Москва). Штамм был выделен из ферментера Котласского ЦБК (Архангельская область) и предназначен для производства этанола из гидролизатов древесины.

2.3 Статистическая обработка результатов. Для оптимизации параметров процесса ферментативного пиролиза использовался униформ-ротатабельный план. Константы скоростей ферментативного гидролиза определялись путём аппроксимации экспериментальных данных методом наименьших квадратов. Расчеты и построение технологических графиков осуществляли с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем - с помощью программы MICROSOFT OFFICE WORD 2010.

Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы представлена на рисунке 1.

Анализ существующих технологий оноконверсив иеллюлозосодержашего сырья 1

Разработка алгсрнтш промьззленяо й технологии сас гонг ер гея пеллюлезосолер'жааето сырь* i

О?оснеЕдкие выбора объектов исследовавш

Мискантус энергетическая культура

Еюдв1Ы( »белочка им

отходы АПК

Разработка технологических этапов бноконверсив ыискаятуса в плодовых оболочек овса с использованием разработанного алгоритма

Разработка мультиэнзюшой композиция длл максимальной степени конверсия мискакгуса, плодовых оболочек овса в продуктов га переработал

Определение опткиальиъга условий процесса >

фермеитатпаиого гидролиза разработанной композицией ;

~~~—: .......i—~ ~ 1

Ра ¡работка методики оцемл реакционной способности к фермент о лип* целлюлозосодержащих субстратов

Опенка зависимости реакционной способности к ферментативному гидролизу

от физико-химических характеристик субстратов

Выбор способа предварительной обработки сырья

... J _. .. '

Разработка технологии бноконверсив мискантуса и плодовых оболочек овса

Массггаонровалн«по оЗъеху ферментативного пиролиза целлюлозы в водной среде

-—-;-1-

Сбраживание водного гндролизата

--5--

Этанол !

Рисунок 1 - Общая схема исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Подбор мультиэнзимной композиции для гидролиза мискантуса и ПОО.

3.1.1. Определение химического состава мискантуса и ПОО. Химический состав сырья (таблица 1) представлен по большей части гидролизуемыми компонентами: м.д. в мискантусе целлюлозы 52 % и пентозанов 21 %, в ПОО целлюлозы 45 % и пентозанов 31 %. Содержание негидролизуемых компонентов находится на одном уровне - 23 %.

Таблица 1 - Химический состав мискантуса и плодовых оболочек овса

Наименование сырья М.д., %

целлюлоза пентозаны лигнин зола

Мискантус 52,1 21,3 18,6 4,8

ПОО 44,7 30,8 18,1 4,6

3.1.2 Подбор мультиэнзимнон композиции

В работе использовались четыре ферментных препарата, препараты «Л» и «Г» стандартизированы по целлюлазе, препарат «Б» - по гемицеллюлазе и обладает высокой целлюлазной активностью, препарат «В» - комплекс гемицеллюлазных ферментов. Подбор композиции, обеспечивающей максимальную степень конверсии субстрата, проводился на примере мискантуса.

Препараты включались в композицию, исходя из своей основной функции в соотношении 1:1:1: в каждую композицию входили препараты целлюлазного и гемн-целлюлазного назначения. Фермент-субстратное соотношение 1:50. Гидролиз проводился в ацетатном буфере (рН 4,7) при температуре (50±2) °С и постоянном перемешивании. Начальная концентрация субстрата составляла 30 г/л. Результаты гидролиза мискантуса с применением индивидуальных препаратов и композиций из них представлены в таблице 2.

Установлено, что гидролиз мискантуса индивидуальпымн ферментными препаратами проходит с низкой степенью конверсии: выход РВ не превышает 4,4 %. Среди мультиэнзимных композиций наибольшую степень конверсии показала композиция, («А»+«Б»+«В») в соотношении 1:1:1 - выход РВ составил 11,1 % от массы субстрата и 14,4 % от массового содержания гидролизуемых компонентов.

Данный факт может быть связан с наличием в ферментном препарате «В» неза-явленной производителями целлобиазиой активности, которая характерна для препаратов, продуцируемых грибами рода Aspergillus, в результате этого обеспечивается повышение эффективности действия препаратов «А» и «Б», поскольку известно, что препараты, продуцируемые грибами рода Trichoderma, обеднены целлобиазой. Подобранная композиция из трех препаратов использовалась для гидролиза ПОО, в результате чего они конверсировались более успешно: выход РВ составил 12,2 % от массы субстрата и 14,9 % от массового содержания гидролизуемых компонентов.

Таблица 2 - Результаты ферментолиза мискантуса индивидуальными ферментными препаратами и мультиэнзимными композициями

Ферментный препарат РВ

концентрация, г/л выход, %

от массы субстрата от массового содержания гидролизуемых компонентов

А 1,46 3.9 5,1

Б 1,64 4.4 5,7

Г 0,89 2,4 3,1

А+В 1.67 4.5 5.9

Б+В 1,70 4.6 6.0

А+Б 1,76 4.8 6.3

А+Б+В 4,10 11.1 14,4

3.2. Определение оптимальных параметров ферментативного гидролиза 3.2.1. Характеристики субстратов. Химический состав образцов целлюлозы, полученных на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН азотнокислым (АС) и комбинированным (КС) способами (таблица 3), представлен по большей части гидролизуе-мыми компонентами - целлюлозой (90-92 %) и пентозанами (2-7 %). Очень малая доля относится к негидролизуемым компонентам - остаточному лигнину (0,5-3,6 %) и золе (0,1-4,2%).

