Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Целлюлолитические ферментные препараты на основе грибов Trichoderma, Penicillium и Myceliophtora с увеличенной гидролитической активностью

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Целлюлолитические ферментные препараты на основе грибов Trichoderma, Penicillium и Myceliophtora с увеличенной гидролитической активностью"

На правах рукописи

/

ЧЕКУШИНЛ АННА ВЯЧЕСЛАВОВНА

Целлюлолитические ферментные препараты на основе грибов Trichoderma, Pénicillium и Myceliophtora с увеличенной гидролитической активностью

03.01.04 Биохимия

2 8 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2013

005539697

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха

Российской академии наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Снницмп Аркадий Пантслсймонович

Официальные оппоненты: Нифаптьсв Николай Эдуардович

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Федеральное государственное бюджетное учреждения науки Институт органической химии имени Н.Д. Зелинского Российской академии наук заведующий лабораторией

Скомаровский Антон Андреевич

кандидат химических наук «БиоХимМак Диагностика» Закрытое акционерное общество специалист по продукции

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

Защита состоится «19» декабря 2013 года в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук и доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.

Автореферат разослан

// 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Орловский А.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Большие запасы возобновляемой растительной биомассы (около одного триллиона тонн) делают её привлекательным сырьём для получения различных полезных продуктов. Широкое разнообразие ферментов и их характеристик предоставляет большие возможности для эффективной переработки растительного сырья в сахара. Глюкоза, получаемая ферментативным путём из целлюлозы, может быть конвертирована с помощью микроорганизмов в этанол, бутанол, ацетон, органические и аминокислоты, полимеры и многие другие продукты микробного синтеза. Таким образом, растительная биомасса может служить (частичной) альтернативой нефти, которая в настоящее время является основным сырьем при производстве различных продуктов органического синтеза, а также для получения моторного топлива.

К ферментам, осуществляющим конверсию целлюлозосодержащего сырья (ЦСС), относятся различные эндоглюканазы (ЭГ) и целлобиогидролазы (ЦБГ), осуществляющие деструкцию нерастворимой целлюлозы, а также ксиланазы, гидролизующие ксилан (гемицеллюлозу). Однако в последнее время была наглядно продемонстрировано существенное влияние на общую кооперативную эффективность процессов биоконверсии ЦСС «вспомогательных» ферментов (реализация т.н. boosting эффекта), осуществляющих гидролиз растворимых олигосахаридов (например, Р-глюкозидаз и Р-ксилозидаз), а также ферментов негидролитической природы (полисахаридмонооксигеназ, ПМО).

Целлюлолитические ферменты и многие другие карбогидразы продуцируются преимущественно микроскопическими грибами. Мутантные или рекомбинантные штаммы грибов рода Trichoderma играют ведущую роль среди промышленных продуцентов целлюлолитических ферментов, что объясняется, во-первых, их высокой секреторной способностью, а, во-вторых, разнообразием состава продуцируемого ферментного комплекса. Поэтому неудивительно, что ферментные препараты целлюлаз и гемицеллюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются в разных странах ведущими производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), DuPont&Genencor (США) и др. При этом следует подчеркнуть, что поиск новых продуцентов ферментов, предназначенных для гидролиза ЦСС, по-прежнему является актуальной задачей. Грибы рода Pénicillium, Myceliophtora (ранее Chrysosporium) и др. могут стать достойной альтернативой штаммам рода Trichoderma, поскольку по наиболее важным биотехнологическим критериям не уступают, а иногда и превосходят лучшие из известных штаммов Trichoderma.

Выбор для гидролиза ЦСС высокоэффективных целлюлолитических ферментных препаратов, представляющих собой многокомпонентные ферментные

комплексы, зависит от ряда факторов и, в значительной степени, от сбалансированности состава ферментного комплекса и уровня активности его индивидуальных компонентов. Очевидно, что для осуществления максимально эффективного гидролиза ЦСС первостепенное значение приобретает решение задачи, связанной с пониманием оптимального качественного и количественного состава ферментного комплекса. Поэтому в области ферментативной конверсии ЦСС активно ведутся фундаментальные исследования и прикладные разработки не только по поиску и получению новых высокоактивных микроорганизмов-продуцентов, но также по поиску новых ферментов, как с высокой гидролитической способностью, так и обладающих «вспомогательной» функцией в процессах гидролиза. Результатом таких исследований могут быть ферментные препараты, способные осуществлять высокоэффективную конверсию различных видов ЦСС. Исследования, проведенные в нащей лаборатории ранее, показали, что ферментные комплексы, секретируемые грибом Pénicillium verruculosum могут стать достойной альтернативой современным промышленным ферментным препаратам. Поэтому в диссертационной работе мы проводили исследование по поиску возможностей дальнейшего увеличения эффективности ферментного комплекса P.verruculosum в процессах биоконверсии ЦСС.

Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось получение высокоэффективных целлюлолитических ферментных препаратов с увеличенной гидролитической активностью по отношению к различным видам ЦСС. Для этого было необходимо решить следующие задачи:

• Сопоставить гидролитическую активность и компонентный состав новых промышленных ферментных препаратов, выпускаемых ведущими зарубежными компаниями, предназначенных для гидролиза ЦСС;

• Определить оптимальный состав ферментного препарата для гидролиза ЦСС;

• Провести сравнительный анализ лучшего промышленного ферментного препарата и лабораторного препарата на основе гриба рода P.verruculosum по таким параметрам как компонентный состав и гидролитическая активность по отношению к различным видам ЦСС;

• Создать новый продуцент P.verruculosum и получить новый целлюлазный ферментный препарат с увеличенной гидролитической активностью, исследовать его состав, свойства и возможности применения в процессах биоконцерсии ЦСС.

Научная новизна и практическая значимость работы. На основании результатов анализа компонентного состава различных ферментных комплексов, продуцируемых грибами родов Trichoderma и Myceliophtora, обладющих высокой гидролитической активностью по отношению к различным видам ЦСС, выявлены общие закономерности их «конструирования»: содержание целлобиогидролаз - от 30

4

до 60%, эндоглюканаз - от 10 до 30%, Р-глюкозидаз - от 5 до 20%, ксиланаз - от 5 до 10% от общего содержания белка. Исследовано влияние полисахаридмонооксигеназ грибов Myceliophtora thermophila, Trichoderma reesei и Thelavia terrestris как нового компонента целлюлазного комплекса на эффективность гидролиза различных видов ЦСС под действием ферментных препаратов. Установлено, что полисахарид-монооксигеназы являются важным компонентом целлюлазного комплекса и оказывают существенное положительное влияние на увеличении эффективности ферментативной конверсии ЦСС. Впервые на основе рекомбинантного штамма гриба P.verruculosum получен ферментный препарат, имеющий в своем составе полисахаридмонооксигеназу из M.thermophila, определен его компонентный состав, биохимические свойства и показано, что этот препарат значительно эффективнее гидролизует различные виды ЦСС (в случае микрокристаллической целлюлозы выход продуктов гидролиза увеличивается на 60%, для различных видов растительного сырья - на 40%), чем препарат, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum. Ферментный препарат P.verruculosum, содержащий полисахаридмонооксигеназу M.thermophila по своей эффективности гидролиза ЦСС сравним с лучшими новыми коммерческими целлюлазными ферментными препаратами, предназначенными для биоконверсии ЦСС. Показано, что совместное применение целлюлазного ферментного препарата P.verruculosum и Р-глюкозидазного ферментного препарата P.verruculosum приводит к увеличению общей гидролитической активности ферментного комплекса до уровня современных промышленных препаратов.

