Регуляция активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина у высших растений

Мирзорахимов, Акобир Каримович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина у высших растений
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина у высших растений"

005006311

Мирзорахимов Акобир Каримович

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.01.04 - биохимия

1 5 ДЕН 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Душанбе-2011

005006311

Работа выполнена на кафедре биохимии и лаборатории ферментологии при кафедре физиологии растений Таджикского национального университета, Лаборатории молекулярной биологии и генной инженерии Института ботаники, физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан.

Научный консультант: заслуженный работник

Республики Таджикистан доктор биологических наук, профессор Бабаджанова

Мухаббат Абдурахмановна

Официальные оппоненты:

заслуженный работник Высшей школы Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор Карначук Раиса Александровна

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Халиков Ширинбек Халикович

доктор биологических наук Нугмонов Мукбил

Таджикский аграрный университет им. Ш. Шотемура

года в <¿0часов на заседании

Защита состоится «

диссертационного совета Д 737.004.05 по защите докторских диссертаций при Таджикском национальном университете по адресу: 734025, Республика Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского национального университета

Автореферат разослан «

_ 2011 года.

Размещён на сайте ВАК www.ed.gov.ru

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент ----З.М.Хамрабаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Эффективность функционирования фотосинтетического аппарата оказывает существенное влияние на рост, развитие и продуктивность растений. Ведущая роль фотосинтеза в продукционном процессе доказана работами многих исследователей (Ничипорович, 1956; 1967; 1982; 1988; Насыров, 1975; 1982; 1982а; 1986; Мокроносов, 1981; 1983; 1988; 1992; Тарчевский, 1977).

В процессе фотосинтеза синтезируются первичная энергия (АТФ, НАДФ Н) и первичные органические вещества, используемые для роста, развития и плодоношения растений. Какие по химической природе вещества, в каком количестве, на каком этапе онтогенеза и в какие органы они будут поступать, зависит продуктивность растений и качество урожая. Каждый из этих этапов подвержен действию имеющихся в живом организме различных типов регуляторных механизмов. Координация всех метаболических процессов и способность организма выполнять свои разнообразные функции осуществляется через регуляцию активности ферментов в клетке. Поэтому выявление регуляторных механизмов, действующих на уровне сложной кооперативной взаимосвязи между ферментной системой фотосинтеза и эпигенетическими процессами является актуальным.

П.Д. Усмановым (1984) была установлена широкая гено-типическая изменчивость признаков фотосинтетического аппарата высших растений.

В 1972-1990 - тые годы М.М. Якубовой с сотрудниками и М.А.Бабаджановой с сотрудниками были проведены комплексные исследования структурно-функциональных особенностей фотосинтетического аппарата у мутантных форм растений с низкой и высокой интенсивностью фотосинтеза и продуктивностью. Проведённые исследования показали, что фотосинтетический аппарат мутантов отличающихся по продуктивности характеризуется рядом физиолого-биохимических особенностей влияющих на его функциональную активность (Якубова и др. 1980; Якубова, Юлдашев, 1983; 1984; 1986; 1989; Бабаджанова, 1990; Бакаева, 1996) .

Любое изменение в организме, в конечном счёте, связано с изменениями, происходящими на молекулярном уровне. По

современным представлениям, одним из ведущих регуляторных механизмов метаболизма на молекулярном уровне является образование разнообразных надмолекулярных комплексов ферментов. Такие комплексы обнаружены при протекании гликолиза, цикл Кребса, окисления жирных кислот, биосинтеза белков и нуклеиновых кислот. (Наградова и др., 1984; Фридрих, 1986; Курганов, 1978; 1984; 1986; 1986а;1992; Курганов и др., 1986; 1989; 1991; Калрельянц, 1988; Каган, 1989; Наградова, 1990; Наградова, Муромец, 1985;1991; Ермаков, 1993).

Ответ на вопрос, способны ли ключевые ферменты фотосинтеза образовывать мультиферментные комплексы, имеет принципиальное значение, так как механизмы регуляции активности ферментов в свободном состоянии и ферментов, встроенных в мультиферментный комплекс различаются.

С 1980-ых годов Бабаджановой М.А. с сотрудниками ведутся комплексные исследования молекулярно-кинетических свойств ключевых ферментов темновой фазы фотосинтеза-рибозофосфатизомеразы (РФИ, КФ 5.3.1.6), фосфорибулокина-зы (ФРК, КФ 2.7.1.19) и рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/ оксигеназы (РБФК/О, КФ 4.1.1.39) из листьев арабидопсиса и хлопчатника. Была установлена кинетическая комплементар-ность этих ферментов и координированная регуляция активности одними и теми же эффекторами, что указывало на объединение их в функциональный кластер (Бабаджанова, 1981; 1981а; 1990; 1990а; Бабаджанова и др., 1985; Бабаджанова, Бакаева, Бабаджанова, 1998; Бабаджанова, Бакаева, Алиев, 1989; 1990). Объединение этих ферментов в структурно-функциональный кластер было доказано выделением из листьев хлопчатника электрофоретически гомогенного ферментного препарата с молекулярной массой 520 кД, у которого были определены рибо-зофосфатизомеразная, фосфорибулокиназная и РБФ-карбоксилазная активности (Бабаджанова, 1990а; Мирзорахимов и др., 1993; 1994).

Затем из листьев хлопчатника, гороха, пшеницы и арабидопсиса при использовании разных методов очистки были выделены мультиферментные комплексы цикла Кальвина с различными величинами молекулярных масс: 180, 240, 400, 480 и 520 кД. У этих отдельно выделенных специфическим для каждого мультиферментного комплекса методом были изучены ки-

нетические параметры ферментов РФИ, ФРК и РБФК/О (Бакаева и др., 1993; 1993а; 19936; 1994; Мирзорахимов и др., 1993; 1994).

Из листьев хлопчатника были одновременно выделены свободный и менбраносвязанный мультиферментные комплексы и проведено сравнительное изучение их каталитических свойств и кинетических параметров (Бабаджанова М.П., Алиев К.А. и др., 1999; 2001; 2001а;2002;2003;2003а).

К настоящему времени установлено, что ферменты цикла Кальвина могут образовывать мультиферментные комплексы с различным числом ферментов - от двух до восьми, различающиеся по молекулярной массе - от 200 до 1000 кД и функциональным свойствам (обзоры: Романова, Павловец, 1997; Бабаджанова М.П. 20бЗ; Оойего, 2002).

Однако, оставались невыясненными причины образования мультиферментных комплексов с такими различными величинами молекулярных масс и функциональной активности и какую роль они играют при фотосинтетической ассимиляции С02 в различных условиях роста и развития растений.

На основании анализа, литературных данных и результатов собственных многолетних исследований нами сделано предположение, что образование разных по молекулярной массе и функциональным свойствам мультиферментных комплексов может быть связано с различным морфофизиологическим состоянием растений, их возрастом, с условиями их выращивания, влиянием факторов внешней среды.

Всё выше изложенное даёт основание считать, что исследование молекулярно-функциональных свойств мультиферментных комплексов цикла Кальвина, выделенных в различные фазы развития растений и влияния на их ферментативную активность разнообразных факторов окружающей среды является весьма актуальным.

Отсутствие комплексных сравнительных исследований структурно-функциональных особенностей мультиферментных комплексов цикла Кальвина у мутантов, отличающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности от исходных форм растений, делают эту работу ещё более актуальной.

Целью настоящей работы являлось: сравнительное исследование возрастных изменений спектра (набора) и функцио-

нальной активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина в листьях хлопчатника, выявление регуляторных механизмов фотосинтетической ассимиляции С02 на основе анализа структурно-функциональных свойств мультиферментных комплексов у различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности исходных и мутантных форм растений, а так же изучение механизмов адаптации активности мультиферментных комплексов к изменяющимся факторам внешней среды.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

- подобрать для листьев хлопчатника и арабидопсиса такие условия выделения электрофоретически - гомогенных препаратов свободных мультиферментных комплексов, которые не вызывали бы денатурацию белков;

- выделить из листьев растений хлопчатника различного возраста свободные мультиферментные комплексы цикла Кальвина и определить у них величины молекулярных масс и активности трёх ферментов рибозофосфатизомеразы (КФ 5.3.1.6), фосфорибулокиназы (КФ 2.7.1.19) и рибулозобис-фосфаткарбоксилаза/оксигеназы (КФ 4.1.1.39);

- выделить из листьев трёх генотипов хлопчатника (сорт 108-Ф, мутант Дуплекс, линия Л-461,) и трёх генотипов арабидопсиса (раса Энкхайм, мутанты - триплекс, 58/15), различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности, мультиферментные комплексы, сравнить их содержание и величины ферментативных активностей;

- изучить влияние условий выращивания растений хлопчатника и гороха на спектр (набор) и ферментативные активности свободных мультиферментных комплексов.