Таблица 3- Физико-химические характеристики образцов целлюлозы

Показатели Образец целлюлозы

мискантуса ПОО

АС КС АС КС

М.д. а-целлюлозы 90,3 90,5 91,0 92,3

М.д. остаточного лигнина 3,6 1,4 0,8 0,5

М.д. золы 4,2 0,7 5,8 0,1

М.д. пентозанов 1,7 6,4 2,0 6,9

Степень полимеризации 660 760 1140 1140

Степень кристалличности, % 70 65 67 62

На примере образца целлюлозы мискантуса повторно было показано, что применение мультиэнзимной композиции («А»+«Б»+«В») в соотношении 1:1:1, обеспечивает увеличение выхода РВ на 18-24 % в сравнении с препаратами «А» и «Б», и на 10,4 % в сравнении с композицией («А»+«Б»),

3.2.2. Определение оптимальных параметров ферментолиза (рН (х0, температура (Х2), начальная концентрация субстрата (хз) на примере образца целлюлозы мискантуса (АК). Для математического планирования эксперимента использовался план второго порядка (униформ-ротатабельного) на базе плана ПФЭ типа 23 (таблица 4).

Таблица 4 - Параметры процесса и результаты гидролиза целлюлозы мискантуса

№ п/п Х| X;, °С X ¡, г/л Выход РВ. %

У, У2 У,

1 5.5 50 90 70.5 76.7 74.0

2 3.5 50 90 28.3 30.1 33.0

3 5.5 50 30 77.3 89.4 87.7

4 3.5 50 30 36.8 37.0 36.4

5 5.5 30 90 65.5 69.9 61.5

6 3.5 30 90 43.0 45.2 48.1

7 5.5 30 30 84,8 81.2 79.4

а 3.5 30 30 58,2 55.7 54.5

9 6.2 40 60 70.1 72.4 73.6

10 2.8 40 60 28.8 30.3 31,3

II 4.5 57 60 75,4 77.2 79,1

12 4.5 28 60 84.7 83.0 82.1

13 4,5 40 110 83.3 81.8 85.5

14 4.5 40 10 98.1 96.0 94.9

15 4,5 40 60 85.0 84.8 87.3

16 4.5 40 60 84.7 86.0 88.2

На основании полученных результатов была построена экспериментально-статистическая модель, позволяющая определить выход РВ (У) от рН, температуры (I, °С) и концентрации субстрата (С. г/л) (рисунок 2). Каждая из поверхностей на рисунке соответствует определенному выходу РВ от 50 % до 90 % с шагом в 10 %.

у = 90 %

у = ВО °Л>

Рисунок 2 - Зависимость выхода РВ (У) от рН. С и С

Уравнение регрессии для выхода РВ от указанных факторов:

У = 5,345-10"4 + 2,4210"3-Х1 + 7,946-10"3-Х2 + 1,216-Ю'-хз + 0.047-х,-х2 + + 7,672- 10"3-х1-хз + 0,01х2 хз + 0,019х1-х2-х3 + 8.825- 10-3-Х]2 - 0.177-х22 + 0.168-х,2-х2-- 0.098-х,2-х3 + 0,095-хгх22 - 1,202- 10"3-х22-хз - 0.014 х12-х22 + 0.021-х,3.

Уравнение получено методом наименьших квадратов, адекватно описывает процесс Брас = 1,43 < Ртеор = 2,35 с достоверностью ц = 0.95.

Используя уравнение регрессии, были рассчитаны оптимальные параметры, позволяющие получить максимальный выход РВ: рН (4,6±0.3); температура (44,6+2) °С: концентрация субстрата 30 г/л.

3.3. Разработка методики определения реакционной способности к ферментативному гидролизу целлюлозосодержащих субстратов. По результатам экспериментов (п. 3.2.2) разработана методика определения реакционной способности к ферментолизу целлюлозосодержащих субстратов, включающая в себя:

ферментативный гидролиз субстрата мультиэнзимной композицией («А»+«Б»+«В») в соотношение 1:1:1 (фермент-субстратное соотношение 1:50) при температуре (45+2) °С в ацетатном буфере (рН=(4,6+0.3)) и начальной концентрации субстрата 30 г/л при постоянном перемешивании:

- отбор проб из гидролизатов через определенные промежутки времени (8 ч) и анализ концентрации РВ для оценки скорости гидролиза субстрата;

- фильтрование полученных гидролизатов и анализ концентрации пентоз в пересчете на ксилозу в фильтрате, гравиметрический анализ твердых осадков. Полученные результаты могут быть представлены в виде зависимости концентрации (выхода) РВ от продолжительности ферментолиза. рассчитанных значений скорости фермен-

толиза, конечных выходов РВ, в том числе пентоз, определении глюкознон составляющей части РВ.

Продолжительность процесса определяется для каждого вида субстрата отдельно по окончанию прироста концентрации РВ, максимальная - 72 ч.

С помощью разработанной методики произведена оценка реакционной способности к ферментолизу образцов целлюлозы, полученных АС и КС (характеристики в таблице 3). В результате построен ряд реакционной способности:

целлюлоза ПОО (КС) > целлюлоза мискантуса (КС) ¡»целлюлоза ПОО (АС) > >целлюлоза мискантуса (АС).

Данная методика была апробирована для оценки реакционной способности к ферментолизу не только продуктов предварительной обработки мискантуса и ПОО, но и других целлюлозосодержащих субстратов: брикетированной рапсовой соломы, продуктов химической обработки соломы ржи, образцов целлюлозы, полученных из хлопка, различными способами из древесины, волокна льна-долгунца и др.

3.4. Исследование ферментолиза образцов целлюлозы при различных начальных концентрациях субстрата. Концентрация субстрата является одним из главных факторов, влияющих на выход и начальную скорость ферментативного гидролиза. Проведение ферментативного гидролиза при повышенной начальной концентрации субстрата является важным этапом для масштабирования по объему до пилотного промышленного производства

Концентрация субстратов в эксперименте варьировалась от 30 г/л до 120 г/л с шагом 30 г/л. В результате для исследуемых образцов целлюлозы (характеристики в таблице 3) построены зависимости конечной концентрации и выхода РВ от начальной концентрации субстрата (рисунок 3) и установлено, что они носят линейный характер.