Апробаиия работы. Основные результаты исследований были представлены на международных конференциях и конгрессах: «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010), «Ломоносов - 2012» (Москва, 2012), «Ломоносов - 2013» (Москва, 2013), «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012), «Biocatalysis: fundamentals & applications» (Москва, 2013), «Физико-химия растительных полимеров» (Архангельск, 2013), «Биомасса: топливо и энергия» (Москва, 2012), «Биотехнология: состояния и перспективы развития» (Москва, 2013) и «EU-Russia: cooperation in biotechnology, agriculture, forestry, fisheries and food» (Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, а также 1 статья и 10 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (главы 1 -4), отдельной главы с изложением материалов и методов исследования (глава 5), результатов и их обсуждение (главы 6-8), выводов и списка

литературы, включающего 157 источников. Работа изложена на 98 страницах печатного текста, содержит 36 рисунков и 14 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Состав и свойства промышленных целлюлазных ферментных препаратов, полученных с помощью различных продуцентов

Важными характеристиками целлюлазных ферментных препаратов являются их активности по отношению к различным субстратам, компонентный состав ферментного комплекса, а также гидролитическая способность (активность) в процессах биоконверсии различных видов ЦСС. В работе были исследованы новые промышленные ферментные препараты, созданные для ферментативного гидролиза ЦСС, продуцируемые грибами рода Тпскос/егта (серии СеШс СТес и АсссНегаэе), а также грибом МлЬегторИИа (серия С1).

Активность промышленных ферментных препаратов. Одним из важных критериев для сравнения эффективности ферментных препаратов, предназначенных для биоконверсии ЦСС, является их удельная активность по ряду специфических субстратов - растворимых и нерастворимых полисахаридов, таких как микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ, авицел), карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), ксилан, а также олигосахаридов (целлобиозы). Активности исследуемых препаратов по отношению к этим субстратам были определены нами по начальным скоростям гидролиза и приведены в табл. 1.

Таблица 1. Удельные активности промышленных ферментных препаратов по

отношению к различным субстратам, (ед./мг белка).

Продуценты препаратов Ферментные препараты Активность

Авицел-азная КМЦ-азная Целлоби -азная Ксилан-азная

40°С, рН 5.0 50°С, рН 5.0 40°С, рН 5.0 50°С, рН 5.0

T.reesei Cellic CTecl 0,3 10,9 2,4 1,5

Celtic CTec2 0,3 15,6 4,0 11,3

Cellic СТесЗ 0,5 18,7 13,9 12,6

T.reesei Accellerase 1000 1,2 12,3 2,7 2,4

Accellerase DUET 0,8 7,9 2,2 14,0

Accellerase TRIO 0,7 14,0 10,0 20,0

M.thermophila CI 1 0,2 12,6 2,6 2,9

CI 2 0,3 43,2 4,5 10,1

CI 3 0,3 41,2 4,6 10,2

С14 0,4 12,2 2,4 3,5

Удельная активность по МКЦ иллюстрирует способность ферментных препаратов гидролизовать высокоупорядоченные кристаллические зоны целлюлозы и, в целом, характеризует активность ЦБГ. Препараты серии Accellerase характеризовались наиболее высокими значениями удельной авицелазной активности: от 0,7 ед./мг белка (Accellerase TRIO) до 1,2 ед./мг белка (Accellerase 1000). Для остальных ферментных препаратов значения удельной активности по отношению к МКЦ варьировало от 0,2 ед./мг белка (С 14) до 0,5 ед./мг белка (Cellic СТесЗ).

Удельная активность препаратов по КМЦ демонстрирует их способность гидролизовать менее упорядоченные, аморфные зоны целлюлозы, и характеризует активность ЭГ. Исследуемые промышленные ферментные препараты характеризовались значениями удельной активности по КМЦ в пределах 10-20 ед./мг белка, за исключением препаратов С1_2 и С1_3, которым соответствовали наиболее высокие значения удельной КМЦ-азной активности (43,2 и 41,2 ед./мг белка, соответственно). Следует отметить, что наиболее высокие значения удельной активности по отношению к КМЦ наблюдались в серии препаратов Cellic СТес для Cellic СТесЗ (18,7 ед./мг белка), а в серии препаратов Accellerase для Accellerase TRIO (14,0 ед./мг белка).

Удельная активность препаратов по целлобиозе (Р-глюкозидазная активность, БГЛ) характеризует их способность конвертировать образующиеся в ходе гидролиза ЦСС целлобиозу и целлоолигосахариды (растворимые промежуточные продукты) в глюкозу. Значения активностей рассматриваемых препаратов по целлобиозе заметно отличались друг от друга. Препараты Cellic CTecl, Accellerase 1000, Accellerase DUET, Cl_l и Cl_4 характеризовались низкой удельной активностью по отношению к целлобиозе (от 2,2 до 2,7 ед./мг белка), удельные активности препаратов Cellic СТес2, С1_2 и С1_3 были примерно в 2 раза выше (от 4,0 до 4,6 ед./мг белка), а у препаратов Cellic СТесЗ и Accellerase TRIO - примерно в 4 раза выше (13,9 и 10,0 ед./мг белка, соответственно).

Исследованные ферментные препараты продемонстрировали разный уровень ксиланазной активности: у Cellic CTecl значение удельной активности (1,5 ед./мг белка) было самое низкое, ~ в 2 раза меньше, чем у препаратов Accellerase 1000, С1_1 и С1_4 (от 2,4 до 3,5 ед./мг белка), и в ~7-10 раз меньше, чем удельная активность остальных ферментных препаратов. Следует отметить, что наиболее высокое значение ксиланазной удельной активности демонстрировал препарат Accellerase TRIO (20,0 ед./мг белка).

Таким образом, по результатам изучения удельных активностей промышленных ферментных препаратов можно сделать вывод о том, что Cellic СТесЗ и

Accellerase TRIO значительно превосходят остальные препараты по значениям удельных активностей по отношению к целлобиозе и ксилану, что позволяет предположить, что в их составе увеличено содержание БГЛ и ксиланаз. Препараты С12 и С1_3 характеризовались наиболее высокими значениями по отношению к КМЦ, что говорит о высоком содержании ЭГ. Однако, как уже было отмечено выше, приведённые активности были определены нами по начальным скоростям гидролиза соответствующих субстратов, и их сопоставление не всегда является достаточным для сравнения препаратов, поскольку в ходе длительного гидролиза ЦСС существенное значение приобретают процессы инактивации ферментов, ингибирования их лигнином (за счёт непродуктивной адсорбции на нём ферментов), а также ингибирования ферментов продуктами реакции. Поэтому нами было проведено сравнение активности исследуемых ферментных препаратов в ходе длительного процесса гидролиза различных видов ЦСС (МКЦ и различные виды предобработанного растительного лигнифицированного сырья - измельченной осиновой древесины, измельченной обессмоленной сосновой древесины и измельченной багассы).

Эксперимент проводили при дозировке ферментных препаратов 2, 5 и 10 мг белка на 1 г субстрата, в качестве продуктов гидролиза определяли глюкозу и восстанавливающие сахара (ВС), отбирая пробы из реакционной смеси через 3, 24 и 48 часов после начала гидролиза. На рис.1 представлены данные, характеризующие выход ВС и глюкозы через 24 часа гидролиза при дозировке ферментных препаратов 5 мг/г субстрата, так как именно в этих условиях наилучшим образом проявлялось различие в гидролитической активности разных препаратов.

Гидролитическая активность ферментного препарата Cellic СТесЗ была в 2-2,5 раза более высокой по сравнению с ферментным препаратом Cellic CTecl и на 1020% более высокой по сравнению с Cellic СТес2. В серии препаратов Accellerase наибольшей гидролитической активностью обладал Accellerase TRIO, препараты Accellerase 1000 и DUET проявляли более низкую (и близкую между собой) гидролитическую активность. Препараты серии С1 характеризовались близкой гидролитической активностью по отношению ко всем видам ЦСС, несколько более высокой гидролитической активностью в этой серии обладал препарат С1_4.

Таким образом, наибольшую гидролитическую активность по отношению к ЦСС проявляли промышленные ферментные препараты Cellic СТесЗ, Accellerase TRIO и С1_4, причём первый из них был наиболее активным. С точки зрения значений удельных активностей (табл.1) одним из факторов, позволяющих интерпретировать полученные результаты является достаточно высокая целлобиазная (БГЛ) активность этих препаратов.