Научная новизна. Из листьев растений хлопчатника различного возраста с помощью методики щадящего выделения получены электрофоретически гомогенные препараты свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина. Впервые установлены возрастные изменения спектра (набора) и ферментативных активностей мультиферментных комплексов цикла Кальвина: в фазе 5-6 настоящих листьев обнаружен один муль-тиферментный комплекс с молекулярной массой 520 ± 20 кД, а начиная с фазы бутонизации два - с молекулярными массами 520 ± 20 кД и 480 ±15 кД.

Установлено, что независимо от величины молекулярной массы мультиферментных комплексов наибольшая рибозофос-фатизомеразная, фосфорибулокиназная и рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилазная активность этих комплексов, как и интенсивность фотосинтеза, проявлялась в фазах бутонизации и цветения растений, то есть в репродуктивную фазу. Такая закономерность свидетельствует о том, что необходимое при формировании репродуктивных органов увеличение количества ас-симилятов связано с возрастанием функциональной активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина.

Обнаружено, что на всех фазах развития растений величины фосфорибулокиназной и рибулозо-1.5-бысфосфаткарбоксилазной активности мультиферментных комплексов в присутствии собственных специфических субстратов были ниже, чем при использовании рибозо-5-фосфата - субстрата первого фермента метаболической последовательности, состоящий из пяти ферментов - рибо-зофосфатизомеразы (КФ 5.3.1.6), фосфорибулокиназы (КФ 2.7.1.19), рибулозобггсфосфаткарбоксилаза/ оксигеназы (КФ 4.1.1.39)' фосфоглицераткиназы (КФ 2.7.2.3.) и глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.13).

Полученные данные являются весьма существенным доказательством преимуществ работы комплекса ферментов в сравнении со свободными формами ферментов. Более высокая каталитическая эффективность работы ферментов в комплексе свидетельствует о проявлении таких механизмов регуляции активности ферментов в мультиферментном комплексе как - «направленный или туннельный перенос метаболитов», координированная и диссоциативная регуляция. Снижение РБФ-карбоксилазной активности по мере уменьшения величины молекулярной массы мультиферментных комплексов указывает на функциональную значимость диссоциативного механизма регуляции карбоксилазной активности РБФК/О, встроенной в муль-тиферментные комплексы с различной молекулярной массой.

ческих механизмов регуляции метаболизма: увеличением количественного содержания мультиферментных комплексов и возрастанием каталитической активности входящих в их состав ферментов, причём эти различия сохранялись при значительном изменении факторов внешней среды (понижение температуры и освещённости). Следовательно, содержание и функциональная активность мультиферментных комплексов являются важнейшими механизмами регуляции фотосинтеза и эпигенеза.

Впервые изучено влияние изменений факторов внешней среды - температуры и освещённости на количественное содержание и ферментативную активность мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника и гороха взятого в качестве классического объекта биохимических исследований.

Установлено, что при пониженных температурах и освещённости независимо от генотипа растения образуется новый тип мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400кД. Полученные результаты дают основание считать, что образование новой разновидности мультиферментного комплекса, является проявлением третьего биохимического механизма регуляции активности ферментов при адаптации растений к изменяющимся условиям окружающей среды.

Практическая ценность Результаты полученных экспериментальных исследований имеют значение для понимания и дальнейшего изучения механизмов регуляции физиолого-биохимических процессов в течение жизни растения и его адаптации к постоянно меняющимся внешним факторам, при решении ряда теоретических и прикладных задач физиологии и биохимии продукционного процесса растений, при разработке тестов в биотехнологической и селекционной работе для оценки продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений, теоретических и прикладных аспектов энзимологии фотосинтеза, а так же для развития теории ферментативного катализа.

Полученные данные можно рекомендовать для чтения лекций по общим курсам биохимии, физиологи растений, спецкурсов по фотосинтезу, энзимологии и экологии на биологических факультетах ВУЗ-ов, а разработанные методы использовать при проведении различных лабораторных практикумов, выполнении дипломных и диссертационных работ.

Положения, выносимые на защиту:

• ведущими биохимическими механизмами регуляции фотосинтетической ассимиляции углекислоты в онтогенезе растений являются изменения спектра (набора) мультифер-ментных комплексов цикла Кальвина, их количественного содержания и функциональной активности ферментов, встроенных в эти комплексы;

• более высокая каталитическая эффективность ферментов цикла Кальвина встроенных в мультиферментные комплексы в сравнении со свободными формами этих ферментов обусловлена проявлением действия важнейших механизмов регуляции активности ферментов в мультиферментных комплексах - «направленный» перенос метаболитов («интерме-диатов») координированная и диссоциативная регуляция;

• характерными физиолого-биохимическими особенностями продуктивных мутантов хлопчатника и арабидопсиса в сравнении с исходными формами растений являются увеличение количественного содержания водорастворимых белков, содержания мультиферментных комплексов и их функциональной активности. Следовательно, возрастание фотосинтетической активности у исследуемых мутантов обусловлено на ряду с другими факторами состоянием ферментной системы цикла Кальвина.

• Адаптация фотосинтетического аппарата к пониженным температурам и освещённости осуществляется благодаря действию находящихся под генетическим контролем трёх биохимических механизмов регуляции метаболизма:

1. увеличение количественного содержания уже имеющихся типов мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520 и 480 кД.

2. возрастание каталитической активности этих мультиферментных комплексов

3. появление нового типа мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400 кД.

Устойчивость мультиферментных комплексов цикла Кальвина в неблагоприятных условиях роста может быть использована в числе других признаков используемых в селекции при выделении высокопродуктиных сортов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на ежегодных апрельских конференциях профессорско-преподавательского состава Таджикского национального университета (Душанбе, 1986; 1987; 1989; 1990; 1991; 1993; 1994; 2007; 2009, 2010; 2011), II-ом Всесоюзном съезде физиологов растений (Минск, 1990), международной конференции «Итоги и перспективы энзимологических исследований метаболизма углерода при фотосинтезе» (16-20 сентября, 1991г., г. Душанбе), V-ой Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991), 1-ой Конференции биохимиков Таджикистана (Душанбе, 1993), П-ой Конференции биохимического общества республики Таджикистан «Проблемы биохимии» (Душанбе, 1996), международной научной конференции «Достижения современной физиологии растений: теоретические и прикладные аспекты», посвященной памяти академика АН Республики Таджикистан Ю.С.Насырова (Душанбе, 2008), международной конференции «Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане» (Душанбе, 2009).

Структура и объем работы Диссертация изложена на 211 страницах и состоит из введения, 6 глав (обзор литературы; экспериментальная часть - объекты и методы исследований; четырёх глав - результаты исследований), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего в себя 284 источника, из них 79 иностранных авторов. Работа содержит 28 таблиц, 32 рисунка.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 работы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследований

Источником получения ферментных препаратов служили листья сельскохозяйственной культуры - средневолокнистого хлопчатника {Gossypiym hirsutum L, семейство Malvaceae) сорта 108-Ф, его мутанта Дуплекс и инбредной линии Л-461, модельного объекта - арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh), семейство Cmciferae расы Энкхайм, его мутантов - триплекс, 58/15, а также

гороха (Pisum sativum L.,семейство Leguminosae), сорта Крепыш, как классического объекта биохимических исследований.

Исследованиями Якубовой М.М. и сотр. (Якубова и др., 1980; 1984; Кононенко, 1983; Юлдашев, 1985; Хамрабаева, 1992) установлено, что листья исходных и мутантных форм хлопчатника и арабидопсиса различались по структурно-функциональным особенностям фотосингетического аппарата, эффективности протекания первичных световых реакций, скорости синтеза транспортного продукта - сахорозы и т.д., а также интенсивности фотосинтеза и продуктивности.

Хлопчатник сорта 108-Ф, мутант Дуплекс и инбредная линия Л-461 выращивались в полевых условиях на экспериментальном участке Института ботаники, физиологии растений и генетики АН Республики Таджикистан (Гиссарская долина, г. Душанбе, 830 м над ур. моря).

Исходная раса арабидопсиса Энкхайм и мутанты триплекс, 58/15 выращивались в ящиках в оранжерее при оптимальных условиях - температура 20-25°С, почва (перегной, песок, 1:2), относительная влажность 70-80%, освещённость 20-25 тыс. люкс. (Иванов, 1974).

Определение содержания белка. Количественное содержание белка определяли по методу Лоури и др. (Lowry et al, 1951) или с реактивом Бенедикта (Кочетов, 1980). Измерения велись при длине волны 330 нм на высокочувствительном спектрофотометре ULTROSPEC II (LKB, Швеция) с полной шкалой от 0 до 0,001 экстинции.

Определение ферментативных активностей мультифер-ментных комплексов. Рибозофосфатизомеразную активность определяли по модифицированному методу Аксельрода и Янг (Axelrod, Jang, 1954). Определение продукта реакции - кетосаха-ра рибулозо-5-фосфата проводили карбазольным методом по реакции Дише (Dische, Borenfreund, 1951).

Фосфорибулокиназную активность определяли по методу Гурвитца и др. (Hurwitz et al., 1956). Количество щелочегидро-лизуемого фосфора определяли по методу Фиске-Суббароу (Лоури-Jlonac) в модификации Скулачева (Кочетов, 1980).

