Биосинтез карбогидраз гриба Penicillium Verruculosum при культивировании на различных целлюлозосодержащих субстратах

Немашкалов, Виталий Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосинтез карбогидраз гриба Penicillium Verruculosum при культивировании на различных целлюлозосодержащих субстратах
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез карбогидраз гриба Penicillium Verruculosum при культивировании на различных целлюлозосодержащих субстратах"

НЕМАШКАЛОВ ВИТАЛИЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

БИОСШГГЕЗ КАРБОГИДРАЗ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCVLOSUM ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА РАЗЛИЧНЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ

СУБСТРАТАХ " ~

03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 (Ж 2012

Пущино - 2012

005046016

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и получения ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

Научный руководитель:

Окунев Олег Николаевич

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Ефременко Елена Николаевна

доктор биологических наук, профессор Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова заведующая лабораторией

Солонин Александр Сергеевич кандидат биологических наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН заведующий лабораторией

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится « 29 » июня 2012 г. в 10 часов 00 мин на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино.

Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ni и http://www.ibpm.ru Автореферат разослан «25» мая 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Н.В. Доронина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Микробная деградация целлюлозы и гемицеллюлозы, являющихся самыми распространенными биополимерами на Земле, в настоящее время предоставляет растущему человечеству способы решения экологических проблем, освоения новых источников сырья, энергии и пищи. Природная древесина, отходы ее переработки, отходы целлюлозно-бумажного и пергаментного производств являются дешевым и возобновляемым сырьем для получения моно- и олигосахаридов, спиртов, а также промышленных ферментов, в частности, карбогидраз (Berlin, Gilkes, 2005).

Основными продуцентами промышленных карбогидраз являются мицелиальные грибы рода Trichoderma, обладающие высокой секреторной способностью (Godfrey, West, 1996). Однако грибы рода Pénicillium также по праву занимают одно из главных мест в списке промышленно важных продуцентов, поскольку способны синтезировать ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз (эндоглкжаназ, целлобиогидролаз, ксиланаз и р-глюкозидаз) более сбалансированного состава, чем у Trichoderma, и эффективнее расщеплять целлюлозные субстраты; кроме того, индивидуальные ферменты обладают более высокой удельной активностью и операционной стабильностью (Кастельянос, 1995).

Одним из важнейших факторов рентабельности процессов биоконверсии лигноцеллюлозных материалов, наряду со стоимостью самого сырья, является эффективность гидролитического действия целлюлазных полиферментных комплексов, которая, в свою очередь, определяется как свойствами индивидуальных ферментов, так и их взаимодействием в составе этого комплекса, а также стоимость ферментационного процесса. С целью снижения затрат на получение конечного продукта (целлюлазного ферментного препарата) в лаборатории биосинтеза ферментов ИБФМ РАН вот уже более 15 лет активно ведется работа по созданию новых штаммов - суперпродуцентов внеклеточных карбогидраз в том числе и с помощью методов генетической инженерии, а также проводится оптимизация ферментационных сред и условий культивирования. На сегодняшний день наиболее известными и широко используемыми являются высокопродуктивный мутант P.verruculosum В221-151 и рекомбинантный штамм, полученный на его основе, P.verruculosum F10 -продуцент гетерологичной р-глкжозидазы из A.niger. Были предприняты попытки клонирования и экспрессии самых разных генов целевых ферментов, наиболее успешными из которых оказались в отношении гомологичной эндо-р-1,4-глюканазы II (ЭГ36Н) P.verruculosum - одного из ключевых компонентов мультиферментного комплекса, продуцируемого этим грибом.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение особенностей биосинтеза внеклеточных карбогидраз как новыми, так и ранее полученными рекомбинантными штаммами, созданными на основе мицелиального гриба P.verruculosum. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

• Создать на основе штамма P.verruculosum В1-221-151 новый рекомбинантный штамм-продуцент с повышенным уровнем экспрессии гомологичной эндоглкжаназы И.

• Оптимизировать условия культивирования и состав питательной среды для нового рекомбинантного цггамма-продуцента ЭГН P.verruculosum ЭГН-40 и ранее полученного рекомбинантного штамма-продуцента р-глюкозидазы (БГЛ) P.verruculosum FIO.

• Исследовать индуцирующее действие продуктов реакции поликонденсации глюкозы (целлобиозы, гентиобиозы, софорозы) на биосинтез целлюлаз новым рекомбинантным штаммом P.verruculosum ЭГИ-40.

• Исследовать биосинтез целлюлаз штаммом P.verruculosum ЭГН-40 при культивировании на различных целлюлозосодержащих материалах (ЦСМ).

• Исследовать гидролитическую способность ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов P.verruculosum - продуцентов ЭГН.

• Исследовать способность ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов P.verruculosum - продуцентов ЭГН, к увеличению питательной ценности кормов.

Научная новизна работы. Впервые созданы рекомбинантные штаммы-продуценты эндоглкжаназы II P.verruculosum ЭГН-40 и ЭГН-34 на основе штамма-реципиенга P.verruculosum В537 с помощью новой плазмидной конструкции, содержащей соответствующий ген целевого фермента под контролем собственного индуцибельного промотера cbhl гена мажорного секреторного белка целлобиогидролазы I (ЦБГ1). В ходе оптимизации условий культивирования в 1-литровых ферментерах трансформантов P.verruculosum ЭГН-40 и F10 впервые установлено, что рН-оптимумы синтеза целевых ферментов находятся в интервале значений 4,5-5,5, температурный оптимум - 32°С, оптимальным способом подачи подпитывающего раствора является дробный способ. Впервые установлено, что 2% МКЦ в составе исходной питательной среды достаточно для обеспечения высоко уровня синтеза основных ферментов трансформантами P.verruculosum ЭГН-40 и F10. Впервые исследовано индуцирующее влияние различных дисахаридов (целлобиозы, софорозы, гентиобиозы) на биосинтез внеклеточных карбогидраз рекомбинантным штаммом P.verruculosum ЭГИ-40 и установлено, что наиболее сильным индуктором целевых ферментов является гентиобиоза. Впервые показана возможность полной замены дорогостоящей микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) в составе ферментационной среды на пергамент при

культивировании штамма P.verruculosum ЭГН-40 в 1-литровых ферментерах. На основе штаммов P.verruculosum ЭГН-40 и ЭГН-34 впервые получены новые ферментные препараты, обладающие повышенной гидролитической способностью по отношению к различным природным целлюлозным субстратам, а также некрахмальным полисахаридам сельскохозяйственных кормов по сравнению с коммерческими аналогами.

Практическая значимость работы. В ходе проведенных исследований удалось снизить количество основного дорогостоящего компонента питательной среды (МКЦ) с 6 до 2% без существенных потерь в активностях ферментов при культивировании рекомбинантных штаммов P.verruculosum ЭГИ-40 и F10, что позволит значительно уменьшить стоимость получаемых ферментных препаратов. Выявлена возможность замены дорогостоящей МКЦ в составе исходной ферментационной среды для P.verruculosum ЭГН-40 на более дешевый целлюлозосодержащий субстрат (пергамент). Показана возможность частичной замены МКЦ в составе исходной питательной среды на смесь дисахаридов, что также может привести к положительному экономическому эффекту. Применение нового ферментного препарата ЭГН-40 при гидролизе различных видов ЦСМ (измельченной осиновой древесины, измельченной сосновой древесины, измельченной багассы) позволяет увеличить выход сбраживаемых Сахаров на 10-15% по сравнению с существующими лабораторными и коммерческими ферментными препаратами. Показана более высокая эффективность действия нового ферментного препарата ЭГН-40 на некрахмальные полисахариды кормов по сравнению с коммерческими аналогами, что, вероятно, позволит значительно снизить дозировки добавляемого на практике ферментного препарата.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2009, 2010 гг.); на международных конференциях: «BIOCATALYSIS 2007, 2009: Fundamental&Applications» (Санкт-Петербург 2007, Архангельск 2009), московской международной научно-практической конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов» (Москва 2010), втором международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «EURASIABIO» (Москва 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе, 3 статей в журналах из списка ВАК и 7 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах, иллюстрирована 16 таблицами и 54 рисунками. Библиографический указатель содержит 211 источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Создание рекомбинаитпых штаммов-продуцентов на основе штамма РлеттисиЫит В221-151

Получение штамма-реципиента для последующей трансформации генетической конструкцией, несущей целевой ген эндоглюканазы (ед///) Р.уеггиси1отт. Из исходного штамма Р.\еггиси1о$ит В221-151 (из коллекции лаборатории биосинтеза и получения ферментов ИБФМ РАН) посредством УФ-облучения и последующей селекции на питательных средах, содержащих в качестве источника азота нитрат натрия, нитрит натрия, гипоксантин, глутамнновую кислоту и хлорид аммония, а также биохимического тестирования при культивировании облученных клонов в колбах (табл.1), был получен мутантный штамм Рл>еггиси1о$ит, обладающий селективным маркерным признаком Л'/аСЧ

Из 5 протестированных клонов был отобран мутант №5, который использовался как штамм-реципиент для последующей трансформации целевой плазмидой (в дальнейшем обозначается как штамм Р.\еггисиШит В537).

Таблица 1. Значения удельных активностей и содержание белка в КЖ л/'аО^ мутантов

№ Белок, КМЦ-аза, Ксиланаза,

мутанта мг/мл ед/мг ед/мг

4 5,4±0,3 12,1±0,5 27,4±1,3

5 5,4±0,2 11,9±0,7 27Д±2,1

9 5,1±0,2 12,0±1,1 26,8±1,7

14 5,3±0,1 11,7±0,5 27,2±0,8

19 5,2±0,1 11,3±0,7 26,4±1,2

В221-151 5,4±0,2 12,1 ±0,6 27,3±1,5

Трансформация штамма-реципиента РжписиШит В537. Проведена котрансформация штамма-реципиента Р.\erruculosum В537 таНУ'' плазмидой рРгСВШ-ЕОН_В1 (рис.1), несущей целевой ген гомологичной эндоглюканазы (eglIГ) Р.хеггисиШит совместно с плазмидой рБТА 10, несущей ген нитратредуктазы (тай), обеспечивающей комплементацию дефектного гена нитратредуктазы в штамме-рецепиенте для позитивной селекции трансформантов на средах с нитратом натрия.

Плазмидная конструкция была получена и любезно предоставлена нашими коллегами из ИНБИ РАН им. А.Н. Баха. Далее проводили тест на стабильность трансформантов, состоящий в 4-х последовательных пересевах на селекционную среду, содержащую нитрат натрия в качестве источника азота. Стабильные трансформанты подвергали дальнейшему скринингу.

Л^иЫ (5749) иррегИС

//«1111 (75)

СВН1 В1 ргото(вг

ИЫШ (333^ ЯсоШ (331'

вит!II (3308) Ьо«г IX. М>в (3286)

СВШВИегт

Рисунок 1. Схематическое изображение экспрессионной плазмиды, несущей ген г%111.

ЕСН В1 та! иге рго1е!п

Ш (2248) №о! (2344) (№1111 (2499) №о1 (2628)

Первичный скрининг и анализ трансформантов, содержащих гомологичный ген эндоглюканазы II Р.чеггисШозит. Полученные трансформанты культивировали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на стандартной ферментационной среде КС-среде для Р.\erruculosum. Объем питательной среды для культивирования составлял 100 мл. Условия культивирования: 32°С, рН 5, 220 об/мин, 144 час. По окончании ферментации были отобраны пробы КЖ, в которых были измерены целевая (КМЦ-аза) и базовые (ксиланаза, авицелаза, Р-глюкозидаза) активности ферментов (табл.2). В качестве контроля использовали КЖ, полученную с помощью исходного штамма Р.\erruculosum В537.

Таблица 2. Значения активностей и содержания белка в культурапьной жидкости

№ Белок, КМЦ-аза, Ксиланаза, Авицелаза, Р-глюкозидаза,

мутанта мг/мл ед/мл ед/мл ед/мл ед/мл

1 2,6±0,1 104±12 68±4 3,0±0,2 1,1±0,1

2 2,0±0,1 141±12 55±4 2,9±0,2 1,7±0,1

3 1,4±,02 100±9 20±1 0,6±0,1 0,9±0,1

4 2,5±0,1 132±11 54±5 4,4±0,2 1,9±0,1

5 1,3±0,1 85±8 12±1 0,3±0,1 1,0±0,1

б 2,1 ±0,1 158±11 М 0,5±0,1 1,0±0,1

7 1,6±0,3 88±9 6±1 0,3±0,1 0,8±0,1

8 2,5±0,2 109±10 69±3 2,5±0,2 1,9±0,1

9 1,5±0,3 60±8 18±2 0,5±0,1 1,2±0,1

10 1,8±0,1 97±8 23±2 1,4±0,1 1,1±0,1

11 1,5±0,1 86±7 48±4 1,3±0,1 1,5±0,1

12 1,1 ±0,2 128±14 25±2 0,9±0,1 1,6±0,1

13 2,9±0,2 132±17 59±3 1,0±0,1 1,7±0,1

14 1,0±0,1 51±4 12±2 0,4±0,1 0,7±0,1

15 1,3±0,1 77±8 10±2 0,4±0,1 0,9±0,1

16 4,1±0,4 168±15 114±4 4,2±0,2 2,4±0,1

17 2,3±0,3 149±13 48±3 5,9±0,3 1,4±0,1

18 1,2±0,1 92±10 10±2 0,5±0,1 0,9±0,1

19 4,2±0,3 135±12 24±2 3,0±0,1 1,3±0,1

20 2,6±0,2 133±18 137±5 4,4±0,2 2,4±0,1

21 3,1±0,1 133±16 205±16 4,3±0,2 2,7±0,1

22 2,8±0,2 180±21 190±15 4,1±0,2 2,3±0,1

23 3,0±0,3 44±7 30±2 1,0±0,1 0,5±0,1

24 3,2±0,2 137±17 117±12 3,1±0,1 2,0±0,1

25 4,4±0,2 150±8 134±1 3,8±0,1 2,4±0,1

26 1,7±0,1 93±10 17±3 0,2±0,1 0,4±0,1

27 4,1±0,2 158±18 285±2 4,8±0,2 3,8±0,1

28 2,4±0,1 174±13 35±4 1,4±0,1 1,Ш,1

29 4,1 ±0,3 172±12 90±5 2,1 ±0,1 2,0±0,1

30 2,7±0,2 114±11 8±2 0,3±0,1 0,6±0,1

31 4,4±0,1 123±18 95±17 4,5±0,1 3,3±0,1

32 6,2±0,1 123±19 135±9 2,3±0,1 1,2±0,1

33 5,9±0,3 129±10 158±13 2,6±0,1 0,9±0,1

34 3,5±0,2 14Ш2 25±2 1,2±0,1 1,5±0,1

35 6,3±0,3 104±16 85±10 1,2±0,1 1,8±0,1

36 4,0±0,1 92±10 47±4 3,7±0,1 1,8±0,1

37 4,5±0,1 90±8 147±9 3,5±0,2 2,5±0,1

38 2,5±0,2 97±16 27±3 1,6±0,1 1,5±0,1

39 4,0±0,1 104±9 14±1 1,1±0,1 1,2±0,1

40 5,4±0,1 148±11 165±10 3,4±0,1 2,4±0,1

41 3,2±0,1 90±15 37±2 3,4±0,1 2,1 ±0,1

42 3,5±0,4 89±13 143±21 4,2±0,2 2,4±0,1

43 3,5±0,2 104±11 94±11 3,7±0,1 2,6±0,1

44 3,2±0,1 136±17 42±3 1,7±0,1 1,3±0,1

45 3,1±0,1 101±11 36±4 1,8±0,1 2,0±0,1

46 4,6±0,1 99±13 14±1 1,3±0,1 1,4±0,1

47 2,8±0,2 60±9 23±2 1,2±0,1 0,8±0,1

48 2,8±0,2 138±18 102±10 2,Ш,1 2,1±0,1

49 4,4±0,3 137±12 144±10 3,0±0,2 2,6±0,1

50 3,3±0,2 120±18 44±6 2,7±0,1 2,5±0,1

51 5,7±0,2 79±7 150±6 2,7±0,1 2,4±0,1

52 5,8±0,3 103±10 117±13 3,0±0,1 2,8±0,1

53 4,9±0,2 114±12 33±3 2,5Щ1 2,Ш,1

В537 5,7±0,2 61±8 150±8 2,7±0,2 2,4±0,1

Сопоставляя значения целевой (КМЦ-азной) и базовых (ксиланазной, авицелазной и р-глюкозидазной) активностей, полученные трансформанты можно условно разделить на 2 группы. В первую группу следует отнести трансформанты № 16, 33,40,48 (в табл. 2 отмечены жирным шрифтом, на рис. 2 обозначены сплошной стрелкой), у которых наблюдается повышение активности КМЦ-азы без существенного снижения активностей базовых ферментов; во вторую группу - трансформанты № 6, 28, 34, 53 (в табл. 2 отмечены жирным курсивом, на рис. 2 обозначены пунктирной стрелкой), являющиеся наиболее удачными с точки зрения экспрессии только одной КМЦ-азы.

Ша 1 2 3 4 М 5 6 7 В537

к!)а 35 116

Ша 27 28 29 М 30 31 32 33 34 В537

Рисунок 2. Электрофореграмма образцов культуральной жидкости трансформантов, полученных с помощью конструкции рРгСВН1-Е011_В1.

Совместно с коллегами из лаборатории биотехнологии ферментов ИНБИ РАН им. А.Н. Баха с помощью метода МАЫЭМОР масс-спектрометрии были проанализированы трипсиновые гидролизаты белковых полос, соответствующих ЭГН из РуеггисиЬзит. Основываясь на данных масс-спектрометрии можно утверждать, что в КЖ трансформантов, полученных с помощью плазмиды рРгСВН1-ЕОП_В1, содержится ЭГП из РжггиЫояит.

2. Оптимизация условий глубинного культивирования рекомбинантных штаммов Р.геггиси/ояит в 1-литровых ферментерах (на примере штамма ЭГН-40)

Оптимизация процесса подачи подпитывающего раствора при культивировании штамма Р.\еггисиЫит ЭГН-40. Проводили серию ферментаций трансформанта Р.\erruculosum ЭГП-40 на стандартной ферментационной среде для РуеггиЫохит с

различными способами подачи подпитки (50%-ный раствор глюкозы) в 1-литровых ферментерах. Подпитку осуществляли: 1 - по парциальному давлению рОг; 2 - дробно, 3-е постоянной скоростью. Результаты ферментации представлены на рис.3.

Показано, что оптимальным способом подачи подпитывающего раствора, при котором достигаются максимальные значения активности исследуемых ферментов и общего содержания внеклеточного белка в КЖ, является дробный способ.

--•--порог Л

Дроби« /

г. ■

24 « 72 ве 120 1*4 1М Чес

(в)

Рисунок 3. Динамика накопления продуктов штаммом Р. \erruculosum ЭГН-40 при разных режимах подпитки (а - КМЦ-аза; б - ксиланаза; в - авицелаза; г - (3-глюкозидаза; д - белок).

Влияние температуры и рН среды на биосинтез ферментов штаммом Р.\еггиси1о$ит ЭГП-40 при культивировании в 1-литровых ферментерах.

На уровень биосинтеза ферментов в значительной степени оказывает влияние температура культивирования продуцента и значение рН ферментационной среды (Грачева И.М., Кривова А.Ю., 2000). В связи с этим было проведено культивирование рекомбинантного штамма Р^еггисиЬвит ЭГП-40 при различных температурах, а также значениях рН питательной среды, поддерживаемых в процессе ферментации.

Из полученных данных (табл.3) видно, что оптимальная температура для синтеза целевых ферментов штаммом Р.уеггисиЬзит ЭГП-40 - 32°С. При снижении температуры до 30 и 28°С уровень синтеза карбогидраз снижался, в среднем, на 15-30 и 25-40%, соответственно. Повышение температуры культивирования до 34°С значительного влияния на активность и продуктивность штамма не оказало. рН-оптимум ферментационной среды при культивировании полученного продуцента находится в широком диапазоне значении 4,5 - 5,5.

Таблица 3. Влияние температуры и рН ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом Р. уеггиси1озит ЭГН-40.__

Условия культивирования Белок, % КМЦ-аза, % Авицелаза, %

Т,°С рН

28 4 75 76 68

5 76 77 69

6 61 63 59

30 4 83 84 82

5 83 83 80

6 71 73 69

32 4 100 100 100

5 100 100 100

6 97 95 98

34 4 100 100 100

5 100 99 100

6 94 92 96

Оптимизация питательной среды при культивировании штамма Ржггиси1о$ит ЭГН-40. Были исследованы четыре варианта количества МКЦ в составе исходной ферментационной среды: 0, 2, 4 и 6% с добавлением или без добавления 3 порций МКЦ в ходе ферментации. Длительность культивирования составляла 168 часов. В табл. 4 представлены результаты измерений активностей ферментов и общего содержания внеклеточного белка в пробах слива.

Таблица 4. Продукция внеклеточных карбогидраз штаммом РжггисиШит ЭГН-40 при культивировании в ферментере на питательной среде с разным содержанием МКЦ._

МКЦ в исходной среде, % 3 добавки МКЦ Белок, мг/мл КМЦ-аза, ед/мл Ксиланаза, ед/мл Авицелаза, ед/мл р-глюкозидаза, ед/мл

0 + 19±1,0 592±18 392±38 8±1 26±2

- 13±0,5 330±20 218±36 4±1 16±1

2 + 34±0,6 1157±38 970±50 14±3 60±2

- 26±0,8 802±22 621±52 11±1 45±3

4 + 35±1,2 1184±36 1014±41 16±1 66±1

- 28±0,5 973±21 785±39 15±2 52±2

6 + 37±0,5 1315±35 1090±47 17±1 71±1

- 36±0,6 1262±43 1026±54 16±1 67±1

В ходе данного эксперимента показано, что для достижения высокого уровня синтеза целевой КМЦ-азы и других (базовых) ферментов достаточно 2% МКЦ в составе исходной

питательной среды с тремя добавки МКЦ в процессе ферментации, что позволит снизить стоимость ферментационной среды примерно на 25%.

Оптимизация условий глубинного культивирования рекомбннантных штаммов P.verruculosum FIO в 1-литровых ферментерах. Для рекомбинантного штамма P.verruculosum FIO, полученного ранее в лаборатории биосинтеза ферментов ИБФМ РАН, используя аналогичную схему экспериментов, были также проведены исследования по оптимизации условий культивирования и состава ферментационной среды. Было показано, что оптимальным способом подачи подпитки, так же, как и для штамма-продуцента P.verruculosum ЭГН-40, является дробный способ, температурный оптимум биосинтеза ферментов для данного продуцента - 32°С, рН-оптимум также находится в достаточно широком диапазоне -4,5 - 5,0. Исследуя влияние состава ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом P.verruculosum FIO, удалось снизить количество дорогостоящего компонента (МКЦ) в составе исходной питательной среды до 2%, при этом, не осуществляя добавок МКЦ в ходе ферментации, без существенных потерь в активностях получаемого ферментного препарата. Это, в свою очередь, позволит сократить затраты на ферментационную среду примерно на 30%.

3. Влияния индуцирующего действия растворимых дисахаридов на биосинтез целлюлаз штаммом P.verruculosum ЭГН-40

Исследование индуцирующего действия растворимых дисахаридов на биосинтез целлюлаз штаммом P.verruculosum ЭГН-40 при культивировании в колбах. Известно, что синтез микробных целлюлаз наряду с целлюлозой индуцируется различными дисахаридами. Так, например, софороза является хорошим индуктором для Trichoderma reesei (Sternberg, Mandéis, 1979), гентибиоза - для P.purpurogenum (Takashi Kurasawa, 1991). Известны также примеры индукции ферментов целлобиозой, ламинарибиозой, лактозой и др.(ЕЬегЬаП, Beck, 1973; Woodward, Wiseman, 1982). Таким образом, целью работы на данном этапе было исследование индуцирующего действия, как смеси продуктов реакции поликонденсации, получаемой с помощью р-глкжозидазного ферментного препарата, так и отдельных дисахаридов, на биосинтез целлюлаз штаммом P.verruculosum ЭГН-40.

В рамках этого исследования было проведено периодическое культивирование трансформанта P.verruculosum ЭГН-40 на стандартной питательной среде для P.verruculosum, содержащей различные индукторы целлюлаз. Исходя из полученных данных (рис.4), видно,

что все исследуемые дисахариды, как в смеси, так и отдельно оказывают индуцирующее действие на биосинтез карбогидраз.

100

# ео

Я 60

о 40

<А. 20

1 2 3 4 5 6 7 (В)

Рисунок 4. Влияние различных индукторов на биосинтез ферментов штаммом Р \erruculosum ЭГН-40 при культивировании в колбах (1 - 6% глюкозы (контроль); 2 - 4% смеси Сахаров + 2% глюкозы; 3 - 4% смеси Сахаров; 4 - 6% смеси Сахаров; 5 - б% глюкозы + 65 мг софорозы; 6 - 6% глюкозы + 345 мг гентиобиозы; 7 - 6% глюкозы + 85 мг целлобиозы).

Очевидно, что гентиобиоза является наиболее сильным индуктором КМЦ-азы и ксиланазы Р.уеггиси1о.тт по сравнению с другими дисахаридами. Однако активность Р-глюкозидазы в присутствии только гентиобиозы наблюдается на очень низком уровне. Подобное нескоординированное изменение уровня синтеза ферментов штаммом ЭГН-40 может объясняться различиями в механизмах регуляторного контроля синтеза ферментов.

Исследование индуцирующего действия растворимых дисахаридов на биосинтез целлюлаз штаммом Р.\еггиси^ит ЭГН-40 при культивировании в 1-литровых ферментерах. В ходе настоящего эксперимента была предпринята попытка полной или частичной замены микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) в составе исходной питательной среды, а также 3 добавок МКЦ в процессе ферментации, на смесь Сахаров, полученной в

результате реакции поликонденсации глюкозы, при культивировании штаммом Р.\еггиси1о$ит ЭГП-40 в 1-литровых ферментерах.

Как вино из полученных данных (рис.5а), при замене 1/3 количества МКЦ на смесь Сахаров активности ферментов несколько превосходят контрольный вариант (1). При замене 2/3 количества МКЦ активности ферментов снижаются незначительно. Однако суммарные активности ферментов (в пересчете на весь объем супернатанта слива) наблюдаются на уровне контрольных значений (рис.5б). При осуществлении только 3 добавок МКЦ в процессе ферментации потери в активностях ферментов в среднем составили 15-17%. Более существенное снижение активностей ферментов наблюдается при полной замене МКЦ на смесь Сахаров.

Таким образом, показано, что 2/3 МКЦ в составе исходной питательной среды можно заменить на смесь продуктов конденсации без потерь в активностях основных ферментов, осуществляя при этом 3 добавки МКЦ в процессе ферментации.

(а)

Рисунок 5. Индукция синтеза ферментов дисахаридами (софорозой, гентиобиозой, целлобиозой) при культивировании в 1-литровых ферментерах (а - максимальные активности ферментов; б - выход ферментов); 1 - 6% МКЦ + 4% глюкозы + 3 добавки МКЦ (контроль); 2 - 6% МКЦ + 4% глюкозы; 3 - 4% МКЦ + 2% смеси Сахаров + 4% глюкозы + 3 добавки МКЦ; 4 - 4% МКЦ + 2% смеси Сахаров + 4% глюкозы; 5 - 2% МКЦ + 4% смеси Сахаров + 4% глюкозы + 3 добавки МКЦ; 6 - 2% МКЦ + 4% смеси Сахаров + 4% глюкозы; 7 -0% МКЦ + 6% смеси Сахаров + 4% глюкозы + 3 добавки МКЦ; 8 - 0% МКЦ + 6% смеси Сахаров + 4% глюкозы.

4. Культивирование трансформанта Р.\еггисиЫит ЭГН-40 на различных целлюлозосодержащих субстратах

С целью исследования возможности замены дорогостоящей МКЦ в составе исходной ферментационной среды было проведено культивирование штамма Р.\erruculosum ЭГН-40 на питательных средах, основным углеродным субстратом в которых являлись: древесина хвойная обессмоленная (ДХОС), целлюлоза лиственная, целлюлоза хвойная (отходы отечественных целлюлозно-бумажных комбинатов), пергамент растительный (обрезки, накапливающиеся при производстве пергамента). Контрольным экспериментом было

культивирование на МКЦ. На рие.6 представлены максимальные значения активностей ферментов и содержания внеклеточного белка в КЖ.

Из всех исследованных субстратов наилучшие результаты были получены при культивировании на пергаменте. Активности КМЦ-азы, ксиланазы и р-глюкозидазы в этом случае уступали контрольным значениям примерно на 24-27%. В случае использования в качестве субстратов лиственной и хвойной целлюлозы снижение уровня синтеза ферментов относительно контрольного было в среднем на 50%. При культивировании на ДХОС снижение активности ферментов оказалось наиболее существенным и составило по сравнению с контролем примерно 73%, что, вероятно, вызвано, присутствием в ней большого количества нецеллюлозных компонентов, в частности лигнина.

Таким образом, отходы пергаментного производства являются весьма привлекательным субстратом для получения промышленных целлюлаз, так как обеспечивают достаточно высокий (сопоставимый с МКЦ) уровень синтеза целевых ферментов. 1«0 1200

з 1000-

>2 800

1 400

200-О-

Рисунок 6. Активности ферментов и содержание внеклеточного белка в КЖ, полученной при культивировании штамма РжггисиЬзит ЭГН-40 в 1-литровых ферментерах на различных целлюлозосодержащих субстратах: микрокристаллической целлюлозе (МКЦ), древесине хвойной обессмоленной (ДХОС), целлюлозе лиственной (ЦЛ), целлюлоза хвойной (ЦХ), пергаменте.

Отметим, однако, что при культивировании на лиственной и хвойной целлюлозах и пергаменте, наблюдалась значительная задержка начального роста культуры (примерно 4-5 суток) (рис.7а), тогда как при культивировании на МКЦ и измельченной сосне она составляла 1-2 суток. Предположительно она вызвана наличием веществ, входящих в состав исследуемых субстратов и подавляющих начальный рост гриба, а также синтез целлюлозолитических ферментов, которые используются при производстве этих целлюлоз на ЦБК. Одной из причин удлиненной лаг-фазы, вероятно, также может служить и повышенная устойчивость данных субстратов к ферментативному воздействию, обусловленная их надмолекулярной структурой.

Таким образом, из-за существенного увеличения продолжительности процесса культивирования получение карбогидраз с использованием целлюлозосодержащих субстратов, альтернативных МКЦ, значительно удорожается.

В поисках решения этой проблемы было проведено периодическое культивирование Р.\еггиси1охит ЭШ-40 в 1-литровых ферментерах на среде, содержащей 6% пергамента, предварительно предобработанного ферментным препаратом Руеггиси1оьит В537 в дозах 1 и 2,5 мг ФП на 1 г пергамента (рис.7б и 7в, соответственно).

Рисунок 7. Динамика накопления продуктов в КЖ при культивировании штамма Ржтилйошп ЭГЦ-40 в 1-литровых ферментерах с предварительной обработкой пергамента ФП В537 (а - без предобработки; б- 1 мгф.пЛгБ; в-2,5 мгф.п./1г8).

Как видно из полученных данных, в результате предобработки пергамента в случае дозы 1 мг ФП на 1 г $ лаг-фаза составила примерно 3 суток (рис.76), при увеличение дозы ФП до 2,5 мг ФП на 1 г Б - примерно 2 суток, что на 3 и 2 суток короче по сравнению с вариантом без предобработки. Необходимо отметить что, максимумы активностей исследуемых ферментов и количество внеклеточного белка в КЖ, полученной при культивировании с предобработкой, в среднем на 25% уступают таковым, полученным при культивировании без предобработки, однако эти потери могут быть компенсированы сокращением времени ферментации, так как максимальные значения активностей ферментов наблюдаются уже на 120 часов культивирования.

5. Исследование гидролитической способности ферментного препарата, полученного на основе рекомбннантного штамма P.verruculosum ЭШ-40, по отношению к различным видам ЦСМ

Был проведен гидролиз различных видов ЦСМ (измельченной осины, измельченной обессмоленной сосны, измельченной багассы) с помощью ФП, полученных на основе новых штаммов P.verruculosum ЭШ-40 и ЭГН-40. Гидролиз проводили в течение 48 часов при 50°С и различной дозировке ФП по белку (2, 5, 10 мг белка на 1 г субстрата) в присутствии избытка целлобиазного ФП F10 (40 ед целлобиазы на 1 г субстрата). Через 3, 24 и 48 часов из реакционной смеси отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию восстанавливающих Сахаров (ВС) и глюкозы. В качестве контрольных препаратов были использованы: В537, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum В537, коммерческие препараты, полученные на основе T.reesie: Spesyme CP, Celluclast 1.5L, Accelerase 1000, CellicCtec (значения активностей препаратов представлены в табл.5).

Таблица 5. Удельные активности ферментных препаратов, ед/мг белка.

Название ФП Белок, мг/мл КМЦ-аза Ксиланаза Р-глюкозидаза

P.verruculosum В537, (контроль) 834± 33 14,9± 0,6 15,0± 0,6 1,25± 0,05

Spesyme CP 118±5 27,7±1,1 7,5±0,3 0,57±0,02

Celluclast 1.5L 184± 7 17,5±0,7 2,9±0,1 0,15±0,01

Accelerase 1000 103±4 30,7±1,2 3,3±0,1 2,94±0,12

CellicCtec 182±6 11,3±1,0 1,4±0,1 2,81±0,03

P.verruculosum ЭГН-40 760±27 17,6±0,5 23.2±0,8 1,1 ±0,05

P.verruculosum ЭГН-34 704±25 20,0±0,6 7,5±0,3 0,35±0,05

Наиболее высокой осахаривающей способностью по отношению к исследуемым природным целлюлозосодержащим субстратам обладает рекомбинантный препарат ЭГН-40 рис.8 и превосходит по эффективности гидролиза этих видов ЦСМ как контрольный препарат, полученный с помощью исходного штамма Ржггиси1о5ит В537, так и коммерческие ферментные препараты (рис.8). Степень конверсии в результате гидролиза измельченной осины, сосны и багассы при действии препарата ЭГН-40 составила 52, 46 и 54%, соответственно. Препарат ЭГН-34 также обладает достаточно высокой осахаривающей способностью, хотя и уступает на всех субстратах препарату ЭГН-40, а также контрольным препаратам Зрезуше СР и В537 на измельченной сосне. Однако по отношению к измельченной осине и багассе гидролитическая способность препарата ЭГН-34 превосходит или находится примерно на одинаковом уровне с контрольным и коммерческими препаратами. Степень конверсии измельченной осины, сосны и багассы в случае использования этого препарата составила 50,44 и 50%, соответственно.

Рисунок 8. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 48 часов гидролиза различных природных ЦСМ в присутствии препарата F10 (40 ед целлобиазной активности на 1 г субстрата): а - измельченная осина; б - измельченная обессмоленная сосна; в - измельченная багасса. Условия: 50°С, рН 5, [S] = 100 г/л (сухой вес), [Е] = 5 мг/г субстрата, 250 об/мин.

На рис. 9 представлены кинетические кривые гидролиза измельченной осиновой древесины рекомбинантными ферментными препаратами ЭГН-40, ЭП1-34, препаратом В537 и коммерческими препаратами.

О 12 24 36 Время, ч 48

Рисунок 9. Кинетические кривые накопления ВС при гидролизе измельченной осиновой древесины препаратами ЭГП-40, ЭГ11-34 и контрольными препаратами в присутствии препарата F10 (40 ед целлобиазной активности на 1 г субстрата): а - 2 мг на 1 г субстрата, б -5 мг на 1 г субстрата, в - 10 мг на 1 г субстрата. Условия: 50°С, рН 5, [S] = 100 г/л (сухой вес), 250 об/мин.

Как видно из полученных данных, ферментный препарат ЭГН-40 по глубине и скорости гидролиза превосходит контрольный препарат В537 и коммерческие препараты за исключением начального отрезка времени при дозировке 10 мг на 1 г субстрата, где он несколько уступил контрольному препарату В537. Отметим также, что при гидролизе измельченной осиновой древесины выход ВС, достигаемый при действии рекомбинантных

препаратов через 24 часа гидролиза, превосходит или находится на уровне значений выхода ВС, достигаемый при действии контрольного или коммерческих препаратов через 48 часов, что позволяет снизить время гидролиза.

б. In vitro "кормовые" испытания препаратов ЭГП-40 и ЭГП-34 на различных типах кормов

Существует два распространенных типа кормовых рационов животных и птиц. Основу первого рациона составляют пшеница, ячмень и рожь, основу второго - соя. Исходя из этого, в качестве модельных систем при проведении "кормовых" испытаний препаратов и индивидуальных ферментов были выбраны следующие: смесь пшеница + ячмень (в соотношении 60:40 по весу), соевая мука и пшеничные отруби. Все субстраты предварительно измельчали на механической мельнице и просеивали, чтобы получить однородную смесь. "Кормовой" тест проводили при следующих условиях: 40°С, рН 5, концентрация субстрата 50 мг/мл, перемешивание реакционной смеси. Препараты уравнивали по белку, использовали три концентрации - 1 мг/г, 2 мг/г, 5 мг/г белка на 1 г субстрата. Данный диапазон белковых концентраций выбран, исходя из имеющихся сведений по реальному применению ферментных препаратов на практике. Продолжительность инкубирования составляла 3 часа, после чего отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию ВС.

Как видно из представленных данных (рис.10), наиболее эффективным при действии на различные кормовые субстраты оказался препарат ЭГН-40, что объясняется сбалансированностью компонентного состава его ферментного комплекса, который, в свою очередь, характеризуется не только высокой целлюлазной (КМЦ-азной), но и высокой ксиланазной активностью. Подобное увеличение способности рекомбинантного препарата ЭГН-40 гидролизовать кормовые субстраты позволит значительно снизить количество ферментного препарата, добавляемого на практике в кормовые смеси.

Рисунок 10. Результаты in vitro "кормового" теста препаратов на различных кормовых субстратах: а - смесь пшеница + ячмень (в соотношении 60:40 по весу), б - соевая мука, в -пшеничные отруби. Условия: 40°С, рН 5, [S] = 500 г/л (сухой вес), [Е] = 1, 2 и 5 мг/г, 250 об/мин.

выводы

1. Созданы новые рекомбинантные штаммы на основе гриба P.verruculosum, продуцирующие гидролитические комплексы с увеличенной целлюлазной и эндо-Р-1,4-глюканазной активностью.

2. Для рекомбинантных штаммов P.verruculosum - продуцентов зндоглюканазы II (ЭП1-40) и ß-глюкозидазы (F10) оптимизированы состав питательной среды и условия культивирования в 1-литровых ферментерах. Оптимальными параметрами для достижения высокого уровня синтеза ферментов являются Т = 32°С, pH = 4,5 - 5,5, способ подачи подпитывающего раствора - дробный.

3. В процессе оптимизации удалось снизить количество основного компонента питательной среды (микрокристаллической целлюлозы) с 6 до 2% без существенных потерь активностей ферментов (КМЦ-азы, ксиланазы, ß-глюкозидазы).

4. Исследовано индуцирующее действие продуктов реакции поликонденсации (глюкозы, целлобиозы, софорозы, гентиобиозы) на биосинтез целлюлаз новым рекомбинантным штаммом P.verruculosum ЭГП-40. Установлено, что использование смеси этих продуктов позволяет заменить до 70% микрокристаллической целлюлозы в составе исходной питательной среды без существенных потерь в активностях ферментов.

5. Установлена возможность полной замены МКЦ в составе исходной питательной среды на пергамент.

6. С помощью рекомбинантных штаммов P.verruculosum получен ферментный препарат карбогидраз P.verruculosum ЭГП-40, который обеспечивает увеличение выхода продуктов гидролиза на 10-15% по сравнению с контрольным ферментным препаратом, полученным с помощью исходного штамма P.verruculosum В537.

7. В результате проведения in vitro "кормовых" тестов установлено, что рекомбинантный препарат P.verruculosum ЭГП-40 обладает повышенной эффективностью действия на кормовые субстраты по сравнению с коммерческими аналогами, что позволит значительно сократить дозу препарата, добавляемого на практике в кормовые смеси.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. В.А. Немашкалов, А.О. Беккаревич, A.B. Кошелев, О.Н. Окунев, A.M. Рожкова, О.Г. Короткова, А.П. Синицын. Создание высокоактивного ферментного препарата для биоконверсии багассы на основе рекомбинантного штамма Pénicillium verruculosum. Хранение и переработка сельхозсырья. 2011, №10, С. 33-35.

2. О.Г. Короткова, A.M. Рожкова, В.Ю. Матыс, A.B. Кошелев, О.Н. Окунев, В.А. Немашкалов, O.A. Синицына, А.Г. Правильников, P.M. Андрианов, И.Н. Овешников, Е.Р.

Давидов, А.П. Синицын. Получение комплексных биокатализаторов на основе ферментных препаратов из рекомбинантного гриба Pénicillium vemiculosum и применение их в гидролизе отходов деревообрабатывающей и сельскохозяйственной промышленности. Катализ в промышленности. 2011, №5, С. 61-68.

3. A.M. Рожкова, О.Г. Короткова, А.Г. Правильников, P.M. Андрианов, А.П.Синицьш,

0.А. Синицына, О.Н.Окунев, В.Ю. Матыс, А.В. Кошелев, В.А. Немашкалов, Н.В. Цурикова. Применение нового комплексного ферментного препарата при переработке целлюлозосодгржащей биомассы. Хранение и переработка сельхозсырья. 2011, №10, С. 44-47.

4. Koshelev A.V., Matys V.Yu., Nemashkalov V.A., Skoraorovsky A.A., Ustinov B.B., Zorov

1.N., Morozova V.V., Korotkova O.G., Sinitsyn A.P., Biodégradation of paper parchment by mycelium fungi Pénicillium and Trichoderma and possibility of their application for production of cellulose-lytic enzymes and bioethanol. Abstract of International Conference "Biocatalysis-2007: Fundamentals & Applications". St. Petersburg, 2007, P. 114.

5. Osipov D.O., Koshelev A.V., Zorov I.N., Matys V.Yu., Bubnova T.V., Nemashkalov V.A., Okunev O.N., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P. Simultaneousfermentalion of fungi Trichoderma longibrachiatum and Pénicillium verruculosum as a tool for obtaining cellulose complex with increased (3-glucosidasc activity. Abstract of International Conference "Biocatalysis-2007: Fundamentals & Applications". Arkhangelsk, 2009, P. 107.

6. Немашкалов B.A., Кошелев A.B., Окунев O.H. Биосинтез карбдгидраз гриба Pénicillium verruculosum при культивировании на различных целлюлозосодержащих субстратах. Тезисы 13-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2009, С. 174.

7. Немашкалов В.А., Беккаревич А.О., Кошелев А.В., Матыс В.Ю., Бубнова Т.В., Рожкова А.М, Короткова О.Г. Создание рекомбинантного штамма-продуцента р-глкжозидазы для увеличения эффективности процесса ферментативного осахаривания целлюлозосодержащего сырья. Материалы 2-ого Конгресса-партнеринга и выставки по биотехнологии и биоэнергетике. Москва, 2010, С. 133.

8. Синицын А.П., Синицына О.А., Рожкова A.M., Зоров И.Н., Федорова Е.А., Семенова М.В., Саттрудинов А.Д., Короткова О.Г., Андрианов P.M., Правильников А.Г., Волков П.В., Осипов Д О., Бушина Е.В., Кондратьева Е.А., Гусаков А.В., Немашкалов В.А., Беккаревич АО., Матыс В.Ю., БубноваТ.В., КошелевА.В., Окунев ОН. Комплекс ферментов для эффективного осахаривания лигноцеллюлозных материалов. Материалы 2-ого Конгресса-партнерингаи выставки по биотехнологии и биоэнергетике. Москва, 2010, С. 162-163.

9. Немашкалов В.А., Кошелев А.В., Окунев О.Н. Создание рекомбинантного штамма-продуцента целлобиазы (Р-глюкозидазы). Тезисы 14-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2010, С. 276-277.

10. Короткова О.Г., Правильников А.Г, Немашкалов В.А., Рожкова А.М., Синицын А.П. Гидролитическая способность новых ферментных препаратов на основе гриба Pénicillium verruculosum. Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2011, С. 326-328.

Подписано в печать:

22.05.2012

Заказ № 7391 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Немашкалов, Виталий Алексеевич

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗОСООДЕРЖАЩИЕ МАТЕРИАЛЫ (ЦСМ).

1.1. Виды и запасы ЦСМ.

1.2. Состав и структура ЦСМ.

1.3. Предварительная обработка ЦСМ.

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАЗРУШЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ

МАТЕРИАЛОВ (ЦСМ).

2.1. Современные представления о классификации карбогидраз.

2.2. Основные ферменты целлюлазного комплекса.

2.3. Современные представления о механизме действия целлюлазного комплекса.

2.4. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы.

2.5. Штамм Pénicillium verruculosum и секретируемые им ферменты.

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ

ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ.

3.1. Влияние условий ферментации на эффективность биосинтеза ферментов грибными продуцентами.

3.2. Получение генетически измененных штаммов P. verruculosum.

3.2.1. Ненаправленный мутагенез.

3.2.2. Генетическая инженерия.

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КАРБОГИДРАЗ В РАЗЛИЧНЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ.

4.1. Использование ферментов в качестве кормовых добавок.

4.2. Использование ферментов для отбеливания целлюлознобумажной пульпы.

4.3. Применение ферментов в текстильной промышленности.

4.3.1. Биоотварка хлопчатобумажных тканей.

4.3.2 Биодепигментация и биополировка хлопчатобумажных изделий.

4.4. Применение ферментов в производстве альтернативного топлива.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

5.1. Исходный штамм-продуцент.

5.2. Использованные вещества.

5.2.1. Ферментные препараты.

5.2.2. Субстраты и реактивы.

5.2.3. Состав питательных сред.

5.3. Методы.

5.3.1. Мутагенез и селекция штаммов.

5.3.2. Метод получения протопластов.

5.3.3. CaCh/PEG трансформационный метод.

5.3.4. Культивирование гриба P. verruculosum в колбах.

5.3.5. Культивирование гриба P. verruculosum в ферментерах.

5.3.6. Метод определения Сахаров.

5.3.7. Метод определения концентрации белка.

5.3.8. Методы определения активности ферментов.

5.3.9. Определение гидролитической способности ферментных препаратов.

5.3.10. Оценка "кормовой" эффективности ферментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ - ПРОДУЦЕНТОВ

ЦЕЛЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ.

6.1. Получение маркерного штамма-реципиента для последующей трансформации целевыми генами р-глюкозидазы ((3Glu) и эндоглюканазы (EGII).

6.1.1. Получение споровой суспензии штамма гриба P. verruculosum В221-151 и подготовка к УФ - мутагенезу.

6.1.2. Проведение УФ - мутагенеза.

6.1.3. Отбор мутантов на селективной среде с хлоратом натрия.

6.1.4. Скрининг устойчивых к хлорату натрия niaD^ мутантов среди колоний штамма Pénicillium verruculosum В221-151, тестирование их по способности усваивать различные источники азота.

6.1.5. Отбор истинных пш£)^мутантов.

6.2. Трансформация штамма-реципиента P. verruculosum В 537.

6.2.1. Первичный скрининг и анализ трансформантов, содержащих гомологичный ген эндоглюканазы II P. verruculosum.

ГЛАВА 7. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ Р-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И

ЭНДОГЛЮКАНАЗЫ II В 1-ЛИТРОВОМ ФЕРМЕНТЕРЕ.

7.1. Культивирование рекомбинантных штаммов-продуцентов ЭГП в 1-литровых ферментерах.

7.1.1. Оптимизация процесса подачи подпитывающего раствора при культивировании штамма Р. verruculosum ЭГИ-40.

7.1.2. Влияние температуры и рН ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом Р. verruculosum ЭГП-40.

7.1.3. Оптимизация состава питательной среды при культивировании штамма

Р. verruculosum ЭГП-40.

7.2. Культивирование рекомбинантных штаммов-продуцентов (3-глюкозидазы в

1-литровых ферментерах.

7.2.1. Оптимизация процесса подачи подпитывающего раствора при культивировании штамма Р. verruculosum FIO.

7.2.2. Влияние температуры и рН ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом Р. verruculosum FIO.

7.2.3. Оптимизация состава питательной среды при культивировании штамма

Р. verruculosum FIO.

7.3. Совместное культивирование рекомбинантных штаммов Р. verruculosum

ЭГП-40 и F10 с исходным штаммом Р. verruculosum В537.

7.3.1. Совместное культивирование штаммов Р. verruculosum В537 и F10.

7.3.2. Совместное культивирование штамма Р. verruculosum В537 и ЭГ II-44.

ГЛАВА 8. ИНДУКЦИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ ШТАММА Р. VERRUCULOSUM ЭГП-40 РАЗЛИЧНЫМИ ДИСАХАРИДАМИ.

8.1. Получение смеси продуктов реакции поликонденсации с помощью ферментных препаратов Р. verruculosum В537 и FIO.

8.2. Полная или частичная замена МКЦ на смесь Сахаров при культивировании штамма Р. verruculosum ЭГП-40 в колбах.

8.3. Исследование влияния различных дисахаридов на биосинтез целлюлаз штаммом

Р. verruculosum ЭГП-40 при культивирования в колбах.

8.4. Полная или частичная замена МКЦ на смесь Сахаров при культивировании штамма Р. verruculosum ЭГП-40 в 1-литровых ферментерах.

ГЛАВА 9. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТРАНСФОРМАНТА Р. VERRUCULOSUM ЭГП

НА РАЗЛИЧНЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ СУБСТРАТАХ.

9.1. Исследование возможности полной замены МКЦ на альтернативные целлюлозосодержащие субстраты при культивировании рекомбинантного штамма ЭГП-40.

ГЛАВА 10. ИССЛЕДОВАНИЕ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ P. VERRUCULOSUM, ПО ОТНОШЕНИЮ К РАЗЛИЧНЫМ ВИДАМ ЦСМ.

10.1. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины.

10.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины.

10.3. Результаты гидролиза измельченной багассы.

ГЛАВА 11. ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБНОСТИ ПОЛУЧЕНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ К УВЕЛИЧЕНИЮ ПИТАТЕЛЬНОЙ ЦЕННОСТИ КОРМОВ

ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ.

11.1 .In vitro "кормовые" испытания препаратов ЭГП-40 и ЭГП-34 на различных типах кормов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез карбогидраз гриба Penicillium Verruculosum при культивировании на различных целлюлозосодержащих субстратах"

Микробная деградация целлюлозы и гемицеллюлозы, являющихся самыми распространенными биополимерами на Земле, в настоящее время предоставляет растущему человечеству способы решения экологических проблем, освоения новых источников сырья, энергии и пищи. Природная древесина, отходы ее переработки, отходы целлюлозно-бумажного и пергаментного производств являются дешевым и возобновляемым сырьем для получения моно- и олигосахаридов, спиртов, а также промышленных ферментов, в частности, карбогидраз [1].

Основными продуцентами промышленных карбогидраз являются мицелиальные грибы рода Trichoderma, обладающие высокой секреторной способностью [2]. Однако грибы рода Pénicillium также по праву занимают одно из главных мест в списке промышленно важных продуцентов, поскольку способны синтезировать ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз (эндоглюканаз, целлобиогидролаз, ксиланаз и р-глюкозидаз) более сбалансированного состава чем, у Trichoderma, и эффективнее расщеплять целлюлозные субстраты, кроме того, индивидуальные ферменты обладают более высокой удельной активностью и операционной стабильностью [3].

Одним из важнейших факторов рентабельности процессов биоконверсии лигноцеллюлозных материалов, наряду со стоимостью самого сырья, является эффективность гидролитического действия целлюлазных комплексов, которая, в свою очередь, определяется как свойствами индивидуальных ферментов, так и их взаимодействием в составе этого комплекса, а также стоимость ферментационного процесса. С целью снижения затрат на получение конечного продукта (целлюлазного ферментного препарата) в лаборатории биосинтеза и получения ферментов ИБФМ РАН вот уже более 15 лет активно ведется работа по созданию новых штаммов -суперпродуцентов внеклеточных карбогидраз в том числе и с помощью методов генетической инженерии [4], а также проводится оптимизация состава ферментационных сред и условий культивирования. На сегодняшний день наиболее известными и широко используемыми являются высокопродуктивный мутант P. verruculosum В221-151 и рекомбинантный штамм, полученный на его основе, P. verruculosum F10 - продуцент гетерологичной Р-глюкозидазы из A. niger. Были предприняты попытки клонирования и экспрессии самых разных генов целевых ферментов, наиболее успешными из которых оказались в отношении гомологичной эндо-(3-1,4-глюканазы II (ЭГН) P. verruculosum -одного из ключевых компонентов мультиферментного комплекса, продуцируемого этим грибом.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

• создать на основе штамма Р. verruculosum В1-221-151 новый рекомбинантный штамм-продуцент с повышенным уровнем экспрессии гомологичной эндоглюканазы II;

• оптимизировать условия культивирования и состав питательной среды для нового рекомбинантного штамма-продуцента ЭГП Р. verruculosum ЭГП-40 и ранее полученного рекомбинантного штамма-продуцента Р-глюкозидазы (БГЛ) Р. verruculosum FIO;

• исследовать индуцирующее действие продуктов реакции поликонденсации глюкозы (целлобиозы, гентиобиозы, софорозы) на биосинтез целлюлаз новым рекомбинантным штаммом Р. verruculosum ЭГП-40;

• исследовать биосинтез целлюлаз штаммом Р.verruculosum ЭГП-40 при культивировании на различных ЦСМ;

• исследовать гидролитическую способность ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов Р. verruculosum - продуцентов ЭГП.

• исследовать способность ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов Р. verruculosum - продуцентов ЭГП, к увеличению питательной ценности кормов;

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Немашкалов, Виталий Алексеевич

выводы

1. Созданы новые рекомбинантные штаммы на основе гриба P. verruculosum, продуцирующие гидролитические комплексы с увеличенной целлюлазной и эндо-Р-1,4-глюканазной активностью.

2. Для рекомбинантных штаммов P. verruculosum - продуцентов эндоглюканазы II (ЭГП-40) и Р-глюкозидазы (F10) оптимизированы состав питательной среды и условия культивирования в 1-литровых ферментерах. Оптимальными параметрами для достижения высокого уровня синтеза ферментов являются Т = 32°С, рН = 4,5 - 5,5.

4. Исследовано индуцирующее действие продуктов реакции поликонденсации (глюкозы, целлобиозы, софорозы, гентиобиозы) на биосинтез целлюлаз новым рекомбинантным штаммом Р. verruculosum ЭГП-40. Установлено, что использование смеси этих продуктов позволяет заменить до 70% микрокристаллической целлюлозы в составе исходной питательной среды без существенных потерь в активностях ферментов.

5. Установлена возможность полной замены МКЦ в составе исходной питательной среды на пергамент.

6. С помощью рекомбинантных штаммов Р. verruculosum получен ферментный препарат карбогидраз Р. verruculosum ЭГП-40, который обеспечивает увеличение выхода продуктов гидролиза на 10-15% по сравнению с контрольным ферментным препаратом, полученным с помощью исходного штамма Р. verruculosum В537.

7. В результате проведения in vitro "кормовых" тестов установлено, что рекомбинантный препарат P. verruculosum ЭГП-40 обладает повышенной эффективностью действия на кормовые субстраты по сравнению с коммерческими аналогами, что позволит значительно сократить дозу препарата, добавляемого на практике в кормовые смеси.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Немашкалов, Виталий Алексеевич, Пущино

1. Godfrey T., West S. Industrial enzymology, 2nd edition. Macmillan Press Ltd., Hampshire, 1996, 609 p.

2. Кастельянос О.Ф. Каталитические биохимические и биотехнологичнские свойства целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum и его компонентов. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1995, 204 с.

3. Wilson D.B. Genetics and properties of cellulas. Adv. Biochem. Eng., 1999, V. 65, P. 221.

4. Тиунова H.А. Применение целлюлаз. Целлюлазы микроорганизмов. Под ред. Клетовича В.Л. М.,1981, С. 40-73.

5. Грачева И.М., Гаврилова Н.Н., Иванова JI.A. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М. 1980, С. 83-90.

6. Евилевич А.З., Ахмина Е.И., Раскин М.Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М. 1982, С. 4-40.

7. Шариков В.И., Куйбина И.И., Соловьева Ю.П. и др. Количественный и химический анализ растительного сырья. М., 1976, С. 203.

8. Raj Kumar, Sompal Singh, От V. Singh. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives. J. Ind Microbiol. Biotechnol., 2008, V. 35. P. 377-391.

9. Roger M. Rowell, Tor P. Schultz, Ramani Namani Narayan. Emerging Technologies for Materials and Chemicals from Biomass. ACS Symposium Series, 1992, V. 476, P. 12-27.

10. Reshamwala S., Shawky B.T., Dale B.E., Ethanol production from enzymatic hydrolysates of AFEX-treated coastal Bermuda grass and switchgrass. Appl. Biochem. Biotechnol., 1995, V. 51-52, P. 43-55.

11. Nisizawa K. Mode of action of cellulases. J. Ferment. Technol., 1973, V. 51, P. 267-304.

12. Рогозин З.А. Химия целлюлозы. М.:Химия, 1972, С. 520.

13. Клесов А.А. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы. Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология. 1988, М., ВИНИТИ, Т. 12, С. 53.

14. Химия древесины (Йенсен В., ред.), М.: Лесная промышленность, 1982, С. 399.

15. Гудвин Т., Мэрсер Э. Введение в биохимию. М., 1986, С. 387.

16. Coughlan М.Р., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases. Portland Press Research Monograph. London and Chapel Hill., 1993, V.IV, P. 120.

17. ScalbertA., Monties В., Lallemand J.Y., Guitted E., Rolando C.: Ether linkage between phenolic acids and lignin fraction from wheat straw. Phitochemistry, 1985, V. 24, P. 1359-1362.

18. Дзедзюля Е.И. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, МГУ, 2000, 117с.

19. McNeil M., Darvil. A.G., Fry S.С., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. Annu. Rev. Biochem., 1984, V. 53, 625 p.

20. Закис Г.Ф., Крейцберг 3.H., Можейко Л.H., Сергеева В.H. Лигнин. В сб.: Клеточная стенка древесины и ее изменения при химическом воздействии. Рига, Зинатне, 1972, С. 136-242.

21. Мецлер Д. Биохимия. М., 1980, Т.З, С.152-153.

22. Boominathan К., Reddy С.A. cAMP-mediated differential regulation of lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase production in the white-rot basidiomycete Phanerochaete crysosporium. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, V. 89, P. 5586-5590.

23. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазое В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М., МГУ, 1995, 224 с.

24. Клесов А.А. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы. Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология. 1983, М., ВИНИТИ Т.12, С. 63-150.

25. Синицын А.П., Клесов А.А. Влияние предобработки на эффективность ферментативного превращения хлопкового линта. Прикл. биохим. микробиол, 1981, Т. 17, С. 682-695.

26. Chang M., Chou T., Tsao G.T. Structure, pretreatment and hydrolysis of cellulose. In: Bioenergy (Fiechter A., éd.). Berlin, Heidelberg, New York, 1981, P. 15-32.

27. Rolz C., Arriola J., Villadares J. Effect of some phisical and chemical pretreatments on the composition, enzymatic hydrolysis and digestibility of lignocellulosic sugar cane residue. Process Biochem., 1987, V. 2, P. 17-23.

28. McMillan J.D. Pretreatment of lignocellulosic biomass. In: Himmel M.E., Baker J.O., Overed R.P. (Eds.), Enzymatic conversion of biomass for fuels production. American Chemical Society, Washington, DC, 1994, P. 292-324.

29. Kim Т.Н., Kim J.S., Sunwoo C., Lee Y.Y. Pretreatment of corn stover by aqueous ammonia. Bioresours. Technol., 2003, V. 90, P. 39-47.

30. Jehanipour A., Taherzadeh M.J. Ethanol production from cotton-based waste textiles. Bioresour. Technol., 2009, V. 100, P. 1007-1010.

31. Schell D.J., Farmer J., Newman M., McMillan J.D. Dilute-sulfuric acid pretreatment of corn stover in pilot-scale reactor. Appl. Biochem. And Biotech., 2003, V. 105, P. 69-85.

32. Bungau H.R. Energy, the biomass options. N.Y. Wiley and sons, 1981, P. 13-15.

33. Selvan P.V., Ghose Т.К., Ghosk P. Catalitic solvent delignification of agricaultural residues: inorganic catalysis. Prosess Biochem., 1983, №3, P. 13-15.

34. NC-IUBMB Enzyme nomenclature 1992. Recommendations of the nomenclature committee of the international Union of Biochemistry and Molecular Biology on nomenclature and classification of enzymes. Academic Press, Orlando, 1992.

35. Henrissat В., Davies G. Structural and sequence-based classification of hydrolases. Curr. Opin. Struct. Biol., 1997, P. 637-644.

36. Henrissat В., Bairoch A. New families and classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J., 1993, V. 293, P. 781-788.

37. Clarke, A.J. Biodégradation of cellulose. Enzymology and biotechnology, Technomic Publishing Company Inc., Lancaster, 1997, P. 272.

38. Karlson G., Siika-aho M., Tenkanen M., Tjerneld F. Enzimatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cell2A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei. J. Biotechnol., 2002, V. 99, P. 63-68

39. Марков А.В. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени кандидата хим. наук, Москва, МГУ, 2003, 201 с.

40. Schiilein M. Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens. J. Biotechnol., 1997, V. 57, P. 71-81.

41. Schou, Rasmussen G., Kaltoft M.B., Henrissat В., Schiilein M. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellelases. Eur. J. Biochem., 1993, V. 217, P. 947-953.

42. Vincken J.-P., Beldman G., Voragen A.G.J. Substrate specificity of endoglucanases: what determines xyloglucanase activity? Carbohydr. Res., 1997, V. 298, P. 299-310.

43. Wong Y., Fincher G.B., McLachlan G.M. Kinetic Properties and substrate specificities of two cellulases from Auxin treated Pea Epicolyls. J. Biol. Chem., 1977, V. 252, P. 14021407.

44. Teeri T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends biotechnol., 1997, V. 15, P. 160-167.

45. Vranska M., Biely P. The cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei QM 9414: action on cellooligosaccharides. Carbohydr. Res., 1992, V. 227, P. 19-27.

46. Imai T., Biosset C., Samejima M., Igarashi K., Sugiyama J. Unidirectional processive action of cellobiohydrolase Cel7A on Valonia cellulose microcristals. FEBS Lett., 1998, V. 432, P. 113-116.

47. Knowles J.K.C., Lehtovaara P., Murray M., Sinnot M. L. Stereochemical course of the action of the cellobioside hydrolases I and II of Trichoderma reesei. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1988, V. 21, P. 1401-1402.

48. Wood T.M., McCrae S.I. The purification and properties of the CI component of Trichoderma koningii cellulose. Biochem. J., 1972, V. 128, P. 1183-1192.

49. Wood T.M., McCrae S.I. Purification and properties of a cellobiohydrolase from Pénicillium pinophilum. Carbohydr. Res., 1986, V. 148, P. 331-344.

50. Wood T.M., McCrae S.I. Cellulase from Fusarium solani. Purification and properties of the CI component. Carbohydr. Res., 1977, V. 57, P. 117-133.

51. Nisizawa K. Mode of action of cellulases. J. Ferment. Technol., 1973, V. 51, P. 267-304.

52. Ladish M.R., Lin K.W., Voloch M., Tsao G.T. Process considerations in the enzymatic hydrolysis of biomass. Enzyme Microb. Technol., 1983, V. 5, P. 82-102.

53. Tuohy M.G., Walsh D.J., Murray P.G., Claeyssens M., Cuffe M.M., Savage A.V., Coughlan M.P. Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii. Biochim. biophys. Acta, 2002, V. 1596, P. 366-380.

54. Umile C., Kubichek C.P. A constitutive, plasma-membrane bound P-glucosidase in Trichoderma reesei. FEMS Microbiol. Lett., 1986, V. 34, P. 291-295.

55. Wilson R.W., Niederpruem D.J. Control of P-glucosidases in Schyzophyllum commune. Can. J. Microbiol., 1967, V. 13, P. 1009-1020.

56. Konstantinidus A.K., Marsden I., Sinnot M.L. Hydrolyses of a- and P-cellobiosil fluorides by cellobiohydrolases of Trichoderma reesei. Biochem. J., 1993, V. 291, P. 883-888.

57. Shewale J.D., Sadana J. Purification, characterization and properties of P-glucosidase enzymes from Sclerotium rolfsii. Arch. Biochem. Biophys., 1981, V. 207, P. 185-196.

58. Chen H., Hayn M., Esterbauer H. Purification and characterization of two extracellular P-glucosidases from Trichoderma reesei. Biochim Biophys. Acta, 1992, V. 1121, P. 54-60.

59. Gong C.-S., Ladisch M.R., Tsao G.T. Cellobiase from Trichoderma viride: purification, properties, kinetics and mechanism. Biotechnol. Bioeng., 1977, V. 19, P. 959-981.

60. McHale A., Coughlan M.P. The cellulolytic system of Talaromyces emersonii. Purufication and characterization of the extracellular and intracellular p-glucosidases. Biochim. Biophys. Acta, 1981, V. 662, P. 152-159.

61. Hash J.H., King K.W. Some properties at an aril-P-glucosidase from culture filtrates of Myrothecium verrucaria. J. Biol. Chem., 1958, V. 232, P. 395-402.

62. Umezurike G.M. Kinetic analysis of the mechanism of action of P-glucosidase from Bortyodiplodia theobromae pat. Biochim. Biophys. Acta, 1975, V. 397, P. 164-178.

63. Румянцева Г.М., Родионова H.A., Мартинович Л.И. Очистка и характеристика двух типов Р-глюкозидаз: целлобиазы и арил-р-Б-глюкозидазы. В сб.: Целлюлазы микроорганизмов (рад. B.JI. Кретович), М., Наука, 1981, С. 83-93.

64. Woodward J. Fugal and other p-D-glucosidases their properties and applications. Enzyme Microb. Technol., 1982, V. 4, P. 73-79.

65. Woodward J., Arnold S.L. The inhibition of P-glucosidase activity in T. reesei C30 cellulase by derivatives and isomers of glucose. Biotechnol. Bioeng., 1981, V. 23, P. 1553-1562.

66. Ghose Т.К., Sachden R.K. Kinetics of immobilized P-glucosidase for hydrolysis of cellobiose to glucose. J. Molec. Catal., 1979, V. 6, P. 99-109.

67. Гусаков A.B. Кинетическое описание ферментативного гидролиза целлюлозы (сырье, ферменты, процесс, реакторы). Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, Москва, МГУ, 1984, 192 с.

68. Клесов А. А. Современное состояние проблемы ферментативной переработки целлюлозы в сахара и спирт за рубежом. Прикл. биохим. микробиол., 1985, Т. 21, №2, С. 269-283.

69. Coughlan M.P. Enzymatic hydrolysis of cellulose: an overview. Biores. Technol., 1992, V. 39, P.107-115.

70. Galbe M., Zacchi G. A review of the production of the ethanol from softwood. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, V. 59, P. 618-628.

71. Duff S.J.В., Murray W.D. Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Biores. Technol., 1996, V. 55, P. 1-33.

72. Околелова T.M., Румянцев С.Д., Кулаков A.B., Морозов A.M., Иевлев С.А. Корма и биологически активные добавки для птицы, М., Колос, 1999, С. 96.

73. Chang М., Chou Т., Tsao G.T. Structure, pretreatment and hydrolysis of cellulose. In: Bioenergy (Fiechter, A., ed.), Berlin, Heidelberg, New York, 1981, P. 15-32.

74. Огарков В.И., Киселев О.И., Быков В.А., Биотехнологические направления использования растительного сырья. Биотехнология, 1985, №3, С. 1-15.

75. Reese Е.Т., Siu R.G.H., Levinson H.S. The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. J. Bacterid., 1950, V. 59, P. 485-497.

76. Wood T.M., McCrae S.I. Purification and some properties of a 1,4-(3-D-glucan glucohydrolase associated with the cellulose from the fungus Penicillium fyniculosum. Carbohydr. Res., 1982, V. 110, P. 291-303.

77. Wood T.M., McCrae S.I. Synergism between enzymes involved in the solubilisation of native cellulose. Adv. Chem. Ser., 1979, V. 181, P. 181-209.

78. Ryu D.D.Y., Kim C., Mandels M. Competition and sorbtion of cellulase componennts and its significance in a synergetic mechanism. Biotechnol. Bioeng., 1984, V. 26, P. 488496.

79. Henrissat В., Drigues H., Viet С., Schulein M. Synergism of cellulase from Trichoderma reesei in degradation of cellulose. Bio. Technology, 1985, V. 3, P. 722-726.

80. Fujii M., Shimizu M. Synergism of endoenzyme end exoenzyme on hydrolysis of soluble cellulose derivatives. Biotechnol. Bioeng., 1986, V. 28, P. 878-882.

81. Синицын А.П., Митькевич O.B., Калюжный C.B., Клесов А.А. Изучение синергизма в действии ферментов целлюлазного комплекса. Биотехнология, 1987, Т. 3, С. 39-46.

82. Клесов А.А., Черноглазов В.М., Рабинович M.JI., Синицын А.П. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации кристаллической и аморфной целлюлозы. Биоорг. химия, 1982, Т. 8, С. 643-651.

83. Синицын А.П., Наджеми Б., Митькевич О.В., Клесов А.А. Взаимное усиление гидролитического действия прочно и слабо адсорбирующихся целлюлазных препаратов. Прикл. биохим. и микробиол., 1986, Т. 22, С. 333-336.

84. Klyosov А.А. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation. Biochem., 1990, V. 129, P. 10577-10585.

85. Гусаков A.B. Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз: фундаментальные и прикладные аспекты. Диссертация на соискание ученой степени д-ра. хим. наук. М., МГУ, 2005, 385 с.

86. Синицын А.П., Митькевич О.В. Различия в кинетических свойствах прочно и слабо адсорбирующихся на целлюлозе целлюлолитических ферментов. Биотехнология 1987, Т. 3, С. 227-233.

87. Рабинович M.JL, Мельник М.С., Болобова А.В. Целлюлазы микроорганизмов. Прикл. биохим. микробиол., 2002, Т. 38, №4, С. 355-373.

88. Клесов А.А., Рабинович M.JL, Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. II. Свойства компонентов целлюлазных комплексов из различных источниковю Биоорг. Химия, 1980, Т. 6, №6, С. 12251241.

89. Клесов А.А., Рабинович M.JL, Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. I. Свойства компонентов целлюлазных комплексов из различных источниковю Биоорг. Химия, 1980, Т. 6, №3, С. 12251241.

90. Gusakov A.V., Sinitsyn А.Р., Mamenkova J.A., Protas O.V. Enzymatic sacharification of industrial and agricultural lignocellulosic wastes. Appl. Biochem.biotechnol., 1992, V. 34, №5, P. 625-637.

91. Клесов А.А., Рабинович M.JI. Ферментативный гидролиз целлюлозы. В кн.: Инженерная энзимология и биоорганический катализ. Итоги науки и техники, сер. Биол. Химия. М., ВИНИТИ, 1978, Т. 12, С. 49-91.

92. Lytzen N.W., Nielsen М.Н., Oxonboel К.М. Cellulase and their application in the conversion of lignocellulose to fermentable sugars. Phil. Trans. R. Soc. Lond., 1983, P. 283-291.

93. Stakheev I.V., Sheherva V.V., Babitskaya V.G., Vadetskii B. Yu. The grow of Penicillium verruculosum BIM G-122 on heterogeneous midia depending on the method of the substrate pretreatment. 1986, V. 22., №3, P. 363-167.

94. Saddler J.N. Screening of highly cellulolitic fungi and the action of their cellulose enzyme system. Enzyme Microb. Technol., 1982, V. 4, P. 414-418.

95. Клесов А.А., Синицын А.П. Ферментативный гидролиз целлюлозы. IV. Влияние физико-химических и структурных факторов на эффективность ферментативного гидролиза. Биоорг. Химия. 1981, Т. 7, №12, С. 1801-1812.

96. Nystrom J.M., Andren R.K., Allen A.L. Enzymatic hydrolysis of cellulosic waste: the status of process technology and economic eccessment. AIChE Symp. Ser., 1978, V. 74, P. 82-88.

97. Гусаков A.B., Синицын А.П., Клесов.А.А. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Инактивация и стабилизация ферментов целлюлазного комплекса. Биохимия, 1982, Т. 47, С. 1322-1331.

98. Синицын А.П., Митькевич О.В., Клесов А.А. Инактивация препаратов ферментов целлюлазного комплекса при перемешивании и стабилизация целлюлозой. Прикл. биохим. микробиол., 1986, Т. 2, С. 759-765.

99. Клесов А.А., Черноглазое В.М., Ермолова О.В., Елкин В.В. Влияние лигнина ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов. Биотехнология, 1985, Т. 3, С. 106-112.

100. Neilson M.J., Kelsey R.G., Shafizadeh F. Enchancement of enzymatic hydrolysis by simultaneous attrition of cellulose substrates. Biotechnol. Bioeng., 1982, V. 24, P. 293-304.

101. Palonen H., Tjerneld F., Zacchi G., Tenkanen M. Adsorption of Trichoderma reesei CBH I and EG II and their catalytic domains on steam pretreated softwood and isolated lignin. J. Biotechnol., 2004, V. 107, P. 65-72.

102. Берлин A.X. Исследование тополитических эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Penicillium verruculosum и Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1999.

103. Грачева И. М., Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов. М., изд-во Элевар, 2000, С. 13-288.

104. Зоров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М„ МГУ, 1998, 156 с.

105. Скомаровский А.А. Компонентный состав и гидролитическая способность ферментного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2006, 170 с.

106. Кислухина О., Кюдулас И. Биотехнологические основы переработки растительного сырья. Каунас, изд-во Технология, 1997, С. 73-169.

107. Panagiotou G., Kekos D., Macris В.J., Christakopoulos P. Production of cellulytic and xylanolytic enzymes by Fusarium oxysporum grown on corn stover in solid state fermentation. Ind. Crops Products, 2003, V. 18, P. 37^15.

108. M. Latifian, Z. Hamidi-Esfahani, M. Barzegar. Evaluation of culture conditions for cellulase production by two Trichoderma reesei mutants under solid-state fermentation conditions. Bioresource Technol., 2007, V. 98. P. 3634-3637.

109. Yang Y.H., Wang B.C., Wang Q.H., Xiang L.J., Duan C.R. Research on solid state fermentation on rice chaff with a microbial consortium. Colloid Surf., 2004, V. 34, P. 1-6.

110. Chanal D. S. Solid-state fermentation with Trichoderma reesei for cellulase production. Appl. Environ. Microbiol., 1985, V. 49, P. 205-212.

111. Alazard, D., Raimbault M. Comparative study of amylolytic enzyme production by Aspergillus niger in liquid and solid-state cultivation. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1981, V. 12, P. 113-117.

112. Deschamps, F., Huet M. С. (3-Glucosidase production by Aspergillus phoenicis in solid state fermentation. Biotechnol. Lett., 1984, V. 6, P. 55-62.

113. Silman R. W. Enzyme formation during solid-substrate fermentation in rotating vessels. Biotecnol. Bioeng., 1980, V. 22, P. 411-418.

114. Pastore G. M., and Park Y. K. Purification and characterization of P-galactoidase from Scopulariopsis sp. J. Ferment. Technol., 1980, V. 58, P.79-85.

115. Cayle T. Treating Lactase Deficiency with an active Lactase. U.S. Patent 3718739, 1973.

116. Jecu L. Solid state fermentation of agricultural wastes for endoglucanase production. Ind. Crops Products, 2000, V. 11, P. 1-5.

117. Pirt S. J. The theory of feed batch culture with reference to the penicillin fermentation. J. Appl. Chem. Biotechnol., 1974, V. 24, P. 415-422.

118. Dunn I., J., Мог J.-R. Variable volume continuous cultivation. Biotechnol. Bioeng., 1975, V. 17, P. 1805-1817.

119. Isil S., Nilufer A. Investigation of factors affecting xylanase activity from Trichoderma harzianum 1073 D3. Braz. arch. biol. technol., 2005, V. 48, P. 187193.

120. McLean D., Podruzny M. F. Further support for feed-batch production of cellulases. Biotechnol. Lett., 1985, V. 7, P. 683-687.

121. Gottvaldova M., Kucera J., Podrazky V. Enhancement of cellulase production by Trichoderma viride using carbon/nitrogen double feed-batch. Biotechnol. Lett., 1982, V. 4, P. 229-240.

122. Karthikeyan N., Sakthivel M., Palani P. Screening, Identifying of Pénicillium K-P Strain and Its Cellulase Producing Conditions. J. of Ecobiotechnol., 2010, V. 2, P. 4-7.

123. Hendy N. A., Wilke C. R., Blanch H. W. Enhanced cellulase production in feed-batch culture of Trichoderma reesei RUT-C30. Enzyme Microbiol. Technol., 1984, V. 6, P. 73-77.

124. Tangnu S. К., Blanch H. W., Wilke С. R. Enhanced production of cellulase, hemicellulase and p-glucosidase by Trichoderma reesei RUT-C30. Biotechnol. Bioeng., 1981, V. 23, P. 1837-1845.

125. Ryu D., Mandels M. Cellulases: byosynthesis and applications. Enzyme Microb. Technol., 1980, V. 2, P. 91-115.

126. Robinson P. D. Cellulase and xylanase production by Trichoderma reesei RUT-C30. Biotechnol. Lett., 1984, V. 6, P. 119-128.

127. Béguin P. Molecular biology of cellulose degradation. Annu. Rev. Microbiol., 1990, V. 44, P. 219-248.

128. Beguin P., Gilkes N.R., Kilburn D.G., Miller R.C. Jr., O'Neill G.P., Warren R.A.J. Cloning of cellulase genes. CRC Critical Reviews in Biotechnology, 1987, V. 6, Issue 2, P. 129-163.

129. Вавилова E.A., Винецкий Ю.Л. Индукция синтеза эндо-1,4-/?-ксиланазы и /?-галактозидазы в исходных рекомбинантных штаммах гриба P. canescens. Прикл. биохим. и микробиол., 2003, Т. 39, С. 167-172.

130. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V., Clutterbuck A.J. Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene. Curr. Genet., 1995, V. 28, P. 474-477.

131. Brygoo Y. and Debuchy R. Transformation by integration in Podospora anserina.l. Methodology and phenomenology. Mol. and Gen. Genet., 1985, V. 200, P. 128-131.

132. Ballance D.J. and Turner G. Gene cloning in Aspergillus nidulans: isolation of iscitrate lyase gene (acuD). Molec. and General Genetics, 1986, V. 202, P. 271-275.

133. Tilburn J., Scchazzocchio C., Taylor G.G., Zabicky-Zissman J.H., Lockington R.A. and Davies R.W. Transformation by integration in Aspergillus nidulans. Gene, 1983, V. 26, P. 205-221.

134. John M.A. and Peberdy J.F. Transformation of Aspergillus nidulans using the argB gene. Enzyme Microbial Technol., 1984, V. 6, P. 386-389.

135. Buxton F.P., Gwynne D.I. and Davies R.W. Transformation of Aspergillus niger using the argB gene of Aspergillus nidulans. Gene, 1985, V. 37, P. 207-214.

136. Iimura Y., Gomi K., Uzu H. and Hara S. Transformation of Aspergillus oryzae through plasmid-mediated complementation of the methionine-auxotrophic mutation. Agric. and Biol. Chem., 1987, V. 51, P. 323-328.

137. Malardier L., Daboussi M.J., Julien J., Roussel F., Scchazzocchio C. and Brygoo Y. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidulans and ist use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene, 1989, V. 78, P. 147-156.

138. Unkles S.E., Campbell E.I., Carrez D., Grieve C., Contreras R., Fiers W., Van den Hondel C.A. M.J.J, and Kinghorn J.R. Transformation of Aspergillus niger with the homologous nitrate reductase gene. Gene, 1989, V. 78, P. 157-166.

139. De Graaf L., Van den Broek H. and Visser J. Isolation and transformation of pyruvate kinase gene of Aspergillus nidulans. Curr. Genet., 1988, V. 13, P. 315-321.

140. Durrens P., Green P.M., Arst H.N. and Scchazzocchio C. Heterologous insertion of transforming DNA and generation of new deletions associated with transformation in Aspergillus nidulans. Mol. and Gen. Genet., 1986, V. 203, P. 544-549.

141. Banks G.R. and Taylor S.Y. Cloning of the PYR3 gene of Ustilago maydis and its use in DNA transformation. Mol. and Cell. Biol., 1988, V. 8, C. 5417-5424.

142. Ballance D.J., Buxton F.P., and Turner G. Transformation of Aspergillus nidulans by the oritidine-5'-phosphate decarboxylase gene of Neurosporra crassa. Biochem. and Biophys. Res. Commun., 1983, V. 112, P. 284-289.

143. Oakley B.R., Rinehart J.E., Mitchell B.L., Oakley C.E., Carmona C., Gray G.L. and May G.S. Cloning, mapping and molecular analysis of the pyrG orotidine-5'-phosphate decarboxylase gene of Aspergillus nidulans. Gene, 1987, V. 61, P. 385-399.

144. Van Hartingsveldt W., Mattern I.E., Van Zeijl C.M.J., Pouwels P.H. and Ven den Hondel C.A.M.J.J. Development of a homologous transformation system for the Aspergillus niger based on the pyrG gene. Mol. and Gen. Genet., 1987, V. 206, P. 71-75.

145. Goosen T., Bloemheuvel G., Gysier C., De Bie D.A., Van den Broek H.W.J, and Swart K. Transfornation of Aspergillus niger using the homologous oritidine-5'-phosphate decarboxylase gene. Curr. Genet., 1987, V. 11, P. 499-503.

146. Van Hartingsveldt W., Van den Hondel C.A.M.J.J., Veenstra A.E. and Van den Berg J.A. Gene replacement as a tool for the construction of Aspergillus strains. European Patent Application 89202106.4.

147. Da Silva A.J.F., Whittington H., Clements J., Roberts C. and Hawkins A.R. Sequence analysis and transformation by the catabolic 3-dehydroquinase (QUTE) gene from Aspergillus nidulans. J. Biochem., 1986, V. 240, P. 481-488.

148. Turgeon B.G., MacRae W.D., Garber R.C., Fink G.R. and Yoder O.C. A cloned tryptophan-synthesis gene from Ascomycete Cochliobolus heterostrophus functions in Escherichia coli, yeast and. Aspergillus nidulans. Gene, 1986, V. 42, P. 79-88.

149. Yelton M.M., Hamer J.E. and Timberlake W.E. Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid. Processing f the National Academy of Sciences, USA, 1984, V. 81, P. 1470-1474.

150. Sanchez E., Lozano M., Rubio V. and Penalva M.A. Transformation in Penicillium chrysogenum. Gene, 1987, V. 51, P. 97-102.

151. Picknett T.M., Sauners G., Ford P. and Hold G. Development of a gene transfer system for Penicillium chrysogenum. Curr. Genet., 1987, V. 12, P. 449-455.

152. Kelly J.M. and Hynes M.J. Transformation of Aspergillus niger by the amdS gene of Aspergillus nidulans. J. EMBO, 1985, V. 4, P. 475-479.

153. May G.S., Gambino J., Weatherbee J.A. and Morris N.R. Identification and functional analysis of /^-tubulin genes by site-specific integrative transformation in Aspergillus nidulans. J. of Cell Biol., 1985, V. 100, P. 712-718.

154. Kolar M., Punt P.J., Van den Hondel C.A.M.J.J. and Schwab H. Transformation of Penicillium chrysogenum using dominant selection markers and expression of an Escherihia coli lacZ fusion gene. Gene, 1988, V. 62, P. 127-134.

155. Mattern I.E., Punt P.J. and Van den Hondel C.A.M.J.J. A vector of Aspergillus transformation conferring phleomycin resistance. Fung. Genet. Newslett., 1988, V. 25, P. 35.

156. Banks G.R. Transformation of Ustilago maydis by a plasmid containing yeast 2 micron DNA. Curr. Genet., 1983, V. 7, P. 73-77.

157. Ward M., Wilson M.J., Carmona C.L. and Turner G. The oliC3 gene of Aspergillus niger: isolation, sequence and use as a selectable marker for transformation. Curr. Genet., 1988, V. 14, P. 37-42.

158. Bull J.H., Smith D.J. and Turner G. Transformation of Penicillium chrysogenum with a dominant selectable marker. Curr. Genet., 1988, V. 13, P. 377-382.

159. Carramolino L., Lozano M., Pérez-Arando A., Rubio V. and Sánchez E. Transformation of Penicillium chrysogenum to sulfonamide resistance. Gene, 1989, V. 77, P. 31-38.

160. Orbach M.J., Porro E.B. and Yanofsky C. Cloning and characterization of the gene for ^-tubulin from a benomyl-resistant mutant of Neurosporra crassa and its use as a dominant selectable marker. Mol. And Cell Biology, 1986, V. 6, P. 2452-2461.

161. Cooley R.N. and Caten C.E. Cloning and characterization of the /^-tubulin gene and determination of benomyl resistance in Septoria nodorum. In Proceedings, EMBO Alko Workshop on Molecular Biology of Filamentous Fungi, 1989, V. 6, P. 207-216.

162. Varadarajalu L.P., Punekar N.S. Cloning and use of sC as homologous marker for Aspergillus niger transformation. J. Microbiol. Methods, 2005, V. 61, P. 219-224.

163. Ito H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriol., 1983, V. 153, P. 163-168.

164. Bedford M.R. Exogenous enzymes in monogastric nutrition their current value and future benefits. Animal Feed Science and Technology, 2000, V. 86, P. 1-13.

165. Annison G., Choct M. Anti-nutritive activities of cereal non-starch polysacharides in broiler diets and strategies minimizing their effect. World's Poultry Science Journal, 1991, V. 47, P. 164-172.

166. Buchert J., Tenkanen M., Kantelinen A., Viikari L. Application of xylanases in the pulp and paper industry. Bioresourse Technol., 1994, V. 50, P. 65-72.

167. Viikarri L., Ranua M., Kantelinen A., Linko M., Sundquist J. Bleaching with enzymes. In: "Biotechnology in the pulp and paper industry". Proc. 3rd Int. Conf., P. 6769.

168. Paice M., Gurnagul N., Page D.H., Jurasek L. Mechanism of hemicellulose-direct prebleaching of kraft pulps. Enzyme Microbiol. Technol., 1992, V. 14, P. 272-276.

169. Patel R.N., Grabski A.C., Jeffries T.W. Chromophore release from craft pulp by purified Streptomices roseiscleroticus xylanases. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, V. 39, P. 405-412.

170. Elegir G., Sykes M., Jeffries T.W. Differential and synergistic action of Streptomices endoxylanases in prebleaching of kraft pulps. Enzyme Microbiol. Technol., 1995, V. 17, P. 954-959.

171. Jeffries T.W. Conserved motifs in xylanases for pulp bleaching. IBCs Third Annual Symposium on Commercial enzymes, March 23-24, Wyndham Emerald Plasa, San Diego, CA, 1998, P. 212-218.

172. Buchert J., Ranua M., Kantelinen A., Viikari L. The role of two Trichoderma reesei xylanases in the bleaching of pine kraft pulp. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, V. 37, P. 825-829.

173. Hartzell M.M., Hsieh Y.-L. Enzymatic scouring to improve cotton fabric wettability. Textile Res. J., 1998, V. 68, №4, P. 233-241.

174. Гришутин С.Г., Гусаков A.B., Синицын А.П., Кричевский Г.Е., Тиматков А.Г., Барышева Н.В. Биоотварка хлопчатобумажных изделий. Текстильная химия. Специальный выпуск РСХТК, 2000, №2 (18), С. 65-70.

175. Bhat М.К. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotechnology Advances, 2000, V. 18, P. 355-383.

176. Cavaco-Paulo A., Almeida L. Hydrolysis of Cotton Cellulose by Engineered Cellulases from Trichoderma reesei. Textile Research Journal, 1998, V. 68, № 4, P. 273280.

177. Гусаков A.B., Попова H.H., Берлин A.X., Синицын А.П. Сравнение осахаривающей и тополитической активности различных препаратов целлюлаз. Прикладная биохимия и микробиология, 1999, Т. 35, № 2, С. 137-140.

178. Miettinen-Oinonen A., Heikinheimo L., Buchert J., Morgado J., Almeida L., Ojapalo P., Cavaco-Paulo A. Role of Trichoderma reesei cellulases in finishing of cotton. In:" Book of papers, AATCC conf.", October 12-15, 1999, P. 70-76.

179. Heikinheimo L., Cavaco-Paulo A., Nousiainen P., Siika-aho M., Buchert J. Treatment of cotton fabrics with purified Trichoderma reesei cellulases. JSDC, 1998, V. 114, P. 18-22.

180. Dunnett A.J., Adjiman C.S. and Shah N. A spatially explicit whole-system model of the lignocellulosic bioethanol supply chain: an assessment of decentralised processing potential. Biotechnol. Biofuels, 2008, V. 1, P. 13.

181. Stakheev I.V., Shehera V.V., Babitskaya V.G., Vadetskii B.Yu. The grow of Penicillium verruculosum BIM G-122 on heterogeneous media depending on the method of the substrate pretreatment. 1986, V. 22, №3, P. 363-367.

182. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1944, V. 153, P. 375-379.

183. Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1952, V. 195, P. 19-23.

184. Березин И.В., Рабинович M.JI., Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы. Биохимия, 1977, V. 42, С. 1631-1636.

185. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., Мир, 1991, 543 с.

186. Sternberg G., Mandels G.R. Induction of cellulolytic enzymes in Trichoderma reesei by sophorose. J. of Bacteriol., 1979, V. 139, P. 761-769.

187. Takashi K., Makoto Y., Manabu S., Yoishi K. Induction of Cellulase by Gentiobiose and Its Sulfur-Containing Analog in Penicillium purpurogenum. App. Envir. Microbiol., 1992, V. 58, P. 106-110.

188. Волков П.В. Молекулярно-генетические подходы к получению ферментных препаратов карбогидраз с улучшенными гидролитическими свойствами. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., 2012, 119 с.

189. Правильников А.Г. Состав и осахариваюгцая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., 2012, 91 с.

190. Зам директора ИБФМ им Г К Скрябина РАН.докт бирТГнаук-V1. X 25«/ мая 2012 г1 « —А-А Леонтьевский1. ПРОТОКОЛ

191. О проведении процесса биосинтеза и приготовлении опытной партии целлюлазного ферментного препарата на базе Опытной технологическойустановки ИБФМ РАН

192. Зав таб . к б н ОН Окунев \iM-y

193. Зав таб кбн В А Самойленко |\V /

194. Вед технолог Л П Рухлова v1. Зав таб В В Фетисов1. Д>

Информация о работе

Немашкалов, Виталий Алексеевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Биосинтез карбогидраз гриба Penicillium Verruculosum при культивировании на различных целлюлозосодержащих субстратах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Биосинтез карбогидраз гриба Penicillium Verruculosum при культивировании на различных целлюлозосодержащих субстратах - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы