Направленный биосинтез ксиланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride 44-11-62/3 и разработка технологии получения ферментного препарата

Ларина, Любовь Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Направленный биосинтез ксиланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride 44-11-62/3 и разработка технологии получения ферментного препарата
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Направленный биосинтез ксиланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride 44-11-62/3 и разработка технологии получения ферментного препарата"

На правах рукописи

ЛАРИНА Любовь Ннколаевна

НАПРАВЛЕННЫЙ БИОСИНТЕЗ КСИЛАНАЗЫ МИКРОСКОПИЧЕСКИМ ГРИБОМ ТпсНойегта viride 44-11-62/3 И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории биологически активных веществ Научно-технического центра биотехнологии „Лекарства и биотехнология" (Лекбиотех")

Научный руководитель: кандидат технических наук,

ПАВЛОВА Наталья Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ЭЛЬ-РЕГИСТАН Галина Ивановна

кандидат технических наук, доцент РУМЯНЦЕВА Галина Николаевна

Ведущая организация: Московский государственный Университет пищевых производств

М 200б г в ч

Защита состоится " / _2006 г. в ' ^ ч мин на

заседании диссертационного совета ДМ.212.204.13 в РХТУ им. Д.И.Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., .9) в ^^З ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им. Менделеева

Просим Вас принять участие в заседании диссертационного совета или прислать отзыв в 2-х экземплярах, заверенных печатью научного учреждения, по вышеуказанному адресу.

Автореферат диссертации разослан "_ С/ " фгьФ/^«*. 2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ.212.204.13, к.т.н.

Шакир И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Интерес к ксиланазам - ферментам, расщепляющим растительные полисахариды - ксиланы, неуклонно растет благодаря огромному потенциалу их использования в сельскохозяйственном производстве и ряде отраслей промышленности, ориентированных на переработку растительного сырья. Ксиланы являются наиболее распространенными гемицеллюлозами, составляют более 30 % сухого веса растительной биомассы и занимают второе место по распространенности после целлюлозы.

В настоящее время ксилапазы нашли широкое применение в пищевой промышленности для повышения выхода и качества продукции в производствах хлеба, соков, вин, пива, спирта, растительного масла, растворимого кофе и др. Ксиланазы используются с высокой эффективностью в целлюлозо-бумажной промышленности для отбеливания бумажной пульгы, Они улучшают качество грубых кормов для сельскохозяйственных животных и пгицы.

В настоящее время промышленное производство препаратов ксиланазы в нашей стране отсутствует. На внутреннем рынке присутствуют препараты ксиланазы зарубежных фирм и комплексные целлюлолитические ферментные препараты, в которых ксиланаза является сопутствующим ферментом.

В связи с этим разработка технологии высокоэффективного конкурентоспособного ферментного препарата ксиланазы для пищевой промышленности и других отраслей, перерабатывающих растительное сырье, и создание производства на отечественных заводах является своевременной и актуальной задачей.

В качестве перспективного продуцента ксиланазы в работе был использован микроскопический гриб Тпс1юс1егта viride 44-11-62/3, применяемый в настоящее время как продуцент целлюлолитических ферментов, в частности при производстве ферментного препарата «Целловиридин». Данный штамм способен синтезировать ксиланазу, которая при производстве целлюлазы присутствует как сопутствующий фермент. Известно, что микроорганизмы, в том числе микроскопические грибы, обладают высокой адаптивностью к изменению внешних факторов - источников питания и условий роста, что обусловлено гибкой регуляцией обменных процессов, включая синтез ферментов, принимающих участие в их физиологии питания. Это предполагает возможность направленного

изменения соотношения основных дсполимераз, образующихся при .культивировании мик-

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 БИБЛИОТЕКА { С-Петербург „л |

роскопического гриба Тг viride 44-11-62/3 и повышения активности синтеза ксиланазы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение закономерностей биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом ТпсЬос1егта уМс/е 44-11 -62/3 и условий направленного повышения ее активности, а также разработка технологии получения очищенного ферментного препарата.

Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:

• изучить закономерности биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Тг. viHde 44-11-62/3 на различных источниках углерода, оптимизировать состав питательной среды и условия культивирования для направленного повышения биосинтеза ксиланазы и изменения соотношения ксиланазы и целлюлазы;

• разработать режимы выделения, очистки, концентрирования и сушки фермента;

• изучить основные физико-химические и биохимические свойства ксиланазы Тг. тпс1е 44-11-62/3;

• разработать нормативно-техническую документацию на получение препарата;

• исследовать эффективность применения полученного ферментного препарата ксиланазы в различных отраслях народного хозяйства.

Научная новизна. Впервые выявлены закономерности биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Тг. \iride 44-11-62/3 на различных источниках углерода.

Показано, что индуцирующими биосинтез ксиланазы факторами являются ксипан, а также ксилан- и целлюлозосодержащие субстраты, такие как пшеничные отруби, целлюлоза, солодовые ростки и продукты их ферментативного гидролиза, применение которых позволяет интенсифицировать процесс биосинтеза.

Разработаны условия дополнительного введения источника углерода в процессе культивирования продуцента, позволившие увеличить активность ксиланазы на 43 %.

Разработаны приемы регулирования биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Тг. \iride 44-11-62/3 за счет использования индукторов биосинтеза и оптимизации условий культивирования гриба, что позволило не только повысить синтетическую активность продуцента, но существенно изменить соотношение активностей ксиланазы и целлюлазы в культуральной жидкости (с 0,74:1 до 5,3:1), а также сократить время культивирования гриба с 168 до 96 ч.

Впервые охарактеризованы ферментный комплекс и субстратная специфичность полученного препарата и изучены физико-химические свойства ксиланазы Тг. 44-11 -62/3 (рНопт, Тмгт, рН- и термостабильность, субстратная специфичность и др.).

Практическая значимость работы. На основании полученных данных разработана технология получения ферментного препарата ксиланазы «Ксилозим» и утверждена нормативно-техническая документация, включающая опытно-промышленный регламент получения ферментного препарата «Ксилозим» и технические условия на препарат. Получено разрешение Минздрава РФ на использование препарата «Ксилозим» в пищевой промышленности.

Показано, что препарат эффективен в хлебопекарной промышленности. Разработаны рекомендации по его использованию в качестве улучшнтеля хлеба, получаемого с использованием ржаной и пшеничной муки.

Показана перспективность применения препарата «Ксилозим» в виноделии для повышения выхода виноматериалов и повышения скорости фильтрации сусла.

Разработаны рекомендации по использованию ферментного препарата «Ксилозим» в составе мультиэнзимной композиции МЭК-СХ-3, предназначенной для введения в комбикорма с высоким содержанием некрахмалистых полисахаридов для сельскохозяйственных животных и птицы.

Стоимость препарата «Ксилозим» составляет 480 руб/кг, в то время как стоимость препаратов «Пентопан» аналогичной степени очистки фирмы «Ыоуогутез» -20-25 долларов за кг (566-707,5 руб/кг). Экономический эффект от использования 1 кг препарата «Ксилозим» в хлебопекарном производстве взамен импортного препарата «Пентопан 500ЕЮ» фирмы «Ыоуогутея» при расходе препаратов 0,10 кг на 1 т муки составит 227,5 руб.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на международных и российских научно-технических конференциях, симпозиумах и конгрессах, в том числе на II Международной научно-практической конференции (Ялта, 2001г.); Первом съезде микологов «Современная микология в России» (Москва, 2002 г.); I, II, IV Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002,2003,2005 г.г.); на заседаниях Ученого совета НТЦ «Лекбиотех».

Публикации. По результатам исследований опубликованы 4 статьи и 4 тезисов докладов, в которых отражены основные положения диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Материал изложен на 222 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 18 таблиц, список литературы включает 303 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы. Представлены основные сведения о распространенности и структуре ксиланов различной природы, классификации ксиланаз по механизму действия и их физико-химических свойствах, а также данные о способности микроорганизмов различных таксономических групп синтезировать ксиланазы, изложены современные представления о регуляции их синтеза. Рассмотрены направления применения ксиланаз в различных отраслях народного хозяйства.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Материалы и методы исследований Объектом исследования являлся штамм микроскопического гриба Trichoderma viride 44-11-62/3, полученный в Институте биотехнологии путем индуцированной селекции.

В лабораторных условиях погруженную культуру гриба выращивали в периодическом режиме в колбах на круговой качалке и в ферментерах емкостью 10 дм3, в опытных - в ферментерах емкостью 100 дм3. В качестве базовой среды при изучении влияния источников углерода на направленный синтез ксиланазы использовали модифицированную среду Чапека; в качестве источников углерода - различные moho-, ди-, полисахариды, очищенные и технические целлюлозосодержащие материалы, а также природные ксилан- и целлюлозосодержащие субстраты в различных концентрациях. Оптимизацию питательной среды осуществляли с использованием методов математического планирования эксперимента (Грачев, 1971; Максимов, Федоров, 1969).

Для предварительного гидролиза углеродсодержащих компонентов среды использовали ферментные препараты «Целловиридии» из расчета 5 ед/г сырья и «Амилосубти-лин» - 2 ед/г сырья и их композицию. Обработку сырья проводили в течение 1-4 ч при оптимальных условиях действия для каждого препарата.

Влияние температуры на регуляцию синтеза ксиланазы исследовали при культивировании продуцента в диапазоне температур от 25 до 35 °С; влияние начального значения рН питательной среды изучали в диапазоне значений рН от 3,5 до 7,5; влияния аэрации при культивировании в колбах - путем варьирования объема питательной среды и скорости вращения качалки; в ферментере емкостью 10 дм3 - изменением числа оборотов мешалки и количеством подаваемого в ферментер воздуха.

Очистку и концентрирование ксиланазы осуществляли методами микро- и ультрафильтрации, используя микрофильтрационные и ультрафильтрацнонныс мембраны с различным размером пор. В лабораторных условиях концентрат высушивали на лиофильной сушилке, в опытных - на распылительной сушилке.

Эффективность направленного биосинтеза ксиланазы оценивали соотношением уровней активностей ксиланазы и целлюлазы.

Активность ксиланазы определяли по количеству образовавшихся редуцирующих Сахаров при гидролизе ксилана овса (фирмы «Sigma»). Гидролиз вели в течение 1ч при температуре 50 °С и рН 5,0. Количество образовавшихся редуцирующих Сахаров определяли методом Шомодьи-Нельсона (Клесов и др., 1980).

Активность целлюлазы определяли по количеству образовавшихся редуцирующих Сахаров при гидролизе хроматотрафической бумаги Ватман № 1. Гидролиз вели в течение 1 ч при температуре 50 °С и рН 4,7. Количество образовавшихся редуцирующих Сахаров определяли феррицианидным методом (Ghose etal., 1981).

Для изучения субстратной специфичности препарата использовали полисахариды с различным типом связей. Содержание белка, аминного и аммиачного азота, неорганического фосфора, сульфитное число, содержание сухих веществ и количество биомассы определяли общепринятыми методами.

2. Влияние состава питательной среды на направленный синтез ксиланазы микроскопическим грибом Tr.viride 44-11-62/3 Для микроорганизмов - продуцентов ферментов источник углерода в среде имеет особое значение в связи с тем, что он не только обеспечивает рост продуцента, но и может выступать в роли фактора, индуцирующего сшгтез внеклеточных дсполимераз. Изучение биосинтеза ксиланазы при росте продуцента Trviride на различных источниках углерода показало (рис.1), что почти все углеродные субстраты обеспечивали хороший рост гриба, но значительный сшгтез ксиланазы был обнаружен лишь в вариантах введения в состав питательной среды ксилана и ксилан- и целлюлозосодержащих субстратов (пшеничных отрубей, порошка целлюлозы, солодовых ростков). Так на ксилане, используемом в составе питательной среды в качестве единственного источника углерода, активность ксиланазы на 5 и 7 супси роста составляла соответственно 13,2 и 21,6 ед/см3, на порошке целлюлозы - 12,0 и 16,1 ед/см3, на солодовых ростках - 10,7 ед/см3 и 17,8 ед/см3. Наиболее высокий уровень биосинтеза ксиланазы (29,6 сд/см3) при низком уровне синтеза целлюлазы (4,9 ед/см3) был достигнут на 5 сутки при использовании в со-

■ Ксиланэза □ Целлюлаза

ставе питательной среды пшеничных отрубей, что можно объяснить присутствием в них значительного количества ксилана (17-24 %) и целлюлозы (10-30 %). Наиболее выраженные различия в соотношении ксиланаза/целлюлаза с преобладанием целлюлазы были отмечены на среде, содержащей свекловичный жом, на 7 сутки роста. При внесении в среду моно- и дисахаридов, а также КМЦ, крахмала и пектина наблюдалась выраженная репрессия синтеза ксиланазы. Представленные результаты свидетельствуют об

индуцибельной природе фермента и направленном синтезе ксиланазы при введении в питательную среду ксилан- и цел-люлозосодержащих субстратов как индукторов синтеза этой деполимеразы.

Активность,

ед/см1 35 т

30252015 ■ 1050 ■ 35 • 30 • 25 ■ 2015 ■ 10 5 ■ О •

,L,..,„, Алл

L. ,1 JL.

JbJL

lml

■Д|. п

iijjn

Рис. 1 Биосинтез кси-. ланазы и целлюлазы на различных источниках углерода.