Активность РБФК/О определяли радиометрически или спектрофотометрическим по методике Рэккера, модифицированной А.К.Романовой (1980).

Получение электроФеретически гомогенных ферментных препаратов. При получении ферментных препаратов из листьев хлопчатника в соответствии со специфическими особенностями объектов использовали общепринятые приёмы очистки, модифицировав методику получения и очистки экстракта.

Определение гомогенности и молекулярной массы ферментных препаратов. Аналитический диск-элекрофорез в 7.5% полиакриламидном геле использовали для определения гомогенности ферментных препаратов и их молекулярной массы. Молекулярную массу определяли по калибровочному графику, построенному по относительной электрофоретической подвижности белков-метчиков.

Полученные результаты обработаны статистически (Ур-бах, 1964; Методы биохимического анализаД978; Лакин,1973).

Представленные данные достоверны при доверительной вероятности 97-99%.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ НА РАЗДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА И ИХ ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ АКТИВНОСТИ ИЗ ЛИСТЬЕВ ХЛОПЧАТНИКА

СОРТА 108-Ф.

Хлопчатник является для энзимологических исследований очень трудным, специфическим объектом из-за содержания в его листьях большого количества фенольных соединений. В связи с этим нами была модифицирована методика получения и очистки экстракта, а так же изучено влияние на выделение мультиферментных комплексов различных величин рН в течение всех процедур очистки и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе при ступенчатом и линейном градиентах концентраций №С1.

3.1. Выделение мультиферментных комплексов при рН 8.0 и ионообменной хроматографии при различных градиентах концентрации

Для наших методических исследований были выбраны растения хлопчатника в фазе начала бутонизации.

На рисунках 1,3 представлены профили элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе свободных белков, выделенных при значении рН 8.0 в течение всех процедур очистки и ионообменной хроматографии ступенчатым и линейным градиентом концентраций КаС1.

На рис. 1 видно, что белки элюировались в виде двух нечётких пиков, причём второй был очень широким. Для определения гомогенности, молекулярной массы и активности ферментов нами были выбраны белки фракций 5 и фракции 15.

Для определения величин молекулярных масс белковые фракции 5 и 15 по отдельности и их смесь подвергали диск-электрофорезу в 7.5% ПААГ. На рис. 2а видно, что смесь белков фракций 5 и 15 (рис. 1) разделилась на две полосы. Белки фракции 5, а также фракции 15, нанесенные по отдельности, проявились в виде одной полосы (рис. 26 и 2в). Молекулярная масса белков фракции 15 (рис. 26) составляла 520 ± 20 кД. Белок фракции 5 (рис. 2в) имел большую электрофоретическую подвижность по сравнению с белком фракции 15 (рис. 26), и его молекулярная масса равнялась 480 ± 15 кД.

500

NaCIwM

I 4 7 10 13 16 19 22 25 28 помер фракции

сорт 108-Ф

|-Ступенчатый градиент

концентраций NaCl

Piic.1. Профиль эшоцго! белков выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе начала бутонизации, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе ступенчатым градиентом концентраций NaCl, pH 8.0.

1 4 7 10 13 16 1922 25 2831 Номер фрикцн

-о-Сорт 108-Ф

Линейный градиент концентраций. NaCl

Рис. 3. Профиль элюции белков выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе начала бутонизации, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе линейным градиентом концентраций NaCl, pH 8.0.

* <« > ( О > { ,) >

I...............

I К1Ж

« АЛ» •

Рис.2. Электрофорез в 7.5% ПААГ белков, выделенных при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе из листьев хлопчатника в фазе бутонизации.

а - смесь белков фракций 5 и 15; б - фракция 15; в - фракция 5.

На рис. 3 видно, что белок элюировался в виде двух более чётких пиков, чем при ступенчатом градиенте концентраций МаС1. Для определения гомогенности, молекулярной массы и активности ферментов были выбраны белки фракций 4 и 18. Белок фракции 4 имел молекулярную массу 480±15кД а белок фракции 18 - 520 ±20.

В табл. 1 приведены данные о величинах активностей обоих мультиферментных комплексов выделенных при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе при рН 8.0 ступенчатым и линейным градиентом концентрации ЫаС1.

Из приведенных в табл. 1 данных видно, что мультифер-ментные комплексы не различались по величинам рибозофосфа-тизомеразной и фосфорибулокиназной активности. По величинам же РБФ-карбоксилазной активности мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520кД выделенный при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе при рН 8.0 ступенчатым градиентом концентрации Ка€1 превосходил мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480кД в 4 раза, а выделенный линейным градиентом ШС1 превосходил мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480кД по РБФ-карбоксилазной активности в 3.6 раз.

В результате проведённых экспериментов можно сделать вывод, что независимо от ступенчатого или линейного градиента концентраций КаС1 при ионообменной хроматографии мультиферменг-ные комплексы не различались по величинам рибозофосфатизоме-разной и фосфорибулокиназной активности.

Таблица 1.

Активности мультиферментных комплексов (МФК) выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф при рН 8.0 и ионообменной хроматографии при ступенчатом и линейном градиенте концентраций N80 рН 8.0. Фаза развития растений начало бутонизации.

Мол. масса МФК, кД Тип активности Субстрат Удельная активность, мкмоль продукта/ мин. на 1 мг белка.

Ступенчатый Линейный

520 480 Рибозофосфатизоме-разная Рибозо- 5-фосфат 1357 ±21 1298±17 1366±19 1372±22

520 480 Фосфорибулокиназная Рибуло- 30-5- фосфат 1341±20 1348±20 1322±19 1341±20

520 480 РБФ-карбоксилазная РБФ 0.53±0.01 0.13±0.01 0.82±0.01 0.22±0.01

Что же касается величины РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов с различной молекулярной массой выделенных при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе линейным градиентом концентраций ШС1, то они были значительно выше, чем при использовании ступенчатого градиента концентраций №С1. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД, выделенный линейным градиентом концентраций №С1, превосходил в 2 раза по РБФ-карбоксилазной активности аналогичный комплекс, выделенный ступенчатым градиентом концентраций КаС1. РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного линейным градиентом концентраций №С1, была выше на 56% в сравнении с активностью мультиферментного комплекса, выделенного ступенчатым градиентом концентраций №С1.

3.2. Выделение мультиферментных комплексов при рН 8.5 и ионообменной хроматографии при различных градиентах концентрации

На рисунках 4-5 представлены профили элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе свободных белков, выделенных при значении рН 8.5 во время получения экстракта и буфера с рН 8.3 в течение всех остальных процедур очистки и ионообменной хроматографии ступенчатым и линейным градиентом концентраций ШС1.

NaCl мМ

1,2 "

S s 0.8

б d 0-<

I = »

I ! 9 1з 17 п га 21 Номер фрякшш

—»—Сорт 108-Ф

I СгувСичатый градиент кмшешраний, ]ЧаС"1

Рис. 4. Профиль элюции белков выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе начала бутонизации, при ионообменной хро-матогрбафии на ДЭАЭ - целлюлозе ступенчатым градиентом концентраций Ка(Д рН 8.3.

ДХ f ■ ■ 1«) z

0 ЬГам.птч.им.мнпмн.! 0 1 -I 7 tOU 16 1922 252831 Номер фракшш

—•—Copv 108-Ф

..........Лниепнын 1 (EiitiLMif kijiitstni¡xmmi,NaCl

Рис. 5. Профиль элюции белков выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе начала бутонизации, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе линейным градиентом концентраций NaCl, рН 8.3.

На рис. 4 видно, что белки элюировались в виде одного большого пика с пологами плечами и одного маленького. Для анализов были выбраны белки фракции 4 и 13. Молекулярная масса белка фракции 4 составляла 480±15кД, а фракции 13 -520±20кД.

На рис. 5 видно, что белки элюировались в виде двух чётких пиков. Для анализов были выбраны белки фракции 4 и 16. Молекулярная масса белка фракции 4 составляла 480±15кД, а фракции 16 - 520±20кД.

Результаты определения активности этих мультиферментных комплексов представлены в табл. 2.

Из представленных в табл. 2 данных видно, что мультиферментные комплексы почти не различались по рибозофосфа-тизомеразной и фосфорибулокиназной активности. По величинам же РБФ-карбоксилазной активности независимо от градиента концентраций №С1 мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 кД значительно превосходили мультиферментные комплексы с молекулярной массой 480 кД. Выделенные линейным градиентом №С1 мультиферментные комплексы по РБФ-карбоксилазной превосходили аналогичные мультиферментные комплексы, выделенные ступенчатым градиентом концентраций ЫаС1.

Таблица 2

Активности мультиферментных комплексов (МФК), выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф при рН 8.5 и ионообменной хроматографии при рН 8.3 ступенчатым и линейным градиентом концентраций №С1. Фаза развития растений - начало бутонизации.

