Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение целлюлазных комплексов с увеличенной осахаривающей способностью на основе рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение целлюлазных комплексов с увеличенной осахаривающей способностью на основе рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum"

На правах рукописи

КОРОТКОВА ОЛЬГА ГЕНРИХОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ С УВЕЛИЧЕННОЙ ОСАХАРИВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ PENICILLIUM VERRUCULOSUM

03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.15 - кинетика и катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2011 1 2 МАЙ 2011

4846084

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и в Учреждении Российской Академии наук Институте биохимии имени А.Н.БАХА РАН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Синицын А.П. кандидат химических наук Рожкова A.M.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков И.А. кандидат химических наук Скомаровский А.А.

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии наук Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Защита состоится «31» мая 2011 года в 1500 час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.ВЛомоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан « » апреля 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время остро стоит проблема истощения запасов ископаемого углеводородного сырья. В связи с этим все больший интерес вызывает использование альтернативных источников сырья и энергии. Лигноцеллюлозная биомасса представляет собой наиболее распространенное, легкодоступное и возобновляемое сырье на нашей планете для получения разнообразных полезных продуктов. Целлюлозосодержащие отходы накапливаются в больших количествах в лесоперерабатывающей, целлюлозно-бумажной, сельскохозяйственной и пищевой промышленностях. Превращение полисахаридов в сахара протекает под действием комплекса ферментов карбогидраз и является одной из наиболее важных стадий в технологической цепочке биоконверсии растительного сырья.

Получаемые сахара могут быть превращены с помощью микроорганизмов в спирты (моторное топливо), амино- и органические кислоты, которые в дальнейшем могут быть трансформированы в разнообразные полезные продукты, включая полимерные материалы, продукты для фармацевтической промышленности, пищевые и кормовые добавки.

В настоящее время деградация растительной биомассы осуществляется под действием целлюлазных и гемицеллюлазных ферментных комплексов. Целлюлазы включают в себя эндоглюканазы, целлобиогидролазы и р-глюкозидазы; гемицеллюлазы представлены в основном ксиланазами, Р-ксилозидазами, арабинофуранозидазами и некоторыми другими ферментами. Эффективность деструкции растительной биомассы зависит от сбалансированности состава целлюлазных и гемицеллюлазных комплексов. Ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы в природе, продуцируются в основном микроскопическими грибами и бактериями. Наибольшее распространение на мировом рынке получили секретируемые ферментные комплексы грибов рода Trichoderma. Однако, недостаток р-глюкозидазы в этом комплексе приводит к ингибированию целлобиогидролаз продуктом реакциии - целлобиозой и, как следствие, ведет к снижению выходов продуктов реакции. Грибы рода Pénicillium продуцируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава. Компоненты целлюлолитического комплекса, продуцируемого Pénicillium, превосходят по своим свойствам компоненты комплекса Trichoderma и эффективнее расщепляют целлюлозосодержащую биомассу. В связи с этим, важным, на наш взгляд, является дальнейшее увеличение осахаривающей способности ферментного комплекса Pénicillium.

Цели и задачи исследования. В диссертационной работе были поставлены следующие цели и задачи:

- Получить целлюлазные комплексы с увеличенной осахаривающей способностью на основе рекомбинантных штаммов P.verruculosum с использованием гистоновой системы экспрессии.

- Создать экспрессионную систему на основе гистонового промотора Н4.1 P.verruculosum.

- Провести трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum AniaD и выявить рекомбинантные штаммы (трансформанты), продуцирующие ферментные комплексы с увеличенной осахаривающей способностью.

- Получить ферментные препараты на основе выбранных рекомбинантных штаммов и исследовать их биохимические свойства.

- Исследовать осахаривающую способность новых ферментных препаратов по отношению к различным видам предобработанных растительных субстратов.

Научная новизна работы. Впервые была клонирована полинуклеотидная последовательность, соответствующая промоторной области гена гистона Н4.1 низшего гриба P.verruculosum 221-151. На основе вектора pUC-LIC были впервые созданы плазмидные конструкции, включающие в себя состыкованные полинуклеотидные последовательности гистонового промотора и генов целевых белков - ß-глюкозидазы Aspergillus niger (bgll), эндо-1,4-Р-ксиланазы А (ксиланаза A) P.canescens (xylA) и эндо-1,4-Р-глюканазы 1Г (ЭГН) P.verruculosum (eglll). Используя методы плазмидной трансформации на базе штамма-реципиента P.verruculosum 537, были получены новые штаммы-продуценты, секретирующие мультиферментные комплексы, обладающие активностью гетерологичных ß-глюкозидазы A.niger и ксиланазы A P.canescens, а также с увеличенной активностью гомологичной ЭГИ P. verruculosum. На основе лучших продуцентов были получены и проанализированы ферментные препараты. Показано, что уровень привнесенного целевого белка составил от 5 до 13 % от общего содержания белка в препарате, при этом состав собственного комплекс целлюлолитических ферментов штамма-реципиента P.verruculosum 221-151 остался практически на базовом уровне.

Таким образом, впервые была создана экспрессионная система на основе конститутивного гистонового промотора Н4.1 P.verruculosum, позволяющая получать ферментные препараты с заданным содержанием целевого белка.

Практическая значимость работы. Получены и исследованы новые ферментные препараты (Гист4-Р-ГЛ-3, Гист4-КсилА-3 и Гист4-ЭГН-1) с увеличенной осахаривающей способностью по отношению к биотехнологически важным растительным субстратам, что позволяет использовать их в дальнейшем в технологической цепочке биоконверсии растительного сырья на стадии гидролиза полисахаридов клеточной стенки, избегая традиционную трудоемкую стадию смешивания индивидуальных ферментных препаратов. На примере гидролиза различных видов непищевого растительного сырья, таких как измельченная осиновая древесина, измельченная и обессмоленная сосновая древесина и измельченная багасса, показано, что выход продуктов под действием новых ферментных препаратов существенно увеличивался по сравнению с исходным ферментным препаратом P.verruculosum 221-151 (на 1430%).

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009); на международной конференции «Биокатализ-2009» (Архангельск, 2006); на VI Международной конференции по возобновляемым ресурсам и биоперерабатывающим заводам

(Германия, 2010); на V и VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2010 и 2011), а также, на международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных

работ.

Струюура и объем работы. Диссертация построена по традиционной схеме и состоит из введения, обзора литературы (4 главы), отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 154 ссылки. Работа изложена на 155 страницах, содержит 49 рисунков и 23 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор посвящен существующим в настоящее время методам повышения уровня экспрессии целевых белков. Рассмотрены преимущества и недостатки различных систем экспрессии, в том числе генно-инженерных. Подробно описано действие ферментных препаратов на целлюлозосодержащее сырье. Рассмотрены факторы, влияющие на эффективность гидролиза растительного сырья. Описаны состав и структура целлюлозосодержащей биомассы. Обсуждены перспективы развития и мировой опыт по переработке различного природного сырья в топливный биоэтанол. Отдельная глава посвящена описанию использованных в работе методов исследования, приводится список субстратов, реактивов и ферментных препаратов.

В последующих главах изложены результаты исследований и их обсуждение.

I. ПОЛУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ P. VERRUCULOSUM.

В настоящее время для увеличения осахаривающей способности ферментных комплексов используется два основных подхода. Первый заключается в подборе оптимальных ферментных смесей путем смешения индивидуальных компонентов (или различных по свойствам ферментных препаратов). Существенным недостатком, в этом случае являются большие трудозатраты, поскольку требуется произвести (получить) несколько ферментных препаратов. Второй подход состоит в привнесении с помощью генно-инженерных методов необходимого целевого фермента (ферментов) в секретируемый одним (индивидуальным) штаммом-продуцентом ферментный комплекс. В этом случае может применяться индуцибельная система экспрессии на основе так называемого «сильного» промотора. Таким промотором, обычно, служит регуляторная последовательность гена мажорного секреторного белка. Преимуществами этой системы экспрессии является возможность получения продуцентов с высоким содержанием целевого фермента - до 40-90% от общего пула секреторного белка. Общая концентрация секреторного белка при этом может не изменяться (или

незначительно падать), однако за счет процесса «титровки промотора» может утрачиваться часть основного секреторного целлюлазного комплекса штамма-хозяина, что является недостатком этой системы экспрессии. Следовательно, целесообразно применение других генно-инженерных подходов. Для решения этой проблемы, возможно применение системы экспрессии с использованием гистоновых промоторов (Beishaw N.J., 2002), которая позволяет привносить целевые активности без заметного изменения состава основного ферментного комплекса. В нашей работе был использован именно этот подход.

Создание экспрессионной системы на основе гистонового промотора.

Для получения штаммов-продуцентов целевых белков были сконструированы экспрессионные плазмиды рГист4-Р-ГЛ, рГист4-КсилА и рГист4-ЭГП на основе pUC-LIC вектора, содержащего экспрессионную кассету, состоящую из нуклеотидной последовательности промоторной области гена гистона h4.l P.verruculosum и нуклеотидной последовательности гена, соответствующего целевого белка (рис.1). В нашем случае, это были последовательности генов следующих белков - ß-глюкозидазы A.niger, эндо-1,4-р-ксиланазы А P.canescens и эндо-1,4-р-глюканазы II P.verruculosum. Для обеспечения внеклеточной секреции целевых ферментов, использовались полинуклеотидные последовательности, отвечающие сигнальным пептидам соответствующих целевых белков.

Экспрессионные кассеты были получены состыковкой полинуклеотидных последовательностей промотора гена гистона Н4.1 и следующих генов - гена bgll, кодирующего ß-глюкозидазу A.niger (AN: AJ132386.1), гена xylA, кодирующего ксиланазу А (AN: AY756109) и гена eglll, кодирующего ЭГП P.verruculosum.

сЬЫ1«л*паЬг

ген

ген ху!А

р/ис>

1:0

йа 81

ВипК1Ш1б)

Рисунок 1. Схематическое представление экспрессионных плазмид. А - плазмида рГист4-[5-ГЛ, содержащая ген Р-глюкозидазы A.niger, Б - плазмида рГист4-ЭГП, содержащая ген эндо-1,4-р-глюканазы II Р.\еггиси1о$ит и В - плазмида,рГист4-КсилА, содержащая ген эндо-1,4-Р-ксиланазы А Р.сапеясет.