А - на 5 сутки роста,

Б - на 7 сутки роста

Исходя из физиологических потребностей продуцента, при оптимизации состава тггателыюй среды были использованы 16 компонеотов (источники углерода, азота, фосфора, ростовые факторы и др.). Путем отсеивающего эксперимента по плану случайного баланса из них были отобраны 6 компонентов, значимо влияющих на биосинтез ксиланазы. В результате реализации дробного факторного эксперимента (ДФЭ 26"2) и крутого восхождения по методу Бокса-Уилсона были установлены их оптимальные концентрации, обеспечивающие наибольший выход ксиланазы На основании полученных данных разработан оптимальный состав питательной среды (%): отруби пшеничные - 2,0, целлюлоза (порошок) - 0,7, кукурузный экстракт - 1,0, кормовые дрожжи - 0,45, КН2 Р04 - 0,4, (NI-LO2HPO4 - 0,8. При росте Tr. viride на разработанной среде на 120 ч культивирования

максимальный уровень активности ксилаиазы составил 96,2 ед/см3, целлюлазы -32,4 ед/см3, их соотношение - 3,0:1.

Для оценки результативности направленного биосинтеза ксилаиазы в качестве кон" троля использовали уровни активностей ксилаиазы и целлюлазы, достигнутые при культивировании продуцента на питательной среде, используемой при производстве ферментного i препарата «Целловиридин», на которой активность ксилаиазы составляет - 34 ед/см3, активность целлюлазы - 46 ед/см3, их соотношение 0,74:1 при продолжительности культивирования продуцента 168 ч.

Таким образом, оптимизация состава питательной среды позволила осуществить направленный синтез ксилаиазы микроскопическим грибом Tr.viride 44-11-62/3, повысить ее активность в 2,8 раза по сравнению с активностью на производственной среде для биосинтеза целлюлазы, изменить соотношение между ксиланазой и целлюлазой (увеличить до 3,0:1) и сократить продолжительность культивирования продуцента на 48 часов.

Из литературных данных известно, что индукторами биосинтеза ксилаиазы могут бьггь низкомолекулярные продукты гидролиза ксилана и целлюлоты. Нами было исследовано влияние продуктов гидролиза углеводсодержащих компонентов питательной среды - пшеничных отрубей и целлюлозы (совместно) на синтез ксилаиазы. Для ферметгтативного гидролиза целлюлозы и пшеничных огрубей, содержащих 17-24 % ксилана, 10-30 % целлюлозы, 16-20 % крахмала использовали ферментные препараты целлюлолигического и амилолитического действия. В экспериментах определяли динамику активности деполимсраз.

Результаты исследований показали, что возможность интенсифицировать синтез ксилаиазы и увеличить соотношение ксилаиазы и целлюлазы в культуральной жидкости зависит от глубины гидролиза источников индуктора (пшеничных отрубей и целлюлозы) при их обработке препаратом «Целловиридин» (рис.2). При выращивании продуцента на среде с использованием гидролизатов отрубей и целлюлозы (содержание РВ 0,35 %), полученных при их обработке препаратом «Целловиридин» в течение 1 ч, биосинтез ксилаиазы значительно опережал биосинтез целлюлазы, достигая максимума активности к 72 ч культивирования при максимуме активности целлюлазы на 108 ч ферментации (рис.2, кривая 2). При этом соотношение активностей ксиланазы и целлюлазы на 72 ч составило 4,0:1. Наличие в питательной среде продуктов гидролиза полисахаридов сырья, с одной стороны, способствовало сокращению продолжительности лаг-фазы и ускоряло рост продуцента, а с другой - индуцировало синтез ксиланазы, что сокращало продолжительность культивирования и повышало активность фермента в культуральной жидкости.

Продолжительность культивирования, ч Продолжительность культивирования, ч

Рис. 2 Влияние предварительного гидролиза субстратов питательной среды (пшеничных отрубей - 2,0 и целлюлозы - 0,7 %) на биосинтез ксиланазы и целлюлазы. 1 - контроль (без гидролиза). Гидролиз препаратом «Целловирвдин»: 2 - в течение 1 ч, 3 - в течение 2 ч, 4 -в течение 4 ч; 5 - последовательный пиролиз «Целловиридином» в течение 2 ч и «Амилосубтилином» в течение 2 ч.

Более глубокий гидролиз субстратов препаратом «Целловиридин» (в течение 24 ч) и последовательный гидролиз препаратами «Целловиридин» и «Амилосубтилин» (рис.2, кривые 3, 4, 5) способствовал интенсификации роста продуцента вследствие высокого содержания в среде легкоусвояемых углеводов (содержание РВ 0,48-0,70%), однако приводил к увеличению продолжительности культивирования и снижению биосинтеза ксиланазы. Следовательно, действие продуктов гидролиза нельзя объяснить только улучшением условий питания гриба. Регуляторное влияние низкомолекулярных углеводов на биосинтез ксиланазы, по всей вероятности, определяется их концентрациями в среде. При низких концентрациях они являются индукторами, при высоких - репрессируют синтез ксиланазы.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что использование в составе питательной среды углеводсодержащих субстратов, индуцирующих синтез ксиланазы, глубина их гидролиза и способ обработки позволили направленно повысить синтез ксиланазы продуцентом Тгмпс/е 44-11-62/3, увеличить ее активность в культуральной жидкости до 106,4 сд/см3 при акшвности целлюлазы 26,6 ед/см3, изменить их соотношение до 4,0:1 и существенно сократить продолжительность культивирования (до 72 часов).

3. Регуляция синтеза ксиланазы условиями культивирования

Изучено влияние температуры культивирования на синтез ферментов и обнаружено, что температуры культивирования продуцента, оптимальные для биосинтеза ксилана-

зы и целлюлазы, различны. Оптимальной для синтеза ксиланазы является температура культивирования 32 °С, совпадающая с оптимальной температурой роста продуцента, в то время как для биосинтеза целлюлазы оптимальной была температура 28 °С.

При исследовании влияния исходного значения рН питательной среды на биосинтез ксиланазы было установлено (рис.3), что максимальная активность ксиланазы (115,2 ед/см3) и увеличение соотношения ксиланазы и целлюлазы в культурапьной жидкости до 5,6:1 достигаются при начальных значениях рН питательной среды 6,5-7,0, в то время как максимальная активность целлюлазы образуется при рН 4-4,5.

Рис. 3 Влияние исходного значения рН питательной среды на синтез ксиланазы и целлюлазы

Исследования по влиянию аэрации и массообменных процессов на синтез ферментов культурой 7>У1г/г/е показали, что оптимальный режим аэрации для биосинтеза ксиланазы предусматривает более высокий уровень растворения кислорода, чем для биосинтеза целлюлазы. В опытных условиях максимальная активность ксиланазы получена при дифференцированном режиме аэрации, когда в первые 16 ч в ферментер поступает 0,8 объема воздуха на 1 объем среда в мин, а затем до окончания ферментации - 1,5 объема воздуха на 1 объем среды в мин при скорости вращения мешалки 200 об/мин, которые обеспечивают концентрацию кислорода в культурапьной жидкости на уровне 22-28 % от насыщения.

В результате оптимизации условий культивироваиия продуцента акшвность ксиланазы в культурапьной жидкости на 72 ч роста была увеличена до 123,8 ед/см3, активность целлюлазы при этом составляла 22,5 сд/см3 (рис. 4), а соотношение ферментов равно 5,5:1.

Анализ динамики накопления ксиланазы (рис. 4) показал, что интенсивный биосинтез фермента начинается в экспоненциальной фазе роста, а максимум достигается в стадии отмирания культуры, при этом автолиз культуры может быть связан с исчерпанием углеводов на фойе высокого уровня азота и фосфора в срсде.

Рис. 4 Динамика биосинтеза ферментов, изменения рН и потребления питательных веществ при оптимальных условиях культивирования

1 - ксиланаза,

2 - целлюлаза,

3 - биомасса,

4 - рН среды, 5-РВ,

6 -общий сахар,

7 - фосфор, 8-аминный азот, 9 - аммиачный азот

С целью предотвращения автолиза продуцента и продления продуктивного состояния культуры были проведены исследования по дополнительному введению в среду суспензии гидролизованных пшеничных отрубей и целлюлозы на стадии интенсивного роста |риба и биосинтеза ферментов.

Культивирование продуцента с подпитками проводили в колбах с начальным объемом питательной среды 50 см3. В качестве подпитки использовали гидролизат, в 10 см3 которого содержится 1,0 % пшеничных отрубей и 0,35 % порошка целлюлозы. Были исследованы следующие варианты периодического культивирования с подпиткой: 1 - подпитка 10 см3 гидролизата на 24 час, 2 - подпитка 20 см3 гидролизата на 24 час, 3 - двукратная подпитка 10 см3 гидролизата на 24 и 36 часы роста. Результаты исследований выявили (рис.5), что дополнительная подпитка во всех случаях способствовала продолжению роста мицелия, поддерживала его продуктивность более длительное время и увеличивала продолжительность периода интенсивного биосинтеза ксиланазы, что привело к увеличению ее активности в культурапьной жидкости.

Наиболее эффективным для биосинтеза ксиланазы был вариант с двукратной подпиткой на 24 и 36 ч культивирования (рис.5, кривая 4), когда содержание РВ в среде снижалось до 0,17 и 0,2 % соответственно. Углеводы, внесенные в среду в фазе активного роста мицелия, быстро потреблялись растущим мицелием, в результате чего к 96 ч культивирования их количество в среде снижалось до 0,1-0,12 % (рис.6, Б).

NN. МН, «ОС- Общ РВ, рН Ксиланаза, мг% мг'Афор сахар, % адГсмЗ мг% %

150

100

зек

10£

2.0

1,5

1.0

0.5

0.4

0.2

Целлю- Био-л«м, масса, •д/смЗ г/дмЗ

■Ж Ж Ж Ж б

д-д-д-д-д-д 5

- 60 • 50 -40

зо 20 10

- 25 .20 15 .10 5

0 24 48 72 96 120 144 Продолжительность культивирования, ч

70 -1 60'

|50 §30

о 20 * ж 10

100 "

Рис. 5 Влияние подпитки на биосинтез ксиланазы микроскопическим грибом ТгуШеА 4-11-62/3.

Активность: 1 - контроль (без подпитки); 2 - подпитка 10 см3 гидролизата на 24 ч; 3- подпитка 20 см3 гидролизата на 24 ч; 4 - двукратная подпитка 10 см3 гидролизата на 24 и 36 ч.

Биомасса: 1* - контроль; 4* - двукратная подпитка.

При использовании двукратной подпитки питательные вещества потреблялись до 84 ч культивирования (рис.6, Б), тогда, как при ферментации без подпиток они исчерпывались практически к 48 ч роста (рис.4). Использование двукратной подпитки позволило повысить активность ксиланазы на 43 % по сравнению с контрольным вариатом без подпитки при максимуме активности фермента на 96 ч ферментации. Активность цел-люлазы при этом увеличилась всего на 11 %.

ЦлА- КсА,

г/яи'

ин, нн4. Фос- рв, общий мг*А мг% фор, % сахар,

300, мг% 3

200 _ 2.5 •

- 08

200 150 в(Х 2 -

100 400 0.4" 1 5 .

100 1 •

- 50 щ 0 2" 0.5 ■ —в-

О 24 48 72 96 120

Продолжительность культивирования, ч

0 24 48 72 96 120 Продолжительность культивирования, ч

Рис. 6 Динамика роста продуцента, биосинтеза ферментов, изменения рН (А) и потребления питательных веществ (Б) при культивировании с двукратной подпиткой

А: 1 - ксиланаза, 2 - целлгол'аза, 3 - биомасса, 4 - рН среды. Б- 5 - общие сахара, б - РВ, 7 - фосфор, 8 - аминный азот, 9 - аммиачный азот. Стрелками указано время внесения подпитки

Таким образом, регулирование процесса биосинтеза путем оптимизации состава питательной среды и условий культивирования продуцента позволили направить биосинтетический аппарат клетки на синтез ксиланазы, активность которой была увеличена в 5,2 раза и составила 177,3 ед/см3, а активность целлюлазы снижена в 1,4 раза, тем самым увеличено соотношение ксиланазы и целлюлазы с 0,74:1 до 5,3:1.

4. Разработка условий получения очищенного препарата ксиланазы Для получения препарата ксиланазы («Ксилозим») использовали культуральную жнлкость с активностью ксиланазы 175-185 ед/см3, целлюлазы - 31-37 ед/см3, содержанием сухих веществ 4,0-4,3 % и рН 6,5-6,8.

Для выделения и очистки ксиланазы использовали традиционные способы: отделение биомассы, стерилизующую фильтрацию, ультрафильтрацию и высушивание концентрата. Особое внимание в разработке технологии было уделено разработке режимов мембранных методов очистки. Так как ферменты обладают разными физико-химическими свойствами, процесс ультраконцентрирования необходимо разрабатывать индивидуально для каждого фермента. В результате были изучены и определены основные параметры процесса ультраконцентрирования фильтрата культуральной жидкости, обеспечивающие высокую производительность и максимальную селективность фермента. Оптимальные показатели производительности, селективности и сохранения ферментативной активности в процессе конце! ггрирования были получены при использовании полиамидной мембраны марки УПМ-50. Процесс необходимо вести при рН 6,0-7,0, что обеспечивает среднюю производительность процесса при 10 кратном концентрировании 22,6 дм'лА и селективность по ксиланазе 90,2 % (табл. 1).

Таблица 1 .

Характеристика процесса ультраконцентрирования ксиланазы на мембранах УПМ

Тип мембраны Удельная производительность, дм /м ч Активность ксиланазы в концентрате, ед/см Удельная активность, ед/мг белка Селективность, % Степень очистки

УПМ-10 8,9 1760 13,8 97,8 1,4

УПМ-20 11,9 1703 19,1 94,6 1,7

УПМ-50 22,6 1624 23,7 90,2 1,9

УПМ-67 23,7 1408 26,4 78,2 1,7

МФЦ+УПМ-50 30,2 1405 24,0 90,1 2,2

С целью интенсификации процесса концентрирования проводили предварительную очистку фильтрата культуральной жидкости путем стерилизующей фильтрации на мембране МФЦ с размером пор 0,22 мкм, что позволило увеличить производительность ультрафильтрационной мембраны в 1,3 раза (табл.1). При исследовании влияния степени концентрирования (от 5 до 15 раз) на сохранение активности фермента установлено, что без значительных потерь от инактивации ксиланазы культуральная жидкость может быть сконцентрирована в 10 раз.