Мол. масса МФК, кД Тип активности Субстрат Удельная активность, мкмоль продукта/ мин. на 1 мг белка.

Ступенчатый Линейный

520 480 Рибозофосфатизоме-разная Рибозо- 5-фосфат 2281±24 2116 ±23 3418±30 3210±27

520 480 Фосфорибулокиназная Рибуло- зо-5-фосфат 2307±20 2267±19 3375±21 3199±17

520 480 РБФ-карбоксилазная РБФ 1.44±0.01 0.19±0.01 1.51±0.01 0.95±0.01

Таким образом, чёткое разделение мультиферментных комплексов и наибольшие величины всех ферментативных активностей были получены при использовании для получения экстракта из листьев буфера со значением рН 8.5 и при ионообменной хроматографии с буфером рН 8.3 линейным градиентом

концентраций NaCI. В связи с этим, данный метод выделения свободных мультиферментных комплексов был использован нами в последующих исследованиях.

ГЛАВА 4. ОБРАЗОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ОНТОГЕНЕЗЕ ХЛОПЧАТНИКА

4.1. Возрастные изменения активности свободных мультиферментных комплексов.

В работе (Suss et al., 1993) установлено, что свободные мультиферментные комплексы цикла Кальвина элюировались в широком диапазоне концентраций КС1 - О-бООмМ. Молекулярная масса мультиферментных комплексов составляла от 200 до 1000 кД.

Ранее из листьев хлопчатника были выделены свободные мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 и 240 кД (Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев К.А., 2006). Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 240 кД был выделен в денатурирующих условиях, как и комплекс из листьев шпината с молекулярной массой 284 кД (Rault et al., 1993). Денатурирующие условия при выделении мультиферментных комплексов были использованы для диссоциации их на мультиферментные комплексы с меньшими величинами молекулярных масс.

При выделении из листьев хлопчатника в фазах бутонизации и цветения мультиферментного комплекса в обычных щадящих условиях на профиле элюции свободных белков при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе суммарный белок выходил в виде двух отчётливых пиков, резко различавшихся по содержанию белка. Фракция с наибольшим содержанием белка представляла собой мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД. У фракции с меньшим содержанием белков не была определена ни величина молекулярной массы, ни ферментативные активности (Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев, 2002, 2006).

На рис. 6 изображён профиль элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе линейным градиентом

концентраций №С1 свободных белков, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе 5-6 настоящих листьев.

t> и

г s

сЗ "й

* 2

,1 ,1_I_I_L—

500

400

300

200v

100

Н'?мер фракции

Рис. 6. Профиль элюцпи белков, выделенных ю листьев хлопчатника в фазе 5-6 настоящих листьев, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе линейным градиентом концентраций №С1.

123456789 10 Номер фракции Рис. 7. Профиль эяюции белков выделенных из листьев хлопчатника в фазе бутонизации, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе линейным градиентом концентраций №С1.

Как видно на рисунке 6, белки элюировались в виде одного отчётливого пика. Наибольшее количество белка элюирова-лось во фракциях 3,4,5 при концентрации NaCl 100,150 и 200 мМ соответственно. В фазе бутонизации (рис. 7) отчётливо видны два пика (фракция 4 и 8), резко различавшихся по содержанию белка. При выделении мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника в фазе массового цветения профиль элю-ции белков был такой же, как и в фазе бутонизации. Белки фракции 4 элюировались при концентрации NaCl 150-160 мМ, а белки фракции 8 - при концентрации NaCl 370-380 мМ. Белки фракции 4 (рис.6,7) и 8 (рис. 7) брали для определения молекулярной массы и активности ферментов.

Белки 1-го пика (рис. 5.6, фракция 4) проявились в виде одной полосы, молекулярная масса которого оказалась равной 520 ± 20 кД. Начиная с фазы бутонизации растений обнаруживался второй мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 ± 15 кД (рис. 7, фракция 8).

В табл. 3 приведены результаты определения активностей этих мультиферментных комплексов.

В приведённых в табл. 3 данных видно, что независимо от величины молекулярной массы на всех фазах развития растений

фосфорибулокиназная и РБФ-карбоксилазная активности муль-тиферментных комплексов были выше при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата + АТФ, а не в присутствии собственных специфических субстратов рибулозо-5-фосфата+АТФ для фосфорибулокиназы и рибулозэ -1.5-бисфосфата для РБФ-карбоксилазы.

Таблица 3

Активности мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф на различных фазах развития растений.

Мол.м., КД Тип активности Субстрат Активность на различных фазах, мкмоль про-дукта/(мин. мг белка)

5-6 настоящих листьев Бутонизация Цветение

520 Рибозофосфатизо-меразная (РФИ) рибозо-5-фосфат 2673±16 3080 ± 18 3376 ± 20

480 не обнаружен 3041 ± 17 3345 ± 20

520 Фосфорибулокиназная (ФРК) рибозо-5-фосфат + АТФ 3490 ±21 4185 ± 26 4432 ± 28

480 не обнаружен 3597± 21 3794 ± 25

520 рибуло- 30-5-фосфат +АТФ 3122 ±19 3604 ± 24 3715 ± 23

480 не обнаружен 3412 ± 20 3518 ± 22

520 Рибулозобмсфос- фаткарбокси- лазная рибозо-5-фосфат + АТФ 1.38 ± 0.01 1.92 ± 0.01 2.33 ± 0.01

480 не обнаружен 1.68 ± 0.01 2.11 ± 0.01

520 РБФ 1.14 ± 0.01 1.55 ± 0.01 1.86 ± 0.01

480 не обнаружен 1.45 ± 0.01 1.74 ± 0.01

В фазе массовой бутонизации по сравнению с фазой 5-6 настоящих листьев величины различных типов активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД была значительно выше. Рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность возросла на 16%, фосфорибулокиназная активность при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата + АТФ была выше на 20%, а в присутствии собственного специфического субстрата рибулозо-5-фосфата + АТФ - на 15%. РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса при использованиив качестве субстрата рибозо-5-фосфата + АТФ увеличилась на 39%, а в присутствии собственного специфического субстрата рибулозо-1,5-бисфосфата- на 36%.

Величины всех типов активностей мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД были ниже в сравнении с величинами акимвностей мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520кД.

В фазе цветения по сравнению с фазой бутонизации рибо-зофосфатизомеразная активность у обоих мультиферментных комплексов возрасла на 10%. Фосфорибулокиназная активность как в присутствии собственного специфического субстрата, так и в присутствии рибозо-5-фосфата+АТФ почти не изменилась у обоих мультиферментных комплексов. РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса с мол. м. 520 кД независимо от субстрата была выше на 7-10%, чем у мультиферментного комплекса с мол. м. 480 кД. При этом активность комплекса с мол. м. 520 кД в присутствии собственного специфического субстрата возрасла на 20%, а при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата+АТФ - на 26%.

Таким образом, в фазе цветения ферментативная активность мультиферментных комплексов была наибольшей независимо от величины молекулярной массы.

ГЛАВА 5. АКТИВНОСТЬ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕР-МЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ИСХОДНЫХ И МУТАНТНЫХ ФОРМАХ РАСТЕНИЙ.

5.1. Ферментативные активности свободных гдульти-ферментных комплексов, выделенных га листьев хлопчатника сорта 108-Ф, его мутанта Дуплекс и инбредной линии Л-461.

Выделение и очистка ферментных препаратов, определение их активности проводились многократно. Поскольку во всех случаях были получены очень близкие результаты, в работе приведены типичные примеры.

Сравнительные исследования активностей мультифер-ментных комплексов из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс проводились на электрофоретически гомогенных препаратах, выделенных одновременно (в один и тот же день, в один и тот же час) в фазе бутонизации растений.

Профиль элюции свободных белков выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе линейным градиентом концентраций №С1 приведён на рис. 8.

Из представленных на рисунке 8 данных видно, что в обоих случаях белки элюировались в виде двух отчётливых пиков, резко различающихся по содержанию белков. По содержанию белка во фракции 6 (пик I) и во фракции 15 (пик II) мутант Дуплекс превосходил исходный сорт хлопчатника 108-Ф. Белки фракции 6 и 15 брали для определения молекулярной массы и активности ферментов.

Для обоих объектов получены аналогичные результаты. Молекулярная масса белка I пика (фракция 6) составляла 520±20кД, а белка П-го пика (фракция 15) - 480±15кД.

£ ч

5 5

5 "5

а *

2- а а ч

14 - 2 500

12 400

10 -

8 - У / - 300 § %

6 - / 200 и я г

4 / /

2 , 0 /% 1 1 1 1 1 1 1 1 трет.! 1 и 1,-1 „ХЖЗ 100 0

I 3 5 7 9 И 13 15 17 19 Номер фракции

-»-Сорт 108-Ф Мутант Дуплекс

Линейный градиент концентраций, N801 Рис. 8. Профиль элюции свободных белков выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф (1) него мутанта Дуплекс (2) в фазе бутонизации при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - целлюлозе линейным градиентом концентраций N301.