О^ о^ с>0 / ^ / о- О- О- О-о* О- О- / *

Рисунок 1. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 24 часа гидролиза различных видов ЦСС: А) измельченная багасса; Б) измельченная и обессмоленная сосна; В) измельченная осина; Г) МКЦ. Условия: 50°С, рН 5, [5]= 100 г/л, [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 1000 об/мин.

9

Компонентный состав промышленных ферментных препаратов.

Качественный состав исследуемых ферментных препаратов был определен с помощью двухстадийного хроматографического фракционирования, с последующим измерением специфических активностей полученных фракций по отношению к различным субстратам, электрофоретического разделения фракций, масс-спектрометрического анализа фрагментов белковых полос полиакриламидного геля и сопоставления полученной информации с белковыми базами данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Количественный состав ферментных препаратов изучали путем определения содержания индивидуальных ферментов в хроматографических фракциях. Концентрацию ферментов во фракциях измеряли спектрофотометрически как отношение поглощения фракции на 280 нм (А280) к среднему коэффициенту экстинкции белка, который принимали равным 2,0. За содержание каждого фермента в исследуемом ферментном препарате принимали массовую долю этого фермента, рассчитанную относительно общего количества белка в образце и выраженную в процентах.

Используемый нами подход для определения компонентного состава ферментных препаратов можно проиллюстрировать на примере препарата Cellic СТесЗ. Ферментный препарат обессоливали методом гель-проникающей хроматографии на носителе Bio-Gel Р6 и фракционировали методом анионообменной хроматографии среднего давления (FPLC) на колонке с носителем Source 15Q (объем 1 мл) при рН 7,0 в линейном градиенте соли (1 M NaCl). В результате были получены несвязавшаяся с носителем фракция (NB) и ряд фракций, элюирущихся в градиенте NaCl. Электрофореграмма полученных фракций и хроматографический профиль фракционирования препарата Cellic СТесЗ на колонке Source 15Q представлены на рис.2 и 3, соответственно.

На рис.4 приведен MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата фрагмента белковой полосы полиакриламиднго геля и результаты идентификации пептидов на примере БГЛ 120 кДа Aspergillus fumigatus. Анализ результатов MALDI-TOF масс-спектрометрии проводили с использованием программы Bruker Data Analysis, а поиск пептидов осуществляли по белковым базам данных с помощью программы Mascot (http://expasy.or8/tools/mascot.html). Подобным образом была проведена идентификация и других ферментов.

В табл.2 представлены данные о составе (содержание основных компонентов) ферментных препаратов Cellic СТесЗ, Accellerase TRIO и С1_4, которые продемонстрировали наиболее высокую гидролитическую активность по отношению к различным видам ЦСС.

КснлП, ЭГ VBinsolens

A.fumigsSits

Lreesei/Л.оіуш или AoryiaelinidaloRS

КсилШ

ЭГ С F.oxvsporum Кен л CA.terreus

Рисунок 2. Электрофореграмма фракций после анионообменной хроматографии ферментного препарата Cellic СТесЗ на колонке с носителем Source 15Q (М - маркёры молекулярной массы).

¡NaCtJ, М

БГЛ, ЦБГ A.fumigatus, А28° ЭГ II, ЭГ С f. oxysporum, ЭГ V H.insoiens,

lOG tiC 200

Объем хііадвта,

БГЛ A.fumigatus, ПМО М. thermophila

Рисунок 3. Хроматографический профиль при фракционировании ферментного препарата СеПіс СТесЗ на колонке с анионообменным носителем (рН 7,0), градиент соли приведен серым цветом.

Основными компонентами этих трех исследуемых являлись ЦБГ: суммарное содержание ЦБГ в препаратах варьировало в пределах от 30 до 60% от общего пула белка. Наиболее высоким содержанием ЦБГ характеризовался препарат СеШс СТесЗ (до 60%). Для препаратов С1_4 и Accellerase TRIO содержание ЦБГ было примерно одинаковым (32-35%). Для всех исследуемых препаратов было характерно преобладание высокомолекулярной формы ЦБГ (содержащей как каталитический, так и целлюлозосвязывающий модули), над низкомолекулярной (лишенной целлюлозосвязывающего модуля).

Intens.

xio8-

VSQMTLAEKV TNVAATWDKT VLFAETIKGI LWPFADAVRA AALAGLDMSM RIPPNFSSWT

PLTGKEVKVG VISNGGNVFA GEAVIDTWS VNPSAKTPFT HGLSYTTFGY YPWLNSTDLE TITNTGNVAG EAQDWVITKY

NLTTGTGWEM LAYLRGKAMG QDAGVIATAK GVGAVMCSYN PGDISFDDGL RDEYGWEHSA

VFDNSHGNNQ DRCVGOTGSV

ELAFSPPFYP PRLGINWGLC

SPWADGQGEW GODSPLGIRF

HYILNEOEHF

QINNSYGCQN SFWGTNLTVS VSEGAWTKVN

RQVGEAQGYG SQTLNKLLKA : VLNGTVPAWR ' DFVNVORSHS

VLGEDAGSNP VTDNGALSQM HCNNTIWIH WGKTRESYGA SHLRVQALNS DSSDDPNYGW YEVPQLYVSL PKKVHVGSSS

EEFNDKGVDI LLGPAAGPLG КYPDGGRIWE YNITETISSN ELGFQGFVMS VDDMAVRIMT OIIREIGAAS GSGTANFPYL GFISVDGNEG WAGLPGQESG VFIDYRHFDK IGSAADYLYP AGGAPGGNPT GEQKVWTTTL

ADAHRRAVEI SDLNSAFPAG

WGANGCPDRG ADVASQSSVS SVGPVLIDRW PLLTEPNNGN SSSAYVPTSG EDSEYIPEGA GGPNEPRVVL RKLPLRAPLP

CDNGTLAMAW LVFVNADSGE YDNPNVTAII GAPQDDFNEG ETKPAPTYGE RDGSPQPLLK RKFDRIFLAP RVY

GFSPDPALTG VDDKTMHELY

DWSAHHSGVG AYYKVGRDRJ, TVLLKNTGAL VTPEQAIQRE DRKNLTLWKN NSLVDVLYGR RNETPIYEFG EGLKRITKFI LYQDLVRVSA NRRDLANWDV

84O.^003/J

1875-1 "(952.0

Рисунок 4. MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата фрагмента белковой полосы, соответствующей р-глюкозидазе A.fumigatus (входящей в состав ферментного препарата Cellic СТесЗ) и ее аминокислотная последовательность. Пептиды, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии, подчеркнуты.

Общее содержание ЭГ составляло от 13 до 33% от общего пула белка, причем содержание ЭГ в препарате С1_4 в 1,5 и 2 раза превосходило таковое в препаратах Accellerase TRIO (21%) и Cellic СТесЗ (13-16%).

Содержание БГЛ варьировало от 7% до 23%, причем содержание БГЛ в препарате С1_4 было ниже в 3 раза содержания БГЛ в препаратах Accellerase TRIO (22%) и Cellic СТесЗ (14-23%). Следует отметить, что препараты Accellerase TRIO и Cellic СТесЗ имели в своём составе как гомологичные, так и гетерологичные БГЛ, причем, содержание гетерологичных БГЛ превышало содержание гомологичной БГЛ T.reesei. Препарат Cellic СТесЗ включал одну гомологичную и две гетерологичные БГЛ - БГЛ A.fumigatus и БГЛ A.oryzae, а препарат Accellerase TRIO - одну гомологичную и одну гетерологичную БГЛ A.nidulans.

Суммарное содержание ксиланаз варьировало от 3% до 10%, наиболее высоким содержанием ксиланаз характеризовался препарат Accellerase TRIO, а наиболее низким - С1_4.

В препаратах Celtic СТесЗ и С14 был обнаружен фермент, который согласно масс-спектрометрическим данным, относится к классу ПМО M.thermophila.