Получение и анализ ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Р. 1'еггиси1о\ипи Все полученные в работе экспрессионные плазмиды были трансформированы в штамм-реципиент Ржггиси1озит ДшаЭ. В качестве котрансформационной плазмиды использовали плазмиду рБТАЮ, несущую ген нитратредуктазы, обеспечивающей комплементацию дефектного гена нитратредуктазы в штамме реципиенте. Частота трансформации составила 15-20 колоний на 1 мкг ДНК. С целью выявления наиболее продуктивных трансформантов проводился отбор лучших трансформантов путем измерения основных и целевых активностей, а также проводился ДДС-гельэлектрофорез. Трансформанты были неоднократно последовательно пересеяны на селективную среду (4 и более раз), и было показано, что продукция целевых ферментов стабильна. Уровень экспрессии секретируемого целевого белка оценивался по наличию белковой полосы на ДДС-гельэлектрофорезе культуральной жидкости (КЖ) и измерению соответствующих целевых активностей. Лучшие трансформанты были культивированы в 1-л ферментерах на стандартной ферментационной среде для Р.чеггиси1о$ит. КЖ была лиофилизована и, таким образом, получены сухие ферментные препараты.

Удельные активности полученных трех новых ферментных препаратов представлены в табл.1. Сравнение активностей новых ферментных

препаратов проводили по отношению к препарату, полученному с помощью исходного штамма РуеггисиШит 221-151. Для ферментного препарата Гист4-Р-ГЛ-3, содержащего гетерологичную р-глюкозидазу, было отмечено увеличение удельной активности по отношению к л-НФ-Р-О-глюкопиранозиду (пНФГ) в три раза, а по отношению к целлобиозе - более чем в десять раз. Для ферментного препарата Гист4-КсилА-3, содержащего гетерологичную ксиланазу А, удельная активность по отношению к глкжуроноксилану возросла на 20%. Удельная активность по отношению к КМЦ для ферментного препарата Гист4-ЭГП-1 с увеличенным содержанием в комплексе гомологичной ЭГП также возросла на 20%.

Таблица!. Удельная активность полученных ферментных препаратов, ед/мг белка.

Название ферментного препарата КМЦ Р-Глюкан МКЦ Целлобиоза Глюкуроно-ксилан пНФГ

Р. уеггиси1о$ит 221-151 (кот-роль) 14,9±0,6 19,9±0,8 0,54±0,02 0,73±0,03 15,0±0,6 1,25±0,05

Гист4-(5-ГЛ-3 11,6±0,5 9,2±0,4 0,49±0,02 9,72±0,39 13,3±0,5 3,75±0,15

Гист4-КсилА-3 9,6±0,4 12,3±0,5 0,45±0,02 0,81 ±0,03 18±0,7 1,63±0,07

Гист4-ЭГН-1 17,9±0,7 22,3±0,9 0,65±0,03 0,79±0,03 21,9±0,9 1,6±0,0б

Все полученные ферментные препараты были проанализированы по схеме, представленной на рис.2. Схема включала: измерение целевых и базовых активностей; проведение ДДС-гельэлектрофореза с последующим анализом трипсинового гидролизата полосы целевого белка с помощью МАЬБГ-ТОР масс-спектрометрического анализа; хроматографический анализ качественного и количественного состава ферментных препаратов, а также, выделение целевых рекомбинантных ферментов в гомогенном виде; сравнение свойств нативных и рекомбинантных целевых ферментов; изучение осахаривающей способности полученных ферментных препаратов при гидролизе растительных субстратов.

Рисунок 2. Схема анализа ферментных препаратов.

Доказательством, свидетельствующим в пользу наличия экспрессии целевых белков ф-глюкозидазы, ксиланазы А и ЭГП), являлись данные MALDI-TOF масс-спектрометрии. Для этого белковые полосы после ДДС-электрофореза, соответствующие целевым белкам, подвергали обработке трипсином, полученные пептиды анализировали методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Анализ результатов и поиск целевых пептидов проводили с использованием программы Bruker DataAnalysis. Данные о полученных пептидах после трипсинолиза сравнивали с теоретическими пептидными последовательностями, полученными с использованием программы PeptideMass (http://expasy.org/tools/peptide-mass.html) для первичной аминокислотной последовательности гетерологичных ферментов.

На рис.3 приведен MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата и результаты идентификации пептидов на примере Р-глкжозидазы - на основании этих данных можно с достоверностью утверждать о наличии целевого белка в комплексе. Подобным образом было доказано наличие экспресии и других целевых генов.

Для определения состава ферментных препаратов мы использовали разработанный в нашей лаборатории экспресс-метод их хроматографического фракционирования. Метод включал три стадии (рис.4): на первой - исходный препарат (Гист4-р-ГД-3, Гист4-КсилА-3 и Гист4-ЭПЫ) растворяли и обессоливали на колонке с носителем Биогель П4, на второй - обессоленный образец наносили на колонку с анионообменным носителем Source 15Q (рН 6,8) и собирали фракции белков в линейном градиенте NaCl от 0 до 0,4 М.

Intens. «10 8 5-

mrftlteavaltavslasadelaysppyy pspwangqgdwaeayqravdivsqttlaekv nlttgtgwelelcvgqtggvprlgipgmcaqds plgvrdsdynsafpagvnvaatwdknl aylrgqamgqefsdk spdggrnwegfspdpalsgvlfaetikgiq

dagwatak.!yi/1.i.^_ « qapeaqgygfnitesgsanlddktthelylwpfadairag

AGAVMCSYNINNSYGCQNSYTLSKLLKAELGFQGFVMSDWAAHHAGVSGALAGLDMSMP GDVDYDSGTSYWGTNLTISVLNGTVPQWRVDDMAVRIMAAYYKVGRDRLWIPPNFSSWTR DEYGFK7:-"< , • NHSEHRRIGADSTVLLKNDGALPLTGKERLVAL

IGEDAGSNPYGANGCSDRGCDNGTLAMGWGSGTANFPYLMTPEQAISNEVLKNKNGVFTA TDNWAI DQIEALAKTASVSI.VFVNADSGEGYINVDGNLGDRRNLTLWRNGDNVIKAAASN CNNTIVIIHSVGPVLVNEWYDNPNVTAILWGGLPGQESGNSLADVLYGRVNreAKKPtTW GKTR GFDKRNETPIYEFGYGLSYTTFNYS

NLQVEVLSAPAYEPASGETFAAPTFGEVGNASDYLYPDGLQRITKFIYPWLNSTDLEASS GDASYGQDA5DYLPEGATDGSAQPILPAGGGAGGNPRLYDELIRVTVTIK £'<31. r . - -^-IVLRQFERITLQPSEETQWsrTLTRRDLANWNVETQDWEITSYPKM

VFVGSSSRKLPLRASLPTVH

Рисунок 3. МАЬЭМОР масс-спектр трипсинового гидролизата полосы, соответствующей Р-глюкозидазе A.niger и ее аминокислотная последовательность. Пептиды, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии, выделены серым цветом.

Рисунок 4. Схема фракционирования ферментных препаратов на основе гриба P.verruculosum.

На третьей стадии проводили фракционирование с помощью гидрофобной хроматографии на носителе Source 15ISO. Связавшийся белок элюировали, уменьшая концентрацию сульфата аммония в элюенте. Во фракциях были измерены активности по отношению к следующим субстратам - КМЦ (характеризует эндоглюканазную активность), микрокристаллической целлюлозе (МКЦ, целлобиогидролазная активность), глюкуроноксилану (ксиланазная активность) и пНФГ (ß-глюкозидазная активность). Проводили также ДДС-гельэлектрофорез фракций и MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ белков во фракциях. На основании анализа полученных данных был определен количественный компонентный состав ферментного препарата Гист4-Р-ГЛ-3 представленный в табл.2. Сравнение компонентного состава проводилось по отношению к составу контрольного ферментного препарата P.verruculosum 221-151, основными компонентами целлюлазного комплекса которого являются целлобиогидролазы I и II (ЦБГ1 и ЦБГП) и эндо-глюканазы. Ферментный препарат Гист4^-ГЛ-3 содержал 13% гетерологичной ß-глюкозидазы от общего пула белка, при этом содержание основных целлюлазных компонентов существенно не изменилось. У ферментного препарата Гист4-Р-ГЛ-3 отмечено небольшое увеличение содержания таких белков, как ксилоглюканаза 70 кДа, эндоглюканаза III 25 кДа и ксиланаза 23 кДа по сравнению с контрольным препаратом.

Таблица 2. Компонентный состав ферментных препаратов Гист4-Р-ГЛ-3 и контрольного

Фермент Название препарата

P.verruculosum 221-151 (Контроль) Гист4-Р-ГЛ-3

ЦБГ I 66 кДа 20 20

ЦБГ 1 55 кДа 15 15

ЦБГ II 60 кДа 17 7,5

ЦБГ II 50 кДа 17 18

Р-ГЛ 116 кДа (собст.) 4 <1

3-ГЛ 120 кДи A.niger - 13

КГ 70 кДа <1 4

ЭГ170 кДа <1 <1

ЭГI 52 кДа 4 <1

ЭГ I 57 кДа <1 1,5

ЭГ II36 кДа 3 -

ЭГ II33 кДа 5 <1

ЭГ III 25 кДа 2 5

ЭГ 40 кДа - 5

Ксил 23 кДа - 5

На стадии анионообменной хроматографии гетерологичная Р-глюкозидаза (120 кДа) элюировалась в гомогенном состоянии во фракции в конце градиента соли. Основные свойства рекомбинантной р-глюкозидазы были изучены и сравнены по отношению к нативной р-глюкозидазе A.niger, выделенной нами ранее из ферментного препарата Novozyme 188. Обнаружено, что удельные активности по отношению к специфическим субстратам, рН- и Т-оптимумы, а также, кинетические константы существенно не изменились (табл.3).

Таблица 3. Сравнение свойств рекомбинантной и нативной р-глюкозидазы A.niger.

Параметры Р-ГЛ рек. Р-ГЛ нат.

Удельная активность, ед/мг белка

рН 5,0, 40"С

пНФГ 104±4 105±5

Целлобиоза 125±5 124±5

рН 5,0, 50"С

КМЦ 4±0,2 3±0,2

Р-Глюкан 10±0,4 9±0,4

Ламинарии 30±1,2 32±1,3

Кинетические параметры гидролиза пНФГ, 40иС

К„ мМ 0,73 ± 0,02 0,60+0,01

Ki (I-Глк), мМ 2,59 ±0,01 2,73 ±0,01

Оптимум активности

рН-огтгимум 4,5-5,0 4,5-5,0

Т-оптимум 60"С 60"С

ii. осахаривающая способность ферментного препарата гист4-р-гл-3, полученного на основе рекомбинантного штамма р. УЕКяисиюБим, содержащего гетерологичную р-глюкозидазу

Для оценки гидролитической способности полученного ферментного препарата Гист4-Р-ГЛ-3, содержащего гетерологичную Р-глюкозидазу, мы провели эксперименты по осахариванию различных видов предобработанной древесины и багассы. В табл.4 представлены данные по содержанию белка и

активности по отношению к целлюлозным и гемицеллюлозным субстратам для выбранного для экспериментов по осахариванию круга лабораторных и коммерческих ферментных препаратов. Лабораторные ферментные препараты были представлены препаратом на основе исходного штамма P.verruculosum 221-151 и двумя препаратами, полученными с помощью штаммов P.verruculosum СVI2 и P.verruculosum FIO, с содержанием гетерологичной Р-глюкозидазы 25 и 80%, соответственно. Отметим, что эти препараты были получены с помощью индуцибельной системы экспрессии, основанной на использовании промотора ЦБГ1 P.verruculousm. Коммерческие препараты (полученные на основе штамма T.reeseí) были разделены на две группы: препараты целлюлаз с низкой р-глюкоз ид аз ной актвиностью - Ксибетен-Целл, Spezyme CP и Celluclast 1.5; и ферментные препараты, обладающие Р-глюкозидазной активностью - AccelleraselOOO и CellicCtecl. В качестве субстратов для гидролиза использовали измельченную обессмоленную сосновую древесину, измельченные осиновую древесину и багассу (жом сахарного тростника). Измельчение субстратов проводили на лабораторной планетарной шаровой мельнице АГО-2.

Таблица 4. Удельные активности ферментных препаратов по отношению к разным субстрата, ед/мг белка.

Название ферментного препарата [Белок], мг/г (*мг/мл) КМЦ Р-Глюкан МКЦ Ксилан Целлобиоза пНФГ

Гист4-Р-ГЛ-3 732±29 11,6±0,5 9,2±0,4 0,49±0,02 13,3±0,5 9,72±0,39 3,75iO,15

P.verruculosum CV12 864±35 13,2±0,5 17,3±0,7 0,80±0,03 12,8±0,5 67,84±2,71 26,9±1,1

Р. verruculosum FIO 738±30 4,9±0,2 10,4±0,4 0,2±0,01 3,2±0,2 111,4±5 55,3±2,2

P.verruculosum 221-151 834±33 14,9±0,6 19,9±0,8 0,54±0,02 15,0±0,6 0,73±0,03 1,25±0,05

Ксибетен-Целл 284±11 10,9±0,4 10,4±0,4 0,92±0,04 1,8±0,1 0,12±0,005 0,22±0,01

Spezyme CP* 118±5 27,7±1,1 26,5±1,1 2,02±0,08 7,5±0,3 0,25±0,01 0,57±0,02

Celluclast 1.5L* 184±7 17,5±0,7 14,4±0,6 1,29±0,05 2,9±0,1 0,08±0,003 0,15±0,01

AccelleraselOOO* 103±4 30,7±1,2 21,9±0,9 2,11±0,08 3,3±0,1 1,18±0,05 2,94±0,12

CellicCtecl* 182±7 ll,3±0,5 ll,4±0,5 0,26±0,01 l,4t0,l 2,69±0,U 2,81*0,11

Для сравнения осахаривающей способности ферментные препараты были уравнены между собой по концентрации белка в реакционной смеси (5 мг белка на 1 грамм субстрата). Гидролиз проводили при 50°С, рН 5,0 и перемешивании. На рис.5 А представлены данные по выходу восстанавливающих Сахаров (ВС) и глюкозы через 24 часа гидролиза измельченной осиновой древесины. Было установлено, что наиболее эффективным ферментным препаратом оказался, полученный нами, новый препарат Гист4-Р-ГЛ-3 - он обеспечивал на 20% больший выход продуктов (ВС) по сравнению с контрольным препаратом Ржггиси1о5ит 221-151 и на 35% больший выход ВС по сравнению с коммерческими препаратами АссеНегавеЮОО и СеШсО:ес1, обладающими Р-глюкозидазной активностью. Разница в действии ферментного препарата Гист4-Р-ГЛ-3 и группы коммерческих целлюлазных препаратов с низкой Р-

глюкозидазной активностью была еще более существенна (до 50% в пользу Гист4-Р-ГЛ-3).

Через 24 часа гидролиза измельченной багассы наибольший выход продуктов также наблюдали при действии нового ферментного препарата Гист4-(3-ГЛ-3 (рис.5 Б). Разница в выходе ВС по сравнению с контрольным препаратом Р ^еггиси1о8ит 221-151 и одними из лучших коммерческих препаратов АссеПегазеЮОО и СеШсС1ес1 составляла 23% в пользу Гист4-Р-ГЛ-3.

Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины показали, что ферментный препарат Гист4-р-ГЛ-3 превосходит по выходу ВС контрольный препарат Р^еггиси1озит 221-151 на 18%, однако, несколько уступает коммерческому препарату СеШсО:ес1, что по-видимому, объясняется структурными особенностями данного субстрата (рис.5 В).

А)

-5 о

Рисунок 5. Выход ВС и глюкозы через 24 часа гидролиза: А) - измельченной осиновой древесины; Б) - измельченной багассы; В) - измельченной обессмоленной сосновой древесины. Условия: 50 °С, рН 5, [8]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание

- 250 об/мин.

Следует отметить, что при действии на любой из использованных растительных субстратов ферментных препаратов P.verruculosum CV12 и P.verruculosum FIO, полученных с помощью индуцибельной системы экспрессии, выход продуктов гидролиза был существенно меньше по сравнению с действием ферментного препарата Гист4-р-ГЛ-3, а также с действием контрольного препарата P.verruculosum 221-151. В особенности, уменьшение выхода продуктов было характерно для препарата P.verruculosum FIO, содержащего 80% р-глюкозидазы.

С целью определения достаточно ли содержание р-глюкозидазы в ферментном комплексе, продуцируемом штаммом P.verruculousm Гист4-Р-ГЛ-3, мы провели эксперимент, в котором дополнительно вводили в реакционную смесь Р-глюкозидазу (используя для этого препарат P.verruculosum FIO). На рис.6 приведены кинетические кривые выхода ВС при гидролизе измельченной багассы ферментными препаратами Гист4-р-ГЛ-3 и P.verruculosum 221-151 в отсутствии и в присутствии дополнительной Р-глюкозидазы A.niger (40 ед. целлобиазной активности на 1 г субстрата) при дозировке ферментных препаратов в реакционной смеси 2, 5 и 10 мг/г субстрата.

Ферментный препарат P.vemiculosum 221-151 Ферментный препарат Гист-р-ГЛ-3

Рисунок 6. Ферментативный гидролиз измельченной багассы (100 г/л) под действием ферментных препаратов Руеггиси1ошт Гист4-р-ГЛ-3 и Р.\erruculosum 221-151 (2, 5 и 10 мг/г субстрата) в отсутствие и в присутствии дополнительной р-глюкозидазы (40 ед. целлобиазной

активности на 1 г субстрата).

Обнаружено, что дополнительное добавление р-глюкозидазы к новому ферментному препарату Гист4-Р-ГЛ-3 не влияло на выход продуктов гидролиза. Однако, добавление р-глюкозидазы к ферментному препарату Ржггиси1о5ит 221-151 приводит к увеличению продуктов на 10-15% в зависимости от дозировки препарата. Следует отметить, что выход ВС при действии ферментного препарата Гист4-Р-ГЛ-3 (содержащего гетерологичную рекомбинантную Р-глюкозидазу) и выход ВС при действии контрольного ферментного препарата РлеггисиЬзит 221-151 в присутствии дополнительно добавленного Р-глюкозидазного препарата - одинаковый. Таким образом, содержание р-глюкозидазы в новом ферментном препарате Гист4-Р-ГЛ-3 в количестве 13% от общего пула белка, очевидно, является оптимальным количеством для эффективного гидролиза.

III. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ И ОСАХАРИВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ГИСТ4-КСИЛА-3 НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА Р. VERRUCULOSUM, СОДЕРЖАЩЕГО ГЕТЕРОЛОГИЧНУЮ ЭНДО-1,4-р-КСИЛАНАЗУ

В состав растительной биомассы помимо целлюлозы входит гемицеллюлозы (представленные преимущественно ксиланом), которые препятствуют доступу комплекса гидролитических ферментов к волокнам целлюлозы. Можно ожидать, что добавление к целлюлазному комплексу ксиланаз приведет к увеличению выхода продуктов гидролиза растительных субстратов за счет разрушения гемицеллюлозной матрицы и увеличения доступа целлюлаз к субстрату. Поэтому для увеличения осахаривающей способности комплекса P.verruculosum был, с использованием гистонового промотора, создан штамм P.verruculosum Гист4-КсилА-3, который позволил получить ферментный препарат Гист4-КсилА-3, содержащий гетеролгичную ксиланазу А.

Анализ компонентного состава ферментного препарата Гист4-КсилА-3.

С целью определения содержания гетерологичной ксиланазы А и основных ферментов целлюлазного комплекса был проведен анализ компонентного состава (с использованием экспресс-метода хроматографического фракционирования, аналогичного изложенному выше на примере фракционирования ферментного препарата Гист4-рТЛ-3). Содержание гетерологичной ксиланазы А в препарате Гист4-КсилА-3 составило 6% от общего пула белка (табл.5), при этом состав целлюлазного комплекса этого препарата практически не изменился по сравнению с составом ферментного препарата, продуцируемого исходным штаммом P.verruculosum 221-151. Таблица 5. Компонентный состав ферментных препаратов Гист4-КсилА-3 и контрольного

Фермент Название препарата

P.verruculosum 221-151 (Контроль) Гист4-КсилА-3

ЦБГI 66 кДа 20 23

ЦБГ I 55 кДа 15 27

ЦБГ II60 кДа 17 6

ЦБГ II 50 кДа 17 5

Р-ГЛ 116 кДа 4 2

ЭГ I 52 кДа 4 3

ЭГ I 57 кДа <1 3

ЭГ II 36 кДа 3 3

ЭГ II 33 кДа 5 3

ЭГ III 25 кДа 2 2

ЭГ 40 кДа - 4

Ксил 32 кДа - 3

Юс ил 31 кДа P.cattescens - 6

Ксил 23 кДа - 3

При фракционировании ферментного препарата Гист4-КсилА-3 с помощью анионообменной хроматографии гетерологичная ксиланаза А (31 кДа) элюировалась в несвязавшейся фракции в гомогенном виде (рис.7). Наличие гетерологичной ксиланазы А в комплексе было подтвервдено с помощью

MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа трипсинового гидролизата полосы, соответствующей ксиланазе А на ДДС-гельэлектрофореграмме.

Рисунок 7. Фракционирование ферментного препарата Гист4-КсилА-З с помощью анионо-обменной хро-матографии на носителе Source 15Q, рН 6,8, градиент соли приведен серым цветом.

Свойства выделенной гомогенной рекомбинантной ксиланаза А были исследованы в сравнении со свойствами нативного фермента (табл.6), изученного в нашей лаборатории ранее. Установлено, что биохимические и кинетические параметры, субстратная специфичность, стабильность и другие свойства рекомбинантного и нативного ферментов практически не различаются.

Таблица 6. Сравнение свойств рекомбинантной и нативной эндо-1,4-р-ксиланазы А 31 кДа Р.сапг$сеп$.

Параметры КсилА 31 рек. КсилА 31 нат.

pi 8,9 9,2

Удельная активность, ед/мг белка

рН 5,0,40"С

иНФ-Р-О-Целлобиозвд 6,0±0,2 6,4±0,3

рН5,0,40"С

Глюкуроноксилан 30,1±1,2 29,4±1,5

Арабиноксилан 24,9±0,9 24,Ш,1

Р-Глюкан 1,8±0,1 2,0±0,1

Кинетические параметры гидролиза специфических субстратов

К„, г/л 4,1 + 0,9 3,4 ±0,8

Глюкуроноксилан

Км, г/л Арабиноксилан 2,3 ±0,1 2,0 ±0,1

Оптимум активности

рН-огтгимум 5,4 5,9

Т-опттшум 60"С 55"С

Осахарнвающая способность ферментного препарата Гист4-КсилА-3.

Осахаривающую способность ферментного препарата Гист4-КсилА-3 сравнивали с таковой для ферментного препарата, полученного с помощью исходного штамма Р.\erruculosum 221-151, а также с осахаривающей способностью коммерческих ферментных препаратов, приведенных в табл.4. Результаты гидролиза различных видов предобработанной древесины приведены на рис.8 А-В. При гидролизе измельченной осиновой древесины (рис.8 А) наибольший выход ВС и глюкозы наблюдали при действии нового ферментного препарата Гист4-КсилА-3. Разница в выходе ВС по сравнению с контрольным препаратом Р.уеггиайоьит 221-151 и одними из лучших

коммерческих препаратов АссеПегазеЮОО и Се1ПсС1ес1 составляла в обоих случаях 14% в пользу Гист4-КсилА-3.

Результаты гидролиза измельченной багассы (рис.8Б) также свидетельствуют о том, что наиболее высокую глубину гидролиза обеспечивал препарат Гист4-КсилА-3, который приводил к образованию продуктов на 24% больше, чем в случае контрольного препарата Ржггиси1озит 221-151. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины показали, что ферментный препарат Гист4-КсилА-3 превосходит по выходу продуктов гидролиза контрольный препарат Р .\erruculosum 221-151 на 15%. Таким образом, привнесение гетерологичной ксиланазы А в целлюлазный комплекс Р\verruculosum приводит к увеличению выхода продуктов при осахаривании растительного сырья.

о вс

А)

В)

□ ВС ш Глюкоза rj-i д.

|Ш:ГЙЁЕЁ|

1

§

Рисунок 8. Выход ВС и глюкозы через 24 часа гидролиза: А) - измельченной осиновой древесины; Б) - измельченной багассы; В) - измельченной обессмоленной сосновой древесины. Условия: 50 °С, рН 5, [S]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 250 об/мин.

IV. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ И ОСАХАРИВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ГИСТ4-ЭГИ-1 НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА Р. УЕМ<ПСШ.ОЯИМ С УВЕЛИЧЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ГОМОЛОГИЧНОЙ ЭНДО-1,4-р-ГЛЮКАНАЗЫ II.

В комплексе целлюлолитических ферментов эндоглюканазы выполняют роль ферментов, гидролизуюших внутренние 1,4-Р-глюкозидные связи, удаленные от концов полимерной цепи целлюлозы с образованием целлоолигосахаридов, что сопровождается существенным уменьшением степени полимеризации субстрата. Таким образом, действие эндоглюканаз способствует существенному облегчению атаки другими целлюлолитическими ферментами (в первую очередь - целлобиогидролазми) нерастворимого целлюлозного субстрата, что приводит, в конечном счете, к увеличению общей эффективности гидролиза. С этой целью с использованием гистонового промотора был создан штамм Р.\erruculosum Гист4-ЭГП-1, который позволил получить ферментный препарат Гист4-ЭГП-1 с увеличенным содержанием гомологичной ЭГ11.

Анализ компонентного состава ферментного препарата Гист4-ЭГП-1.

При фракционировании ферментного препарата Гист4-ЭГП-1 на стадии анионообменной хроматографии ЭГН (36 кДа) элюировалась во фракции в конце градиента соли в гомогенном состоянии (рис. 9). С помощью экспресс-метода хроматографического фракционирования было установлено, что содержание гомологичной ЭГП в комплексе было увеличено до 6% от общего пула белка (в исходном ферментном комплексе Р^еггисгйотт 221-151 содержание ЭГН составило 3%, табл. 7). Состав целлюлазного комплекса препарата Гист4-ЭГН-1 незначительно изменился по сравнению с составом ферментного препарата, продуцируемого исходным штаммом РжггисиЬзит 221-151.

Рисунок 9. Фракционирование фер-08 ментного препара-та Гист4-ЭП1-1 с

0 6 помощью анионо-s обменной хрома-о тографии на носителе 04 1 Source 15Q, рН 6,8, градиент приведен 0 2 серым цветом.

' ' 6 ' 25 ' 50 ' 7*5 ' lio ' ife ' 1 io ' 1 f5 ' 2io Объем элюента, мл

Таблица 7. Компонентный состав ферментных препаратов Гист4-ЭГП-1 и контрольного

ферментного препарата Р.уеггисиЬзигп 221-151 (в % от общего соде

Фермент Название препарата

Р.чеггиси1ошт 221-151 (Контроль) Гист4-ЭГ11-1

ЦБГ I 66 кДа 20 28

ЦБГ I 55 кДа 15 13

ЦБГ II 60 кДа 17 9

ЦБГ II 50 кДа 17 7

Р-ГЛ 116 кДа 4 2

КГ 70 кДа <1 <1

ЭГ I 70 кДа <1 <1

ЭГ I 52 кДа 4 7

ЭГ I 57 кДа <1 7

ЭГ II 36 кДа 3 6

ЭГ 11 33 кДа 5 5

ЭГШ 25 кДа 2 3

ЭГ 40 кДа - 3

Ксил 32 кДа - 3

Ксил 23 кДа - 2

эжания белка).

С помощью хроматографического фракционирования рекомбинантная ЭГИ была выделена в гомогенном виде, что позволило изучить ее биохимические и кинетические свойства и сравнить их со свойствами нативного фермента, изученного в нашей лаборатории ранее (табл. 8). Было установлено, что свойства рекомбинантного и нативного ферментов практически идентичны.

Таблица 8. Сравнение свойств рекомбинантной и нативной эндо-1,4-(3-глюканазы II Р.уеггиси1озит.

Параметры ЭГП 36 рек ЭГП 36 нат.

р1 2,0 2,0

Удельная активность, ед/мг белка

рН 5,0, 50°С

КМЦ (ВС) 46±2 48±2

(СМЦ (визкозим.) 2!±1 20±1

р-Глюкан 54±3 56±3

Кинетические параметры гидролиза специс >ических субстратов

Кш г/л КМЦ 6,7 ±0,5 6,5 ±0,48

к*, г/л Р-Глюкан 21,2 + 0,2 22,8 + 0,2

Оптимум активности

рН-оптимум 4,5 4,5

Т-оптимум 65°С 70"С

Осахаривающая способность ферментного препарата Гист4-ЭГН-1.

Сравнительный анализ осахаривающей способности полученного ферментного препарата Гист4-ЭГП-1 и ряда контрольных препаратов, приведенных в табл.4, показал, что увеличение содержания ЭГП в комплексе приводит к значительному увеличению выхода продуктов при гидролизе растительных субстратов, причем при гидролизе богатых аморфными участками субстратов (измельченные осиновая древесина и багасса) разница в выходе ВС и глюкозы была наиболее заметной. При гидролизе измельченной осиновой древесины (рис. 10) выход ВС увеличивался на 23% по сравнению с действием контрольного препарата Р .\erruculosum 221-151. Следует отметить, что разница

в выходе продуктов по сравнению с коммерческими препаратами Ассе11егазе1000 и СеШсС1ес1 составляла более 40% в пользу препарата Гист4-ЭГП-1.

□ ВС

а Глюкоза

Рисунок 10. Выход ВС и глюкозы через 24 часа гидролиза измельченной осиновой древесины. Условия: 50 °С, рН 5, [Э]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание - 250 об/мин.

При гидролизе измельченной багассы (рис. 11) в случае препарата Гист4-ЭГП-1 выход ВС был существенно (на 30% после 24 часов гидролиза) больше, чем при действии контрольного препарата Р.уегтси1охит 221-151, причем заметная разница в выходе ВС наблюдалась уже на начальном этапе гидролиза (3 часа). Основываясь на результатах анализа состава продуктов гидролиза с помощью метода ВЭЖХ можно заключить, что этот эффект объясняется образованием целлоолигосахаридов в качестве продуктов гидролиза под действием ферментного препарата Гист-ЭГП-1, что подтверждает предположение об уменьшении степени полимеризации субстрата под действием эндоглюканаз.

Рисунок 11. Кинетические кривые накопления ВС из измельченной багассы (100 г/л) под действием различных ферментных препаратов. Условия: 50 °С, рН 5, [Б]= 100 г/л (сухой вес), [Е]= 5 мг/г субстрата, перемешивание -250 об/мин.

—Ф—Рлегтиси1о8ит 221-151 ~а- . Ксибетеи-Целл

& «врегутеСР

Се11ис1аз11.51

АссеМегазеЮОО

При гидролизе измельченной обессмоленной хвойной древесины (рис.12) выход продуктов реакции при действии нового ферментного препарата Гист4-ЭГП-1 увеличился на 14% по сравнению с действием контрольного препарата РуеггисьЛозит 221-151 и на 10% по сравнению с ферментным препаратом АссеПегаБе 1000, но, тем не менее, уступал на 10% препарату СеШсОес1. Следует отметить, что ферментный препарат Гист4-ЭГП-1 обеспечивал увеличение

выхода ВС по сравнению с группой коммерческих целлюлазных препаратов с низкой [3-глюкозидазной активностью более чем на 40%.

и о

т о о

о ш

__ О) о

с/з со о

т аз

о О) ф

— О

ИЗ О 0) о о <

Рисунок 12. Выход ВС и глюкозы через 24 часа гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины.

Условия: 50 °С, рН 5, [8]=100 г/л (сухой вес), [Е]=5 мг/г субстрата, перемешивание -250 об/мин.

Таким образом, увеличение содержания гомологичной ЭГП в секретируемом ферментном комплексе Р.уеггиси1озит с 3 до 6% приводит к значительному увеличению его осахаривающей способности при гидролизе растительного сырья.

На примере полученных в работе ферментных препаратов - Гист4-р-ГЛ-3, Гист4-КсилА-3 и Гист4-ЭГП-1 нами показано, что, используя гистоновую систему экспрессии, удалось получить штаммы-продуценты препаратов, сохранивших мощный целлюлазный комплекс исходного штамма Руеггиси1о$ит, и, кроме того, обладающие привнесенными дополнительными целевыми ферментами, усиливающими действие целлюлазного комплекса -гетерологичными (3-глюкозидазой A.niger или ксиланазой А Р.сапеясет, а также гомологичной ЭГП, содержание которых составило 13, 6 и 6% от пула секреторного белка, соответственно. Такое увеличение содержания усиливающих действия целлюлазного комплекса ферментов является, очевидно, достаточным для увеличения эффективности гидролиза растительных субстратов и позволяет исключить необходимость смешивания различных индивидуальных ферментных препаратов. Таким образом, основным преимуществом гистоновой системы экспрессии Р.уеггиси1оизт является возможность получения комплекса ферментов с заданными свойствами: с уровнем секретируемого (нового) целевого фермента не более 6-13% от общего пула секреторного белка и одновременным сохранением практически интактным состава базового целлюлазного комплекса. Были получены и исследованы новые ферментные препараты с увеличенной осахаривающей способностью по отношению к биотехнологически важным субстратам, что позволяет использовать их в дальнейшем в реализации технологического процесс а биоконверсии растительного сырья на стадии гидролиза полисахаридов клеточной стенки и получения Сахаров.

ВЫВОДЫ:

1. Создана новая система экспрессии в рекомбинантном штамме-реципиенте Pénicillium verruculosum с использованием промоторной области гомологичного гена гистона Н4.1. Сконструированы экспрессионные плазмиды рГист4-р-ГЛ с геном р-глюкозидазы A.rtiger, рГист4-КсилА с геном эндо-1,4-р-ксиланазы A P.canescens и рГист4-ЭГИ с геном гомологичной эндо-1,4-р-глюканазы II P.verruculosum и оптимизированы методики трансформации штамма реципиента полученными плазмидами.

2. Впервые получены мутантные штаммы гриба P. verruculosum, обладающие способностью к продукции гетерологичных Р-глюкозидазы A.rtiger и эндо-1,4-р-ксиланазы A P.canescens, а также с увеличенным уровнем продукции гомологичной эндо-1,4-Р-глюканазы II P.verruculosum. На основе наиболее активных отобранных штаммов-продуцентов целевых ферментов получены ферментные препараты.

3. Анализ компонентного состава ферментных препаратов Гист4-р-ГЛ-3, Гист4-КсилА-3 и Гист4-ЭПЫ и ферментного препарата, полученного с помощью штамма P.verruculosum 221-151, показал, что применение созданной системы экспрессии позволяет получать ферментные препараты с уровнем привнесенного белка в пределах 6-13 % от общего содержания компонентов ферментного комплекса, продуцируемого штаммом P.verruculosum. Преимуществом применяемой гистоновой системы экспрессии является практически полное сохранение базового целлюлолитического комплекса P.verruculosum, а также высокий уровень продуктивности секреторного белка.

4. Выделены рекомбинантные гомогенные р-глюкозидаза A.niger, эндо-р-1,4-ксиланаза P.canescens и эндо-1,4-р-глюканаза II P.verruculosum и показано, что по своим свойствам - субстратной специфичности, биохимическим и кинетическим параметрам, зависимости активности от рН и температуры - рекомбинантные ферменты практически не отличаются от нативных.

5. Ферментные препараты, полученные на основе мутантных штаммов P.verruculosum, значительно эффективнее (на 15-30%) гидролизуют различные виды предобработанной хвойной и лиственной древесины, а также багассы, чем коммерческие ферментные препараты, получаемые с использованием штаммов гриба Trichoderma, и чем препарат, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum.

6. Высокая осахаривающая способность ферментного препарата Гист4-р-ГЛ-3 обусловлена наличием в секретируемом ферментном комплексе высокоактивной р-глюкозидазы A.niger (13% от общего пула секретируемого белка), которая осуществляет конверсию целлобиозы в глюкозу, элиминируя ингибирующее действие целлобиозы на целлобиогидролаз.

7. Высокая осахаривающая способность ферментного препарата Гист-КсилА-3 обусловлена наличием в комплексе высокоактивной эндо-1,4-р-ксиланазы A P.canescens (6% от общего пула секретируемого белка), которая, гидролизуя гемицеллюлозу, облегчает доступ целлюлолитических ферментов к целлюлозе.

8. Увеличение осахаривающей способности ферментного препарата Гист-ЭГН-I обусловлено увеличением содержания высокоактивной эндо-1,4-р-глюканазы II P.verruculosum (до 6% от общего пула секретируемого белка), которая обеспечивает более эффективную деградацию аморфных участков целлюлозы, в значительной мере уменьшает степень полимеризации субстрата и облегчает гидролитическое действие целлобиогидролаз.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Короткова О.Г., Семенова М.В., Морозова В.В., Зоров И.Н., Соколова Л.М., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства грибных (3-глюкозидаз. Биохимия, 2009, том 74, вып. 5, с. 699-709.

2. Короткова О.Г., Рожкова А.М., Матыс В.Ю., Кошелев А.В., Окунев О.Н., Немашкалов В.А., Правильников А,Г., Андрианов Р.М., СиницынаО.А., Синицын А.П., Цурикова Н.В. Применение комплексного ферментного препарата с увеличенной активностью эндоглюканазы для переработки целлюлозосодержащей биомассы. Хранение и переработка сельхозсырья, 2011, вып.4, с.29.

3. Синицын А.П., Рожкова А.М., СиницынаО.А., Федорова Е.А., Морозова В.В., Зоров И.Н., Семенова М.В., Саттрутдинов А.Д., Короткова О.Г., Осипов Д.О., Середа А.С., Цурикова Н.В., Беккаревич А.О., Кошелев А.В., Окунев О.Н. Создание рекомбинантного штамма-продуцента целлобиазы ф-глюкозидазы) для увеличения эффективности процесса ферментативного осахаривания целлюлозосодержащего сырья. Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях. Сборник научных трудов под ред. Полякова В.А., 2008, Москва, с. 10-13.

4. Korotkova O.G., Pravolnikov A.G., Okunev O.N., Koshelev A.V., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P., Application of histone promoter to increase the expression of beta-glucosidase in the fungus Pénicillium verruculosum. Abstracts of International Conférence "Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications", 2009, p. 103.

5. Короткова О.Г., Рожкова A.M., Синицын А.П. Использование гистонового промотора для увеличения экспрессии целевых белков, продуцируемых грибом Pénicillium verruculosum. Материалы московской международной научно-практической конференции «Биотехнология; экология крупных городов», 15-17 марта, 2010, Москва, с. 305.

6. Синицын А.П., Синицына О.А., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Федорова Е.А., Семенова М.В., Короткова О.Г. Ферменты гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы в системах получения биотоплив. Материалы московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов», 15-17 марта, 2010, Москва, с. 286.

7. Синицын А.П., Синицына О.А., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Федорова Е.А., Семенова М.В., Саттрутдинов А.Д., Короткова О.Г. Комплекс ферментов для эффективного осахаривания лигноцеллюлозных материалов. Материалы 2-ого международного Конгресса-партнеринга и выставки по биотехнологии и биоэнергетики, 13-15 апреля, 2010, Москва, с. 162.

8. Немашкалов В.А., Беккаревич А.О., Кошелев А.В., Матыс В.Ю., Бубнова Т.В., Рожкова А.М., Короткова О.Г., Окунев О.Н., Синицын А.П. Создание рекомбинантного штамма-продуцента |3-глюкозидазы для увеличения эффективности процесса ферментативного осахаривания целлюлозосодержащего сырья. Материалы 2-ого международного Конгресса-партнеринга и выставки по биотехнологии и биоэнергетики, 13-15 апреля, 2010, Москва, с. 133.

9. Sinitsyn А. P., Sinitsyna О.А., Zorov I.N., Rozkova А.М., Kondratieva E.G., Korotkova O.G., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Volkov P. Highly active cellulases for saccharification of lignocellulosic biomass. Abstracts of Sixth International Conférence on Renewable resources and biorefineries, 7-9 June, 2010, Dusseldorf, Germany, p. 101.

10. Короткова О.Г., Правильников A.Г., Немашкалов B.A., Рожкова А.М., Синицын А.П. Гидролитическая способность новых ферментных препаратов на основе гриба Pénicillium verruculosum. Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 21-25 марта, 2011, с. 326-328.

Подписано в печать 26.04.2011 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 1106 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Короткова, Ольга Генриховна

10.1. Конструирование экспрессионной плазмиды рН1з14-ЕОИ и трансформация штамма-реципиента Р. \erruculosum ДгиаБ.

10.2. Анализ свойств трансформантов.

10.3. Анализ свойств сухих ферментных препаратов.

10.4. Сравнительное исследование свойств гомогенных рекомбинантной и нативной эндо-1,4-р-глюканазы II.