Результаты определения активностей электрофоретически гомогенных мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс приведены в таблице 4.

Из приведённых в табл. 4 данных видно, что мультифер-ментные комплексы выделенные из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и у мутанта Дуплекс в фазе бутонизации, почти не различались по величинам рибозофосфатизомеразной и фосфорибу-локиназной активности. Различия между мультиферментными комплексами были выявлены только по величинам РБФ-карбоксилазной активности. По величинам РБФ-карбоксилазной активности мультиферментные комплексы с различной молекулярной массой, выделенные из листьев мутанта Дуплекс значительно - на 35-36% превосходили аналогичные мультиферментные комплексы, выделенные из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф.

Таблица 4

Активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его продуктивного мутанта Дуплекс в фазе бутонизации растений.

Мол. масса, цЦ Тип активности Субстрат Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка

Сорт 108-Ф Мутант Дуплекс

520 480 Рибозофосфатизо-меразная Рибозо-5-фосфат 3010±31 2975±30 3175±33 3080±29

520 480 Фосфорибулокиназ-ная Рибулозо-5-фосфат 3625±38 3360±37 3820±41 3405±36

520 480 Рибулозобисфосфат-карбоксилазная Рибулозо- 1,5-бисфосфат 1.4б±0.05 0.92±0.05 1.98±0.05 1.25±0.05

Поскольку листья инбредной линии Л-461, как и у мутанта Дуплекс отличались от листьев хлопчатника сорта 108-Ф по форфобио-логичеким характеристикам, показаниям фотосинтеза и продуктивности, то было важно выделить мультиферментные комплексы из листьев этого генотипа хлопчатника. Из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и инбредной линии Л-461 в фазе массового цветения - начала пло-дообразования, одновременно были выделены элекгрофоретически гомогенные препараты свободных мультиферментных комплексов и определена их рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность.

Профиль элюции свободных белков, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и линии Л-461 при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе линейным градиентом концентраций №С1 представлен на рис. 9.

На рис. 9 видно, что белки элгоировались в виде двух отчётливых пиков, резко различающихся по содержанию белка. По содержанию белка во фракции 4 сорт 108-Ф уступал линии Л-461 почти на 50%. Белок фракции 4 (1 пик) - это мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД, а белок фракции 8 (2 пик) -мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 кД.

0123456789 10

Номер фракции 0 Лини» Л-461 —^СортШ-Ф

"■"""•Линейный 1радиент концентраций ,\'аС1

Рис. 9. Профиль элюции свободных белков, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и линии Л-461, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе лннеГшым градиентом концентраций №С1.

Результаты определения рибулозобмсфосфаткарбоксилаз-ной активности мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520 и 480 кД приведены в табл. 5.

Таблица 5

Рибулозобисфосфаткарбокснлазная активность мультиферментных комплексов цикла Кальвина из листьев различающихся по продуктивности генотипов хлопчатника. Фаза развития растений - массовое цветение - начало плодообра-

зовання.

Объект РБФ-карбоксилазная активность МФК, мкмоль С02/мин на 1 мг белка

520 кД 480 кД

Сорт 108-Ф 2.19 ±0.01 1.36 ±0.01

Линия Л-461 2.73 ± 0.01 2.13 ±0.01

Из приведенных в табл.5 данных видно, что мультифер-ментный комплекс с молекулярной массой 520 кД (1 пик, фракция 4), выделенный из линии хлопчатника Л-461, по рибулозо-бисфосфаткарбоксилазной активности превосходил сорт 108-Ф на 24%. Величина рибулозобисфосфаткарбоксилазной активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД (2 пик, фракция 8), выделенного из листьев хлопчатника сор-

та 108-Ф, была меньше на 56% в сравнении с активностью такого же мультиферментного комплекса, выделенного из листьев продуктивной линии JI-461.

Таким образом, мутант Дуплекс и инбредная линия JI-461 отличались от сорта 108-Ф и высоким содержанием водорастворимых белков в экстрактах из листьев, и высоким содержанием мультиферментных комплексов и большей рибулозобисфосфат-карбоксилазной активностью (Бабаджанова; Мирзорахимов и др., 1993; 20076; 2010).

5.2. Ферментативные активности мультиферментных комплексов из листьев арабидопсиса исходной расы Энк-хайм и его мутантов триплекс, 58/15.

Сравнительные исследования ферментативных активностей мультиферментных комплексов из листьев исходной формы арабидопсиса Энкхайм и его двух мутантов проводились на электрофоре-тически гомогенных ферментных препаратах, выделенных одновременно из листьев растений в фазе сформировавшейся розетки.

Профиль элюции свободных белков, выделенных из листьев арабидопсиса расы Энкхайм и его мутанта триплекс при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в фазе формировавшейся розетки представлен на рис. 10.

Номер фракции входная раса Энкхайм мутант т риплекс

-Линейный градиент концентраций N30

Рис.10. Профиль элюции свободных белков, выделенных из листьев арабидопсиса расы Энкхайм (I) и его мутантов триплекс (П) в фазе розетки при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе линейным градиентом концентраций КаС1.

На рис. 10 видно, что белки элюировались в виде двух отчётливых пиков, резко различавшихся по содержанию белка. По содержание белка во фракции 8 (пик 1) мутант триплекс превосходил исходную расу Энкхайм. Белки фракций 8 и 20 брали для определения молекулярной массы и активности ферментов. Молекулярная масса белка фракции 8 была равна 520 ± 20 кД, а белка фракции 20 - 480 ± 15 кД.

В табл. 6 приведены результаты определения ферментативных активностей этих мультиферментных комплексов.

Таблица 6

Активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев арабидопсиса расы Энкхайм и его продуктивного мутанта триплекс в фазе сформировавшейся розетки.

Мол.масса, кД Тип активности Субстрат Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка

Роса Энкхайм Мутант триплекс

520 480 Рибозофосфатизо-меразная рибозо-5-фосфат 2972±28 2986±27 3021±32 2992±30

520 480 Фосфорибулокиназ-ная рибулозо-5-фосфат 2425±22 2375±24 3606±38 3101±33

520 480 Рибулозобисфосфат-карбоксилазная рибулозо- 1,5- бисфосфат 1.67±0.05 1.24±0.05 1.96±0.05 1.45±0.05

Из представленных в табл. 6 данных видно, что у обоих объектов мультиферментные комплексы не различались по величинам рибозофосфатизомеразной активности.

Мультиферментные комплексы с различной молекулярной массой выделенные из листьев исходной расы арабидопсиса Энкхайм не различались по величинам фосфорибулокиназной

активности. У мутанта же триплекс мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил по фосфори-булокиназной активности на 16% мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 кД.

По величинам РБФ-карбоксилазной активности мульти-ферментные комплексы с молекулярной массой 520 кД у обоих объектов превосходили мультиферменгные комплексы с молекулярной массой 480 кД на 34-35%.

Величины всех ферментативных активностей мультифер-ментных комплексов, выделенных из листьев исходной расы Энкхайм были значительно ниже в сравнении с активностями мультиферментных комплексов, выделенными из листьев мутанта триплекс. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД, выделенный из листьев мутанта триплекс превосходил аналогичный мультиферментный комплекс листьев исходной расы Энкхайм по фосфорибулокиназной активности на 48%, а по РБФ-карбоксилазной -на 17%.

Величины активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного из листьев мутанта триплекс, в сравнении с активностями аналогичного комплекса листьев исходной расы Энкхайм также были выше: фосфорибу-локиназная - на 31%, РБФ-карбоксилазная - на 20%.

Номер фракции -a-MjniHTia/li * I!с\<1днйм раса

—ЛинеШгмй Г[Hiini-tti K-oHuemßaimtl NaCI

Рис. 11. Профиль элюции свободных белков, выделенных из листьев ара-бвдопсиса расы Энкхайм (I) и его мутанта 58/15 (П) в фазе розетки, при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе с линейным градиентом

концентраций NaCl.

На рис. 11 представлен профиль элюции при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе свободных белков, выделенных из листьев арабидопсиса росы Энкхайм и его низкопродуктивного мутанта 58/15.

Как видно из рис. 11 белки элюировались в виде двух отчётливых пиков, резко отличающихся по содержанию белка. Белки первого пика (фракция 8) имели молекулярную массу 520±20 кД, молекулярная масса белков второго пика (фракция 20) оказалась равной 480 кД.

В табл. 7 представлены результаты определения активностей мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520 и 480 кД, выделенных из листьев мутанта 58/15 в фазе сформировавшейся розетки.

Таблица 7

Активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев низкопродуктивного мутанта арабидопсиса 58/15.