Полученный концентрат высушивали на лиофильной сушилке в лабораторных

условиях или иа распылительной сушилке (при Т,„=130-135 °С и Твых= 60-65 °С) в опытных условиях. С целью уменьшения потерь от инактивации в процессе сушки изучено влияние различных солей на стабильность ксиланазы. Было установлено, что сульфат аммония снижает инактивацию фермента в процессе сушки иа 8-11 % и способствует сохранению активности ксиланазы в процессе хранения препарата в течение 3-х лет.

В результате проведенных исследований разработана технологическая схема получения ферментного препарата ксиланазы, которая включает следующие стадии: 1-приготовление посевного материала, 2-выращивание продуцента в ферментере с двукратной подпиткой культуры, 3-отделение биомассы, 4-микрофильрацию, 5-концентрирование микрофильтрата, 6-жидкостную стандартизацию концентрата сульфатом аммония, 7-сушку препарата, 8-сухую стандартизацию препарата сульфатом аммония (схема приведена в диссертации). По данной схеме проведена отработка технологии в опытных условиях.

Разработана и утверждена нормативно-техническая документация на получение препарата ксиланазы («Ксилозим»): опытно-технологический регламент, технические условия на препарат и получено разрешение Минздрава РФ на его использование в пищевой промышленности.

5. Изучение некоторых свойств препарата «Ксилозим»

Изучение рН-оптимума и температурного оптимума действия препарата ксиланазы «Ксилозим» показало, что фермент наиболее активен при рН 4,5-5,5, проявляет максимальную активность при значении рН 5,0, имеет температурный оптимум действия 50 °С. Зона стабильности фермента находится в слабокислой среде при рН 4,5-6,0 и температуре не выше 40 °С. За 5 часов инкубации при 50 °С фермент сохраняет 50 % первоначальной активности, а при 60 °С в течение 1 часа активность почти полностью подавляется вследствие термоинакгивации фермента.

При исследовании ферментных комплексов и субстратной специфичности препарата «Ксилозим», а также одного из лучших зарубежных аналогов препарата «Пентопан 500ВО» фирмы «НоуогутеБ» (Дания) и комплексного препарата «Целловиридин Г20Х», выпускаемого отечественной промышленностью, установлено, что препараты содержат довольно широкий набор целлюлолитических и гемицеллюлолитических ферментов, способных гидролизовать некрахмалнетые полисахариды растительного сырья. По качественному составу и количественному содержаншо ферментов препарат «Ксилозим» близок к зарубежному аналогу препарату «Пентопан», но значительно отличается по количественному соотношению ксиланолитических и целлюлолитических ферментов от

препарата «Целловиридин Г20Х» (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика ферментных комплексов исследованных препаратов

Активность, ед/г

Фермент Субстрат Тип связи «Ксилозим» «Пентопан 500в0» «Целловиридин Г20Х»

Ксиланаза Ксилан овса (арабинометилглю- куроноксилан) Р-1,4- 2 ООО 2200 740

Ксилан березы (ацетилметилглю- куроноксилан) р-1,4- 1880 2640 670

Р-ксилозидаза п-нитрофенил-р-Д-ксилопиранозид Р-1,4- 56 28 27

Целлюлаза - комплексная (АФБ) Фильтровальная бумага (ватман Ко 1) Р-1,4- 410 608 2000

- р-1,4-глюканаза Ыа-карбокси-метилцеллголоза Р-1,4- 590 512 1676

Глюкан ячменный Р-1,4-(75%) Р-1,3-(25%) 1150 1250 1100

Р-тлюканаза Глюкан дрожжевой Р-1,3-(28%) Р-1,6-(72%) 260 150 155

Ламинарии Р-1,3- 103 140 38

Лихеннн Р-1,4-(65%) Р-1,3-(35%) 1265 1265 2087

Р-глюкозидаза п-нитрофенил-Р-Д-глюкопиранозид Р-1.4- 45 108 90

р-талактозидаза п-нитрофенил-Р-Д-гапактопиранозид Р-1,4- 11,6 2,3 4,5

Амилаза Растворимый крахмал а-1,4-а-1,6- 0 0 0

Исследованные препараты гидролизовали катаны разной структуры и различного

происхождения. Структурные различия между арабинометилглюкуроноксиланом овса и аце-тилметилглокуроноксиланом березы не оказывали значительного влияния на гидролиз этих кенланов препаратами «Ксилозим» и «Целловиридин Г20Х», степень их гидролиза отличалась всего на б и 10 % соответственно. В то же время препарат «Пентопан 500в0» способен к более глубокому гидролизу ацетилметилглюкуроноксилана березы (на 20 %), чем арабиноме-тилппокуроноксилана овса.

Кроме ксиланазы препарат «Ксилозим» содержит экзофермент Р-ксипозидазу. В препарате присутствуют также сопутствующие ферменты: целлюлазы, способные гидро-лнзовать как растворимую целлюлозу (Ыа-КМЦ), так и высокоупорядочную форму цел-

лголозы; глгоканазы, высокоэффективные по отношению к глюканам, содержащим (3-1,4- и р-1,3-связи, и менее эффективные по отношению к глюканам, содержащим только Р-1,3-связи и глюканам, имеющим |3-1,6-спязн. Кроме того, в препарате присутствуют в небольших количествах экзоферменты - (3-глюкозидаза и р-галактозидаза. В препарате отсутствует амилаза.

6. Применение ферментного препарата «Ксилозим» Препарат «Ксилозим» прошел успешные испытания в ГосВПИИ хлебопекарной промышленности при производстве хлебобулочных изделий из пшеничной и ржаной муки. Показано, что способность эндоксиланаз гидролизовать арабиноксиланы, присутствующие в муке, облегчает перераспределение воды в тесте и хлебе, улучшает процесс вымешивания теста, увеличивает эластичность глютена, увеличивает объем хлеба, улучшает структуру мякиша и замедляет черствение хлеба. Рекомендуемая доза внесения препарата «Ксилозим» - 2-10 г на 100 кг муки. Установлено, что по эффективности действия препарат соответствует лучшему зарубежному аналогу - препарату «Пентопан 500в0» фирмы «Моуогутеэ», используемому в настоящее время в хлебопекарной промышленности.

Установлена перспективность применения препарата «Ксилозим» в виноделии. В опытных условиях отмечено увеличение общего выхода сусла на 1-5 %, увеличение скорости фильтрации в 2,5-3,6 раза и сокращен расход оклеивающих веществ в 2-4 раза. Рекомендованная доза внесения препарата - 0,01-0,03 %.

Показана возможность использования препарата «Ксилозим» в составе мультиэн-зимной композиции МЭК-СХ-3 для введения в комбикорма с включением нетрадиционного вида фуражного зерна с высоким содержанием некрахмалистых полисахаридов (ячменя, овса, проса, сорго).

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Впервые изучено влияние на биосинтез ксиланазы микроскопическим грибом ТгМп<к 44-11-62/3 различных источников углерода и показан индуцибельный характер биосинтеза ксиланазы. Индуцирующими факторами процесса являются ксилан и ксилан- и целлюлозосодержащие субстраты.

2. Разработаны приемы регулирования биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Тг. уЬ'Ме 44-11 -62/3 за счет использования индукторов биосинтеза и оптимизации условий культивирования гриба, что позволило не только повысить синтетическую активность продуцента, но и существенно изменить соотношение активностей кенланазы и целлголазы в культуральной жидкости (с 0,74:1 до 5,3:1), а также сократить продолжительность культивирования гриба со 168 до 96 ч.

3. Разработаны режимы очистки и концентрирования ксиланазы с использованием микро- и ультрафильтрации, а также условия сушки и стабилизации фермента сульфатом аммония, обеспечивающие сохранение активности ферментного препарат «Ксилозим» при его хранении в течение 3-х лет.

4. Изучена субстратная специфичность и установлен ферментный состав полученного препарата «Ксилозим» и показано, что он содержит ксиланазы, способные гидролизовать ксиланы овса и твердой древесины, а также экзофермент Р-ксилозидазу. В качестве сопутствующих ферментов препарат содержит цел-люлазы, глюканазы, экзоферменты Р-ппокозидазу и Р-галактозидазу. В препарате отсутствует амилаза.

5. Определены оптимальные условия действия ксиланазы ферментного препарата: • рН -4,5-5,5, температура - 50 °С, зона стабильности фермента - при рН 4,5-6,0 и температуре не выше 40 °С.

6. Показана эффективность использования препарата «Ксилозим» при производстве хлеба, хлебобулочных и сдобных изделий; в виноделии для повышения выхода виноматериалов и скорости фильтрации сусла. На основе препарата «Ксилозим» разработана мультиэнзимная композиция МЭК-СХ-3, предназначенная для введения в комбикорма, содержащие нетрадиционные вида фуражного зерна с высоким содержанием некрахмалистых полисахаридов.

7. Разработана нормативно-техническая документация на производство препарата «Ксилозим»: опытно-промышленный технологический регламент и технические условия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бравова Г.Б., Шишкова ЭЛ., Павлова U.M., Петрова II.T., Нестеренко Е.А., Ежова А.Ю., Ларина Л.Н., Полетаева O.A. Комплексный ферментный препарат ксилозим для перерабатывающих отраслей пищевой промышленности: Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в агроиндуст-рии: Тезисы докладов II Международной научно-практической конференции. -Ялта, 2001г.-С. 67

2. Ларина Л.Н., Павлова Н.М., Шишкова Э.А., Петрова Н.Т., Полетаева O.A., Бравова Г.Б. Влияние условий культивирования на биосинтез ксиланазы и целлюлазы микроскопическим грибом Trichoderma viride 44-11-62/3: Тезисы докладов Первого съезда микологов «Современная микология в России». - М., 2002. - С. 300.

3. Ларина Л.Н., Павлова Н.М., Петрова Н.Т., Нестеренко Е.А., Полетаева O.A. Получение и характеристика комплексного ферментного препарата с высокой ксиланазной активностью: Материалы I конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития». - М., 2002 г. - С.228.

4. Ларина Л.Н., Павлова Н.М., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б. Направленный биосинтез ксиланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride: Материалы II международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Ч. 1. - М„ 2003г. - С.328.

5. Шишкова Э.А., Ларина Л.Н. Перспективы производства полиферментных систем и их использование в пищевой промышленности: Сборник докладов Всероссийской научно-технической конференции-выставки «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации». Московский Государственный университет пищевых производств. - М., 2003. - С. 182-187.

6. Ларина Л.Н., Павлова Н.М., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б. Биосинтетические свойства Trichoderma viride - продуцента целлюлазы и ксиланазы: Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК - М.: Пищепромиздат, 2004. - С.71-75.

7. Ларина Л.Н., Павлова Н.М., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б. Оптимизация биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride // Биотехнология. - 2005. - № 4. - С.29-37.

8. Ларина Л.Н., Павлова Н.М., Шишкова Э.А., Петрова Н.Т., Нестеренко Е.А., Полетаева O.A., Бравова Г.Б. Использование мембранной технологии для концентрирования и очистки ксиланазы Trichoderma viride и некоторые свойства ферментного препарата // Биотехнология. - 2005. - № 4. - С.38-46.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

Подписано в печать 02.02.06. Заказ № 72 Тираж 100 экз.

- 2 9 64

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Ларина, Любовь Николаевна

ВВЕДЕНИЕ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Особенности структуры ксиланов.

2. Классификация ксиланаз по механизму действия.

3. Биосинтез ксиланазы различными микроорганизмами.

4 .Регуляция синтеза ксиланазы.

4.1. Индукция ксиланазы.

4.2. Репрессия синтеза ксиланазы.

4.3. Влияние компонентов питательной среды на синтез ксиланазы.

4.4. Влияние условий культивирования на биосинтез ксиланазы.

5. Физико-химические свойства ксиланаз.

6. Применение ксиланазы в различных отраслях народного хозяйства.

7. Анализ обзора литературы и задачи исследования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1.1. Характеристика объекта исследований.

1.2. Условия культивирования и питательные среды.

1.3. Методы получения очищенного ферментного препарата.

1.4. Методы, использованные при исследовании свойств препарата.

1.5. Методы определения активности ферментов.

1.6. Прочие методы.

ГЛАВА 2. ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА НАПРАВЛЕННЫЙ БИОСИНТЕЗ КСИЛАНАЗЫ МИКРОСКОПИЧЕСКИМ ГРИБОМ ТпсНоЛегта хтйе 44-11-62/3.

2.1. Некоторые сведения о штамме-продуценте - микроскопическом грибе Тпс1юс1егта У1пс1е 44-11 -62/3.

2.2. Влияние различных источников углерода на синтез кси-ланазы микроскопическим грибом Тг1скос1егта утс1е4А-\ 1-62/3.

2.3. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза ксиланазы с использованием методов математического планирования эксперимента.

2.4. Влияние предварительной ферментативной обработки углеродсодержащих субстратов питательной среды на биосинтез ксиланазы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Направленный биосинтез ксиланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride 44-11-62/3 и разработка технологии получения ферментного препарата"

Актуальность темы. Интерес к ксиланазам - ферментам, 'т расщепляющим растительные полисахариды - ксиланы, неуклонно растет благодаря огромному потенциалу их использования в сельскохозяйственном производстве и ряде отраслей промышленности, ориентированных на переработку растительного сырья. Ксиланы являются наиболее распространенными гемицеллюлозами, составляют более 30 % сухого веса растительной биомассы и занимают второе место по распространенности после целлюлозы.

В настоящее время ксиланазы нашли широкое применение в пищевой промышленности для повышения выхода и качества продукции в производствах хлеба, соков, вин, пива, спирта, растительного масла, растворимого кофе и др. Ксиланазы используются с высокой эффективностью в целлюлозо-бумажной промышленности для отбеливания бумажной пульпы. Они улучшают качество грубых кормов для сельскохозяйственных животных и птицы.