При повышении начальной концентрации субстрата от 30 г/л до 120 г/л конечная концентрация РВ в гидролизатах увеличивается от 20 г/л до 100 г/л, но при этом их выход уменьшается от 90 % до 45 %. Снижение выхода РВ при увеличении концентрации субстрата свыше 90 г/л вызвано трудностями при перемешивании системы, в результате чего целлюлазы имели ограниченную подвижность из-за адсорбции на пористой структуре волокон целлюлозы, а также - частичным ингибированием ферментов избытком субстрата, что позволяет прогнозировать увеличение степени конверсии целлюлозы при внесении дополнительной порции ферментных препаратов.

Дтя проведения масштабирования по объему ферментолиза образцов целлюлозы мискантуса и ПОО в водной среде рекомендуемая начальная концентрация субстрата составляет 60-90 г/л. Следует отметить, что обнаружена степень конверсии на уровне 40-70 % для всех субстратов, несмотря на высокие значения степени полимеризации (более 500) и степени кристалличности (более 60 %) целлюлозы.

120 -| 100 -

£ 80 -

бо

40 20 0

т 100

-• 50

-■ 60 .

+ 40 3 3

-• 20

30 60 90 120 150 Концентрация субстрата, г/л

120 п

_ 100

I 60 -

| 40 |

0 30 60 90 120 150 Концентрация субстрата, г/л

120

_ 100 и

£ 50 к

I 60

I 40 |

20 О

100

-- 60

-- 40 §

О 30 60 90 120 150 Концентрация субстрата, г/л

100

60 й'

„ 100 -

+ 40 * Е"

О 30 60 90 120 150 Концентрация субстрата, г/л

Рисунок 3 - Зависимость концентрации (1) и выхода РВ (2) от начальной концентрации субстрата при гидролизе образцов целлюлозы мискантуса (а - ЛС, б - КС); целлюлозы ПОО (в - ЛС, г-КС)

3.5. Исследование кинетики ферментативного гидролиза образцов целлюлозы. По экспериментальным данным (таблица 5) были построены математические модели, описывающие кинетику процессов ферментолиза образцов целлюлозы мискантуса и ПОО на основе модифицированного уравнения Мнхаэлнса-Ментен, предложенного Бриггсом и Холдейном. Определены константы скоростей реакций путём аппроксимации экспериментальных данных методом наименьших квадратов.

Таблица 5 - Зависимости концентрации и выхода РВ через 72 ч от начальной

концентрации субстратов (г/л)

Продолжительность гидролиза, ч Концентрация РВ, г/л

образец целлюлозы мискантуса

АС КС

30 60 90 120 30 60 90 120

8 7,75 14,8 19,6 25,1 13,8 22,7 28,4 26,0

16 13,25 18,9 23,5 27,3 22,4 32,7 42,5 47,1

24 16,00 20,4 28,7 35,5 25,8 39,4 52,8 60,0

32 18,00 26,7 36,3 41,1 27,3 45,5 58,3 68,2

40 19,60 33,0 41,8 47,1 28,3 50,2 63,1 74,0

48 21,00 35,3 46,0 51,2 29,0 53,2 67,2 78,0

56 22,00 36,7 49,5 57,2 29,5 54,5 70,5 82,0

64 22,20 38,0 50,0 58,7 30,0 55,0 71,8 84,3

72 22,20 38,0 50,0 58,7 30,0 55,0 72,0 84,3

Выход РВ, % 66,7 57,0 50,0 44,0 90,0 82,5 72,0 63,2

Продолжительность гидролиза, ч образец целлюлозы плодовых оболочек овса

АС КС

30 60 90 120 30 60 90 120

8 11,5 20,2 22,2 40,0 22,8 26,9 38,4 39,3

16 17,0 28,5 38,4 53,1 27,8 35,2 52,5 60,4

24 20,7 34,7 50,6 59,5 29,3 41,3 62,8 73,3

32 23,2 38,7 59,1 65,1 30,0 45,3 68,3 81,3

40 25,3 41,7 66,5 72,0 30,4 48,3 73,1 87,3

48 26,5 46,0 70,9 79,5 30,5 52,7 77,2 91,3

56 27,3 50,0 76,5 87,1 30,8 58,7 80,5 95,3

64 27,5 53,7 77,6 87,5 30,8 60,0 81,3 96,9

72 27,5 53,8 77,9 87,5 30,8 60 81,3 96,9

Выход РВ, % 82,5 80,7 77,9 65,6 92,4 90,0 81,3 72,7

Согласно классической теории ферментативного катализа Михаэлиса-Ментен получение конечного продукта (РВ) из субстрата (образцы целлюлозы мискантуса и ПОО) проходит через образование фермент-субстратного комплекса ЕБ. При этом реакция образования фермеит-субстратного комплекса характеризуется константой скорости ¿1, реакция его распада - кг, реакция образования конечного продукта Р - кз. Такой механизм описывается следующим уравнением химической реакции:

5 + ±Е (1)

"г

где 5 - субстрат; Е - фермент; ЕБ - фермент-субстратный комплекс; Р - продукт.

В таком случае, обозначив концентрации исходного и промежуточного веществ и продукта реакции как С$, Себ и Ср можно записать систему уравнений, описывающую кинетику процесса фермеитолиза. Уравнения, описывающие процесс ферменто-лиза всех образцов целлюлозы, при их математической записи будут идентичными и отличаются только значениями коэффициентов к\, кг, кг и С„, (С„, - равновесная концентрация РВ).