Мол.масса, кД Тип активности Субстрат Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка

520 480 Рибозофосфатизомеразная рибозо-5-фосфат 2042±23 1811±20

520 480 Фосфорибулокиназная рибулозо-5-фосфат 2056±22 1895±19

520 480 Рибулозобмсфосфат-карбоксилазная рибулозо- 1,5-бмсфосфат 1.41±0.05 1.12±0.05

Из представленных в табл. 7 данных видно, что мульти-ферментные комплексы почти не различались по величинам ри-бозофосфатизомеразной активности. Различия менаду мульти-ферментными комплексами наблюдались по фосфорибулоки-назной и РБФ-карбоксилазной активности. Мультиферментный

комплекс с молекулярной массой 520кД превосходил мулъти-ферментный комплекс с молекулярной массой 480кД по величине фосфорибулокиназной активности на 11%, а по величине РБФ-карбоксилазной активности - в 2.6 раза.

При сравнении ферментативных активностей мультиферментных комплексов, выделенных из листьев исходной расы Энкхайм и его мутантов наибольшие различия между ними выявлены по величинам фосфорибулокиназной и РБФ-карбоксилазной активности. По величинам этих активностей мультиферментные комплексы, выделенные из листьев продуктивного мутанта триплекс, значительно превосходили аналогичные мультиферментные комплексы, выделенные из листьев исходной расы Энкхайм и его низкопродуктивного мутанта 58/15.

Таким образом, независимо от генотипов растений мультиферментные комплексы, выделенные из листьев продуктивных мутантов, значительно превосходили исходные формы по содержанию водорастворимых белков в экстрактах из листьев мультиферментных комплексов и РБФ-карбоксилазной активности.

ГЛАВА 6. МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К ВНЕШНИМ ФАКТОРАМ АКТИВНОСТИ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ЛИСТЬЯХ ХЛОПЧАТНИКА И ГОРОХА.

Адаптация к высоким температурам и освещённости мультиферментных комплексов листьев хлопчатника в фазе бутонизации растений.

Для хлопчатника характерен длинный вегетационный период (120-150 дней). В течение этого периода происходят значительные сезонные изменения температуры, влажности воздуха, освещённости и т.д. В годы, когда лето было прохладным, температура и освещённость понижены, нами наблюдалось увеличение содержания водорастворимых белков в листьях хлопчатника в расчёте и на г сырого веса листьев, и на дм2 площади листа (Бакаева, Бабаджанова, 1984; Бабаджанова, Мирзорахимов и др., 1993). Для других культур(Удовенко, 1979; 1979а; Дроздов и др., 1980; Акимова и др., 1982; Филимонов, 1984) также

было установлено увеличение содержания водорастворимых белков как при холодовом, так и при тепловом закаливании активно вегетирующих растений.

В связи с этим представляется важным для выяснения адаптивности провести сравнительные исследования ферментативных активностей свободных мультиферментных комплексов, выделенных из листьев растений исходного сорта хлопчатника 108-Ф и его мутанта Дуплекс, высеянных как обычно весной и в августе. При посеве семян хлопчатника в августе в «естественной» лаборатории происходило постепенное или резкое изменение комплекса внешних факторов - температуры и влажности воздуха, почвы, освещённости и т.д.

В табл. 8 представлены результаты определения ферментативной активности мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф весеннего посева в фазе бутонизации растений.

Из представленных в табл. 8 данных видно, что величины ферментативных активностей мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев исходного сорта хлопчатника 108-ф и его мутанта Дуплекс, имели очень близкие величины рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности, но различались по РБФ-карбоксилазной активности. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД, выделенный из листьев мутанта Дуплекс, по РБФ-карбоксилазной активности превосходил на 36% мультиферментный комплекс с такой же молекулярной массой, выделенный из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф. РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного из листьев мутанта Дуплекс, была выше на 25% активности мультиферментного комплекса, выделенного из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф.

Таблица 8

Активность мультиферментных комплексов (МФК) с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и высокопродуктивного мутанта Дуплекс в фазе бутонизации растений (1991).

Мол.масса кД Дата выде лени я МФК Температура С Тип активности Субстрат Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1 мг белка

День Ночь 108-Ф Дуплекс

520 480 6-10 июля 3036 18-23 Рибозо- фос-фатизо-меразная рибозо-5-фосфат 3119±33 2981±30 3237±34 3117±33

520 480 фосфо-рибу-локиназ-ная рибозо-5-фосфат 4012±43 3575±37 4126±45 3680±38

520 480 РБФ-карбокси-лазная рибулозо- 1,5-бисфосфат 1.40±0.05 0.90±0.05 1.91±0.05 1.Ш0.05

6.2. Защитно-приспособительные механизмы адаптации к пониженным температурам и освещённости активности мультиферментных комплексов листьев хлопчатника в фазе бутонизации.

В табл. 9 представлены результаты определения ферментативной активности мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс при выделении их из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и мутанта Дуплекс осеннего посева, в фазе бутонизации растений, когда была солнечная погода и температура воздуха для хлопчатника днём и ночью имела благоприятные физиологические значения (1-ое выделение).

Независимо от времени выделения и величины молекулярной массы мультиферментные комплексы, выделенные из листьев мутанта Дуплекс, имели большие значения величин всех типов ферментативных активностей в сравнении с мульти-ферментным комплексами выделенными из листьев исходного сорта хлопчатника сорта 108-Ф.

Таблица 9

Ферментативная активность мультиферментных комплексов (МФК) с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и мутанта Дуплекс в фазе бутонизации растений (осенний посев, август

1991г.).

Мол.масса кД Дата выде ле-ния Температура С Тип активности Суб-стра т Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка

МФК День Ночь 108-Ф Дуплекс

520 480 Рибозо- фос фатизо меразная Ри- бозо- 5-фосфат 3542±37 3388±35 4074±42 4049±41

520 480 8-10 октября сол- 2429 1621 Фосфо- рибу локиназ-ная Ри- бозо- 5-фосфат 4496±46 3345±35 4542±48 4113±43

неч- Ри-

520 480 но РБФ- карбокси-лазная було- 301,5-бис фосфат 2.52±0.05 2.0 ±0.05 2.72±0.05 2.31±0.05

При сравнении величин ферментативных активностей мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс выделенных из листьев хлопчатника весеннего и осеннего посева (I - выделение) в фазе бутонизации растений видно, что выделенные осенью мультиферментные комплексы имели более высокие величины всех ферментативных активностей.

Выделенный осенью из листьев хлопчатника сорта 108-Ф мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД пре-

восходил аналогичный мультиферментный комплекс, выделенный весной, по рибозофосфатизомеразной активности - на 13%, по фосфорибулокиназной активности - на 11%, а по РБФ-карбоксилазной активности - на 80%. У мультиферментного комплекса, с молекулярной массой 480 кД, выделенного осенью, в сравнении с аналогичным комплексом, выделенная весной, рибо-зофосфатизомеразная активность была выше на 13%, фосфорибу-локиназная активность - на 12%, РБФ-карбоксилазная - в 2.2 раза.

Выделенный осенью из листьев мутанта Дуплекс мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил аналогичный мультиферментный комплекс, выделенный весной, по рибозофосфатизомеразной активности - на 25%, по фосфорибулокиназной активности - на 10%, а по РБФ-карбоксилазной активности - на 42%. У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного осенью, в сравнении с мультиферментным комплексом, выделенным весной, рибозофосфатизомеразная активность была выше на 29%, фосфорибулокиназная активность - на 24%, РБФ-карбоксилазная - в 2.0 раза.

В табл. 10 представлены результаты определения ферментативных активностей мультиферментных комплексов, выделенных через 2 недели после 1-го выделения из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и мутанта Дуплекс осеннего посева, в фазе бутонизации растений.

Из представленных в табл. 10 данных видно, что в сравнении с первым выделением мультиферментных комплексов при втором выделении температура воздуха, снизилась на 8-9°С, освещённость также была ниже, погода была пасмурной. При этих условиях был выделен мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД и мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400 кД.

Из представленных в табл. 10 данных видно, что выделенные из листьев обоих объектов мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 кД превосходили мультиферментные комплексы с молекулярной массой 400 кД по величинам рибозофосфатизомеразной, фосфорибулокиназной и РБФ-карбоксилазной активности.

Таблица 10

Мол. масса кД Дата выделения МФК Температура С Тип активности Субстрат Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка

День Ночь 108-Ф Дуплекс

520 480 24-26 октября Пасмурно 1520 8-12 Рибозофос фатизо меразная Рибозо-5-Фосфат 3456±36 2924±31 3990±30 3711±39

520 480 Фосфорибу лоышазная Рибозо-5-Фосфат 3470±37 2961±32 4425±48 3788±39

520 480 РБФ- карбоксилазная Рибулозо- 1,5-бмсфосфат 2.21±0.05 1.64±0.05 2.58±0.05 2.04±0.05

У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД, выделенного из листьев мутанта Дуплекс, в сравнении с аналогичным комплексом, выделенным из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, величина рибозофосфатизомеразной активности была выше на 15%, фосфорибулокшшной на 27%, РБФ-карбоксилазной на 11% Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400 кД листьев мутанта Дуплекс превосходил аналогичный комплекс листьев хлопчатника сорта 108-Ф по рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности на 27%, а по РБФ-карбоксилазной на 24%.