ГЛАВА И. ГИДРОЛИТИЧЕСКАЯ СПОСОБНОСТЬ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ГИСТ4эгн-1 на основе рекомбинантного штамма р. уеш исиьоБим С

УВЕЛИЧЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ГОМОЛОГИЧНОЙ ЭНДО-1,4-Р-ГЛЮКАНАЗЫ II.

11.1. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины.'.

11.2. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины.

11.3. Результаты гидролиза измельченной багассы.

11.4. Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение целлюлазных комплексов с увеличенной осахаривающей способностью на основе рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum"

В настоящее время остро стоит проблема истощения запасов ископаемого углеводородного сырья. В связи с этим все.больший интерес вызывает использование альтернативных источников сырья и энергии. Лигноцеллюлозная биомасса представляет собой наиболее распространенное, легкодоступное и возобновляемое сырье на нашей планете для получения разнообразных полезных продуктов. Целлюлозосодержащие отходы накапливаются в больших количествах в лесоперерабатывающей, целлюлозно-бумажной, сельскохозяйственной и пищевой промышленностях. Превращение полисахаридов в сахара протекает под действием комплекса ферментов карбогидраз и является одной из наиболее важных стадий в технологии биоконверсии растительного сырья.

Получаемые сахара могут быть превращены с помощью микроорганизмов в спирты (моторное топливо), амино- и органические кислоты, которые в дальнейшем могут быть трансформированы в разнообразные полезные продукты, включая полимерные материалы, продукты для фармацевтической промышленности, пищевые и кормовые добавки.

В настоящее время деградация растительной биомассы осуществляется под действием целлюлазных и гемицеллюлазных ферментных комплексов. Целлюлазы включают в себя эндоглюканазы, целлобиогидролазы и р-глюкозидазы; гемицеллюлазы представлены в основном ксиланазами, р-ксилозидазами, арабинофуранозидазами и некоторыми другими ферментами. Эффективность деструкции растительной;биомассы зависит от сбалансированности состава целлюлазных и гемицеллюлазных комплексов. Ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы в природе, продуцируются в основном микроскопическими грибами и бактериями. Наибольшее распространение на мировом рынке получили секретируемые ферментные комплексы грибов рода Trichoderma. Однако, недостаток Р-глюкозидазы в этом комплексе приводит к ингибированию целлобиогидролаз продуктом реакциии - целлобиозой и, как следствие, ведет к снижению выходов продуктов реакции. Грибы рода Pénicillium продуцируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава. Компоненты целлюлолитического комплекса, продуцируемого Pénicillium, превосходят по своим свойствам компоненты комплекса Trichoderma и эффективнее расщепляют целлюлозосодержащую биомассу. В связи с этим, важным, на наш взгляд, является дальнейшее увеличение осахаривающей способности ферментного комплекса Pénicillium.

Целью диссертационной работы являлось получение целлюлазных комплексов с увеличенной осахаривающей способностью на основе рекомбинантных штаммов Р\verruculosum с использованием гистоновой системы экспрессии.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Получить целлюлазные комплексы с увеличенной осахаривающей способностью на основе рекомбинантных штаммов Р.\еггиси1о8ит с использованием гистоновой системы экспрессии.

- Создать экспрессионную систему на основе гистонового промотора Н4.1 Р.уеггиси1озит.

- Провести трансформацию штамма-реципиента Р.\еггиси1о8ит АшаБ и выявить рекомбинантные штаммы (трансформанты), продуцирующие ферментные комплексы с увеличенной осахаривающей способностью.

- Получить ферментные препараты на основе выбранных рекомбинантных штаммов и исследовать их биохимические свойства.

- Исследовать осахаривающую способность новых ферментных препаратов по отношению к различным видам предобработанных растительных субстратов.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Короткова, Ольга Генриховна

ВЫВОДЫ:

1. Создана новая система экспрессии в рекомбинантном штамме-реципиенте Pénicillium, verruculosum с использованием промоторной области гомологичного гена гистона Н4.1. Сконструированы экспрессионные плазмиды рГист4-р-ГЛ с геном Р-глюкозидазы A.niger, рГист4-КсилА с геном эндо-1,4-р-ксиланазы A P.canescens и рГист4-ЭГП с геном гомологичной эндо-1,4-Р-глюканазы II P.verruculosum и оптимизированы методики трансформации штамма реципиента полученными плазмидами.

2. Впервые получены мутантные штаммы гриба P.verruculosum, обладающие способностью к продукции гетерологичных р-глюкозидазы A.niger и эндо-1,4-|3-ксиланазы A P.canescens, а также с увеличенным уровнем продукции гомологичной эндо-1,4-р-глюканазы II P.verruculosum. На основе наиболее активных отобранных штаммов-продуцентов целевых ферментов получены ферментные препараты.

3. Анализ компонентного состава ферментных препаратов Гист4-р-ГЛ-3, Гист4-КсилА-3 и Гист4-ЭГП-1 и ферментного препарата, полученного с помощью штамма P.verruculosum 221-151, показал, что применение созданной системы экспрессии позволяет получать ферментные препараты с уровнем привнесенного белка в пределах 6-13 % от общего содержания компонентов ферментного комплекса, продуцируемого штаммом P.verruculosum. Преимуществом применяемой гистоновой системы экспрессии является практически полное сохранение базового целлюлолитического комплекса P.verruculosum, а также высокий уровень продуктивности секреторного белка.

4. Выделены рекомбинантные гомогенные |3-глюкозидаза A.niger, эндо-р-1,4-ксиланаза P.canescens и эндо-1,4-[3-глюканаза II P.verruculosum и показано, что по своим свойствам - субстратной специфичности, биохимическим и кинетическим параметрам, зависимости активности от рН и температуры - рекомбинантные ферменты практически не отличаются от нативных.

5. Ферментные препараты, полученные на основе мутантных штаммов P.verruculosum, значительно эффективнее (на 15-30%) гидролизуют различные виды предобработанной хвойной и лиственной древесины, а также багассы, чем коммерческие ферментные препараты, получаемые с использованием штаммов гриба Trichoderma, и чем препарат, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum.

6. Высокая осахаривающая способность ферментного препарата Гист4-(3-ГЛ-3 обусловлена наличием в секретируемом ферментном комплексе высокоактивной Р-глюкозидазыАиг^ег (13% от общего пула секретируемого белка), которая осуществляет конверсию целлобиозы в глюкозу, элиминируя ингибирующее действие целлобиозы на целлобиогидролаз.

7. Высокая осахаривающая способность ферментного препарата Гист4-КсилА-3 обусловлена наличием в комплексе высокоактивной эндо-1,4-р-ксиланазы А Р.сапеясет (6% от общего пула секретируемого белка), которая, гидролизуя гемицеллюлозу, облегчает доступ целлюлолитических ферментов к целлюлозе.

8. Увеличение осахаривающей способности ферментного препарата Гист4-ЭГП-1 обусловлено увеличением содержания высокоактивной эндо-1,4-Р-глюканазы II РжггисЫозит (до 6% от общего пула секретируемого белка), которая обеспечивает более эффективную деградацию аморфных участков целлюлозы, в значительной мере уменьшает степень полимеризации субстрата и облегчает гидролитическое действие целлобиогидролаз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной частью возобновляемой органической материи на Земле являются клеточные стенки растений. Общие запасы растительной биомассы составляют около одного триллиона тонн, что делает данный материал идеальным возобновляемым сырьем для получения различных видов топлива и других полезных продуктов. Полисахариды являются наиболее важными химическими компонентами клеточной стенки растений. Различные виды древесины и отходы деревообрабатывающей промышленности имеют разный компонентный состав. В табл.22 представлены данные по компонентному составу используемых в работе природных субстратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Короткова, Ольга Генриховна, Москва

1. Целлюлоза и ее производные (ред. И. Байклз, Л. Сегал), М., Мир, 1974, в 2-х томах, т. 1, 500 е., т. 2,510 с.

2. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение биохимию. М., 1986, с. 387.

3. Stephen A.M. Food polysaccharides and their applications. Marcel Dekker, Inc., 1995, 654 p.

4. Тиунова H.A. Применение целлюлаз. Целлюлазы микроорганизмов. Под ред. Клетовича В.Л. М., 1981, с. 40-73.

5. Грачева И.М., Гаврилова H.H., Иванова Л.А. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М., 1980, с. 83-90.

6. Евилевич А.З., Ахмина Е.И., Раскин М.Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М., 1982, с.4-40.

7. Шарков В.И., Куйбина И.И., Соловьева Ю.П. и др. Количественный и химический анализ растительного сырья. М., 1976, с. 203.

8. Максимов В.Ф., Вольф И.В., Яковлева О.И. Борьба с загрязнениями окружающей среды в целлюлозно-бумажной промышленности. М., 1976, с.ЗО.

9. Азаров В.И., Буров A.B., Оболенская A.B. Химия древесины и синтетических полимеров. Темплан, 1999, изд. №158, с.178-191.

10. Кальнина В.К., Бейнарт И.И., Ведерников H.A. Клеточная стенка древесины и ее изменения при химическом воздействии. Изд-во «ЗИНАТНЕ», 1972, с.73-105.

11. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. МГУ, 1995, с. 224.

12. Калунянц К.А., Шаненко Е.Ф., Зайцева Л.В. Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, Итоги науки и техники, Сер. Химия и технология пищевых продуктов, т.1, М., ВИНИТИ, 1988,187 с.

13. Каргин В.А. Структура и механические свойства полимеров, Избранные труды. М. Наука. 1979, с.ЗЗ.

14. Роговин З.А. Химия целлюлозы. М., Химия, 1972, 519 с.

15. Никитин В.М., Оболенская А.В., Щеголев В.П. Химия древесины и целлюлозы. М., 1978, 363 с.

16. Chang М., Chou Т., Tsao G.T. Structure, pretreatment and hydrolysis of cellulose. In: Bioenergy (Fiechter A., ed.). Berlin, Heidelberg, New York. 1981, p. 15-32.

17. Gharpuray M.M., Lee Y.H., Fan L.T. Structural modification of lignocellulosics by pretreatments to enhance enzymatic hydrolysis. Biotechnol. Bioeng. 1983, v. 25, p. 157-172.

18. Lin K.W., Ladisch M.R., Voloch Met al. Effect of pretreatments and fermentation on pore size in cellulosic material. Biotechnol. Bioeng. 1985, v. 27, p. 1427-1433.

19. Thompson D.N., Chen H.C., Grethlein H.E. Comparison of pretreatment methods on the basis of available surface area. Bioresour. Technol. 1992, v. 39, p. 155-163.

20. Reshamwala S., Shawky B.T., Dale B.E., Ethanol production from enzymatic hydrolysates of AFEX-treated coastal Bermuda grass and switchgrass. Appl. Biochem. Biotechnol. 1995, v. 51, p. 43-55.

21. Bungay H.R. Energy, the biomass options. N.Y. Wiley and sons, 1981, p. 13-15.

22. Selvan P.Y., Ghose Т.К., Ghosk P. Catalytic solvent delignification of agricultural residues:inorganic catalysis. Prosess Biochem., 1983, №3, p.13-15.

23. Lin K.W., Ladish M.R., Voloch M., Patterson J.A., Noller C.H. Effect of pretreatment and fermentation on pore size in cellulosic materials. Biotechnol.Bioeng. 1985, v.27, №10, p. 14271433.

24. Ropas M., Marchal R., Porquie J., Wandecasteele P. Large-scale enzymatic hydrolysis of agricultural lignocellulosic biomass. Part 1: Pretreatment procedures. Biosource Technol. 1992, v.42, p. 197-204.

25. Ropas M., Marchal R., Porquie J., Wandecasteele P. Large-scale enzymatic hydrolysis of agricultural lignocellulosic biomass. Part 2: Conversion into acetone-butanol. Biosource Technol. 1992, v.42, p.205-217.

26. Duff S.J.B., Murray W.D. Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Bioresour. Technol. 1996, v. 55, p. 1-33.143

27. Holtzapple M.T., Humphrey A.E., Taylor J.D. Energy requirements for the size reduction of poplar and aspen wood. Biotechnol. Bioeng. 1989, v. 33, p. 207-210.

28. Clark T.A., Mackie K.L. Steam explosion of the soft-wood Pinus radiata with sulphur dioxide addition. I. Process optimization. J. Wood Chem. Technol. 1987, v. 7, p. 373-403.

29. Holtzapple M.T., Jun J.H., Ashok G., Patibandla S.L et al. The ammonia freeze explosion (AFEX) process: a practical lignocellulose pretreatment. Appl. Biochem. Biotechnol. 1991, v. 28, p. 59-74.

30. Sharma S.K., Kalra K.L., Grewal H.S. Enzymatic saccharification of pretreated sunflower stalks. Biomass. Bioenergy. 2002, v. 23, p. 237-243.

31. Sendich E., Laser M., Kim S., Alizadeh H. et al. Recent process improvements for the ammonia fiber expansion (AFEX) process and resulting reductions in minimum ethanol selling price. Bioresour. Technol. 2008, v. 99, p. 8429-8435.

32. Prior B.A., Day D.F. Hydrolysis of ammonia-pretreated sugar cane bagasse with cellulase, beta-glucosidase, and hemicellulase preparations. Appl. Biochem. Biotechnol. 2008, v. 146, p. 151164.

33. Schultz T.P., Rughani J.R., Meginnis G.D. Comparison of the pretreatment of sweetgum and white oak by steam-explosion and rapid ateam hydrolysis-continuous (RASH) prosesses. Appl. Biochem. Biotechnol., 1989, v. 20, p. 9-28.

34. NC-IUBMB Enzyme nomenclature. Recommendations of the nomenclature committee of the international Union of Biochemistry and Molecular Biology on nomenclature and classification of enzymes. Academic Press, Orlando, 1992.

35. Henrissat, B., Davies G. Structural and sequence-based classification of hydrolases. Curr.Opin. Struct.Biol. 1997, v. 7, p. 637-644.

36. Van Tilbeurgh H., Tomme P., Claeyssens M., Bhikhabhai R., Pettersson G. Limited proteolysis of the cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Separation of the functional domains. FEBS Lett. 1986, v. 204, p. 223-227.

37. Gilkes N.R., Henrissat В., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.A.J. Domains in microbal p-1,4-glycanases: sequence conservation, function and enzyme families. Microbiol. Rev. 1991, v. 55, p. 303-315.

38. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 1991, v. 280, p. 309-316.

39. Henrissat В., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 1993, v. 293, p. 781-788.

40. Henrissat В., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J., 1996, v. 316, p. 695-696.

41. Рабинович M.JI., Мельник M.C., Болобова A.B. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов. Биохимия. 2002, т. 67, № 8, с. 1026-1050.

42. Schiilein, M. Protein engineering of cellulases. Biochim. Biophys. Acta. 2000, v. 1543, p. 239252.

43. Гусаков A.B. Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз: фундаментальные и прикладные аспекты. Диссертация на соискание ученой степени доктора хим. наук. МГУ, 2005.

44. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C., Clayton R.A., Gwinn M.L. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 2000, v. 406 (6795), p. 477-483.

45. Clarke A.J. Biodégradation of cellulose. Enzymology and biotechnology, Technomic Publishing Company Inc., Lancaster, 1997, p. 272.

46. Марков A.B. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, Москва, МГУ, 2003, с. 201.

47. Baldrian P., Valaskova V. Degradation of cellulose by basidiomycetous fungi. FEMS Microbiol. Rev. 2008, v. 32, p. 501-521.

48. Sandgren M., Stahlberg J., Mitchinson C. Structural and biochemical studies of GH family 12 cellulases: improved thermal stability, and ligand complexes. Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005, v. 89, p. 246-291.

49. Percival Zhang Y.H., Himmel M.E., Mielenz J.R. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnol. Adv. 2006, v. 24, p. 452-481.

50. Schou C., Rasmussen G., Kaltoft M.B., Henrissat B., Schulein M. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases. Eur. J. Biochem. 1993, v. 217, p. 947-953.

51. Divne C., Stahlberg J., Reinikainen T., Ruohonen L., Pettersson G., Knowles J.K., Teeri T.T., Jones T.A. The three-dimensional crystal structure of the catalytic core of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Science. 1994, v. 265, p. 524-528.

52. Rouvinen J., Bergfors T., Teeri T., Knowles J.K., Jones T.A. Three-dimensional structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Science. 1990, v. 249, p. 380-386.

53. Divne C., Stahlberg J., Teeri T.T., Jones T.A. High-resolution crystal structures reveal how a cellulose chain is bound in the 50 A long tunnel of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. J. Mo.l Biol. 1998, v. 275, p. 309-325.

54. Teeri, T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends Biotechnol. 1997, v. 15, p. 160-167

55. Vrsanska, M., Biely, P. The cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei QM 9414: action on cellooligosaccharides. Carbohydr. Res. 1992, v. 227, p. 19-27.

56. Ladisch, M.R., Lin, K.W., Voloch, M., Tsao, G.T. Process considerations in the enzymatic hydrolysis of biomass. Enzyme Microb. Technol. 1983, v. 5, p. 82-102.

57. Wilson, R.W., Niederpruem, D.J. Control of P-glucosidases in Schyzophyllum commune. Can. J. Microbiol. 1967, v. 13, p. 1009-1020.

58. Cao W.G., Crawford D.L. Purification and some properties of beta-glucosidase from the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius Strain Smf. Can. J. Microbiol. 1993, v. 39, p. 125129.

59. Dan S., Marton I., Dekel M., Bravdo B.A., He S., Withers S.G., Shoseyov O. Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus niger beta-glucosidase. J. Biol. Chem. 2000, v. 275, p. 4973-4980.

60. Evans CS: Properties of the beta-D-glucosidase (cellobiase) from the wood-rotting fungus, Coriolus versicolor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985, v. 22, p. 128-131.

61. Shewale, J.G., Sadana, J. Purification, characterization and properties of P-glucosidase enzymes from Sclerotium rolfsii. Arch. Biochem. Biophys. 1981, v. 207, p. 185-196.

62. Chen, H., Hayn, M., Esterbauer, H. Purification and characterization of two extracellular p-glucosidases from Trichoderma reesei. Biochim Biophys. Acta. 1992, v. 1121, p. 54-60.

63. Gong, C.-S., Ladisch, M.R., Tsao, G.T. Cellobiase from Trichoderma viride: purification, properties, kinetics and mechanism. Biotechnol. Bioeng. 1977, v. 19, p. 959-981.

64. McHale, A., Coughlan, M.P. The cellulolytic system of Talaromyces emersonii. Purification and characterization of the extracellular and intracellular p-glucosidases. Biochim. Biophys. Acta. 1981, v. 662, p. 152-159.

65. Hash, J.H., King, K.W. Some properties at an aryl-P-glucosidase from culture filtrates of Myrothecium verrucaria. J. Biol. Chem. 1958, v. 232, p. 395-402.

66. Umezurike, G.M. Kinetic analysis of the mechanism of action of p-glucosidase from Bortyodiplodia theobromae pat. Biochim. Biophys. Acta. 1975, v. 397, p. 164-178.

67. Гусаков А.В. Кинетическое описание ферментативного гидролиза целлюлозы (сырье, ферменты, процесс, реакторы). Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, Москва, МГУ, 1984, с. 192.

68. Клесов А.А. Современное состояние проблемы ферментативной переработки целлюлозы в сахара и спирт за рубежом. Прикл. биохим. микробиол. 1985, т.21, №2, с.269-283.

69. Coughlan, M.P. Enzymatic hydrolysis of cellulose: an overview. Biores. Technol. 1992, v.39, p.107-115.

70. Galbe, M., Zacchi, G. A review of the production of ethanol from softwood. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, v. 59, p. 618-628.

71. Duff, S.J.B., Murray, W.D. Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Biores. Technol., 1996, v. 55, p. 1-33.

72. Umezurike G.M. Kinetic analysis of the mechanism of action of p-glucosidase from Bortyodiplodia theobromae pat. Biochim. Biophys. Acta. 1975, v. 397, p. 164-178.

73. Iwashita K, Todoroki K, Kimura H, Shimoi H, Ito K. Purification and characterization of extracellular and cell wall bound beta-glucosidases from Aspergillus kawachii. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998 oct., v. 62(10), p. 1938-46.

74. Reese E.T., Sue R.G., Levinson H.S. The biological degradation of soluble cellulose derivates and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. J. Biotechnol. 1950, v. 59, p. 485497.

75. Reese E.T. History of cellulase program at the U.S. Army Development Center. Biotechnol. Bioeng. 1976, v. 6, p. 9-21.

76. Karlsson J., Siika-aho M., Tenkanen M., Tjerneld F. Enzymatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cell2A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei. J. Biotechnol. 2002, v. 99, p.63-68.

77. Henriksson G., Nutt A., Henriksson H., Pettersson В., Stahlberg J., Johansson G. and Pettersson G. Endoglucanase 28 (cell2A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase. Eur. J. Biochem. 1999, v. 259, p. 88-95.

78. Scott B.R., Hill C., Tomashek J., Liu C. Enzymatic hydrolysis of lignocellulosic feedstock using accessory enzymes. United State Patent Application. 2009, #0061484.

79. Zhang Y.H., Lynd L.R. Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose: noncomplexed cellulase system. Biotechnol. Bioeng. 2004, v. 88, p. 797-824.

80. Klyosov A.A. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation. Biochem., 1990, v. 129, p. 10577-10585.

81. Брунштейн Б. А., Клименко В. JI., Цыркин Е.Б., Производство спиртов из нефтяного и газового сырья, Л., 1964.

82. Сапотницкий С. А. Использование сульфитных щелоков. 2 изд., М., 1965.

83. Стабников В. Н., Ройтер И. М., Процюк Т. Б. Этиловый спирт. М., 1976.

84. Боуден Б.С. Справочник по производству спирта. Сырье, технология и технохимконтроль, М., 1981.

85. Dunnett A.J., Adjiman C.S. and Shah N. A spatially explicit whole-system model of the lignocellulosic bioethanol supply chain: an assessment of decentralised processing potential. Biotechnol. Biofuels. 2008, v. 1, p. 13.

86. Lin Y., Tanaka S. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Appl. Microb. Biotechnol. 2006, 69, p. 627-642.

87. Olofsson K., Bertillson M., Liden G. A short review on SSF an interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks. Biotechnology for Biofuels, 2008, v. 1, p. 7.

88. Severian D. Polysaccharides: Structural diversity and functional versatility. Marcel Dekker, New York, 2005, p. 957-984.

89. Скомаровский A.A. Компонентный состав и гидролитическая способность ферментного комплекса Penicillium verruculosum-, Диссертация канд.хим.наук. М., 2006,170 с.

90. Chung К.С., Kawai К., Yashima S., Eguchi Y. Purification of cellulolitic enzymes by Penicillium verruculosum. Hakkokogaki-kaishi. 1982, V. 60. p. 363-367.

91. Берлин A.X. Исследование тополитических эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Penicillium verruculosum и Trichoderma reesei. Диссертация канд. хим. наук. М., 1999, 199 с.

92. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов; Москва: Элвар, 2000, с. 13-288.

93. Кастельянос О., Ермолова О.В., Синицын А.П., Попова Н.Н. и др.Схема очистки ферментов целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum, исследование их биохимических свойств и специфичности. Биохимия. 1995, Т. 60, с. 925-943.

94. Зоров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum. Диссертация канд. хим. наук. М., 1998, 156 с.

95. Гутиеррес Родригес Б. Каталитические, биохимические и биотехнологические свойства эндоглюканазы В4 целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum. Диссертация канд. хим. наук. М., 1997,116 с.

96. Сахаров И.Ю., Зоров И.Н., Синицын А.П. Выделение эндоглюканазы Pénicillium verruculosum методом иммуноафинной хроматографии. Биохимия. 1996, т. 61, с. 16581663.

97. Montenecourt В.S., Eveleigh D.E. Preparation of mutants of Trichoderma reesei with enhanced cellulase production. Appl. Env.Microbiol. 1977, v. 34, p.777-782.

98. Ilmén M., Thrane С., Penttilâ M. The glucose repressor gene creí of Trichoderma: isolation and expression of a full-length and a truncated mutant form. Mol. Gen. Genet. 1996, v. 251, p. 451— 460.

99. Bevill K. The forefront of enzyme production. Ethanol Producer Magazine. 2009, v. 15(6), p. 100-105.

100. Agbogbo F.K., Wenger K.S. Production of ethanol from corn stover hemicellulose hydrolyzate using Pichia stipitis. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2007, v. 34, p.723-727.

101. Cherry J.R, Fidantsef A.L. Directed evolution of industrial enzymes: an update. Curr. Opin. Biotechnol. 2003, v. 14, p. 438^143.

102. Merino S.T, Cherry J. Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2007, v. 108, p. 95-120.

103. Rasmussen L.E., S0rensen H.R, Vind J., Viks0-Nielsen A. Mode of action and properties of the beta-xylosidases from Talaromyces emersonii and Trichoderma reesei. Biotechnol. Bioeng. 2006, v. 94, p. 869-876.

104. Rey M.W., Ramaiya P., Nelson B.A., Brody-Karpin S.D., Zaretsky E.J., Tang M. et.al. Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species. Genome Biol. 2004, v.5, R77.

105. SticklenM.B. Plant genetic engineering for biofuel production: towards affordable cellulosic ethanol. Nat. Rev. Genet. 2008, v. 9, p. 433^43.

106. Banerjee G. et al. Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations. Biotechnology for Biofuels. 2010, v. 3, p.:22.

107. Banerjee G., Car S., Scott-Craig J.S., Borrusch M.S., Aslam N., Walton J.D. Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set. Biotechnol. \ Bioengineer. 2010, v. 106, p.707-720.

108. Banerjee G., Car S., Scott-Craig J.S., Borrusch M.S., Bongers M., Walton J.D. Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction oflignocellulosic biomass. Bioresour. Technol. 2010, v.101, p. 9097-9105.

109. Heinzelman P., Snow C.D., Wu I., Nguyen C., Villalobos A., Govindarajan S., Minshull J., Arnold F.H. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, v. 106, p. 5610-5615.

110. Qin Y., Wei X., Song X., Qu Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J. Biotechnol. 2008, v. 135, p. 190195.

111. Zhang Y.H., Himmel M.E., Mielenz J.R. Outlook for cellulose improvement: screening and selection strategies. Biotechnol. Adv. 2006, v. 24, p. 452-^481.

112. Banerjee G., Scott-Craig J.S., Walton J.D. Improving enzymes for biomass conversion: A basic research perspective. Bioenerg. Res. 2010, v.3, p.82-92.

113. Zang J., Zhong Y., Zhao X., Wang T. Development of the cellulolytic fungus Trichoderma reesei strain with enhanced p-glucosidase and filter paper activity using strong artifical CBHI promoter. Biores.Tech. 2010, v. 101, p. 9815-9818.

114. Nyyssonen E., Keranen S. Multiple roles of the cellulose CBHI in enhancing production of fusion antibodies by the filamentous fungus Trichoderma reesei. Curr. Genet. 1995, v. 28, p. 7179.

115. Ti Liu, Tianhong Wang, Xian Li, and Xuan Liu, Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cellobiohydrolase I gene (cbhl) promoter optimization. Acta. Biochim. Biophys. Sin. 2008, v. 40, Issue 2, p. 158-165.

116. Wang T.H., Liu T., Wu Z-H., Liu S-L., Lu Y., Qu Y-B. Novel Cellulase Profile of Trichoderma reesei Strains Constructed by cbhl Gene Replacement with eg3 Gene Expression Cassette. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2004, v. 36(10), p. 667-672.

117. Karhunen T., Mantyla A., Nevalainen K.M., Suominen P.L. High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 1993, v. 241(5-6), p. 515-522.

118. Lewin B. Genes, VII Edition, Oxford University Press. 2002, p. 567-580.

119. Jones P.A., Baylin S.B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat. Rev. Genet. 2002, v.3, p. 415-428.

120. Luger K. Structure and dynamic behavior of nucleosomes. Curr. Opin. Genet. Dev. 2003, v. 13, p. 127-135.

121. Brosch G., Loidl P., Graessle S. FEMS Microbiol Rev 32. 2008, p. 409-439

122. Loidl P. A plant dialect of the histone language. Trends. Plant. Sci. 2004, v. 9, p. 84-90.

123. Lachner M., Jenuwein T. The many faces of histone lysine methylation. Curr. Opin. Cell. Biol. 2002, v. 14, p. 286-298.

124. Nowak S.J., Corces V.G. Phosphorylation of histone H3: a balancing act between chromosome condensation and transcriptional activation. Trends. Genet. 2004, v. 20, p. 214-220.

125. Allfrey V.G., Faulkner R., Mirsky A.E. Acetylation and methylation^ of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1964, v. 51, p. 786-794.

126. Loidl P. Histone acetylation: facts and questions. Chromosoma. 1994, v. 103, p. 441-449.

127. Ehingen A., Denison S.H.', May G.S., Sequence, organization and expression of the core histone genes of Aspergillus nidulans. Mol. Gen. Genet. 1990, v. 222, p. 416-424.

128. Woudt L.P., Pastink E., Kempers-Veestra A., Jansen A., Mager W., Planta RJ. The genes encoding histonr H3 and H4 in Neysporra crassa are unique and contain intervening sequences. Nucleic Acid Res 1983, v. 11, p. 5347-5360.

129. Belshaw N.J., Haigh N.P., Fish N.M., Archer D.B., Alcocer MJ.C. Use of a histone H4 promoter to drive the expression of homologous and heterologous proteins by Pénicillium funiculosum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, v. 60, p.455-460.

130. Gessner M., Raeder U. Histone H4 promoter for expression of a phleomycin-resistance gene in Phanerochaete chrysosporium. Gene. 1994, v. 142, p. 237-241.

131. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982.

132. Aslanidis C., J.de Jong P. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic. Asid. Research. 1990, v. 18, p. 6069-6075.

133. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V., Clutterbuck A.J. Curr.Genet. 1995, v. 28, p. 474-478.

134. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1944, v. 153, p. 375-379.

135. Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1952, v. 195, p. 1923.

136. Doner L.W., Irwin P.L. Assay of reducing end groups in oligosaccharide homologues with 2,2'-bicinchoninate. Anal. Biochem. 1992, v. 202, p. 50-53.

137. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика, М., Мир, 1991, с. 543.

138. James P. Proteome research: mass spectrometry. Springer-Verlag, Berlin, 2001.

139. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. МИР, 1980, с. 119.

140. Короткова О.Г., Семенова М.В., Морозова В.В., Зоров И.Н., Соколова JI.M., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства грибных Р-глюкозидаз. Биохимия, 2009, том 74, вып. 5, с. 699-709.

141. Синицына О.А., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Серебряный В.А., Вавилова Е.А., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Рекомбинантная эндо-1,4-Р-ксиланазаРеш'с////шя canescens. Биохимия. 2003. т.68. вып.12. с.1631-1638.