Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum"

На правах рукописи

00501470»

ПРАВИЛЬНИКОВ АРТЕМ ГЕННАДИЕВИЧ

Состав и осахаривающая способность ферментных

препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum

03.01.04 - биохимия

1 2 l\-ï а р ¿с ¡2

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2012

005014708

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха

Российской академии наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Синицын Аркадий Пантелеймонович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Ямсков Игорь Александрович

доктор биологических наук, профессор Королева Ольга Владимировна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К. Скрябина Российской академии наук, г. Пущино

Защита состоится « 2.с) » 2012 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Института биохимии им.А.Н.Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

Автореферат разослан « *-0 » ДОе^ГС/1^2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Орловский А.Ф.

Актуальность темы исследования. В современном мире четко прослеживается тенденция к приоритетному развитию альтернативной энергетики, основанной на возобновляемых источниках энергии, и сокращению доли углеводородного сырья в глобальном энергетическом балансе. Кроме этого, существуют серьезные экологические проблемы, связанные с увеличением объема выброса парниковых газов в атмосферу.

Биотехнологическая переработка сельскохозяйственных и лесотехнических отходов, а именно лигноцеллюлозной биомассы, являющейся возобновляемым и наиболее распространенным на нашей планете растительным материалом, позволяет значительно снизить нагрузку на экосистему Земли.

Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо - этанол, бутанол, а также другие полезные продукты - органические и аминокислоты, кормовые продукты, адгезивные материалы, биосинтезируемые лекарственные препараты, биоразлагаемые пластики и другие полезные продукты. Таким образом, в будущем растительная биомасса будет играть роль возобновляемого источника сырья, в том числе для получения биотоплива.

Эффективность процесса получения Сахаров зависит от ряда факторов и в значительной степени - от состава комплекса целлюлолитических ферментов и синергетического взаимодействия индивидуальных ферментов в нем.

В настоящее время на мировом рынке представлен широкий спектр ферментных препаратов, полученных на основе культуральной жидкости, секретируемой низшими грибами рода ТгкИос1егта. Эти препараты традиционно применяются для гидролиза растительного сырья, однако они обладают рядом существенным недостатком, заключающимся в относительно Низкой эффективности гидролиза - в первую очередь из-за недостатка составе ферментных комплексов Тпскос1егта Р-глюкозидазы (целлобиазы), что приводит к накоплению в реакционной смеси в качестве одного из продуктов целлобиозы, которая ингибирует ключевые ферменты, участвующие в осахаривании целлобиогидролазы.

Поэтому в настоящее время в области ферментативного гидролиза возобновляемого растительного сырья весьма активно развиваются фундаментальные и прикладные исследования, направленные на поиск и получение новых штаммов-суперпродуцентов целлюлаз, гемицеллюлаз и сопутствующих ферментов, обладающих высокой гидролитической способностью и имеющих «управляемый» состав ферментов, так, чтобы комплекс продуцируемых ферментов был наилучшим образом адаптирован к осахариванию тех или иных видов целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ).

Грибы рода Pénicillium, в отличие от Trichoderma, продуцируют комплексы целлюлитических ферментов более сбалансированного состава, которые эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие материалы.

Ранее нами были разработаны подходы к получению эффективных ферментных препаратов, основным из которых является создание штаммов-продуцентов, содержащих индивидуальные целевые гены целлюлаз. Стратегия создания таких штаммов-продуцентов заключалась в последовательной трансформации штамма-реципиента одной плазмидой, несущей целевой ген, совместно с ко-трансформацией плазмидой pSTAlO, позволяющей отбирать трансформанты при культивировании на селективной среде. Основываясь на данных по встройке отдельных целевых генов и распределению целевых активностей в конечных ферментных препаратах, нами была разработана новая стратегия получения штаммов-продуцентов с заданными свойствами, заключающаяся в одновременной трансформации штамма-реципиента несколькими плазмидами с целевыми генами, а также трансформация экспрессионной кассетой, представляющей собой линейный участок ДНК с несколькими целевыми генами.

Таким образом, создание новых рекомбинантных штаммов на основе штамма гриба P.verruculosum, продуцирующих мультиферментные комплексы карбогидраз, обладающих улучшенной осахаривающей способностью по отношению к природному растительному сырью, является важной и актуальной задачей, поскольку применение данных мультиферментных комплексов будет способствовать увеличению эффективности процессов переработки целлюлозосодержащих материалов.

Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось получение новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum и ферментных препаратов на их основе, обладающих увеличенной осахаривающей способностью.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

• получить экспрессионные плазмиды, содержащие гены целлюлаз: эндо-1,4-р-глюканазы II (egl2) P.verruculosum, целлобиогидролазы II (cbhll) Trichoderma reesei и P.verruculosum и ß-глкжозидазы (bgl) Aspergillus niger под контролем сильного индуцибельного промотора целлобиогидролазы I (cbhl)\

• провести трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD~) и осуществить скрининг трансформантов на целевые активности;

• исследовать каталитические, физико-химические и биохимические свойства новых ферментных комплексов, продуцируемых полученными новыми рекомбинантными штаммами;

• определить компонентный состав ферментных комплексов;

• проанализировать осахаривающую способность наиболее перспективных ферментных комплексов по отношению к различным видам ЦСМ (измельченной багассе, измельченной обессмоленной сосновой древесине, измельченной осиновой древесине и микрокристаллической целлюлозе) и сравнить ее с осахаривающей способностью коммерческих и лабораторных ферментных препаратов.

Научная новизна. Впервые с помощью метода одновременной трансформации грибного штамма-реципиента P.verruculosum 537 несколькими плазмидами, несущими индивидуальные гены гомологичных и гетерологичных целлюлаз, созданы новые штаммы P.verruculosum - продуценты высокоактивных целлюлолитических ферментных комплексов. На базе наилучших штаммов-продуцентов целевых ферментов впервые получены новые мультиферментные комплексы карбогидраз с увеличенной осахаривающей способностью, определен их компонентный состав и описаны физико-химические свойства. Найдены корреляции между составом растительного сырья, составом полученных комплексов и эффективностью процесса осахаривания природных субстратов.

Практическая значимость работы. Показано, что новая стратегия создания штаммов-продуцентов позволяет получать ферментные комплексы заданного состава. Ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum, значительно эффективнее (на 19-50%) гидролизуют различные виды предобработанных хвойной и лиственной древесины, а также багассы, чем коммерческие ферментные препараты, получаемые с использованием штаммов гриба Trichoderma sp., и препарат, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: московской международной научно-практической конференции "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов" (Москва, 2010), втором международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «ЕШ1А81АВЮ» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования; четырех глав, в которых приведены полученные результаты и их обсуждение; выводов и списка литературы, содержащего 151 ссылок на публикации в отечественных и зарубежных журналах. Объем диссертации составляет /Об страниц и включает 42. рисунков и 1&таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Получение рекомбинантных штаммов на основе штамма-реципиента Р. verruculosum 537

Ранее в нашей лаборатории были проведены исследования по получению штаммов-продуцентов различных целлюлаз с помощью системы экспрессии под контролем индуцибельного промотора гена cbhl. При использовании данной системы экспрессии можно получить продукты с высоким содержанием целевого белка в количестве 40-80% от общего количества секреторного белка. При этом возможно снижение общей продуктивности штамма. Поэтому, была разработана новая стратегия создания на основе штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD") рекомбинантных штаммов, продуцирующих мультиферментные комплексы с повышенным уровнем активности целевых ферментов методом ко-трансформации смесью двух и трех целевых плазмид, несущих индивидуальные гены гомологичных эндо-1,4-глюканазы II (ЭГП 36 кДа), целлобиогидролазы II (ЦБГП 60 кДа), а также гетерологичных целлобиогидролазы II (ЦБГП 57 кДа) T.reesei и р-глюкозидазы ((5ГЛ 120 кДа) A.niger. В случае использования двух плазмид полученные ферментные препараты называли «дуплетами», в случае трех плазмид - «триплетами». Кроме того нами был получен ферментный препарат «тандем» на основе штамма, созданного методом трансформации линейной плазмидой, несущей последовательно 2 гена целлюлаз (гомологичной ЭГП 36 кДа и гетерологичной рГЛ 120 кДа).

Схема получения ферментных препаратов включала следующие стадии:

1) вьщеление генов целевых ферментов, создание экспрессионных плазмид, получение трансформированных штаммов;

2) проведение первичного скрининга полученных трансформантов;

3) культивирование отобранных трансформантов и наработка сухих ферментных препаратов;

На первом этапе работы был получен ряд экспрессионных конструкций с различной комбинацией целевых генов. Далее была проведена серия трансформаций штамма-реципиента Р.\erruculosum 537 (таО") плазмидами (рРгСВН1-р01и_А5р-ЕОП_В1, рРгСВН1-ЕОН_В 1, рРгСВН1-СВНН_В1, рРгСВЬШЗ-СВШГГг, рРгСВНГ-Р01и_А5р) совместно с плазмидой рЗТАЮ с геном нитратредуктазы (тай). В табл.1 представлены варианты смесей плазмид, использованных для трансформации.

Таблица 1. Плазмиды и их смеси (композиции), использованные для трансформации реципиентного штамма Р. х>еписи1отт 537 (шаО").

Название конструкции Целевые гены Плазмиды и их смеси

«Тандем» РГЛ A.niger ЭГП Р. геггиси1о5ит рРгСВНІ-рС1и_А5р-ЕОІІ_В 1

«Дуплеты» рГЛ Л.niger ЭГП Р. \'еггиси1о5ыт рРгСВНІ-р01и_Азр + рРгСВНІ-ЕОІІВ 1

РГЛ A.niger СВНП Р.\еггиси1о$ит рРгСВНІ-рй1и_А5р + рРгСВНІ-СВНІІ_В1

РГЛ А.т^ег СВНН Г.гееле! рРгСВНІ-рОІиАБр + рРгСВН^-СВШГТг

«Триплеты» РГЛ A.niger СВНН Р.уеггиси1о$ит ЭГП Р.\еггиси1о$ит рРгСВНІ-р01и_Азр + рРгСВНІ-СВНІІ_В1 + рРгСВНІ-ЕОІІ_В 1

РГЛ A.niger СВНП Т.гее$г1 ЭГП Р.\еггиси1о$ит рРгСВНІ-Р01и_Азр + рРгСВНІ-СВНІІТг + рРгСВНІ-ЕОІІ_В 1

Первичный скрининг трансформантов (на примере трансформантов «дуплет» рГЛ А.п'щег и ЦБГП Р.хетгисиЫит). Были проанализированы трансформанты, полученные с помощью одновременной трансформации плазмид рРгСВШ-рОШ Аэр и рРгСВН1-СВНП_В 1. Для этого были измерены целевые активности в культуральных жидкостях (ЮК) трансформантов (табл.2), а также проведен ДДС-электрофорез КЖ (рис.1).

Все полученные трансформанты отличались высокой р-глюкозидазной активностью, при этом у трансформанта рОир1е12 наблюдалось увеличение значений авицелазной и КМЦ-азной активностей. В качестве контроля использовали КЖ, полученную с помощью исходного штамма Р.геггисиЬяит В1-221-151.

Анализ электрофореграммы (рис.1) позволяет заключить, что почти у всех трансформантов наблюдается увеличение интенсивности полосы, соответствующей РГЛ 120 кДaЛ.mger, у трансформанта рОир1е12 наблюдалось сохранение основного пула собственного целлюлолитического комплекса.

Для идентификации целевых ферментов, белковые полосы после ДДС-электрофореза, соответствующие целевым белкам, подвергали обработке трипсином, полученные пептиды анализировали методом МАЬОЬТОР масс-спектрометрии. Данные МАЬ01-Т0Р масс-спектрометрии подтвердили наличие экспрессии целевых белков (Р-ГЛ, ЦБГИ и ЭГИ).

Таким образом, клон рОир1е12 и был выбран нами для дальнейших исследований.

Таблица 2. Значения удельных активностей (рН5.0, 50°С) в КЖ трансформантов, полученных с помощью одновременного использования плазмид рРгСВШ-рвЫ Азр и рРгСВН1-СВНИ_В1 (в ед. на мг белка).

Номер Белок (Лоури), мг/мл КМЦ-аза, Авицелаза, р-глюкозидаза,

трансформанта ед/мг ед/мг ед/мг

рОир1еИ 3,53 14 0,81 4,89

рОир1е12 3,63 26,9 0,65 37,9

рОир1е13 1,59 4,8 0,11 40,9

рБир1е14 3,14 12,9 0,77 8,5

рОир1е15 2,6 12,4 0,63 36,1

В1 221-151, контроль 4,75 12,9 0,54 1,2

№в|| г——

(ЗГЛ 120 кДа A.mger

22 , , - ' | :

ШШЯШЯт ШШШяШШ

Рисунок 1. Электрофореграмма образцов КЖ трансформантов, полученных при одновременном использовании плазмид рРгСВН1-р01и_Азр и рРгСВН1-СВШ1_В 1.

Обработку масс спектров проводили с использованием программы Вгыкег ОаГаАпа1уз15. Данные о полученных пептидах после трипсинолиза сравнивали с теоретическими пептидными последовательностями, полученными с использованием программы РерМеМавэ (http://expasv.org/tools/peptide-mass.html) для установления первичной аминокислотной последовательности гетерологичных ферментов.

На рис.2 приведен МА1Л)1-Т0Р масс-спектр трипсинового гидролизата и результаты идентификации пептидов на примере Р-глюкозидазы - на основании этих данных можно с достоверностью утверждать о наличии целевого белка в комплексе экспрессируемых ферментов. Подобным образом было доказано наличие экспресии и других целевых генов.

MRFTLIEAVALTAVSLASADELAYSPPYYPSPWANGQGDWAEAYQRAVDIVSQTTLAEKV МЬТТСТСІ<7ЕЬЕЬСУС<2ТССУРЇШЗІ РСМСАОБЗ РЬСУКОЗОУМЗАЕРАСУЫУААТИОКЫЬ AYLRGQAMGQEFSDфADIQLGPAAGPLGR|SPDGGtlNWБGFSPDPALSGVLFAETIKGIQ DAGWATAK]HYIAYEQEHFфAPEAQGYGFNITESGSANLDDKTTHELYLWPFADAIRAG AGAVMCSYNINNSYGCQNSYTLSKLLKAELGFQGFVMSDWAAHHAGVSGALAGLDMSMP GDVDYDSGTSYWGTNLTISVLNGTVPQWRVDDMAVRIMAAYYKVGRDRLWTPPNFSSWTR БЕ УС FK^YYYVSEGPYEtWNQFVNVQR^NHSELIRRIGADSTVLLKNDGALPLTGKERLVAL IGEDAGSNPYGANGCSDRGCDNGTLAMGWGSGTANFPYLMTPEQAISNEVLKNKNGVFTA Т DNWAI 0<Э IЕАЬАКТ АЭ УЭЬ V Г^АОБСЕСУІ NVDGNLGDRRNLTLWRNGDNVIКАААБЫ CNNTIVIIHSVGPVLVNEWYDNPNVTAILWGGLPGQESGNSLADVLYGRVNPGAKSPFTW GKTR|EAYQDYLYTEPNNGNGAPQEDFVEGVFIDYt^GFDKRNETPIYEFGYGLSYTTFNYS NLQVEVLSAPAYEPASGETEAAPTFGEVGNASDYLYPDGLQRITKFIYPWLЫSTDIJEASS GDASYGQDASPYLPEGATDGSAQPILPAGGGAGGNPRLYDELIRVTVTIK)^ITGKVAGDEV| |PQLYVSLGGPNEPK|IVLRQFERITLQPSEETQWSTTLTRRDLANWNVETQDWEITSYPKM

VFVGSSSRKLPLRASLPTVH

о-)—^ЛЛ«, , ^щшдщш^щшщщ ....................... !■ .....!■ ■ и.......

1000 1500 2000 2500 3000 3500 тЛ

Рисунок 2. МАЬОІ-ТОР масс-спектр трипсинового гидролизата полосы, соответствующей (3-глюкозидазе Л.niger и ее аминокислотная последовательность. Пептиды, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии, выделены рамкой.

Получение ферментных препаратов. Была проведена наработка ферментных препаратов, которые представляли собой лиофильно высушенную КЖ наилучших

отобранных рекомбинантных штаммов-продуцентов (табл.3).

Таблица 3. Ферментные препараты и экспрессионные конструкции, использованные для их получения препаратов.

Название конструкции Плазмиды Полученные препараты

«Тандем» рРгСВШ-|ЗОІи_Азр-ЕОІІ_В 1 рГл+ЭГН

«Дуплеты» рРгСВНІ-|Ю1и_А5р + рРгСВНІ-ЕОІІВ 1 рГл-ЭГП-1

рГл-ЭГП-2

ргл-эгп-з

рРгСВНІ-(501и_Азр + рРгСВНІ-СВНІІ_В1 рГл-ЦБГП_Р.у.

рРгСВШ-|301и_А5р + рРгСВНІ88-СВНІІ_Тг рГл-ЦБГП_Т.г.

«Триплеты» рРгСВНІ-рОІиАзр + рРгСВН1-СВНП_В1 + рРгСВНІ-ЕОІІВ 1 рГл-ЦБГІІ Р.у-ЭГП-1

рГл-ЦБГИ_Р.у-ЭГП-2

рГл-ЦБГПР.у-ЭГП-З

рРгСВШ-раиАзр + рРгСВНІ-СВНІІТг + рРгСВНІ-ЕОІІВ 1 рГл-ЦБГПТ.г.-ЭГП-1

рГл-ЦБГП_Т.г.-ЭГП-2

рГл-ЦБ ГІ 1_Т. г.-ЭГИ-3

рГл-ЦБГП_Т.г.-ЭГП-4

!

I

Свойства ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Р. \гггисиЫит. Были определены молекулярные массы гомологичных и гетерологичных белков, входящих в состав ферментных препаратов, активность ферментных препаратов по отношению к широкому кругу природных и синтетических субстратов, температурные и рН-оптимумы действия для различных актвностей и их стабильность в различных условиях.

Молекулярные массы индивидуальных ферментов в составе сухих ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов определяли ДЦС-электрофорезом (рис.3). На электрофореграммах наблюдаются полосы, соответствующие ЭГП 36 кДа Р. \/еггиси1о5ит, ЦБГН 50 кДа Р.\>еггиси1озит, ЦБГИ 60 кДа Т. геезе1, ЦБГН 60 кДа Р. меггиЫоэит, (ЗГл 120 кДа А. niger. По сравнению с контрольным препаратом Р.уеггиси1сиит В1-221-151 увеличение интенсивности полос, отвечающих рГл 120 кДа А. niger в препаратах (ЗГл+ЭГП, рГл-ЦБГИ_Т.г.-ЭГП-1, рГл-ЦБГН Т.Г.-ЭГП-2, рГл-ЦБГПР.у-ЭГП-З, РГл-ЭГП-1, рГл-ЭГП-2, рГл-ЭГП-З, полосы, отвечающие ЦБГИ 60 кДа и ЦБГН 50 кДа наблюдались во всех препаратах, за исключением рГл-ЦБГП_Т.г., РГл-ЭГП-1, рГл-ЭГИ-2, [ЗГл-ЭГИ-З. Значительное увеличение интенсивности полосы, отвечающей ЭГП 36 кДа Р.\erruculosum, наблюдалось в препаратах рГл-ЦБГН_Р.у-ЭГН-3, -ЭГП-1, рГл-ЭГП-2, РГл-ЭГП-З.

1_ ^

о о о « о

ШтЩ. шшшшшЙ.

=гу? =Г =Г =Г =Г =Г

и О

К

и со + и ш гг С ш =г

£ £ £

СО. со. М =1

. ■1 Ж

а а а а.

ш 3" £ и О £ о £ 1_ СО £ Гч)

са о. са. со. £

«И» ЯЯ*»1

5Я5

-(ЗГл 120 кДа

ЦБГИ 60 кДа

18 14

ЦБГИ 50 кДа ЭГИЗбкДа

Рисунок 3. Электрофорефаммы ферментных препаратов (стрелками указаны полосы, соответствующие рекомбинантным ферментам.

Активность ферментных препаратов. В табл.4 представлены данные, характеризующие активность новых ферментных препаратов по отношению к различным субстратам.

Таблица 4. Удельные активности ферментных препаратов, содержащих рекомбинатные ферменты (50°С, рН 5,0).

Группа препаратов Диапазон значений удельных активностей (ед/мг) Содержание белка в рекомбинантных препаратах (мг/г)

Активность Рекомбинант-ные препараты Контроль, Р.уеггиси/ояит В1-221-151

Тандем Ксиланазная 7,59±0,38 14,54±0,73 545±27

Авицелазная 0,66±0,03 0,61±0,03

КМЦ-азная 12,74±0,64 16,21±0,81

Целлобиазная 17,78±0,89 0,17±0,01

Дуплет Ксиланазная 4,37±0,22 -19,48±0,97 14,54±0,73 543±22 - 968±48

Авицелазная 0,43±0,02 -0,91±0,05 0,61±0,03

КМЦ-азная 10,24±0,51 -Зб,11±1,81 16,21±0,81

Целлобиазная 1,76±0,09 -17,78±0,89 0,17±0,01

Триплет Ксиланазная 6,63±0,33 -20,78±1,04 14,54±0,73 510±26 - 886±44

Авицелазная 0,52±0,03 -0,85±0,04 0,61±0,03

КМЦ-азная 9,74±0,49 -26,28±1,31 16,21±0,81

Целлобиазная 1,17±0,06 -22,60±1,13 0,17±0,01

Анализируя данные, приведенные в табл.4, следует заключить, что целевые активности различных ферментных препаратов варьируют в широком диапазоне значений и превосходят значения соответствующих активностей контрольного ферментного препарата, полученного с помощью продуцируемого исходным штаммом Ржггисиїозит В1 -221-151.

рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность ферментных препаратов. Важными характеристиками ферментных препаратов являются рН- и температурные оптимумы целевых активностей, а также их стабильность при различных температурах - эти параметры во многих случаях являются ключевыми при выборе ферментов для конкретных биотехнологических процессов. Данные по изучению рН и температурных оптимумов, а также рН и температурной стабильности (рН50% и Т50% - интервал значений рН и температур, при которых активности ФП выше 50% от максимального значения) ферментных препаратов суммированы в табл.5.

Исследуемые ферментные препараты имели значения рН-оптимумов целлобиазной, КМЦ-азной и авицелазной активности, расположенные в слабокислой области (рН 4,5-5,5), значения температурных оптимумов варьировались от 50 до 60°С. Диапазоны значений рН50% составили рН 3,5-6,5, Т50% 35-65°С. ФП проявляли наибольшую стабильность при 50°С, наименьшую - при 70°С.

2. Состав мультиферментных комплексов рекомбинантных ферментных препаратов

Эффективность процесса получения Сахаров из ЦСМ в значительной степени зависит от состава мультиферментного комплекса и кинетического взаимодействия индивидуальных ферментов этого комплекса. Знания о количественном составе мультиферментных комплексов позволят найти объяснение результатам осахаривания определенных видов ЦСМ и оптимизировать состав целлюлазных и гемицеллюлазных мультиферментных композиций для достижения максимальной эффективности процесса осахаривания ЦСМ.

В нашей лаборатории была разработана хроматографическая схема эффективного и быстрого разделения ферментных препаратов на основе штаммов Руеггиси1о$ит. Схема включает три стадии:

• обессоливание исходного препарата методом гельпроникающей хроматографии;

• грубое фракционирование ферментного комплекса (ионообменная хроматографии на носителе Боигсе 15(3), с последующим анализом специфических активностей собранных белковых фракций (на рис.6 в качестве примера представлена хроматограмма разделения ферментного препарата «тандем» рГл+ЭГН);

• тонкую очистку, включающую дополнительное разделение (гидрофобная хроматография на носителе Source 15ISO) белковых фракций, полученных в ходе предыдущей стадии, с последующим анализом специфических активностей полученных фракций, а также проведением ДДС-электрофореза;

ЦБ Г И 60 к Да ЦБ Г И 50кДа

Рисунок 6. Хроматографический профиль препарата (ЗГл+ЭГИ при разделении на ионообленном носителе Source 15Q при рН 6,8.

Зная содержания белка и удельную активность соответствующих ферментов во фракциях, определяли компонентный состав ФП. Результаты, характеризующие компонентный состав наиболее эффективных по нашей оценке рекомбинантных ферментных препаратов точки зрения осахаривания ЦСМ, а также контрольного ферментного препарата P.verruculosum В1-221-151, представлены в табл.6.

Таблица 5. рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, температурная стабильность ферментных препаратов.

Название препарата Тандем Дуплет Триплет Тандем Дуплет Триплет Тандем Дуплет Триплет

рГл+ЭГИ рГл-ЦБГІІР.у рГл-ЦБГН_Р.у-ЭГП-1 РГл+ЭГИ рГл-ЦБГП_Р.у. рГл-ЦСГПРл-ЭГН-1 РГл+ЭГИ рГл-ЦБГП_Р.у. рГл-ЦБГП_Р.у-ЭГП-1

Активность по субстрату Целлобиоза МКЦ КМЦ

рН-оптимум (рН5„%) 4,5 (3,5-6,0) 5,0 (3,0-6,5) 5,0 (3,5-6,0) 5,5 (3,5-7) 5,5 (4,0-6,0) 4,5 (3,5-6,0) 5,0 (4,0-6,5) 4,5 (4,0-6,5) 5,0 (3,0-6,5)

Т-оптимум (Т»%) 60 (40-65) 60 (35-65) 60 (40-65) 60 (40-65) 60 (40-65) 50 (45-57) 50 (40-55) 50 (40-55) 50 (40-55)

Время полуинактивации при рН 5,0, мин 50°С 140 180 120 >180 >180 >180 >180 >180 >180

60°С 6,1 6,8 5 100 >180 >180 80 55 95

70°С 2,7 2,9 2,6 >5 30 25 4 2,5 4,5

Таблица 6. Компонентный состав наиболее эффективных с точки зрения осахаривания ЦСМ ферментных препаратов.

Ферментный препарат Целевые гены Содержание основных компонентов в препарате, %

ЦБГ 166 ЦБГ 155 ЦБГ II 60 ЦБГ II 50 ЭГЕ р-Гл 116 Р.уеггис и1о\цгп (!-Гл 120 Лмі^ґг Ксилг

РГл+ЭГН «тандем» Р-Гл Л.л., ЭГП Р. V. 20 ±2 10 ±1 7,0 ±0,7 7,5 ± 0,7 10± 1 2,0 ± 0,1 30 ±1 1,0 ±0,1

рГл-ЦБГН_Р.у. «дуплет» Р-ГлЛ.п., ЦБ Г II Р. V 35 ±3 18±2 11 ±1 12 ±1 13 ±1 2,0 ±0,1 8,0 ±0,8 3,0 ±0,3

рГл-ЦБГИ Р.у-ЭГП-1 «триплет» Р-Гл Л.п., ЦБГII Р.у ЭГ II Р. V. 17 ±1 35 ±3 5,0 ± 0,5 6 ±0,6 25 ±3 1,0 ±0,1 3,0 ±0,3 2,0 ± ОД

В1-221-151 Контроль 20±2 15±2 17±2 17±2 1б±2 4,0± 0,4 0 4,0* 0,4

Анализ данных о компонентном составе полученных ферментных препаратов позволили выдвинуть следующие предположения:

1. Наибольшей осахаривающей способностью по отношению к измельченной МКЦ будет обладать препарат рГл-ЦБГНР.у. вследствие высокого содержания ЦБГ1 и ЦБГП, а также достаточного количества гетерологичной РГЛ 120 \aJ\AA.niger.

2. При гидролизе измельченной и обессмоленной сосновой древесины лучшим окажется ферментный препарат рГл-ЦБГ11_Р.у-ЭГ11-1. Данный препарат содержит в своем составе большое количество слабо адсорбирующихся целлобиогидролаз без целлюлозосвязывающего домена (ЦСД) - ЦБГ1 55 кДа и ЦБГП 50 кДа, а также обладает высокой целлобиазной активностью. Это позволит ему быстро эффективно осахаривать ЦСМ, содержащие большое количество, как целлюлозы, так и лигнина. Можно предположить, что отсутствие ЦСД будет способствовать уменьшению непродуктивной адсорбции целлюлаз на лигнине.

3. Наиболее эффективным ферментным препаратом при гидролизе измельченной осины и багассы будет рГл-ЦБГ11_Р.у-ЭГ11-1. Как отмечалось ранее, данный вид ЦСМ отличается наличием большого количества аморфных участков целлюлозы, а также гемицеллюлоз, представленных ксиланами.

Высокое содержание эндоглюканаз, гидролизующие преимущественно аморфные участки целлюлозы, а также высокая ксиланазная активность, позволят ферментному препарату (ЗГл-ЦБГН_Р.у-ЭГН-1 эффективно расщеплять эти участки, а так же увеличить доступность целлобиогидролаз к целлюлозным микрофибриллам за счет разрушения гемицеллюлозной матрицы.

3. Анализ осахаривающей способности новых ФП по отношению к различным видам ЦСМ.

На данном этапе работы было проведено исследование осахаривающей способности полученных новых ФП. В качестве субстратов использовали измельченные МКЦ, осиновую древесину и багассу, а также измельченную и обессмоленную сосновую древесину. Эффективность осахаривания зависит как от качественного и количественного состава ФП, так и от эффективности предобработки и состава предобработанных субстратов. Таким образом, результаты гидролиза различных предобработанных субстратов позволят понять, какой компонентный состав ФП наилучшим образом подходит для осахаривания конкретного вида ЦСМ.

Гидролиз проводили в течение 48 часов при 50°С и различной дозировке ФП по белку (2, 5 и 10 мг белка на 1 г субстрата). Через 3, 24 и 48 часов из реакционной смеси отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию восстанавливающих Сахаров (ВС) и глюкозы.

В качестве контрольных препаратов были использованы: препарат В1-221-151, полученный на основе исходного штамма РуеггисиЫит, коммерческие ферментные препараты целлюлаз с низкой р-глюкозидазной активностью - Ксибетен-Целл, Сс11ис1а51 1.5Ь и Брегуте СР и препараты целлюлаз, обладающие высокой Р-глюкозидазной активностью -АссеИегаБеЮОО, СеШсС1ес 1 (данные по активностям контрольных препаратов представлены в табл.7).

Таблица 7. Удельная активности контрольных ферментных препаратов по отношению к различным субстратам (50°С, рН 5,0).

Название ферментного препарата Содержание белка, мг/г (*мг/мл) КМЦ-аза Авицелаза Целлобиаза Ксиланаза

Контроль, препарат Р. уеггисиїояит В1-221-151 900±36 14,9±0,6 0,60±0,03 0,73±0,03 15,0±0,6

Ксибетен-Целл 284±11 10,9±0,4 0,92±0,04 0,120±0,005 1,8±0,1

8ре?.уте СР* 118±5 27,7±1,1 2,02±0,08 0,25±0,01 7,5±0,3

СеИис^ 1.51/ 184±7 17,5±0,7 1,29±0,05 0,080±0,003 2,9±0,1

АссеНегаеЮОО* 103±4 30,7±1,2 2,11±0,08 1,18±0,05 3,3±0,1

СеШсОес 1* 182±7 11,3±0,5 0,26±0,01 2,69±0,11 1,4±0,1

На рис.7 представлены результаты гидролиза - в данном случае приведены выходы глюкозы и ВС за 24 часа при дозировке ФП 5 мг/г субстрата. Наиболее эффективными с точки зрения осахаривания измельченной МКЦ оказались препараты рГл-ЦБГИР.у. (содержащий гетерологичную РГЛ A.niger и гомологичную СВНН Р .\crruculosum) и рГл+ЭГП (содержащий гетерологичную РГЛ A.niger и гомологичную ЭГП Р.уеггиси1ояит), обладающие наиболее высокой среди полученных рекомбинантных ФП удельной авицелазной активностью - 0,91 ед/мг и 0,66 ед/мг. Кроме того, значительные выходы глюкозы и большую степень конверсии целлюлозы обеспечивала высокая целлобиазная активность новых препаратов.

Лучшими при гидролизе измельченной обессмоленной сосновой древесины оказались препараты рГл-ЦБГП_Р.у-ЭГН-1 и рГл-ЦБГН_Р.у. с повышенным содержанием рекомбинантных ферментов, приводя к образованию одинакового количества глюкозы (40 г/л) и ВС (42 г/л). Однако, в отличие от ферментного препарата рГл-ЦБГП_Р.у, препарат рГл-ЦБГИР.у-ЭПМ достигает предельных значений выходов конечных продуктов уже через 24 часа.

Наиболее эффективным рекомбинантным ФП при гидролизе измельченной осиновой древесины оказался «триплет» рГл-ЦБГПР.у-ЭПЫ, обладающий повышенным содержанием соответствующих рекомбинантных ферментов, выходы глюкозы и ВС в обоих случаях составили 45 г/л. Отметим, что высокие выходы глюкозы и ВС показал ФП рГл-ЦБГН_Р.у.

Рисунок 7. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 24 часа гидролиза различных природных целлюлозосодержащих материалов: А) имельченная МКЦ Б) измельченная и обессмоленная сосна; В) измельченная осина; Г) измельченная багасса. Условия: 50°С, рН 5, [S]= 100 г/л, [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 250 об/мин.

При гидролизе измельченной багассы наиболее эффективным оказался препарат рГл-ЦБГ11_Р.у-ЭГ11-1 с повышенным содержанием гетерологичной РГЛ А. niger и гомологичной ЭГН Р.чгггисиїотт.

В табл.7 представлены более подробные данные, характеризующие увеличение выхода ВС и глюкозы при гидролизе разных видов ЦСМ при использовании различных групп рекомбинантных ФП по сравнению с контрольным препаратом, полученным с помощью исходного штамма Руеггисиїозит В1-221-151.

Таблица 8. Выход ВС и глюкозы при гидролизе лучшими препаратами различных

видов измельченных ЦСМ (100 г/л): [Е]= 5 мг/г субстрата, 50°С, pH 5,0.

Субстрат Лучшие препараты Время гидролиза, ч Выход конечных продуктов, г/л Увеличение выхода по сравнению с контрольным препаратом В1-221-151, %

Глюкоза ВС Глюкоза ВС

мкц рГл-ЦБГН_Р.у. 3 14,9±0,7 15,0±0,8 124 93

24 45,5±2,3 46,4±2,3 117 102

48 49,8±2,5 50,6±2,5 105 98

рГл+ЭГП 3 15,5±0,8 16,7±0,8 133 114

24 35,3±1,8 35,8±1,8 69 56

48 39,3±2,0 40,2±2,0 62 58

Сосновая древесина рГл-ЦБГІІ Р.у-ЭГП-1 3 18,7±0,9 23,2±1,2 124 94

24 38,3±1,9 40,1±2,0 50 32

48 39,5±2,0 42,0±2,1 32 15

Осиновая древесина рГл-ЦБГН_Р.у. 3 16,9±0,8 18,4±0,9 87 50

24 32,2±1,6 32,5±1,6 16 3

48 40,0±2,0 42,1±2,1 23 14

РГл-ЦБГІІ Р.у ЭГП-1 3 16,0±0,8 16,5±0,8 77 34

24 39,2±2,0 40,7±2,0 41 28

48 44,6±2,2 45,7±2,3 37 24

3 12,9±0,6 19,4±1,0 52 54

рГл-ЦБГН_Р.у. 24 28,6±1,4 37,7±1,9 5 18

48 35,3±1,8 42,2±2,1 14 23

ВГл-ІГБГГГ Р V- 3 12,7±0,б 19,4±1,0 49 54

ЭГП-1 24 32,2±1,6 39,5±2,0 19 24

48 38,3±1,9 46,1±2,3 24 34

Анализируя данные, представленные в табл.8, можно сделать следующее заключение:

• при гидролизе измельченной МКЦ и измельченной и обессмоленной сосновой древесины наиболее эффективными оказались препараты «дуплет» рГл-ЦБГИ_Р.у. (с увеличенным содержанием рГЛ A.niger) и препарат «триплет» рГл-ЦБГП_Р. v-ЭГП-1 (с увеличенным содержанием ^ГП A.niger и ЭГН P.verruculosum), соответственно.

• при гидролизе измельченных осиновой древесины и багассы наиболее эффективным был препарат рГл-ЦБГП_Р.у-ЭГП-1.

• реакционная способность различных видов ЦСМ уменьшается в ряду: измельченная МКЦ > измельченная осиновая древесина > измельченная и обессмоленная сосновая древесина > измельченная багасса.

ВЫВОДЫ

1. Впервые с помощью метода одновременной трансформации несколькими плазмидами, несущими индивидуальные гены гомологичных и гетерологичных целлюлаз, грибного штамма-реципиента Penicillum verruculosum, созданы новые рекомбинантные штаммы, обладающие способностью к повышенной продукции гетерологичной р-глюкозидазы Aspergillus niger, а также штаммы с увеличенным уровнем продукции гомологичных эндо-1,4-р-глюканазы II и целлобиогидролазы II.

2. Анализ компонентного состава ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum рГл+ЭГН (с увеличенным содержанием рГЛ A.niger), рГл-ЦБГН_Р.у и рГл-ЦБГИ_Р. v-ЭГП-1 (с увеличенным содержанием РГЛ A.niger и ЭГП P.verruculosum) показал, что содержание рекомбинантных ферментов в них составляет 2-30% от общего пула секретируемого белка, при этом в целом сохраняется состав целлюлолитического комплекса реципиентного штамма P.verruculosum.

3. Ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантных

штаммов P. verruculosum, значительно эффективнее гвдролизуют различные виды

предобработанных хвойной и лиственной древесины, а также багассы,

обеспечивая увеличение выхода восстанавливающих Сахаров и глюкозы на 19-50%

21

по сравнению с коммерческими ферментными препаратами, полученными с использованием штаммов гриба рода Trichoderma, и препаратами, полученными на основе исходного штамма P. verruculosum.

4. Исследованы физико-химические и биохимические свойства ферментных препаратов, обладающих наибольшей осахаривающей способностью. Установлено, что оптимумы действия ферментных препаратов располагаются в области рН 3,5-6,5 и при температурах от 50 до 60°С, а также стабильны в температурном диапазоне 35-65°С.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Синицына О.А., Федорова Е.А., Правильников А.Г.. Рожкова А.М„ Скомаровский А.А., Матыс В.Ю., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Выделение и свойства ксилоглюканаз Pénicillium sp., Биохимия, 2010, т.75, вып. 1, стр. 52-62.

2. О. Г. Короткова, А.М. Рожкова, В.Ю. Матыс, А.В. Кошелев, О.Н. Окунев, А.Г. Правильников, Р.М. Андрианов, В.А. Немашкалов, Н.В. Цурикова, О.А. Синицына, А.П. Синицын. Применение нового комплексного ферментного препарата при переработке целлюлозосодержащей биомассы. Хранение и переработка сельхозсырья, 2011, №7, вып.201, стр.44-47.

Тезисы докладов.

1. Sinitsyn А.Р ., Sinitsyna О.A., Zorov I.N., Fedorova Е.А., Rozhkova А.М., Pravilnikov A.G.. Bushina E.V., Kondrateva E.A., Satrutdinov A.D., Sereda A.S., Volkov P.V., Bekkarevich A.O., Koshelev A.V., Bubnova T.V., Matys V.Yu., Okunev O.N., Chulkin A.M., Vavilova E.A., Vinetsky Yu.P. Pénicillium canescens as a perspective fungal host strain for production of commercial recombinant enzymes. Abstracts of International Conférence «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals& Applications», 19-24 June, Arkhangelsk, p. 110.

2. Осипов Д.О., Рожкова A.M., Правильников А.Г., Зоров И.Н., Синицын А.П. Высокоэффективный комплекс гемицеллюлаз рекомбинантных штаммов микромицета Pénicillium sp. для ферментативного гидролиза хвойной древесины. Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике «EURASIABIO 2010», 12-15 Апреля, Москва, стр.140.

22

3. Синицын А.П., Синицына О.А., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Федорова Е.А., Семенова М.В., Саттрудинов А.Д., Короткова О.Г., Андрианов Р.М., Правильников А.Г.. Волков П.В., Осипов Д.О., Бушина Е.В., Кондратьева Е.А., Гусаков А.В., Немашкалов В.А., Беккаревич А.О., Матыс В.Ю., Бубнова Т.В., Кошелев А.В., Окунев О.Н. Комплекс ферментов для эффективного осахаривания лигноцеллюлозных материалов, Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике «EURASIABIO 2010», 12-15 Апреля, Москва, стр. 162-163.

4. Правильников А.Г., Проскурина О.В., Синицын А. П., Получение оптимального гидролитического комплекса на основе целлюлаз Pénicillium sp. и 0-глюкозидазы Aspergillus japonicus для эффективного осахаривания лигноцеллюлозного сырья, VI Московский Международный Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Москва, 21-25 марта 2011 г, Часть1, Секция 4, стр 366-367

5. Короткова О.Г., Правильников А.Г., Немашкалов В.А., Рожкова А.М., Синицын А.П., Гидролитическая способность новых ферментных препаратов на основе гриба Pénicillium verruculosum, VI Московский Международный Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Москва, 21-25 марта 2011 г, Часть1, Секция 4, стр. 326-328.

Подписано в печать 21.02.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 50 экз. Заказ № 1184 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Правильников, Артем Геннадиевич, Москва

61 12-2/404

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А.Н. Баха РАН

На правах рукописи

Г

Правильников Артем Геннадиевич

Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н., проф. Синицын А.П.

Москва - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................................................................................8

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ РАСТЕНИЙ И ИХ

СВОЙСТВА........................................................................................................................................................................................................8

1.1. Целлюлоза..................................................................................................................................................................................................9

1.2. Гемицеллюлозы и пектины........................................................................................................................................................11

1.3. Лигнин.........................................................................................................

ГЛАВА 2. ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЖЕРЖАЩИЕ МАТЕРИАЛЫ (ЦСМ)............................................................15

2.1. Общая характеристика состава ЦСМ..............................................................................................................................................................^

2.2. ЦСМ как перспективный источник сырья и энергии..........................................................................................17

2.3. Предобработка целлюлозы и целлюлозосодержащих материалов........................................................19

ГЛАВА 3. БИОКАТАЛИТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ЦСМ................................................................................21

3.1. Современная классификация целлюлаз....................................................................................................................................................21

3.2. Основные ферменты целлюлолитического комплекса....................................................................................22

3.3. Механизм биокаталитической деградации целлюлозы....................................................................................25

3.4. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы..................28

ГЛАВА 4. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ НОВЫХ ШТАММОВ-

ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗ....................................................................................................................................................................31

4.1. Общая характеристика подходов к оптимизации состава ферментных комплексов.... 31

4.2. Система экспрессии в грибах рода Pénicillium....................................................................................................34

II. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................................................................................................................39

ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ....................................39

5.1. Ферментные препараты............................................................................................................................................................39

5.2. Субстраты..............................................................................................................................................................................................39

5.3. Прочие реактивы..............................................................................................................................................................................39

5.4. Хроматографические сорбенты............................................................................................................................................40

5.5. Получение протопластов и проведение трансформации штамма-реципиента гриба Р. verruculosum....................................................................................................................................................................................................40

5.6. Культивирование трансформантов................................................................................................................................42

5.7. Метод определения компонентного состава ферментных препаратов..........................................42

5.8. Определение концентрации белка....................................................................................................................................43

5.9. Определение биохимических характеристик ферментов..........................................................................43

5.10. Методы определения активности ферментов......................................................................................................43

5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков......................................45

5.12. Определение температурного и pH-оптимума действия ферментных препаратов..........46

5.13. Изучение термостабильности ферментных препаратов............................................................................46

5.14. Гидролиз ЦСМ..............................................................................................................................................................................46

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................................................................48

ГЛАВА 6. Получение ферментных препаратов, полученных с помощью новых

рекомбинантных штаммов Р. verruculosum..............................................................................................................................48

6.1. Трансформация штамма - реципиента Р.verruculosum 537........................................................................49

6.2. Результаты первичного скрининга трансформантов «тандем»............................................................50

6.3. Результаты первичного скрининга трансформантов «дуплет»............................................................52

6.4. Результаты первичного скрининга трансформантов «триплет»..........................................................55

6.5. Получение сухих ферментных препаратов............................................................................................................58

ГЛАВА 7. Физико-химические свойства новых ферментных препаратов, полученных с

помощью рекомбинантных штаммов Р. verruculosum....................................................................................................59

7.1. Анализ ферментных препаратов методом ДДС-электрофореза в денатурирующих условиях..................................................................................................................................................................................................................59

7.2. Анализ активностей ферментных препаратов по отношению к различным субстратам............................................................................................................................................................................................................59

7.3. pH- и температурные оптимумы активности и стабильности ферментных препаратов............................................................................................................................................................................................................63

ГЛАВА 8. Определение компонентного состава новых рекомбинантных ферментных

препаратов............................................................................................................................................................................................................69

глава 9. верификация уровня экспресии ферментов новых рекомбинантных штаммов р. УЕшисиюзим осахаривающей

СПОСОБНОСТЬЮ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ЦСМ............................................................................................................75

9.1. Результаты гидролиза измельченной микрокристаллической целлюлозы................................76

9.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины..............................78

9.3. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины......................................................................82

9.4. Результаты гидролиза измельченной багассы......................................................................................................85

Выводы................................................................................................................................................................................................................89

Список литературы.............................................................................................................................90

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Ферменты

ЦБГ - целлобиогидролаза ЭГ - эндоглюканаза рГЛ - р-глюкозидаза Ксил - ксиланаза КГ - ксилоглюканаза

Прочие сокращения

ЦСМ - целлюлозосодержащие материалы

ЦСД - целлюлозосвязывающий домен

КЖ - культуральная жидкость

ВС - восстанавливающие сахара

ИЭФ - изоэлектрофокусирование

КМЦ - Ка-соль карбоксиметилцеллюлозы

МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза

ПААГ - полиакриламидный гель

ДДС-Ыа - додецидсульфат натрия

ПГУ - К-соль полигалактуроновой кислоты

/?НФ - и-нитрофенол

иНФГ - я-нитрофенил-Р-Б-глюкопиранозид СП - степень полимеризации

ДДС-ЭФ - электрофорез в денатурирующих условиях

ГКА - гидрофобный кластерный анализ

МУФ - метилумбеллиферил

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПАВ - поверхностноативные вещества

ВВЕДЕНИЕ

В современном мире четко прослеживается тенденция к приоритетному развитию альтернативной энергетики, основанной на возобновляемых источниках энергии, и к сокращению доли углеводородного сырья в глобальном энергетическом балансе.

Общие запасы на Земном шаре возобновляемого сырья, представляющего собой растительную биомассу, оцениваются в приблизительно в 800-1000 млрд. т, причем ежегодно в результате фиксации 1021 кал солнечной энергии образуется примерно 50 млрд. т биомассы, а также накапливается около 4-5 млрд. т отходов или вторичных продуктов промышленной и сельскохозяйственной переработки растений и древесины [1,2].

Таким образом, в растительная биомасса играет роль возобновляемого источника сырья, в том числе для получения биотоплива и сможет конкурировать с нефтью.

Главным компонентом растительной биомассы являются природные полисахариды - целлюлоза и гемицеллюлоза. Их биодеградация осуществляется под действием целлюлазных и гемицеллюлазных мультиферментных комплексов. Целлюлазы включают в себя эндоглюканазы, целлобиогидролазы и Р-глюкозидазы; гемицеллюлазы представлены ксиланазами, (3-ксилозидазами, маннаназами, арабиназами, галактаназами и рядом других ферментов.

В настоящее время на мировом рынке представлен широкий спектр ферментных препаратов, полученных с помощью грибов рода Тпскойегта. Эти препараты традиционно применяются для гидролиза растительного сырья, однако они обладают рядом существенным недостатком, заключающимся в относительно низкой эффективности гидролиза - в первую очередь из-за того, что в составе ферментных комплексов ТпсЪо(1егта наблюдается недостаток Р-глюкозидазы (целлобиазы), что приводит к накоплению в реакционной смеси в качестве одного из продуктов целлобиозы, которая ингибирует наиболее важные для осахаривания ферменты целлобиогидролазы.

Эффективность процесса получения Сахаров зависит от ряда факторов и в значительной степени - от состава комплекса целлюлолитических ферментов и синергетического взаимодействия индивидуальных ферментов в нем.

Поэтому в настоящее время в области ферментативного гидролиза возобновляемого растительного сырья весьма активно развиваются фундаментальные и прикладные исследования, направленные на поиск и получение новых штаммов-суперпродуцентов целлюлаз, гемицеллюлаз и сопутствующих ферментов, обладающих высокой гидролитической способностью и имеющих «управляемый» состав ферментов,

так, чтобы комплекс продуцируемых ферментов был наилучшим образом адаптирован к осахариванию соответствующих видов целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ).

Грибы рода Pénicillium, в отличие от Trichoderma, продуцируют комплексы целлюлитических ферментов более сбалансированного состава, которые эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие материалы [3].

Таким образом, создание новых рекомбинантных штаммов на основе штамма гриба P.verruculosum, продуцирующих мультиферментные комплексы карбогидраз, обладающих улучшенной осахаривающей способностью по отношению к природному растительному сырью, является важной и актуальной задачей, поскольку применение данных мультиферментных комплексов будет способствовать увеличению эффективности процессов переработки целлюлозосодержащих материалов.

Ранее нами были разработаны подходы к получению эффективных ферментных препаратов, основным из которых является создание штаммов-продуцентов, содержащих индивидуальные целевые гены целлюлаз. Стратегия создания таких штаммов-продуцентов заключалась в последовательной трансформации штамма-реципиента одной плазмидой, несущей целевой ген, совместно с ко-трансформацией плазмидой pSTAlO, позволяющей отбирать трансформанты при культивировании на селективной среде. Основываясь на данных по встройке отдельных целевых генов и распределению целевых активностей в конечных ферментных препаратах, нами была разработана новая стратегия получения штаммов-продуцентов с заданными свойствами, заключающаяся в одновременной трансформации штамма-реципиента несколькими плазмидами с целевыми генами, а также трансформация экспрессионной кассетой, представляющей собой линейный участок ДНК с несколькими целевыми генами.

Целью диссертационной работы являлось получение новых рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum и ферментных препаратов на их основе, обладающих увеличенной осахаривающей способностью.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• получить экспрессионные плазмиды, содержащие гены целлюлаз (эндо-1,4-ß-глюканазы II (egl2) P.verruculosum), целлобиогидролазы II (cbhll)) Trichoderma reesei и P.verruculosum и ß-глюкозидазы Aspergillus niger под контролем сильного индуцибельного промотора целлобиогидролазы I (cbhl);

• провести трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD~) и осуществить скрининг трансформантов на целевые активности;

• исследовать каталитические, физико-химические и биохимические свойства новых ферментных комплексов, продуцируемых полученными новыми рекомбинантными штаммами;

• определить компонентный состав ферментных комплексов;

• проанализировать осахарившощую способность наиболее перспективных ферментных комплексов по отношению к различным видам цел л юл о з о с о держат ни х материалов (измельченной багассе, измельченной обессмоленной сосновой древесине, измельченной осиновой древесине и микрокристаллической целлюлозе) и сравнить ее с осахаривающей способностью имеющихся коммерческих и лабораторных ферментных препаратов.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ РАСТЕНИЙ И ИХ СВОЙСТВА

Клеточные стенки растений - основная часть органической материи па Земле. Их основными компонентами являются:

1. Полисахариды

2. Лигнин

3. Структурные белки

Компоненты клеточной стенки делятся на: целлюлозу, гемицеллюлозу, пектин, лигнин и белки, выполняющие, по-видимому, структурную роль, и, в некоторых случаях, неорганические включения, главным образом карбонаты и силикаты кальция [4, 5, 6, 7, 8].

Пектин

Целлюлозные м и кро фибриллы

Ге ми целлюлоза

Растворимые белки

Рисунок 1. Упрощенная схема строения клеточной стенки растений.

С точки зрения получения полезных продуктов, наиболее важными химическими компонентами клеточной стенки растений являются полисахариды: молекулы целлюлозы, собранные в сложные пучки - фибриллы, образующие каркас, погруженный в основу (матрикс), состоящий из гемицеллюлоз, пектинов и гликопротеидов (рис. 1). Молекулы целлюлозы состоят из большого числа линейно расположенных мономеров - остатков глюкозы. Целлюлоза очень стойка, не растворяется в разбавленных кислотах и даже в концентрированных щелочах. Целлюлозный скелет придает клеточной оболочке механическую прочность. Первоначально число микрофибрилл, образованных молекулами целлюлозы, в клеточной стенке относительно невелико, но с возрастом оно увеличивается, и клетка теряет способность к растяжению.

Гемицеллюлозы отличаются от целлюлозы составом мономеров и разветвленным их расположением в молекулах. Являясь одним из компонентов пластичного матрикса, гемицеллюлозы придают клеточной стенке дополнительную прочность, но почти не препятствуют ее росту. Гемицеллюлозы могут быть и запасными веществами, так как легко гидролизуются. Кроме гемицеллюлоз, в матрикс, а также в срединную пластинку входят пектиновые вещества, или пектины, и полисахариды, образованные мономерами -уроновыми кислотами. Эти вещества скрепляют, склеивают оболочки соседних клеток. Молекулы гемицеллюлоз, пектина и гликопротеидов соединяют целлюлозные микрофибриллы.

Помимо полисахаридов, в матриксе стенок многих клеток часто обнаруживаются неуглеводные компоненты, например лигнин - полимерное вещество полифенольной природы. Содержание его в стенках некоторых видов клеток может достигать 30%.

Стенки некоторых типов клеток могут включать слои липидов: воска, кутина и суберина. Кутин и воск обычно покрывают наружные стенки клеток эпидермы. Слой кутина создает на поверхности растения водо- и воздухонепроницаемый слой кутикулы. Суберин пропитывает стенки. Он непроницаем для воды и газов, поэтому такая суберинизированная, или опробковевшая, клетка быстро отмирает.

Остановимся подробно на основных компонентах растительной клеточной стенки.

1.1. Целлюлоза

Целлюлоза содержится в древесине, однолетних растениях, травах, льне, хлопке, конопле, в оболочках семян плодов, в морских и пресноводных водорослях. В природе встречается также бактериальная и животная целлюлоза (некоторые ракообразные и улитки) [9].

По молекулярному строению целлюлоза представляет собой линейный полимер, ангидридные звенья которого связаны Р-1,4-Б-глюкозидными связями (рис. 2). Степень полимеризации (СП) нативной целлюлозы может составлять более 10 тыс., а молекулярная масса - более 1,5 млн. [10, 11]. Длина одного ангидроглюкозного звена составляет 5,5 А, следовательно, длина молекулы целлюлозы будет около 5 мкм.

СП целлюлозы меняется в зависимости от фазы роста растений. На ранних стадиях она имеет низкую СП и обладает высокой пористостью и со