При сравнении величин ферментативных активностей мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс при 1-ом и П-ом выделении видно снижение величин их активности, особенно у обнаруженного при И-ом выделении мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400 кД, но все величины ферментативных активностей были выше, чем у мультиферментных комплексов выделенных из растений весеннего посева.

При всех условиях роста и развития растений у мультиферментных комплексов, выделенных из листьев мутанта Дуплекс, величины всех ферментативных активностей были значительно выше,

чем у мультиферментных комплексов, выделенных из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф. В работе (Бабаджанова, Мирзо-рахимов, Алиев, 1990; Мирзорахимов, 1992) установлено, что РБФК/О мутанта обладает большим сродством к субстратам, т.е. имеет меньшие значения величин константы Михаэлиса Кмг1абл. 11.

Таблица 11.

Величины Км(каж)8 0,5 для обоих субстратов РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс.

Объект Субстраты

РБФ, Км(* 0,5)х10^м №Н14С03 Км(80,5)х105м

Хлопчатник, сорт 108-Ф 0.89±0.01 1.75± 0.01

мутант Дуплекс 0.38±0.01 0.95± 0.05

Из представленных в табл. 11 данных видно, что в сравнении с исходным сортом хлопчатника РБФ-карбоксилаза мутанта Дуплекс имеет меньшую величину константа Михаэлиса для рибулозо-1.5-бисфосфата и №Н14С03 что свидетельствует об увеличении сродства с субстратом фермента листьев мутанта.

6.3. Активность мультиферментных комплексов, выделенных из листьев гороха в фазе вегетации, выращенных при пониженных температурах и освещённости.

Поскольку растения гороха являются классическим объектом биохимических исследований, то представлялось важным изучить влияние пониженных температур и освещённости на образование и функциональные свойства мультиферментных комплексов. В связи с этим горох был высеян в почву (месяц - февраль) в лабораторных условиях. При зимнем посеве из листьев двухнедельных проростков гороха были выделены после ионообменной хроматографии на ДЭ-АЭ-целюлозе линейным градиентом концентраций №С1 три мультиферментных комплекса с молекулярной массой 520,480 и 400 кД. В табл. 12 приведены результаты определения величин активностей этих мультиферментных комплексов.

Таблица 12

Активность мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев двухнедельных проростков гороха сорта Крепыш при зимнем выращивании растений (февраль).

Ферментативная активность Молекулярная масса Субстрат Активность, мкмоль продукта/ мин. на 1мг белка

Рибозофосфат-изомеразная 520 480 400 рибозо-5-фосфат 2870±30 2742±28 2716±28

Фосфорибуло-киназная 520 480 400 рибулозо-5-фосфат 1863±19 1560±16 1450±15

РБФ- карбоксилазная 520 480 400 РБФ 1.06±0.05 0.75±0.05 0.66±0.05

Из представленных в табл. 12 данных видно, что мульти-ферментные комплексы не различались между собой по величинам рибозофосфатизомеразной активности.

По фосфорибулокиназной активности мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 и 400 кД на 80-78% соответственно.

Наибольшие различия мультиферменгные комплексы имели по величине рибулозо-1,5-басфосфаткарбоксилазной активности. У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД РБФ-карбоксилазная активность была выше активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400 кД - на 38%. Из представленных результатов видно, что чем меньше величина молекулярной массы, тем ниже их РБФ-карбоксилазная активность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты многолетних исследований позволяют заключить, что образующиеся на разных фазах развития растений свободные мультиферментные комплексы цикла Кальвина с различной молекулярной массой и каталитической активностью обеспечивают онтогенетические особенности изменений интенсивности фотосинтеза, связанные с необходимостью удовлетворения возрастающей потребности эпигенетических процессов в ассимилятах.

Полученные нами результаты подтверждают данные об онтогенетических изменениях интенсивности фотосинтеза и количества образующегося продукта реакции карбоксилирования ФГК у хлопчатника (Якубова, Юлдашев, 1983; Якубова, 1984; Юлдашев, 1996). Образование различных типов мультифермент-ных комплексов цикла Кальвина вызвано необходимостью увеличения фотосинтетической фиксации С02 в период формирования репродуктивных органов и их созревания, так как активность ферментов фосфорибулокиназы и РБФ-карбоксилазы/оксигеназы, встроенных в мультиферментные комплексы, значительно выше, чем у свободных форм ферментов. Это обусловлено действием в мультиферментных комплексах особых регулягорных механизмов - «направленного или туннельного переноса метаболитов», координированной регуляции одними и теми же эффекторами и диссоциативного механизма регуляции.

Использование сравнительного подхода при изучении активности ферментов цикла Кальвина фазы карбоксилирования у исходных форм растений хлопчатника и арабидопсиса и их мутантов с низкой и высокой интенсивностью фотосинтеза и продуктивностью позволило выявить независимо от генотипа растения специфические физиолого-биохимические особенности, характерные для высокопродуктивных мутантов. Высокопродуктивные мутанты хлопчатника и арабидопсиса отличались от низкопродуктивных форм более высоким содержанием мультиферментных комплексов и их большей каталитической активностью.

листовой поверхности активного фермент - субстратного комплекса, осуществляющего первичную фиксацию С02 (Расулов 1994; Каспарова, 2006).

Полученные данные свидетельствуют о том, что возрастание активности ферментов фазы карбоксилирования является необходимым условием для повышения фотосинтетической фиксации растения наряду со многими другими факторами. К таким факторам относятся, прежде всего, морфофизиологиче-ские особенности растений, например, форма листьев и такое расположение их на стебле, которое способствовало бы лучшему радиационному режиму в посеве и повышению интенсивности фотосинтеза; близость плодовых органов к донорным, что оптимизировало бы донорно-акцегггорные отношения и т.д.

Важным условием для нормального протекания продукционного процесса является устойчивость растений к постоянно изменяющимся факторам внешней среды. Поэтому нами была предпринята попытка моделирования изменений факторов внешней среды не в искусственной камере, как это было сделано А. Абдуллаевым (1991; 1994), а в «естественной» лаборатории при осеннем посеве (август) хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. В период выращивания растений хлопчатника с августа по ноябрь происходило постепенное снижение температуры воздуха и освещённости причём величины температуры воздуха были физиологически благоприятными, для С3 - вида растения.

Величины РБФ-карбоксилазной активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина, выделенных в начале июля (фаза бутонизации), когда была высокая освещённость, а температура воздуха днём в тени достигала 30-36°С, были значительно ниже величин РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов, выделенных в начале октября, когда освещённость была ниже, а температура воздуха днём в тени достигала 24-29°С. Аналогичные результаты были получены в искусственной камере (Магомедов и др., 1991; Аб-дуллаев, 1994), где растения хлопчатника выращивали при температурах 25 и 35°С комбинируя низкую и высокую освещённость. Длительное охлаждение растений (от нескольких суток до месяцев) при неповреждающей температуре, сопряжённое, как правило, с ростом их холодоустойчивости, приводит к существенным изменениям активности рибулозо-1.5-

бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназы (Филимонов, 1984). У целого ряда объектов с различными путями ассимиляции углерода, адаптации к холоду сопровождалось ускорением карбоксилиро-вания РБФ. Подобная закономерность показала и для растений хлопчатника фотмйоп, Б1а1уег, 1972).

В работе А. Эргашева (1997) также установлено, что температуры выше 37 °С в сочетании с воздушной засухой в период от начала бутонизации до массового формирования коробочек приводили к существенным сдвигам физиолого-биохимических процессов: снижалось содержание водорастворимых белков, хлорофилла, аскорбиновой кислоты, интенсивность фотосинтеза, сухого вещества, при этом одновременно повышалась интенсивность темнового дыхания и активность каталазы.

Важнейшим типом приспособительных реакций организма к изменяющимся температурным условиям являются изменения каталитических свойств ферментов в результате модификаций их молекул.

В результате индукции стрессовых генов при адаптации растений к температурному сдвигу могут появиться новые разновидности ферментов с кинетическими свойствами, отвечающими новым температурным условиям. Они могут появиться даже тогда, когда температура среды колеблется в пределах всего лишь 8-6°С.

Снижение освещённости и температуры воздуха днём до 15-20°С приводило к появлению новой разновидности мульти-ферментного комплекса, что является, по всей вероятности, одной из защитно-приспособительных реакций хлоропласта.

При всех вариантах варьирования факторов внешней среды (температуры и освещённости) величины ферментативных активностей мультиферментных комплексов цикла Кальвина, выделенных из листьев мутанта Дуплекс были всегда значительно выше величин активности мультиферментных комплексов, выделенных из листьев исходного сорта 108-Ф. Следовательно, стабильность при различных условиях отличий мутанта Дуплекс от исходного сорта 108-Ф по содержанию мультиферментных комплексов и их каталитической активности свидетельствует об устойчивости его фотосинтетического аппарата к воздействию таких постоянно изменяющихся факторов внешней среды как температура и освещённость.

