Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые высокоэффективные ферментные препараты для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих субстратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Новые высокоэффективные ферментные препараты для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих субстратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium"

На правах рукописи

БУШИНА ЕКАТЕРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

НОВЫЕ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ГИДРОЛИЗА ПЕКТИН- И ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ СУБСТРАТОВ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА PENICILLIUM

03.01.06 - биотехнология (в том числе нанобиотехнология) 02.00.15 - кинетика и катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 О ЯНВ 2013

МОСКВА-2012

005048222

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Синицын Аркадий Пантелеймонович кандидат химических наук Рожкова Александра Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, зав. лабораторией физиологически активных биополимеров Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук Ямсков Игорь Александрович

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией молекулярных основ биотрансформаций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук Королева Ольга Владимировна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

РАН, г. Пущино

Защита состоится « 25 » декабря 2012 года в 15°° часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 23 » ноября 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

Актуальность темы. В настоящее время существует широкий спектр полезных продуктов, производимых на основе возобновляемого сырья растительного происхождения. Так, из растительных материалов с высоким содержанием пектиновых веществ производят различные пищевые продукты, например, сахар, вина, плодово-овощные соки и пюре, ягодные морсы и т.д. Применение ферментных препаратов, обладающих высокой гидролитической способностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим субстратам, позволяет увеличить выход целевых конечных продуктов, способствует повышению качества и улучшению их органолептических показателей.

Ферментативный гидролиз также является ключевым звеном в процессе переработки отходов пищевой промышленности. Полученные в результате гидролиза простые сахара в последующих стадиях используют в качестве основы для получения различных полезных продуктов -топлива (метана, этанола), исходных соединений для получения полимеров (изопрена, янтарной кислоты), кормовых добавок (ветеринарных антибиотиков, аминокислот, кормовых дрожжей, ферментных препаратов и пр.). Отметим, что в последние десятилетия особое значение приобрела концепция переработки природных ресурсов, реализация которой подразумевает снижение выбросов в окружающую среду отходов производства, более рациональный подход к использованию растительного сырья - извлечение из него максимума полезных продуктов.

Наиболее многотоннажным отходом пищевой промышленности России является свекловичный жом - отход производства сахара из сахарной свёклы. По данным Росстата за 2009 год, только малая его часть - 13 %, используется как кормовая добавка, большая же часть жома остается невостребованной. Существующие избытки свекловичного жома целесообразно использовать для получения различных полезных продуктов.

Одним из основных этапов переработки отходов растительного происхождения является превращение сложных полисахаридов клеточной стенки растений в простые сахара. Эффективность проведения этого процесса определяет выход конечного продукта и экономическую целесообразность процесса переработки растительного сырья в целом. Основу клеточной стенки растений с высоким содержанием пектиновых веществ, к которым, в частности, относится сахарная свёкла, составляют волокна целлюлозы, покрытые слоем гемицеллюлоз. Пространство между волокнами заполняют пектиновые вещества, снижающие доступ соответствующих ферментов к целлюлозе и гемицеллюлозам. Следовательно, комплекс ферментов для эффективного превращения

з

такого сырья в простые сахара помимо целлюлаз и гемицеллюлаз, обеспечивающих гидролиз соответствующих полисахаридов, должен также содержать пектиназы, способствующие повышению эффективности гидролиза за счет разрушения пектиновых веществ.

Коммерческие ферментные препараты, применяемые по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим материалам, можно разделить на две категории. К первой принадлежат ферментные препараты с высоким содержанием пектолитических ферментов, используемые при производстве пищевых продуктов и обладающие относительно невысокой гидролитической способностью по отношению к целлюлозе и гемицеллюлозам. Ко второй категории относятся ферментные препараты целлюлаз и гемицеллюлаз, предназначенные для гидролиза растительной биомассы с низким содержанием пектиновых веществ и не обеспечивающие высокоэффективный гидролиз пектин- и целлюлозосодержащих материалов вследствие вышеупомянутых особенностей их строения. Ферментные препараты, содержащие в оптимальном соотношении пектиназы, целлюлазы и гемицеллюлазы, на рынке не представлены. Согласно литературным данным, гидролиз пектин- и целлюлозосодержащих отходов пищевой промышленности, например, выжимок различных цитрусовых, проводят смесью ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз, подбирая их оптимальное соотношение для каждого конкретного вида сырья. В условиях современного биотехнологического производства приготовление смесей ферментных препаратов является нецелесообразным, поскольку вносит дополнительную стадию в технологическую схему переработки отходов и увеличивает расходы.

В ходе систематических исследований, проводимых в нашей лаборатории, было показано, что комплекс внеклеточных ферментов гриба Pénicillium verruculosum по гидролитической способности в отношении лигноцеллюлозных материалов превосходит ферментный комплекс гриба Trichoderma reseei, наиболее часто использующийся в качестве основы для производства коммерческих ферментных препаратов целлюлаз. Кроме того, было показано, что гриб Pénicillium canescens секретирует эффективный комплекс гемицеллюлаз. Однако пектолитические ферменты являются минорными компонентами комплекса внеклеточных ферментов как P.canescens, так и P.verruculosum. Следовательно, создание продуцентов ферментов-карбогидраз (пектиназ и других недостающих ферментов) на основе штаммов грибов P.canescens и P.verruculosum с последующим получением ферментных препаратов оптимального состава на их основе, обладающих высокой гидролитической способностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим материалам, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось получение высокоактивных комплексных ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Pénicillium для гидролиза природных пектин- и целлюлозосодержащих субстратов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

S клонировать гены целевых ферментов,

S осуществить трансформацию штаммов-реципиентов грибов рода Pénicillium,

■S подобрать оптимальное соотношение компонентов ферментного комплекса,

S определить гидролитическую способность новых ферментных препаратов, полученных на основе созданных штаммов-продуцентов, по отношению к природным пектин- и целлюлозосодержащим субстратам на примере свекловичного жома, яблочных и цитрусовых выжимок,

S изучить биохимические свойства и определить компонентный состав полученных ферментных препаратов.

Научная новизна. Показана принципиальная возможность получения штаммов-продуцентов на основе грибов рода Pénicillium, секретирующих несколько целевых ферментов в заданном соотношении, путем котрансформации исходного штамма-реципиента смесью двух и трех целевых плазмид совместно с трансформирующей плазмидой и последующего скрининга полученных трансформантов.

Изучены биохимические свойства и компонентный состав новых ферментных препаратов, полученных на основе созданных штаммов-продуцентов и обладавших максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому, яблочным и цитрусовым выжимкам. Показано, что состав новых ферментных препаратов соответствует оптимальному составу смеси ферментов, обеспечивающей максимальный выход глюкозы или арабинозы при гидролизе свекловичного жома.

Практическая значимость работы. На основе созданных штаммов-продуцентов получены новые ферментные препараты, обладающие высокой гидролитической способностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим материалам. Так, ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов Pénicillium canescens, эффективнее (26-38% по выходу арабинозы при гидролизе свекловичного жома) по сравнению с ферментным препаратом на основе реципиентного штамма. В то время как ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов Pénicillium

\erruculosum, эффективнее (20-30% по выходу глюкозы при гидролизе свекловичного жома) по сравнению с ферментным препаратом исходного штамма В1. Гидролитическая способность новых ферментных препаратов в 4,5 и 4 раза выше по сравнению с ферментным препаратом на основе реципиентного штамма при гидролизе яблочных и цитрусовых выжимок, соответственно.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: международной конференции «Биокатализ-2009» (Архангельск, 2009), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2010" (Москва, 2010), II Международной конференции Российского Химического общества им. Д.И.Менделеева "Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов" (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 116 источников. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включает 55 рисунков и 23 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы приведены данные об особенностях структуры растительных материалов с высоким содержанием пектиновых веществ, примеры технологических процессов ферментативной переработки растительного сырья. Подробно описаны состав и свойства комплекса внеклеточных ферментов грибов Р.\erruculosum и Р.сапеьсет, а также возможности их применения в качестве штаммов-реципиентов в ходе создания продуцентов различных практически значимых ферментов. Заключительные разделы обзора литературы посвящены обсуждению методов получения грибных рекомбинантных штаммов-продуцентов.

Экспериментальная часть содержит описание методов, использованных в работе, а также субстратов, реактивов, плазмид, ферментов и ферментных препаратов.

В последующих главах изложены результаты исследований и их обсуждение.

1. Создание продуцентов целевых ферментов

Клонирование генов целевых белков. Ген пектинлиазы А (ре/А) из Р.сапезсет был клонирован в векторы рХЕОцп.^аЬ обеспечивающий экспрессию гена ре1А под контролем индуцибельного промотора

I l

ксиланазы А (P.canescens), и рСВН, обеспечивающий экспрессию гена pelA под контролем индуцибельного промотора целлобиогидролазы I (.P.verruculosum). В результате клонирования гена peí А были получены кольцевые плазмиды pRNPelA и pBI Peí А, которые обеспечивали интеграцию гена pelA в хромосому грибов P.canescens и P.verruculosum, соответственно. Остальные кольцевые плазмиды (pRNJ3Glu, pRN EGII, pBGP, pRNEnPG, pRN Abn, pBIJ3GIu - см. рис. 1-2) были получены ранее в нашей лаборатории.

На рис. 1 и 2 приведены схемы экспрессионных кассет, обеспечивающих экспрессию целевых ферментов.

pRNJGlu pRN_EGII pRN_PelA pBGP pRNEnPG pRN_Abn 1000 пн

xylA bgll SS bgll egUH y

tSg^gi^ai^Sl ■ K444444444\\4\\\\\\W)

xylA eglll SS eglll egUII

ттшшвФт

xylA bgaS SS pelA egUII

gast :: КЧч\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\

bgaS bgaS SS pelA egUII

Es^sisas^wsasal:::: N\\4\\\\4\4\\\\\\\\\4\s

bgaS bgaS SS Pga ^^ ,

xylA abnA SS abnA egUII

кчччччччччччччччччччччФ

Рисунок I. Схемы экспрессионных кассет для трансформации штамма гриба P.canescens RN3-11-7 niaD'"'. Обозначения: Щ - промоториые области, ■ -сигнальные пептиды, ППх] - целевые гены, ES3 - терминаторные участки генов ксиланазы (xylA), ß-галактозидазы (bgaS) и пектинлиазы А (pelA) P.canescens, ß-глюкозидазы {bgll), эндо-1,4-а-полигалактуроназы (pga) и эндо-1,5-а-арабиназы (abnA) A.niger, эндо-1,4-Д-глюканазы III (egUII) и эндо-1,4-р-глюканазы II (eglll) Р. verruculosum.

В наборе экспрессионных кассет, предназначенных для трансформации штамма-реципиента гриба P.canescens, представлены структуры, в составе которых гены целевых белков находятся под контролем одного из двух промоторов - ß-галактозидазного (bgaS) или

ксиланазного (ху1А). Например, ген ре1А из Р.сапеьсет состыкован как с промотором ху1А (плазмида рКМ_Ре1А), так и промотором (плазмида р1ЮР), ген эндо-1,4-а-полигалактуроназы (р%а) из A.niger в составе плазмиды рИЧ ЕпРС находится под контролем bgaS промотора, в то время как гены эндо-1,5-а-арабиназы {аЬпА) из A.niger (плазмида рЯТМ ЛЬп), ген эндо-1,4-Р-глюканазы eglП из Р.уеггисиЬяит (плазмида рЕШ ЕОП) и ген Р-глюкозидазы (bglí) из A.niger (плазмида рЯМ (Ю1и) -под ху1А промотором. Секреция целевых белков в культуральную жидкость (КЖ) трансформантов гриба Р.сапеэсет обеспечивалась сигнальным пептидом целевого белка в случае экспрессионных кассет рЮМ_рС1и, р!Ш БОН и рКЫ_АЬп, а также р-галактозидазным сигнальным пептидом в остальных случаях (см. рис. 1).

Экспрессионные кассеты для трансформации штамма-реципиента Р^еггисиЬяит (см. рис. 2) содержат ген соответствующего зрелого белка и последовательности, кодирующие промоторную и терминаторную области целлобиогидролазы I (сЬМ), а также сигнальный пептид пектинлиазы А в случае плазмиды рРе! А (ре1А и Р-глюкозидазы в случае плазмиды рВ[_рС1и {bgUSS).

5' 3'

еШ реИ 55 реМ сЬк!

рВ1 Ре1А шттжтттжя- ■нгекзкф

М1 Ъф^ ¡¡и лы

рВЦЗШ КЧЧЧЧЧЧЧЧ''

1000 ПН

Рисунок 2 Схемы экспрессионных кассет для трансформации штаммов гриба Р .\erruculosum В1-537 шаБ*"*. Обозначения: ЩЗ - промоторные области, ■ сигнальные пептиды, Г | - целевые гены, Е2д-терминаторные участки генов пектинлиазы А (ре1Л) Р.сапехсепя, р-глюкозидазы А.т%ег, целлобиогидролазы I

(сЫгГ) Р. уеггиси1озит.

Трансформация штаммов-реципиентов Р.сапезсет 1ШЗ-11-7 и Р.\erruculosum В1 с использованием СаСЬ/РЕСЗ-метода была проведена одной или комбинацией двух и трех целевых плазмид совместно с котрансформирующей плазмидой р5ТА (0, обеспечивающей комплиментацию дефектного гена нитратредуктазы в штамме-реципиенте. Общее количество целевых плазмид, используемых для трансформации в равных соотношениях, составляло 10 мкг на 1 мкг плазмиды рБТАЮ.

Сочетания трансформированных целевых плазмид, а также количество клонов, полученных в результате трансформации, приведены в табл. 1.

Первичный скрининг трансформантов. В КЖ трансформантов серии RN PEB (P.canescens), В[_Р и BIPB (P. verruculosum) были определены концентрация белка, целевые и базовые активности. Под целевыми подразумевались активности пектинлиазы А (ПЕЛ) для серий трансформантов RNPEB, BI P и В1_РВ, Р-глюкозидазы (БГЛ) в случае RNPEB и BIPB, эндо-1,4-Р-глюканазы II (ЭГ) для трансформантов серии RN PEB. Базовыми активностями являлись активности ферментов целлюлолитического комплекса P.verruculosum - целпобиогидролазы (ЦБГ) и ЭГ, а также активность ксиланазы P.canescens (КСИЛ).

Таблица 1. Результаты трансформации наборами целевых конструкций.

Штамм-реципиент Комбинация трансформируемых конструкций Название серии трансформантов Кол-во полученных трансформантов

pRN ßGlu, pRN EGII. RNPEB 48

P.canescens pRN ßGlu, pRN EGII. 82

pRN EnPG, pRN PelA RN PP 124

RN3-11-7 pRN Abn RN А 110

pRN Abn, pRN PelA RN AP 95

pRN Abn, pRN EnPG, RN AEP 130

Р.verruculosum pBI PelA BI P 98

BI pBI PelA, pBI ßGlu BI PB 72

На основании полученных данных для трансформантов серии RN PEB был отобран ряд штаммов, которые показали увеличение активности ПЕЛ, ЭГ и БГЛ активностей по сравнению с исходным штаммом P.canescens RN3-11-7.

Одним из важных факторов при отборе штаммов-продуцентов из серии BI P и В1_РВ являлось сохранение в составе ЮК трансформантов активностей целлюлолитического комплекса - ЦБГ и ЭГ. Таким образом, среди трансформантов на основе P.verruculosum были выбраны штаммы-продуценты, в КЖ которых активности ПЕЛ (в случае серии трансформантов BI P) и ПЕЛ и БГЛ (BI PB) были существенно выше по сравнению с исходным штаммом-реципиентом, а активности целлюлолитических ферментов сохранялись на максимально высоком уровне.

Остальные трансформанты (серии RNPP, RNA, RNAP, RN AEP) были анализированы методом ПЦР с использованием геномной ДНК в качестве матрицы, что позволило упростить трудоемкую стадию первичного скрининга, основанного на определении активности ферментов в КЖ трансформантов. Например, доказательством факта произошедшей встройки гена гетерологичной abnA в геномную ДНК

трансформантов серии RNAEP (см. рис. 3) являлось наличие полосы -1500 п.н. в амплификате, полученном на основе геномной ДНК трансформантов с использованием прайм еров, специфичных гену abnA. В качестве контроля выступали исходная плазмида pRNAbn (Рг) и геномная ДНК штамма-реципиента (RN).

Штаммы, полученные в результате трансформации штамма-реципиента P.canescens RN3-11-7 комбинацией двух и трех плазмид были скринированы поэтапно. Например, в начале трансформанты серии RNPP были скринированы на наличие гена pelA, а затем был проведен анализ трансформантов со встроенным геном pelA на наличие гена эндо-1,4-а-полигалактуроназы (pga).

Поскольку геномная ДНК P.canescens содержала ген pelA, то в ходе ПЦР, предназначенного для скрининга трансформантов на наличие гена pelA, использовались праймеры, комплементарные промотору xylA и З'-концу гена pelA, в результате чего проходила амплификация именно встроенных олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих гену pelA.

~ Щ „ m « m m I* **

- гч.. а ^«е s с-: ееее?^ в* ^ 48 49 50 51 52 53 54 55 5« 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72

/ Ч_ ' ' _ ---^

N. ---V---

RNAEP

= • А- -щ щ ЩЩт Щ • ~ «••

__ ,., ,ч »»»j ют -"-< »—ч .-« —« »"»•« fÇ^n f— «-*■ '

яа * -^"еГГи - 4« 'к o^^wc aiCjUr'^îr'U^ _

Pr RN 25 2'6 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47

v—:-v-y

RN_AEP

Рисунок 3 Электрофореграммы образцов ДНК, полученных в результате скрининга трансформантов серии RN_AEP на наличие гена abnA с использованием метода ПЦР (в качестве матрицы выступали геномная ДНК трансформантов - обозначены цифрами 25-72 и штамма-реципиента - RN, а также плазмида pRN_Abn с геном abnA - Рг).

Тестирование штаммов-продуцентов на стабильность секреции целевых белков. Отобранные в результате первичного скрининга штаммы культивировали в качалочных колбах объемом 750 мл на среде, состав которой был подобран ранее в соответствии с видом гриба. В полученной КЖ определяли целевые активности и концентрацию белка. Под целевыми активностями подразумевались ПЕЛ (в случае трансформантов серий RNPEB, RNPP, RN АР, RN AEP, BI P и BI PB), БГЛ (RN РЕВ и BI PB), ЭГ (RNPEB), эндо-1,5-а-арабиназы - АБН

ю

(RN A, RNAP, RNAEP) и эндо-1,4-а-полигалактуроназы - ПГ (RN PP RNAEP).

Полученные штаммы-продуценты были три раза последовательно рассеяны на чашки Петри с агаризованной, минимальной селективной средой, содержащей нитрат натрия, глюкозу и дигидрофосфат калия. Наблюдаемые скорость и характер роста, форма и размер колоний, а также способность к спорообразованию оставались одинаковыми в ходе трех пересевов. После второго и третьего пересева было проведено культивирование штаммов в качалочных колбах, в полученной КЖ были определены целевые активности и концентрация белка.

Полученные результаты показали, что активности ПЕЛ и БГЛ в КЖ штаммов-продуцентов серий BI P и В[ PB, полученных на основе штамма P.verruculosum, после двух последовательных пересевов снизились не более чем на 15 % по сравнению с первым культивированием, а после третьего остались на уровне результатов второго культивирования. Таким образом, штаммы-продуценты серий В1_Р и В1_РВ обладали стабильной способностью к секреции гетерологичных ПЕЛ и БГЛ.

Таблица 2 Целевые активности (ед/мл) и концентрация белка (г/л) в КЖ, полученной в результате культивирования в колбах новых штаммов-продуцентов, созданных на основеР.уеггиси/ояит В1.

Серия Номер штамма ПЕЛ БГЛ ЦБГ эг Белок

BIP 7 25,9±2,96 - 2,683±0,1 - 5,7±0,3

12 20,8±1,7 - 2,706±0,2 - 4,9±0,5

13 19,8±1,6 - 2,591±0,3 - 5,3±0,6

28 12,4±1,9 - 2,827±0,5 - 5,2±0,7

BI PB 8 34,6±1,3 10,0±1,1 1,97±0,4 35,0±3,6 5,4±0,4

11 9,4±0,6 3,2±0,8 0,79±0,1 8,9±1,2 4,1 ±0,6

4 10,1±0,5 5,5±0,3 1,62±0,3 47,4±4,1 5,0±0,5

15 22,8±1,8 64,4±7,4 1,04±0,2 18,6±2,2 4,6±0,7

5 12,1±1,2 50,6±6,9 2,65±0,8 21,8±2,0 5,2±0,5

2 5,0±0,5 39,6±4,8 1,23±0,4 23,3±1,9 4,5±0,6

6 5,2±0,9 16,0±0,96 1,87±0,3 36,2±3,2 5,6±0,4

20 35,8±3,3 39,8±2,6 1,96±0,2 27,3±2,6 5,5±0,5

18 4,6±0,7 60,3±5,7 1,17±0,1 17,3±1,5 5,3±0,8

- BI 0,0 5,1 ±0,4 3,2±0,2 29,1±2,7 4,8±0,7

Штаммы-продуценты, полученные на основе штамма Р.сапезсет, также обладали стабильной секреторной способностью. Наблюдаемое падение целевых активностей после двух последовательных пересевов составляло в среднем 11 % по сравнению с первым культивированием, а после третьего пересева оставалось на уровне второго культивирования. Следует отметить, что концентрация белка в КЖ штаммов-продуцентов,

п

полученных как на основе Р.саие^сет, так и на основе Р .\erruculosum, оставалась постоянной. Величины целевых активностей и концентрации белка в КЖ штаммов-продуцентов, усредненные по результатам трех культивирований приведены в табл. 2 и 3.

На рис. 4 приведены примеры электрофореграмм образцов КЖ, полученной в результате культивирования в колбах штаммов-продуцентов. Видно, что на основе штаммов-реципиентов Р.сапезсеж ЯШ-11-7 и Р .уеггисиЬэит В1 в результате проведенных генно-инженерных работ, были получены штаммы-продуценты, секретирующие АБН (40 кДа, рис. 46), ПГ (36 кДа, рис. 4а,б), ПЕЛ (38 кДа, рис. 4а-г), ЭГ (36 кДа, рис. 4в) и БГЛ (120 кДа, рис. 4в,г).

ШРР

штамм

118 Ш

дд ф Щщ^Щ- ««щи ДБН

г< Г 40 кДа

50 Ш —. ЩЬ I гПЕЛ д 38

34 • Ш » Ш \ пг 36 кДа /

21 ц . да*

а

к:^ АЕР км л

120

- : I Щ %4 85

Т 1. Ш 50

35 25

БГЛ 120 кДа

ПЕЛ 38 кДа ЭГ ЗбкДа

118 «в »»; 1»,

БГЛ

120 к-Да

г-.-

Ж-

ПЕЛ 38 кДа

Рисунок 4 Электрофореграммы КЖ, полученной в результате культивирования в колбах штаммов-продуцентов серии ЮМ_РР (а), ЯЫ_АР, ЮМ_АЕР (б), Я>1_РЕВ

(в) на основе Р.сапезсепв 1ШЗ-11-7 и серии В1_РВ (г) на основе РжггисиЬхит В1.

Таблица 3. Целевые активности (ед/мл) и концентрация белка (г/л) в КЖ, полученной в результате культивирования в колбах новых штаммов-продуцентов, полученных на основе штамма-реципиента Р.сапезсет 1-7.

Серия Название штамма БГЛ ЭГ ПЕЛ пг АБН Белок

КМ_РЕВ А1 93,43±14,01 13,04±1,9б 0,63±0,09 - 8,26±1,24

А4 71,04±10,66 10,0б±1,51 0,34±0,05 - 8,37±1,26

А8 38,08±5,71 60,43±9,06 11,67±1,75 - 13,09±1,96

В2 65,09±9,76 63,31±9,50 1±0,15 - 8,74±1,31

В5 38,88±5,83 26,18±3,93 6,44±0,97 - 9,97±1,50

С1 0,53±0,08 69,74410,46 24,5±3,68 - 12,85±1,93

С 9 42,94±6,44 114,21±17,13 0,69±0,10 - 8,68±1,30

Э6 33,23±4,98 13,21±1,98 0,59±0,09 - 7,52±1,13

СЗ' 34,94±5,24 55,51±8,33 6,45±0,97 - 6,72±0,81

С5' 31,85±4,78 61,08±9,16 26,55±3,98 - 6,09±0,73

С9' 67,32±Ю,10 98,06±14,71 16,51±0,98 - 8,24±0,99

ОЗ' 57,59±8,64 85,92±12,89 28,28±1,54 - 7,19±0,86

КМ_РР 24 - - 61,2±5,2 120,2±13,9 13,0±0,6

39 - - 0,7±0,02 263,3±13,0 13,7±1,2

7 - - - - 119,2± 10,4 9,5±1,1

11 - - - - 263,6±20,1 10,6±1,4

ЯК_АР 16 - - 27,8±1,8 - 87,8±10,2 8,1±0,5

20 - - 11,4±1,0 - 111,3±9,9 6,5±0,3

8 - - 7,2±0,8 232,1±20,0 81,8±9,5 14,4±1,7

11 - - 1,6±0,2 270,6±22,1 218,0±25,0 13,8±1,5

12 - - 0,6±0,1 304,5±29,5 187,4±20,0 14,1±2,1

31 - - 0,4±0,1 174,0±15,2 169,2±18,0 16,2±2,0

- Я№-11-7 5,79±0,87 17,52±2,63 0,20±0,03 3,0±0,8 21,0±2,5 7,82±0,94

Таким образом, с использованием методов генной инженерии были созданы штаммы гриба P.canescens, являющиеся продуцентами гомологичной пектинлиазы A P.canescens и гетерологичных ß-глюкозидазы A.niger и эндо-1,4-Р-глюканазы II P.verruculosum (RNPEB), гетерологичной эндо-1,5-а-арабиназы A.niger (RN_A), эндо-1,5-а-арабиназы A.niger и пектинлиазы A P.canescens (RNAP), пектинлиазы А P.canescens и гетерологичных эндо-1,5-а-арабиназы A.niger и эндо-1,4-а-полигалактуроназы A.niger (RN_AEP), а также штаммы гриба P.verruculosum, продуценты гетерологичной пектинлиазы A P.canescens (BI P), гетерологичных пектинлиазы A P.canescens и ß-глюкозидазы A.niger (BIPB, F10P). Полученные штаммы-продуценты характеризовались стабильной секрецией целевых ферментов. Эти штаммы были культивированы в Зл- и Юл- ферментерах для получения сухих ферментных препаратов (ФП) путем лиофильного высушивания КЖ или ультраконцентратов КЖ.

2. Гидролитическая способность ферментных препаратов, полученных на основе новых штаммов-продуцентов

Гидролиз свекловичного жома под действием новых ферментных препаратов был проведен с целью определения гидролитической способности ФП, полученных на основе созданных штаммов-продуцентов и соответствующих реципиентных штаммов (в качестве контроля). Критериями, выбранными для сравнения эффективности деструкции свекловичного жома под действием ФП серий RNPEB, BI P, BI PB и F Ю Р, служили концентрация восстанавливающих Сахаров (ВС) и глюкозы (Глю), а в случае ФП серий RN A, RN AP и RN AEP - концентрация ВС и арабинозы (Ара).

На рис. 5 приведены результаты гидролиза сухого свекловичного жома, измельченного на мельнице MF 10 basic ("IKA WERKE", Германия), под действием ФП, полученных на основе реципиентного штамма P.canescens (RN3-11-7) и штамма С9', являющегося продуцентом трех ферментов - ПЕЛ, БГЛ и ЭГ (серия RNPEB) и обладающего максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому среди ФП серии RN PEB. При дозировке ФП 2, 5 и 10 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома ФП С9' обеспечил выход ВС (обозначен сплошной линией черного цвета на рис. 5) в среднем на 45% выше по сравнению с ФП RN3-11-7 (обозначен черной пунктирной линией на рис. 5).

О 10 20 30 40 50

Время, ч

Рисунок 5 Выход ВС по истечении 3, 24 и 48 ч гидролиза свекловичного жома (100 г/л) под действием ФП, полученного на основе штамма-продуцента С9' серии RN PEB и штамма-реципиента RN3-11-7 при 50°С и pH 5,0 (дозировка ФП составляла 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата).

На рис. 6 приведены результаты гидролиза измельченного свекловичного жома под действием ФП, обладающих повышенными активностями АБН, ПЕЛ и ПГ. Видно, что при дозировке ФП 2 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата среди ФП серий RN РР, RN A, RN AP и RN АЕР максимальный выход ВС наблюдался в случае ФП на основе штамма P.canescens АЕР 8, являющегося продуцентом АБН, ПГ и ПЕЛ. Выход ВС после 3, 24 и 48 ч гидролиза свекловичного жома под действием ФП АЕР 8 (обозначен сплошной линией серого цвета на рис. 6а) в среднем на 20 % выше по сравнению с ФП RN (обозначен черной пунктирной линией на рис. 6а). Однако при повышении дозировки ФП (5 мг/г) картина менялась и максимальный выход ВС наблюдался в случае ФП АР16, являющегося продуцентом АБН и ПЕЛ (обозначен сплошной линией черного цвета на рис. 66). Выход ВС после 3, 24 и 48 ч гидролиза оказался в среднем на 19 % выше по сравнению с ФП RN (обозначен черной пунктирной линией на рис. 66). Причем в тех же условиях ФП АР 16 показал выход Ара на 26 % выше по сравнению с ФП RN (см. рис. 6в).

Наиболее существенное увеличение гидролитической способности ФП АР 16 по сравнению с ФП RN наблюдалось на начальном этапе гидролиза свекловичного жома. Так, при дозировке ФП 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата по истечении 3 ч гидролиза выход ВС и Ара под действием ФП АР 16 был, соответственно, на 29 и 38 % выше, соответственно, по сравнению с ФГ1 RN. Наблюдаемый эффект, по-видимому, обусловлен особенностями строения клеточной стенки сахарной свеклы. Согласно литературным данным, в состав свекловичного

жома входит значительное количество пектиновых веществ, которые не расщеплялись в случае ФП ЯЫ с низкой активностью ПЕЛ и затрудняли доступ гемицеллюлаз к соответствующим полисахаридам. Напротив, ФП АР 16, обладающий высокой активностью ПЕЛ, обеспечивал расщепление пектиновых веществ уже на первом этапе процесса, что, в свою очередь, приводило к активизации гемицеллюлаз.

Время, ч

а б

О 10 20 30 40 50

Время, ч

В

Рисунок 6 Выход ВС (а,б) и Ара (в) по истечении 3, 24 и 48 ч гидролиза свекловичного жома (100 г/л) под действием ФП АР 16 и АЕР 8, обладавших максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому

среди ФП серий 1Ш_АР, 1Ш_АЕР, ШМ_РР, а также ФП ЯМ (на основе

исходного штамма) при 50°С и рН 5,0 (дозировка ФП составляла 2 и 5 мг белка на 1 г

сухих веществ субстрата).

На рис. 7 приведены результаты гидролиза измельченного свекловичного жома под действием ФП, полученных на основе исходного штамма Р^еггисиЬзит (В1, обозначен пунктирной черной линией) и

нового штамма-продуцента ПЕЛ и БГЛ - № 5 (обозначен сплошной черной линией), обладающего максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому среди ФП серий BIPB, BI Р и F10 P. ФП № 5 обеспечивал выход ВС и Глю, соответственно, на 38% и 32% выше по сравнению с ФП BI по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома при дозировке ФП 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата. Наиболее значимое повышение гидролитической способности ФП № 5 серии BI РВ по сравнению с ФП BI наблюдалось на начальном этапе гидролиза, так, выход Глю после 3 ч гидролиза был выше контроля на 80%, в то время как после 24 ч гидролиза разница составляла 32 %.

Таким образом, на основании данных по выходу Глю в ходе гидролиза свекловичного жома, ферментный препарат BIPB 5, полученный на основе созданного штамма P.verruculosum, являющегося продуцентом ПЕЛ и БГЛ, обладал максимальной гидролитической способностью по отношению к целлюлозной компоненте свекловичного жома по сравнению с другими исследованными ФП. На основании данных по выходу Ара, ФП RN AP 16 на основе штамма P.canescens, продуцента ПЕЛ и АБН, обладал максимальной среди исследованных ФП гидролитической способностью по отношению к арабинану свекловичного жома. Наконец, ФП RN PEB С9' на основе штамма P.canescens, продуцента ПЕЛ, БГЛ и ЭГ, обеспечивал максимальный выход ВС.

0 10 20 30 40 50 о 10 20 30 40 50

Время, ч Время, ч

а б

Рисунок 7 Выход ВС (а) и Глю (б) по истечении 3, 24 и 48 ч гидролиза свекловичного жома (100 г/л) под действием ФП, полученных на основе исходного

штамма P.verruculosum BI и штамма-продуцента, обладавшего максимальной гидролитической способностью среди ФП серий BI P, BI PB, F Ю Р, при 50°С и рН 5,0 (дозировка ФП составляла 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата).

Определение состава ферментного комплекса, оптимального для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих материалов на примере свекловичного жома. Был проведен поиск оптимального (обеспечивающего наиболее эффективную деструкцию свекловичного жома) соотношения гомогенных ферментов (АБН из А.п'^ег и ПЕЛ из Р.сяле^се/м) и комплекса внеклеточных ферментов реципиентного штамма Р.сапезсепя ЮМЗ-11-7. На первом этапе был проведен гидролиз свекловичного жома смесями ФП ЯЫ (полученного на основе штамма Р.сапезсет ЯШ-11-7) и гомогенной АБН (результаты гидролиза приведены на рис. 8, состав смесей - в табл. 4). Наибольшей гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому обладали смеси № 2', 3' и 4', содержащие 10% - 30 % АБН от общего количества белка в реакционной смеси. Выход ВС и Ара по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома под действием смесей № 2', 3' и 4' в среднем, соответственно, на 48% и 49% выше по сравнению с ФП (см. рис. 8а).

Рисунок 8 Выход ВС (О - концентрация ВС), Ара (□ - концентрация Ара) и Глю - концентрация Глю) по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома (100 г/л) под действием смесей ФП (полученного на основе реципиентного штамма Р.сапезсепэ ШМЗ-11-7) и АБН (а) и смесей ФП АБН и ПЕЛ (б) при 50°С и рН 5,0 (общая дозировка смеси составляла 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата, состав смесей ферментов приведен в табл. 4).

Далее были приготовлены смеси с фиксированным соотношением гомогенной АБН (30 % по белку) и ФП 1Ш и различным содержанием гомогенной ПЕЛ (состав смесей приведен в табл. 4). Из данных на рис. 8 видно, что наибольшей гидролитической способностью обладали смеси № 10', 1 Г, 12' и 13' с содержанием ПЕЛ от 10% до 50% по белку, обеспечившие выход ВС и Ара в среднем на 78% и 67% выше по сравнению с ФП 1Ш. Следовательно, наиболее оптимальной для

гидролиза полисахаридов свекловичного жома является смесь ферментов, состоящая, в пересчете на общее количество добавляемого белка, из 1530% АБН, 10-50% ПЕЛ и 35-60% ферментного комплекса штамма-реципиента Р .сапехсет 1ШЗ-11-7.

Таблица 4 Состав смесей, состоящих из ферментного препарата, полученного на основе реципиентного штамма Р.сапезсеп* ¡<.N3-11-7 - (ФП ЯЫ) и гомогенных АБН и ПЕЛ (смеси № 1' — 17'), а также ферментного препарата, полученного на основе реципиентного штамма Р.уеггиси^ит В1 - (ФП В1) и гомогенных БГЛ и ПЕЛ (смеси № Г'-17"). ____ ____

№ смеси ФП1Ш АБН ПЕЛ № смеси ФП В1 БГЛ ПЕЛ

Г 100 % - - 1" 100 % - -

2' 90% 10% - 2" 90% 10% -

3' 80% 20% - 3" 80% 20% -

4' 70% 30% - 4" 70% 30% -

5' 50% 50% - 5" 50% 50% -

6' 30% 70% - 6" 30% 70% -

Т 20% 80% - 7" 20% 80% -

8' 10% 90% - 8" 10% 90% -

9' - 100 % - 9" - 100 % -

10' 63% 27% 10% 10" 81 % 9% 10%

И' 56% 24% 20% 11" 72% 8% 20%

12' 49% 21 % 30% 12" 63% 7% 30%

13' 35% 15% 50% 13" 45% 5% 50%

14' 21 % 9% 70% 14" 27% 3 % 70%

15' 14% 6% 80% 15" 18% 2% 80%

16' 7% 3% 90% 16" 9% 1 % 90%

17' - - 100 % 17" - - 100%

Согласно литературным данным, среднее содержание остатков Ара в свекловичном жоме, составляет 20,9 % масс, по с.в., следовательно, при концентрации свекловичного жома в реакционной смеси 100 г/л (по с.в.) максимальная ожидаемая концентрация образовавшейся в результате ферментативного гидролиза Ара составляет 23,8 г/л (с учетом присоединенной молекулы воды). Таким образом, выход Ара на уровне 23,0±2,5 г/л по истечении 48 ч гидролиза свекловичного жома под действием смесей ФП КГ\', АБН и ПЕЛ оптимального состава близок к теоретическому.

Аналогичным образом был проведен поиск оптимального для проведения гидролиза свекловичного жома соотношения гомогенных ферментов - БГЛ из A.niger и ПЕЛ из Р.сапезсепэ и комплекса внеклеточных ферментов реципиентного штамма Р^еггиси1озит В1 (ФП В1). На первом этапе было определено оптимальное соотношение ФП В1 и гомогенной БГЛ (соотношения компонентов ферментного комплекса реципиентного штамма и гомогенной БГЛ приведены в табл. 4), на втором — оптимальный состав смеси ФП В1, БГЛ и ПЕЛ (см. табл. 4).

Наилучший результат гидролиза смесями ФП В1 и БГЛ после 24 ч и 48 ч наблюдали для смеси, содержащей 10% БГЛ от общего количества белка в реакционной смеси (смесь № 2" на рис. 9а). Более значительные эффекты наблюдались при гидролизе свекловичного жома смесями с фиксированным соотношением БГЛ и ФП В1 и различным содержанием гомогенной ПЕЛ. Смеси с максимальной гидролитической способностью (№ 10" - 13", см. рис. 96), состоявшие из 5-9% БГЛ, 10-50% ПЕЛ и 45-80% ферментного комплекса реципиентного штамма Р.\erruculosum В1, обеспечили выход ВС и Глю после 3 ч гидролиза, соответственно, на 44% и 108% выше по сравнению с ФП В1.

Рисунок 9 Выход ВС (□ - концентрация ВС) и Глю (| - концентрация Глю) по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома (100 г/л) под действием смесей ФП

В1 (полученного на основе реципиентного штамма Р.уеписи1озит В1) и БГЛ (а) и смесей ФП В1, БГЛ и ПЕЛ (б) при 50°С и рН 5,0 (общая дозировка смеси составляла 5 мг белка на 1 г сухих веществ субстрата, состав смесей ферментов приведен в табл. 4).

При увеличении времени гидролиза свекловичного жома (24ч и 48ч, см. рис. 9) смеси № 10" - 13" также обладали максимальной гидролитической способностью, причем выход Глю составлял 22,3±2,1 г/л. Среднее содержание Глю в свекловичном жоме составляет приблизительно 21,1% по с.в., следовательно, при концентрации свекловичного жома в реакционной смеси 100 г/л (по с.в.) максимальная ожидаемая концентрация образовавшейся в результате ферментативного гидролиза Глю составляет 23,4 г/л (с учетом присоединенной молекулы воды). Отметим, что уже по истечении 24 ч гидролиза свекловичного жома происходила практически полная конверсия глюкозосодержащих полисахаридов под действием смесей ферментов, состоявших, в пересчете на общее количество добавляемого белка, из 5-9% БГЛ, 10-50% ПЕЛ и 4580% компонентов ферментного комплекса реципиентного штамма Р.\erruculosum В1.

3. Свойства новых ферментных препаратов

По результатам гидролиза свекловичного жома новыми ФП, а также цитрусовых и яблочных выжимок образцами КЖ штаммов-продуцентов серии 1Ш РЕВ были отобраны лучшие ФП для дальнейшего изучения их свойств, к ним относятся ФП, полученные на основе штаммов Р.сапезсет В5 и С9' (продуценты ПЕЛ, БГЛ, ЭГ) и АР 16 (продуцент АБН и ПЕЛ), а также ФП, полученный на основе штамма РВ 5 (продуцента ПЕЛ и БГЛ), удельные активности ФП приведены в табл. 5. На рис. 10 представлены электрофореграммы образцов лучших ФП, полученных на основе штаммов грибов Р.сапезсет и Р. \erruculosum.

В1 РВ

БГЛ 120 кДа

118

90

50 Ц

35

27 ш

В1 5

■ ЧБГ1 66

............<

~ЦБГ I 55 кДа

. ЦБГ II 50 кДа х ПЕЛ А

I

38 кДа

а б

Рисунок 10 Электрофореграммы образцов растворенных и предварительно обессоленных ФП, полученных на основе штаммов грибов Р.сапеясет (а) и Р.уеггиси1озит (б). Обозначения: 1УМ - реципиентный штамм ЯЮ-11-7, В5 и С9' — лучшие штаммы серии ЮМРЕВ, 16 - лучший штамм серии АР, В1 - реципиентный штамм В 1,5- лучший штамм серии В1_РВ.

Н\'РЕП Н.\_ЛР

АБФ 60 кДа АБФ 70 кДа

¡4 - ¥ «

Кспл . ЛкДа ^

А 38 кДа АБН 40 кДа

ПЕЛ А 38 кДа ЭГ II 36 кДа

БГЛ 120 кДа

Таблица 5 Удельные активности ФП, обладавших максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому (16, РВ 5, С9'), яблочным (В5) и цитрусовым выжимкам (В5)._

ФП, полученные на основе штаммов гриба P.canescens:

ПЕЛ ЭГ КСИЛ ЦБГ БГЛ

RN3-11-7 (реципиентный) 0,0 0,1 130 0,1 0,1

Продуценты ПЕЛ, ЭГ II и БГЛ: В5 1,1 0,3 138,2 0,2 2,4

С9 6,6 1,4 67,1 0,1 2,4

ПЕЛ КСИЛ АБН

RN3-11-7 (реципиентный) 0,0 130 0,1

Продуцент ПЕЛ и АБН: | 16 5,6 60,1 8,1

ФП, полученные на основе штаммов гриба P.verruculosum:

ПЕЛ ЭГ КСИЛ ЦБГ БГЛ

BI (реципиентный) 0,0 11,1 21,0 0,35 1,0

Продуценты ПЕЛ и БГЛ: РВ 5 7,0 6,8 3,9 0,40 2,0

Компонентный состав. Разделение ФП проводили с использованием методов гель-фильтрации, анионо-обменной хроматографии (АОХ) на носителе Source 15Q и гидрофобной хроматографии на носителе Source 15ISO в соответствии с многократно апробированной в нашей лаборатории методикой разделения ФП, полученных на основе различных штаммов P.canescens и P.verruculosum. Выделенные гомогенные ферменты идентифицировали по целевой активности и молекулярной массе (ДДС-электрофорез), а также методом масс-спектрометрии. На основании данных определения концентрации белка и целевой активности гомогенных фракций ферментов был рассчитан компонентный состав ФП. Оказалось, что компонентный состав ФП RN AP 16 (см. табл. 6) и ФП BI PB 5 (см. табл. 7) соответствует составу смесей ферментов (см. п. 2), показавших максимальный выход ВС, Глю и Ара в ходе гидролиза свекловичного жома (см. табл. 4, рис. 8 и 9).

Таблица 6 Содержание основных компонентов в составе ФП, полученных на основе штаммов гриба Р.сапе$сеп$.

Серия Штамм КСИЛ, % ПЕЛ, % ЭГ, % БГЛ, % АБН, %

- RN3-11-7 30 <1 0 0 0

RNPEB В5 • 32 4 1 1 0

С9' 15 11 18 12 0

RN АР № 16 10 10 0 0 26

Таблица 7 Основные компоненты ФП, полученных на основе штаммов гриба Р .\erruculosum.

Серия Штамм ПЕЛ, % ЦБ Г, % эг, % БГЛ, %

- В1 <1 69 14 4

В1 РВ №5 27 33 13 11

Биохимические характеристики. Было изучено влияние температуры и рН на активность и стабильность сухих ФП, полученных на основе новых штаммов-продуцентов и обладавших максимальной гидролитической способностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим субстратам.

Согласно полученным данным (см. табл. 8), новые ФП обладали высокой стабильностью целевых активностей в процессе инкубирования при рН 4,0 и 5,0 и температуре от 25 до 50°С. Следует отметить, что в ходе гидролиза различных полисахаридных субстратов полученные ФП проявляют целевые активности, близкие к максимальным, при рН 5,0 и 50°С, что позволяет считать данные условия оптимальными для гидролиза таких субстратов, как свекловичный жом, яблочные и цитрусовые выжимки.

Таблица 8 Влияние температуры и рН на активность ФП.

Ферментный препарат РЕВ В5 NN АР 16 В1 РВ 5

Целевой фермент ПЕЛ ЭГ II ПЕЛ АБН ПЕЛ

Субстрат Пектин цитрусовый СЭ кмц Пектин цитрусовый СЭ Арабинан линейный Пектин цитрусовый СЭ

рН-оптимум (рН>5о%) 5,0 (4,5-6,5) 4,5 (3,8-6,0) 5,0 (4,2-6,5) 4,0 (2,5 - 6,0) 5,0 (4,8-6,5)

Т-оптимум (Т>50%) 45 (25-60) 70 (48-65) 45 (25 -60) 60 (45-70) 55 (25 - 60)

Остаточная активность после Зч инкубирования ГГ 50°С), % рН 4,0 80 80 80 80 80

рН 5,0 80 70 80 80 80

Остаточная активность после Зч инкубирования (рН 4,0 для АБН, во всех остальных случаях рН 5,0), % 25 °С 95 95 95 95 95

40 °С 95 80 95 95 90

50 °С 85 70 85 75 80

60 °С 15 45 20 20 10

выводы

1. Созданы новые рекомбинантные штаммы-продуценты пектинлиазы А, эндо-1,4-Р-глюканазы II, Р-глюкозидазы, эндо-1,5-а-арабиназы и эндо-1,4-а-полигалактуроназы на основе грибов Р.сапеисет и Р.хеггисиЬэьит с применением подходов генетической инженерии и микробиологии. Доказано наличие генов целевых белков в хромосомах рекомбинантных штаммов; ферментные препараты, полученные с помощью созданных штаммов, обладали заданными целевыми активностями.

2. Показано, что ферментные комплексы новых рекомбинантных штаммов Р.сапеэсет эффективнее при гидролизе свекловичного жома (на 26-38% по выходу арабинозы) по сравнению с ферментным комплексом исходного реципиентного штамма 1ШЗ-11-7, а ферментные комплексы новых рекомбинантных штаммов Р.уеггисиЬяит эффективнее (на 20-30% по выходу глюкозы) по сравнению с ферментным комплексом исходного реципиентного штамма В1.

3. Новые ферментные препараты, полученные с помощью созданных штаммов-продуцентов и обладавшие максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому, имели следующий компонентный состав: Р.\erruculosum В1_РВ 5 - 27% пектинлиазы А, 11% Р-глюкозидазы, 33% целлобиогидролазы и 13% эндо-1,4-р-глюканазы; Р.сапеясет АР 16 - 10% ксиланазы, 10% пектинлиазы А и 26% эндо-1,5-а-арабиназы от общего количества белка ФП.

4. Изучена гидролитическая способность ферментных композиций по отношению к свекловичному жому. Установлено, что для обеспечения максимального выхода глюкозы оптимальной являлась смесь гомогенных пектинлиазы А (10-50%) и Р-глюкозидазы (5-9%) в сочетании с ферментным комплексом реципиентного штамма Р.\erruculosum В1 (4580% от добавляемого белка). Для обеспечения максимального выхода арабинозы оптимальной являлась смесь гомогенных эндо-1,5-а-арабиназы (15-30%) и пектинлиазы А (10-50%) с ферментным комплексом реципиентного штамма Р.сапезсет 1ШЗ-11-7 (35-60%). Оптимальное соотношение компонентов мультиферментных композиций соответствовало составу ферментных препаратов с максимальной гидролитической способностью, полученных с помощью новых штаммов-продуцентов.

5. Оптимальные значения целевых активностей ферментных препаратов с максимальной гидролитической способностью наблюдаются при рН 4,0-5,0 и температуре 45-70°С. При температуре 25-50°С и рН 4,05,0 ферментные препараты теряют в водном растворе в течение 3 часов не более 5-30% целевой активности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Рожкова А.М., Волков П.В., Кондратьева Е.А., Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А., Бушина Е.В.. Зоров И.Н., Синицына О.А., Синицын А.П., Кошелев А.В., Беккаревич А.О., Бубнова Т.В., Окунев О.Н. Создание продуцентов биотехнологически важных ферментов на основе рекомбинантного штамма гриба Pénicillium canescens. Хранение и переработка сельхозсырья, 2010, Т. 7, с. 37-39.

2. Рожкова А.М., Бушнна Е.В.. Зоров И.Н., Кошелев А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Применение комплексных ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз для переработки свекловичного жома. Вестник Мичуринского государственного аграрного университета. 2011, Т.2, №2, с. 96-99.

3. Волчок А.А., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Щербаков С.С., Бушииа Е.В.. Синицын А.П. Использование ферментных комплексов нового поколения для обработки различных плодово-ягодных субстратов. Виноделие и виноградарство, 2012, № 1,с. 20-21.

4. Бушина Е.В.. Рожкова А.М., Зоров И.Н., Сатрутдинов А.Д., Беккаревич А.О., Кошелев А.В., Окунев О Н., Синицын А.П. Создание комплексных ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз для переработки свекловичного жома. Прикладная биохимия и микробиология, 2012, Т. 48, № 5, с. 543-549.

5. Bushina E.V.. Rozhkova А.М., Semenova M.V., Sinitsyn A.P. Development Pectinase and Cellulase Strain-producer Using recombinant Strain P.canescens. Abstracts of International Conférence "Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 19-24, 2009, p.87.

6. Бушнна E.B.. Рожкова A.M., Семенова M.B., Синицын А.П. Получение продуцента гетерологичной пектинлиазы на основе рекомбинантного штамма Pénicillium sp. Сборник материалов Второго международного конгресс-партнеринга и выставки по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике "EurasiaBio", Москва, 1315 апреля, 2010, с.38.

7. Бушина Е.В. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Pénicillium для гидролиза отходов пищевой промышленности. Сборник материалов II Международной конференция Российского Химического общества им. Д.И.Менделеева "Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов". Москва, 28 сентября 2010, с.212.

8. Бушииа Е.В., Рожкова А.М., Середа А.С., Рубцова Е.А., Семенова М.В., Синицын А.П. Получение ферментных препаратов с заданными свойствами для гидролиза отходов пищевой промышленности. Сборник материалов Московской международной научно-практической конференции "Биотехнология: экология крупных городов", Москва, 15-17 марта 2010, с.301-302.

9. Бушина Е.В. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Pénicillium для гидролиза отходов пищевой промышленности. Сборник материалов школы-конференции "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины". Москва, 29-30 сентября 2011, с . 14.

Подписано в печать 22.11.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1273 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Бушина, Екатерина Вячеславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ПЕКТИН- И ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИЕ МАТЕРИАЛЫ

1.1. Строение клеточной стенки растений с высоким содержанием пектиновых веществ

1.2. Состав пектин-и целлюлозосодержащих материалов

1.3. Виды технологической схемы переработки пектин- и целлюлозосодержащих отходов

ГЛАВА 2. ПРОДУЦЕНТЫ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ

2.1. Преимущества грибных штаммов

2.2. Рекомбинантные штаммы гриба Pénicillium verruculosum

2.2.1. Основные компоненты комплекса внеклеточных ферментов гриба P.verruculosum

2.2.2. Этапы получения и возможности применения реципиентных штаммов P.verruculosum BlniaD^HFlOniaD"

2.3. Рекомбинантные штаммы гриба Pénicillium canescens

2.3.1. Основные компоненты ферментного комплекса гриба P.canescens

2.3.2. Возможности применения реципиентного штамма P.canescens RN3-11-7 niaDH для создания штаммов-продуцентов

2.4. Пектолитические ферменты

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ

3.1. Этапы создания штамма-продуцента

3.2. Системы переноса генов

3.2.1. Селективные маркеры

3.2.2. Интеграция трансформированной ДНК

3.3. Трансформация мицелиальных грибов

3.3.1. Методы получения протопластов различных видов мицелиальных грибов

3.3.2. СаСЬ/ПЭГ трансформационный метод 39 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1. Используемые плазмидные конструкции

4.2. Реактивы для клонирования генов целевых белков

4.3. Реактивы и оборудование для трансформации мицелиальных грибов СаС12/ПЭГ методом

4.4. Использованные ферментные препараты

4.5. Субстраты и реактивы для анализа

4.6. Клонирование методом независимого лигирования

4.7. Получение протопластов и трансформация реципиентных штаммов

4.8. Тесты на стабильность секреции целевых ферментов

4.9. Культивирование грибных штаммов

4.10. Методы определения активностей

4.11. Определение концентрации белка

4.12. Гидролиз свекловичного жома

4.13. Определение концентрации восстанавливающих Сахаров, глюкозы, арабинозы

4.14. Методы выделения и очистки белков

4.15. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов.

4.16. Изучение термостабильности ферментов 51 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЕВЫХ БЕЛКОВ 52 5.1. Клонирование генов целевых белков

5.1.1. Плазмиды для трансформации штамма P.canescens RN3-11-7 niaD()

5.1.2. Плазмиды для трансформации реципиентного штамма P.verruculosum BI niaD() 54 5.3. Скрининг трансформантов, отбор штаммов-продуцентов

5.3.1. Культивирование рекомбинантных штаммов

5.3.2. Первичный скрининг трансформантов

5.3.3. Тестирование штаммов-продуцентов на стабильность секреции целевых ферментов

ГЛАВА 6. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ПЕКТИН- И ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ

СУБСТРАТОВ

6.1. Сравнение гидролитической активности коммерческих ферментных препаратов и ферментных препаратов, полученных с помощью реципиентных штаммов, к свекловичному жому

6.2. Результаты гидролиза свекловичного жома смесями гомогенных ферментов

6.3. Сравнение гидролитической активности новых ферментных препаратов по отношению к свекловичному жому

6.4. Результаты гидролиза цитрусовых и яблочных выжимок культуральной жидкостью созданных штаммов P.canescens, являющихся продуцентами пектинлиазы, эндо-1,4-р-глюканазы и Р-глюкозидазы

ГЛАВА 7. СВОЙСТВА НОВЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

7.1. Оптимум Т и рН стабильность новых ферментных препаратов

7.2. Компонентный состав ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов гриба Pénicillium canescens

7.3. Свойства рекомбинантной эндо-1,5-а-арабиназы

7.4. Компонентный состав ферментных препаратов, полученных с помощью штаммов гриба Pénicillium verruculosum

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые высокоэффективные ферментные препараты для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих субстратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium"

В настоящее время существует широкий спектр продуктов, получаемых на основе возобновляемого сырья растительного происхождения. Так, из растительных материалов с высоким содержанием пектиновых веществ производят различные пищевые продукты, например, сахар, вина, плодово-овощные соки и пюре, ягодные морсы и т.д. Применение ферментных препаратов, обладающих высокой гидролитической активностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим субстратам, позволяет увеличить выход целевых конечных продуктов, способствует повышению качества и улучшению их органолептических показателей.

Ферментативный гидролиз также является ключевым звеном в процессе переработки отходов пищевой промышленности. Полученные в результате гидролиза простые сахара в последующих стадиях используют в качестве основы для получения различных полезных продуктов - топлива (метана [1], этанола [2]), исходных соединений для получения полимеров (молочной кислоты [3], янтарной кислоты [4]), кормовых добавок (ветеринарных антибиотиков [5], аминокислот, кормовых дрожжей [6], ферментных препаратов [7, 8] и пр.). Отметим, что в последние десятилетия особое значение приобрела концепция переработки природных ресурсов, реализация которой подразумевает снижение выбросов в окружающую среду отходов производства, более рациональный подход к использованию растительного сырья - извлечение из него максимума полезных продуктов [2, 8].

В частности, наиболее популярным биотопливом является этанол, объемы производства которого в мире за 2011 год составили 84,5 млн тонн [9]. Большая часть биотоплива, 69 % от общего количества по данным [10] за 2010 год, производится в США и Бразилии. Основным сырьем для получения биоэтанола в США является кукуруза [9], в Бразилии - отходы переработки сахарного тростника (по данным организации "European biofuels", http://www.biofuelstp.eu/globaloverview.html). Наиболее многотоннажным отходом пищевой промышленности России является свекловичный жом. По данным Росстата за 2009 год, только малая его часть - 13 %, используется как кормовая добавка, большая же часть жома остается невостребованной. Существующие избытки свекловичного жома целесообразно использовать для получения различных полезных продуктов.

Одним из основных этапов переработки отходов растительного происхождения является превращение сложных полисахаридов клеточной стенки растений в простые сахара. Эффективность проведения этого процесса определяет выход конечного продукта и экономическую целесообразность процесса переработки растительного сырья в целом. Основу клеточной стенки растений с высоким содержанием пектиновых веществ, к которым, в частности, относится сахарная свекла, составляют волокна целлюлозы, покрытые слоем гемицеллюлоз. Пространство между волокнами заполняют пектиновые вещества, снижающие доступ соответствующих ферментов к целлюлозе и гемицеллюлозам. Следовательно, комплекс ферментов для эффективного превращения такого сырья в простые сахара помимо целлюлаз и гемицеллюлаз [11], обеспечивающих гидролиз соответствующих полисахаридов, должен также содержать пектиназы, способствующие повышению эффективности гидролиза за счет разрушения пектиновых веществ.

Коммерческие ферментные препараты, применение которых возможно по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим материалам, можно разделить на две категории. К первой принадлежат ферментные препараты с высоким содержанием пектолитических ферментов, используемые при производстве пищевых продуктов и обладающие относительно невысокой гидролитической активностью по отношению к целлюлозе и гемицеллюлозам. Ко второй категории относятся ферментные препараты целлюлаз и гемицеллюлаз, предназначенные для гидролиза растительной биомассы с низким содержанием пектиновых веществ и не обеспечивающие высокоэффективный гидролиз пектин- и целлюлозосодержащих материалов вследствие вышеупомянутых особенностей их строения. Ферментные препараты, содержащие в оптимальном соотношении пектиназы, целлюлазы и гемицеллюлазы, на рынке не представлены. Согласно литературным данным, гидролиз пектин- и целлюлозосодержащих отходов пищевой промышленности, например, выжимок различных цитрусовых, проводят смесью ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз, подбирая их оптимальное соотношение для каждого конкретного вида сырья [12, 13]. В условиях современного биотехнологического производства приготовление смесей ферментных препаратов является нецелесообразным, поскольку вносит дополнительную стадию в технологическую схему переработки отходов и увеличивает расходы.

В ходе систематических исследований, проводимых в нашей лаборатории, было показано, что комплекс внеклеточных ферментов гриба Pénicillium verruculosum по гидролитической активности к лигноцеллюлозным материалам превосходит ферментный комплекс гриба Trichoderma reseei [14], наиболее часто использующийся в качестве основы для производства коммерческих ферментных препаратов целлюлаз. Кроме того, было показано, что гриб Pénicillium çanescens секретирует эффективный комплекс гемицеллюлаз [15]. Однако пектолитические ферменты являются минорными компонентами комплекса внеклеточных ферментов как P. canescens, так и P.verruculosum. Следовательно, создание продуцентов ферментов-карбогидраз (пектиназ и других недостающих ферментов) на основе штаммов грибов P.canescens и P.verruculosum с последующим получением ферментных препаратов оптимального состава на их основе, обладающих высокой .гидролитической активностью по отношению к пектин- и целлюлозосодержащим материалам, является актуальной задачей.

Таким образом, целью работы являлось получение высокоактивных комплексных ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Pénicillium для гидролиза природных пектин- и целлюлозосодержащих субстратов. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

S клонировать гены целевых ферментов,

S осуществить трансформацию штаммов-реципиентов грибов рода Pénicillium,

S подобрать оптимальное соотношение компонентов ферментного комплекса,

S определить гидролитическую активность новых ферментных препаратов, полученных на основе созданных штаммов-продуцентов, по отношению к природным пектин- и целлюлозосодержащим субстратам на примере свекловичного жома, яблочных и цитрусовых выжимок,

•S изучить биохимические свойства и определить компонентный состав полученных ферментных препаратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Бушина, Екатерина Вячеславовна

выводы

1. Созданы новые рекомбинантные штаммы-продуценты пектинлиазы А, эндо-1,4-(3-глюканазы II, р-глюкозидазы, эндо-1,5-а-арабиназы и эндо-1,4-а-полигалактуроназы на основе грибов Р. сапехсет и Р. уеггисиЬяит с применением подходов генетической инженерии и микробиологии. Доказано наличие генов целевых белков в хромосомах рекомбинантных штаммов; ферментные препараты, полученные с помощью созданных штаммов, обладали заданными целевыми активностями.

2. Показано, что ферментные комплексы новых рекомбинантных штаммов Р.сапезсет эффективнее при гидролизе свекловичного жома (на 26-38% по выходу арабинозы) по сравнению с ферментным комплексом исходного реципиентного штамма 1ШЗ-11-7, а ферментные комплексы новых рекомбинантных штаммов Р.уеггисгйозит эффективнее (на 20-30% по выходу глюкозы) по сравнению с ферментным комплексом исходного реципиентного штамма В1.

3. Новые ферментные препараты, полученные с помощью созданных штаммов-продуцентов и обладавшие максимальной гидролитической способностью по отношению к свекловичному жому, имели следующий компонентный состав: Р.\erruculosum В1РВ 5 - 27% пектинлиазы А, 11% Р-глюкозидазы, 33% целлобиогидролазы и 13% эндо-1,4-Р-глюканазы; Р. сапехсет АР 16 - 10% ксиланазы, 10% пектинлиазы А и 26% эндо-1,5-а-арабиназы от общего количества белка ФП.

4. Изучена гидролитическая способность ферментных композиций по отношению к свекловичному жому. Установлено, что для обеспечения максимального выхода глюкозы оптимальной являлась смесь гомогенных пектинлиазы А (10-50%) и Р-глюкозидазы (5-9%») в сочетании с ферментным комплексом реципиентного штамма Р.\еггиси1о$ит В1 (45-80% от добавляемого белка). Для обеспечения максимального выхода арабинозы оптимальной являлась смесь гомогенных эндо-1,5-а-арабиназы (15-30%) и пектинлиазы А (10-50%) с ферментным комплексом реципиентного штамма Р.сапезсет 1ШЗ-11-7 (35-60%). Оптимальное соотношение компонентов мультиферментных композиций соответствовало составу ферментных препаратов с максимальной гидролитической способностью, полученных с помощью новых штаммов-продуцентов.

5. Оптимальные значения целевых активностей ферментных препаратов с максимальной гидролитической способностью наблюдаются при рН 4,0-5,0 и температуре 45-70°С. При температуре 25-50°С и рН 4,0-5,0 ферментные препараты теряют в водном растворе в течение 3 часов не более 5-30% целевой активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Бушина, Екатерина Вячеславовна, Москва

1. Kaparaju P.L., Rintala J.A. Termophilic anaerobic digestion of industrial orange waste //Environ. Technol. -2006. -V. 27. -P. 623-633.

2. Lopez J.A., Li Q., Thomson I.P. Biorefinery of waste orange peel //Crit. Rev. in Biotech. -2010. -V. 30. -P. 63-69.

3. Bustos G., Moldes A.B., Cruz J.M., Dominigues J.M. Production of fermentable media from vine-trimming wastes and bioconversion into lactic acid by Lactobacillus pentosus //J. Sci. Food Agric. -2004. -V. 84. -P. 2105-2112.

4. Li Q., Siles J.A., Tompson I.P. Siccinic acid production from orange peel and wheat straw by batch fermnetation of Fibrobacter succinogenes S85 //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2010. -V. 88. -P. 671-678.

5. Asagbra A.E., Sanni A.I., Oyewole O.B. Solid state fermentation production of tetracycline by Streptomyces strains using some agricultural wastes as substrate //World J. Microbiol. Biotechnol. -2005. -V. 21. -P. 107-114.

6. Tripodo M.M., Lanuzza F., Micali G., Coppolino R. Citrus waste recovery: a new environmentally friendly procedure to obtain animal feed //Bioresour. Technol. -2004. -V. 91.-P.111-115.

7. Silva D., da Silva Martins E., da Silva R., Gomes E. Pectinase production by Pénicillium viridicatum RFC3 by solid state fermentation using agricultural wastes and agro-industrial by-products //J. Microbiol. -2002. -V. 91, -P. 318-324.

8. Mamma D., Kourtoglou E., Christakopoulos P. Fungal multienzyme production on industrial by-products of the citrus-processing industry //Bioresour. Technol. -2008. -V. 99. -P. 2373-2383.

9. Renewable Fuels Association. Acelerating Industry Innovation. Ethanol Industry Outlook. /Renewable Fuels Association. -2012. -3, 8, 10, 22 and 23 p.

10. BP Statistical Review of World Energy /bp.com/statistical review. -2011. -39 p.11. van Den Brink J., de Vries R.P. Fungal enzyme sets for plant polysaccharide degradation//Appl. Microbiol. Biotechnol. -2011. -V. 91. -P. 1477-1492.

11. Wilkins M.R., Widmer W.W., Grohmann K., Cameron R.G. Hydrolysis of grapefruit peel waste with cellulase and pectinase enzymes //Bioresour. Technol. -2008. -V. 98. -P. 1596-1601.

12. Boluda-Aguilar M., Garcia-Vidal L., Del Pilar Gonsalez-Castaneda F., Lopez-Gomez A. Mandarin peel wastes pretreatment with steam explosion for bioethanol production //Bioresour. Technol. -2010. -V. 101. -P. 3506-3513.

13. Синицына О.А., Бухтояров Ф.Е., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Беккаревич А.О., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Выделение и свойства основных компонентов внеклеточного ферментного комплекса Pénicillium canescens //Биохимия. -2003. -Т. 68. -С. 1494-1505.

14. Carpita N., Mccann M.C. The cell wall //Biochem. and Molec. Biol, of plants. -2000. -V. 29. -P. 52-108.

15. Растительная клеточная стенка как динамичная система /Горшкова Т.А. М.: Наука, 2007. -429 с.

16. Zykwinska A., Thibault J.F., Ralet M.C. Competitive binding of pectin and xyloglucan with primary cell wall cellulose //Carbohydr. Polym. -2008. -V. 74. -P. 957-961.

17. Carpita N.C., Mccann M.C. The functions of cell wall polysaccharides in composition and architecture revealed through mutations //Plant Soil. -2002. -V. 274. -P. 7180.

18. Vorwerk S., Somerville S., Somerville C. The role of plant cell wall polysaccharide compositionin disease resistance //Trend Sin Plant Science. -2004. -V. 9. -P. 203-209.

19. Mohnen D. Pectin structure and biosynthesis //Curr. Opin. Plant Biol. -2008. -V. 11.-P. 266-277.

20. Caffalla K.H., Mohnen D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides //Carbohydrate Res. -2009. -V. 344. -P. 1879-1900.

21. Yincken J., Schols H.A., Oomen R.J., Mccann M.C. If homogalacturonan were a side chain of rhamnogalacturonan I. Implications for cell wall architecture //Plant. Physiol. -2003. -V. 132.-P. 1781-1789.

22. O'neill ma Ishii Т., Albersheim P., Darvill Ag. Rhamnogalacturonan II: structure and function of a borate cross-linked cell wall pectic polysaccharide //Annu. Rev. Plant. Biol.2004. -V. 55. -P. 109-39.

23. Matsunaga Т., Ishii Т., Matsumoto S. Occurrence of the primary cell wall polysaccharide ramnogalacturonan II in pteridophytes, lycophytes and bryophytes. Implication for the evolution of vascular plants //Plant Physiol. -2004. -V. 134. -P. 339-351.

24. Arnous A., Meyer A.S. Quantitative prediction of cell wall polysaccharide composition in grape (Vitis vinifera L.) and apple (Malus domestica) skins from acid hydrolysis monosaccharide profiles //Agric. Food Chem. -2009. -V. 57. -P. 3611-3619.

25. Kurita O., Fujiwara Т., Yamazaki E. Characterization of the pectin extracted from citrus peel in the presence of citric acid //Carbohydr. Polym. -2008. -V. 74. -P. 725-730.

26. Taherzadeh M.J., Karimi K. Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review //Int. J. Mol. Sci. -2008. -V. 9. -P. 1621-1651.

27. Edwards M.C., Doran-Peterson J. Pectin-rich biomass as feedstock for fuel ethanol production//Appl. Microbiol. Biotechnol. -2012. -V. 95. -P. 565-575.

28. Wilkins M.R., Widmer W.W., Cameron R.G., Grohmann K. Effect of seasonal variations on enzymatic hydrolysis of Valencia orange peel //Proc. Fla State Hort. Soc.2005. -P. 419-422.

29. Ферменты в производстве пищи и кормов /Кислухина. О.В. М.: ДеЛи-принт, 2002. -273 с.

30. Micard M., Renard C., Thibault J.F. Enzymatic saccharification of sugar-beet pulp //Enzyme and Microb. Technol. -1996. -V. 19. -P. 162-170.

31. Hutnan M., Drtil M., Mrafkova L. Anaerobic biodégradation of sugar beet pulp //Biodegradation. -2000. -V. 11. -P. 203-211.

32. Matora A.V., Korshunova V.E., Shkodina O.G., Zhemerichkin D.A., Ptitchkina N.M. Morris E.R. The application of bacterial enzymesfor extraction of pectin from pumpkin and sugar beet //Food Hydrocolloids. -1995. -V. 9. -P. 43-46.

33. Handbook of food enzymology /Whitaker J.R., Voragen A.G., Wong D. New York: Marcel Dekker Inc. Basel, 2003. 1108 p.

34. Cosgrove D.J. Growth of the plant cell wall. Nat. Rev //Mol. Cell Biol. -2005. -V. 6. -P. 850-861.

35. Cardoso P.G., Ribeiro J.B., Teixeira J.A., De Queiroz M.V. Overexpression of the plgl gene encoding pectin lyase in Pénicillium griseoroseum //J. of Industrial Microbiol, and Biotech. -2008. -V. 35, -P. 159-166.

36. Olofsson K., Bertillson M., Liden G. A short review on SSF an interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks //Biotechnology for Biofuels. -2008. -V. 1. -P. 7-14.

37. Zhisheng Y., Hongxun Z. Ethanol fermentation of acid-hydrolyzed cellulosic pyrolysate with Saccharomyces cerevisiae //Bioresour. Technol. -2003. -V. 90. -P. 95-100.

38. Stavrinides A.J., Phipps D. A., Al-Shamma'a A. Current and developing lignocellulosic pretreatment methods for bioethanol production. BEAN (Built Environment & Natural Environment) 5th Annual Conference. Liverpool, UK. 2010. -233 p.

39. Martens-Uzunova E.S. Schaap P.J. Assessment of the pectin degrading enzyme network of Aspergillus niger by functional genomics //Fungal Genet. Biol. -2009. -V. 46. -P. 170-179.

40. Deboy R.T., Mongodin E.F., Fouts D.E., Tailford L.E. Insight into plant cell wall degradation from the genome sequence of the soil bacterium Cellvibro japonicus //J. of Bacteriology. -2008. -V. 190. -P. 5455-5463.

41. Morozova V.V., Gusakov A.V., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. Cellulases of Pénicillium verruculosum //Biotechnol. J. -2010. -V. 5. -P. 871-880.

42. Синицына О.А., Федорова E.A., Правильников А.Г., Рожкова A.M. Выделение и свойства ксилоглюканаз Pénicillium sp //Биохимия. -2010. -Т. 75. -С. 52-62.

43. Короткова О.Г., Семенова М.В., Морозова В.В., Зоров И.Н., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства грибных р-глюкозидаз //Биохимия. -2009. -Т. 74. -С. 699-709.

44. Зоров И.Н., Гусаков А.В., Баразненок В.А., Беккаревич А.О., Окунев О.Н., Синицын А.П., Кондратьева Е.Г. Выделение и свойства целлобиазы из Pénicillium verruculosum //Прикл. биохим. микробиол. -2001.-Т. 37. -С. 687-693.

45. Скомаровский А.А., Марков А.В., Гусаков А.В., Кондратьева Е.Г., Окунев О.Н., Беккаревич А.О., Матыс В.Ю., Синицын А.П. Новые целлюлазы для высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы //Прикл. биохимия и микробиол. -2006. -Т. 6. -С. 674-680.

46. Короткова. О.Г. Получение целлюлазных комплексов с увеличенной осахаривающей способностью на основе рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum. M.: МГУ. 2011. -171 с.

47. Klyosov А.А. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation //Biochem. -1990. -V. 129. -P. 10577-10585.

48. Szakacs G., Reczey K., Hernadi P., Dobozi M. Pénicillium verruculosum WA 30 a new source of cellulase //European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. -1981. -V. 11. -P. 120-124.

49. Короткова О.Г., Рожкова A.M., Матыс Ю.В. и др. Получение комплексных биокатализаторов на основе ферментных препаратов из рекомбинантного гриба

50. Pénicillium verruculosum и применение их в гидролизе отходов деревообрабатывающей промышленности //Катализ в промышленности. -2011. -Т. 5. -С. 61-68.

51. Синицына О.А., Федорова Е.А., Вакар И.М. и др. Выделение и свойства а-галактозидаз Pénicillium canescens //Биохимия. -2008. -Т. 73. -С. 119-130.

52. Синицына О.А., Федорова Е.А., Семенова М.В. и др. Выделение и свойства внеклеточной пектинлиазы Pénicillium canescens //Биохимия. -2007. -Т. 72. -С. 699-706.

53. Серебряный В.А., Вавилова Е.А., Чулкин А.М., Винецкий Ю.П. Клонирование гена эндо-1,4-Р-ксиланазы Pénicillium canescens получение мультикопийных штаммов //Прикл. биохим. и микробиол. -2002. -Т. 38. -С. 495-501.

54. Чулкин А.М., Вавилова Е.А., Беневоленский C.B. Транскрипционный регулятор углеродной катаболитной репрессии Cre А мицелиального гриба Pénicillium canescens //Молекулярная биология. -2010. -Т. 44. -С. 1-11.

55. Рожкова А.М., Волков П.В., Кондратьева Е.А., Сатрутдинов А.Д. и др. Создание продуцентов биотехнологически важных ферментов на основе рекомбинантного штамма гриба Pénicillium canescens //Хранение и переработка сельхозсырья. -2010. -Т. 7. -С. 37-39.

56. Jensen M.H., Otten H., Christensen U. et ail. Structural and biochemical studies elucidate the mechanism of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus //J. Mol. Biol. -2010. -V. 404. -P. 100-111.

57. Yadav S., Kumar P., Yadav D. et ail. Pectinlyase: a review //Proc. Biochem. -2009. -V. 44.-P. 1-10.

58. Семенова M.В., Гришутин С.Г. и Синицын А.П. Выделение и свойства пектиназ из гриба Aspergillus japonicus //Биохимия. -2003. -Т. 68. -С. 686-697.

59. Sharma N., Rathore M., Sharma M. Microbial pectinase: sources, characterization and applications //Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 2012. in publishing: DOI 10.1007/sl 1157-0129276-9.

60. Вавилова Е.А., Винецкий Ю.Л. Индукция синтеза эндо-1,4-/?-ксиланазы и ß-галактозидазы в исходных рекомбинантных штаммах гриба P.canescens //Прикл. биохим. и микробиол. -2003. -Т. 39. -С. 167-172.

61. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V. et all. Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene //Curr. Genet. -1995. -V. 28. -P. 474-477.

62. Brygoo Y., Debuchy R. Transformation by integration in Podospora anserina I. Methodology and phenomenology //Mol. and Gen. Genet. -1985. -V. 200. -P. 128-131.

63. Ballance D.J., Turner G. Gene cloning in Aspergillus nidulans: isolation of iscitrate lyase gene {acuD) //Molec. and General Genetics. -1986. -V. 202. -P. 271-275.

64. Tilburn J., Scchazzocchio C., Taylor G.G. et all. Transformation by integration in Aspergillus nidulans //Gene. -1983. -V. 26. -P. 205-221.

65. Buxton F.P., Gwynne D.I. and Davies R.W. Transformation of Aspergillus niger using the argB gene of Aspergillus nidulans //Gene. -1985. -V. 37. -P. 207-214.

66. Durrens P., Green P.M., Arst H.N. and Scchazzocchio C. Heterologous insertion of transforming DNA and generation of new deletions associated with transformation in Aspergillus nidulans //Mol. and Gen. Genet. -1986. -V. 203. -P. 544-549.

67. Horng J.S., Linz J.E. and Pestka J.J. Cloning and characterization of the trpC gene from an aflatoxigenic strain of Aspergillus parasiticus //Appl. and Env. Microbiol. -1989. -V. 55.-P. 2561-2568.

68. Kelly J.M., Hynes M.J. Transformation of Aspergillus niger by the amdS gene of Aspergillus nidulans //J. EMBO -1985. -V. 4. -P. 475-479.

69. May G.S., Gambino J., Weatherbee J.A. and Morris N.R. Identification and functional analysis of ß-tubulin genes by site-specific integrative transformation in Aspergillus nidulans Hi. of Cell Biol. -1985. -V. 100. -P. 712-718.

70. Kolar M., Punt P.J., van Den Hondel C.A.M.J.J. and Schwab H. Transformation of Penicillium chrysogenum using dominant selection markers and expression of an Escherihia coli lacZ fusion gene //Gene. -1988. -V. 62. -P. 127-134.

71. Banks G.R. Transformation of Ustilago maydis by a plasmid containing yeast 2 micron DNA //Curr. Genet. -1983. -V. 7. -P. 73-77.

72. Ward M., Wilson M.J., Carmona C.L. and Turner G. . The oliC3 gene of Aspergillus niger: isolation, sequence and use as a selectable marker for transformation //Curr. Genet. -1988. -V. 14. -P. 37-42.

73. Carramolino L., Lozano M., Pérez-Arando A. et all. Transformation of Penicillium chrysogenum to sulfonamide resistance //Gene. -1989. -V. 77. -P. 31-38.

74. Orbach M.J., Porro E.B. and Yanofsky C. Cloning and characterization of the gene for |3-tubulin from a benomyl-resistant mutant of Neurosporra crassa and its use as a dominant selectable marker //Mol. And Cell Biol. -1986. -V. 6. -P. 2452-2461.

75. Varadarajalu L.P., Punekar N.S. Cloning and use of sC as homologous marker for Aspergillus niger transformation //J. Microbiol. Methods. -2005. -V. 61. -P. 219-224.

76. Fontaine Т., Simenel C., Dubreucq G. et all. Molecular organization of the alkali-insoluble fraction of Aspergillus fumigatus cell wall //J. Biol. Chem. -2000. -V. 275. -P. 27594-27607.

77. Bernard M., Latge J.P. Aspergillus fumigatus cell wall: composition and biosynthesis //Med. Mycol. -2001. -V. 39. -P. 9-17.

78. Ito H., Fukuda Y., Murata K. and Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations Hi. Bacteriol. -1983. -V. 153. -P. 163-168.

79. Suzuki S., Tada S., Fukuoka M. et all. A novel transformation system using a bleomycin resistance marker with chemosensitizers for Aspergillus oryzae //Biochem. Biophys. Res. Commun. -2009. -V. 29. -P. 42-47.

80. Gruber S. and Seidl-Seiboth V. Self versus non-self: fungal cell wall degradation in Trichoderma //Microbiology. -2012. -V. 158. -P. 26-34.

81. Haakana H., Miettinen-Oinonen A., Joutsjiki V. et all. Cloning of cellulase genes from Melanocarpus albomyces and their efficient expression in Treechoderma reesei //Enzyme and Microbial Technol. -2004. -V. 72. -P. 159-167.

82. Kubodera Т., Yamashita N. and Nishimura A. Transformation of Aspergillus sp. and Trichoderma reesei using the pyrithiamine resistance gene (ptrA) of Aspergillus oryzae //Biosci. Biotechnol. Biochem. -2002. -V. 66. -P. 404-406.

83. Meyer V., Mueller D., Strowig T. et all. Comparison of different transformation methods for Aspergillus giganteus //Curr. Genet. -2003. -V. 43. -P. 371-377.

84. Gruber F., Visser J., Kubicek C.P. and de Graaf L.H. Cloning of the Trichoderma reesei pyrG gene and its use as a homologous marker for a high-frequency transformation system//Curr. Genet. -1990. -V. 18. -P. 447-451.

85. Mach R.L., Schindler M., Kubicek C.P. Transformation of Trichoderma reesei based on the hygromycin В resistance using homologous expression signals //Curr. Genet. -1994. -V. 25. -P. 567-570.

86. Aslanidis C.J., de Jong P. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR) //Nucleic. Asid. Research. -1990. -V. 18. -P. 6069-6075.

87. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов /Синицын А.П., Черноглазов В.М. и Гусаков А.В. М.: Биотехнол, 1993. -152 с.

88. Doner L.W., Irwin P.L. Assay of reducing end groups in oligosaccharide homologues with 2,2'-bicinchoninate //Anal. Biochem. -1992. -V. 202. -P. 50-53.

89. Collmer A. and Reid J. Assay methods for pectic enzymes. //Methods in enzymology. Academic Press. -1988. -V. 161, part B. -P. 329-335.

90. Pitt D. //Methods in enzymology. Academic Press. -1988. -V. 161, part B. -P. 353-359.

91. Справочник биохимика. /Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. М.: Мир, 1991. -481 с.

92. Березин И.В., Рабинович М.Л., Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы //Биохимия. -1977.-Т. 42.-С. 1631-1636.

93. Martens-Uzunova E.S. and Schaap P.J. Assessment of the pectin degrading enzyme network of Aspergillus niger by functional genomics //Fungal. Genet. Biol. -2009. -V. 46. -P. 170-179.

94. Morozova V.V. Gusakov A.G., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. Cellulases of Penicillium verruculosum //Biotechnol. J. -2010. -V. 5. -P. 8718801. БЛАГОДАРНОСТИ