Проведённые нами исследования состава ферментных препаратов, обдающих наибольшей гидролитической активностью по отношению к различным видам ЦСС -Cellic СТесЗ и Accellerase TRIO на основе гриба рода T.reesei и С1_4 гриба M.thermophila - позволили выявить общие закономерности «конструирования» их ферментных комплексов (табл.2). Суммарное содержание ЦБГ в этих ферментных препаратах варьировало в пределах от 30 до 60% от общего пула белка, суммарное содержание ЭГ — от 10 до 30%, ксиланаз - 3 до 10%, ß-глюкозидаз - от 5 до 20%. Обнаружено, что в состав препаратов Accellerase TRIO и Cellic СТесЗ входят гетерологичные ß-глюкозидазы из различных видов грибов Aspergillus, и их содержание в 5-7 раза превышает содержание гомологичной ß-глюкозидазы. Кроме того, в составе ферментных препаратов Cellic СТесЗ и С1_4 были обнаружены ферменты, относящиеся к классу ПМО.

Таблица 2. Компонентный состав промышленных ферментных препаратов, обладающих наибольшей гидролитической активностью, % от общего содержания

белка.

Ферментный препарат

Ферменты С1_4 Accellerase TRIO Cellic СТесЗ

Целлобиогидролазы 35 32 40-60

Эндоглюканазы 33 21 13-16

ß-Глюкозидаза гомологичная 7 3 2-4

ß-Глюкозидаза гетерологичная (Aspergillus sp.) - 19 12-19

Ксиланазы 3 10 4-8

Полисахаридмонооксигеназа + - +

2. Сравнение свойств лучших промышленных ферментных препаратов со свойствами лабораторного препарата Р.геггисиїохит В221-151

Как отмечалось выше, исследования, проведенные в нашей лаборатории,

показали, что ферментный комплекс гриба Р.геггисиїозит обладает высокой

гидролитической активностью по отношению к ЦСС и может стать достойной

альтернативой современным промышленным ферментным препаратам. Мы провели

сравнительный анализ активности и компонентного состава промышленного

ферментного препарата, проявившего наибольшую гидролитическую активность по

13

отношению к ЦСС (Cellic СТесЗ) и лабораторного ферментного препарата В221-151, полученного с помощью гриба P. verruculosum.

Сравнение активностей и компонентного состава ферментных препаратов Cellic СТесЗ и P.verruculosum В221-151. Удельные активности препаратов В221-151 и Cellic СТесЗ по отношению к МКЦ им КМЦ являлись величинами одного порядка и были примерно одинаковыми (ср. табл.1 и 3). Удельная ксиланазная активность препарата В221-151 превышала таковую препарата Cellic СТесЗ примерно в три раза. По уровню удельной целлобиазной активности препарат В221-151 заметно уступал Cellic СТесЗ (что может говорить о более низком содержании БГЛ в В221-151).

Таблица 3. Удельные активности ферментного препарата P.verruculosum В221-151,

по отношению к различным субстратам, ед./мг белка.

Ферментный препарат Активность

Авицелазная КМЦ-азная Целлоби -азная Ксиланазная

40°С, рН 5.0 50°С, рН 5.0 40°С, рН 5.0 50°С, рН 5.0

P. verruculosum В221-151 0,7 18,3 0,7 30,3

Компонентный состав ферментного препарата В221-151 определяли с помощью методов, описанных в предыдущем разделе, Данные, характеризующие компонентный состав препарата В221-151 приведены в табл.4.

Препарат В221-151 характеризовался более высоким суммарным содержанием ЦБГ (69% от общего пула белка), чем препарат Сеіііс СТесЗ (40-60%, табл.2), что объясняет более высокое значение удельной активности по МКЦ для препарата В221-151 по сравнению с Сеіііс СТесЗ (ср. табл.3 и 1), поскольку именно авицелазная активность характеризует активность ЦБГ.

Таблица 4. Компонентный состав ферментного препарата Р.уеггисиїояит В221-151,

% от общего содержания белка.

Ферменты Ферментный препарат

В221-151

Целлобиогидролазы 69

Эндоглюканазы 17

р-Глюкозидаза гомологичная 4

р-Глюкозидаза гетерологичная (Aspergillus sp.) -

Ксиланазы 4

Суммарное содержание ЭГ как в препарате В221-151, так и в Cellic СТесЗ, оказалось примерно одинаковым (14-16%, ср. табл.2 и 4), что соответствует близким удельным активностям этих препаратов по КМЦ (ср. табл.3 и 1).

Препарат В221-151 характеризовался значительно более низким содержанием гомологичной БГЛ (4%) по сравнению с общим содержанием БГЛ в препарате Cellic СТесЗ (порядка 20%), которые были представлены как гомологичными, так и гетерологичными (БГЛ из A.fumigatus и A.oryzae) ферментами (ср. табл.2 и 4). Низкое содержание БГЛ в препарате P.verruculosum В221-151 объясняет соответствовавшие ему невысокие значения удельной активности по целлобиозе (табл.3).

Исследуемые ферментные препараты характеризовались примерно в 2 раза отличающимся суммарным содержанием ксиланаз (4% и 8% для В221-151 и Cellic СТесЗ, соответственно, ср. табл.2 и 4). При этом удельная активность препарата В221-151 по ксилану превышала активность препарата Cellic СТесЗ по этому субстрату примерно в три раза (ср. табл.3 и 1), что, видимо, обусловлено большей удельной активностью ксиланаз P.verruculosum В221-151.

Отметим, что, в отличие от ферментного препарата Cellic СТесЗ, в состав В221-151 не входит ПМО.

Таким образом, ферментный препарат P.verruculosum В221-151 и Cellic СТесЗ обладали примерно одинаковыми удельными активностями по отношению к МКЦ и КМЦ, удельная целлобиазная активность В221-151 была ниже, а ксиланазная активность - выше, чем у Cellic СТесЗ, Оба ферментных препарата обладали примерно одинаковым компонентным составом с точки зрения содержания ЦБГ и ЭГ, однако В221-151 имел по сравнению с Cellic СТесЗ пониженное содержание БГЛ и не имел в своём составе ПМО.

3. Получение и свойства ферментных препаратов P.verruculosum с увеличенной гидролитической активностью

Гидролитическая активность целлюлазного комплекса P.verruculosum может быть увеличена за счет введения в состав комплекса вспомогательных белков, таких как ПМО, а также за счет увеличения содержания БГЛ. В нашей лаборатории уже проводились работы по увеличению содержания БГЛ в составе ферментных препаратов на основе P.verruculosum, в результате был получен штамм P.verruculosum FIO, продуцент БГЛ A.niger (её содержание в препарате F10 составило 80% от общего пула белка). Было установлено, что препарат F10 может быть использован как эффективная добавка к препарату В221-151 при гидролизе различных видов ЦСС, приводящая к увеличению выхода продуктов гидролиза. Поэтому наше внимание было сконцентрировано на возможности получения ферментных препаратов

P.verruculosum, имеющих в своем составе ПМО, способных при добавлении к целлюлазному комплексу существенно увеличить выходы продуктов гидролиза ЦСС.

Сравнение свойств полисахаридмонооксигеназ грибов рода T.reesei, M.thermophila и T.terrestris. В нашей лаборатории были выделены в гомогенном виде три фермента, относящиеся к ПМО, а именно ПМО из T.reesei, M.thermophila и T.terrestris. Нами были проведены исследования по сравнению каталитической активности выделенных ПМО при их использовании в качестве добавок к ферментному препарату P.verruculosum В221-151 для гидролиза МКЦ и измельченной осиновой древесины (в качестве контроля использовали ферментный препарат В221-151). Дозировка В221-151 составила 2 мг/г субстрата, ПМО - 1 мг/г. На рис.5 представлены данные, характеризующие выходы ВС и глюкозы через 24 часа гидролиза нерастворимых субстратов.