Наряду с другими гидролитическими ферментами ксиланазы можно использовать для повышения выхода белковых веществ, пигментов, крахмала, пектина, сахаристых и биологически активных веществ за счет разрушения клеточных стенок растительного сырья.

С каждым годом накапливается все больше данных в пользу экономической рентабельности ферментативного способа получения ксилозы из отходов промышленности и сельского хозяйства. Ксилоза, получаемая при ферментативном гидролизе ксиланов, может быть превращена в ксилит и фурфурол, широко применяемые в химической и фармацевтической промышленности, может служить источником углерода для микроорганизмов с целью получения топлива и различных химических соединений (уксусной кислоты, этанола, бутанола, метана, ацетона и др.), а также белковых кормовых продуктов.

В последние годы производство ксиланаз, наряду с целлюлазами и пектиназами, значительно расширено. Эти ферменты занимают около 20% мирового промышленного производства ферментов (Mantyla et al., 1998). Основными продуцентами, используемыми для производства ксиланаз, являются культуры Trichoderma и Aspergillus (Uhlig, 1998).

В связи с этим разработка технологии получения высокоэффективного конкурентоспособного ферментного препарата ксиланазы для пищевой промышленности и других отраслей, перерабатывающих растительное сырье, и создание производства на отечественных заводах является своевременной и актуальной задачей.

В качестве перспективного продуцента ксиланазы в работе был использован микроскопический гриб Trichoderma viride 44-11-62/3, применяемый в настоящее время как продуцент целлюлолитических ферментов, в частности при производстве ферментного препарата «Целловиридин». Данный штамм способен синтезировать ксиланазу, которая при производстве целлюла-зы присутствует как сопутствующий фермент. Известно, что микроорганизмы, в том числе микроскопические грибы, обладают высокой адаптивностью к изменению внешних факторов — источников питания и условий роста, что обусловлено гибкой регуляцией обменных процессов, включая синтез ферментов, принимающих участие в их физиологии питания. Это предполагает возможность направленного изменения соотношения основных деполимераз, образующихся при культивировании микроскопического гриба Tr. viride 44-11-62/3 и повышения активности ксиланазы.

Штамм хорошо изучен с точки зрения его способности синтезировать ферменты целлюлазного комплекса. В то же время следует сказать, что закономерности биосинтеза других компонентов ферментного комплекса, и в частности ксиланазы, изучены неполно. В связи с этим исследование регуляторных механизмов ферментообразования является необходимым условием целенаправленного использования биосинтетического аппарата микроорганизма.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение закономерностей биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Тпскос1егта утс1е 44-11-62/3 и условий направленного повышения ее активности, а также разработка технологии получения очищенного ферментного препарата. Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:

• изучить закономерности биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Тг. утс1е 44-11-62/3 на различных источниках углерода, оптимизировать состав питательной среды и условия культивирования для направленного повышения биосинтеза ксиланазы и изменения соотношения ксиланазы и целлюлазы;

• разработать режимы выделения, очистки, концентрирования и сушки фермента;

• изучить основные физико-химические и биохимические свойства ксиланазы Тг. уМе 44-11-62/3;

• разработать нормативно-техническую документацию на получение препарата;

• исследовать эффективность применения полученного ферментного препарата ксиланазы в различных отраслях народного хозяйства. Научная новизна. Впервые выявлены закономерности биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Тг. утс1е 44-11-62/3 на различных источниках углерода.

Показано, что индуцирующими биосинтез ксиланазы факторами являются ксилан, а также ксилан- и целлюлозосодержащие субстраты, такие как пшеничные отруби, целлюлоза, солодовые ростки и продукты их ферментативного гидролиза, применение которых позволяет интенсифицировать процесс биосинтеза.

Разработаны приемы регулирования биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Тг. viride 44-11-62/3 за счет использования индукторов биосинтеза и оптимизации условий культивирования гриба, что позволило не только повысить синтетическую активность продуцента, но и существенно изменить соотношение активностей ксиланазы и целлюлазы в культуральной жидкости (с 0,74:1 до 5,3:1), а также сократить время культивирования гриба со 168 до 96 ч.

Впервые охарактеризованы ферментный комплекс и субстратная специфичность полученного препарата и изучены физико-химические свойства ксиланазы Тг. утс1е 44-11-62/3 (рНоПХ, Топх, рН- и термостабильность, субстратная специфичность и др).

Практическая значимость работы. На основании полученных данных разработана технология получения ферментного препарата ксиланазы «Ксило-зим» и утверждена нормативно-техническая документация, включающая опытно-промышленный регламент получения ферментного препарата «Ксилозим» и технические условия на препарат. Получено разрешение Минздрава РФ на использование препарата «Ксилозим» в пищевой промышленности.

Показано, что препарат эффективен в хлебопекарной промышленности. Разработаны рекомендации по его использованию в качестве улучшителя хлеба, получаемого с использованием ржаной и пшеничной муки.

Стоимость препарата «Ксилозим» составляет 480 руб/кг, в то время как стоимость препаратов аналогичной степени очистки фирмы «ЫоуогутеБ» -20-25 долларов за 1 кг (566,0-707,5 руб). Экономический эффект от использования 1 кг препарата «Ксилозим» в хлебопекарном производстве взамен импортного препарата «Пентопан 500ЕЮ» фирмы «ЫоуогутеБ» при расходе препаратов 0,10 кг на 1 т муки составит 227,5 руб.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на международных и российских научно-технических конференциях, симпозиумах и конгрессах, в том числе на II Международной научно-практической конференции (Ялта, 2001г.); Первом съезде микологов «Современная микология в России» (Москва, 2002 г.); I, II, IV Международных конгрессах «Биотехнология — состояние и перспективы развитии» (Москва, 2002, 2003, 2005 г.г.); на заседаниях Ученого совета НТЦ «Лекбиотех».

Публикации. По результатам исследований опубликованы 4 статьи и 4 тезиса докладов, в которых отражены основные положения диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ларина, Любовь Николаевна

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Впервые изучено влияние на биосинтез ксиланазы микроскопическим грибом ТгМпс1е 44-11-62/3 различных источников углерода и показан ин-дуцибельный характер биосинтеза ксиланазы. Индуцирующими факторами процесса являются ксилан и ксилан- и целлюлозосодержащие субстраты.

2. Разработаны приемы регулирования биосинтеза ксиланазы микроскопическим грибом Тг. утс1е 44-11-62/3 за счет использования индукторов биосинтеза и оптимизации условий культивирования гриба, что позволило не только повысить синтетическую активность продуцента, но и существенно изменить соотношение активностей ксиланазы и целлюлазы в культуральной жидкости (с 0,74:1 до 5,3:1), а также сократить продолжительность культивирования гриба с 168 до 96 ч.

3. Разработаны режимы очистки и концентрирования ксиланазы с использованием микро- и ультрафильтрации, а также условия сушки и стабилизации фермента сульфатом аммония, обеспечивающие сохранение активности ферментного препарата «Ксилозим» при его хранении в течение 3-х лет.

4. Изучена субстратная специфичность и установлен ферментный состав полученного препарата «Ксилозим» и показано, что он содержит ксиланазы, способные гидролизовать ксиланы овса и твердой древесины, а также экзофермент - Р-ксилозидазу. В качестве сопутствующих ферментов препарат содержит целлюлазы, глюканазы, экзоферменты — Р-глюкозидазу и Р-галактозидазу. В препарате отсутствует амилаза.

5. Определены оптимальные условия действия ксиланазы ферментного препарата: рН -4,5-5,5, температура - 50 °С, зона стабильности фермента - при рН 4,5-6,0 и температуре не выше 40 °С.

Показана эффективность использования препарата «Ксилозим» при производстве хлеба, хлебобулочных и сдобных изделий; в виноделии для повышения выхода виноматериалов и скорости фильтрации сусла. На основе препарата «Ксилозим» разработана мультиэнзимная композиция МЭК-СХ-3, предназначенная для введения в комбикорма, содержащие нетрадиционные виды фуражного зерна с высоким содержанием некрахмалистых полисахаридов.

Разработана нормативно-техническая документация на производство препарата «Ксилозим»: опытно-промышленный технологический регламент и технические условия.

6.4 Заключение

Показана эффективность применения препарата «Ксилозим» в хлебопекарной промышленности при производстве хлебобулочных изделий. Разработаны рекомендации по его использованию в качестве улучшителя хлеба, получаемого с использованием ржаной и пшеничной муки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Ларина, Любовь Николаевна, Москва

1. Александрова Г.П., Медведева С.А., Синицын А.П., Окунев О.Н. Изменение состава структурных компонентов лиственной сульфатной целлюлозы в процессе ферментативного отбеливания ксиланазами // Прикл. биохим. и микробиол. 2000. - Т. 36, № 3. - С. 287-292.

2. Алексеева В.В. Получение гомогенной нейтральной бактериальной про-теиназы Bacillus subtilis шт. 103 и изучение ее свойств: Автореф. дисс. .канд. техн. наук. — М., 1977.-32 с.

3. Альперович Е.Д. Получение целлюлазных ферментных препаратов на основе грибных культур: Автореф. дисс. канд. техн. наук М., 1986 - 25 с.

4. Апрасюхина Н.И., Тавобилов И.М., Родионова H.A. Множественные формы гемицеллюлаз в фильтрате культуральной жидкости Trichoderma viride 1310 //Прикл. биохим. и микробиол. 1987. - Вып. 23, № 5. - С. 624-629.

5. Аре Р.Ю., Виестур У.Е. Получение микробных метаболитов — М.: Пищевая пр-ть, 1979. 72 с.

6. Балцере Д.Ю., Арен А.К., Безбородов A.M. и др. Способ получения иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса. A.C. СССР № 1055770, 1983.

7. Берлин A.B., Тихомиров Д.Ф., Гутьерес Б.Р., Гусаков A.B., Попова H.H., Синицын А.П. Оценка топоферментной активности целлюлаз и ксила наз // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. - Т. 34, № 4. - С. 328-287.

8. Борисенко Т.Н., Сергеева И.Ю., Чегодаев Ф.Н. Интенсификация процесса приготовления пивного сусла с использованием Целловиридина Г20Х // Пиво и напитки. 2000. - № 4. - С. 32-35.

9. Брустовецкая Т.П., Окунев О.Н., Шульга A.B. Образование и свойства грибных целлюлаз и ксиланаз в жидкой среде и в условиях твердофазной ферментации // Прикл. биохим. и микробиол. 1991. - Т. 27, №. 4. -С. 577-583.

10. Вавилова Е.А., Антонова Е.Д., Барсуков Е.Д., Винецкий Ю.ГТ. Механизм суперпродукции секретируемых ферментов у мицелиального гриба Pénicillium canescens // Прикл. биохимия и микробиол. — 2003 — Т. 39, №3.-С. 284-292.

11. Вавилова Е.А., Винецкий Ю.ГТ. Индукция синтеза эндо-1,4-р~ксиланазы и р-галактозидазы в исходных и рекомбинантных штаммах гриба Pénicillium canescens // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. - Т. 39, № 2 -С. 167-172.

12. Голубев А.М., Иватулин Ф.М., Килимник Ф.Ю., Родионова Н.А., Неуст-роев К.Н. Выделение и свойства эндоксиланазы и Р-ксилозидазы из As-pergillus orizae // Биотехнология. 1993. - T. 58, № 6. - С. 845-851.

13. Гомартели M., Квеситадзе Э., Безбородов А.М. Школьный А.Т., Джобава М., Адейшвили Е. Pénicillium canescens с повышенной ксиланазной активностью // Прикл. биохим. и микробиол. 1998. - Т. 34, № 6. - С. 650-654.

14. Горбачева И.М. Ферменты Aspergillus niger, расщепляющие ксиланы: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М., 1977.-25 с.

15. Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов. -М., 1971.-117 с.

16. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов — М.: Элевар, 2000. 512 с.

17. Гужова Э.П., Логинова Л.Г. Целлюлолитические ферменты и ксиланаза Myceliophthora thermophila // Прикл.биохимия и микробиол. — 1987. -Т. 23, вып. 6.-С. 820-825.

18. Гумерова У.А., Румянцева Н.И., Лозовая В.В., Селиванова А.С., Рабинович М.Л. Новые литические композиции ферментов для получения делящихся протопластов гречихи // Прикл. биохим. и микробиол. 1993. -Т. 29, вып. 4.-С. 591-596.

19. Даниляк Н.И., Черных В.А. Ксиланазы в биотехнологических процессах. -Киев, 1989.-98 с.

20. Девяткин А.А., Чалов И.С., Аржанова И.Н. Влияние фермента ксиланаза на выход и качество этилового спирта // Материалы Третьего съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова / Ред. Васи лов Р.Г. М.: МАКС Пресс, 2005. - С. 149.

21. Дроздов Н.С., Мотеранская Н.П. Практикум по биологической химии. — М.: Высшая школа, 1970.-256 с.

22. Дубовая Н.В. Исследование процессов выделения и очистки микробной эндо-1,4-Р-ксиланазы из рода Geotrichum и изучение свойств фермента: Автореф. дисс . канд. биол. наук. Москва, 2002. - 25 с.

23. Дытнерский Ю.И. Обратный осмос и ультрафильтрация. М.: Химия, 1978.-352 с.

24. Ежова А.Ю. Разработка технологии выделения и очистки трансэлимина-зы Bacillus macerans и изучение их свойств: Автореф. дисс. .канд. техн. наук. М., 2002.-24с.

25. Иванова И.И., Коршунов В.В., Григорьев Е.Ф. Биосинтез целлюлаз термотолерантным грибом Aspergillus terreus // Темофильные микроорганизмы в практике народного хозяйства. М., 1985. - С. 65-72.

26. Калунянц К.А, Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты. -М.: Пищевая промышленность, 1979. 304 с.

27. Квеситадзе Э., Гомартели М., Безборордов A.M., Адейшвили Е. Термостабильные эндоксиланазы грибов термофилов // Прикл. биохим. и микробиол. - 1998. - Т. 34, № 5. - С. 517-520.

28. Кислухина О.В., Доронин А.Ф., Жданова M.JL Получение сока из яблокс применением цитолитических ферментных препаратов // Пищ. пр-ть. -1994.-№9.-С. 28-29.

29. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов М.: ДеЛи-принт, 2002. - 330 с.

30. Клесов A.A., Рабинович М.Л., Чурилова и др. Ферментативный гидролиз целлюлозы. 1. Активность и компонентный состав целлюлазных комплексов из различных источников // Биоорганическая химия. 1980. -Т. 6,№8.-С. 1225-1242.

31. Коломбет Л.В., Жиглецова С.К., Дербышев В.В., Ежов Д.В., Косарева Н.И., Быстрова Е.В. Микофунгин препарат на основе Trichoderma viride для борьбы с болезнями растений // Прикл. биохим. и микробиол.-2001.-Т. 37, вып. 1.-С. 110-114.

32. Крохина В., Антошин В., Удалова Э. Мультиэнзимная композиция в комбикормах для поросят // Комбикорма. 2000. - № 7. - С. 47-48.

33. Ленгуорси Т. Жизнь микроорганизмов при экстремальных значениях рН // Жизнь микробов в экстремальных условиях / Ред. Кашпер Д.М. -М.: Мир, 1981.-С. 922-926.

34. Лобуцкая Н.В., Волков Ю.Г., Ермак И.М., Дедюхина В.П. Получение биологически активных веществ с помощью грибных ферментов // Биотехнология. 2002. - № 6. - С. 68-69.

35. Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. — М.: Изд-во Московского университета, 1969.-125 с.

36. Маркина О.А., Румянцева Г.Н., Птичкина Н.М. Использование отечественных ферментных препаратов для получения пектина из жома // Материалы 1-го конгресса "Биотехнология состояние и перспективы развития". - М., 2003. - С. 379.

37. Матвеева И.В. Новые аспекты применения ферментных препаратов фирмы "Ново Нордиск" в хлебопекарном производстве // Хлебопечение России. 2000. - № 4. - С. 20-22.

38. Матвеева И.В., Пучкова Л.И., Малофеева Ю.Н., Юдина Е.А. Применение ферментных препаратов при производстве хлеба из смеси ржаной и пшеничной муки // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 2001-№2.-С. 68-71.

39. Месхи Р.Г. Разработка технологии комплексного ферментного препарата (3-глюканазы, ксиланазы и глюкозидазы: Автореф. дисс. . канд. тех. наук.-М., 1983.-25 с.

40. Морозова Е.С. Основные достижения и направления селекции продуцентов целлюлаз в СССР и за рубежом // Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты: Итоги науки и техники. Серия биотехнология / Ред. Клесов А.А. 1988. - Т. 10. - С. 6-71.

41. Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. М.: Легкая и пищ. пром-ть, 1982. - С. 25.

42. Нарсия Т.А. Разработка технологии ферментного препарата инулиназы: Автореф. дисс. .канд. техн. наук. -М., 1989. -24 с.

43. Наумов Г.Н., Пенкина А.Г., Дмитриев В.И. Разработка технологии био-каталического получения ксилита // Материалы Третьего съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова / Ред. Василов Р.Г. -М.: МАКС Пресс, 2005. -С. 175-176.

44. Нуцубидзе Н.Н., Прабакаран К., Джафарова А.Н., Клесов А.Н. Получение протопластов из целлюлолитического гриба Trichoderma viride QM 9414 // Прикл. биохим. и микробиол. 1988. - Т. 24, вып. 5. — С. 725-729.

45. Нуцубидзе Н.Н., Образцова Н.И., Демина В.А., Зверева Е.А. Получение протопластов базидиомицетов белой гнили и биохимические характеристики секретируемых ферментных комплексов // Прикл. биохим. и микробиол. 1992. - Т. 28, вып. 3 - С. 409-415.

46. Острикова H.A. Разработка биотехнологии целлюлолитических ферментов на основе экспериментально полученного мутанта Trichoderma viride 44: Автореф. дисс. канд. техн. наук. — М., 1983.-25 с.

47. Острикова H.A., Коновалов С.А., Переведенцева М.М., Павлова Н.М., Белогорцев Ю.А., Калунянц К.А., Гернет М.В., Замотайлова Л.П., Чего-даев Ф.Н. Штамм гриба Т.viride — продуцент внеклеточной целлюлазы и ксиланазы. Патент РФ № 1525208, 1989.

48. Папета Н.Ф., Цилосани Г.М., Николаишвили Н.Т., Квеситадзе Г.И. Идентификация, очистка и характеристика ксиланазы из Nocardiopsus sp., ингибирующей рост ряда фитопатогенных грибов // Биохимия. -1995. Т. 60, вып. 4. - С. 578-584.

49. Павлова Н.М. Разработка технологии пектолитических ферментов на основе экспериментально полученного мутанта Asp. foetidus М-45: Автореф. дисс. канд. техн. наук. -М., 1982.-27 с.

50. Петрова Н.Т. Разработка технологии получения литических ферментов, расщепляющих клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов, с использованием мутантного штамма Streptomyces griseinus: Автореф. дисс. канд. техн. наук. — М., 2005. — 18 с.

51. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. -М.: Мир, 1978.-332 с.

52. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. М.: Колос, 1976. -С. 255.

53. Поландова Р.Д., Еркинбаева Р.К. Применение ферментных препаратов в хлебопекарном производстве. Современное состояние и перспективы // Хлебопечение России. 1997. -№ 3. - С. 20-22.

54. Поландова Р.Д., Увайтхэст Б., Атаев A.A. К вопросу механизма действия хлебопекарных улучшителей // Хлебопечение России. 1999. -№ 1.-С. 13-15.

55. Поляков В.А., Римарева JI.B. Перспективные ферментные препараты и особенности их применения в спиртовой промышленности // Пиво и напитки. 2000. - № 2. - С. 52-55.

56. Рафаловская Т.Я., Шишкова Э. А. Коцентрирование а-амилазы Вас. subtilis методом ультрафильтрации // Методы получения высокоочищенных ферментов: Тезисы Всесоюзного симпозиума. Вильнюс, 1978. — С.36-37.

57. Родионова Н.А., Горбачева И.В., Тавобилов И.М. Ксиланазы Aspergillus niger // Проблемы биоконверсии растительного сырья / Ред. Скрябин Г.К., Головлев E.JL, Клесов А.А. М.: Наука, 1986. - С. 237-271.

58. Родионова H.A., Килимник А.Ю., Миляева Э.А., Мартинович Л.И., Безбородое A.M. Расщепление изолированных клеточных стенок оболочек пшеничного зерна высокоочищенными и гомогенными ферментами // Прикл. биохим. микробиол. 1999. - Т. 35, № 6. - С. 629-637.

59. Рожанская Т.Н., Марголинап H.A., Возная Э.Е., Селезнева A.A. Исследование некоторых закономерностей процесса ультрафильтрации растворов белков // Хим. Фармац. Журнал. 1981. - Т. XV, № 5. -С. 75-79.

60. Синицын А.П. Штамм гриба "Trichoderma reesei" продуцент целлюло-литических ферментов. Патент RU № 2001949, 1993.

61. Синицын А.П., Черноглазое В.М., Гусаков A.B. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов: Итоги науки и техники. Серия биотехнология. 1993. - Т. 25. - С. 33-34.

62. Скляр В.И., Калюжный C.B., Михентьева Т.В. и др. Конверсия геми-целлюлоз в метан. 1. Мезофильный режим // Биотехнология. 1987. -Т. 3, № 1. - С. 79-85.

63. Смирнова Т.Е., Бравова Г.Б., Данилова Т.И., Бурмистрова В.В. Изучение влияния продуктов деградации пектина на биосинтез пектат-транс-элиминазы //Новое в биотехнологии. -М.: ВНИИСЭНТИ, 1988. С. 83-87.

64. Супрунов Д. Обогащение комбикормов ферментным комплексом для цыплят-бройлеров // Комбикорма. 2000. — № 1. — С. 47-48.

65. Ташпулатов Ж., Джалалова X., Абдуллаев Т., Мирзарахимова М. Цел-люлаза Trichoderma lignorum 19 // Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981.-С. 114-125.

66. Тиунова Н.А., Кобзева Н.Я., Сороваева А.В. Ферментные системы Geotrichum candidum Зс и Pénicillium citreo-viride 26, гидролизующие полисахариды клеточных стенок // Прикл. биохим. и микробиол. 1991. -Т. 27,№3.-С. 338-345.

67. Удалова Э., Околева Т. МЭК для птицы // Комбикормовая промышленность.- 1995.-№ 6.-С. 18-20.

68. Фалунина З.П.Исследование и разработка способа предварительной очистки ферментного раствора глюкоамилазы перед ультрафильтрацией: Автореф. дисс. .канд. техн. наук. -М., 1979.-24 с.

69. Федоренко Б.Н. Ферменты и мембраны: научные основы взаимодействия. Монография. М.: МГУПП, 2002. - 195 с.

70. Фролова Н.Ф., Каган С.Ф., Орещенко Л.И. Применение ультрафильтрационного метода для концентрирования глюкоамилазы // Второе Всесоюзное совещание по ферментам микроорганизмов: Тезисы докладов. — М., 1978.-С. 78.

71. Чегодаев Ф.Н. Разработка промышленной технологии целлобранина при глубинном культивировании Trichoderma longibranchiatum: Автореф. дисс. канд. техн. наук. М., 1987. — 25 с.

72. Черемнова Е.А. Изучение биосинтеза ксиланазы плесневым грибом Aspergillus awamori: Автореф. дисс. канд. техн. наук. -М., 1979.-24 с.

73. Черно Н.К., Дудкин М.С., Белкина Н.Е. Арабиноксилан листьев березы: Химия, биохимия и использование гемицеллюлоз // Тез. докл. 3 Всесоюзной конференции. Рига: Зинатне, 1985. — С. 21-22.

74. Шишкова Э.А., Фокина С.С. Использование мембран для предочистки ферментных растворов // Современное направление развития биотехнологии: Тез. докл. М., 1991.-С. 125.

75. Шлеленко JI.A., Поландова З.В., Дремучева Г.Ф. Влияние мультиэнзим-ных композиций на свойство теста и качества пшеничного хлеба // Хлебопечение России. 2001. - № 1. - С. 22-24.

76. Шубаков А.А., Михалева Н.И., Боев А.В., Окунев О.Н. Образование ксиланазы дрожжами Ciyptococcus podzolicus // Прикл. биохим. и микробиол. 1994. - Т. 30, вып. 6. - С. 812-820.

77. Шубаков А.А., Окунев О.Н., Голубев В.И., Михалева Н.И. Распространение ксиланазной активности среди базидиомицетных дрожжевых грибов // Микробиология. 1994. - Т. 63, № 2. - С. 217-220.

78. Шубаков Е.А., Елькина У.Ф., Федоров Э.И. Биоотбеливание лиственной сульфатной целлюлозы ферментными препаратами целловиридин ГЗХ и пектофоетидин ГЗХ // Биотехнология. 2000. - № 1. - С. 52-57.

79. Элисашвили В.И. Биосинтез и свойства целлюлаз и ксиланаз высших ба-зидиомицетов // Прикл. биохим. и микробиол. 1993. - Т. 29, вып. 3. -С. 340-452.

80. Anthony Т., Raj К.С., Rajendran A., Gunasekan P. High molecular weight cellulase-free xylanase from alkali-tolerant Aspergillus fumigatus // Enzyme Microbial Technology. 2003. - V 32. - P. 647-654.

81. Ashita D., Sunil K. Production of a thermostable alkali-tolerant xylanase from Bacillus circulans AD 16 grown on wheat straw // Wold J. Microb. Biotech-nol. — 2000. -V. 16, N 14.— P. 325-327.

82. Bailey B.A., Avni A., Anderson J.D. The influence of ethylene and tissue age on the sensitive of xanthi tobacco leaves to a Trichoderma viride xylanases // Plant Cell Physiol. 1995. -V. 36. - P. 1659-1676.

83. Bailey M.J., Nevalainen K.N.N. Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing cellulose // Enzyme. Microb. Technol. 1981. - V. 3. - P. 153-157.

84. Bailey M.J., Buchert J., Viikari L. Effect of pH on production of xylanase by Trichoderma reesei on xylan- and cellulose-based media // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - V. 40. - P. 224-229.

85. Bakir U., Yavascaoghlu S., Guvens F., Ersyin A. An endo-P-l,4-xylanase from Rhizopus oiyzae: production, partial purification and biochemical characterization // Enzyme Microbial Technology. 2001. - V. 29. - P. 328-334.

86. Beck M.J. Effect of intermittent feeding of cellulose hydrolyzate to hemicellu-lose hydrolyzate on etanol yeld by Pachysolen tannophilus // Biotechnol. Lett. 1986. - V. 8, N 7. - P. 513-516.

87. Beldman G., Vogaren A.G.J., Rombouts F.M., Searle-van Leeuwen M.F., Pilnik W. Specific and nonspecific glucanases from Trinhoderma viride // Biotechnol. Bioeng. 1988. -V. 31. -P. 160-167.

88. Berenger J.-F., Frixon C., Bigliardi J., Creuzet N. Production, purification and properties of thermostable xylanase from Clostridium stercorarium // Can. J. Microbiol. 1985. -V. 31, N 7. - P. 635-643.

89. Berens S., Kaaspari H., Klemme J. Purification and characterization of two different xylanases from the thermophilic aktinomycete Microtetraspora flexuosa SIIX // Antonie van Leeuwenhoek 69. 1996. - P. 235-341.

90. Biely P., Kratky Z., Vrsanska M., Urmanicova D. Induction and inducers of endo-l,4-P-xylanase in the yeast Ciyptococcus albidus // Eur. J. Biochem. — 1980.-V. 108.-P. 323-329.

91. Biely P., Petrakova E. Novel inducer of the xylan-degrading enzyme system of Ciyptococcus albidus // J. Bacterid. 1984. - V. 160. - P. 408-412.

92. Biely P. Microbial xylanolytic systems // Trends Biotechnol. 1985. - V. 3, N11.-P. 286-290.

93. Biely P., MacKenzie C.R., Puis J., Schneider H. Cooperatively of esterases and xylanases in the enzymatic degradation of acetyl xylan // Biotechnol. -1986.-V. 4.-P. 731-733.

94. Biely P. Biotechnological potential and production of xylanolytic systems free ofcellulases//ACS Symp., 1991. Ser. 460. - P. 408-416.

95. Biely P. Biochemical aspect of production of microbial hemicellulases // Hemicellulose and Hemicellulases / Eds. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. -Portland Press. Cambridge, 1993. P. 29-51.

96. Biely, P., Vrsanska, M., Claeyssens, M. The endo-l,4-p~glucanase 1 from Trichoderma reesei. Action on (3-1,4-oligomers and polymers derived from D-glucose and D-xylose // Eur. J. Biochem. 1991. - V. 2000. - P. 157-163.

97. Biswas S.R., Jana S.C., Mishra A.K., Nanda G. Production, purification and characterization of xylanase from a hyper xylanolitic mutant of Aspergillus ochraceus // Biotechnol. Bioeng. 1990. - V. 35. - P. 244.

98. Bragger J.M., Daniel R.M., Coolbear T., Morgan H.W. Very stable enzymes from extremely thermophilic archaebacteriua and cubacteriua // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. - V. 31. - P. 556-561.

99. Brown A.J., Ogawa K., Wood T.M. Studies on the preparation and regeneration of protoplasts from the cellulolytic fungus Penicillium pinophilum // Enzyme Microb. Technol. 1986. - V. 9. - P. 527-532.

100. Camacho N.A., Aguilar G.A. Production, purification and characterization of a low-molecular-mass xylanase from Aspergillus sp. and its application in baking//Appl. Biochem. Biotechnol.-2003.-V. 104.-P. 159-171.

101. Chanel D.S. Bioconversion of hemicelluloses into useful products in an integrated process for food/feed and fuel (etanol) production from biomass // Biotechnol. Bioeng. Symp. 1984. - N. 14. - P. 425-433.

102. Chapman K.D., Conyers-Jackson A., Morean R.A., Tripathy S. Increased N-acylphosphati-aylethanolamine biosynthesis in elicitor-treated tobacco cells // Physiol. Plantarum. 1995. - V. 95, N 1. - P. 120-126.

103. Chaudhari B.K., Tauto P. Selective induction of fi-glucosidase in Trichoderma reesei by xylan // Eur. J. Microbiol. Biotechnol. 1982. - V. 15. - P. 185-187.

104. Chaudhari B.K. Comparison of growth and maintenance parameters for cellu-lase biosynthesis by Trichoderma reesei C5 with some published data effects of lactose feed concentration // Enzyme. Microb. Technol. 1994. -V. 16,N 12. -P.1079-1083.

105. Cho H.K., Jung H.K., Pack Y.M. Xylanase encoded by genetically engineered Clostridium thermocellum gene in Bacillus subtilis. // Biotechnol. 1995. -V. 17.-P. 157-160.

106. Copa-Patino J.L., Kim Y.G., Broda P. Production and initial characterization of the xylan-degrading system of Phanerochaete chrysospotium // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - V. 40. - P. 69-76.

107. Coronel L., Mesina O.G., Jonson L.M., Sobrejuanite E.E. Cellulase and xylanase production of Aspergillus fumigatus, a thermophilic fungus // Philipp. J. Sci. 1991. -V. 120, N 3. - P. 283-303.

108. Cosson T. Study on the production of a xylanolytic complex from Pénicillium canescens 10-10C // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. - V. 67, N 1-2. -P. 45-58.

109. Coughlan M.P., Harlewood G.P. 1,4-P-D-xylan-degrading enzyme systems: biochemistry, molecular biology and application // Appl. Biochem. 1993. -V. 17.-P. 259-289.

110. Curotto E., Concha M., Milagres A., Duran N. Production of extracellular xy-lanases by Pénicillium jantinellum: effect of selected growth condition // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. - V. 48, N 2. - P. 107-116.

111. Curotto E., Nasal A., Aguirre C., Campos V., Duran N. Enzymatic pretreat-ment of kraft pulps from pinus radiate D don with xylanolytic complex of pénicillium canescens (CP 1) fungi // Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. -V. 73.-P. 29-42.

112. Czakaj J., Sawicka-Zukowska R., Jedry Chowska B. Optizymawa nie ksy-lanazy z Chaetomium globosum. Pr. Inst, i lab. bak. przem. spoz., 2000. -V. 55.-P. 41-59.

113. Dahlberg L., Hoist O., Kristjansson J.K. Thermostable xylanolytic enzymes from Rhodothermus marinus grown on xylan // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. -V. 40.-P. 63-68.

114. Dean J.F., Anderson J.D. Ethylene biosynthesis-inducing xylanase // Plant Physiol. 1991. -V. 95. -P. 316-323.

115. Defaye J., Driguez H., John M., Schmidt J., Ohleyer E. Induction of D-xylan-degrading enzymes in Trichoderma lignorum by non metabolizable inducer. A synthesis of 4-thioxylobiose // Carbohydr. Res. 1985. - V. 139. - P. 123-132.

116. Defaye J., Guillot J.M., Biely P., Vrsanska M. Positional isomers of thioxylo-biose, their synthesis and inducing ability for D-xylan-degrading enzymes in the yeast Cryptococcus albidus // Carbohydrate Research. 1992. - V. 228. -P. 47-64.

117. Dekker R.F.H., Richard G.N. Purification, properties and mode of action of hemicellulase-producer by Ceratocystis paradoxa // Carbohydr. Res. 1971. -V. 39.-P. 97-114.

118. Dekker R.F.H. Bioconversion of hemicellulose: Aspect of hemicellulase production by Trichodeerma reesei QM 9414 and ensymatic saccharification of hemicellulose // Biotechnol. Bioeng. 1983. - V. 25, N 4. - P. 1127-1146.

119. Detroy RW., Cunningham R.L., Bothast et al. Bioconversion of wheat straw cellulose/hemicellulose to etanol by Saccharomyces unarum and Pachysolen tannophilus // Biotechnol. Bioeng. 1982. - V. 25, N 5. - P. 1105-1113.

120. Deschamps F., Huet M.C. Xylanase production in solid-state fermentation: a study of its properties // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. - V. 22. -P. 177-180.

121. Deschatelets L., Yu E.K.S. A simple pentose for biomass conversion studies // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986.-V. 28, N 12.-P. 1832-1837.

122. Domingues F.C., Queiroz J. A., Cabrai J.M.S., Fonseca L.P. The influents of culture conditions on mycelial structure and cellulose production by Trichoderma reesei Rut C-30 // Enzyme Microb. Technol. 2000. - V. 26. - P. 394-401.

123. Eriksson K.E., Goodell E.W. Pleiotropic mutants of woorotting fungus Poly-porus adustus lacking cellulase, mannanase and xylanase // Can. J. Microbiol. 1974. - V. 20, N 3. - P. 371-378

124. Fernandez-Espinar M., Pinaga F., de Graaff L., Visser J., Ramon D., Valles S. Purification, characterization and regulation of the synthesis of an Aspergillus nidudans acidic xylanase // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V. 42. -P. 555-562.

125. Ferraris L., Cardinale F., Matta A. In vitro production of cell wall degradading enzymes by Phytohthora capsiciteon // Phytothol mediterr. — 1996. V. 35, N3.-P. 199-206.

126. Ferreira-Costa M., Dias A., Maximo C., Morgado M.J., Martins-Sena G., Duarte C J. Xylanolitic enzyme production by an Aspergillus niger isolate // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. - V. 44. - P. 231-242.

127. Filho E.X.F., Puls J., Coughlan M.P. Biochemical characteristics of two endo-ß-l,4-xylanases produced by Pénicillium capsulatum // J. Industrial Microbiology.-1993.-V. 11.-P. 171-180.

128. Fond O., Engasser J.-M., Matta-El-Amouri G. et al. The acetone butanol fermentation on glucose and xylose. 11. Regulation and kinetic in fed-batch culture // Biotechnol. Bioeng. 1986. - V. 28, N 2. - P. 167-175.

129. Fournier R., Frederick M.M., Frederick I.R., Reily P.I. Purification and characterization of endo-xylanases from Aspergilus niger. III. An enzyme of pi 3,65 // Biotechnol. Bioeng. 1985. - V. 27, N 4. - P. 539-546.

130. Fudjimoto H., Ooi T., Wang S.-L., Takasawa T., Hidaka H., Murao S., Arai M. Purification and properties of three xylanases from Aspergillus aculeatus // Bioshi. Biotech. Biochim. 1995. - V. 59, N 3. - P. 538-540.

131. Gandhi J.P., Rao K.K., Dave P.J. Characterization of exracellular thermostable xylanase from Chaetomium globusum // Chem. Technol. Biotechnol. -1994.-V. 60, N1.-P. 55-60.

132. Gao P.J., Gu Y.B., Wang D., Zhang X. Production, characterization and application of cellulase-free xylanase from Aspergillus niger // Appl. Biochem. Biotechnol. 1996.-V. 57-58.-P. 375-381.

133. Gasper A., Cosson T. Study on production of a xylanolitic complex from Pénicillium canescens 10-10c // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. - V. 67, N 1-2.-P. 45-68.

134. Gawande P.V., Kamat M.Y. Production of xylanase by immobilized Aspergillus sp. using lignocellulosic waste // World. J. Microbiol. Biotechnol. -2000. V. 16,N1.-P. 111-112.

135. Ghareib M., Nour Ec., Dein Mahmoud M. Purification and general properties of xylanase from Aspergillus terreus // Microbiol. 1992. - V. 147, N 8. -P. 569-576.

136. Ghose T.K., Montenecourt B.S., Eveleigh D.E. Measure of cellulose activity (substrates, assays, activities and recommendations). P reprint of IUPAC Commission on biotechnology, 1981.

137. Ghosh V.K., Deb J.K. Production and characterization of xylanase from Thie-laviopsis basicola // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. - V. 29, P. 44-47.

138. Godden B., Legon T., Helvenstein P. M. Regulation of the production of hemicellulolitic enzymes by Streptomyces sp. growing on lignocellulose // J. General Microbiol. 1989. - V. 135. - P. 285-292.

139. Graham H., Balnave D. Dietary enzymes for increasing energy availability // Biotechnology in animal feeds and animal feeding / Eds. Wallace R.J., Ches-son A. Wenheim, Germany: VHC, 1995. - P.296-309.

140. Grassin C., Fauquembergue P. Fruit juices: Industrial enzymology /Eds. Godfrey T., West S Macmillan Press, 1996. - P. 226-234.

141. Gruninger H., Fiechter A. A njvel, highly thermostable D-xylanase // Enzyme. Microb. Technol. 1986. - V. 8. - P. 309-314.

142. Haltrich D., Laussamayer B., Steinar W. Xylanase formation by Sclerotium rolfsii: effect of growth substrates and development of a culture medium using statistically designed experiments // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. -V. 42.-P. 522-530.

143. Haltrich D., Steiner W. Formation of xylanase by Shizophyllum commune: Effect of medium components // Enzyme Microb. Technol. 1994. - V. 16. -P. 229-235.

144. Harbord R., Simpson C., Wegstein J. Winery scale evaluation of maceration enzymes in grape processing // Wine Industry J. 1990. - N5.-P. 134-137.

145. Haros M., Rosell C.M., Benedito C. Improvement of flour quality through carbohydrates treatment during wheat tempering // J. Agric. Food. Chem. -2002. V. 50. - P. 4126-4130.

146. Hazlewood G.P., Gilbert H.J. Molecular biology of hemicellylases // Hemi-cellulose and hemicellulases / Eds. Coughlan M.P., Hazlewood G.P., 1993. -P. 103-106.

147. Heldt-Hansen H.P. Development of enzymes for food applications // Biotechnology in the food chain-new tools and applications for future foods: VTT symp. / Ed. Poutanen K. Helsenki, Finland, 1997. - N 177 - P. 45-55.

148. Hoffman R.M., Wood T.M. Isolation and characterization of a mutant of Penicillium funiculosum for the saccharification of straw // Biotechnol. Bioeng. 1985.-V. 27, N 1.-P. 81-85.

149. Hog M.M., Deckwer W.-D. Cellulase-free xylanase by thermophilic fungi: A comparison of xylanase production by two Thermomyces lanuginosus strans // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - N 4. - P. 604-609.

150. Honda H., Kudo T., Horikoshi K. Selective excretion of alkalin xylanase by Escherichia coli carry in PCX311 // Agric. Bios. Chem. 1985. - V. 49, N10.-P. 3011-3015.

151. Hrmova M., Biely P., Vrsanska M., Petrakova E. Induction of cellulose and xylan-degrading enzymes in the yeast Trichosporon cutaneum // Arch. Microbiol. 1984. - V. 138. - P. 371-376.

152. Hrmova M., Biely P., Vrsanska M. Specifity of cellulase and xylanase induction in Trichoderma reesei QM 9419 // Arch. Microbiol. 1986. - V. 144. -P. 307-311.

153. Hrmova M., Beily P., Vrsanska M. Cellulose and xylan degrading enzymes of Aspergillus terreus // Enzyme Microbiol. Technol. 1989. - V. 11. - P. 610-616.

154. Hrmova M., Petrakova E., Biely P. Induction of cellulose and xylan-degrading enzymes systems in Aspergillus terreus by homo and hetero-disaccharides composed of glucose and xylose // J. Gen. Microbiol. — 1991. — V. 137.-P. 541-547.

155. Iefuji H., Chino M., Kato M., Iimura Y. Acid xylanase from yeast Cryptococ-cus sp. S-2: purification, characterization, cloning and sequencing // Biosci. Biotech. Biochem. 1996. - V. 80, N 8. - P. 1331-1338.

156. John M., Schmidt J. Xylanase and p-xylosidase of Trichoderma lignorum // Meth. Enzymol. 1988. - V. 160. - P. 662-670.

157. Jorgensen H., Ericsson T., Boijesson J., Tjerneld F., Olsson L. Purification and characterization of five cellulases and one xylanase from Penicillium bra-sidianum IBT 20888 // Enzyme Microbial Technology. 2003. - V. 32. -P. 851-861.

158. Kanauchi M., Bamfort C.W. Growth of Trichoderma viride on crude cell wall preparations from barley // Agric. Food. Chem. 2001. - V. 49, N 2. — P. 883-887.

159. Kang S.-W. K., Kim S.-W., Lee J.-S. Production of cellulase and xylanase in bubble column using immobilized Aspergillus niger KKS // Appl. Biochem. Biotechnol.-1995.-V.53, N2.-P. 101-106.

160. Kanson A.L., M-Ali A., A-El-Gammal A. Xylanolytic activities of Streptomyces sp. 1 taxonomy, production, partial purification and utilization of agricultural wastes // Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. - 2001. -V. 48.-P. 39-52.

161. Kantelinen A., Hortlihg B., Sundquist J., Linko M., Viikari L. Proposed mechanism of the enzymatic bleaching of kraft pulp with xylanases // Hol-zforshung. 1993. - V. 47. - P. 318-324.

162. Khasin A., Alchanti I., Shoham Y. Purification and characterization of a thermostable xylanase from Bacillus stearothermophilus T-6 // Appl. Environ. Microbiol. 1993. -V. 59. - P. 1725-1730.

163. Kluepfel D., Ishaque M. Xylan-induced cellulolytic enzymes in Streptomyces flavogriseus // Ind. Microbiol. 1982. - V. 23. - P. 389-396.

164. Kluepfel D., Vets-Menta S., Aujvont F., Sharek F., Morosoly R. Purification and characterization of a new xylanase (xylanase B) // Biochem. J. 1990. -V. 267.-P. 45-50.

165. Kolarova N., Farkas V. Laminarinase, xylanase and amylases in crude cellulolytic enzyme complex from Trichoderma reesei // Biologia, Bratislava. -1983. V. 38, N 8. - P. 711-725.

166. Krishnamurthy S., Vithayathil P.J. Purification and characterization of endo-l,4-(3-xylanase from Paecilomyces varioti banier // J. Ferment. Bioeng. — 1989.-V. 67.-P. 77-82.

167. Lappalainen A. Purification and characterization of xylanolytic enzymes from Trichoderma reesei // Biotechnol. Appl. Biochem. 1986 - V. 8, N 5. -P. 437-448.

168. Leather T.D., Kurtzman C.P., Detroy R.W. Overproduction and regulation of xylanase in Aureobasidium albidus // Biotechnol. Bioeng. 1984. - V. 14. -P. 225-250.

169. Leather T.D., Detroy R.W., Bothast R.J. Induction and glucose repression of xylanase from a color variant strain of Aureobasidium pullulans // Biotechnol. Lett. 1986.-N 12.-P. 867-872.

170. Lemmel A.S., Dalta R., Frankiewicz R.J. Fermentation of xylan by Cljstridium acenobutylicum // Enzyme Microb. Technol. 1986. - V. 8. - P. 217-222.

171. Lemos J. L., Solorzano B. E. P.S., Ebole S.M.F., Pereira J. N. Thermal stability of xylanases produced by Aspergillus awamori // Praz. J .Microbiol. -2000. V. 31, N 3. - P. 206-211.

172. Lewis G.E., Sanchez W.K., Treacher R., Pritchard G.T. Effect of direct-fed fibrolytic enzymes on the digestive characteristics of a forage-based diet fed to beef steers // J. Animal Sci. 1996. - V. 74. - P. 3020-3028.

173. Liner V., Mayrohoferova A. The kinetic of oxidation of aqueous sodium sulphite solution // Chem. Eng. Sie. 1970. - V. 15, N 6. - P. 787-801.

174. Lowri O.N., Rohenolrought N.J., Farr A.L., Randakk R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // Agr. Biol. Chem. 1970. - V. 44, N 9. -P. 393-399.

175. Magnuson T.S. Purification and characterization of alkalin xylanase from Streptomyces viridesporus // Abstr. Gen. Meet. Am. Microbiol. 1996. -V. 96.-P. 566.

176. Mandels M., Andreotti R., Roche C. Measurement of saccharifying cellulose // Biotechnol. Bioeng. Symp. 1976. - N 5. - P. 81-106.

177. McCarthy A.J. Lignocellulase-degrading of cellulose // FEMS Microbiol Rev. 1987.— V. 46.-P. 145.

178. McCleary B.V. Ensymatic modification of plant polysaccharides // Int. J. Macromol. 1986. - V. 8. - P. 349-354.

179. Mendicuti C., Laura P., Trejo-Aguilar B.A., Aguilar O.G. Thermostable xylanase produced at 37 °C and 45 °C by a thermotolerant Aspergillus strain// FEMS Microbiol. Lett. 1997. - V. 146. - P. 97-102.

180. Merchant R., Merchant F., Margaritis. Production of xylanase by thermophilic fungus Thielavia terrestris // Biotechnol. Lett. 1988. - V. 10, N 7. - P. 513-516.

181. Milagres A.M., Prade R.A. Production of xylanase from Penicillium janthi-nellum and its use in the recovery of cellulosic-textile fibers // Enzyme Microbial Technology. 1994. - V. 16. - P. 627-632.

182. Morales P., Madarto A., Flors A., Sendrra J.M., Peres-Gonzales J.A. Purification and characterization of a xylanase and arabinofuranosidase from Bacillus polymixa // Enzyme Microdial Technol. 1995. - V. 17. - P. 424-429.

183. Morosoli R.J., Bertrand J.L., Mondou F., Shareck F., Klupfel D. Purification and properties of a xylanase from Streptococcus lividans // J. Biochem. -1986.-V. 239.-P. 587-592.

184. Nakamura S., Nakai R., Wakabayashi K., Ishiguro Y., Aono R., Horikohi K. Thermophilic alkalin xylanase from newly isolated alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp.TAR-1 // Bioshi. Biotech. Biochem. 1994. - V. 58. - P. 78-81.

185. Nakanishi K., Yasui T. Production of xylanase by Streptomyces sp. using non-metabolizable inducer//Agric. Biol. Chem. 1980. -V. 44. - P. 2729-2730.

186. Nath D., Rao M. Increase in stability of xylanase from an alkalophilic Bacillus (NCIM 59) // Biotechnology. 1995. - V. 17, N 5. - P. 557-560.

187. Nevalainen K.H.H., Palva E.T. Production of extracellular enzymes in mutant isolated from unable to hydrolyze cellulose // Appl. Environ. Microbiol. -1978.-V. 35.-P. 11-16.

188. Ohkoshi A., Kudo T., Mase T., Horikoshi K. Purification of three types of xylanases from an alkalophilic Aeromonas sp. // Agric. Biol. Chem. 1985. -V. 49.-P. 3037-3038.

189. Okazaki W., Akiba T., Horikoshi K., Akahoshi R. Production and properties of two types of xylanases from alkalophilic, thermophilic Bacillus sp. // Appl. Microb. Technol.- 1984.-V. 19.-P. 335-340.

190. Oksanen T., Pere J., Paavilainen L., Buchert J., Viikari L. Treatment of recycled kraft pulps with the Trichoderma reesei hemicellulases and cellulases // Biotechnol. 2000. - V. 78, N 1. - P. 39-48.

191. Okunev O.N., Lappalainen A., Niku-Paovola M.L., Nummi M. Xylanase and cellobiohydrolase from Aspergillus terreus // VII Symp. 1985. - N 60. -P. 171-180.

192. Paice M.G., Bernier RJr., Jurasek L. Vickosity-enhancing bleaching of hardwood krafi pulp with xylanase from a cloned gene // Biotechnol. Bioeng. -1988.-V. 32.-P. 235-239.

193. Palma M.B. Influence of aeration and agitation rate on the xylanase activity from Pen. janthinellum endo-l,4-beta-D-xylanase production in sugarcane bagassa culture medium // Process Biochem. - 1996. -V. 31, N 2. - P. 141-146.

194. Paul J., Varma A.K. Influence of sugars on endoglucanase and (3-xylanase activities of a Bacillus strain // Biotechnol. Lett. 1990. - V. 12. - P. 61-64.

195. Pekka M., Raudaskoski M., Viikari L. Hemicellulolytic enzymes in P- and S-strains of Heterobasidion annosum // Microbiology. 1995. - V. 141. -P. 743-750.

196. Peter-Avalos O.P., Neresa P., Ignasio M., Mayra D. Induction of xylanase and P-xylosidase in Cellulomonas flavigena growing on different carbon sours // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - V. 46. - P. 405-409.

197. Pham P.J. Optimization of a culture medium to xylanase production by Bacillus sp. using statistical experimental designs. Nat. Polytech. Inst. Toulouse // Wold J. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 14. - P. 2185-2190.

198. Pham P.L., Taillander P., Delmans M., Strehaiano P. Production of xylanase by Bacillus polymyxa using lignocellulosic wastes // Industrial Crops and Products. 1998. - V. 7. - P. 195-203.

199. Poutanen K., Puis J. Characteristics of Trichoderma reesei P-xylosidase and its use in the hydrolisis of solubilized xylans // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1988.-V. 28. P.425-432.

200. Poutanen K., Puis J. The xylanolytic enzyme system of Trichoderma reesei: Plan cell wall polymers // Biogenes and biodegradation of plan cell wall polymers / Eds. Lewis G., Paice M. American Chemical Society. Washington. D. C., 1989. - P. 630-640.

201. Poutanen K. Enzymes: an important tool in improvement of the quality of cereal foods // Trends food Sci. Technol. 1997. - V. 8. - P. 300-306.

202. Prabhu K.A., Manshwari R. Biochemical properties of xylanases from a thermophilic fungus, Melanocarpus albomyces, and their action on plant cell walls // J. Biosci. 1999. - V. 24, N 4. - P. 461-470.

203. Prade R.A. Xylanases: from biology to biotechnology // Biotechnology and Genetic Engineering Revios.-1995.-V. 13.-P. 101-131.

204. Prasad D.Y., Heitman J.A., Joyce T.W. Enzyme de-inking of black and white letterpress printed newsprint waste // Progress in Paper Recycling. 1992. -V. 1.-P. 21-30.

205. Purkarthofer H., Steiner W. Induction of endo-xylanase in the fungus Thermomyces lanuginosus // Enzyme Microbial Technology. 1995. - V. 17. -P. 114-118.

206. Rahman A.K.M.S., Sugitani N., Hatsu M., Takamizawa K. A role of xy-lanase, a-L-arabinofuranosidase, and xylosidase in xylan degradation // Can. J. Microbiol. 2003. - V. 49. - P. 58-64.

207. Raijaram S., Varma A. Production and characterization of xylanase from Bacillus thermoalkalophilus grown on agricultural wastes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. -V. 34 - P. 141-144.

208. Ramakrishnan V.M., Strohfiis B.R.-H., West T. P. Characterization of a xylanase from Aureobasidium pullulans // Microbios. 1996. - V. 85, N 344. -P. 179-187.

209. Rani D.S., Nand K. Production of thermostable cellulase-free xylanase by Clostridium absonum CFR-702 // Process. Biochem. 2000. - V. 36. -P. 355-362.

210. Rao M., Gaikwad S., Mishra C., Deshpande V. Induction and catabolite repression of cellulase in Pénicillium funiculosum // Appl. Biochem. Biotech-nol. 1988. -V. 19.-P. 129-137.

211. Ratto M., Pautanen K., Viikari L. Production of xylanolitic enzymes by an alkalitolerant Bacillus circulans stran // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. -V. 37.-P. 470.

212. Ravijot K., Dhillon G.S, Singa A., Kalsa M.S. Xylanase and celllulase production by mutant N10 of Trichoderma reesei QM 9414 // J. Res. Punjab Agr. Univ. 1996. - V. 32, N 2. - P. 170-177.

213. Reily P.J. Xylanases structure and function // Basic Life Sci. 1981. - V. 18. -P. 111-129.

214. Rishnan M.V.R, Strohfus B.R.-H., West H.P. Characterization of a xylanase from Aureobasidium pullulans // Microbios. 1996. - V. 85, N 344. - P. 159187.

215. Ristroph D.L., Humphey A.E. Kinetic characterization of the extracellular xylanases of Termomonospora sp. // Biotechnol. Bioeng. 1985. - V. 27, N 6. -P. 832-836.

216. Robinson P.D. Cellulase and xylanase production by Trichoderma reesei Rut C-3 // Biotechnol. Lett. 1984. - V. 6, N 2. - P. 119-122.

217. Rodrigues E.M., Milagres A.M.F., Pessoa J.A. Selective recovery of xylanase from Renicillium janthinellum using BDBAC recovered micelles // Acta Biotechnol.-1999.-V. 19, N2.-P. 157-161.

218. Roychowdary S., Cox D.C., Lewandowsky M. Production of combustible gas from enzyme-treated cellulosic and hemicellulosic waste // Amer. Chem. Soc. Polym. Prepr. 1983. - V. 24, N 2. - P. 438.

219. Royer J., Nakas J. Production of xylanase by Trichoderma longibrachiatum // Enzyme Microbiol. Technol. 1989. - V. 11, N 7. - P. 405-410.

220. Royer J., Nakas J. Purification and characterization of two xylanases from Trichoderma longibranchiatum // Eur. J. Biochem. -1991. V. 202, N 2. -P. 521-529.

221. Rulkarni N., Shendye A., Rao M. Molecular and biotechnology aspects of xylanases // FEMS Microbiol. Rev. 1999. - V. 23. - P. 411-456.

222. Saake B., Clark T., Puis J. Investigations on the reaction mechanism of xylanases and mannanases on sprucewood chemical pulps // Hozforschung. -1995.-V. 49.-P. 60-68.

223. Sadder J.N., Mes-Hartree M. The enzymatic hydrolysis and fermentations of pretreated wood substrates // Biotechnol. Adv. 1984. - V. 2. - P. 161-181.

224. Saddler J.N. Biotechnology for the conversion of lignocellulosc // Biomass and Bioenergy. 1992. - V. 2. - P. 229-238.

225. Sakaswat V., Bisaria V.S. Purification, characterization and substrate specificities of xylanase isoensymese from Melanocarpus albomyces // Biosci Biotechnol. Biochem. -2000. -V. 64, N 6. P. 1147-1180.

226. Sandhu D.K., Karla M.K. Production of cellulase, xylanase and pectinase by Trichoderma longibranhiatum on different substrates // Trans .Br. Mycol. Soc. 1982. - V. 79, N 3. - P. 409-413.

227. Sa-Pereira P., Mesquita A., Duarte J.C., Barros M.R.A., Costa-Ferreira M. Rapid production of thermostable cellulase-free xylanase by a strain of Bacillus subtillis and its properties // Enzyme Microbial Technology. 2002. -V.30-P. 924-933.

228. Sharma A., Gurta M.N. Macroaffinity ligand-facilitated three-phase partitioning (MLFTPP) for purification of xylanase // Biotech. Bioeng. 2002 -V. 80, N2.- P. 228-232.

229. Senior D.J., Mayers P.R., Saddler J.N. Xylanase production by Trichoderma harzianum E 58 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. - V. 32. - P. 137-142.

230. Shei J.C., Fratzke A.K., Frederick M.M., Frederick J.R., Reilly P.J. Purification and characterization of endoxylanases from Asp. niger. II An enzyme of pi 4,5 // Biotechnol. Bioeng. 1985. - V. 27, N 4. - P. 533-538.

231. Siedenberg D. Production of xylanase by Asp.awamory on complex medium in stirred tank and airlift tower loop reactor endo- 1,4-ß-Dxylanase production in a fermentator// J. Biotechnol. - 1997. - V. 56, N 3. - P. 205-216.

232. Simao C.R, Souza M.G.C., Peralta M.R. Induction of xylanase in Aspergillus fumarii by methyl-ß-D-xyloside // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. -V. 47.-P. 267-271.

233. Simpson H.D. Haufler U.D., Daniel R.M. An extremely thermostable xylanase from the thermophilic eubacterium Thermotoga // Biochem. J. — 1991. -V. 277.-P. 413-417.

234. Singht A., Kuhad R.C., Manish K. Xylanase production by a hyperxylanolytic mutant of Fusarium oxysorum // Enzyme Microb. Technol. — 1995. — V. 17, N6.-P. 252-253.

235. Soundar S., Chandra T.S. Production of cellulase and detection of avicel-adsorbing carboxymethylcellulase from a mesophilic fungus Humicola grisea Fb. // Enzyme Microb. Technol. 1988. - V. 10. - P. 368-273.

236. Srivastava R, Srivastava A.K. Characterization of a bacterial xylanase resistant to repression by glucose and xylose // Biotechnol. Lett. 1993. -V. 15.-P. 847-852.

237. Sternberg D., Mandels G.R. Induction of cellulolytic enzymes in Trichoderma reesei by soforose // Journal of Bacteriology. 1979. - V. 139. - P. 761-769.

238. Stewart J.C., Lester A., Milburn B., Parry J.B. Xylanase and cellulase production by Aspergillus fumigatus fresenius // Biotechnol. Lettes. 1983. - V.5, N8.-P. 543-548.

239. Suurnakki A., Tenkanen M., Buchert J., Viikari L. Hemicellulases in the bleaching of chemical pulps // Adv. Biochem Eng./ Biotechnol. 1997. -V. 57.-P. 261-287.

240. Taguchi F., Hasegawa K., Saito-Taki T., Hara K. Simultaneous production ofxylanase and hydrogen using xylan in batch culture of Clostridium sp. Strain X 53 // J. Ferment. Bioeng. 1996. - V. 81. - P. 178-180.

241. Tan L.U.L., Wong K.K.Y., Yu E.K.S., Saddler J.N. Purification and characterization of two D-xylanases from Trichoderma harzianum // Enzyme Microb. Technol. 1985. - V. 7. - P. 425-430.

242. Tangnu S.K., Blanch H.W., Charles R. Enhanced production of cellulase, hemicellulase and P-glucosidase by Trichoderma reesei (Run C-30) // Biotechnol. B ioeng. 1981. - V. 23. - P. 1837-1849.

243. Taussky H.H., Shorr E. A microcolorimetric method for the determination of the inorganic phosphorus // J. Biological. Chem. — 1953. — V. 202, N 2. -P. 675-685.

244. Tenkanen M., Puis J., Poutanen K. Two major xylanases of Trichoderma reesei // Enzyme Microb. Technol. 1992. - V. 14. - P. 566-574.

245. Tenkanen M., ViiKari L., Bucher J. Use of acid-tolerant xylanase for bleaching ofkraft pulps//Biotechnol. Techn.- 1997.-V. ll,N2.-P.935-938.

246. Thomson J.A. Molecular biology of xylan degradation // FEMS Microbiol. Rev.- 1993.-V. 104.-P. 65-82.

247. Thukral V., Dey S., Panda T. Multipl pH and temperature optimum of extracellular xylanase from T. reesei QM 9414 // Bioprocess. 1989. - V. 4. — P. 40-47.

248. Timell T.E. Wood hemicelluloses: Part I // Carbohydr. Chem. 1965. -V. 20.-P. 409-483.

249. Tribak M., Ocampo J.A., Garcia-Romera I. Production of xyloglucanolytic enzymes by Trichoderma viride, Paecilomyces farinosus, Wardomyces inflatus and Pleurotus ostreatus // Mycologia. 2002. - V. 94, N 3. - P. 404-410.

250. Tseng M.-J., Yap M.-N., Ratanakhanokchai K., Kyu K.L., Chen S.-T. Purification and characterization of two free xylanases from an alkaliphic Bacillus fir-mus // Enzyme Microbial Nechnology. 2002. - V. 30. - P. 590-595.

251. Uden K.O. Effect of different inorganic sources on the production of cellu-lase-free beta-l,4-xylanase by Aurebasidium pullulans // Pol. J. Food. Nutrit. Sc. 1999. - V. 8, N 3. - P. 39-48.

252. Uhlig H. Industrial enzymes and their applications // New York: John Wiley & Sons, Inc. 1998. - P.435.

253. Ujile M., Roy C., Yaguchi M. Low molecular weight xylanase from Trichoderma viride // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. - P. 1860-1862.

254. Vap der Toorn J.J.T.K., Van Gelswyk N.O. Xylan-degesting bacteria from the rumen of sheep fed maize straw diets // J. Gen. Microbiol. 1985. - V. 131, N10.-P. 2601-2607.

255. Vicina R., Escobar F., Osses M., Jara A. Bleaching of eucaluptus kraft pulp with commercial xylanases // Biotechnol. Lett. 1997. - V. 19. - P. 75-78.

256. Viikari I., Ranua M., Kantelinen A., Sundquist J., Linko M. Bleaching with enzymes // Proc. 3rd Int. Conf. Biotechnology Pulp and Paper Industry. -Sockgolm, 1986. P. 67-69.

257. Viikari L., Tenkanen M., Buchert J., Ratto M., Bailey M., Siika-Aho M., Linko M. Hemicellulases for industrial applications // Byconversion of forest and agricultural wastes / Ed. Saddler J. CAB International. Oxon. UK., 1993.-P. 131-182.

258. Viikari L., Kantelinen A., Buchert J., Puis J. Enzymatic accessibility of xylans in lignocellulosic materials // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V. 41. -P. 124-129.

259. Viikari L., Kantelinen A., Sundquist J., Linko M. Xylanases in bleaching: From an idea to the industry // FEMS Microbiol. Rev. 1994. - V. 13. -P. 335-350.

260. Wang M., Hettiarachchy N.S., Qi M., Burks W., Siebenmorgen T. Preparation and functional properties of rice bran protein isolate // J. Agr. Food. Chem. 1999. - V. 47, N 2. - P. 411-416.

261. Wizani W., Esterbaner H., Steiner W., Gomen G., Cheie L. Exo- und endo-cellulase-free xylanase. Verfahren und deren Verwendung. Пат.40175221, ФРГ, МКИ 5 С12 N 9/24. (Dentschland) GmbH. N 40175227. Заявл. 31.05.90. Опубл. 05.12.91.

262. Wong K.K.J., Tan L.U.L, Saddler J.N., Vaguchi M. Purification of third distinct xylanase from xylanolytic system of Trihoderma harzianum // Canad. J. Microb. 1986. - V. 32, N 7. - P. 570-576.

263. Wong K.K.J., Tan L.U.L, Saddler J.N. Multiplicity of |3—1,4-xylanase in microorganisms: functions and applications // Microbiol. Rewiews. 1988. -V. 52, N3.-P. 05-317.

264. Wong K.K.Y., Saddler J.N. Trichoderma xylanases: their properties and application // Xylans and xylanases / Eds. Visser J., Belman G., Someren M.A.K., Voragen A.G.J. Elser, Amsterdam, 1992. - P. 171-186.

265. Wong K.K.Y., Saddler J.N. Application of hemicellulases in the food, feed and pulp and paper industries // Hemicellulose and hemicellulases / Eds. Coughlen P.P., Hazlewood G.P. Portland Press, London, 1993. - P. 127-143.

266. Wood T.M., Mcrae S.I. The effect of acetyl groups on the hydrolysis of ryegrass cell walls by xylanase and cellulase from Trichoderma koningii // Phy-tochemistry. 1985. -V. 25, N 5. - P. 1053-1055.

267. Woodvard DJ. Xylanases: function, properties, and application // Enzyme ferment Biotechnol. 1984. - V. 8. - P. 9-30.

268. Xu J., Nogava M., Okada H., Morickawa Y. Xylanaze induction by L-corbose in a fungus Trichoderma reesei HC-3-7 // Biosc. Biotechnol. Biochem. -1998. V. 62, N 8. - P. 1555-1559.

269. Yu E.K.S., Deschatelets L., Levitin N., Saddler J.N. Production of 2,3-butanediol from HF-hydrolyzed aspen wood // Biotechnol. Lett. 1984. -V. 6, N9.-P. 611-614.

270. УТВЕРЖДАЮ Генеральный директор Научно-технического опытного1. АКТо наработке экспериментальных партий очищенного препарата ксиланазы (Ксилозим)

271. На опытной установке научно-технического опытного предприятия "Сатурн-Е" с 21.05 по 28.06.2001 г. были проведены работы по получению экспериментальных партий очищенного препарата ксиланазы (Ксилозим).

272. Гидролиз пшеничных отрубей и целлюлозы проводили в ферментере в 10 л водопроводной воды ферментным препаратом Целловиридин ГЗХ из расчета 5 ед/г сырья при температуре 50 °С в течение 1 часа.

273. Приготовление питательной среды и ее стерилизацию осуществляли непосредственно в ферментере. Стерилизацию среды проводили при 120 °С в течение 30 мин. Начальный объем питательной среды в ферментере 50 л.

274. Засев питательной среды проводили вегетативным посевным материалом, выращенным на качалке в течение 36 ч.

275. Процесс культивирования продуцента ксиланазы вели при температуре 32 °С и постоянном перемешивании и аэрировании культуры. '

276. В процессе культивирования осуществляли двукратную подпитку культуры в процессе роста на 24 и 36 ч гидролизованными пшеничными отрубями и целлюлозой в количестве 10 л. Гидролиз и стерилизацию сырья для подпитки осуществляли в колбах объемом 10 л.

277. Контроль за процессом ферментации осуществляли круглосуточно. Два раза в сутки отбирали пробы для проведения микробиологических и биохимических анализов.

278. Отделение биомассы из культуральной жидкости проводили на нутч-фильтре, используя в качестве фильтрующего слоя лавсановую ткань.

279. Для получения стандартного препарата ксиланазы с активность 2000 ед/г базовый препарат стандартизовали сульфатом аммония.

280. Наработано три партии стандартного препарата Ксилозим с активность 2000 ед/г в количествах 3,1, 3,3 и 3,7 кг и активностью 2000 ед/г. Средний выход препарата по трем операциям составил 60,4 %.

281. Технологические показатели процесса получения препарата "Ксилозим" представлены в таблице 1.

282. От Института биотехнологии: От ООО Научно-техническогоопытного предприятия "Сатурн-Е":

283. Завлабораторией ¿Щ^ъ} Э.А.Шишкова

284. Вед.специалист Л.И.Белая Вед.н.сотрудник ¿Т/^у? Н.М.Павлова /• Н.сотр. С.Е.Лазарева Ст.н.сотр. ^¿ёщ— Е.А.Нестеренко1. О / Инженер В.И.Степанов

285. Н.сотрудник ¿уЬ^/л. Л.Н.Ларина

Информация о работе

Ларина, Любовь Николаевна
кандидата технических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Направленный биосинтез ксиланазы микроскопическим грибом Trichoderma viride 44-11-62/3 и разработка технологии получения ферментного препарата - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы