Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические подходы к получению ферментных препаратов карбогидраз с улучшенными гидролитическими свойствами

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические подходы к получению ферментных препаратов карбогидраз с улучшенными гидролитическими свойствами"

На правах рукописи

ВОЛКОВ ПАВЕЛ ВАЛЕРЬЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ КАРБОГИДРАЗ С УЛУЧШЕННЫМИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ

Специальность 03.01.04 - «биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 5 Ш

МОСКВА-2012

005014271

005014271

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Синицын Аркадий Пантелеймонович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Королева Ольга Владимировна

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, г. Пухцино

Защита состоится «27» марта 2012 года в И 00 час на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » О^МяиЛ. 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Орловский А.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В мировой практике для создания биотехнологически важных ферментных препаратов используют различные молекулярно-генетические подходы, которые состоят в комбинации методов генетической инженерии и микробиологии для получения рекомбинантных ферментных препаратов с заданными свойствами, которые, в свою очередь, определяются типом гидролизуемого субстрата.

Наиболее востребованными ферментными препаратами, осуществляющими гидролиз таких сложных полимеров, как инулин и целлюлоза, являются инулиназы эндо-и экзо-деполимеразного действия, а также комплекс гидролитических ферментов, включающий в себя эндо-1,4-/?-глюканазу, экзе-целлобиогидролазу и /?-глюкозидазу соответственно.

Известно, что инулин является важным полисахаридом клетки растений семейства сложноцветных, в частности, топинамбура, представляющим собой линейные цепи /9-2,1-связанных молекул D-фруктофуранозы, которые заканчиваются остатком глюкозы на невосстанавливающем конце молекулы биополимера. Клубни топинамбура, урожайность которых в среднем составляет 30-40 т/га, обогащены инулином, содержание которого в клубнях достигает 80-90% от массы сухого вещества. Поэтому, применение ферментных препаратов инулиназ может не только увеличить эффективность гидролиза инулосодержащего сырья до простых Сахаров - фруктозы и глюкозы, но и позволит получать фруктоолигосахариды, являющиеся необходимыми компонентами функционального питания.

С другой стороны, основными полисахаридами клеточной стенки высших растений являются целлюлоза и гемицеллюлозы, составляющие, соответственно 40-50% и 30-40% от массы растительного сырья. Оптимизированный состав смесей основных компонентов целлюлазного гидролитического комплекса позволит сделать вывод о наиболее эффективном соотношении основных ключевых ферментов при гидролизе природных целлюлозосодержащих материалов.

В лаборатории биотехнологии ферментов ИНБИ РАН ведутся работы со штаммом низшего гриба Pénicillium canescens, зарекомендовавшим себя как простая и удобная лабораторная модель для получения рекомбинантных штаммов с заданными свойствами. Таким образом, актуальной задачей представлялось получение рекомбинантных ферментных препаратов, а также оптимизация их смесей для максимально эффективного гидролиза природного сырья до простых Сахаров, используя грибной реципиентный штамм Pénicillium canescens.

Цель н задачи исследования. Цель работы заключается в применении молекулярно-генетических подходов к созданию рекомбинантных ферментных препаратов, обладающих высоким гидролитическим потенциалом по отношению к

целлюлозо- и инулосодержащим субстратам, а также поиск оптимальных соотношений ферментных препаратов для высокоэффективного гидролиза природного сырья.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

1. Получить плазмидные конструкции, несущие гены инулиназ (экзоинулиназы (inul)) Aspergillus awamori, эндоинулиназы (iniiA) A.niger, а также /?-фруктофуранозидазы (fopA) A.oryzae на основе векторов, содержащих промоторы гена xylA (кодирующего ксиланазу А Penicillium canescens), гена bgal (кодирующего ß-галактозидазу P.canescens) и гена abß (кодирующего арабинофранозидазу А Р. canescens);

2. Получить плазмидные конструкции, несущие гены целлюлаз (целлобиогидролазы I и II (cbhl и cbh2)), эндоглюканазы II (egl2) P.verruculosum, а также /f-глюкозидазы (bgll) A.niger) на основе экспрессионного вектора, содержащего промотор гена ксиланазы А (xylA) Р. canescens-,

3. Провести трансформацию полученными плазмидами штамма-реципиепта P.canescens RN3-11-7 AniaD и осуществить скрининг трансформантов. Получить новые ферментные препараты инулиназ и целлюлаз и исследовать их свойства;

4. Выделить в гомогенном виде и изучить свойства экзоинулиназы и эндоинулиназы, сравнить со свойствами соответствующих ферментов из природных штаммов;

5. Исследовать гидролитические свойства ферментных препаратов по отношению к целлюлозосодержащему и инулосодержащему сырью, а также определить оптимальное соотношение в них ключевых ферментов;

6. Определить компонентный состав ферментных комплексов, обладающих наиболее высокой эффективностью гидролиза растительного сырья.

Научная новизна и практическая значимость работы. Новизна работы состоит в получении новых эффективных ферментных препаратов с улучшенными гидролитическими свойствами на основе лабораторного грибного штамма P.canescens с использованием современных ДНК-технологий. Показано, что ферментные комплексы инулиназ и целлюлаз, полученные путем смешения новых ферментных препаратов, обладают увеличенной гидролитической активностью. Применение полученных в результате выполнения работы индивидуальных ферментных препаратов, а также их смесей, при гидролизе различных видов инулосодержащего (инулин топинамбура и измельчённые клубни топинамбура), а также целлюлозосодержащего (микрокристаллическая целлюлоза и измельчённая осиновая древесина) сырья позволяет достичь высокой степени его конверсии, что может быть использовано в ряде технологических процессов пищевой и биотехнологической промышленности.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: московской международной научно-практической

конференции "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов" (Москва, 2010), втором международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «ЕиЯА81АВЮ» (Москва, 2010), четвёртой международной школе молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Москва, 2010), шестом московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), а также московской школе конференции «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовало 9 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ((¡9 ссылок). Диссертация содержит страниц печатного текста, включает рисунка и ^ таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ ИНУЛИНАЗ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ Р.сапеясет ЮО-П-г

1. Получение эксирсссионных конструкций и трансформация штамма Р.сапе$сеп$ 1ШЗ-11-7. Используя в качестве матрицы геномные ДНК А.статоп, А^ег и А.огугае методом Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР) были амплифицированы полинуклеотидные последовательности, соответствующие целевым генам. Фрагменты ДНК, соответствующие генам экзоинулиназы (шиГ) и эндоинулиназы (тиА) были клонированы в вектор, содержащий полинуклеотидные последовательности, соответствующие промоторной области гена ксиланазы А Р.са^сепя а терминаторной области гена eglШ Р.меггисиЫит. Аналогично, ПЦР-амплификаты, соответствующие генам эндоинулиназы (тиА) и /?-фруктофуранозидазы (/орА) были клонированы в вектора, содержащие гомологичные промоторные области генов ¿>£о/ и аЬ/А. Таким образом, были получены следующие плазмиды - рАВБ-РОРА, рРгХу1А-1ГША, рРгХу1А-1Ш1 и рВСАЭ-1ША (рис.1).

С полученными плазмидами была проведена серия трансформаций ауксотрофного штамма-реципиента Р.сапезсет 1Ш-3-11-7 ДшаО, совместно с плазмидой рБТАЮ, несущей ген нитратредуктазы, обеспечивающей комплементацию дефектного гена нитратредуктазы в штамме-реципиенте и возможности селекции трансформантов на средах с нитратом натрия.

Рисунок 1. Схематическое изображение экспреесионных плазмид с генами: А — /орА, кодирующего /3-фруктофуранозидазу, Б - тиА, кодирующего эндоинулиназу под контролем ху1А промотора, В - ти1, кодирующего экзоинулиназу под контролем ху!А промотора и Г- тиА, кодирующего эндоинулиназу под контролем bgaS промотора.

Трансформанты бьши последовательно пересеяны на селективную среду с нитратом натрия (4 и более раз), и показано, что биосинтез целевых ферментов стабилен.

2. Первичный скрининг трансформантов на примере трансформантов с гетерологичной экзоинулиназой А.ан>атоп. Трансформанты культивировались в колбах на стандартной ферментационной среде штамма Р.сапевсет ИМ 3-11-7. В культуральной жидкости (КЖ) определялась целевая (инулиназная) и базовая (ксиланазная) активности: инулиназную активность определяли по гидролизу инулина топинамбура, ксиланазную -по гидролизу берёзового ксилана (табл.1).

На рис.2 приведена электрофореграмма образцов КЖ, полученных при культивировании трансформантов в 100 мл ферментационной среды. В качестве контроля использовали КЖ, полученную при культивировании исходного штамма Р.сапеьсет 1ШЗ-11-7 ДшаО.

1

6

№ трансформанта Активность но инулину топинамбура, ед/мл Активность по ксилану, ед/мл

А5 2232Ü58 i50±li

Аб 2119±140 170±12

А7 1284±113 175±15

А8 1751Ü03 !70±12

А10 1638±160 125±11

А12 2910±179 30(Н9,8

В4 1723±118 130±11

В5 2656±263 1!0±10

BIO 3467±242 97±8

В12 1497±122 112±11

С5 2367±197 100±9

СЮ 959±80 200±!8

D3 1273±117 175±16

RN3-11-7 (контроль) 2±0,2 220±20

Таблица 1. Активности ферментов КЖ трансформантов с гетеро-

логичной экзоинулиназой.

По сравнению с контролем на электрофореграмме трансформантов обнаруживаются полосы в районе 70 кДа, соответствующие молекулярной массе экзо-инулиназы. Исходя из полученных данных, были отобраны два клона обладающие максимальной активностью по отношению к инулину топинамбура (А12 и BIO) для получения ферментных препаратов (ФП).

Рисунок 2. Электрофорсграмма образцов КЖ трансформантов, содержащих гетерологичную экзоинулиназу (нумерация трансформантов, соответствует нумерации в табл.1).

Все полученные ФП были проанализированы по схеме, представленной на рис.3. Анализ ФП состоял из следующих стадий: измерение целевой активности, проведение ДДС-электрофореза с последующим анализом трипсинового гидролизата полосы целевого белка с помощью МА1Л}1-ТОР масс-спектрометрического анапиза; хромато1"рафический анализ качественного и количественного состава ферментных препаратов, а также, выделение целевых рекомбинантных ферментов в гомогенном Еиде; сравнение свойств нативных и рекомбинантных целевых ферментов; изучение гидролитической способности полученных ФП при гидролизе растительного сырья.

Ферментный І препарат (ФП) !

Измерение целевой

активности и ДДС-электрофорез

Анализ компонентного

состава с помощью _РРї-С

Масс-спектрометрический анализ целевого белка

Изучение осахаривающей способности ФП

Изучение свойств гомогенных рекомбинантных белков

Рисунок 3. Схема анализа рекомбинантных ферментных препаратов.

Были использованы также молекулярно-генетические подходы к получению мультиферментных комплексов инулолитических ферментов, состоящий в одновременной экспрессии трех различных ферментов, таких как эндо- и экзоинулиназы и /?-фруктофуранозидазы (Триплеты 1 и 2), в пределах одного штамма-реципиента Р.сапезсет К№-11-7. ДтаБ. Предполагалось, что мультиферментные препараты, полученные таким образом, будут обладать большей эффективностью при гидролизе инулосодержащего сырья за счет синергетического эффекта действия 3-х ферментов. Для этого были разработаны следующие подходы.

Первый подход заключался в использовании промотора гена ксиланазы А (ху1А) для экспрессии экзоинулиназы и эндоинулиназы, а также промотора гена арабинофуранозидазы А (аЬ/А) для экспрессии /?-фруктофуранозидазы, с последующей трансформацией трёх плазмид в один реципиентный штамм. Второй подход заключался в использовании промоторов гена ксиланазы А (ху1А) для экспрессии экзоинулиназы, промотор гена /?-галактозидазы для экспрессии эндоинулиназы, и промотор гена арабинофуранозидазы А (аЬ/Л) для экспрессии /?-фруктофуранозидазы, с последующей трансформацией трёх плазмид в один реципиентный штамм.

Для скрининга целевых генов был применён ПЦР-метод с использованием спор грибных трансформаитов как матрицы для проведения Г1ЦР и специфических праймеров на целевые гены. Было обнаружено два клона, где были обнаружены все три искомых гена. На основе отобранных трансформантов были получены ФП, именуемые в дальнейшем - Триплеты 1 и 2.

6,55

5,20

4,55

3,75 3,50 2.80 $

|Г л

■вр

Экзоинулиназа (р! 4,3)

/?-фруктофуранозидаза

(р1 3,4) ' Эндоинулиназа (р! 3)

Рисунок 4. Результаты изоэлектрофокусирования ферментных препаратов Триплет 1 и 2 (Обозначения: ¡-маркёры, 2- ферментный препарат Триплет1, 3 - ферментный препарат Триплет2)

Поскольку у эндоинулиназы, экзоинулиназы и /?-фруктофуранозидазы молекулярные массы очень близки ( молекулярные массы экзоинулиназы - 60, эндоинулиназы - 56, /?-фруктофуранозидазы - 63 кДа), метод ДДС-электрофореза не позволил идентифицировать эти ферменты. Для их идентификации был использован метод ИЭФ (р! экзоинулиназы, эндоинулиназы и ^-фруктофуранозидазы по литературным данным составили 4,3, 3 и 3,4 соответственно). На рис. 4 видно, что все три гетерологичных фермента входят в состав полученного ФП Триплет 1 и 2.

3. Свойства ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Р.сапеясепх. Были определены целевая (инулиназная) и базовая (ксиланазная) активности полученных ФП (табл.2). Из данных, приведённых в таблице видно, что эти ФП обладают на порядки более высокой удельной активностью по инулину топинамбура по сравнению с контролем.

Таблица 2. Удельная активность полученных ферментных препаратов

Ферментный препарат Содержание белка, мг/г Активность по инулину топинамбура, ед/мг Активность по ксилану, ед/мг

Экзоинулиназа (ЭКЗИН) 245±21 87 ±9 77,6 ± 6,5

Эндоинулиназа (ЭНДИН) 237±19 11,6 ± 1 11,8 ± 1,1

Триплет 1 552±43 8,4 ± 0,8 25,6 ± 3

Триплет 2 445±39 18 ± 1,5 121 ±10

ЮМЗ-11-7 (контроль) 336±29 0,05 ± 0.01 80 ±5

Результаты гидролиза инулина топинамбура новыми рекомбинантными ФП инулиназ. Для исследования гидролитической активности полученных ФП был проведён гидролиз инулина топинамбура и измельчённых клубней топинамбура. Эффективность их конверсии зависит как от оптимального соотношения ключевых ферментов в ФП, так и от свойств и состава субстрата. Таким образом, результаты гидролиза выбранных субстратов позволят установить наиболее эффективные ферментные комплексы, а также оптимальное соотношение ключевых ферментов.

Гидролиз проводили в течение 24 часов при 50°С и различной дозировке ФП по белку. Через 30 мин, 3 и 24 ч из реакционной смеси отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию восстанавливающих Сахаров (ВС), фруктозы и глюкозы.

При гидролизе инулина ФП экзоинулиназы (ЭКЗИН) с дозировкой белка 0,5 мг'г сухого субстрата через 3 ч выход ВС составил 45 г/л (рис.5), при этом степень конверсии субстрата составила 80%. Ферментный препарат эндоинулиназы (ЭНДИН) значительно уступает по гидролитической способности ФП экзоинулиназы, выход ВС за 3 ч составил всего 16 г/л. При использовании смесей ФП экзо- и эндоинулиназы различного состава, наилучшей оказалась смесь 0,5 мг ФП ЭКЗИН + 0,5 мг ФП ЭНДИН на 1 г сухого субстрата, при этом выход ВС через 3 ч составил 52 г/л. Степень конверсии субстрата в этом случае приближалась к 100%.

60 13 Гл ВФр РВС

ЭДЗЧмг Эндо-0,5 мг Экзо - 0,05 мг Экзо - 0,1 мг Экзо - 0,5 мг Эндо+экзо: Эндо+экзо: Эндо+экзо:

0,5+0,05 0,5+0,1 0,5+0,5

Рисунок 5. Выход ВС, фруктозы и глюкозы при гидролизе инулина топинамбура ФП ЭКЗИН и ЭНДИН. Условия: 50°С, рН 5, натрий-ацетатный буфер, [8]=50 г/л (сухой вес), дозировка белка приведена на оси абсцисс, перемешивание - 250 об./мин, время реакции -Зч.

Результаты гидролиза инулина топинамбура ФП Триплет 1 и 2 приведены на рис.6. При минимальной из использованных дозировок (0,5 мг/г сухого субстрата) было показано, что ФП экзоинулиназы обеспечил более высокую скорость гидролиза по сравнению с ФП Триплет 1. Таким образом, молекулярно-генетический подход, состоящий в получении продуцента всего искомого мультиферментного комплекса, с технологической точки зрения не выгоден. Поэтому в дальнейшей работе было

10

акцентировано внимание на смешивании ФП, полученных с помощью рекомбинантных штаммов - продуцентов индивидуальных целевых ферментов, а также определении оптимального соотношения ключевых ферментов в смесях ФП.

60 -|

Я фр □ ВС

Экзо - 0.5 мг Триплет! -0,5мг

3 ч

Рисунок 6. Выход ВС, фруктозы и глюкозы при гидролизе инулина топинамбура ФП Триплет 1 и 2. Условия: 50°С, рН 5, натрий-ацетатный буфер, [S]=50 г/л (сухой вес), дозировка ФП по белку приведена на оси абсцисс, перемешивание - 250 об./мин, время реакции - 24 ч.

Результаты гидролиза клубней топинамбура новыми рекомбинантными инулиназными ферментными препаратами. Был проведён гидролиз измельчённых клубней топинамбура полученными ФП. Максимальный выход фруктозы наблюдали пр ФП экзоинулиназы (ЭКЗИН). При дозировке ФП по белку 5 мг/г сухого субстрата через 3 ч реакции концентрация фруктозы (основного продукта гидролиза), составила 60 г/л. Следует отметить, что при использовании ФП эндоинулиназы (ЭНДИН) при гидролизе клубней топинамбура могут быть получены фруктоолигосахариды (ФОС) с различной степенью полимеризации (СП).

Результаты анализа хроматографических данных, характеризующих состав ФОС представлены в табл. 3. Исходя из полученных результатов, очевидно, что максимальная концентрация ФОС приходится на 3 часа гидролиза при данных условиях проведения реакции.

Таблица 3. Состав продуктов гидролиза клубней топинамбура ФП ЭНДИН с дозировкой белка 0,5 мг/г сухого субстрата

Продукты Выход продуктов гидролиза, г/л

гидролиза 30 мин гидролиза Зч гидролиза 24 ч гидролиза

Глюкоза (Г) 3,4 5,1 0,5

Фруктоза (Ф) 3 10 28

ф2 1 5 11

Г-Ф2 2 5 1

ФЗ 7 8,5 1

Г-Фз 4 5 1

Ф4 4,5 7 1,5

Ферментные препараты экзо- и эндоинулиназы смешивали в различных соотношениях, представленных на оси абсцисс (рис. 7). Наиболее оптимальным соотношением, как и при гидролизе инулина топинамбура, оказалось 0,5 мг ФП ЭКЗИН + 0,5 мг ФП ЭНДИН на 1 г сухого субстрата, при этом соотношении ФП через 3 часа гидролиза выход ВС составил 65 г/л.

Рисунок 7. Выход ВС, фруктозы и глюкозы при гидролизе измельчённых клубней топинамбура ФП ЭКЗИН и ЭНДИН. Условия: 50°С, рН 5, [ЭНОО г/л (сухой вес), дозировка белка приведена на оси абсцисс, перемешивание - 250 об./мин, время реакции -3 ч.

Также показана возможность применения ФП экзоинулиназы при обработке сиропов из топинамбура. В результате гидролиза при дозировке ФП ЭКЗИИН по белку 0,5 мг/г наблюдалась полная конверсия ФОС во фруктозо-глюкозный сироп (ФГС) (рис.8), с содержанием фруктозы порядка 95%, что существенно увеличивает сроки его хранения, и как следствие, снимает необходимость добавления консервантов в ФГС.

Время удерживания, мин

Рисунок 8. Хроматограмма, характеризующая состав Сахаров при гидролизе сиропа из топинамбура под действием ФП ЭКЗИН (Условные обозначения; Г - глюкоза, Ф -фруктоза, С - сахароза, ФОС - фруктоолигосахариды)

4. Анализ компонентного состава ферментного препарата на примере препарата эндоинулиназы (ЭНДИН). Для определения состава ФП эндоинулиназы мы использовали разработанный в нашей лаборатории экспресс-метод хроматографического фракционирован!« ФП. Протокол включает три стадии: на первой - ФП растворяли и обессоливали на колонке с носителем Биогель П4, на второй - обессоленный образец наносили на колонку с анионообменным носителем Source 15Q (рН6,8) и собирали фракции белков в линейном градиенте NaCl от 0 до 0,4М (рис.9). На третьей стадии проводили фракционирование с помощью гидрофобной хроматографии на носителе Source I5!SO. Связавшийся белок элюировали. уменьшая концентрацию сульфата аммония в элюенте. Во фракциях были измерены активности по отношению к следующим субстратам - инулин топинамбура, ксилан берёзы, пНФ-«-1.-арабинофуранозид и пНФ-/?-D-галактопранозид.

На хроматограмме (рис.9) видно, что эндоинулиназа выходит в середине градиента соли при фракционировании на колонке Source 15Q и находится во фракциях с 9-13, что подтверждается соответствующей полосой в районе 70 кДа на ДДС-электрофореграмме (рис. 10).

О 10 20 ЗО Объем элюента, мл

Рисунок 9. Фракционирование ферментного препарата эндоинулиназы (ЭНДИН) с помощью анионообменной хроматографии на носителе Source 15Q, рН 6,8, градиент соли приведён серым цветом.

Рисунок 10. Электрофореграмма гомогенной эндоинулиназы, полученной после разделения фракций 9-13 на гидрофобном носителе Source 15ISO

Доказательством наличия целевых белков (экзоинулиназы, эндоинулиназы и сахаразы) в ФП, являлись данные MALDI-TOF масс-спектрометрии. Для этого образцы геля с белковыми полосами, полученными в результате проведения ДЦС-электрофореза и соответствующие предполагаемым массам целевых белков, обрабатывали трипсином. Полученные пептиды анализировали MALDI-TOF масс-спектрометрии. Анализ результатов и поиск целевых пептидов проводили с использованием программы Bruker DataAnaiysis. Данные о полученных пептидах после трипсинолиза сравнивали с

теоретическими пептидными последовательностями, полученными с использованием программы PeptideMass для первичной аминокислотной последовательности гетерологичных ферментов.

На рис. 11. приведён MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата и результаты идентификации пептидов на примере эндоинулиназы - на основании этих данных можно с достоверностью утверждать о наличии целевого белка в комплексе. Подобным образом было доказано наличие экспрессии и других целевых генов.

Intens.

)С109

1.0

0.8

0.6

0,4 0,2 0,0

Рисунок И. МАІЛЛ-ТОР масс-спектр трипсинового гидролизата полосы, соответствующей эндопнулиназе А.піцег

Таблица 4. Компонентный состав ферментных препаратов инулиназ (ЭКЗИН и ЭНДИН (в % от общего содержания белка).

Компонент препарата ЭКЗИН ЭВДИН

Инулиназа 51 15

Кспланаза 16 12,5

Арабинофуранозидаза 20 23

Б-галактозидаза 5 12

Другие белки 7 37.5

На основании данных о содержании белка и активности соотвстствуиих ферментов во фракциях был определён компонентный состав ФП, содержащих экзо- и эвдоинулнназу (табл. 4). ФП ЭКЗИН содержал 51% экзоинулиназы, ЭНДИН - 15 % эндоинулиназы от общего пула белка ФП. Отметим, что аналогичный подход был применен для определия компонентного состава всех изученных в данной работе ФП.

5. Биохимические свойства гомогенных экзоинулиназы и эндоинулиназы. После выделения и очистки экзо- и эндоинулиназы в гомогенном виде по схеме, предложенной выше, были определены следующие свойства гомогенных ферментов: специфичность, тип

МШРетАИ4У»МТСІ.СІ.П.Р5!!А(!ЗМ>ЇИРЗЇНПР«гї WMKEPNGLIKIGSTVIHLFFQHNPTAKVWGNICWGHATST DIJtHWAHKPTAIAaENGVEArTGTATYPPNKASGLGDSA NPPrLAWFTGYTVSSQTQDQRfLAFSVDNGArWTKFQGN^ [FlSTSCEAPHDITGgLESRjDPKVFFHRQSGWIWVIAHa GQDK)LSFVrSADTINVrWQSPI.i^STSINOLSSDITGW£V

PDMraLPVEGIEETTWWMMTPAEGSPAGGNGVLAITGS FDGKjSFTADPTOASTMWLNaGaDFÜGALSWraVPASOGlR RIIAAVWS*GSNFPTITKKGWLrFPRTI.SlJÜCV5T03H FVQQPITELDTISTSI.QTLEMQTITPGQTLLSSIPGTAL DVB|yÄFYPDAGSVI.SLAVPjKGAgEQTVHCYTQSDATLSV DRTESGDTSnJPAASGVHTAXLEEDDTGLVSIRVLVDTC SVEVFGG0GEAVTSDLIFPSDSSDGLALEVTGGNAVLQS VDVRSVSLE

действия фермента на субстрат, кинетические параметры, а также рН- и температурные оптимумы действия ферментов. Полученные данные сведены в табл.5.

Таблица 5. Биохимические свойства гомогенных экзо- и эндоинулиназ.

Параметры Экзоинулиназа Эндоинулиназа

М(теор.), кДа 60 56

РІ 4,3 3,0

Тип действия Экзо-деполимераза Эндо-деполимераза

Удельная активность, ед/мг белка, рН 5,0 50°С

Инулин агавы 325±27 2,2 ±0,2

Инулин цикория 90 ±8 32 ±2,1

Инулин артишока 10 ±1 10 ±1

Инулнн топинамбура 80 ±6 31 ±2,5

Сахароза 80 ±6 8 ±0,5

Кинетические параметры гидролиза инулина

Км, г/л (инулин топинамбура) 27 ±2,5 12 ±1

Км, г/л (инулин георгина) 25 ±2,1 15 ±1.3

Км, г/л (инулин цикория) 11 ±1 4,9 ±0,3

Кса„ мин-'(инулин топинамбура) 159 ±14 100 ±10

Кса„ мин-Цинулин георгина) 138 ±11 50 ±4,5

Кса,, мин-'(инулин цикория) 73 ±6 36 ±3,1

Оптимумы активности ферментов

рН - оптимум 4,0-4,5 5,5-6,0

Т-оптимум 50°С 55°С

Отметим, что эндоинулиназа обладает наибольшей активностью (определенной по начальным скоростям гидролиза) по отношению к инулину цикория и топинамбура, экзоинулиназа - по отношению к инулину агавы. Оба фермента проявляли активность к сахарозе. рН и температурный оптимум эндоинулиназы составил 4,0-4,5 и 50°С, и экзоинулиназы - 5,5-6,0 и 50°С, соответственно. Свойства рекомбинантных ферментов, в целом, совпадают со свойствами ферментов, полученных из природных штаммов-продуцентов.

II. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ Р.сапезсет РСА-10.

1. Получение экспрессионных конструкций и трансформация штамма-реципиента.

Используя геномные ДНК Рл'еггиЫояит и A.mger в качестве матрицы, методом ПЦР были амплифицировапы и выделены фрагменты ДНК соответствующие целевым генам (целлобиогидролаза I (сШ), целлобиогвдролаза II (сШ), эндо-/?-1,4-глюканаза (е%!2) II Р.\erruculosum и Д-глюкозидаза (Ьф) А.п'щег), которые были клонированы в вектор, содержащий нуклеотидные последовательности, соответствующие промоторной области гена мажорного белка - ксиланазы А (ху1А) Р.сапезсет и терминаторной области гена эндоглюканазы III {е%1III) РжгтсиЬзит. Полученные экспрессионные плазмиды (рис.12) были трансформированы в штамм-реципиент Р.сапезсет Аглай совместно с плазмидой

16

рЭТАЮ с геном нитратредуктазы, обеспечивающей комплементацию дефектного гена нитратредуктазы. Далее был проведен скрининг трансформантов, проверена стабильность полученных трансформантов и проведена наработка рекомбинантных ФП.

Рисунок 12. Схематическое изображение экспрессионных плазмид (А - плазмида с геном целлобиогидролазы I Р^еггисиЬяит, Б - с геном целлобиогидролазы II Р. чеггиси1о$ит, В - с геном эндоглюканазы II Рмеггиайоъит, Г - с геном /У-глюкозидазы А.пщгг).

2. Свойства ферментных препаратов целлюлаз. Были определены активности полученных рекомбинантных ФП по отношению к ряду субстратов: к нерастворимой микрокристаллической целлюлозе (МКЦ), что характеризует целлобиогидролазную активность, к растворимой Ка-соли карбоксиметилцеллюдозы (КМЦ) - эндоглюканазная активность, берёзовому ксилану - ксиланазная активность, а также по п-нитрофенил-//-0-глюкопиранозиду (ПНФГ) - /?-глюкозидазная (целлобиазная) активность. ФП рекомбинантной эндоглюканазы имели увеличенную удельную активность по КМЦ, ФП целлобиогидролазы - увеличенную активность по МКЦ, ФП /?-глюкозидазы -увеличенную удельную активность по ПНФГ (табл. 6).

Таблица 6. Удельные активности ферментных препаратов по отношению к разным субстратам, ед/мг белка.

Ферментный препарат Содержание белка, мг/г кмц МКЦ Ксилан ПНФГ

ЭГН-1 450±36 24,8±2,3 0,13±0,01 17,1±1,2 0,3±0,03

ЭГИ-2 515±41 25,7±1,5 0,1 ±0,01 19,2±1,3 0,16±0,01

ЭГН-З 792±65 21,3±1,6 0,31±0,03 5,8±0,4 0,13±0,01

ЭГП-4 767±71 21,4±1,2 0,37±0,02 6,9±0,6 0,13±0,01

ЭГИ-5 796±75 20,2±1,9 0,35±0,02 6,8±0,5 0,07±0,01

ЭГН-6 758±81 20,3±1,2 0,29±0,01 8,4±0,9 0,05±0,01

ЦБП 330±31 3,9±0,2 0,51±0,03 48,5±0,31 0,17±0,02

ЦБГ1І 390±32 5,1 ±0,3 0,45±0,03 55,1±5,2 0,3±0,025

БГЛ 245±21 0,75±0,05 0,05±0,01 2,6±0,21 5,8±0,34

РСА-10 контроль 336±32 2,89±0,5 0,1±0,01 70±5,6 0,12±0,01

Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы и измельчённой осиновой древесины новыми рекомбннантными ферментными препаратами целлюлаз. Для

исследования гидролитической способности полученных рекомбинантных ФП были выбраны два субстрата: МКЦ - как модельный субстрат для изучения действия ферментов целлюлолитического комплекса, и измельчённая осиновая древесина как быстровозобновляемое сырье, являющееся отходом деревообрабатывающей промышленности. Гидролиз проводили в течение 24 часов при 50°С и различной дозировке ПФ по белку. Через 3, 24 и 48 ч из реакционной смеси отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию ВС и глюкозы (Гл).

Среди полученных шести ФП гетерологичной эндоглюканазы лучшим с точки зрения гидролитической активности, как при гидролизе МКЦ, так и при гидролизе измельчённой осиновой древесины, оказался препарат ЭГН-6, рис.13. При дозировке по белку 10 мг/г сухого субстрата этот ФП обеспечивает увеличение выхода ВС в среднем на 65% по сравнению с результатами гидролиза контрольным препаратом, исходного штамма-реципиента Р.сапезсет РСА-10. На основании полученных данных, для дальнейших экспериментов были выбраны следующие ФП: ЦБП, ЦБГП, ЭГП-6 и БГЛ.

Рисунок 13. Выход ВС при гидролизе МКЦ (А) и измельчённой осиновой древесины (Б) ФП ЭГИ-6. Условия: 50°С, рН 5, [S]=100r/n (сухой вес), дозировка ФП по белку составила от 2-10 мг/г сухого субстрата, перемешивание - 250 об./мин, время реакции - 48 ч.

Для изучения совместного действия ка целлюлозосодержащие материалы рекомбинантных ФП целлобиогидролаз и эндоглюканаз их смешивали в следующих соотношениях: 2+8, 4+6, 6+4 и 8+2 мг/г сухого субстрата (соотношения представлены на оси абсцисс, рис.14). Гидролиз проводили в присутствии препарата БГЛ из расчёта 40 ед целлобиазной активности на 1 г субстрата. Данные, приведенные на рис. 14 позволяют заключить, что наиболее эффективным соотношением ФП, при котором наблюдались максимальные выходы ВС и Гл при гидролизе МКЦ - 8 мг/г (по белку) ФП ЦБП к 2 мг/г ФП ЭГИ-6. Выход ВС и Гл в этом случае составил 31 и 30 г/л, что в 6 и 10 раз больше, чем при гидролизе МКЦ контрольным ФП, полученным с помощью исходного штамма реципиента P.canescens РСА-10 (рис. 14 а).

В случае использования смеси ФП ЦБГИ и ЭГП-6 соотношение ФП 8 мг/г (по белку) к 2 мг/г также оказалось наиболее оптимальным: ВС и Гл в этом случае составил ¡9 и 16 г/л. что в 6 и 7 раз больше, чем при гидролизе контрольным ФП (рис.14 б).

Рисунок 14. Выход ВС и Гл при гидролизе МКГД смесью ФП ЦБП + ЭГП-6 (А) и ЦБГН + ЭГН-6 (Б). Условия: 50°С, рН 5, [SHOOr/л (сухой вес), [Е]= 2+8, 4+6, 6+4 и 8+2 мг на 1 г, в присутствии ФП БГЛ (40 ед целлобиазной активности на 1 г субстрата), перемешивание - 250 об./мин, время реакции - 48 ч.

Наиболее эффективным соотношением ФП при гидролизе измельчённой осиновой древесины для препаратов ЦБП и ЭГП-6 также являлось 8 к 2, рис. 15а. Выход ВС и Гл при этом составил 62 и 38 г/л, соответственно, что в 5 и 4 раз выше, чем при гидролизе измельчённой осиновой древесины контрольным ФП. Аналогичный результат наблюдался и для совместного использования ФП ЦБГН и ЭГИ-6 - выход ВС и Гл составил 56 и 35 г/л, что в 4,5 и 4 раза выше, чем при использовании контрольного ФП (рис. 156).

-5 70

РСА 10 2+8 4+6

6+4 8+2

5 70

g 60 a

S 50

я

о 40 о; s я <0 a ix о =f X

о

ЗО 20 -10

О -н

а вс в Гл

□ ВС + БГЛ □ Гл + БГЛ

it

ffi

і

РСА10 2+8 4+6 6+4 8+2

Рисунок 15. Выход ВС и Гл при гидролизе осиновой древесины смесью ФП ЦБГІ + ЭГП-6 (А) и ЦБГІІ + ЭГИ-6 (Б). Условия: 50°С, рН 5, [S]=100rfti (сухой вес), [Е]= 2+8, 4+6, 6+4 и 8+2 мг на 1 г, в присутствии ФП БГЛ (40 ед целлобиазной активности на 1 г субстрата), перемешивание - 250 об./мин, время реакции - 48 ч.

3. Анализ компонентного состава рекомбинантных ферментных препаратов целлюлаз. Компонентный состав ФП ЦБГІ, ЦБГ1І, ЭГИ-6 и БГЛ, определённый с помощью аналитического фракционирования с помощью методов FPLC, приведён на рис.16.

Анализ состава контрольного ФП РСА-10, полученного на основе исходного штамма-реципиента, показал превалирующее содержание в нём ксиланазы - 57% от общего пула белка. ФП ЦБГГ содержат 27% целлобиогидролазы I, ЦБГП - 20% целлобиогидролазы II, ЭГИ-6 - 42% эндоглюканазы И, БГЛ - 20% Д-глюкозидазы (содержание целевых ферментов на рис.16 обозначены чёрным сектором).

А

другие белки

21%

ЦВГ11

КсилА 32%

АБФ 10%

КсилА

14%

другие белки 25%

ЭГН-б

33%

другие белки Г^

19% 1

Рисунок 16. Компонентный состав рекомбинантных ферментных препаратов целлюлаз (А- ФП ЦБГ1, Б - ФП ЦБГП, В - ФП БГЛ, Г - ФП ЭГП-б, Д - контрольный ФП

РСА-10)

Все рекомбинантные ФП содержали гомологичную ксиланазу Р.сапеясепз (от 13 до 38%) - наличие ксиланазы в составе рекомбинантных ФП способствует увеличению эффективности процесса гидролиза богатых ксиланами видов растительного сырья, в том числе осиновой древесины.

*****

Таким образом, на основании изложенных выше результатов, установлено, что рекомбинантные ферментные препараты инулиназ и целлюлаз, полученные с использованием молекулярно-генетических подходов обладают повышенной гидролитической способностью по отношению к инулосодержащему и целлюлозосодержащему сырью, причём для достижения максимальной глубины гидролиза соответствующих субстратов необходимо оптимальное соотношение ключевых ферментов в составе ФП, полученных на основе рекомбинантных штаммов Р.сапезсепз.

выводы

1. Получены плазмиды с гетерологичными генами inul и ЫиА, кодирующими экзоинулиназу A.awamori и эндоинулиназу A.niger, геном fopA, кодирующим /?-фруктофуранозидазу A.oryzae, cbhl, cbhll и egUI, кодирующими целлобиогидролазу I, целлобиогидролазу II и эндоглюканазу II P.verruculosum, а также bgll, кодирующим р-глюкозидазу A.niger, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых белков в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов-продуцентов гриба Pénicillium canescens.

2. Используя молекулярно-генетические подходы были созданы штаммы гриба P.canescens, обладающие способностью к продукции гетерологичных экзоинулиназы A.awamori, эндоинулиназы A.niger, /?-фруктофуранозидазы A.oryzae, а также целлобиогидролазы I, целлобиогидролазы II, эндоглюканазы II P.verruculosum и /?-глюкозидазы A.niger. На основе наиболее активных отобранных штаммов-продуцентов целевых ферментов получены рекомбинантные ферментные препараты и изучены их биохимические свойства.

3. Получение наиболее эффективного гидролитического комплекса было достигнуто путём смешения ферментных препаратов. Показано, что оптимальным соотношением ферментных препаратов экзо- и эндоинулиназ для эффективного гидролиза инулина и клубней топинамбура является 0,5 мг ЭКЗИН + 0,5 мг ФП ЭНДИН на I г сухого вещества субстрата.

4. Изучен компонентный состав и содержание целевых ферментов в ферментных препаратах инулиназ, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов-продуцентов и установлено, что содержание экзоинулиназы составляет 51%, а содержание эндоинулиназы - 15% от общего пула секреторного белка.

5. Выделены рекомбинантные гомогенные экзоинулиназа A.awamori и эндоинулиназа A.niger и показано, что по своим свойствам - субстратной специфичности, кинетическим параметрам, pi, зависимости активности от рН- и термостабильности -рекомбинантные ферменты не отличаются от аналогичных ферментов природных штаммов.

6. Исследованы гидролитические свойства целлюлазных ферментных препаратов и показано, что состав смеси ФП ЦБГ1 (или ЦБГ11) и ЭГН в соотношении 8 мг (ЦБГ1 или ЦБГН) + 2 мг (ЭГП) на 1 г сухого субстрата является наиболее оптимальным для достижения максимальной глубины гидролиза целлюлозосодержащих субстратов -

микрокристаллической целлюлозы (30% конверсии до восстанавливающих Сахаров) и измельченной осиновой древесины (62% конверсии до восстанавливающих Сахаров). 7. Изучен компонентный состав и содержание целевых ферментов в ферментных препаратах целлюлаз, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов-продуцентов и установлено, что содержание целлобиогидролазы I составляет 27%, целлобиогидролазы II - 20%, эндоглнжаназы II - 42%, а /?-глюкозидазы - 20% от общего пула секреторного белка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах

1. Рожкова А.М., Волков П.В.. Кондратьева Е.А., Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А., Бушина Е.В., Зоров И.Н., Синицына O.A., Синицын А.П., Кошелев A.B., Беккаревич O.A., Бубнова Т.В., Окунев О.Н. Создание продуцентов биотехнологически важных ферментов на основе рекомбинантного штамма гриба Pénicillium canescens //Хранение и переработка сельхозсырья,- 2010, №7, с.37-39.

2- Волков П.В- Рожкова А.М., Правильников А.Г., Андрианов P.M., Доценко Г.С., Беккаревич А.О., Кошелев A.B., Окунев О.Н., Зоров И.Н., Синицын А.П. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Pénicillium canescens с высокой способностью к гидролизу растительного сырья // Прикладная биохимия и микробиология. -2012, Т. 48, №1, с. 66-73

3. Волков П.В.. Рожкова А.М., Зоров И.Н., Цурикова Н.В., Нефёдова Л.И., Окунев О.Н., Кошелев A.B., Синицын А.П.. Получение ферментных препаратов эндоинулиназы для высокоэффективного гидролиза клубней топинамбура II Хранение и переработка сельхозсырья. - 2012, №2, с.12-15.

4. Волков П.В.. Синицына O.A., Фёдорова Е.А., Рожкова А.М., Сатрутдинов А.Д., Зоров И.Н., Окунев О.Н., Гусаков A.B., Синицын А.П. Изучение ферментных препаратов инулиназ Aspergillus sp. Выделение и свойства рекомбинантных ферментов // Биохимия. -2012, Т.77, вып.5 (в печати).

Тезисы докладов

1- Волков П.В-. Рожкова А.М., Зоров И.Н., Семенова М.В., Синицын А.П. Экспрессия гетерологичной липазы в рекомбинантном штамме гриба Pénicillium canescens. Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике «EURASIABIO», 13-15 Апреля, 2010, Москва, с.49

2. Волков Н.В.. Рожкова А.М., Синицын А.П. Создание системы экспрессии генов в рекомбинантном штамме Pénicillium canescens на основе промотора гена ct-L-арабинофуранозидазы. Московская международная научно-практическая конференция "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов", 15-17 Марта, Москва, 2010, с.318-319.

3. Волков П.В. Использование промоторов xylA, bgaS и ab/A в системах экспрессии целевых ферментов в рекомбинантном штамме Pénicillium canescens. IV Международная Школа молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки», 29 ноября - 3 декабря 2010 г., Москва-Звенигород, с.62-64.

4. Волков П.В.. Рожкова А.М., Синицын А.П. Получение оптимального ферментативного комплекса целлюлолитических ферментов для осахаривания измельчённой осиновой древесины. VI Московский Международный Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», 21-25 марта, часть 1, 2011 Москва, с.385-386.

5. Волков П.В. Получение ферментных препаратов инулиназ на основе рекомбинантного гриба Pénicillium canescens для высокоэффективного гидролиза топинамбура. Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины. Школа-конференция. Москва. Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, 29-30 сентября 2011 г.: Сборник материалов, 2011. с.86.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Волков, Павел Валерьевич, Москва

61 12-2/282

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А.Н. Баха

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК__

На правах рукописи

Волков Павел Валерьевич

Молекулярно-генетические подходы к получению ферментных препаратов карбогпдраз с улучшенными гидролитическими свойствами

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н., проф. Синицын А.П.

Москва - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6

ВВЕДЕНИЕ 7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

Глава 1. Состав и строение растительной клеточной стенки 9

1.1. Основные компоненты растительной клеточной стенки 9

1.2. Целлюлоза 11

1.3. Нецеллюлозные /? - глюканы 14

1.4. Гемицеллюлозы и пектины 15

1.5. Пектины 17 Глава 2. Инулин - строение и свойства 18 Глава 3. Свойства и структура целлюлаз и инулиназ 20

3.1. Общие представления о целлюлолитических ферментах и их классификации 20 3.2.Особенности строения и биохимические параметры целлюлолитических

22

ферментов

3.3. Свойства инулиназ из различных микроорганизмов 24

Глава 4. Механизм ферментативной деградации целлюлозы и инулина 27

4.1. Механизм действия целлюлазного комплекса 27

4.2. Синергизм действия целлюлолитических ферментов на субстрат 29 4.3 Механизм гидролиза инулосодержащего сырья 30

Глава 5. Применение целлюлаз и инулиназ в биотехнологии 30 Глава 6. Возможности использования штамма Р. сапеасет для получения

32

ферментных препаратов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 34

Глава 7. Материалы и методы экспериментов 34

7.1. Ферментные препараты 34

7.2. Субстраты 34

7.3. Прочие реактивы 3 4

Глава 8. Получение ферментных препаратов целлюлаз на основе рекомбинантных штаммов P.canescens

36

37

7.4. Хроматографические сорбенты 36

7.5. Проведение полимеразной цепной реакции и получение генетических конструкций

7.6. Получение протопластов и проведение трансформации штамма-реципиента

P.canescens

7.7. Культивирование трансформантов P.canescens в 3-л ферментёрах 38

7.8. Определение концентрации белка 39

7.9. Определение биохимических характеристик ферментов 39

7.10. Методы определения активности ферментов 3 9

7.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков 41

7.12. Определение температурного и pH-оптимума действия ферментов 42

7.13. Изучение термостабильности ферментов 42

7.14. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов

42

гидролиза целлюлозо- и инулосодержащего сырья

7.15. Хроматографическое фракционирование ферментных препаратов Р. canescens 43

7.16. Гидролиз целлюлозосодержащих субстратов 44

7.17. Гидролиз инулосодержащих субстратов 44

7.18. Определение кинетических параметров действия ферментов (Km, Kcat) 45

7.19. Изучение влияния эффекторов на активность ферментов 45

7.20. Анализ молекулярно-массового распределения (ММР) продуктов гидролиза

45

инулина

7.21. Окрашивание агаризованной среды с КМЦ конго-красным 46 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 47

47

8.1. Выделение генов и создание экспрессионных конструкций 48

8.2. Первичный скрининг полученных трансформантов 49

Глава 9. Свойства новых ферментных препаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов Р.сапе5сет

9.1. Анализ ферментных препаратов с помощью методов электрофореза и изоэлектрофокусирования

9.2. Субстратная специфичность исследуемых ферментных препаратов 59

9.3. рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность использованных ферментных препаратов.

Глава 10. Ферментативный гидролиз микрокристаллической целлюлозы и измельчённой осиновой древесины ферментными препаратами Р.сапеясет

10.1 Результаты гидролиза МКЦ ФП ЦБГ1, ЦБГП и ЭГИ 1-6 65

10.2 Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы смесью ФП ЦБГ1 и ЭГП-6.

10.3 Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы смесью ФП ЦБГП и ЭГН-6.

61

65

66

67

10.4 Результаты гидролиза осиновой древесины ФП ЦБГ1, ЦБГП и ЭГП 1-6 68

10.5 Результаты гидролиза измельчённой осиновой древесины смесью препаратов ЦБГ1 и ЭГП-6

69

10.6 Результаты гидролиза измельчённой осиновой древесины смесью препаратов ЦБГ1 и ЭГП-6 70

10.7 Сравнение гидролитической способности рекомбинантных ФП с коммерческими 71

10.8 Состав рекомбинантных ферментных препаратов целлюлаз 72

Глава 11. Получение ферментных препаратов инулиназ на основе рекомбинантных штаммов Р.сапезсет

11.1. Выделение генов и создание экспрессионных конструкций 75

11.2. Трансформации пггамма-реципиентаР. сапеэсет ШЗ-11-7 76

11.3. Анализ ФП с помощью методов электрофореза и изоэлектрофокусирования 82

11.4. Активность ферментных препаратов инулиназ по отношению к различным субстратам

11.5. Ферментативный гидролиз чистого инулина и клубней топинамбура ФП, полученными на основе Р.сапевсет

83

Глава 12. Выделение и свойства рекомбинантных инулиназ 91

12.1. Хроматографический анализ ферментных препаратов инулиназных штаммов Pénicillium canescens

12.2. Фракционирование препарата экзоинулиназы (ЭКЗИН). 91

12.3. Фракционирование препарата эндоинулиназы (ЭНДИН). 94

12.4. Субстратная специфичность инулиназ 98

12.5. Механизм действия инулиназ по отношению к инулинам из разных ^ источников

12.6. Кинетические параметры инулиназ 100

12.7. рН и температурные зависимости активности инулиназ 100

12.8. Стабильность инулиназ 101

12.9. Влияние катионов металлов и анионов кислот на активность инулиназ 102 ВЫВОДЫ 104 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 106 ПРИЛОЖЕНИЯ 119

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ферменты

ЦБГ целлобиогидролаза

ЭГ эндоглюканаза

БГЛ (5-1,4-глюкозидаза

АБФ арабинофуранозидаза

Ксил ксиланаза

Р-Гал Р-галактозидаза

Прочие сокращения

ММ^О 1 -метил-3 -нитро-1 -нитрозогуанин

МАЫ)1-ТОР МБ Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация -

времяпролетная масс-спектрометрия

а.к. аминокислота

ВС восстанавливающие сахара

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ДДС-ЭФ электрофорез в денатурирующих условиях

ЮК культуральная жидкость

ИЭФ изоэлектрофокусирование

КМЦ Иа-соль карбоксиметилцеллюлозы

МКЦ микрокристаллическая целлюлоза

ПААГ полиакриламидный гель

иНФГлю и-нитрофенил-Р-О-глюкопиранозид

иНФГал я-нитрофенил-Р-О-галактопиранозид

иНФАра и-нитрофенил-а-Ь-арабинофуранозид

СП степень полимеризации

УФ, ЦУ ультрафиолетовое излучение

ФП ферментный препарат

ЦСМ целлюлозосодержащие материалы

Фр фруктоза

Гл глюкоза

ВВЕДЕНИЕ

В последнее десятилетие особое внимание уделяется созданию рекомбинантных штаммов продуцентов целевых ферментов. Особое положение среди таких микроорганизмов занимают мицелиальные плесневые грибы рода Pénicillium, Trichoderma и Aspergillus, используемые в настоящее время в качестве объектов современных генно-инженерных подходов с целью создания штаммов супер-продуцентов ферментов, имеющих биотехнологическое значение. Актуальным направлением в биотехнологии в настоящее время является рациональный дизайн ферментных препаратов путём комбинации подходов генной инженерии и микробиологии.

В последние несколько лет в ИНБИ ведутся работы со штаммом Pénicillium canescens -продуцентом ß-галактозидазы и ксиланазы. Штамм обладает рядом преимуществ в сравнении с другими грибными микромицетами - обладает более высокой скоростью роста культуры и биосинтеза внеклеточных ферментов, растет на простой и недорогой по составу ферментационной среде со свекловичным жомом, процесс ферментации легко масштабируется, получен штамм-реципиент с ауксотрофным признаком селекции, отработана система трансформации штамма экзогенной ДНК и получены 3 системы экспрессии на основе гомологичных регуляторных элементов генов abfA, xylA и bgaS. Более того, Р. canescens показал себя весьма эффективным штаммом - продуцентом при получении ферментных препаратов арабинофуранозидазы, а-галактозидазы, ферулоил-эстеразы и ряда других ферментов, что подтверждено соответствующими патентами. Все это позволяет использовать штамм Pénicillium canescens как лабораторную модель для получения ферментных препаратов с заданными свойствами для высокоэффективного гидролиза пищевого и непищевого растительного сырья.

Таким образом, увеличение эффективности гидролиза целлюлозо- и инулосодержащего сырья с использованием новых ферментных препаратов, обладающих высокими значениями целлюлазных и инулиназных активностей, полученных на основе рекомбинантного штамма P. canescens является весьма актуальной целью.

Научная новизна работы. Новизна работы состоит в получении новых эффективных ферментных препаратов с улучшенными гидролитическими свойствами на основе лабораторного грибного штамма P.canescens с использованием современных ДНК технологий.

Практическая значимость. Показано, что ферментные комплексы целлюлаз и инулиназ

обладают увеличенной гидролитической способностью. Применение полученных в

7

результате выполнения работы индивидуальных ферментных препаратов, а также их смесей, при гидролизе различных видов целлолососодержащего (измельчённая микрокристаллическая целлюлоза и осиновая древесина) и инулосодержащего (инулин топинамбура и измельчённые клубни топинамбура) сырья позволяет достичь высокой степени его конверсии, что может быть использовано в ряде технологических процессов пищевой и биотехнологической промышленности.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

• Получить плазмидные конструкции, несущие гены целлюлаз (целлобиогидролазы I и II (cbhl и cbh2)), эндоглюканазы II (egl2) P. verruculosum, а также /9-глюкозидазы (bgll) A.niger) на основе экспрессионного вектора, содержащего промотор гена ксиланазы A (xylA) P. canescens;

• Получить плазмидные конструкции, несущие гены инулиназ (экзоинулиназы (inul)) Aspergillus awamori, эндоинулиназы (inuA) A.niger, а также ß-фруктофуранозидазы (fopA) A.oryzae на основе векторов, содержащих промоторы гена xylA (кодирующего ксиланазу А Penicillium canescens), гена bgal (кодирующего ß-галактозидазу Р.canescens) и гена ab/B (кодирующего арабинофранозидазу А Р. canescens);

• Провести трансформацию полученными плазмидами штамма-реципиента Р. canescens (niaD'J и осуществить скрининг трансформантов. Получить новые ферментные препараты целлюлаз и инулиназ и исследовать их свойства;

• Выделить в гомогенном виде и изучить свойства экзоинулиназы и эндоинулиназы, сравнить со свойствами соответствующих ферментов из природных штаммов;

• Исследовать гидролитические свойства ферментных препаратов по отношению к целлюлозосодержащему и инулосодержащему сырью, а также определить оптимальное соотношение в них ключевых ферментов;

• Определить компонентный состав ферментных комплексов, обладающих наиболее высокой эффективностью гидролиза растительного сырья.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СОСТАВ И СТРОЕНИЕ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ

Клеточная стенка растений - периферическая часть растительной клетки, расположенная снаружи от плазмалеммы и представленная слоем структурированного материала. Толщина клеточной стенки обычно колеблется в пределах ОД-10 мкм [1]. Клеточная стенка составляет весьма значительную часть растительного организма: её содержание в травянистых растениях составляет от 30 до 70% сухой массы, а в древесных растениях достигает 80-90%. Основные компоненты растительной клеточной стенки -полисахариды, фенольные соединения (лигнин) - являются самыми распространёнными органическими соединениями на Земле. [2].

1.1 Основные компоненты растительной клеточной стенки

Наиболее важные компоненты клеточных стенок растений - полисахариды [3], представляют собой длинные неразветвленные молекулы, которые в клеточной стенке агрегированы в пучки, называемые микрофибриллами, обладающими кристаллической структурой [4]. Наиболее распространенным микрофибриллярным полисахаридом растительной клеточной стенки является целлюлоза (рис.1).

Рисунок 1. Схаматическое изображение строения растительной клеточной стенки [5].

СТЕНКИ

Микрофибриллы заключены в матрикс, состоящий из полисахаридов, не имеющих кристаллической структуры. Полисахариды матрикса по химической структуре и растворимости делятся на пектины и гемицеллюлозы. Пектины хорошо экстрагируются кипящей водой, в то время как гемицеллюлозы растворимы лишь в насыщенном растворе КОН (микрофибриллярные полисахариды не растворимы ни в кипящей воде, ни в щелочи). Полисахаридную структуру клеточной стенки можно сравнить со структурой железобетона; при этом целлюлозные кристаллические микрофибриллы эквивалентны стальным стержням арматуры, а полисахариды матрикса - окружающему их бетону.

В табл. 1 представлен полисахаридный состав целлюлозосодержащего сырья, полученного из разных источников. В травах, лиственных и хвойных деревьях содержание целлюлозы приблизительно одинаковое, в то время как содержание гемицеллюлоз сильно различается. В лиственных породах деревьев целлюлоза ассоциирована в основном с ксиланом, а в хвойных содержание ксилана значительно меньше, зато относительно много маннанов и галактанов. В травах содержится много ксилана и арабинана.

Таблица 1 - Состав ЦСС из различных источников, % [6]

Полисахарид Тополь Сосна Пшеничная солома Багасса сахарного тростника

Целлюлоза 42 42 32 39

Ксилан 13 6 19 21

Маннан 2 11 0,2 0,2

Арабинан 0,3 1 2 1

Галактан 0,3 2 0,6 0,3

В клетках растений содержится также лигнин (до 40%) - нерастворимый фенольный полимер, который особенно распространен в клетках деревьев, где он ассоциирован с первичной и вторичной клеточными стенками. Он входит в состав одревесневших клеток всех наземных растений и, по мнению большинства исследователей, химически связан с углеводами. Структура лигнина представляет собой нерегулярный полимер с разветвлёнными макромолекулами построенными в основном из замещённых фенилпропановых звеньев. Основными мономерными звеньями являются 4-оксикоричный (п-кумаровый), З-метокси-4-оксикоричный (конифериловый) и 5-метокси-

4-оксикоричный (синаповый) спирты, которые соединяются углерод-углеродными и простыми эфирными связями. [7].

К минорным компонентам клеточной стенки относят - неорганические соединения, воск, суберин и кутин. Кутин и суберин относятся к гидрофобным соединениям, в состав которых входят ароматические и алифатические (жирнокислотные) элементы. Это сложные полимеры нерегулярного строения, которые содержатся в основном в поверхностных тканях. Кутин - основной компонент кутикулы. Алифатические компоненты кутина и суберина сходны и представлены в основном полиэфирами жирных кислот, среди которых преобладают насыщенные кислоты длиной С16 и С18. [8]

Далее будут рассмотрены свойства основных полисахаридов растительной клеточной стенки.

1.2 Целлюлоза

Целлюлоза содержится в древесине, однолетних растениях, травах, льне, хлопке, конопле, в оболочках семян плодов, в морских и пресноводных водорослях. В природе встречается также бактериальная и животная целлюлоза (некоторые ракообразные и улитки) [9].

Целлюлоза представляет собой полимер, образованный остатками D-глюкозы (Р-1,4-связь). Это классический пример полимера, макромолекулы которого имеют линейное строение и который характеризуется повышенной скелетной жесткостью. Конфигурация макромолекулы целлюлозы дает возможность реализации внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Степень полимеризации (СП) нативной целлюлозы может составлять более 10 тыс., а молекулярная масса - более 1,5 млн. [10]. СП целлюлозы меняется в зависимости от фазы роста растений. На ранних стадиях она имеет низкую СП и обладает высокой пористостью и сорбционной способностью по сравнению с целлюлозой созревшего растения. Целлюлоза в нативном состоянии представляет собой полимолекулярное соединение, в состав которого входят молекулы, идентичные по своему строению, но отличающиеся по длине. Например, для хлопковой целлюлозы установлено наличие двух фракций: основной с СП в диапазоне от 7500 до 9000 и максимумом при 8500, и минорной фракции - с СП от 5500 до 7500 и максимумом при 6500. Для бактериальной целлюлозы показано наличие двух максимумов на кривой молекулярно-массового распределения - при значении СП 2000 и 6000 [9].

Как и все гидрофильные линейные полимеры, целлюлоза обладает склонностью к образованию первичных фибрилл, в которых группы из 40-60 параллельно

расположенных цепей макромолекул связаны между собой множественными водородными связями, причем восстанавливающие концы всех полимерных молекул фибрилл расположены с одной и той же стороны. В первичных фибриллах (рис.2) однородные высокоупорядоченные кристаллические зоны (кристаллиты) чередуются с неоднородными и менее упорядоченными аморфными зонами [11]. В кристаллитах существует трехмерный дальний порядок в расположении цепей целлюлозы. В аморфных участках дальний порядок отсутствует, а сохраняется лишь общая продольная направленность цепей. В аморфных участках относительно легко могут проходить реакции целлюлозы с другими веществами. Длина макромолекул целлюлозы значительно больше длины кристаллических участков, поэтому каждая макромолекула проходит последовательно ряд кристалли