Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика мультиферментных комплексов карбогидраз и исследование их эффективности при осахаривании различных видов целлюлозосодержащих материалов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика мультиферментных комплексов карбогидраз и исследование их эффективности при осахаривании различных видов целлюлозосодержащих материалов"

На правах рукописи

48404,4 (14

ОСИПОВ ДМИТРИИ ОЛЕГОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ КАРБОГИДРАЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ ОСАХАРИВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 9 МАЙ 2011

МОСКВА-2011

4846474

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии ферментов

Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Синицын Аркадий Пантелеймонович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович

доктор биологических наук, профессор Королева Ольга Владимировна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Защита состоится «2» июня 2011 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

Автореферат разослан » 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Актуальность темы исследования. В современном мире истощение запасов ископаемых источников энергии является актуальной проблемой. Кроме этого, существуют серьезные экологические проблемы, связанные с увеличением объема выброса парниковых газов в атмосферу. Биотехнологическая переработка сельскохозяйственных и лесотехнических отходов снизит нагрузку на экосистему Земли, используя возобновляемый и наиболее распространенный на нашей планете растительный биоматериал - лигноцеллюлозную биомассу. Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо - этанол, бутанол, а также другие полезные продукты — органические и аминокислоты, кормовые продукты, адгезивные материалы, биосинтезируемые лекарственные препараты, биоразлагаемые пластики и другие полезные продукты.

Главными компонентами клеточной стенки растений являются природные полисахариды: целлюлоза и гемицеллюлоза. Деградация полисахаридов клеточной стенки происходит под действием комплекса ферментов карбогидраз (целлюлаз и гемицеллюлаз), от сбалансированности состава которого зависит эффективность гидролиза растительной биомассы. В мировой практике основными микроорганизмами, продуцирующими ферментные комплексы карбогидраз, являются микроскопические грибы рода Trichoderma. Однако ферментные препараты (ФП), получаемые на основе штаммов Trichoderma, характеризуются относительно невысокой удельной активностью и обладают низким содержанием р-глюкозидазы -одного из ключевых ферментов целлюлолитического комплекса, что приводит к недостаточно эффективному использованию ФП в промышленной биотехнологии. В отличие от грибов рода Trichoderma, секретируемый ферментный комплекс низшего гриба Pénicillium verruculosum имеет более высокую удельную активность, лучше сбалансирован по составу целлюлолитических ферментов, поэтому ферментные препараты, полученные на его основе, обладают большей эффективностью при осахаривании целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ). Тем не менее, очевидно, что необходимо искать пути дельнейшего увеличения активности ферментного комплекса P.verruculosum - этого можно добиться привнесением в комплекс дополнительных целлюлолитических ферментов, а также ферментов гемицеллюлаз (ксиланаз, маннаназ), обеспечивающих деградацию гемицеллюлозной матрицы растительного сырья и, как следствие, облегчающих доступ целлюлаз к целлюлозному субстрату.

Таким образом, получение новых мультиферментных комплексов карбогидраз на основе штамма гриба P.verruculosum, обладающих улучшенной осахаривающей способностью по отношению к природному растительному сырью, является важной и

актуальной задачей, поскольку их применение будет способствовать увеличению эффективности процессов переработки ЦСМ.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось увеличение эффективности гидролиза целлюлозосодержащего сырья с использованием новых комплексных ферментных препаратов, обладающих высокими значениями целлюлазных и гемицеллюлазных активностей, полученных на основе высокопродуктивных рекомбинантных штаммов P.verruculosum. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

1. Получить экспрессионные плазмиды, содержащие гены гемицеллюлаз (эндо-1,4-р-ксиланазы А (xylA), эндо-1,4-Р-ксиланазы III (ху13), эндо-1,4-р-маннаназы В (тапВ), эндо-1,4-р-ксиланазы III (ху13)) и целлюлаз (эндо-1,4-р-глюканазы IV (egl4), эндо-1,4-р-глюканазы I (egll) и целлобиогидролазы II (cbhll)) T.reesei и P.canescens;

2. Провести трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum 537 (tiiaD) и осуществить скрининг трансформантов на целевые активности (ксиланазную, маннаназную, КМЦ-азную, авицелазную), удостовериться в стабильности новых рекомбинантных штаммов;

3. Исследовать каталитические, физико-химические и биохимические свойства новых ферментных комплексов, продуцируемых полученными рекомбинантнвми штаммами;

4. Проанализировать осахаривающую способность новых ферментных комплексов карбогидраз по отношению к различным видам ЦСМ (измельченной багассе, измельченной обессмоленной сосновой древесине, измельченной осиновой древесине и микрокристаллической целлюлозе) и сравнить ее с осахаривающей способностью имеющихся коммерческих и лабораторных ферментных препаратов;

5. Определить компонентный состав ферментных комплексов, обладающих наиболее высокой осахаривающей способностью.

Научная новизна. Впервые созданы плазмидные конструкции, обеспечивающие экспрессию целевых генов (целлюлаз и гемицеллюлаз) под контролем индуцибельного промотора cbhl гена мажорного секреторного белка целлобиогидролазы I (ЦБГ1) в штамме-реципиенте Р. verruculosum 537. На базе наилучших штаммов-продуцентов целевых ферментов впервые получены новые мультиферментные комплексы карбогидраз с увеличенной осахаривающей способностью, определен их компонентный состав и описаны биохимические свойства. Найдены корреляции между составом растительного сырья, составом полученных комплексов и результатами осахаривания природных субстратов. На основе полученных экспериментальных данных впервые предложена методика получения мультиферментных комплексов заданного состава.

Практическая значимость работы. Показано, что ферментные комплексы карбогидраз обладают увеличенной осахаривающей способностью (за счет привнесения в их состав новых гетерологичных ферментов). Применение новых ФП при гидролизе различных видов ЦСМ (измельченной багассы, измельченной осиновой древесины, измельченной сосновой древесины, микрокристаллической целлюлозы) позволяет увеличить выход сбраживаемых Сахаров на 10-130% по сравнению с существующими лабораторными и коммерческими ферментными препаратами.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications» (Архангельск, 2009), московской международной научно-практической конференции "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов" (Москва, 2010), втором международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «EURASIABIO» (Москва, 2010), Sixth International Conference on Renewable Resources and Biorefineries (Düsseldorf, 2010), седьмой всероссийской научной молодежной школы с международным участием (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования; четырех глав, в которых приведены полученные результаты и их обсуждение; выводов и списка литературы, содержащего ссылок на публикации в отечественных и зарубежных журналах. Объем диссертации составляет (7 Г страниц и включает рисунков и таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Получение рекомбинантных штаммов на основе штамма Р. verruculosum 537

Получение экспрессионных конструкций и трансформация штамма-реципиента. Используя геномные ДНК P.canescens и Т.reesei в качестве матрицы, методом ПЦР были амплифицированы и выделены фрагменты соответствующие целевым генам (эндо-ß-1,4-ксиланаза А P.canescens - xylA, эндо-ß-1,4-ксиланаза III T.reesei - ху13, эндо-ß-1,4-маннан аза В T.reesei - тапВ, эндо-ß-1,4-эндоглюканаза IV T.reesei - egllV, эндо-р-1,4-эндоглюканаза I T.reesei - egll, целлобиогидролаза II T.reesei - cbhllj, которые были клонированы в вектор, содержащий нуклеотидные последовательности, соответствующие промоторной и терминаторной области гена ЦБГ1 (cbhl) P.verruculosum, а также необходимые генетические элементы для репликации в клетках E.coli. Далее, полученные экспрессионные плазмиды были

трансформированы в компетентные клетки E.coli Machi. Таким образом, были получены экспрессионные конструкции, приведенные на рис.1.

■OÍD Г.10)

Рисунок 1. Схематическое изображение экспрессионных плазмид (А - плазмида, несущая тенху1А, Б-тапВ, B-eglI, Г - е£14, Д-сЬЫ1, Е-ху13).

Была проведена серия «¡трансформаций штамма-реципиента Р.уеггиси1озит 537 (шаО") полученными плазмидами совместно с плазмидой рБТАК), несущей ген нитратредуктазы (шаЛ), обеспечивающей комплементацию дефектного гена

нитратрсдуктазы в штамме реципиенте для обеспечения позитивной селекции трансформантов на средах с нитратом натрия. Проводили тест на стабильность трансформантов, состоящий в 4-х последовательных пересевах на селекционную среду, содержащую нитрат натрия в качестве источника азота. Стабильные трансформанты подвергали дальнейшему скринингу.

Первичный скрининг трансформантов (на примере трансформантов с гетерологичной эидо-|!-1,4-ксиланазой А Р.сапе$сеп$). Трансформанты культивировали в колбах на стандартных средах роста штамма Р.уеггисиЬзит. В культуральной жидкости (КЖ) определяли целевую (ксиланазную) и базовые активности (КМЦ-азную и авицелазную, табл.1): КМЦ-азную активность определяли по гидролизу Ыа-соли карбоксиметилцеллюлозы, ксиланазную - по гидролизу ксилана березы, авицелазную - по гидролизу микрокисталлической целлюлозы (МКЦ), маннаназную - по гидролизу галактоманнана. На рис.2 приведены электрофореграммы образцов КЖ, полученных при культивировании трансформантов. В качестве контроля использовали КЖ, полученную с помощью исходного штамма Р. уеггиси1овит В1 -221 -151.

Таблица 1. Активности в КЖ трансформантов с гетерологичной ксиланазой А (обозначения даны в тексте)._

№ Ксиланаза, ед/мл кмц- аза, ед/мл Авицелаза, ед/мл № Ксиланаза, ед/мл кмц- аза, ед/мл Авицелаза, ед/мл

1 461±23 20±1 2.65±0,13 13 511±25 14±1 0.42±0,02

2 384±19 25±1 2.65±0,13 14 793±40 13±1 0.40±0,02

3 350±17 37±2 3.89±0,19 15 287±14 36±2 0.51±0,02

4 338±15 54±3 2.69±0,13 16 309±15 25±1 0,48±0,02

5 261±13 25±1 0.48±0,02 17 349±17 36±2 3.68±0,18

6 678±34 22±1 2.29±0,11 18 343±17 30±2 3.14±0,16

7 741±37 13±1 0.27±0,01 19 266±13 55±5 3.98±0,2

8 712±35 14±1 0.37±0,02 20 318±16 26±1 3.73±0,19

9 339±17 27±2 1.92±0,06 21 382±19 41±2 4.39±0,22

10 390±19 26±2 3.80±0,19 22 265±13 37±2 3.62±0,18

11 511±25 35±2 2.46±0,12 23 460±23 24±1 3.04±0,15

12 34Ш7 27±2 4.5 НО,23 24 463±23 6±1 0.28±0,01

Контроль 173±8 50±3 2.97±0,15

Очевидно, что на этапе первичного скрининга можно выделить две группы трансформантов, различающихся значениями целевой и базовых активностей: к первой группе относятся трансформанты с высоким значением в КЖ целевой ксиланазной активности, но низкими базовыми активностями (отмечены в табл.1 жирным шрифтом; на рис.2 обозначены сплошной стрелкой). Ко второй группе относятся трансформанты с меньшими значениями целевой активности, но сохранившие базовые активности на уровне исходного штамма (отмечены в табл.1 жирным курсивом-, на рис.2 обозначены пунктирной стрелкой).

4 з 6 м ; 8 I № Ц I) и1 К I1? го

24 ^ м ша

ШШШ1

шШШШ

гЯВ

1 Ж

§

: щ И

§ ж

#

Рисунок 2. Электрофореграмма образцов КЖ трансформантов, содержащих гетерологичную ксиланазу А (нумерация трансформантов соответствует нумерации в табл.1).

Доказательством, свидетельствующим в пользу наличия экспрессии целевых белков (эндо-р~1,4-ксиланазы А, эндо-р-1,4-ксиланазы III, эндо-р-1,4-маннаназы В, эндо-р-1,4-глюканаз IV и I и целлобиогидролазы II) в КЖ, являлись данные МАЬ01-ТОР масс-спектрометрии. Для получения этих данных проводили ДДС-ЭФ КЖ соответствующих трансформантов, вырезали образцы геля, соотвествующие по молекулярной массе целевому рекомбинантному ферменту, подвергали их гидролизу трипсином, и далее полученные пептиды анализировали методом МАЬ01-Т0Р масс-спектрометрии. Анализ результатов и поиск целевых пептидов проводили с использованием программы Вгикег Ва1аАпа1у$18. Данные о полученных пептидах после трипсинолиза сравнивали с теоретическими пептидными последовательностями, полученными с использованием программы РерЙеМазв (http://expasy.org/tools/peptide-mass.html) для первичной аминокислотной последовательности гетерологичных ферментов.

На рис.3-4 приведены МАЬ01-Т0Р масс-спектры трипсинового гидролизата и результаты идентификации пептидов на примере эндо-р-1,4-ксиланазы А - на основании этих данных с достоверностью можно утверждать о наличии эндо-Р-1,4-

ксиланазы А Р.сапеясепз в КЖ трансформантов Р.уеггиси/ояит, полученных с помощью экспрессионной конструкции рРгСВН1-Ху1А. Подобным образом было доказано наличие экспресии и других целевых генов.

о . .......................— .........

1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 ЗООО т/2

Рисунок 3. МАЦМ-ТОР масс-спектр трипсинового гидролизата полосы, соответствующей эндо-)3-1,4-ксиланазе А Р.саяг^се/и.

1 МУдЬКТААЬА ЬЬРАООАЬЗв РУРвКдАвУВ ХРАСТКАНеК фГЯТЮРОУ ТЬТК^ТКИРА

61 11|юшгооиг реыбмкушат ершюогтгз овруьуи-ао эшафиюнт ьуушздьрсдо

121 \^331ТРККТЬ 13УЬКГШ1ТТ УМТКУКСК1У АИРУЬНЕХга! ЕРОЗЪгфЮУГ УНУ1СЕРУУВ|

181 ХАЕЕТАЯЗТО РЫАКЪУЮТУ тЛЗАСУЭЮ/ ЫОтгентакЯ ЬААСТРГОв! ОЗОТНЬСАел 241 ОЗАУАСАЫСА ЬАЗАСГКЕ1А 1ТЕЬБ1АОАЗ ЗТБУЛЛЛД/МА СШ0АКС|УС1 ТУУКЗУАРРРэ! 301 ^зэзгрььр ГХЖИРКААУ ЫАЮТАЬ

Рисунок 4. Аминокислотная последовательность эндо-р-1,4-ксиланазы А Р.сапезсепэ. Пептиды, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии, выделены жирным шрифтом.

Получение ферментных препаратов. С помощью выбранных рекомбинантных штаммов была проведена наработка КЖ трансформантов в ферментёрах объемом 1 л на ферментационной среде для Р.уеггиси/о5шп. После отделения грибной биомассы КЖ были лиофильно высушены. Всего для дальнейших исследований было получено 33 ферментных сухих препарата (табл.2).

2. Свойства ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов

Р. уеписи1о$ит

Были исследованы молекулярные параметры (молекулярная масса, р1) гетерологичных белков входящих в состав ферментных препаратов. Определена активность ферментных препаратов по широкому кругу природных и синтетических

субстратов, температурные и рН-оптимумы действия, стабильность в различных условиях.

Таблица 2. Рекомбинантные штаммы и полученные ферментные препараты.

Штамм Промотор/ терминатор Сигнальный пептид Ген Ферментные препараты

В1/СВН1_Ху1А cbhl (Р. verruculosum) xylA (P.canescens) xylA (P.canescens) КсилА-(1-8)

В1/СВН1_Мап cbhl (Р. verruculosum) manB (T.reesei) manB (T.reesei) МанВ-(1-8)

B1/CBHI EGIV cbhl (Р. verruculosum) cbhl (P. verruculosum) egUV (T.reesei) 3fIV-(l-8)

B1/CBHIEGI cbhl (Р. verruculosum) cbhl (P. verruculosum) egll (T.reesei) ЭГ1-(1-4)

B1/CBHI СВН II cbhl (Р. verruculosum) cbhl (P. verruculosum) cbhll (T.reesei) ЦБГП-(1-4)

В1/СВН1_Ху13 cbhl (P. verruculosum) xyl3 (T.reesei) xyl3 (T.reesei) КсилШ-1

Электрофорез и изоэлектрофокусирование. Был проведен ДДС-электрофорез сухих ферментных препаратов (рис.5). На электрофореграммах обозначены полосы, соответствующие эндо-ß-l ,4-эндоглюкан азе IV T.reesei (-39 кДа), эндо-ß-l ,4-эндоглюканазе I T.reesei (~55 кДа), целлобиогидролазе II T.reesei (~55 кДа), эндо-ß-1,4-ксиланазе А P.canescens (-31 кДа), эндо-ß-l,4-ксиланазе III T.reesei (-38 кДа), эндо-ß-l,4-маннаназе В T.reesei (-50 кДаА).

Анализ электрофореграмм свидетельствует, что при увеличении экспрессии целевых белков, уменьшается экспрессия ЦБГ1. Это связано с использованием фланкирующих элементов гена cbhl, что приводит в некоторых случаях к частичной замене гена cbhl на ген гетерологичного белка в процессе гомологичной рекомбинации.

По данным изоэлектрофокусирования значения pl рекомбинантных ферментов имели следующие значения: эндо-ß-l,4-эндоглюканазы IV T.reesei - 2,8; эндо-ß-l,4-эндоглюканазы I T.reesei - 4,6; целлобиогидролазы II T.reesei - 5,7; эндо-ß-l,4-маннаназы В T.reesei - 4,55, эндо-ß-l,4-ксиланазы А P.canescens - 8,5, эндо-ß-l,4-ксиланазы III T.reesei - 9,1.

Активность ферментных препаратов. В табл.3 представлены данные,

характеризующие активность ФП, содержащих рекомбинантные целлюлазы гемицеллюлазы, по отношению к различным субстратам (препараты

Т- сч 7 ю ш г- 00

> > •> > > > ■> >

и

о п о о м ТО Я> т Л

117 75

ЭПУ

- *ф '

кВа 11« ЦБ Г II

сч <*>

С С ё и

ш ю ш 115

м ^ 3 п 3

66,2 45

250 150 100 76 50

* • V < Ь Т. <

! "I "

ЭГ I

зм§ 18.4 ил шш М Ш

г- СМ < < сэ < < № < < г-< 00 <

£ X 2

^ £ к м ё &

ш\ "ШЛ 1 з Р ¡в

- --Л

МИ*

тШ

щ \ Ксиланаза А

18.4 ^ 14.4

-г- О/ ю ар со

со Ш гп СП со Ш Ш Ш

X X X X X X X X

«5 «$ ео « (0 СО со 05

2 № 5 2 г 5 5 2 £

КЗ

Маннаназа В ^

14,4 14,4

Рисунок 5. Электрофореграммы ферментных препаратов, содержащих рекомбинатные гетерологичные целлюлазы и гемицеллюлазы (стрелками указаны полосы, соответствующие рекомбинангными ферментам).

Таблица 3. Удельные активности ферментных препаратов, содержащих рекомбинатные ферменты по отношению к различным субстратам (50 °С, рН 5).

Группа Диапазон значений удельных активностей (ед/мг) Содержание белка в рекомбинантных препаратах (мг/г)

препаратов Активность Рекомбинант-ные препараты Контроль, Р.уеггиси1о5ит В1-221-151

оо Ксиланазная 22,5 - 69,6 12,9

< Авицелазная 0,1 -0,2 0,3 336-737

ц К о КМЦ-азная 1,2-2,9 13,0

X Р-глюкозидазная 0,5 - 3,3 1,1

Маннаназная 14,7-53,7 отсутствует

оо Ксиланазная 1,3-9,7 12,9

03 Я Авицелазная 0,1 - 0,3 0,3 378 - 755

ей КМЦ-азная 2,1 -17,0 13,0

р-глюкозидазная 0,3 - 1,1 1,1

Ксиланазная 12,5-33,3 12,9

> и Авицелазная 0,1-0,2 0,3 620-950

КМЦ-азная 4,9- 10,9 13,0

о р-глюкозидазная 0,8-1,6 1,1

Ксиланазная 9,1 -17,2 12,9

Авицелазная 0,7 - 0,9 0,33 685 - 940

и о КМЦ-азная 10,7-24,2 13,0

Р-глюкозидазная 1,0-1,2 1,1

ч- Ксиланазная 15,2-21,5 12,9

— Авицелазная 0,9-1,4 0,3 751-916

и из КМЦ-азная 14,7- 19,8 13,0

а Р-глюкозидазная 1,1 - 1,5 1,1

Ксиланазная 20,8 12,9

Авицелазная 0,1 0,3 807

в о КМЦ-азная 18,0 13,0

ьг Р-глюкозидазная 1,1 1,1

разбиты на группы, относящиеся к определенным рекомбинантным ферментам ферментам, жирным шрифтом отмечены целевые для определенных групп активности).

Анализируя данные, приведенные в табл.3, следует заключить, что целевые активности различных ферментных препаратов варьируют в широком диапазоне значений и в несколько раз превосходят, значения соответствующих активностей

контрольного ферментного препарата, полученного с помощью исходного штамма Р.\еггиси\озит В1-221-151: удельная ксиланазная активность возросла в 2-5 раз, КМЦ-азная - в 2 раза, авицелазная - в 3-4 раза, маннаназная активность в исходном препарате отсутствовала, но достигала значительного уровня в соответствующих рекомбинантных ферментных препаратах.

рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность ферментных препаратов. Важными характеристиками ферментных препаратов являются рН- и температурные оптимумы целевой активности, а также их стабильность при различных рН и температуре - эти параметры во многих случаях являются ключевыми при выборе ферментов для различных биотехнологических процессов. В табл.4 приведены результаты исследований ферментных препаратов, касающиеся влияния рН и температуры на целевые активности (рН50% и Т50% -интервал значений рН и Т, при которых активности ФП выше 50% от максимального значения).

Таблица 4. Влияние температуры и рН на целевую активность и стабильность ферментных препаратов.

Целевой ген ху1А Р.сапеэсет ху13 Т.гееяи тапВ Т.гесаа СЯЧ Т.геае! ефУ Т.гее$ел сЫгН Т.гее$е1

№ препарата КсилА^ КсилШ-1 МанВ-6 ЭП-4 ЭПУ-2 ЦБГ11-3

Активность по отношению к субстрату Глюкуроно-ксилан Глюкуро-ноксилан Галакто-маннан КМЦ КМЦ МКЦ

рН-оптимум (рН50%) 5,5 (4,2-6,7) 3,5 (2,5-6,5) 3,5 (2,5-7) 4,1 (2,8-5,8) 4,1 (2,5-5,9) 4,9 (2,5-5,8)

Т-оптимум (Т50%) 55 (35-60) 55 (37-67) 80 (60-85) 60 (44-71) 60 (43-76) 59 (40-66)

Остаточная активность после 3 ч инкубации, рН 5,0 (в %) 50°С 30 34 76 75 61 95

60°С Н.с Н.с 75 52 45 17

Время полуинакти вации, рН 5,0 (мин) 50°С 85 150 >180 >180 >180 >180

60°С 4,6 7 >180 >180 100 70

70°С 2,4 4,3 30 >5 >5 3,5

Ферментные препараты проявляли наибольшую стабильность целевой активности при 50 °С (время полуинактивации 1,5-3 часа), наименьшую - при 70 °С (все препараты имели время полуинактивации до пяти минут, препараты, содержащие эндо-|3-1,4-маннаназу В - 30 мин).

Инкубирование ферментных препаратов при 50°С незначительно влияло на их активность, определенную по гидролизу МКЦ (>90% от начальной активности после 3 ч инкубации), активность по гидролизу КМЦ и галактоманнану уменьшалась быстрее (60-75% и 40-75% от начальной активности после 3 ч инкубации, соответственно). Наиболее быстро происходило падение активности по глюкуроноксилану (35-50% от начальной активности после 3 ч инкубации при 50 °С).

Значения рН-оптимумов препаратов располагались в слабокислой области (рН 3,5-5,5). Следует отметить, что ферментные препараты обладали широкими диапазонами значений рН50% (рН 2,5-7,1) и Т50% (30-85 °С).

3. Результаты гидролиза различных видов ЦСМ ферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов P.verruculosum

С целью исследования осахаривающей способности полученных ФП был проведен гидролиз различных видов ЦСМ: в качестве субстратов использовали измельченную осину, измельченную обессмоленную сосну, измельченную багассу, а также МКЦ. Эффективность осахаривания зависит как от качественного и количественного состава ФП, так и от состава предобработанных субстратов. Таким образом, результаты гидролиза различных субстратов позволят понять, какой компонентный состав ферментного препарата наилучшим образом подходит для осахаривания конкретного вида.

Гидролиз проводили в течение 48 часов при 50 °С и различной дозировке ферментных препаратов по белку (2, 5 и 10 мг белка на 1 г субстрата) в присутствии избытка целлобиазного ферментного препарата F10 (40 ед целлобиазы на 1 г субстрата). Через 3, 24 и 48 часов из реакционной смеси отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию восстанавливающих Сахаров (ВС) и глюкозы.

Была исследована осахаривающая способность 33-х полученных ФП. В каждой

группе препаратов было отобрано по одному, показавшему наилучший

осахаривающий эффект на определенных субстратах. В качестве контрольных

препаратов были использованы: препарат В1-221-151, полученный на основе

исходного штамма P.verruculosum В1-221-151, коммерческие препараты на основе

T.ressei: Spezyme CP, Celluclast 1.5L, Accellerase 1000 (данные по активностям

контрольных препаратов представлены в табл.5). На рис.6 представлены результаты

14

гидролиза - в данном случае приведен выход глюкозы и ВС за 24 часа при дозировке ферментных препаратов 5 мг/г субстрата.

Таблица 5. Активности контрольных препаратов по отношению к различным субстратам и содержание белка в контрольных препаратах (50 "С, рН 5).

Название ферментного препарата Содержание белка, мг/г (*мг/мл) КМЦ-аза Авицелаза Р-глюкози-даза Ксиланаза

Контроль, препарат Р. меггисиЬзит В1-221-151 847±33 13,0±0,5 0,30±0,02 1,10±0,05 12,9±0,4

5регуте СР* 118±5 27,7±1,1 2,02±0,08 0,57±0,02 7,5±0,3

СеПис^ 1.51,* 184±7 17,5±0,7 1,29±0,05 0,15±0,01 2,9±0,1

АссеИепцеЮОО* 103±4 30,7±1,2 2,11±0,08 2,94±0,12 3,3±0,1

Рекомбинантные ферментные препараты обладают высокой осахаривающей способностью по отношению к измельченным осине и багассе и превосходят по эффективности гидролиза этих видов ЦСМ как контрольный препарат, полученный с помощью исходного штамма Р.уеггисиЬяит В1-221-151, так и коммерческие ферментные препараты. В случае измельченной обессмоленной сосны рекомбинантные ферментные препараты несколько уступили по осахаривающей способности коммерческому прапарат Брегуте 8Р, но превзошли контрольный препарат Р. уеггиси1о$ит В1 -221-151.

При гидролизе измельченной осиновой древесины наилучшими для осахаривания рекомбинантными ферментными препаратами являются КсилА-4, ЭПУ-2 и КсилШ-1; измельченной обессмоленной сосны - КсилА-4, и КсилШ-1; измельченной багассы - КсилА-4 и ЭГ1У-2.

В табл.6 представлены более подробные данные, характеризующие увеличение выхода ВС и глюкозы при гидролизе разных видов ЦСМ при использовании различных групп рекомбинантных ферментных препаратов по сравнению с контрольным препаратом, полученным с помощью исходного штамма Р. уеггисиЬяит В1-221-151.

Рисунок 6. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 24 часа гидролиза различных природных целлюло-зосодержащих материалов: А) измельченная осина; Б) измельченная обессмоленная сосна; В) измельченная багасса. Условия: 50 °С, рН 5, [S]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 250 об/мин.

Среди препаратов с рекомбинантной эндо-(3-1,4-ксиланазой А максимальный выход Сахаров наблюдался в случае препарата КсилА-4; с рекомбинантной эндо-|3-1,4-ксиланазой III наилучшим показал себя препарат КсилШ-1; с рекомбинантной

эндо-р-1,4-маннаназой - препарат МанВ-2; с рекомбинантной эндо-р-1,4-глюканазой IV - препараты ЭГ1У-1 и ЭПУ-2; с рекомбинантной эндо-р-1,4-глюканазой I -препарат ЭГ1-4; с рекомбинантной целлобиогидролазой II - препарат ЦБГИ-1.

Характерно, что при увеличении дозировки рекомбинантных ферментных препаратов наблюдается относительно меньшее (в %) увеличение выхода ВС и глюкозы по сравнению с контрольным препаратом, что обусловлено исчерпыванием субстрата и выхода Сахаров, близкого к максимальному.

Таблица 6. Выход ВС и глюкозы при гидролизе измельченной осины, измельченной обессмоленной сосны, измельченной багассы и МКЦ (условия гидролиза те же, что на рис.6).

Субстрат Лучшие препараты Дозировка (мг белка на 1 г субстрата) Выход Сахаров при действии рекомбинантных препаратов, г/л Увеличение выхода по сравнению с использованием контроля (препарат Р.уеггиси1о$ит В1-221-151), %

ВС Глюкоза ВС Глюкоза

Осиновая древесина КсилА-4, ЭГГУ-2, КсилШ-1 2 35 30 48 31

5 42 40 17 19

10 48 44 10 2

Сосновая древесина КсилА-4, ЦБГП-1, КсилШ-1 2 32 30 26 19

ЭПУ-2 5 40 38 18 17

МанВ-2 10 43 40 11 12

Багасса ЭП-4 2 35 25 119 167

КсилА-4, ЭП-4 5 47 37 28 37

ЭГ1-4 10 55 48 30 55

МКЦ КсилШ-1, ЭПУ-1 2 26 23 136 119

КсилА-4 5 41 38 71 58

КсилА-4, ЭП-4 10 54 48 54 63

На рис.7 представлены кинетические кривые гидролиза измельченной осиновой древесины рекомбинантными ферментными препаратами (КсилА-4,

ЭГ1У-2), препаратом В1-221-151 и коммерческими препаратами.

50 • 45 -40 -35 -

О 25 -

а

20 -15 -10 -

5 ■ 0

-КсилА-4 -В1-221-151 -Брегугпе СР ' Се11ис1а8Н.51_ - Ассе11ега5е1000

50 45 40 • 35 -30 •

" 20 15 ■ 10 5 -0 -

50

45 ■

40

35 ■

£ 30

с7 25 В

20 -15 • 10 -5 О

24 Время, ч 36

Рисунок 7. Кинетические кривые гидролиза измельченной осиновой древесины препаратом КсилА-4 и контрольными препаратами: А) 2 мг на 1 г субстрата, Б) 5 мг на 1 г субстрата, В) 10 мг на 1 г субстрата. Условия: 50 °С, рН 5, [5]= 100 г/л (сухой вес), 250 об/мин.

Из приведенных данных следует, что при гидролизе измельченной осиновой древесины лучший ферментный препарат КсилА-4 превосходит по глубине и

скорости гидролиза контрольный препарат P.verruculosum В1-221-151 и коммерческие препараты. Наибольший выход ВС наблюдался через 24 и 48 часов гидролиза. При дозировке 10 мг на 1 г субстрата максимальный выход ВС при гидролизе измельченной осиновой древесины препаратами КсилА-4 и В1-221-151 достигается через 24 часа, в отличие от коммерческих препаратов (в случае их использования максимальный выход продуктов гидролиза достигали за 48 часов), что позволяет снизить время гидролиза.

4. Состав мультиферментного комплекса полученных препаратов

Эффективность процесса получения Сахаров из ЦСМ в значительной степени зависит от состава мультиферментного комплекса и кинетического взаимодействия индивидуальных ферментов в нем. Знания о количественном содержании секретируемых мультиферментных комплексов позволят найти объяснение результатам осахаривания определенных видов ЦСМ и оптимизировать состав целлюлазных и гемицеллюлазных мультиферментных композиций для достижения максимальной эффективности осахаривания.

Для определения состава были выбраны ферментные препараты, обеспечившие наибольший выход ВС и глюкозы при гидролизе ЦСМ. Состав ферментных препаратов определяли с помощью разработанного в нашей лаборатории экспресс-метода хроматографического фракционирование ферментных препаратов.

Схема фракционирования включала три стадии:

• обессоливание растворенного препарата методом гельпроникающей хроматографии;

• грубое фракционирование ферментного комплекса с помощью ионообменной хроматографии на носителе Source 15Q, с последующим анализом специфических активностей собранных белковых фракций, а также проведением ДДС-ЭФ (на рис.8 представлено фракционирование лучшего ферментного препарата КсилА-4);

• тонкое фракционирование, включающую дополнительное разделение (гидрофобная хроматография на носителе Source 15Iso) белковых фракций, отобранных в ходе предыдущей стадии и содержащих смесь целлобиогидролаз и (3-глкжозидазы, анализ специфических активностей полученных фракций, а также проведением ДДС-ЭФ.

11БГ1161} кД«

ЦБгияия»

^ ЭГ 40кДя

/

Рисунок 8. Фракционирование ферментного препарата КсилА-4 с помощью анионообменной хроматографии на носителе Source 15Q, рН 6,8.

Ксмл А рек

t

Г!

10

го

40

Объем злюекта, мл

Зная содержания белка и удельную активность соответствующих ферментов во фракциях, определялся компонентный состав препаратов. Результаты, характеризующие компонентный состав рекомбинантных ферментных препаратов: КсилА-4, МанВ-2, ЦБГП-1, ЭГ1У-2, ЭГ1-1, а также контрольного ферментного препарата Р.чеггисиЬяит В1-221-151, представлены в табл.7.

Сравнивая данные хроматографического разделения с результатами гидролиза можно сделать вывод о том, что наибольшей осахаривающей способностью обладают те ФП, в которых не только в значительном количестве присутствуют рекомбинантные (гетерологичные) белки, но и сохраняется собственный целлюлолитический комплекс, например, в препаратах КсилА-4 (18% рекомбинантной эндо-р-1,4-ксиланазы А и 47% целлобиогидролаз), МанВ-2 (45% рекомбинантной эндо-Р-1,4-маннаназы В, 31% целлобиогидролаз). Препараты с другим соотношением рекомбинантных ферментов и целлобиогидролаз, например, КсилА-3 (50% рекомбинантной эндо-Р-1,4-ксиланазы А и 38% целлобиогидролаз), МанВ-1 (70% рекомбинантной маннаназы В, 17% целлобиогидролаз), характеризуются менее высокой осахаривающей способностью.

Таблица 7. Компонентный состав ферментных препаратов.

у Компонент

\ га а СЗ ^ «У 2 е <3 а 3 3 3 3 Ъ) я я К га '2 «и > Й су а Я а И ей 2 8 § £ га Й а «и § < га Я а

\ о о. 3 с о 0 1 о 0 1 и О О к и ■4 2 с; •4 2 ц и ■4 га 4 о ^ а о V. 4 Й Я ы га а д со

\ (О о ю о ю о СО. со. ср. т. ср. а. ср. и о X 2 с; и со.

Препарат \ с о =Г Ц и Я" ч о я 3 Г) § О ч п ч я П 2 О з Г> ч О я и Ы

КсилА-4 35 12 - 10 - - - 2 - 18 2 2

КсилШ-1 25 14 - 25 - - - 5 17 - 3 4

МанВ-2 13 18 - 10 - - 45 2 - - 2 1

ЦБГН-2 44 12 2 27 - - - 7 - - 4 4

ЭПУ-2 32 28 - 10 - 15 - 6 - - 3 4

ЭП-4 39 21 - 24 3 - - 1 - - 3 1

В1-221-151 35 34 - 16 - - - 4 - - 2 4

Кроме того, сравнивая результаты гидролиза и фракционирования ФП, можно прийти к выводу, что препараты с высоким содержанием гетерологичных ксиланаз (КсилА-4 и КсилШ-1) более эффективно гидролизуют ксилансодержащие субстраты - багассу и осиновую древесину; препарат МанВ-2 с высоким содержанием гетерологичной маннаназы эффективнее гидролизует маннансодержащий субстрат -сосновую древесину; препараты с увеличенным содержанием гетерологичных эндоглюканаз (ЭПУ-2, ЭГ1-4) более эффективно гидролизуют субстраты с высокой долей целлюлозы в своем составе - сосновую и осиновую древесину и МКЦ. Таким образом, наблюдается зависимость между составом ЦСМ и составом ферментного комплекса для осахаривания.

Целлобиогидролазы - основные гидролитические ферменты. Их содержание в контрольном ферментном препарате Р.\еггиси1о$ит В1-221-151 и в различных новых

21

рекомбинантных препаратах неодинаково. Так, в препарате В1-221-151 общее содержание целлобиогидролаз около 70%. В препаратах, содержащих рекомбинантные гемицеллюлазы (КсилА-4, КсилШ-1, МанВ-2), содержание целлобиогидролаз в 1,5-2 раза меньше (по причине отгитровки промотора ЦБП), но их осахаривающая способность выше за счет активности привнесенных гетерологичных ферментов.

В препарате ЭПУ-2 не только сохранялся высокий уровень содержания целлобиогидролаз (60%), но и в значительном количестве (15%) присутствовала гетерологичная эндо-fï-l ,4-глюканаза IV.

Препараты ЦБГП-2 и ЭГ1-4 со слабой осахаривающей способностью, характеризовались относительно высоким содержанием ЦБГ I и II (66 и 60% соответственно), но низким содержанием гетерологичных ферментов (2 и 3% соответственно).

Препарат на основе исходного штамма P.verruculosum В1-221-151 обладает высокой осахаривающей способностью за счет наличия высокоактивных

целлобиогидролаз и высокого содержания р-глюкозидазы.

***

Таким образом, основываясь на изложенных результатах, можно утверждать, что ФП, полученные на основе рекомбинантных штаммов P.verruculosum, обладают повышенной осахаривающей способностью ЦСМ по сравнению с коммерческими препаратами и препаратом на основе исходного штамма P.verruculosum В1-221-151. Наиболее эффективными среди полученных ФП являются: препарат ЭПУ-2 для гидролиза измельченной багассы, препарат КсилА-4 для гидролиза измельченной осиновой древесины и препарат МанВ-2 для гидролиза измельченной сосновой древесины. Показано, что применение индуцибельной системы экспрессии дает возможность получения мультиферментных комплексов заданного состава, использование которых приводит к улучшению осахаривающих свойств ФП, необходимых в технологической цепочке биоконверсии ЦСМ на стадии получения Сахаров из полисахаридов клеточной стенки растений.

ВЫВОДЫ

1. Методами генетической инженерии сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гетерологичные гены из Trichoderma reesei и Pénicillium canescens, созданные на основе векторов, содержащих регуляторные области -промотор и терминатор гена cbhl Р verruculosum.

2. Созданы новые рекомбинантные штаммы P.verruculosum, продуцирующие мудьтиферментные комплексы карбогидраз с увеличенной целлюлазной активностью (за счет экспрессии эндо-Р-1,4-глюканазы IV T.reesei), а также с увеличенной гемицеллюлазной активностью (за счет экспрессии эндо-р-1,4-ксиланаз P.canescens и T.reesei или эндо-Р-1,4-маннаназы T.reesei)

3. На основе рекомбинантных штаммов P.verruculosum получены ферментные препараты карбогидраз и проанализирована их осахаривающая способность по отношению к различным видам растительных субстратов. Установлено, что наибольший выход Сахаров при осахаривании измельченной багассы, а также микрокристаллической целлюлозы обеспечивают ферментные препараты, имеющие в своем составе рекомбинантную эндо-р-1,4-глюканазу IV; при осахаривании измельченной осиновой древесины - имеющие рекомбинантную эндо-Р-1,4-ксиланазу, при гидролизе измельченной сосновой древесины - рекомбинантную эндо-р-1,4-маннаназу. Увеличение выхода Сахаров составило 10-130% по сравнению с действием контрольного ферментного препарата, полученного с помощью исходного штамма P. verruculosum.

4. Определен компонентный состав новых ферментных препаратов и установлено, что наиболее высокой осахаривающей способностью обладают препараты ЭПУ-2, КсилА-4, КсилШ-1, МанВ-2, в которых вместе с высоким содержанием целевого привнесенного фермента (эндо-р-1,4-глюканазы IV, эндо-р-1,4-ксиланазы, эндо-Р-1,4-маннанзы) сохраняются ключевые целлюлолитические ферменты P.verruculosum (целлобиогидролазы I и II).

5. Исследованы физико-химические и биохимические свойства ферментных препаратов, обладающих наибольшей осахаривающей способностью. Установлено, что оптимумы действия ферментных препаратов располагаются в области рН 3,5-5,5 и при температурах от 50 до 80°С, а также стабильны в широком температурном диапазоне (Т50% 30-85 °С).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи в рецензируемых журналах:

1. Morozova V.V., Gusakov A.V., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Osipov P.O.. Sinitsyn A.P. Cellulase complex of the fungus Pénicillium verruculosum: properties of major endoglucanases and cellobiohydrolases. Biotechnology Journal, 2010, v.5, №8, pp.871-880.

2. Osipov P.O., Rozhkova A.M., Matys V.J., Koshelev A.V., Okunev O.N., Rubtsova E.A., Pravilnikov A.G., Zorov. I. N., Sinitsyna O. A., Oveshnikov I. N.,

23

Davidov E.R., Sinitsyn A.P. Production of biocatalysts on the basis of recombinant heterologous xylanase producer strains in the Pénicillium verruculosum fungus: their application in the hydrolysis of timber and wood processing industry wastes. Catalysis in Industry, 2011, v.3, №1, pp.34-40.

Тезисы докладов.

1. Osipov P.O.. Koshelev A.V., Zorov I.N., Matys V.Yu., Bubnova T.V., Nemashkalov V.A., Okunev O.N., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P. Simultaneous fermentation of fungi Trichoderma longibrachiatum and Pénicillium verruculosum as a tool for obtaining cellulase complex with increased p-glucosidase activity. Abstracts of International Conference «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications», 19-24 June, Arkhangelsk, p.107.

2. Осипов Д.О.. Синицын А.П., Рожкова A.M., Зоров И.Н. Высокоэффективный комплекс гемицеллюлаз рекомбинантных штаммов микромицета Pénicillium для ферментативного гидролиза багассы Московская международная научно-практическая конференция "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов", 15-17 Марта, Москва, стр.309-310.

3. Осипов Д.О.. Рожкова A.M., Правильников А.Г., Зоров И.Н., Синицын А.П. Высокоэффективный комплекс гемицеллюлаз рекомбинантных штаммов микромицета Pénicillium sp. для ферментативного гидролиза хвойной древесины. Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике «EURASIABIO», 12-15 Апреля, Москва, стр.140.

4. Синицын А.П., Синицына О.А., Рожкова A.M., Зоров И.Н., Федорова Е.А., Семенова М.В., Сатгрудинов А.Д., Короткова О.Г., Андрианов P.M., Правильников А.Г., Волков П.В., Осипов Д.О.. Бушина Е.В., Кондратьева Е.А., Гусаков А.В., Немашкапов В.А., Беккаревич А.О., Матыс В.Ю., Бубнова Т.В., Кошелев А.В., Окунев О.Н. Комплекс ферментов для эффективного осахаривания лигноцеллюлозных материалов, Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике «EURASIABIO», 12-15 Апреля, Москва, стр. 162-163.

5. Осипов Д.О. Увеличение выхода сбраживаемых Сахаров при гидролизе растительного сырья ферментными комплексами грибов, содержащими гетерологичные ксиланазы, Материалы Седьмой Всероссийской Научной Молодежной Школы с Международным Участием, 24-26 Ноября 2010, Москва, стр.254-258.

Подписано в печать:27.04.11 Тираж: 100 экз. Заказ № 3767 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул. Фридриха Энгельса, д. 3/5, стр. 2 (495)661-60-89; www.reglet.rn

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Осипов, Дмитрий Олегович

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Источники целлюлозосодержащего сырья и его состав

Глава 2. Состав, строение и основные свойства компонентов растительной клеточной стенки

2.2. Целлюлоза

2.2. Гемицеллюлозы

2.3. Пектины и лигнин

Глава 3. Ферментативная деградация целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ)

3.1. Общие сведения о гликозил-гидролазах, участвующих в гидролизе ЦСМ

3.2. Целлюлазы

3.3. Гемицеллюлазы

3.4. Механизм действия целлюлазного комплекса

3.5. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы

Глава 4. Штамм Pénicillium verruculosum и компоненты секретируемого им ферментного комплекса

Экспериментальная часть

Глава 5. Объекты исследования и методы экспериментов

5.1. Ферментные препараты

5.2. Субстраты

5.3. Прочие реактивы

5.4. Хроматографические сорбенты

5.5. Проведение полимеразной цепной реакции и получение генетических конструкций

5.6. Окрашивание агаризованной среды с аморфной целлюлозой конго красным

5.7. Культивирование трансформантов P. verruculosum в 3-л ферментерах

5.8. Метод определения концентрации белка

5.9. Методы определение биохимических характеристик ферментов

5.10. Методы определения активности ферментов

5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков

5.12. Определение температурного и pH-оптимума действия ферментных препаратов

5.13. Изучение термо- и pH-стабильности ферментных препаратов

5.14. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов гидролиза целлюлозосодержащего сырья

5.15. Хроматографическое фракционирование препаратов Р. verruculosum

5.16. Гидролиз цсллюлозосодержащих материалов

Результаты и их обсуждение

Глава 6. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Р. verruculosum

6.1. Выделение генов и создание экспрессионных конструкций

6.2. Трансформация штамма-реципиента Р. verruculosum

6.3. Первичный скрининг полученных трансформантов

6.3.1. Первичный скрининг трансформантов, содержащих гетерологичные целлюлазы

6.3.2. Первичный скрининг трансформантов, содержащих гетерологичные гемицеллюлазы

6.4. Получение рекомбинантных ферментных препаратов

Глава 7. Физико-химические свойства новых ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов Р. verruculosum

7.1. Анализ ферментных препаратов с помощью методов электрофореза и изоэлектрофокусирования

7.2. Активность ферментных препаратов по отношению к различным субстратам

7.3. рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность ферментных препаратов

Глава 8. Гидролиз полисахаридных субстратов лабораторными мультиферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов Р. уеггисиЬяит

8.1. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины

8.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины 97 8.2. Результаты гидролиза измельченной багассы

8.4. Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы (МКЦ)

8.5. Сравнение эффективности гидролиза растительных субстратов ферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов Р. уеггисьАотт и коммерческими ферментными препаратами

8.6. Влияние рН и температуры на эффективность гидролиза ЦСМ

Глава 9. Состав рекомбинантных ферментных препаратов 128 Выводы 131 Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ферменты

ЦБГ целлобиогидролаза

ЭГ эндоглюканаза

БГЛ р-1,4-глюкозидаза

Ксил ксиланаза

КГ ксилоглюканаза

Прочие сокращения

М№«Ю 1 -мети л-3 -нитро-1 -нитрозогуанин

МАЬШ-ТОГ МБ Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация ч времяпролетная масс-спектрометрия а.к. аминокислота

ВС восстанавливающие сахара

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ДДС-ЭФ электрофорез в денатурирующих условиях

КЖ культуральная жидкость

ИК индекс кристалличности

ИЭФ изоэлектрофокусирование

КМЦ Иа-соль карбоксиметилцеллюлозы

МКЦ микрокристаллическая целлюлоза

ПААГ полиакриламидный гель

ПАВ поверхностно-активные вещества я-НФ-Р-Глюк и-нитрофенил-р-Б-глюкопиранозид

ПЭГ полиэтиленгликоли

СП степень полимеризации

УФ, иУ ультрафиолетовое излучение

ФП Ферментный препарат

ЦСД целлюлозосвязывающий домен

ЦСМ целлюлозосодержащие материалы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и характеристика мультиферментных комплексов карбогидраз и исследование их эффективности при осахаривании различных видов целлюлозосодержащих материалов"

Исчерпывание традиционного углеводородного сырья, загрязнение окружающей среды отходами производств, а также увеличение объема антропогенных выбросов парниковых газов в атмосферу является в современном мире актуальной проблемой. В связи с этим резко возрос интерес к альтернативным источникам сырья и энергии, одним из которых является возобновляемые растительные материалы - лигноцеллюлозная биомасса, целлюлозосодержащие отходы промышленности и сельского хозяйства. Гидролиз лигноцеллюлозной биомассы с помощью ферментов микроорганизмов позволяет получать глюкозу и другие сахара, которые могут быть использованны далее для превращения в спирты (биотопливо), органические и аминокислоты и многие другие полезные продукты.

Главным компонентом растительной биомассы являются природные полисахариды целлюлоза и гемицеллюлоза. Ферменты, осуществляющие их биодеградацию, занимают центральное место в круговороте органического углерода. Основными микроорганизмами, продуцирующими такие ферменты, являются микроскопические грибы - возбудители мягкой, белой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий.

Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (T. reesei, T. viride, T. longibrachiatum и др.) играют ведущую роль. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием внеклеточных ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования в различных отраслях биотехнологической промышленности. Однако стоит отметить, что одним из недостатков данного продуцента целлюлаз является низкое содержание (З-глюкозидазы, отвечающей за конверсию целлобиозы (промежуточного продукта ферментативного гидролиза целлюлозы) в конечный продукт - глюкозу. В отличие от Trichoderma, грибы рода Pénicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз более сбалансированного состава, которые эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие отходы, при этом индивидуальные ферменты обладают высокой операционной стабильностью.

В лаборатории Биотехнологии ферментов ИНБИ РАН ведутся работы со штаммом гриба Pénicillium verruculosum - одним из наиболее активных продуцентов карбогидраз. Однако в ферментном комплексе, продуцируемом этим грибом недостаточно гемицеллюлазной активности, необходимой для гидролиза богатой гемицеллюлозой биомассы. Поэтому создание новых штаммов, продуцирующих ферментные комплексы, обладающих повышенными уровнями целлюлазных и гемицеллюлозных активностей, могло бы способствовать усовершенствованию процессов переработки лигноцеллюлозного сырья.

Таким образом, увеличение эффективности гидролиза целлюлозосодержащего сырья с использованием новых комплексных ферментных препаратов, обладающих высокими значениями целлюлазных и гемицеллюлазных активностей, полученных на основе высокопродуктивных рекомбинантных штаммов Р. verruculosum является актуальной целью.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• получить экспрессионные плазмиды, содержащие гены гемицеллюлаз (эндо-1,4-Р-ксиланазы А (xylA), эндо-1,4-р-ксил апазы III (ху13), эндо-1,4-Р-маннаназы В (тапВ), эндо-1,4-р-ксиланазы III (ху13)) и целлюлаз (эндо-1,4-Р-глюканазы IV (egl4), эндо-1,4-Р-глюканазы I (egll) и целлобиогидролазы II (cbhll)) Т. reesei и Р. canescens под контролем сильного индуцибельного промотора целлобиогидролазы I (cbhl);

• провести трансформацию штамма-реципиента Р. verruculosum 537 (niaD'J и осуществить скрининг трансформантов на целевые активности (ксиланазную, маннаназную, КМЦ-азную, авицелазную), удостовериться в стабильности новых рекомбинантных штаммов;

• исследовать каталитические, физико-химические и биохимические свойства новых ферментных комплексов, продуцируемых полученными рекомбинантными штаммами;

• проанализировать осахаривающую способность новых ферментных комплексов карбогидраз по отношению к различным видам целлюлозосодержащих материалов (измельченной багассе, измельченной обессмоленной сосновой древесине, измельченной осиновой древесине и микрокристаллической целлюлозе) и сравнить ее с осахаривающей способностью имеющихся коммерческих и лабораторных ферментных препаратов;

• определить компонентный состав ферментных комплексов, обладающих наиболее высокой осахаривающей способностью.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Осипов, Дмитрий Олегович

выводы

1. Методами генетической инженерии сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гетерологичные гены из Trichoderma reesei и Pénicillium canescens, созданные на основе векторов, содержащих регуляторные области — промотор и терминатор гена cbhl P. veiraculosum.

2. Созданы новые рекомбинантные штаммы P. verruculosum, продуцирующие мультиферментные комплексы карбогидраз с увеличенной целлюлазной активностью (за счет экспрессии ондо-р-1,4-глюканазы IV T. reesei), а также с увеличенной гемицеллюлазной активностью (за счет экспрессии эндо-Р-1,4-ксилапаз P. canescens и Т. reesei или эндо-Р-1,4-маннаназы Т.reesei)

3. На основе рекомбинантных штаммов P. verruculosum получены ферментные препараты карбогидраз и проанализирована их осахаривающая способность по отношению к различным видам растительных субстратов. Установлено, что наибольший выход Сахаров при осахаривании измельченной багассы, а также микрокристаллической целлюлозы обеспечивают ферментные препараты, имеющие в своем составе рекомбинантную эндо-Р-1,4-глюканазу IV; при осахаривании измельченной осиновой древесины - имеющие рекомбинантную эндо-Р-1,4-ксиланазу, при гидролизе измельченной сосновой древесины - рекомбинантную эндо-Р-1,4-маннаназу. Увеличение выхода Сахаров составило 10-130% по сравнению с действием контрольного ферментного препарата, полученного с помощью исходного штамма P. verruculosum.

4. Определен компонентный состав новых ферментных препаратов и установлено, что наиболее высокой осахаривающей способностью обладают препараты ЭГ1У-2, КсилА-4, КсилШ-1, МанВ-2, в которых вместе с высоким содержанием целевого привнесенного фермента (эндо-Р-1,4-глюканазы IV, эндо-Р-1,4-ксиланазы, эндо-Р-1,4-маннанзы) сохраняются ключевые целлюлолитические ферменты P. verruculosum (целлобиогидролазы I и II).

5. Исследованы физико-химические и биохимические свойства ферментных препаратов, обладающих наибольшей осахаривающей способностью. Установлено, что оптимумы действия ферментных препаратов располагаются в области рН 3,5-5,5 и при температурах от 50 до 80°С, а также стабильны в широком температурном диапазоне (Т5о% 30-85 °С).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Осипов, Дмитрий Олегович, Москва

1. Тиунова Н.А. Применение целлюлаз. Целлюлазы микроорганизмов. Под ред. Кретовича В.Л. М., 1981, с. 40-73.

2. Грачева И.М., Гаврилова Н.Н., Иванова Л.А. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М., 1980, с. 83-90

3. Шарков В.И., Куйбина И.И., Соловьева Ю.П. и др. Количественный и химический анализ растительного сырья. М., 1976, с. 203.

4. Евилевич А.З., Ахмина Е.И., Раскин М.Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М., 1982, с. 4-40.

5. Максимов В.Ф., Вольф И.В., Яковлева О.И. Борьба с загрязнениями окружающей среды в целлюлозно-бумажной промышленности. М., 1976, с. 30

6. Roger М. Rowell, Tor P. Schultz, Ramani Narayan. Emerging Technologies for Materials and Chemicals from Biomass. ACS Symposium Series, 1992, v. 476, p. 12-27.

7. Reshamwala S., Shawky B.T., Dale B.E., Ethanol production from enzymatic hydrolysatcs of AFEX-treated coastal Bermuda grass and switchgrass. Appl. Biochem. Biotechnol., 1995, v. 51-52, p. 43-55.

8. Collmer A., Keen N.T. The role of pectic enzymes in plant pathogenesis. Ann. Rev. Phytopathol., 1986, v. 24, p. 383-409.

9. Albersheim P., Jones T.N. Biochemistry of the cell wall in relation to infective processes. Ann. Rev. Phytopathol., 1969, v. 7, p. 171-194.

10. Dey P.M. and Brinston K. Plant cell-walls. Adv. in carbohydrate chem. and biochem., 1984, v. 42, p. 265-382.

11. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М., Мир, 1986, 387 с.

12. Stephen A.M. (ed.) Food polysaccharides and their applications. Marcel Dekker, Inc., New York, 1995, 654 p.

13. Hopkins W.G. Introduction to Plant Physiology, 2nd edition. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999, 512 p.

14. Роговин З.А. Химия целлюлозы. M., Химия, 1972, 519 с.

15. Горшкова Т.А. Растительная клеточная стенка как динамичная система. М., Наука, 2007, с. 21.

16. Клесов А.А. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы. Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология. 1988, М., ВИНИТИ, т. 12, с.53.

17. Uhlig Н. Industrial enzymes and their applications. John Willey & Sons, Inc., New York, 1998, 454 p.18.