Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Компонентный состав и гидролитическая способность рекомбинантных целлюлазных препаратов на основе гриба Penicillium verruculosum: новые методы оптимизации состава целлюлазного комплекса

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Компонентный состав и гидролитическая способность рекомбинантных целлюлазных препаратов на основе гриба Penicillium verruculosum: новые методы оптимизации состава целлюлазного комплекса"

На правах рукописи

ее

ПРОСКУРИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

Компонентный состав и гидролитическая способность рекомбинантных целлюлазных препаратов на основе гриба РепісіШит уеггисиїозит: новые методы оптимизации состава целлюлазного комплекса

03.01.06-биотехнология (втом числе бионанотсхнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2013

2 8 НОЯ 2013

005539982

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Синицып Аркадий Пантелеймоиович

Официальные оппоненты:

Нифантьев Николай Эдуардович

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии имени Н.Д. Зелинского Российской академии наук (ИОХ РАН), заведующий лабораторией

Скомаровскии Антон Андреевич

кандидат химических наук ЗАО «БиоХимМак Диагностика», специалист по продукции

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина Российской академии наук, г. Пущино

Защита состоится «П~» декабря 2013 года в 15но часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам нри Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 1199.91, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан

» ноября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Целлюлоза - самый распространенный биополимер на Земле. Целлюлозосодержащая биомасса (ЦСБ) - возобновимый и доступный источник сырья и энергии. В больших количествах целлюлозосодержащие отходы накапливаются в процессе переработки леса, а также в целлюлозно-бумажной, сельскохозяйственной и пищевой промышленностях. Российская Федерация обладает обширнейшими запасами леса в мире и развитым сельским хозяйством, поэтому для неё актуальна проблема эффективного использования ЦСБ, переработки отходов лесной и сельскохозяйственной промышленности.

Биоконверсия является одним из самых перспективных и экологически рациональных методов переработки ЦСБ с целью получения сбраживаемых Сахаров, которые в дальнейшем могут быть направлены на биотехнологическую переработку. Ключевым моментом в данном процессе является гидролиз целлюлозы, катализируемый ферментными препаратами (ФП). Целлюлазные ФП чаще всего представляют собой комплекс белков, секретируемых грибными продуцентами, например, грибами родов Trichoderma или Myceliophtora. В данной работе в качестве продуцентов использовали различные штаммы гриба Pénicillium verruculosum, ФП на основе этого гриба обладают высокой гидролитической способностью и являются конкурентоспособной альтернативой современным промышленным ФП.

Ферментные комплексы, осуществляющие эффективную конверсию ЦСБ, содержат целлюлазы - эндоглюканазы (ЭГ), целлобиогидролазы (ЦБГ), Р-глюкозидазы (БГЛ), гемицеллюлазы и различные вспомогательные ферменты. Эффективность гидролиза ЦСБ зависит от ряда факторов, в том числе от сбалансированности состава ФП и от биохимических характеристик индивидуальных компонентов, входящих в состав ферментного комплекса. В мировой практике для создания биотехнологически важных ФП используют различные молекулярно-генетические подходы, которые состоят в комбинации методов генетической инженерии и микробиологии для получения рекомбинантных штаммов-продуцентов, секретирующих комплекс белков с необходимыми свойствами. Поиск новых высокоактивных компонентов ФП и исследование влияния соотношения компонентов в комплексе на процесс гидролиза целлюлозы в перспективе приведет к получению новых ФП, позволяющих снизить стоимость переработки ЦСБ.

Таким образом, создание новых ФП с измененным компонентным составом и увеличенной гидролитической способностью по отношению к ЦСБ является актуальной задачей.

Цели и задачи исследования. Целью исследования являлось получение и изучение свойств ФП на основе новых рекомбинантных штаммов гриба P.verruculosum с модифицированным компонентным составом, обладающих увеличенной эффективностью гидролиза ЦСБ.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

- Продемонстрировать целесообразность трансформации штамма-реципиента P.verruculosum В221-151 генно-инженерной фьюжн-конструкцией, несущей гены одновременно нескольких высокоактивных целлюлолитических ферментов;

- Исследовать свойства препарата на основе штамма P.verruculosum, несущего ген гетерологичной полисахаридмонооксигеназы (ПМО) - эндоглюканазы IV Т. reesei (ЭГ1У), выделить данный фермент в гомогенном виде и исследовать его свойства;

- Осуществить трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum Гист4-БГЛЗ, характеризующегося конститутивной экспрессией ß-глюкозидазы Aspergillus niger, плазмидами, несущими гены различных целлюлолитических ферментов;

- Изучить свойства ФП на основе новых штаммов и исследовать их гидролитическую активность по отношению к ЦСБ, проанализировать компонентный состав новых ФП.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые с помощью метода трансформации грибного штамма-реципиента P.verruculosum В221-151 фьюжн-конструкцией, несущей гены нескольких белков, созданы новые штаммы-продуценты высокоактивных целлюлолитических ферментов. Впервые использован фермент нового типа (ПМО) для повышения эффективности гидролиза целлюлозы ферментными препаратами на основе гриба P.verruculosum. Впервые получены высокоэффективные целлюлазные ФП путём клонирования генов ряда целлюлолитических ферментов (ЭГП, ЦБГ1) в штамм-реципиент P.verruculosum Гист4-БГЛЗ, характеризующийся конститутивной экспрессией БГЛ A.niger.

Показано, что стратегия клонирования генов одновременно нескольких ферментов в составе единой фьюжн-конструкции позволяет получать ферментные комплексы заданного состава. ФП, полученные на основе новых трансформантов целесообразно использовать в качестве усиливающей добавки к целлюлазным ФП. Продемонстрирована целесообразность введения в целлюлазный комплекс нового компонента - ПМО. Присутствие в реакционной смеси данного компонента способно повысить эффективность гидролиза целлюлозы ферментным препаратом более чем на 50%. При использовании в качестве штамма-реципиента для клонирования генов целлюлаз рекомбинантного штамма P.verruculosum Гист4-БГЛЗ, характеризующимся конститутивной экспрессией ß-глюкозидазы A. niger, были получены новые штаммы, секретирующие комплекс ферментов измененного состава. ФП, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum, обладали повышенной (на 20-50%) гидролитической активностью по отношению к ЦСБ, чем ФП, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва 2010), втором международном Конгрессе-

партнеринге и выставке по биотехнологии и биоэнергетике «EurasiaBio» (Москва 2010), международном конгрессе «Биомасса: топливо и энергия» (Москва 2012), VI и VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2011, 2013), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск 2012), Международной конференции «Biocatalysis-2013: fundamentals & applications» (Москва 2012), V Международной конференции «Физико-химия растительных полимеров» (Архангельск 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, а также 9 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы; главы, посвященной материалам и методам исследования; трех глав, в которых приведены полученные результаты и их обсуждение; выводов и списка цитируемой литературы, включающего 124 источника. Работа изложена на 104 страницах и включает 49 рисунков и 10 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы посвящен современным представлениям о методах эффективной биоконверсии ЦСБ. Подробно описано действие многокомпонентных ФП на ЦСБ. Рассмотрены факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза ЦСБ. Описаны состав и структура растительной ЦСБ. Обсуждены современные подходы к повышению гидролитической активности ФП для биоконверсии ЦСБ. Отдельная глава посвящена описанию использованных в работе материалов и методов исследования, приведён список субстратов, реактивов и ферментных препаратов. В последующих главах изложены результаты исследований и их обсуждение.

I. ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ НЕСКОЛЬКИХ ФЕРМЕНТОВ

В состав базового комплекса ферментов для глубокой деструкции целлюлозы входят ферменты трех типов - эндоглюканазы, целлобиогидролазы и Р-глюкозидазы. Повышение содержания ферментов данных трех типов в ФП может привести к увеличению его гидролитической активности. Для повышения уровня секреции одновременно трех типов целлюлаз, применяли новый метод клонирования белков -использование фьюжн-конструкции, представляющей собой ПЦР-продукт, несущий гены трёх целевых ферментов - ЭГП (39 кДа) и ЦБГ1 (ббкДа) P. verruculosum и БГЛ (116 кДа) A.niger. Все три гена собраны в единую конструкцию под контролем индуцибельного промотора ЦБП.

Получение фьюжн-конструкции и трансформация штамма-реципиента Р.\еггиси1о$ит 151 ша!)1'

Фьюжн-конструкция, состоящая из последовательно соединенных генов целлюлаз - БГЛ А.^ег (Ь§1Г), ЭГ II (е,§-III) и ЦБГ1 (сЬкГ) была получена следующим образом. Нуклеотидные последовательности, соответствующие полноразмерным генам е%111 Р.чеггисЫоэит и ЪglI А.niger были амплифицированы методом ПЦР, где в качестве матрицы использовались геномные ДНК штаммов Р.уеггиси1о$ит и A.niger, соответственно. Нуклеотидные последовательности, соответствующие промоторному региону и полноразмерному гену сЪЫ совместно с терминаторной областью гена сЬЫ были амплифицированы методом ПЦР при использовании геномной ДНК штамма Р.уеггиси1о$ит. Далее, методом ПЦР амплифицировалась нуклеотидная последовательность, схематично представленная на рис.1. Общий размер конструкции составил ~7700 п.о.

Рисунок 1. Схема фьюжн-конструкции, используемой для трансформации штамма-реципиента Р.уеггиси1озит 151 шаО1"1.

Таким образом, полученный ПЦР-продукт представлял собой фьюжн-конструкцию, состоящую из последовательно соединенных целевых генов bgU, egШ и сЬМ, находящихся под контролем единого индуцибельного промотора сЪЫ.

Трансформацию штамма-реципиента Р.чеггиайозит РУ-151 шаБ'"' проводили линейной формой фьюжн-конструкции. В качестве трансформирующей использовалась линеаризованная плазмида рБТАЮ, несущая ген нитратредуктазы, обеспечивающий комплементацию дефектного гена шаВ в реципиентном штамме, что позволяло вести отбор трансформантов на среде с нитратом натрия.

Получение новых рекомбинантных ферментных препаратов

Новые рекомбинантные штаммы Р.уеггисиЬяит, полученные при трансформации фьюжн-конструкцей, были проверены на наличие экспрессии целевых белков, в результате отобраны штаммы, которые использовали для дальнейшей наработки ФП. Сухие ФП получали с помощью лиофильного высушивания культуральных жидкостей новых штаммов после ферментации в 1-л ферментёрах. В качестве контроля был использован ФП на основе исходного штамма Р.уеггисиЬяит Р\М51. ФП получены в ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино). Активности новых ФП по отношению к различным субстратам представлены в табл.1.

Результаты исследования гидролитической активности новых рекомбинантных препаратов представлены на рис.2. Проводили гидролиз микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) под действием данных препаратов в следующих условиях: 50 °С, рН 5, [8]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 1000 об/мин. За критерий гидролитической активности принимали концентрацию восстанавливающих Сахаров (ВС) и глюкозы в реакционной смеси через 24 часа после начала процесса гидролиза. С точки зрения выхода глюкозы, препарат РУ-Ф9 показал повышенную гидролитическую активность по отношению к МКЦ, в сравнении с ФГГ на основе исходного штамма Р.уеггисиЬяит Р\М51. Кроме того, препарат РУ-Ф9 (табл.1) обладал повышенной активностью по отношению к п-НФ-(3-0-глюкопиранозиду (пНФГ) и №-карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ), что характерно для комплексов с высоким содержание БГЛ и ЭГ.

Таблица 1. Характеристика ФП на основе рекомбинантных штаммов, полученных трансформацией исходного штамма Р.уєгпісиїозит РУ-151 піаР1'* фьюжн-конструкцией.

Препарат Белок, мг/г Активность (ед/г) по отношению к различным субстратам

КМЦ (50°С, рН 5,0) МКЦ (40°С, рН 5,0) Ксилан (50°С, рН 5,0) пНФГ (40°С, рН 5,0)

РУ-Ф1 856 ±43 5201 ±260 194 ±10 2300 ±115 183 ±9

РУ-Ф2 724 ±36 2145 ±107 164 ±8 1988 ±99 162 ±8

РУ-ФЗ 840 ±42 8649 ±432 218 ±11 543 ±27 852 ±43

РУ-Ф4 842 ±42 5311 ±266 237 ±12 9267 ±463 483 ±24

РУ-Ф5 856 ±43 2108±105 240 ±12 4074 ±204 257 ±13

РУ-Ф6 739 ±37 2568±128 207 ±10 513 ±26 470 ±24

РУ-Ф7 612 ±31 10258±513 181 ±9 1138 ±57 2932 ±147

РУ-Ф8 710 ±36 4868 ±243 170 ±9 і 784 ±89 160 ±8

РУ-Ф9 627 ±31 9362 ±468 162 ±8 936 ±47 2443 ±122

РУ-151 834 ±42 6943 ±347 320 ±16 14498±725 397 ±20

РУ-Ф1 РУ-Ф2 РУ-ФЗ РУ-Ф4 РУ-Ф5 РУ-Ф6 РУ-Ф7 РУ-Ф8 РУ-Ф9 РУ-151

Рисунок 2. Выход продуктов гидролиза (глюкозы и ВС) МКЦ через 24 часа после начала реакции под действием ФП на основе штаммов, несущих фьюжн-конструкцию, и на основе исходного штамма Р.уегтси1о5ит РУ-151. Условия: 50°С, рН 5, [Б]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 1000 об/мин.

Свойста ферментного препарата Р.уеггиси1ошт РУ-Ф9

ФП РУ-Ф9, показавший повышенную гидролитическую активность по отношению к МКЦ, был выбран для дальнейшего изучения его свойств. Электрофореграмма данного препарата представлена на рис.З(А). Для рекомбинантного ФП заметно явное усиление интенсивности полос в области 116 и 39 кДа, соответствующих ЭГН и БГЛ. Кроме того, можно отметить повышение интенсивности белковой полосы, соответствующей ЦБГ1 (ббкДа). При этом полосы, соответствующие другим ферментам контрольного ФП, на электрофореграмме ФП РУ-Ф9 практически отсутствуют. Таким образом, можно предположить, что все три белка, чьи гены формировали фьюжн-конструкцию, в значительных количествах секретируются рекомбинантным штаммом Р.уеггисиЬэит РУ-Ф9.

Для подтверждения этого предположения проводили эксперимент по определению количественного содержания компонентов ФП РУ-Ф9. Для этого ФП РУ-Ф9 фракционировали на анионообменном носителе (хроматограмма представлена на рисунке 3(Б)). В полученных фракциях определяли содержание белка и авицелазную (по МКЦ), КМЦ-азную, ксиланазную и (З-глюкозидазную активности, а также проводили ДДС-электрофорез фракций. Зная общую активность соответствующих фракций по различным субстратам и содержание в них белка, рассчитывали содержание того или иного целевого фермента в препарате. Компонентный состав ФП РУ-Ф9 и контрольного ФП РУ-151 приведён на рис.4.

Ч4'

БГЛ

А итог г

ЦБГ1-—*

ЭГН

,¿5

| 118 | 90

| 27 20

2 1.8 1,6 1,4 1.2 1

0,8 0,6 0,4 0.2 0

ЭГП /

ЦБГ1 БГЛ Д /

2 1 1 A.niger Г.Д-""

11 3

1| I Л4 —' ' 1\ / 10 \

НС

1

0,9 0,8

0,7 £

о.б ё

о

0,5 г

0,4 О

0,3 2

0,2

0,1

0

20 30 40

объем элюента, рил

Рисунок 3. (А). Электрофореграммы ФП РУ-Ф9 и контрольного ФП РУ-151. Электрофореграмма ФП РУ-Ф9 имеет три мажорные полосы, соответствующие ЭГ II (39 кДа), ЦБГ1 (66 кДа) и р-глюкозидазе пг^ег (116 кДа).

(Б). Хроматограмма анионообменного фракционирования препарата РУ-Ф9. Хроматограмма содержит три основных пика, соответствующие целевым ферментам.

Р\М 51

БГЛ А.підег

12% Д Другое

1* 3%

Рисунок 4. Диаграммы, иллюстрирующие компонентный состав препарата РУ-Ф9 и контрольного ФПРУ-151.

Таким образом, было установлено, что в ФП РУ-Ф9 содержит три мажорных компонента: это рекомбинантные белки - ЦБГІ (35% от общего пула белка), ЭГ II (35%) и БГЛ A.niger 116 кДа (12%). При этом РУ-Ф9 содержит другие (собственные) ферменты Р^еггисиїоїит в незначительных количествах. Полученные данные о компонентном составе коррелируют с данными по активности ФП РУ-Ф9 по отношению к различным субстратам (табл.1). Повышенное содержание ЭГП обуславливает высокую активность ФП по отношению к КМЦ, а повышенная активность по пНФГ свидетельствует о высоком содержании в нём гетерологичной БГЛ A.niger.

Известно, что для осуществления эффективного биокаталитического процесса гидролиза целлюлозы необходимо наличие в составе ферментного комплекса эндоглюканаз, целлобиогидролаз и (5-глюкозидаз. С этой точки зрения объяснимо преимущество ФП РУ-Ф9 в случае гидролиза МКЦ над другими рекомбинантными ФП, тем, что РУ-Ф9 содержит три указанных выше фермента в наиболее оптимальном соотношении. При этом следует отметить, что ФП, полученный с помощью исходного штамма Р.уеггисиїояит РV-151 содержит в своём составе, помимо указанных ферментов, и другие компоненты целлюлазного комплекса (в том числе - ЦБГІІ) и, в целом, несколько превосходит по гидролитической активности ФП РУ-Ф9. Препарат РУ-Ф9 содержит незначительное количество ЦБГІІ, недостаток этого фермента может, по-видимому, служить одной из причин, влияющих на его гидролитическую активность.

Препарат РУ-Ф9 как «усиливающая» добавка к ФП РУ-151

Представлялось интересным определить эффективность биокаталитического процесса гидролиза ЦСБ при совместном применении имеющего как основные, так и минорные компоненты ферментного комплекса ФП РУ-151 и РУ-Ф9, содержащего преимущественно основные (ключевые) ферменты. Иными словами, ФП РУ-Ф9 можно использовать как «усиливающую» добавку к ФП РУ-151.

Для этого проводили гидролиз МКЦ смесями ФП РУ-151 и РУ-Ф9, добавляя в реакционную среду эти ФП в различном соотношении, но в таком количестве, чтобы общее содержание белка в реакционной смеси было неизменным и составляло 5 мг на 1г субстрата. Зависимость выхода продуктов гидролиза (ВС и глюкозы) через 24 часа после начала реакции от содержания препарата РУ-Ф9 в смеси представлена на рис.5. Было установлено, что оптимальным соотношением смеси ФП в выбранных условиях эксперимента было 80% РУ-151 и 20% РУ-Ф9 - при таком соотношении ФП наблюдали максимальное увеличение выхода глюкозы при гидролизе МКЦ на 80% (ВС - на 70%) по сравнению с использованием индивидуального ФП РУ-151 в качестве контроля.

Кроме того, определили гидролитическую активность смеси ФП РУ-151 и РУ-Ф9 оптимального состава по отношению к измельченной осиновой древесине. Выход глюкозы был на 65%, в выход ВС - на 40% выше значений, полученных при индивидуальном использовании контрольного препарата.

% РХ/-Ф9

Рисунок 5. Зависимость выхода продуктов гидролиза МКЦ (ВС и глюкозы) от соотношения ФП РУ-151 и РУ-Ф9 в реакционной смеси. По оси абсцисс процент ФП РУ-Ф9 в смеси двух препаратов. Условия: 50°С, рН 5, [8]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата,

перемешивание - 1000 об/мин.

Таким образом, было показано, что при помощи предложенного нами подхода, основанного на использовании фьюжн-конструкции, могут быть одновременно клонированы гены нескольких (целевых) ферментов. Показано, что ФП Р.уеггисиЬэит РУ-Ф9, полученный на основе одного из новых рекомбинантных штаммов, обладает повышенной гидролитической активностью по отношению к целлюлозе. Исследован компонентный состав ФП РУ-Ф9 и установлено, что он содержит все три целевых клонируемых фермента (ЭГ, ЦБГ и БГЛ), и практически не содержит другие ферменты целлюлазного комплекса Р.геггисиїояит. Показано, что

ФП РУ-Ф9, полученный с использованием фьюжн-конструкции, целесообразно использовать в качестве «усиливающей» добавки к ФП, полученному на основе исходного штамма P.verruculosum PV-151, имеющему в своём составе как ключевые, так и минорные компоненты ферментного комплекса. Использование ФП РУ-Ф9 в качестве добавки приводит к увеличению выхода продуктов гидролиза ЦСБ на 2745% при сохранении общего расхода использованных ФП.

II. ЭНДОГЛЮКАНАЗА IV Trichoderma reesei КАК НОВЫЙ КОМПОНЕНТ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ГРИБА Pénicillium verruculosum

Полисахаридмонооксигеназы (ПМО) - малоизученная группа ферментов, способных значительно повысить эффективность гидролиза ЦСБ под действием целлюлазных препаратов. 3FIV T.reesei (одна из известных ПМО) может стать важным компонентом ферментного комплекса целлюлазных ФП на основе рекомбинантных штаммов P.verruculosum.

Ферментный препарат на основе штамма P.verruculosum PV-3riV продуцента ЭГГУ

Методами генетической инженерии в исходный штамм-продуцент P.verruculousm PV-151 niaD*"' была трансформирована экспрессионная плазмида, несущая ген eg!4, кодирующий 3ITV T.reesei (предполагаемая молекулярная масса ЭГГУ составила 35,5 кДа). В результате скрининга был отобран штамм P.verruculosum PV-3ITV, продуцирующий наряду с ферментами целлюлазного комплекса P.verruculosum, значительное количество рекомбинантного фермента 3riV. Выбранный трансформант был использован для дальнейшей наработки сухого ФП, представляющего собой лиофильно высушенную культуральную жидкость после ферментации в 1-л ферментёрах. В качестве контроля использовали сухой ФП, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum PV-I5I. Электрофореграмма препарата PV-3riV (рис.6) характеризовалась полосой с

увеличенной интенсивностью, соответствующей массе белка около 35кДа. >

118

90

Рисунок 6. Электрофореграммы ФП на основе рекомбинантного и исходного штамма 50 P.verruculosum. Электрофореграмма ФП PV-3FVT характеризуется интенсивной полосой в районе 35 36 кДа, соответствующей ЭГ1У T.reesei.

Удельные активности нового ФП РУ-ЭГТУ по отношению к различным субстратам (фильтровальная бумага, МКЦ, КМЦ, ксилан, пНФГ) ниже, чем у контрольного препарата РУ-151, полученного на основе исходного штамма Р.уеггиси^ит (табл.2). Этот факт можно объяснить снижением содержания секретируемых гидролитических ферментов Р.\еггиси1о$ит за счет появления значительного количества ПМО, не обладающего гидролитической активностью.

Таблица 2. Содержание белка и гидролитические активности препаратов РУ-ЭГУ1 и контрольного препарата РУ-151._

Препарат Белок, мг/г Активность (ед/г) по отношению к различным субстратам

КМЦ (50°С, рН 5,0) МКЦ (40°С, рН 5,0) Ксилан (50°С, рН 5,0) пНФГ (40°С, рН 5,0)

РУ-ЭГУ1 519 ±26 4107 ±205 104 ±5 8895 ±445 1689 ±84

РУ-151 834 ±42 6943 ±347 320 ±16 14498 ±725 397 ±20

Компонентный состав ферментного препарата Р.уеггисиїояит РУ-ЭГ1У

Для определения компонентного состава ФП РУ-ЭГГУ использовали метод анионообменного ИРЬС-фракционирования (рис.7), позволяющий отделить ЭГ1У Т.ГЄЄ8ЄІ от других ферментов. Во фракциях определяли активности по отношению к ряду субстратов, а также проводили их ДДС-электрофорез.

Объем элюента. мл

Рисунок 7. Хроматограмма анионообменного фракционирования ФП РУ-ЭГ1У (на хроматограмме приведены номера фракций).

Исходя из объема фракций, концентрации белка в них, данных ДДС-электрофореза, сопоставления активности во фракциях по отношению к различным субстратам (МКЦ, КМЦ, пНФГ, ксилан) с удельными активностями соответствующих ферментов, определяли наличие и содержание в ФП различных индивидуальных ферментов. Состав исследуемых ФП представлен на рис.8.

РУ-151 РУ-ЭПУ

Ц6ГI66

Рисунок 8. Диаграммы, характеризующие компонентный состав ФП РУ-151 и РУ-ЭГГУ.

Содержание в препарате РУ-ЭГ1У гидролаз, в частности ЦБГ (ЦБГІ и ЦБГІІ) — одних из ключевых целлюлолитических ферментов - снижено по сравнению с контрольным препаратом РУ-15І (суммарное содержание ЦБГ в препаратах РУ-ЭГГУ и РV-151 составляет, соответственно, 56% и 40% от общего пула белка). Полученные данные коррелируют с удельной авицелазной активностью ФП, характеризующей активность ЦБГ: препарат РУ-ЭГГУ обладал более низкой авицелазной активностью, чем РУ-151. Содержание ЭГ1У Т.гееяеі в рекомбинантном ФП составило 24%; препарат РУ-ЭГ1У использовали для выделения ЭГГУ Т.гєєбєі в гомогенном виде с целью дальнейшего изучения.

Гидролитическая активность ферментного препарата РУ-ЭГ1У

Сравнивали гидролитическую активность ФП РУ-ЭГ1У и контрольного ФП РУ-151 по отношению к ЦСБ. В качестве таковых использовали измельченную осиновую древесину и МКЦ (в концентрации 100 г/л по сухой массе). За критерий гидролитической активности ФП принимали выход глюкозы и ВС после 24 часов гидролиза, дозировка ФП составляла 5 мг белка на 1 г субстрата. Результаты эксперимента представлены на рис.9.

Несмотря на пониженное содержание гидролитических ферментов, ФП РУ-ЭГ1У гидролизовал ЦСБ эффективнее, чем ФП на основе исходного штамма РУ-151. Выходы ВС при гидролизе МКЦ препаратом РУ-ЭГ1У были на 11%, а выход глюкозы - на 17% выше, чем в случае контрольного ФП. В случае гидролиза измельченной осиновой древесины выходы ВС для ФП на основе рекомбинантного и исходного штаммов- были близки, при этом выход глюкозы под действием ФП РУ-ЭГГV был на 35% выше, чем в случае РУ-151. Таким образом, рекомбинантный целлюлолитический ФП Р. уеп-іісиїояит РУ-ЭГ1У, в состав которого входила ПМО ЭГ1У Т.гееяеі, обладал более высокой гидролитической активностью по сравнению с препаратом, полученным на основе исходного штамма Р. \'еггисігіохит РУ-151, не содержащего ПМО.

Гидролиз МКЦ

PV-151

PV-ЭПУ

Гидролиз измельченной осиновой древесины

к

S J го Q. ь X о ІГ X

о

35 30 25 20 15 10

эвс

I Глюкоза

ph ■ ІН

■

р щ

1 р 8 І

1

PV-151

pv-ariv

Рисунок 9. Выход продуктов гидролиза (ВС и глюкозы) МКЦ и измельченной осиновой древесины под действием ФП PV-151 и PV-ЭПУ через 24 часа после начала реакции. Условия: 50°С, рН 5, [S]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 1000 об/мин.

Выделение ЭГ1У T.reesei в гомогенном виде и изучение её влияния на гидролитические свойства целлюлазного препарата PV-151

Нами была разработана методика, позволяющая выделить ЭГ1У T.reesei из ФП РУ-ЭГ1У, которая основана на хроматографическом фракционировании на анион ообменном носителе Source 15 Q. ФП наносили на колонку в буфере с низкой ионной силой, элюирование белков осуществляли в подобранном возрастающем градиенте концентрации NaCl, что позволило получить ЭПУ в гомогенном виде и далее его лиофилизовать.

Электрофореграмма выделенного ЭГ1У и MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата образца из участка геля ДДС-электрофореза представлены на рис.10. Электрофореграмма содержала только одну полосу с массой ~35кДа, что соответствует массе ЭГ1У T.reesei. Масс-спектр трипсинового гидролизата содержал только пики, соответствующие ЭПУ T.reesei.

Гомогенная ЭГ1У не обладала детектируемой активностью ни по одному из используемых нами стандартных субстратов для определения активности карбогидраз.

ЭПУ|

Т. гее А

200 150 120 100 85 70 60

50 40

30 25 20

Рисунок 10. Электрофореграмма и MALDI масс-спектр трипсинового гидролизата образца белка из геля ДДС-электрофореза ЭПУ Т.гееэеи

Для исследования влияния ЭГ1У Г.геезег на эффективность конверсии ЦСБ комплексным целлюлолитическим ФП проводили эксперимент по гидролизу МКЦ и измельченной осиновой древесины смесью ФП РУ-151 с очищенной ЭПУ. Концентрация субстрата в реакционной смеси составляла 100 г/л. Содержание ФП РУ-151 в реакционной смеси рассчитывали так, чтобы дозировка по белку составляла 2мг на 1 г субстрата. Дозировка ЭПУ Г.геете/ составляла 1 мг/г субстрата. В качестве контроля использовали реакционные смеси, в которые добавляли только ФП РУ-151 (2 мг/г) или только ЭГ1У (1мг/г). Результаты проведённых экспериментов представлены на рис. 11.

Гидролиз МКЦ

- РУ-151

ЭПУ Т.гееэе -РУ-151+ЭПУ Т.1

Гидролиз измельченной осиновой древесины

-РУ-151

ЭПУ Т.гее561 ~ РУ-151+ЭПУ т.|

Время, часы

Рисунок 11. Кинетические кривые образования глюкозы при гидролизе МКЦ (А) и измельченной осиновой древесины (Б) индивидуальной ЭГ1У 7>еауе/, ФП РУ-151, а также их смесью. Условия: 50°С, рН 5, [Б]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 1000 об/мин.

Согласно полученным данным, добавление в реакционную смесь ЭГ1У Т.геевег значительно увеличивает эффективность гидролиза ЦСБ препаратом РУ-151. В условиях эксперимента удалось добиться повышения выхода глюкозы при гидролизе МКЦ на 70%, при гидролизе измельчённой осиновой древесины - на 40%.

В завершение данного раздела можно заключить, что с помощью методов генетической инженерии нами был создан рекомбинантный штамм-продуцент Р.уеггиси1оБит РУ-ЭПУ, который наряду с собственным комплексом целлюлолитических ферментов, продуцировал ПМО (ЭГГУ Т.геезег). На основе нового штамма был получен ФП с высоким содержанием ЭГ1У, обладающий увеличенной гидролитической способностью по отношению к ЦСБ по сравнению с ФП, полученным с помощью исходного штамма Руеггиси\о$ит РУ-151. ЭГ1У была выделена в гомогенном виде. При исследовании свойств ЭГГУ 7>ее.?ег было показано, что её присутствие в реакционной смеси заметно повышает эффективность гидролиза ЦСБ целлюлолитическим ФП РУ-151.

III. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ШТАММА-РЕЦИПИЕНТА Р.уеггисШоБит РУ-Гист4-БГЛЗ шаБ" ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОВЫШЕННОЙ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Согласно результатам исследований, проведенных ранее нашими коллегами, собственный секретируемый ферментный комплекс гриба Р. \'еггиси1о$ит имеет недостаточное содержание БГЛ (около 4% от общего пула секретируемого белка). В нашей лаборатории был создан штамм Р.хеггиси1о$ит РУ-Гист4-БГЛЗ, несущий ген БГЛ А.п'^ег под контролем конститутивного гистонового промотора, секретирующий БГЛ A.niger в достаточном для эффективного гидролиза ЦСБ количестве: ФП на основе данного штамма содержит комплекс целлюлаз Р. уеггиси!охит и 12% БГЛ A.niger. Очевидно, что штамм Р. 1'еггиси!о.5ит РУ-Гист4-БГЛЗ является перспективным реципиентом для клонирования генов различных ферментов с целью получения ФП с увеличенной гидролитической активностью.

Получение новых ферментных препаратов на основе штамма-реципиента Р.геггисиЫит РУ-Гист4-БГЛЗ шаБ'"' при трансформации генами гомологичных ЦБГ1 ббкДа и ЭГИ 39кДа

На основе штамма РУ-Гист4-БГЛЗ был получен реципиентный штамм РУ-Гист4-БГЛЗ шаОм дефектный по нитратредуктазе и подходящий для генно-инженерных манипуляций. Для получения рекомбинантных штаммов с новыми свойствами, в реципиентный штамм трансформировали плазмиду, несущую ген сЪЫ, кодирующий ЦБГ1 (ббкДа) Рл<еггиси1ояит, или же смесь плазмид, несущих гены сЪЫ и eglII. Трансформацию проводили совместно с плазмидой рБТАЮ, несущей ген

нитратредуктазы для комплементации ауксотрофного признака реципиентного штамма.

После скрининга полученных піаЗ(+) трансформантов на основе наиболее активных рекомбинантных штаммов получили сухие ФП и исследовали их гидролитическую активность по отношению к МКЦ и измельченной осиновой древесине (рис.12 и 13). В качестве контрольных использовали препараты на основе штамма Р. уеггисиїотт РУ-151 и на основе штамма с конститутивной экспрессией БГЛ А.^ег РУ-Гист4-БГЛЗ.

Согласно полученным данным, удалось получить ФП с повышенной гидролитической активностью, как в результате трансформации одной плазмидой, так и в результате трансформации парой плазмид в используемый реципиентный штамм.

Б

Рисунок 12. Выход продуктов гидролиза (ВС и глюкозы) МКЦ (А) и измельченной осиновой древесины (Б) под действием ФП, полученных в результате трансформации РУ-Гист4-БГЛЗ плазмидой, несущей ген ЦБП (ббкДа), в сравнении с контрольными ФП на основе исходных штаммов РУ-151 и РУ-Гист4-БГЛЗ. Условия: 50°С, рН 5, [Б]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 1 ООО об/мин.

А

40 і- 35-- S зо- Выходы продуктов гидролиза МКЦ В ВС - ■ Гпкжаза

І 20-ь I , и 15 -—р О 10 — 5 ~~т ІІІІНИІ 11

л" * 4г 4і 4 -Р 4 4л 4* ^ <f4 <Г 4і <Г <Г <П <Г <Г

Б

Рисунок 13. Выход продуктов гидролиза (ВС и глюкозы) МКЦ (А) и измельченной осиновой древесины (Б) под действием ФП, полученных в результате трансформации РУ-Гист4-БГЛЗ плазмидами, несущими гены ЦБГІ (ббкДа) и ЭГН (39кДа), в сравнении с контрольными ФП на основе исходных штаммов PV-151 и РУ-Гист4-БГЛЗ. Условия: 50°С, рН 5, [S]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 1000 об/мин.

Исследование компонентного состава новых рекомбинантных препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента P.verruculosum PV-Гист4-БГЛЗ niaDH

Для анализа компонентного состава были выбраны ФП, характеризовавшиеся повышенной гидролитической активностью к ЦСБ. Были выбраны ФП на основе штаммов с клонированным геном ЦБГІ - РУ-Гист4-ЦБГ4, РУ-Гист4-ЦБГ12, PV-Гист4-ЦБГ14, и ФП на основе штаммов, трансформированных парой плазмид - PV-Гист4-ЭГЗ, РУ-Гист4-ЭГ8. ФП подвергали фракционированию на анионообменном носителе Source 15Q, получали электрофореграммы фракций, определяли гидролитические активности во фракциях, используя полученные данные определяли компонентный состав ФП (табл.3).

Таблица 3. Содержание компонентов новых рекомбинантных ФП на основе трансформантов штамма-реципиента Р.уеггиси\о$ит РУ-Гист4-БГЛЗ маР1"1 (в % от общего пула белка)._

ФП ЦБП 66 ЦБП 55 ЦБГП 60 ЦБГП 50 ЭП 70 ЭГП 39 ЭГ1П 25 БГЛ 116 БГЛ А.т§ег 116 Другие ферменты

РУ-151 (контр. 1) 20 15 10 11 5 3 2 4 30

РУ-Гист4-БГЛЗ (контр.2) 19 13 7 8 5 3 2 3 12 28

РУ-Гист4-ЦБГ4 54 6 6 6 1 3 2 3 3 16

Р У-Гист4-ЦБГ 12 24 13 9 9 5 3 4 4 5 24

РУ-Гист4-ЦБГ14 23 14 10 10 5 3 6 4 5 20

РУ-Гист4-ЭГЗ 25 2 10 6 5 17 7 4 6 19

РУ-Гист4-ЭГ8 22 7 14 7 4 10 6 3 1 26

Исследованные ФП имеют в своем составе некоторое количество БГЛ A.niger, что говорит о том, что штаммы при трансформации сохранили целевой признак -конститутивную экспрессию гена БГЛ А.п'^ег (116 кДа). Все новые рекомбинантные ФП имеют повышенное содержание ЦБП (ббкДа) по сравнению с контролем, что свидетельствует об экспрессии гена этого фермента. ФП РУ-Гист4-ЦБГ4 имеет в своем составе 54% ЦБП (66 кДа), содержание остальных компонентов целлюлазного комплекса, таких как ЦБГП, ЭП и других, снижено. Компонентный состав препаратов РУ-Гист4-ЦБГ12 и РУ-Гист4-ЦБП4 практически одинаков, ферментный комплекс исходного штамма в данных препаратах сохранен, баланс целлобиогидролаз смещен в сторону ЦБП (66 кДа).

ФП на основе штаммов, трансформированных парой плазмид, несущих гены ЦБП (66 кДа) и ЭГП (39 кДа), отличались повышенным содержанием целевых ферментов. Содержание ЭГП и БГЛ A.niger в препарате РУ-Гист4-ЭГЗ значительно выше (17%), чем в препарате РУ-Гисг4-ЭГ8 (10%). Препарат РУ-Гист4-ЭГ8 содержит полный комплекс ферментов Р\verruculosum с повышенным содержанием ЭГП и ЦБП, дополненный небольшим количеством БГЛ A.niger (116 кДа). Повышенное содержание ЦБП и наличие БГЛ А.п'^ег в составе обсуждаемых ФП позволяет предположить, что они способны к эффективному гидролизу ЦСБ.

Сравнение гидролитической активности новых рекомбинантых препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента Р.уеписи1оьит РУ-Гист4-БГЛЗ

Исследовали гидролитическую способность выбранных рекомбинантных ФП по отношению к МКЦ и измельченной осиновой древесине, результаты представлены на рис.14. В качестве контроля использовали ФП на основе штаммов РУ-151 (контроль 1) и РУ-Гист4-БГЛЗ (контроль 2). Отметим, что препарат РУ-Гист4-БГЛЗ (контроль 2) обеспечивал при гидролизе МКЦ на 15% более высокий выход продуктов гидролиза, чем препарат РУ-151 (контроль 1). При гидролизе измельченной осиновой древесины выход ВС для двух контрольных препаратов

А

Б

Рисунок 14. Выходы продуктов гидролиза (ВС и глюкозы) МКЦ (А) и измельченной осиновой древесины (Б) под действием новых рекомбинантных ФП в сравнении с контрольными ФП на основе исходных штаммов РУ-151 и РУ-Гист4-БГЛЗ. Условия: 50°С, рН 5, [8]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 1000 об/мин.

различается незначительно, а выход глюкозы в случае препарата РУ-Гист4-БГЛЗ на 25% выше.

Все исследованные рекомбинантные ФП продемонстрировали повышенную гидролитическую активность в сравнении с контрольными ФП. Наивысшую гидролитическую активность по отношению к МКЦ показал препарат РУ-Гист4-ЦБГ12, что обусловлено повышенным содержанием ЦБГ1 ббкДа и достаточным количеством БГЛ A.niger (5%) в сочетании с другими ферментами целлюлолитического комплекса ферментов Р.уеггиси1оБит. Выход ВС при использовании этого ФП на 75% выше, а выход глюкозы - на 85% выше, чем при гидролизе МКЦ контрольным препаратом РУ-151. Препарат РУ-Гист4-ЦБГ12 гидролизовал МКЦ на 60% эффективнее, чем препарат РУ-Гист4-БГЛЗ.

Выходы продуктов гидролиза МКЦ

35 -■С 30 -

3 ВС

I Глюкоза

га ¡:':.-1 5 т

-----■■

1; | | I

и

Выходы продуктов гидролиза измельченной осиновой древесины

ФП РУ-Гист4-ЦБГ14 со схожим с РУ-Гист4-ЦБГ12 составом также продемонстрировал высокую гидролитическую активность по отношению к МКЦ - он был на 45% эффективнее, чем препарат РУ-Гист4-БГЛЗ (контроль 2).

Выход ВС при гидролизе МКЦ препаратом РУ-Гист4-ЭГ8 (с повышенным содержании ЭГП и ЦБГ1) был на 48% выше, а выход глюкозы - на 30% выше, чем при гидролизе препаратом РУ-Гист4-БГЛЗ (контроль 2). Разница в выходах глюкозы и ВС объясняется недостаточно высоким содержанием БГЛ A.niger (1%) в препарате РУ-Гист4-ЭГ8.

ФП РУ-Гист4-ЦБГ4 и РУ-Гист4-ЭГЗ оказались наименее эффективными среди выбранных рекомбинантных препаратов, что связано с завышенным содержанием ЦБГ1 (54%) в РУ-Гист4-ЦБГ4 и ЭГП (17%) в РУ-Гист4-ЭГЗ, сопровождавшейся редукцией других компонентов комплекса ферментов Р.уеггисиЬяит.

Аналогичная, в принципе, картина наблюдалась при изучении гидролитической активности ФП по отношению к измельченной осиновой древесине. Рекомбинантные ФП по эффективности действия располагались примерно в том же порядке, что и в случае гидролиза МКЦ, но наибольшая гидролитическая активность по отношению к осиновой древесине была продемонстрирована ФП РУ-Гист4-ЭГ8. По сравнению с гидролизом данного субстрата ФП РУ-151 (контроль 1), препарат РУ-Гист4-ЭГ8 позволил получить на 30% больше ВС и на 75% больше глюкозы, и примерно на 39% больше продуктов гидролиза, чем ФП РУ-Гист4-БГЛЗ (контроль 2). Вероятно, это связано с наличием в измельчённой осиновой древесине значительного количества аморфной целлюлозы, которая является субстратом для ЭГ. Поэтому при этого субстрата больше раскрывается потенциал ФП РУ-Гист4-ЭГ8 с повышенным содержанием ЭГП.

Таким образом, в ходе наших исследований были изучены рекомбинантные ФП, полученные при использовании реципиентного штамма РУ-Гист4-БГЛЗ для гомологичного клонирования генов целевых ферментов (клонированием гена ЦБГ1, а также совместным клонированием генов ЦБГ1 и ЭГП). Продемонстрировано, что метод трансформации штамма РУ-Гист4-БГЛЗ плазмидами, несущими гены целевых белков позволяет получить высокоэффективные целлюлазные ФП требуемого состава. При трансформации в штамм-реципиент плазмиды, несущей ген ЦБГ1, в секретируемом комплексе ферментов повышалось содержание ЦБГ1 66 кДа, при трансформации пары плазмид, несущих гены ЦБГ1 (ббкДа) и ЭГП (39кДа), добились повышения содержания в комплексе обоих соответствующих белков. ФП, полученные на основе новых штаммов-продуцентов, обладали повышенной гидролитической активностью по отношению к ЦСБ.

Трансформация штамма-реципиента Р.\еггиси1отт РУ-Гист4-БГЛЗ та!)'"1 плазмидами, несущими гены ЭГГУ 7>ее$«, ЦБГ1 ббкДа и ЭГИ 39кДа Р. геггисШоБит

Как было показано выше, наличие ЭГГУ 7>еа$е/ в составе комплекса целлюлолитических ферментов может значительно увеличить гидролитическую активность ФП. Кроме того, в ходе исследований мы показали, что методом трансформации штамма РУ-Гист4-БГЛЗ плазмидами, несущими гены целевых ферментов, можно с высокой вероятностью получить штаммы, секретирующие комплекс ферментов с необходимым составом.

Штамм-реципиент РУ-Гист4-БГЛЗ шаО(_) был трансформирован плазмидами, несущими гены трех белков - ЦБГ1 (ббкДа) и ЭГИ (39кДа) Рл>еггиси1охит и ЭГ1У Т. ree.se!. При проведении скрининга трансформантов, был обнаружен рекомбинантный штамм, секретирующий все целевые белки, в том числе и БГЛ A.mger, экспрессия которого контролируется конститутивным промотором. На основе нового рекомбинантного штамма-продуцента был получен ФП РУ-Гист4-ЭГ1У, изучены его компонентный состав и гидролитическая активность.

Компонентный состав ФП определяли с помощью описанного выше метода хроматографического фракционирования на анионообменном носителе. При изучении компонентного состава важно было доказать наличие в препарате гетерологичных белков - ЭГ1У Т.гее.че1 и БГЛ A.niger. Для уточнения и идентификации содержания во фракциях гетерологичных ЭГГУ Г.гееле/ и БГЛ A.niger, из полученных ДЦС-электрофорезов были вырезаны участки геля, которые соответствуют массам целевых белков — 35 и 116 кДа и осуществлен их анализ с помощью МАЬОГ-ТОР масс-спектрометрии, результаты которого показали, что исследуемый ФП имеет в своем составе указанные белки (результаты масс-спектрометрического анализа представлены в приложении к диссертации). Компонентный состав ФП РУ-Гист4-ЭГ1У представлен в табл.4 (в качестве контроля использовали ФП на основе штаммов РУ-151 - контроль 1, и РУ-Гист4-БГЛЗ -контроль 2).

Таблица 4. Содержание основных компонентов ферментного комплекса рекомбинантного ФП на основе нового штамма Р.уеггисиїозит РУ-Гист4-ЭГТЯ (в % от общего пула белка).

Препарат ЦБГІ 66 ЦБГІ 55 ЦБГ 1160 ЦБГ II 50 ЭГ I 70 ЭГ II 39 ЭГ III 25 БГЛ 116 БГЛ A.nigєr ЭГ1У Т.геезеі Другие ферменты

РУ-151 (контр. 1) 20 15 10 11 5 3 2 4 - - 30

РУ-Гист4-БГЛЗ (контр.2) 19 13 7 8 5 3 2 3 12 - 28

РУ-Гист4-ЭГ1У 30 13 9 7 3 13 2 4 2 3 16

Согласно полученным данным, содержание ЭГП и ЦБГІ в новом ФП выше, чем в контрольных препаратах. Этот факт говорит о том, что гены данных белков были интегрированы в хромосому реципиентного штамма и экспрессируются. Наличие в препарате БГЛ A.niger свидетельствует о том, что целевой признак штамма-реципиента в результате генно-инженерных манипуляций не утрачен. Наличие в препарате ЭПУ Г.геезег и повышенное содержание ЭГП и ЦБГІ является свидетельством того, что три типа плазмид, которые были использованы для трансформации штамма-реципиента, повлияли на состав секретируемого комплекса ферментов.

Компонентный состав ФП РУ-Гист4-ЭПУ отличается от состава собственного комплекса гриба Р.уеггисиЬяит повышенным содержанием гомологичных целлюлаз ЭГП и ЦБГІ кДа и наличием двух гетерологичных белков (ЭГ1У и БГЛ), что должно способствовать повышению гидролитической активности этого рекомбинантного ФП. Таким образом, цель - с точки зрения изменения состава секретируемого ферментного комплекса для рекомбинантного штамма Р.чеггисиїозит РУ-Гист4-ЭГГУ - была достигнута.

Результаты исследования гидролитической активности нового ФП РУ-Гист4-ЭГ1У по отношению к МКЦ и к измельченной осиновой древесине представлены на рисунке 15.

Гидролиз МКЦ

■ И ВС В Глюкоза

Гидролиз измельченной осиновой древесины

I ВС I Глюкоза

РУ-151 РУ-Гист4- РУ-Гист4-БГЛЗ ЭПУ

РУ-151

Р\/-Гист4-БГЛЗ

РУ-Гист4-ЭПУ

Рисунок 15. Выход продуктов гидролиза (ВС и глюкозы) МКЦ и измельченной осиновой древесины препаратом РУ-Гист4-ЭГТЯ в сравнении с контрольными препаратами на основе исходных штаммов РУ-151 и РУ-Гист4-БГЛЗ. Условия: 50 С, рН 5, [8]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 1000 об/мин.

Гидролитическая активность ФП РУ-Гист4-ЭГ1У была значительно выше, чем таковая для контрольных ФП. Выход глюкозы при гидролизе МКЦ ФП РУ-Гист4-ЭГ1У был на 50% выше, чем для препарата РУ-151 и на 30% выше, чем для РУ-Гист4-БГЛЗ, выход ВС был, соответственно, на 60% и 45% выше. При гидролизе измельченной осиновой древесины удалось добиться увеличения выхода глюкозы на 55%, и увеличения выходов ВС на 15% в сравнении с контрольным ФП РУ-151. Гидролитическая активность нового ФП по отношению к данному субстрату на 25% выше в сравнении с контрольным ФП РУ-Гист4-БГЛЗ.

Таким образом, были изучены свойства нового ФП на основе рекомбинаниного штамма, полученного при использовании штамма РУ-Гист4-БГЛЗ (обладающего конститутивной экспрессией БГЛ A.niger) в качестве реципиента для клонирования генов трех белков - ЦБГ1 (ббкДа) и ЭГИ (39кДа) Р. \'еггиси1оаит и ЭГ1У Т.гее.че'1. Продемонстрировано, что гидролитическая активность данного препарата значительно выше, чем гидролитическая активность контрольных препаратов на основе исходных штаммов. Установлено, что содержание собственных целевых ферментов (ЦБГ1 ббкДа и ЭГН 39кДа) в данном ФП повышено в сравнении с контрольными ФП, что свидетельствует об успешном гомологичном клонировании генов данных ферментов. Доказано наличие в данном ФП двух целевых гетерологичных белков - БГЛ A.niger и ЭГ1У Г.гееаел Можно утверждать, РУ-Гист4-ЭГГУ является комплексным ферментным препаратом нового типа с высокой гидролитической активностью по отношению к ЦСБ.

выводы

1. Проанализированы свойства и компонентный состав ферментных препаратов (ФП), полученных на основе рекомбинантных штаммов PenicUliun verruculosum, созданных при использовании генно-инженерной фьюжн-конструкции для клонирования генов нескольких ферментов одновременно. Продемонстрирована целесообразность использования рекомбинантных ФП, полученных таким методом, в качестве «усиливающей» добавки к целлюлазному ФП на основе реципиентного штамма P.verruculosum PV-151; при этом эффективность гидролиза микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) увеличивается на 70% при сохранении общего расхода ФП неизменным.

2. Установлено, что штамм гриба P.verruculosum, несущий ген полисахаридмонооксигеназы (ПМО), представляющей собой эндоглюканазу IV (ЭГ1У) Trichoderma reesei, продуцирует ЭГ1У в активной форме. Обнаружено, что присутствие ЭГ1У Т. reesei в реакционной смеси повышает выход продуктов гидролиза МКЦ и измельченной осиновой древесины целлюлазным комплексом Р. verruculosum на 70% и 40%, соответственно.

3. Показано, что при использовании штамма Р.verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ, обладающего конститутивной экспрессией ß-глюкозидазы Aspergillus niger, для клонирования генов целевых белков (эндоглюканаз, целлобиогидролаз, ПМО), могут быть получены новые штаммы P.verruculosum, продуцирующие высокоактивный комплекс целлюлолитических ферментов. ФП, полученные на основе новых штаммов, обладают повышенной гидролитической активностью по отношению к МКЦ и к измельченной осиновой древесине и приводят к увеличению выхода продуктов гидролиза на 60% до 40%, соответственно, по сравнению с ФП на основе исходного штамма P.verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ.

4. Показано, что целлюлазные ФП с повышенной гидролитической активностью по отношению к целлюлозосодержащим субстратам можно получить путём создания рекомбинантных штаммов P.verruculosum при использовании различных подходов:

- использование фьюжн-конструкций для клонирования генов нескольких целлюлолитических ферментов одновременно;

- введение в секретируемый комплекс целлюлолитических ферментов ПМО (ЭГ1У Т.reesei).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Проскурина О.В., Короткова О.Г., Рожкова А.М., Матыс В.Ю., Кошелев А.В., Окунев О.Н., Немашкалов В.А., Синицына О.А., Синицын А.П. Применение технологии «фъюжн» для создания высокоэффективных биокатализаторов на основе рекомбинантных штаммов гриба Pénicillium verruculosum для конверсии целлюлозосодержащей биомассы. Катализ в промышленности, № 5, 2013, с. 65-73.

2. Проскурина О.В., Короткова О.Г., Рожкова А.М., Матыс В.Ю., Кошелев А.В., Окунев О.Н., Немашкалов В.А., Синицына О.А., Ревин В.В., Синицын А.П. Эндоглюканаза IV Trichoderma reesei - новый компонент биокатализаторов на основе целлюлазного комплекса гриба Pénicillium verruculosum для гидролиза целлюлозосодержащей биомассы. Катализ в промышленности, № 6, 2013, с. 73-80.

Тезисы докладов:

1. Правильников А.Г., Проскурина О.В., Синицын А.П. Разработка оптимальной схемы определения компонентного состава ферментных препаратов гриба Pénicillium verruculosum. Материалы московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов», 15-17 марта, 2010, Москва, с. 310.

2. Правильников А.Г., Проскурина О.В., Синицын А.П. Определение компонентного состава внеклеточных ферментов, секретируемых рекомбинантным штаммом Pénicillium verruculosum, несущим гетерологичный ген Xyl А при помощи экспрессного FPLC-метода. Материалы 2-ого международного Конгресса-партнеринга и выставки по биотехнологии и биоэнергетики «EurasiaBio», 13-15 апреля 2010 г, Москва, с. 150.

3. Правильников А.Г., Проскурина О.В.. Синицын А. П. Получение оптимального гидролитического комплекса на основе целлюлаз Pénicillium sp. и глюкозидазы Aspergillus japonicus для эффективного осахаривания лигноцеллюлозного сырья, VI Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Часть 1, Секция 4, 21-25 марта 2011, Москва, с. 366-367.

4. Проскурина О.В.. Матыс В.Ю., Рожкова А.М., Синицын А.П. Рекомбинантные технологии для создания высокоэффективных комплексов ферментов карбогидраз. Международная научная конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии», 3-5 октября 2012, Саранск, с. 145.

5. Проскурина О.В.. Рожкова А.М., Осипов Д.О., Синицын А.П. Эндоглюканаза IV Trichoderma reesei как эффектор в процессе гидролиза целлюлозы ферментным комплексом Pénicillium verruculosum. Международная научная конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии», 3-5 октября 2012, Саранск, с. 146.

6. Проскурина О.В., Синицын А.П. Влияние зндоглюканазы IV Trichoderma reesei на гидролитические свойства целлюлазного комплекса Pénicillium verraciilosum. Международный конгресс «Биомасса: топливо и энергия», 17-18 апреля, 2012, Москва, с. 62.

7. Проскурина О.В. Синицын А.П. Гликозилгидролазы 61 семьи гриба Chrysospurium lucknovense как новый компонент ферментного комплекса для биоконвсрсии лигноцеллюло'зной биомассы. VII Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Часть 1, Секция 4, 21-25 марта 2013 г, Москва, с. 290.

8. Proskurina O.V., Rozhkova A.M, Korotkova О.G., Kondraticva E.G., Sinitsyna О.A., Sinitsyn A.P. Fusion-tcchnology for the création of high-effectivc carbohydrase préparations. International conférence Biocatalysis-2013: fundamentals & applications, Moscow, July 2-5, 2013, p. 114.

9. Проскурина О.В.. Рожкова A.M., Волков П.В., Осипов Д.О., Синицын А.П. Новая группа ферментов для конверсии лигноцеллюлозной биомассы. V Международная конференция «Физико-химия растительных полимеров», 8-11 июля 2013, Архангельск, с. 187.

Автор выражает благодарность коллегам из Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук и Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (г. Пущино) за предоставленные ферментные препараты.

Подписано в печать 14.11.2013 Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ № 2410 полиграфии Научной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова 1 19192 Москва, Ломоносовский проспект, 27

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Проскурина, Ольга Владимировна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

04201452757

ПРОСКУРИНА Ольга Владимировна

КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ И ГИДРОЛИТИЧЕСКАЯ СПОСОБНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ГРИБА Pénicillium verruculosum: НОВЫЕ МЕТОДЫ ОПТИМИЗАЦИИ СОСТАВА ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА

03.00.23 - биотехнология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

д.х.н., профессор Синицын А.П.

МОСКВА - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................................................................................6

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................................................................8

ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩАЯ БИОМАССА......................................................................................8

1.1. Лигно целлюлозные материалы......................................................................................................................................8

1.2. Состав целлюлозосодержащей биомассы из различных источников..........................................9

1.3. Структура клеточной стенки растений..................................................................................................................10

1.4. Целлюлоза..........................................................................................................................................................................................11

1.5. Предобработка лигно целлюлозного сырья............................................................................................................13

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕЙ

БИОМАССЫ....................................................................................................................................................................................................15

2.1. Гликозил-гидролазы..............................................................................

2.2. Механизм действия О-гликозил-гидролаз......................................................

2.3. Общие представления о ферментативной деградации растительной биомассы............18

2.4. Особенности строения и свойств целлюлолитических ферментов................................................19

2.5. Полисахаридмонооксигеназы, особенности классификации..............................................................23

2.6. Механизм окислительного расщепления целлюлозы под действием полисахаридмонооксигеназ..................................................................................................................................................................24

2.7. Эндоглюканаза IV Trichoderma reesei......................................................................................................................25

2.8. Современные представления о механизме биодеградации целлюлозы....................................27

ГЛАВА 3. ПРОДУЦЕНТЫ ЦЕЛЛЮЛАЗ И ЦЕЛЛЮЛАЗНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ

ПРЕПАРАТЫ....................................................................................................................................................................................30

3.1. Промышленные целлюлазные ферментные препараты..........................................................................30

3.2. Ферментный комплекс Pénicillium verruculosum..............................................................................................31

3.3. Реципиентные штаммы Pénicillium verruculosum..........................................................................................33

3.4. Принципы создания рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum, несущих гетерологичные гены карбогидраз............................................................................................................................35

3.5. Современные подходы к повышению эффективности процесса биодеградации целлюлозосодержащей биомассы..........................................................................................................................................36

II. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................................................................................................................39

ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ....................................39

4.1. Ферментные препараты..........................................................................................................................................................39

4.2. Субстраты............................................................................................................................................................................................39

4.3. Прочие реактивы............................................................................................................................................................................40

4.4. Хроматографические сорбенты........................................................................................................................................40

4.5. Культивирование трансформантов Pénicillium verruculosum..............................................................41

4.6. Хроматографическое фракционирование ферментных препаратов для определения компонентного состава........................................................................................................................................................................41

4.7. Определение концентрации белка..............................................................................................................................42

4.8. Определение биохимических характеристик ферментов........................................................................42

4.9. Методы определения активности ферментов ....................................................................................................42

4.10. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков..............................44

4.11. Гидролиз целлюлозосодержащей биомассы......................................................................................................45

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................................................................................46

ГЛАВА 5. ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО КЛОНИРОВАНИЯ

ГЕНОВ НЕСКОЛЬКИХ ФЕРМЕНТОВ ....................................................................................................................................46

5.1. Получение фьюжн-конструкции и трансформация штамма-реципиента

P. verruculosum 537 niaD^..................................................................................................................................................................46

5.2. Получение и скрининг ферментных препаратов............... ................................................................47

5.3. Компонентный состав новых рекомбинантных ферментных препаратов..............................51

5.4. Свойства ферментного препарата P.verruculosum РУ-Ф9........................................................................55

5.5. Ферментный препарат P.verruculosum РУ-Ф9 как добавка к препарату

P.verruculosum PV-151........................................................................................................................................................................59

ГЛАВА 6. ЭНДОГЛЮКАНАЗА IV Т.reesei КАК НОВЫЙ КОМПОНЕНТ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ГРИБА Р. verruculosum..................... 63

6.1. Ферментный препарат на основе штамма Р.verruculosum PV-3TIV - продуцента эндоглюканазы IV Т. reesei.............................................................................. 63

6.2. Компонентный состав ферментного препарата Р.verruculosum PV-ЭПУ............... 65

6.3. Гидролитическая активность ферментного препарата Р. verruculosum PV-ЭПУ....... 67

6.4. Выделение эндоглюканазы IV T.reesei в гомогенном виде и изучение ее влияния на гидролитические свойства целлюлазного препарата Р. verruculosum PV-151................ 69

ГЛАВА 7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ШТАММА-РЕЦИПИЕНТА Р.verruculosum РУ-ГИСТ4-БГЛЗ niaD() ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОВЫШЕННОЙ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ.............................................................. 73

7.1. Получение новых ферментных преператов на основе штамма-реципиента Р. verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ niaD( ) при трансформации плазмиды, несущей ген гомологичной ЦБГ1 ббкДа............................................................................... 74

7.2. Исследование компонентного состава новых ферментных препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента Р.verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ гпаЭ^полученных

7 f\

при трансформации плазмиды, несущей ген гомологичной ЦБГ1 ббкДа......................

7.3. Получение новых ферментных преператов на основе штамма-реципиента Р.verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ niaD("' при трансформации плазмид, несущих гены гомологичных ЦБГ1 ббкДа и ЭГН 39кДа............................................................ g j

7.4. Исследование компонентного состава новых ферментных препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента Р.verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ niaD("\

83

полученных при трансформации плазмид, несущих гены ЦБГ1 ббкДа и ЭГП 39кДа......

7.5. Сравнение гидролитической активности новых рекомбинантых препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента Р. verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ............... gg

7.6. Получение новых ферментных препаратов на основе штамма-реципиента Р.verruculosum PV-rHCT4-Bni3 niaD(_) при трансформации плазмидами, несущими гены ЦБГ1 ббкДа Р.verruculosum, ЭГП 39кДа Р. verruculosum и ЭГ1У 35кДа T.reesei.............. 88

ВЫВОДЫ........................................................................................................ 94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................... 95

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ферменты

ЦБГ - целлобиогидролаза;

ЭГ - эндоглюканаза;

БГЛ - (3-глюкозидаза;

ПМО - полисахаридмонооксигеназа;

Прочие сокращения

ЦСБ - целлюлозосодержащая биомасса;

ФП - ферментный препарат;

СП - степень полимеризации

ЦСМ - целлюлозосвязывающий модуль

КЖ - культуральная жидкость

КМЦ - №-соль карбоксиметилцеллюлозы

МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза

пНФГ - п-нитрофенил- р -Б-глюкопиранозид

ВС - восстанавливающие сахара

ДДС-ЭФ - электрофорез в денатурирующих условиях

НС - несвязавшаяся фракция

ВВЕДЕНИЕ

Целлюлоза - самый распространенный биополимер на Земле. Целлюлозосодержащая биомасса (ЦСБ) - возобновимый, легко доступный источник сырья и энергии. В больших количествах целлюлозосодержащие отходы накаливаются в процессе переработки леса, а также в целлюлозно-бумажной, сельскохозяйственной и пищевой промышленностях [1]. Российская Федерация обладает обширнейшими запасами леса в мире и развитым сельским хозяйством, в России находится 10 % всех пахотных земель мира. Для Российской Федерации актуальна проблема эффективного использования ЦСБ, переработки отходов лесной и пищевой промышленности, а также сельского хозяйства.

Одним из самых перспективных и экологически рациональных методов переработки ЦСБ является биодеградация полисахаридов, входящих в ее состав, с целью получения сбраживаемых Сахаров. Конверсия полисахаридов в простые сахара протекает под действием комплекса ферментов карбогидраз. Получаемые сахара могут быть превращены с помощью микроорганизмов в спирты (моторное топливо), амино- и органические кислоты, которые в дальнейшем могут быть трансформированы в разнообразные полезные продукты, включая полимерные материалы, продукты для фармацевтической промышленности, пищевые и кормовые добавки [2,3,4].

Биоконверсия ЦСБ осуществляется под действием ферментных препаратов. Целлюлазные ферментные препараты (ФП) чаще всего представляют собой ферментный комплекс, секретируемый грибными продуцентами, например, грибами родов Trichoderma или Myceliaphtora. В данной работе в качестве продуцентов использовали различные штаммы гриба Pénicillium verruculosum, препараты на основе данного гриба обладают высокой гидролитической активностью и являются альтернативой современным промышленным препаратам [5].

Эффективность гидролиза ЦСБ зависит от ряда факторов, в том числе от биохимических характеристик ферментов, входящих в состав ферментного комплекса, и от сбалансированности состава ФП. Базовый комплекс ферментов для глубокой деструкции целлюлозы включает в себя ферменты трех типов - эндоглюканазы (ЭГ), целлобиогидролазы (ЦБГ), р-глюкозидазы (БГЛ). Ферментные комплексы, осуществляющие эффективную конверсию ЦСБ, многокомпонентны и содержат целлюлазы, гемицеллюлазы и различные вспомогательные ферменты. К вспомогательным компонентам целлюлазного комплекса относят сволленин, лигнолитические ферменты, полисахаридлиазы, оксидазы и др. [6].

Полисахаридмонооксигеназы (ПМО) - один из типов вспомогательных ферментов. В ходе исследований последних лет было обнаружено, что присутствие в реакционной смеси ферментов данного типа значительно увеличивает эффективность конверсии целлюлозосодержащих субстратов ферментными препаратами [7]. Изучение влияния ПМО на процесс гидролиза целлюлозы в перспективе приведет к повышению гидролитической активности целлюлазных препаратов.

Целью исследования являлось получение и исследование свойств ферментных препаратов на основе новых рекомбинантных штаммов гриба Pénicillium verruculosum с модифицированным компонентным составом, обладающих увеличенной эффективностью гидролиза ЦСБ.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

Продемонстрировать целесообразность трансформации штамма-реципиента P. verruculosum В221-151 генно-инженерной фьюжн-конструкцией, несущей гены одновременно нескольких высокоактивных целлюлолитических ферментов;

- Исследовать свойства препарата на основе штамма P.verruculosum, несущего ген гетерологичной полисахаридмонооксигеназы (ПМО) - эндоглюканазы IV T.reesei (ЭГ1У), выделить данный фермент в гомогенном виде и исследовать его свойства;

- Осуществить трансформацию штамма-реципиента Р .verruculosum Гист4-БГЛЗ, характеризующегося конститутивной экспрессией ß-глюкозидазы Aspergillus niger, плазмидами, несущими гены различных целлюлолитических ферментов;

- Изучить свойства ФП на основе новых штаммов и исследовать их гидролитическую активность по отношению к ЦСБ, проанализировать компонентный состав новых ФП.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩАЯ БИОМАССА

1.1. Лигноиеллюнозные материалы

На Земле ежегодно производится 200*109 тонн растительной биомассы, из них 90% -лигноцеллюлозные материалы. Целлюлозосодержащая биомасса - наиболее крупномасштабный источник возобновляемого сырья для различных нужд, но при этом наименее освоенный [1,8]. Использование ЦСБ, перспективно, ввиду того, что не затрагивает интересов пищевой промышленности [9].

К целлюлозным материалам, которые могут быть пригодны как сырье для получения Сахаров, относятся отходы лесопиления и деревообработки, а также переработки сельскохозяйственных культур. Критериями использования того или иного типа сырья являются их стоимость, размеры запасов, возможности концентрирования их в районе расположения гидролизного производства и другие [10].

Крупнейшим на сегодняшний день источником ЦСБ являются древесные отходы. Для Российской Федерации, страны с обширнейшими запасами леса в мире, древесное сырье является наиболее перспективным источником целлюлозы. В 2012 году на территории России было заготовлено около 200 млн. м3 необработанной древесины, древесные отходы составили 75 млн м3. На лесосеках и производственных площадях скапливается большое количество древесных отходов, что создает экологические проблемы [11].

Багасса сахарного тростника является основным видом ЦСБ доступным в больших количествах в тропических странах. Индия производит около 300 млн. тонн в год сахарного тростника, багассы при этом вырабатывается 75 млн. тонн в пересчете на сухую массу [12]. Бразилия производит около 750 млн. тонн сахарного тростника ежегодно. Для этих и ряда других стран багасса сахарного тростника может стать постоянным сырьем для биотехнологического производства [10].

Другим широко распространенным источником целлюлозы являются стебли риса. Ежегодно по всему миру производится более 700 млн. тонн этого сырья [13]. К важным источникам ЦСБ можно отнести также кукурузные стебли, пшеничную солому, муниципальные отходы, макулатуру [10].

Интересным представляется использование в качестве сырья промышленных отходов, содержащих делигнифицированную, или обработанную иным способом целлюлозу, например, отходы вискозных заводов. В отличие от древесной и хлопковой, эта целлюлоза в значительной степени аморфизована [14], что делает ее более доступной для действия гидролитических ферментов.

1.2. Состав целлюлозосодержащей биомассы из различных источников

ЦСБ, в зависимости от происхождения, значительно отличаются по составу. Так, бытовые и промышленные отходы отличаются высоким содержанием целлюлозы и низким содержанием других компонентов. В травах, коре и зеленых частях многолетних растений обнаруживается большое количество гемицеллюлоз и лигнина, солома также лигнифицирована. Древесина хвойных пород богата целлюлозой, в меньшей степени гемицеллюлозой. Древесина лиственных деревьев отличается от древесины хвойных меньшим содержанием лигнина и отсутствием смол. В табл.1 представлен полисахаридный состав ЦСБ различного происхождения.

Таблица 1. Химический состав ЦСБ из различных источников [10,13].

Вид сырья Целлюлоза, % Гемицеллюлоза, % Лигнин, %

Лиственная древесина 40-55 30-35 18-25

Хвойная древесина 40-45 25-30 25-35

Травянистые растения 25-40 25-50 10-30

Кукурузные стебли 39-47 26-31 3-5

Солома пшеницы 37-41 27-32 13-15

Багасса сах. тростника 32-44 19-24 25-32

Стебли риса 30-35 25-30 15-28

Газетная бумага 40-55 25-40 18-30

Целлюлозная пульпа 60-80 20-30 2-10

При выборе сырья, подлежащего переработке, следует учитывать его состав, поскольку наличие или отсутствие того или иного компонента может значительно влиять на ход процессов ферментативной деструкции.

1.3. Структура клеточной стенки растений

Клеточная стенка составляет значительную часть растительного организма: ее содержание в травянистых растениях составляет до 70% сухой массы, а в древесных растениях достигает 90%. Основные компоненты растительной клетки - самые распространенные органические соединения на Земле [15,16].

Толщина клеточной стенки обычно колеблется от 0,1 до 10 мкм. Ее состав зависит от вида растения и может сильно варьироваться в различных органах и тканях одного растения. Основными компонентами клеточной стенки являются полисахариды, фенольные соединения (лигнин), белки. Упомянутые компоненты структурированы в матриксе, который представляет собой водный гель (75% воды) (рис.1). Матрикс клеточной стенки имеет определенный рН, значения которого обычно колеблются между 4 и 5 [15].

ГЛИКАНОВЫЕ СШИВКИ

. .V -У . >

Компо