В начальный момент времени: г=0;Сх=Ст; Со=С/>=0.

Кинетические уравнения, описывающие превращения субстрата в редуцирующие вещества будут записаны следующим образом:

--^Су +

+ (2)

йСр

= кзСЕБ

Решением системы уравнений (2) являются выражения:

=(з>

Сы = -Г-Ц- ^ехР - ехр (к^Ж (4)

где Л2 =±(а + /?);«= 1 + А3 = ¿(а: -/?); /? = (а2

Для построения математической модели необходимо определить величины С„„ ки кг и кз. Коэффициенты скоростей реакций к\, кг и къ зависят от природы субстрата и от внешних условий (температуры, рН, условий перемешивания субстрата в процессе фермеитолиза и др.), которые не менялись. Поскольку в работе фермент взят в избытке, данные коэффициенты не зависят от соотношения фермента и субстрата. Коэффициент С„„ кроме отмеченных факторов, зависит также и от концентрации субстрата. Поэтому прн нахождении коэффициентов системы уравнений для образцов целлюлозы мискантуса и ПОО данные обстоятельства были учтены. Обработка экспериментальных данных осуществлялась следующим образом:уравнения (3) и (4) были объединены в выражение (5), описывающее изменение концентрации РВ: Ср= С„,-(С5+Сы). (5)

Выражение (5) использовалось в качестве аппроксимирующей функции, определяющей коэффициенты моделей для субстратов. Аппроксимация экспериментальных данных, представленных в таблице 5, выполнялась по уравнению (5) методом наименьших квадратов.

Расчет коэффициентов математических моделей (таблица 6) позволил определить константу диссоциации фермент-субстратиого комплекса к, (предложенную Мн-

хаэлисо.м и Ментен) и константу Мнхаэлиса кт (предложенную Брнггсом и Холдей-иом):

к1=к2/к1',кт=к!+кз/к\.

Графическая интерпретация результатов численного моделирования в виде частных решении уравнения (5) с наложением на них экспериментальных точек представлена на рисунке 4.

Из представленных на рисунке 4 результатов следует, что построенные математические модели хорошо согласуются с экспериментальными данными. Адекватность построенных моделей по выражению (5) с учетом коэффициентов моделей, приведенных в таблице 6, была подтверждена по критерию Фишера.

Таблица 6 - Расчетные значения коэффициентов и констант математических моделей процессов фермеитолиза

Образец целлюлозы мискантуса

АС КС

30 60 90 120 30 60 90 120

С„„ г/л 24,90 40,76 53,78 62,28 32,43 56,79 73,30 84,81

ки ч1 0,269 0,323

кг, ч"1 1,378 1,359

къ, ч"1 0,273 0,330

к„ ч"1 5,125 4,208

кт, Ч"' 6,141 5,228

Образец целлюлозы плодовых оболочек овса

АС КС

30 60 90 120 30 60 90 120

С,„, г/л 29,73 53,31 79,33 90,72 33,78 56,69 81,12 95,80

ки ч-1 0,299 0,363

кг, ч"1 1,369 1,348

Ь, ч"1 0,305 0,370

Ь, ч'1 4,577 3,715

к„„ ч ' 5,598 4,733

При оценке эффективности проведенных процессов фермеитолиза субстратов необходимо совместно рассмотреть поведение начальной скорости гидролиза и выхода РВ. Из результатов, представленных в таблице 6, следует, что отношение коэффициентов кг к к\ (величина А:,) для образцов целлюлозы (АС) выше, чем для образцов целлюлозы (КС). Величина к, обратно пропорциональна скорости образования фермент-субстратного комплекса: чем больше /:„ тем медленнее будет происходить образование фермент-субстратного комплекса. Из полученных данных можно сделать вывод, что из образцов целлюлозы (КС) будет значительно быстрее образовываться фермеит-субстратный комплекс, что приведет к росту скорости образования РВ.

Продскожмтепьнос-ть фсрмвгголша, ч О О О 30 г.'л - эксперимент

• • • 60 г/л - эксперимент □ □ □ 90 г/л - эксперимент ■ ■ ■ 120 г/л - эксперимент -30 г/л - расчет

...... 60 г/л - расчет

• 120 г/я - расчет

бО

Продолжительность фермштошоа, ч

О О О 30 г'я - эксперимент

• • • 60 г'а - эксперимент □ □□ 90 г/я - эксперимент ■ ■■ 120 г/л - мклеркмент

30 г'л - расчет

......60 г'д - расчет

.....90 г'л - расчет

• ... . 120 г'л - расчет

Продолжительность фсрментошпа, ч О О О 30 г/л - эксперимент • • • 60 г/л - эксперимент □ ПО 90 г/л - жпсримент ■ ■■ 120 г'л - эксперимент

-30 г'л - расчет

...... 60г'л • расчет

.....90 г'л - ркчет

------120 г

Продолжительность фернехтошпа, ч О О О 30 г.'л - эксперимент • • • 60 г/л - эксперимент □ □ □ 90 г'л - эксперимент ■ ■ ■ 120 г/л - эксперимент

...... 60 г'л - расчет

..... 90 г/я - расчет .... . 120 г.'л-расчет

В Г

Рисунок 4 - Зависимость концентрации РВ от продолжительности ферментолиза для различных концентраций субстратов целлюлоза мискантуса (а - АС; б -КС); целлюлоза ПОО (в - АС; г - КС)

Скорость процесса образования РВ зависит от величины коэффициента кз и величины Себ. При этом у фермент-субстратных комплексов, образованных с участием образцов целлюлозы (КС), значения выше, чем для образцов целлюлозы (АС). Таким образом, скорость получения РВ в исследуемых процессах у образцов целлюлозы (КС) будет выше, чем у образцов целлюлозы (АС).