Рисунок 5. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 24 часа гидролиза различных видов ЦСС: А) МКЦ; Б) измельченная осина. Условия: 50°С, рН 5, [Э]= 100 г/л, [В221-151]= 2 мг/г субстрата, [ПМО]= 1 мг/г субстрата, перемешивание - 1000 об/мин.

Добавление ПМО Г./етте^га в реакционную смесь не повлияло на гидролитическую активность ферментного препарата В221-151. Добавление ПМО МлИегторИИа увеличило выход ВС и глюкозы по сравнению с контролем примерно в 2 раза, а добавление ПМО Т.геезег - примерно в 1,5 раза по сравнению с ферментным препаратом В221-151.

Отметим, что в отсутствии препарата В221-151 гомогенные ПМО МлИегторкПа, Т.гееяег и Тлеггеяйт! практически не приводили к образованию ВС и глюкозы при гидролизе МКЦ и измельченной осиновой древесины.

Состав и свойства нового ферментного препарата, полученного с помощью гриба рода Р.\еггиси1о$ит В1_МТ. На основании полученных выше данных был сделан вывод о необходимости создания штамма Р.уеггисЫозит, который, наряду с комплексом собственных целлюлолитических ферментов, будет продуцировать ПМО МлЪегторЫ1а. С помощью индуцибельной системы экспрессии под контролем промотора гена сЬИ1, кодирующего мажорный белок Р'.\erruculosum ЦБГ I, такой рекомбинантный штамм-продуцент был создан, на его основе получен ферментный препарат Руеггиси1озит В1_МТ (представлявший собой лиофильно высушенную культуральную жидкость, полученную в 1-л ферментере с помощью штамма-продуцента Р^еггиси^ит В1_МТ). Целью наших дальнейших исследований являлось изучение свойств полученного нового ферментного препарата.

Электрофореграмма препаратов В1_МТ и В221-151 представлена на рис.6. Доказательством наличия экспрессии ПМО М.ЛегторИПа, являлись результаты идентификации трипсинового гидролизата фрагмента соответствующей белковой полосы полиакриаламидного геля, полученные с помощью МА1_ЛЭ1-ТОР масс-спектрометрии. В1 мт м В22М51

ПМО Млкегторкіїа

20

ШШШЖШ'-''-' ' ііу , , -ЇХ",

Рисунок 6. Электрофореграмма ферментных препаратов В1_МТ и В221-151 (М - маркёры молекулярной массы).

Удельные авицелазная, КМЦ-азная и ксиланазная активности ферментного препарата В1_МТ (табл.5) по сравнению с аналогичными активностями препарата В221-151 (табл.3) несколько уменьшились, а удельная целлобиазная активность у обоих препаратов была близка. Уменьшение удельных активностей по отношению к соответствующим субстратам может свидетельствовать о некотором уменьшении

17

содержания в общем пуле секреторного белка таких ферментов как ЦБГ, ЭГ и ксиланазы за счет появления в составе препарата фермента ПМО МлкегторкИа (не обладающего активностью по отношению к этим субстратам).

Качественный и количественный состав ферментного препарата В1_МТ определяли с помощью методов, описанных в предыдущих разделах. Полученные данные представлены в табл.6. Препарат В1_МТ характеризовался меньшим суммарным содержанием ЦБГ, чем препарат В221-151 (ср. табл.4 и 6), что соответствует различию удельных активностей препаратов по МКЦ (ср. табл.3 и 5). Общее содержание ЭГ в препарате В1_МТ оказалось меньше примерно на 40%, что соответствует уменьшению удельной активности препарата по КМЦ. Общее содержание ксиланаз и БГЛ в препарате В1_МТ уменьшилось по сравнению с В221-151 незначительно. Содержание ПМО МлИегторЬіІа в препарате В1_МТ составило 25% от общего пула белка.

Таблица 5. Удельные активности ферментного препарата Р.чеггисиїоьит В1_МТ, по

отношению к различным субстратам, ед./мг белка.

Ферментный препарат Активность

Авицел-азная КМЦ- азная Целлоби -азная Ксилан-азная

40°С, рН 5.0 50°С, рН 5.0 40°С, рН 5.0 50°С, рН 5.0

P. verruculosum В1_МТ 0,3 6,4 0,6 17,5

Таблица 6. Компонентный состав ферментного препарата Р.уеггисы1озит В1_МТ, %

от общего содержания белка.

Фермент Ферментный препарат

В1_МТ

Целлобиогидролазы 54

Эндоглюканазы 10

(З-Глюкозидаза гомологичная 3

р-Глюкозидаза гетерологичная (Aspergillus sp.) -

Ксиланазы 3

Полисахаридмонооксигеназа 25

Сравнивали гидролитическую активность ферментного препарата В1_МТ по отношению к ЦСС с таковой для контрольного препарата В221-151, для смеси ферментных препаратов В221-151 и целлобиазного препарата F10, а также лучшего

промышленного препарата Cellic СТесЗ. В качестве ЦСС использовали измельченные осиновую и сосновую древесину, багассу, а также МКЦ. За критерий гидролитической активности принимали выходы глюкозы и ВС после 24 часов гидролиза (загрузка ферментных препаратов составляла 5 мг белка на 1 г субстрата). Препарат В1_МТ, имеющий в своем составе, помимо гидролитических ферментов целлюлазного комплекса, ПМО M.thermophila, гидролизовал различные виды ЦСС более эффективно по сравнению с препаратом В221-151. Выходы ВС и глюкозы в случае препарата В1 _МТ были выше на 60% и 40% при гидролизе МКЦ и различных видов ЦСС, соответственно (рис.7). По гидролитической активности препарат В1_МТ практически не уступал промышленному ферментному препарату Cellic СТесЗ. Интересно отметить, что добавление целлобиазного препарата F10 к целлюлазному препарату В221-151 приводило к увеличению его гидролитической способности до уровня, примерно сопоставимого с таковой для препарата В 1_МТ.

Таким образом, сформулированные выше на основании сравнительного анализа компонентного состава наиболее активных современных промышленных ферментных препаратов и препарата P.verruculosum В221-151 требования к изменению его состава, заключающиеся в необходимости его дополнительного обогащения ПМО (и БГЛ) оказались справедливыми и подтвердились экспериментальными данными. Следует отметить, что введение в состав ферментного препарата P.verruculosum В1_МТ 25% ПМО (от общего пула белка) позволило сохранить необходимое для эффективного гидролиза ЦСС содержание других целлюлолитических ферментов (ЦБГ и ЭГ).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ферментные препараты на основе новых штаммов-продуцентов P.verruculosum, являются конкурентоспособными для применения в процессах биоконверсии возобновляемого растительного сырья по сравнению с новыми современными промышленными ферментными препаратами, полученными с помощью штаммов-продуцентов Trichoderma и Myceliophtora sp., выпускаемых ведущими биотехнологическими компаниями.

60 50

3 ВС

І Глюкоза

ЙВ

Рисунок 7. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 24 часа гидролиза различных видов ЦСС: А) измельченная МКЦ; Б) измельченная и обессмоленная сосна; В) измельченная осина; Г) измельченная багасса. Условия: 50°С, рН 5, [в]= 100 г/л, [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 1000 об/мин.

выводы

1. Определён компонентный состав новых промышленных ферментных препаратов серий Cellic СТес (Novozymes), Accellerase (DuPont&Genencor) на основе гриба рода Trichoderma reesei и Myceliophtora thermophila Cl (Dyadic International, Inc) для эффективного гидролиза целлюлозосодержащего сырья (ЦСС). Установлено, что содержание целлобиогидролаз (ЦБГ) варьировало в пределах от 30% до 60% от общего количества белка, эндоглюканаз (ЭГ) - от 10 до 30%, ß-глюкозидаз - от 5 до 20%, ксиланаз - от 1-2% (Accellerase 1000 и С1_1) до 5-10% (Accellerase DUET и TRIO, Cellic СТес2, Cellic СТесЗ, С1_2, С1_3 и С1_4), а содержание ß-ксилозидаз составляло 1-2%. Обнаружено, что в состав препаратов Accellerase TRIO и Cellic СТес входят гетерологичные ß-глюкозидазы из различных видов грибов Aspergillus, и их содержание в 5-7 раза превышает содержание гомологичной ß-глюкозидазы. Кроме того, в состав препаратов Cellic СТес2, Cellic СТесЗ и M.thermophila Cl были обнаружены ферменты, относящиеся к классу полисахаридмонооксигенз (ПМО).

2. Проведен сравнительный анализ компонентного состава и гидролитической активности наиболее активного промышленного ферментного препарата Cellic СТесЗ и лабораторного препарата на основе Pénicillium verruculosum В221-151 (ИНБИ РАН). Установлено, что содержание ЦБГ (69%), ЭГ (17%) и ксиланаз (4%) в препарате В221-151 сравнимо с их содержанием в препарате Cellic СТесЗ, однако В221-151 отличался более низким содержанием ß-глюкозидазы (~ 4%), и не содержал ПМО.

3. Исследовано влияние трёх гомогенных ПМО, выделенных из грибов T.reesei, M.thermophila и Thelavia terrestris, на гидролитическую активность ферментного препарата В221-151 по отношению к различным видам ЦСС и показано, что ПМО T.reesei и M.thermophila приводят к 1,5-2-кратному увеличению гидролитической активности препарата В221-151.

4. Создан ферментный препарат на основе нового штамма-продуцента P.verruculosum В1_МТ, содержащий помимо собственного целлюлазного комплекса ПМО M.thermophila; исследованы свойства нового препарата и установлено, что его гидролитическая активность возрастает в 1,5-2 раза по сравнению с исходным ферментным препаратом В221-151, а также достигает уровня препарата Cellic СТесЗ. Установлено, что в состав препарата P.verruculosum В1МТ входит 25% ПМО, 54% ЦБГ, 10% ЭГ, 3% ß-глюкозидазы и 3% ксиланаз.

5. Показано, что совместное применение ферментного препарата P.verruculosum В221-151 и ß-глюкозидазного ферментного препарата P.verruculosum F10 приводит к увеличению общей гидролитической активности ферментного комплекса до уровня препарата Cellic СТесЗ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Доценко Г.С., Чекушина А.В.. Кондратьева Е.Г., Правильников А.Г., Андрианов Р.М., Осипов Д.О., Синицына О.А., Короткова О.Г., Степанов В.И., Новожилов Е.В., Ачильдиев Е.Р., Синицын А.П. Реакционная способность различных целлюлозосодержащих материалов при ферментативном гидролизе. Вестник Московского государственного университета леса - Лесной вестник, 2012, №8, 129135.

2. Чекушина А.В.. Доценко Г.С., Синицын А.П. Сравнение эффективности процессов биоконверсии растительного сырья биокатализаторами на основе ферментных препаратов Trichoderma и Pénicillium verruculosum. Катализ в промышленности, 2012, №6,68-76.

3. Чекушина А.В.. Доценко Г.С., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Компонентный состав коммерческих ферментных препаратов, полученных с помощью грибов рода Trichoderma и предназначенных для биоконверсии растительного сырья. Биотехнология, 2013, №3, 58-68.

4. Чекушина А.В., Доценко Г.С., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Ферментные препараты Pénicillium verruculosum для биоконверсии растительного сырья -альтернатива коммерческим препаратам, полученных с помощью грибов рода Trichoderma. Биотехнология, 2013, №3, 69-80.

Тезисы докладов и статьи:

1. Gusakov A.V., Shulga T.N., Chekushina A.V.. Sinitsyn A.P. Comparison of three protein assays for purified cellulases and hemicellulases from fungi. Open Journal of Analytical Chemistry Research, 2013, №1 (1), 1-4.

2. Андрианов P.M., Чекушина A.B., Зоров И.Н., Синицын А.П. Разработка методик изучения адсорбционных свойств ферментных препаратов на лигноцеллюлозных субстратах. Московская международная научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов», 15-17 марта, 2010, Москва.

3. Денисенко Ю.А., Чекушина А.В. Исследование свойств ферментных препаратов на основе новых штаммов Pénicillium verruculosum. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 9-13 апреля, 2012, Москва.

4. Чекушина А.В.. Синицын А.П. Сравнительный анализ гидролитической способности ферментных препаратов Pénicillium и Trichoderma. Международный конгресс «Биомасса: топливо и энергия», 17-18 апреля, 2012, Москва.

5. Sinitsyn Л. P., Rozhkova A.M., Sinitsyna О.Л., Chckusliina A.V., Bushina E.V., Volkov P.V., Proskurina O.V., Satrutdinov A.D. Production platform for industral enzymes based on a Pénicillium host-vcctor system. VII international symposium «EU-Russia: coopération in biotechnology, agriculture, forestry, fisheries and food», 31 may-1 junc,

2012, Moscow.

6. Чскушина А.В.. Синицмн А.П. Сравнение эффективности применения ферментных препаратов, полученных с использованием грибов рола Pénicillium и Triclwclerma для гидролиза различных видов цсллюлозосодсржашсго сырья. Международная научная конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии», 3-5 октября, 2012, Саранск.

7. Чскушина А.В., Синицын А.П. Изучение компонентного состава ферментных препаратов, применяемых для эффективного гидролиза различных видов цсллюлозосодсржашсго сырья. Международная научная конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии», 3-5 октября, 2012, Саранск.

8. Чскушина А. В.. Синицын А.П. Сравнительный анализ биоконвсрсии растительного сырья ферментативными препаратами различных грибных продуцентов. Международный конгресс «Биотехнология: состояния и перспективы развития», 19-22 марта, 2013, Москва.

9. Булахов А. Г., Чскушина А.В. Сравнение эффективности процессов биоконвсрсии растительного сырья ферментными препаратам» продуцентов Trichoderma и Pénicillium. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 8-13 апреля, 2013, Москва.

10. Chckushina A.V., Bulakhov A.G., Sinitsyn A.V. The main components of multienzyme complex from Trichoderma for effective hydrolysis of plant raw materials. International confcrcncc «Biocatalysis: fundamentals & applications», 2-5 j'uly, 2013, Moscow.

11. Чскушина А.В., Синицын А.П. Анализ компонентного состава ферментных препаратов для эффективного гидролиза лигноцеллюлозных материалов. Международная конференция «Физикохимия растительных полимеров», 8-11 июля,

2013, Архангельск.

Подписано в печать 14.11.2013 Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 "по. Заказ № 2413 Отдел полиграфии Научной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова 119192 Москва, Ломоносовский проспект, 27

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Чекушина, Анна Вячеславовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

На правах рукописи 04201450230 /

Чекушина Анна Вячеславовна

ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ ГРИБОВ TRICHODERMA, PENICILLIUM И MYCELIOPHTORA С УВЕЛИЧЕННОЙ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

03.01.04 Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор А.П. Синицын

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ у

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

Глава 1. Целлюлозосодержащее сырье 9

1.1. Запасы и характеристика целлюлозосодержащего сырья 9

1.2. Клеточная стенка растений 11

1.3. Предварительная обработка целлюлозосодержащего сырья 16 Глава 2. Ферментативная конверсия целлюлозосодержащего сырья 18

2.1. Гликозил гидролазы, классификация и механизм действия 18

2.2. Общие представления о биоконверсии целлюлозосодержащего сырья 19

2.3. Целлюлазы 21

2.4. Гемицеллюлазы 23

2.5. Механизм действия полисахаридмонооксигеназ 23

2.6. Факторы, влияющие на ферментативную конверсию целлюлозосодержащего

27

сырья

Глава 3. Различные продуценты ферментов, используемых в процессах

30

биоконверсии целлюлозосодержащего сырья 3.1 Ферментные комплексы, продуцируемые грибами родов Trichoderma,

30

Aspergillus, Myceliophthora

3.2. Ферментные комплексы, продуцируемые грибами рода Pénicillium 32

Глава 4. Масштабирование процессов биоконверсии целлюлозосодержащего сырья 36

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 40

Глава 5. Материалы и методы экспериментов 40

5.1. Ферментные препараты 40

5.2. Субстраты 40

5.3. Прочие реактивы 41

5.4. Хроматографические сорбенты 41

5.5. Определение концентрации белка 41

5.6. Определение биохимических характеристик ферментов, ферментных

42

препаратов

5.7. Методы определения активности ферментных препаратов 42

5.8. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков 43

5.9. Метод определения компонентного состава ферментных препаратов 44

5.10. Гидролиз целлюлозосодержащего сырья 44 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 46

Глава 6. Состав и свойства промышленных ферментных препаратов, полученных с

46

помощью различных продуцентов

6.1. Состав и свойства ферментных препаратов, полученных с помощью грибов

46

рода Trichoderma reesei

6.1.1. Состав и свойства ферментных препаратов серии Cellic СТес фирмы

47

Novozymes, созданных для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья

6.1.2. Состав и свойства ферментных препаратов серии Accellerase фирмы

59

DuPont&Genencor, созданных для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья

6.2. Состав и свойства ферментных препаратов, полученных с помощью грибов

65

рода Myceliophtora thermophila

Глава 7. Сравнение свойств лучших промышленных ферментных препаратов с лабораторным мультиферментным препаратом, полученным с помощью гриба 74

Pénicillium verruculosum

7.1. Сравнение гидролитической способности ферментных препаратов при

74

различных рН и температуре

7 2 Сравнение активности и компонентного состава ферментных препаратов

76

Pénicillium verruculosum В221-151 и Cellic СТесЗ

Глава 8. Получение и свойства ферментных препаратов Pénicillium verruculosum с 79

увеличенной гидролитической способностью

8.1. Сравнение свойств полисахаридмонооксигеназ грибов рода Trichoderma reesei, 79 Myceliophtora thermophila и Thelavia terrestris

8.2. Состав и свойства нового ферментного препарата, полученного с помощью

81

гриба рода Pénicillium verruculosum

ВЫВОДЫ 87

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 88

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ферменты

ЦБГ целлобиогидролаза

ЭГ эндоглюканаза

БГЛ (3-1,4-глюкозидаза

ПМО полисахаридмонооксигеназа

Ксил ксиланаза

БКС (3-1,4-ксилозидаза

КГ ксилоклюканаза

ЦДГ целлобиозодегидрогеназа

Прочие сокращения

КФ класс ферментов

вя гликозил гидролазы

цсм целлюлозосвязывающий модуль

СП степень полимеризации

К! константа ингибирования

Кэ коэффициент экстинкции

МАиЛ-ТОБ матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация -

времяпролетная масс-спектрометрия

МАиЛ-ТОБ-ТОР тандемная масс-спектрометрия

ЦСС целлюлозосодержащее сырье

ВС восстанавливающие сахара

вэжх высокоэффективная жидкостная хроматография

гпх гельпроникающая хроматография

БРЬС жидкостная хроматография быстрого разрешения

ДДС-ЭФ электрофорез в денатурирующих условиях

кж культуральная жидкость

НФ нитрофенол

кмц Ыа-соль карбоксиметилцеллюлозы

мкц микрокристаллическая целлюлоза

ФБ фильтровальная бумага

/7НФГ и-нитрофенил-(3-В-глюкопиранозид

гсНФК я-нитрофенил-Р-Б-ксилопиранозид

ПААГ полиакриламидный гель

ДДС-Ка додецилсульфат натрия

Шэ гистидин

Туг тирозин

И концентрация субстрата

[Е] концентрация фермента

ВВЕДЕНИЕ

Большие запасы возобновляемой растительной биомассы (около одного триллиона тонн) делают её привлекательным сырьём для получения различных полезных продуктов. Широкое разнообразие биокатализаторов (ферментов) и их характеристик предоставляет большие возможности для эффективной переработки растительного сырья в сахара. Глюкоза, получаемая ферментативным путём из целлюлозы, может быть конвертирована с помощью микроорганизмов в этанол, бутанол, ацетон, органические и аминокислоты, полимеры и многие другие продукты микробного синтеза. Таким образом, растительная биомасса может служить (частичной) альтернативой нефти, которая в настоящее время является основным сырьем при производстве различных продуктов органического синтеза, а также для получения моторного топлива

К ферментам, осуществляющим конверсию целлюлозосодержащего сырья (ЦСС), относятся различные целлюлазы и гемицеллюлазы, которые продуцируются преимущественно микроскопическими грибами, а также бактериями. Мутантные или рекомбинантные штаммы грибов рода Trichoderma (T.reesei, T.viride, T.longibrachiatum) играют ведущую роль среди промышленных грибных продуцентов биокатализаторов на основе целлюлаз и гемицеллюлаз. Это объясняется, во-первых, их высокой секреторной способностью, а, во-вторых, разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью. Поэтому неудивительно, что ферментные препараты целлюлаз и гемицеллюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются во многих странах ведущими производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), DuPont&Genencor (США), Dyadic International, Inc. (США), Iogen (Канада), PrimAlko (Финляндия), Rohm Gmbh (Германия), EnMex (Мексика) и др. При этом поиск новых продуцентов ферментов, предназначенных для гидролиза ЦСС, а также увеличение общей активности и сбалансированности по компонентному составу уже известных ферментных комплексов, по-прежнему являются актуальными задачами современной энзимологии и биотехнологии. В различных научных центрах проводятся интенсивные исследования и разработки по поиску альтернативных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз. Грибы рода Pénicillium, Myceliophtora (ранее Chrysosporium), Acremonium, Chaetomium, Humicola и др. могут стать достойной альтернативой штаммам рода Trichoderma, поскольку по наиболее важным биотехнологическим критериям не уступают, а иногда и превосходят лучшие из известных штаммов Trichoderma.

В нашей лаборатории разработаны различные подходы по получению

ферментных препаратов на основе грибов рода Pénicillium, которые продуцируют

7

комплексы целлюлитических ферментов сбалансированного состава и обладают хорошей гидролитической способностью по отношению к ЦСС.

Выбор высокоэффективных целлюлолитических ферментных препаратов, представляющих собой многокомпонентные ферментные комплексы, зависит от ряда факторов и, в значительной степени, от сбалансированности состава ферментного комплекса и уровня активности его индивидуальных компонентов. Очевидно, что для осуществления максимально эффективного гидролиза ЦСС первостепенное значение приобретает решение задачи об оптимальном качественном и количественном составе ферментного комплекса. Основными ферментами комплекса являются эндоглюканазы и целлобиогидролазы, осуществляющие деструкцию нерастворимой целлюлозы, а также ксиланазы, гидролизующие ксилан (гемицеллюлозу). Однако в последнее время была наглядно продемонстрировано существенное влияние на общую кооперативную эффективность процессов биоконверсии ЦСС «вспомогательных» ферментов (т.н. boosting эффект), осуществляющих гидролиз растворимых олигосхаридов (например, (3-глюкозидаз и Р-ксилозидаз), а также ферментов негидролитической природы (полисахаридмонооксигеназ). Поэтому в области ферментативной конверсии ЦСС активно ведутся фундаментальные исследования и прикладные разработки не только по поиску и получению новых высокоактивных микроорганизмов-продуцентов, но также по поиску новых ферментов, как с высокой гидролитической способностью, так и обладающих «вспомогательной» функцией в процессах гидролиза. Результатом таких исследований могут быть ферментные препараты, способные осуществлять высокоэффективную конверсию различных видов ЦСС.

Таким образом, знание качественного и количественного состава, а также о содержании и свойствах компонентов ферментных комплексов, обладающих высокой гидролитической активностью в процессах биоконверсии ЦСС, является важной и актуальной задачей, направленной на решение проблемы создания высокоэффективных ферментных препаратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Целлюлозосодержащее сырье

1.1. Запасы и характеристика целлюлозосодержащего сырья

Истощение запасов невозобновляемых энергоресурсов, а также обострение экологических проблем определили высокий интерес к использованию ЦСС в качестве потенциального источника углеводов, продуктов микробного синтеза и жидкого моторного топлива [1].

Целлюлоза это один из самых распространенных растительных полимеров. Ежегодный прирост растительных органических соединений в процессе биосинтеза составляет около 2*1011 т, где около трети этого количества приходится на целлюлозу [2].

К ЦСС относятся различные отходы переработки сельскохозяйственных культур, а также вторичные продукты лесопиления и деревообработки. Все это можно использовать в качестве сырья для получения Сахаров [3]. Условиями применения в качестве субстратов различных видов ЦСС являются стоимость, размеры запасов ЦСС, возможности концентрирования их в районе расположения гидролизного производства, технологические свойства.

Среди отходов промышленности, прежде всего, следует отметить древесные материалы. К ним относятся различные отходы лесной промышленности: ветки, вершины, пни, кора (25% от общего количества древесины), лесопильные твердые (горбыль, рейка, обрезки и т.д., всего до 20%) и мягкие отходы - опилки (до 12%). Интересным представляется использование в качестве сырья промышленных отходов, содержащих делигнифицированную, или обработанную иным способом целлюлозу, например, отходы вискозных заводов [4]. В отличие от древесной и хлопковой, эта целлюлоза в значительной степени аморфизована. Также можно использовать отходы целлюлозно-бумажного производства, муниципальные отходы и макулатуру [5].

К отходам сельскохозяйственных культур, прежде всего, относится злаковая солома, которая содержит около 30% целлюлозы. Пшеничная солома является крупнотоннажным отходом, она накапливается до 4-5 млрд. т в год, при этом практически не используется, а гниет или сжигается [2]. Свекловичный жом, который является продуктом свеклосахарного производства, часто используется в качестве ЦСС для ферментативного гидролиза [6]. Кукуруза и сахарный тростник являются крупнотоннажным сырьем для ферментативного гидролиза в Бразилии и США. В качестве

ЦСС также можно использовать стебли хлопчатника (0,8 т на 1 т хлопка), хлопковую шелуху, семена хлопчатника, рисовую шелуху (25% от массы зерна), отходы от обработки льна (до 70% от массы поступающей на обработку). Также следует упомянуть торф (степень разложения 15-20%), химический состав которого во многом повторяет химический состав растений, образующих его, и водоросли [7, 8, 9, 10, 11].

Таким образом, ЦСС является наиболее распространенным возобновляемым органическим сырьем на Земле и поэтому может стать источником для получения жидких и газообразных видов топлива, а также многих других полезных продуктов.

ЦСС, в зависимости от происхождения, значительно отличаются по составу. Так, бытовые и промышленные отходы отличаются высоким содержанием целлюлозы и низким содержанием других компонентов. В травах, коре и зеленых частях многолетних растений обнаруживается большое количество гемицеллюлоз и лигнина, солома также лигнифицирована. Древесина хвойных пород богата целлюлозой, в меньшей степени гемицеллюлозой. Древесина лиственных деревьев отличается от древесины хвойных меньшим содержанием лигнина и отсутствием смол, что определяет её реакционную способность (см. табл.1).

В табл.2 представлен химический состав ЦСС различного происхождения [8, 12, 13,14].

Таблица 1. Содержание основных компонентов ЦСС в различных породах

древесины, %.

вещество содержание, %

в хвойных в лиственных

целлюлоза 41-58 39-47

лигнин 28-34 17-27

гемицеллюлоза 15-23 20-38

порода химический состав, %

целлюлоза лигнин гемицеллюлозы

сосна 52 28 20

ель 58 29 13

лиственница сибирская 46 29,5 24,5

пихта 48 30 22

кедр 50 30 20

дуб 39 24 37

бук 42 21 37

береза 47 21 32

клен 41,5 23 35,5

осина 52 20 28

кукуруза початки 45 15 35

кукуруза стебли 39-47 3-5 26-31

лузга подсолнечника 27 27 22

лузга рисовая 29 19 18

солома пшеницы 30 15 50

солома риса 28-36 12-16 23-28

солома овса 31-37 16-19 27-38

хлопок, очески 60 20 20

хлопок, линт 80-95 0 5-20

травы 25-40 10-30 25-50

стебли тростника 40 25 20

стебли бамбука 26-43 21-31 15-26

стебли багассы 32-44 19-24 27-32

бумага 85-99 0-15 0

газетная бумага 40-55 18-30 25-40

целлюлозная пульпа 60-80 2-10 20-30

1.2. Клеточная стенка растений

Клеточная стенка является основным элементом растительного организма: ее содержание в травянистых растениях составляет до 70% сухой массы, а в древесных растениях достигает 90%. Наиболее важными компонентами в составе растительной клеточной стенки являются полисахариды, которые в зависимости от своего состава и строения могут быть разделены на две большие группы, а именно целлюлоза и гемицеллюлоза. Кроме того в состав клеточной стенки входит лигнин (см. рис. 1). Полисахариды могут составлять до 90% сухой массы клеточной стенки [15].

Рисунок 1. Строение клеточной стенки растений.

Целлюлоза относится к гомополисахаридам и состоит из звеньев О-глюкозы, которые связаны между собой с помощью Р-1,4 гликозидных связей (см. рис. 1). Степень полимеризации (СП) целлюлозы может быть выше, чем 10000. Степень кристалличности целлюлозы в микрофибриллах достигает 80%, что делает растительную целлюлозу резистентной к гидролизу. Высокая механическая прочность клеточной стенки обусловлена наличием в ней микрофибрилл целлюлозы [16, 17].

СН2ОН ОН СН2ОН он

НО—А—П^Л^О^/^г--.^

эн СН2ОН

ж но

Го^4"'

он

Рисунок 2. Строение целлюлозы.

■О

снгон он сн2он

Как и все гидрофильные линейные полимеры, целлюлоза обладает склонностью к образованию первичных фибрилл, в которых группы из 40-60 параллельно расположенных цепей макромолекул связаны между собой множественными водородными связями, причем восстанавливающие концы всех полимерных молекул фибрилл расположены с одной и той же стороны.

В первичных фибриллах однородные высокоупорядоченные кристаллические зоны (кристаллиты) чередуются с неоднородными и менее упорядоченными аморфными зонами. В кристаллитах существует трехмерный дальний порядок в расположении цепей целлюлозы. В аморфных участках дальний порядок отсутствует, а сохраняется лишь общая продольная направленность цепей. В аморфных участках относительно легко могут проходить реакции целлюлозы с другими веществами. Длина макромолекул целлюлозы значительно больше длины кристаллических участков, поэтому каждая макромолекула проходит последовательно ряд кристаллических и аморфных участков [18]. Первичные фибриллы целлюлозы соединяются между собой с помощью водородных связей в микрофибриллы, которые и являются основными звеньями строения волокон целлюлозы. Микрофибриллы состоят из нескольких первичных фибрилл, поперечное сечение их составляет примерно 100x200 А, длина - около 600 А. Между первичными фибриллами в микрофибрилле находится лигнин и гемицеллюлозы.

Химические свойства целлюлозы определяются наличием гликозидных связей между элементарными звеньями и гидроксильных групп. Гликозидная связь в целлюлозе неустойчива в условиях кислотного гидролиза. Функциональная роль целлюлозы -создание механического каркаса - непосредственно связана с особенностями химического строения макромолекулы и характером надмолекулярной структуры.

Гемицеллюлоза является гетерополисахаридом и составляет около 20% клеточной стенки растений. В зависимости от источника (и способов выделения), молекулы гемицеллюлоз могут иметь как линейную, так и разветвленную структуру. Макромолекулы гемицеллюлозы могут быть построены из ксилозы, арабинозы (пентозы) или из фруктозы, галактозы, маннозы (гексозы). Гемицеллюлозы разветвлены и их СП и м