Графическое изображение начальных скоростей реакций исследуемых процессов представлено на рисунке 5.

Из представленных на рисунке 5 результатов следует, что независимо от вида сырья и начальной концентрации субстрата в рассмотренном диапазоне от 30 г/л до 120 г/л начальная скорость процесса ферментолиза для образцов целлюлозы (АС) ниже, чем для образцов целлюлозы (КС).

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Концентрация субстрата, г/л -АС -КС

30 40 50 60 70

90 100 110 120

Концентрация субстрата, г/д -АС ■КС

Рисунок 5 - Зависимость начальной скорости гидролиза от концентрации субстрата а - образец целлюлозы мискантуса; б - образец целлюлозы ПОО

3.6. Исследование ферментолиза целлюлозы в водной среде. Сбраживание водного гндролизата. Субстрат - образец целлюлозы из мискантуса, полученный на опытно-промышленном производстве азотнокислым способом (таблица 3). Фермен-толиз проводился в круглодонной колбе вместимость 4 л приначалыюй концентрации субстрата 90 г/л. Поддержание рН на уровне 4,6 осуществлялось с помощью орто-фосфорной кислоты. Концентрация РВ в водном гидролизате через 72 ч гидролиза составила 61 г/л. В результате сбраживания гндролизата культурой дрожжей Басскаго-тусе.ч сеге\ Ь1ае ВКПМУ-1693 получена бражка крепостью 2,3 % об., что соответствует выходу этанола 63 % от 100 г РВ. Результаты анализа опытного образца этанола, выделенного методом простой перегонки, представлены в таблице 7 в сравнении с нормативами на этиловый спирт-сырец из пищевого сырья и спирт этиловый технический.

В образце этанола из целлюлозы мискантуса концентрация альдегидо-эфирной фракции достаточно высока, а также в следовых количествах обнаружены ацетон, 2-бутанон, характеризующие этанол как непищевой. Массовая концентрация сивушного масла в опытном образце спирта значительно ниже, чем в спирте-сырце нз пищевого сырья, что легко объясняется отсутствием белков и пептидов в ферментативном гидролизате целлюлозы. Объёмная доля метанола крайне мала. Поскольку, полу-

ченный образец епнрта не подвергался никакой очистке, можно предположить, что после ректификации будет получен этанол высокого качества.

Таблица 7 - Результаты анализа образца этанола методом газо-жидкостной хроматографии в сравнении с нормативами

Показатель Образец этанола из целлюлозы мискантуса Этиловый спирт-сырец из пищевого сырья Спирт этиловый технический

спирт-сырец из всех видов сырья спирт-сырец из мелассы марки А ОКП91 8213 1100 марки Б ОКП91 8213 1200

Массовая концентрация альдегидов, мг/дм3 800+50 <300 <500 <200 <350

Массовая концентрация сивушного масла, мг/дм3 1800+50 <5000 <5000 <500 < 1000

Массовая концентрация эфиров, мг/дм3 500+50 <500 <700 <80 < 180

Содержание метанола, об. % 0,0007+0,0002 <0,13 - <0,1 <0,1

Показано, что водный гидролизат целлюлозы мискантуса является питательной средой, которая обеспечивает успешное развитие микроорганизмов, и может быть рекомендован для конверсии не только в этанол, но и в другие продукты микробного метаболизма.

3.7. Оценка зависимости реакционной способности к ферментативному гидролизу от физико-химических характеристик субстратов на примере продуктов химической переработки мискантуса. С целью определения факторов, оказывающих влияние на процесс ферментативного гидролиза, был исследован гидролиз продуктов химической переработки мискантуса с известными характеристиками, такими как степень полимеризации, степень кристалличности, массовая доля остаточного лигнина.

Целлюлозосодержащий продукт (ДСП) был получен предварительным гидролизом измельченного мискантуса раствором Н1ЧОз, липюцеллюлозный материал (ЛЦМ) - азотнокислой варкой ДСП, техническая целлюлоза 1 (Ц 1) - обработкой ЛЦМ раствором N3011, целлюлозы 2 (Ц 2) - декатионированием Ц1. Характеристики субстратов представлены в таблице 8.

Результаты ферментативного гидролиза продуктов химической обработки мискантуса (таблица 9, рисунок 6) показали отсутствие заметной корреляции между характеристиками субстратов и их реакционной способностью. Субстраты, лигноцел-люлозный материал и обе целлюлозы с высокими значениями СК и СП целлюлозы при ферментативном пиролизе характеризуются выходами РВ 80-86 % от массы субстрата и 91-93 % от массового содержания гидролизуемых компонентов.

Таблица 8 - Характеристики продуктов химической обработки мискантуса

Субстрат Влажность, Массовая доля, % Характеристики

% целлюлозы

целлюлозы пентозанов лигнина золы СП2 СК\ %

ЦСП 7,9 62,81 9,6 20,9 2,0 - =46

ЛЦМ 77,6 79,9 4,7 8,8 3,7 - 66

Ш 77,4 89,6 1,3 2,6 7,0 1005 65

Ц2 75,0 95,5 1,2 3,0 2,2 1060 72

1 - массовая доля целлюлозы по Кюршнеру; 2 - степень полимеризации; 3 - степень

кристалличности.

Следует отметить отсутствие ингибирующего действия у кислотонерастворимо-го лигнина в составе лигноцеллюлозного материала: при гидролизе последнего с м.д. лигнина 9 % выход РВ от массового содержания гидролизуемых компонентов достигает 92 %. Данный факт можно связать с отсутствием у частично окисленного в процессе получения лигноцеллюлозного материала лигнина функциональных групп, способных дезактивировать ферментные препараты.

Таблица 9 - Результаты ферментативного гидролиза продуктов химической обработки мискантуса

Показатель Субстрат

ЦСП ЛЦМ Ш Ц 2

Конечная концентрация РВ, г/л 6,8 29,8 31,0 32,0

Выход РВ, %

от массы субстрата 18,4 80,4 83,6 86,4

от массового содержания гидролизуемых компонентов 23,9 91,9 92,5 91,1

Конечная концентрация пентоз, г/л 0,6 1,0 0,4 0,3

Выход пентоз от массового содержания пентозанов в 16,5 56,2 81,2 55,0

субстрате, %

3.8. Исследование реакционной способности к ферментолизу продуктов переработки мискантуса и ПОО, полученных различными способами. В качестве способов предварительной обработки сырья рассмотрены: гидротермобарическая обработка (1,5 МПа/600 с), гидротропная варка, обработка раствором азотной кислоты и щелочная делигнификация (глава 2). Способы предварительной обработки мискантуса и плодовых оболочек овса и результаты оценки реакционной способности к фер-ментолизу полученных продуктов представлены в таблице 10.

Продолжительность гидролиза, ч —»-ЦСП; -«-ЛЦМ: —-Ц1: -*-Ц2

Рисунок 6 - Зависимость выхода РВ от продолжительности гидролиза продуктов химической обработки мискантуса

Субстраты, полученные гидротермобарической обработкой в указанных условиях, при ферментолизе позволяют достигнуть выходов РВ от массового содержания гидролизуемых компонентов 50-95 % (волокнистый продукт) и 87-91 % (целлюлоза).

При ферментативном гидролизе гидротроиной целлюлозы мискантуса выход РВ составляет 74 %, а добавление к смеси ферментных препаратов ПАВ «Тиееп 80» в концентрации 0,1 % в пересчете на массу субстрата гарантированно увеличивает выход до 87 %.

Таблица 10 - Результаты ферментолнза продуктов предварительной обработки мискантуса и ПОО

Субстрат Выход РВ от массового содержания гидролизуемых компонентов в субстрате, %

мискантус ПОО

Продукты гидротермобарической обработки: - волокнистый продукт - целлюлоза 56,0 86,8 95,0 90,7

Гидротропная целлюлоза 74,0-87,0* 95,5

Лигноцеллюлозный материал после обработки НМОз 92,0 98,3

Волокнистый материал после обработки №ОН: 94,6 99,9

* - ферментолиз с добавлением ПАВ «Т\уееп 80»

Обработка сырья в одну стадию разбавленными растворами НИОз или N8011 обеспечивает получение субстратов с выходами РВ при гидролизе 92-100 %.

Проведенные эксперименты позволили рекомендовать обработку мискантуса и плодовых оболочек овса разбавленными растворами азотной кислоты или гидроксида натрия для получения высококонцентрированных глюкозных гидролизатов с целью последующего их микробиологического использования. При этом происходит упрощение процесса получения субстратов, обладающих высокой реакционной способностью к ферментативному гидролизу.

Технология ферментативного гидролиза целшолозосодержащего сырья интегрирована в комплексную блок-схему переработки недревесного сырья в полезные продукты ИПХЭТ СО РАН (рисунок 7, красным цветом выделены процессы, представленные в диссертационной работе) с наработкой укрупненных партий опытных образцов лигноцеллюлозного материала и волокнистого продукта, которые затем были использованы в качестве субстратов при ферментолизе в ацетатном буфере, водной среде и масштабировании по объему в ферментере емкостью 11 л. Технология внедрена на опытно-промышленном производстве ИПХЭТ СО РАН.

Рисунок 7 - Комплексная блок-схема переработки недревесного сырья в полезные продукты ИПХЭТ СО РАН

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана технология биоконверсии мискантуса и ПОО, включающая обработку сырья в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты или щелочи и ферментолиз полученного субстрата при температуре (45±2) °С, рН(4,6+0,3) с использованием высокоэффективной мультиэнзимной композиции из препаратов «А», «Б» и «В» в соотношении 1:1:1, который был внедрен в условиях опытного производства ИПХЭТ СО РАН.

2. Разработан состав мультиэнзимной композиции из комплекса целлюлазиых, ксиланазных и р-глюканазпых ферментов, который по сравнению с индивидуальными препаратами приводит к увеличению выхода РВ при гидролизе исходного сырья на 7-9 %, целлюлозы на 18-24 %.

3. Определены оптимальные параметры ферментативного гидролиза разработанной мультиэнзимной композицией, позволяющие получить максимальный выход РВ: температура (45±2) °С, рН (4,6±0,3) и концентрация субстрата 30 г/л. Продолжительность процесса - для каждого вида субстрата отдельно.

4. Разработана и апробирована методика оценки реакционной способности к ферментативному гидролизу различных целлюлозосодержащих субстратов.

5. Экспериментально установлено, что:

- при гидролизе образцов целлюлозы мисканту са и ПОО с увеличением начальной концентрации субстрата от 30 г/л до 120 г/л конечная концентрация РВ в гидролизатах увеличивается от 20 г/л до 100 г/л со снижением выхода РВ от 90 % до 45 %;

- для проведения масштабирования процесса ферментолиза по объему образцов целлюлозы рекомендуемая начальная концентрация субстрата составляет 60-90г/л, что обеспечивает степень конверсии 50-80 %.

6. Построены математические модели на основе модифицированного уравнения Михаэлиса-Ментен, описывающие кинетику процессов ферментолиза образцов целлюлозы мискантуса и ПОО. На их основе определены константы скоростей реакций ферментолиза и установлено, что независимо от вида сырья при начальной концентрации субстрата в диапазоне от 30 г/л до 120 г/л начальная скорость процесса ферментолиза для образцов целлюлозы, полученных азотнокислым способом, ниже, чем для образцов целлюлозы, полученных комбинированным способом.

7. Получен этанол сбраживанием водного гидролизата целлюлозы мискантуса с выходом спирта 63 % от 100 г РВ, что подтверждает возможность использования ферментативного гидролизата, полученного по разработанной технологии, как питательной среды для получения продуктов микробиологического синтеза.

8. На модели продуктов химической переработки мискантуса установлено:

- отсутствие корреляции между реакционной способностью к ферментативному гидролизу и физико-химическими характеристиками субстратов: продукты с вы-

сокими значениями степени полимеризации (1000) и степени кристалличности (65-72 %) целлюлозы при гидролизе обеспечивают выход РВ от массового содержания гидролизуемых компонентов 91-93

- отсутствие ингибирующего действия кислотонерастворимого лигнина в составе лигноцеллюлозного материала на ферментные препараты: субстрат с массовой долей лигнина 9 % обеспечивает выход РВ от массового содержания гидролизуемых компонентов 92 %.

9. Сравнительная оценка различных способов предварительной обработки мискантуса и ПОО (гидротермобарической обработки, гидротропной варки, обработки разбавленным раствором кислоты или щелочи) показала, что максимальный выход РВ при гидролизе (92-100 %) достигается при обработке разбавленным раствором кислоты или щелочи, независимо от вида сырья.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предложены следующие документы:

- технический акт внедрения «Способ ферментативного гидролиза недревесного сырья (мискантуса и плодовых оболочек овса)», утвержден директором ИПХЭТ СО РАН 05.11.2014 г.;

- «Методика определения концентрации глюкозы на спектрофотометре Unico (модель 2804) в лабораторных условиях», утверждена директором ИПХЭТ СО РАН 06.05.2011 г.

6. СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

6.1. Список научных публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования н науки РФ

1. Макарова Е.И. Использование мультиэнзимных композиций для гидролиза нетрадиционного целлюлозосодержащего сырья / Е.И. Макарова, В.В. Будаева, Р.Ю. Митрофанов // Ползуновский вестник. - 2010. - № 4-1. - С. 192-198. - 0,52 п.л. (лично автором 0,36 пл.).

2. Сакович Г.В. Опыт масштабирования ферментативного гидролиза технических целлюлоз мискантуса и плодовых оболочек овса / Г.В. Сакович, В.В. Будаева, Е.А. Скиба, Е.И. Макарова, И.Н. Павлов, А.Н. Кортусов, В.Н. Золотухин // Ползуновский вестник. - 2012. -№4. - С. 173-177. -0,46 п.л. (лично автором 0,14 п.л.).

3. Скиба Е.А. Получение ферментативных гидролизатов технических целлюлоз мискантуса и их спиртовое брожение / Е.А. Скиба, В.В. Будаева, И.Н. Павлов, Е.И. Макарова, В.Н. Золотухин, Г.В. Сакович // Биотехнология. - 2012. - № 6. - С. 42-52. - 1,31 п.л. (лично автором 0,40п.л.).

4. Макарова Е.И. Результаты ферментации целлюлозы мискантуса в ацетатном буфере и водной среде / Е.И. Макарова // Химия в интересах устойчивого развития. - 2013. - Т. 21, № 2. - С. 219-225. - 0,65 п.л. (лично автором 0,65 п.л.).

5. Будаева В.В. Получение лигноцеллюлозных материалов из недревесного сырья и исследование их в качестве субстратов ферментативного гидролиза / В.В. Будаева, Е.А. Скиба, Е.И. Макарова, В.Н. Золотухин, Г.В. Сакович, Е.В. Удоратина, Л.А. Кувшинова, Т.П. Щербакова, A.B. Кучин // Ползуновский вестник. - 2013. - № 1. - С. 215-219. - 0,46 п.л. (лично автором 0,09 п.л.).

6. Макарова Е.И. Ферментативный гидролиз гидротропных целлюлоз / E.II. Макарова, М.Н. Денисова, В.В. Будаева, Г.В. Сакович // Ползуновский вестник. - 2013. - № 1. - С. 219222. - 0,30 п.л. (лично автором 0,18 пл.).

7. Budaeva V.V. Enzymatic hydrolysis of the products of hydro-thermobaric processing of Miscanthm and oat hulls / V.V. Budaeva, E.I. Makarova, E.A. Skiba, G.V. Sakovich // Catalysis in Industry. - 2013. - V. 5, № 4. - P. 335-341. D01:10.1134/S207005041304003X. - 0,85 п.л. (лично автором 0,3 п.л.).

8. Макарова E.II. К вопросу о роли степени кристалличности целлюлозы при ферментативном гидролизе / Е.И. Макарова, В.В. Будаева, В.Н. Золотухин, И.В. Люханова, JI.A. Алешина // Ползуновский вестник. - 2013. - № 3. - С. 188-193. - 0,51 п.л. (лично автором 0,3 п.л.).

9. Будаева В.В. Исследование кислотного и ферментативного гидролиза пеллет из рапсовой соломы / В.В. Будаева, Е.И. Макарова, Е.А. Скиба, Г.В. Сакович, В.В. Симирский, Д.Л. Лисовский, О.А. Ивашкевич // Ползуновский вестник. - 2013. - № 3. - С. 173-179. -0,66 п.л. (лично автором 0,2 п.л.).

10. Кухленко А.А. Влияние способа предварительной обработки плодовых оболочек овса на эффективность ферментативного гидролиза / А.А. Кухленко, М.С. Василишин, С.Е. Орлов, Д.Б. Иванова, В.Н. Золотухин, Е.И. Макарова, В.В. Будаева // Ползуновский вестник. -2013. - № 3. - С. 238-243. -0,46 п.л. (лично автором 0,09 п.л.).

11. Скиба Е.А. Ферментативный гидролиз целлюлоз плодовых оболочек овса / Е.А. Скиба, В.В. Будаева, Е.И. Макарова, И.Н. Павлов, В.Н. Золотухин, Г.В. Сакович // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. - Т. 16, № 20. - С. 195-198. - 0,25 п.л. (лично автором 0,08 п.л.).

12. Скиба Е.А. Биоэтанол из целлюлозы плодовых оболочек овса / Е.А. Скиба, В.В. Будаева, Е.И. Макарова, И.Н. Павлов, В.Н. Золотухин, Г.В. Сакович // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. - Т. 16, № 22. - С. 202-205. - 0,25 п.л. (лично автором 0,08 п.л.).

13. Makarova E.I. Enzymatic hydrolysis of celluloses obtained via the hydrothermal processing of Miscanthus and oat hulls / E.I. Makarova, V.V. Budaeva, E.A. Skiba, G.V. Sakovich // Catalysis in Industry. - 2014. - Vol. 6, № 1. - P. 67-71. DOMO.1134/S20700504140061. -0,77 п.л. (лично автором 0,46 п.л.).

14. Makarova E.I. Enzymatic Hydrolysis of cellulose from oat husks at different substrate concentrations / E.I. Makarova, V.V. Budaeva, E.A. Skiba // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2014. - V. 40, № 7. - P. 726-732. - 1 п.л. (лично автором 0,7 п.л.).

15. МакароваЕ.И. Глюкозный гидролизат из гидротропной целлюлозы мискантуса (влияние «Tween 80») / Е.И. Макарова, М.Н. Денисова, И.Н. Павлов, В.В. Будаева, Г.В. Сакович // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2014. 9. - С. 2156-2159. - 0,52 п.л. (лично автором 0,36 п.л.).

6.2. Список патентов

16. Патент РФ № 2533921, С13К1/02. Способ предварительной обработки целлюлозосо-держащего сырья для ферментативного гидролиза / Будаева В.В., Макарова E.II., Скиба Е.А., Золотухин В.Н., Сакович Г.В. - Опубл. 27.11.2014.

6.3. Список научных публикации в других изданиях

17. Макарова Е.И. Зависимость прироста глюкозы от концентрации субстрата при ферментации целлюлозы мискантуса / Макарова Е.И., Будаева В.В. // Альтернативные источники сырья и топлива: тезисы докладов III Международной научно-технической конференции «АИСТ - 2011 ». - Минск, 2011. - С. 50.

18. Макарова Е.И. Исследование ферментативного гидролиза технических целлюлоз мискантуса и плодовых оболочек овса // Новые достижения в химии и химической техноло-

run растительного сырья: материалы V Всероссийской конференции. - Барнаул, 2012 г. -С. 55-57.

19. Макарова Е.И. Сравнительная характеристика реакционной способности к ферментации гидротропных целлюлоз // Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии: труды Всероссийской научной молодежной школы-конференции. - Омск-Новосибирск, 2012. - С. 311-312.

20. Макарова Е.И. Последовательная ферментация технической целлюлозы мискантуса / Химия и технология новых веществ и материалов: материалы II Всероссийской молодежной научной конференции. — Сыктывкар, 2012. — С. 77.

21. Макарова Е.И. Разработка способа ферментативного гидролиза биомассы недревесного сырья / Достижения и перспективы развития биотехнологии: материалы международной научной конференции. - Саранск, 2012. — С. 142.

22. Макарова Е.И. Влияние химической обработки мискантуса на реакционную способность к ферментации / Макарова Е.И., Будаева В.В., Скиба Е.А. // Химическая технология и биотехнология новых материалов и продуктов: тезисы докладов IV Международной конференции РХО им. Д.И. Менделеева. — Москва, 2012. — Т. 1. — С. 54-56. .

23. Макарова Е.И. Ферментативный гидролиз продуктов химической переработки мискантуса / Макарова Е.И., Будаева В.В., Люханова И.В., Алешина Л.А. // Молодежь и наука на Севере: материалы III Всероссийской молодежной научной конференции. - Сыктывкар, 2013.-Т 2.-С. 31-32.

24. Макарова Е.И. Ферментативный гидролиз брикетированной рапсовой соломы // Альтернативные источники сырья и топлива: тезисы докладов IV Международной научно-технической конференции «АИСТ - 2013». - Минск, 2013. - С. 72.

25. Макарова Е.И. Глюкозный гидролизат из гидротропной целлюлозы мискантуса (влияние «Tween 80») / Макарова Е.И., Денисова М.Н., Павлов И.Н., Будаева В.В., Сакович Г.В. // Химия и технология растительных веществ: материалы VIII Всероссийской конференции. - Калининград, 2013. - С. 139.

26. Макарова Е.И. Ферментативный гидролиз целлюлоз при различных концентрациях субстрата // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы VI Всероссийской конференции с международным участием. — Барнаул, 2014. -С. 406-408.

27. Денисова М.Н. Зависимость реакционной способности к ферментолизу гидротропной целлюлозы от вида сырья / Денисова М.Н., Макарова Е.И. // Биотехнологии в химико-лесном комплексе: материалы международной научной конференции. — 2014. — Архангельск. -С. 134-137.

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ПОО - плодовые оболочки овса;

«А» — ферментный препарат «Целлолюкс-А»;

«Б» - ферментный препарат «Брюзайм BGX»;

«В» — ферментный препарат «Рапидаза ЦР»;

«Г» — ферментный препарат «Целлюксил»;

РВ - редуцирующие вещества;

АС - азотнокислый способ;

КС — комбинированный способ;

М.д. - массовая доля.

Подписано в печать 06.02.2015г.

Усл.п.л. -1.5 Заказ № 25565 Тираж: 110 экз.