Результаты наших исследований согласуются с данными, полученными К.А.Алиевым и Ш.А.Эсаналиевой (2010) при изучении у четырёх генотипов хлопчатника влияния пониженных температур и освещённости на РБФ-карбоксилазную активность свободных мультиферментных комплексов. У продуктивных инбредных линий хлопчатника Л-461 и Л-601мультиферментные комплексы цикла Кальвина оказались более устойчивыми к продолжительному действию положительных пониженных температур и освещённости, компенсируя их влияние на скорость реакций мультиферментного комплекса двумя путями - снижением каталитической активности ферментов в пределах физиологической нормы и увеличением содержания ферментов в единице площади листа.

Познание регуляторных механизмов адаптации растений к изменяющимся факторам внешней среды имеет важное значение для управления продукционным процессом. Фотосинтез не только обеспечивает строительным материалом и энергией процессы роста, но и генерирует вещества гормональной и ингиби-торной природы, которые сами являются регуляторами дифференциальной активности генов, т.е. фотосинтез участвует в реализации генетической программы развития и, следовательно, активно воздействует на процессы эпигенеза. Таким образом происходит интеграция фотосинтеза и роста (Мокроносов, 1981; 1981а; Кефели, 1992; Кузнецов, Дмитриева, 2006; Алёхина, Бал-нокин и др., 2007; Якубова, 2011).

Совокупность литературных данных и полученных нами результатов экспериментальных исследований позволяет заключить, что в селекционной работе на высокую продуктивность растений необходимо сочетать генетико-селекционное совершенствование различных функциональных систем хлоропласта методами направленной мутационной селекции с традиционными методами селекции на улучшение мор фофизиологических особенностей растения, оптимизации донорно-акцепторных отношений и повышение устойчивости (приспособляемости) к различным факторам внешней среды и т.д.

выводы

1. Подобраны оптимальные условия выделения электрофоре-тически гомогенных препаратов свободных мультифермент-ных комплексов цикла Кальвина из листьев хлопчатника и арабидопсиса позволяющие сохранить на достаточно высоком уровне ферментативную активность.

2. Обнаружено, что в зависимости от возраста растений хлопчатника изменяется спектр (набор) мультиферментных комплексов: в фазе 5-6 настоящих листьев был выделен один мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520±20 кД, а в фазах бутонизации и цветения растений - два с молекулярной массой 520 и 480±15 кД.

3. Установлено, что мультиферментные комплексы проявляли наибольшие величины ферментативных активностей, в фазах формирования репродуктивных органов - бутонизации и цветения. Для этих же фаз развития растений характерны наибольшие величины интенсивности фотосинтеза, Это указывает на то, что возрастание интенсивности фотосинтеза в эти фазы, наряду с другими факторами, обеспечивается увеличением ферментативных активностей различных типов мультиферментных комплексов цикла Кальвина. Раскрыты механизмы регуляции активности мультиферментных комплексов в зависимости от морфофизиологиче-ского состояния растений. Показано, что активизация метаболизма, необходимая при переходе растения с фазы вегетации к репродуктивной фазе развития осуществляется благодаря вступлению в действие следующих биохимических механизмов регуляции: 1- образования нового типа мультиферментных комплексов; 2-диссоциативного механизма регуляции активности фосфорибулокиназы и рибулоза-1.5-бмсфосфаткарбоксилазы в мультиферментных комплексах.

4. Образование на различных фазах развития растений мультиферментных комплексов цикла Кальвина с различными величинами молекулярных масс и ферментативных активностей, по всей вероятности находится под генетическим контролем, регулируется дифференциальной экспрессией генов и обусловлено необходимостью обеспечения эпигенетиче-

ских процессов большим количеством ассимилятов в период формирования репродуктивных органов.

5. Показано, что независимо от величины молекулярной массы и возраста растений величина активностей фосфорибулоки-назы и рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилазы/оксиге-назы у обоих мультиферментных комплексов при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата+АТФ были значительно выше, чем в присутствии собственных специфических субстратов: рибулозо-5-фосфата + АТФ для фосфори-булокиназы и рибулозо-1,5-б«сфосфата для рибулозо-1.5-бнсфосфаткарбоксилазы/ оксигеназы. Меньшая скорость протекания фосфорибулокиназной и РБФ-карбоксилазной реакций при использовании собственных специфических субстратов в сравнении с суммарной реакцией при добавлении рибо-зо-5-фосфата - первого субстрата метаболической цепи из пяти ферментов, свидетельствует о «каналировании» интерме-диатов без выхода их за приделы микрокорпартмента муль-тиферментного комплекса Выявлены важнейшие механизмы регуляции активности ферментов в мультиферментных комплексах цикла Кальвина: «направленный» перенос метаболитов (интермедиатов), координированная и диссоциативная регуляция. Эти механизмы обеспечивают более высокую каталитическую эффективность ферментов, встроенных в муль-тиферментные комплексы в сравнении со свободными формами этих ферментов.

6. Установлено, что для различных генотипов хлопчатника, ара-бидопсиса и гороха - растений относящихся к разным семействам, спектр (набор) свободных мультиферментных комплексов одинаков. Имеющиеся в литературе данные и полученные нами результаты дают основание полагать, что свободные мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520±20кД и 480±15кД являются, по-видимому универсальными и характерными для всех видов высших растений.

7. Показано, что у трёх генотипов хлопчатника и трёх генотипов арабидопсиса продуктивные мутанты превосходили исходные формы по содержанию и количеству водорастворимых белков в экстрактах из листьев, количеству электрофо-ретически гомогенных мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520±20кД и 480±15кД, и по их фермен-

тативной активности. Следовательно у мутантов произошло возрастание биосинтеза белков, в том числе белков - ферментов, а так же на модификационные изменения молекул ферментов, обусловивших повышение их каталитической активности. Об этом свидетельствует изменения кинетических параметров РБФК/О мутанта - возрастание максимальной скорости реакции Утзх и сродства фермента к обоим субстрат, т.е. уменьшение величин константа Михаэлиса Км. Таким образом, повышение продуктивности мутантов обусловлено наряду с другими факторами (форма куста, расположение листьев на нём, возрастание синтеза АТФ и НАД Н, улучшение донорно-акцепторных отношений и т.д.) состоянием ферментативной системы цикла Кальвина.

8. Обнаружено, что при выращивании растений хлопчатника в естественных условиях при пониженных, но благоприятных физиологических температурах воздуха (днём в тени 24-30°С, ночью 16-21 °С) набор (спектр) мультиферментных комплексов в фазе бутонизации растений не изменился, но возросли содержание и ферментативные активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина. Установлено, что при дальнейшем понижении освещённости и температуры воздуха на 8-9°С (днём в тени 15-20 С, ночью 8-12°С) в листьях хлопчатника наряду с мультиферментным комплексом с молекулярной массой 520±20кД обнаружен свободный мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400±10кД. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400кД был обнаружен и в листьях гороха при зимнем (февраль) выращивании растений. Обнаружение в листьях хлопчатника и гороха, относящихся к различным генотипам, мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400кД даёт основание считать, что появление этого нового типа мультиферментного комплекса связано по всей вероятности, с адаптацией растений к пониженным температурам и освещённости.

При понижении освещённости и температуры воздуха из листьев хлопчатника выделены два мультиферментных комплекса, а из листьев гороха - три. Это свидетельствует о специфическом для каждого вида растения ответе на изменившиеся условия внешней среды.

9. Выявлено, что обеспечение необходимой метаболической активности организма при перестройке его функциональной деятельности в различном возрасте и при усилении действия различных факторов окружающей среды осуществляется с помощью трёх основных биохимических механизмов: синтеза новых типов мультиферментных комплексов цикла Кальвина, изменения количеств или концентраций уже имевшихся различных типов мультиферментных комплексов и адаптивной регуляции каталитической активности этих мультиферментных комплексов.

10. Предложена схема механизмов регуляции активности ферментов цикла Кальвина и их мультиферментных комплексов при адаптации фотосинтетического аппарата растений к постоянно изменяющимся температуре воздуха и освещённости (рис. 12) с учётом литературных данных и собственных результатов.

Рис. 12. Механизмы адаптация активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина к изменяющимся температуре и освещённости

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Бабаджанова М.П., Мирзорахнмов А.К., Алиев К.А. Некоторые кинетические свойства рибулозобг/сфосфаткарбоксила-зы/окситеназы листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. // Докл. АН ТаджССР, 1990, т.ЗЗ, №2, с. 129-132.

2. Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Влияние температуры и pH на активность рибулозобисфосфаткарбоксила-зы/оксигеназы (РБФК/О) на листья хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс: Тезисы докладов Y-и Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. - Ташкент, 1991, с. 203.

3. Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.П., Бабаджанова М.А., Лебедева Г.П., Множественные молекулярные формы рибулозо-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О) из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. // Труды конференции молодых учёных «Проблемы биологии и химии в Таджикистане»,- Душанбе, 1991, с. 23.

4. Мирзорахимов А.К., Рубцова Т.В., Фархади З.Н., Бабаджанова М.А., Алиев К.А. Карбоксилазная активность и полипептидный состав РБФ-карбоксилазы в связи с продуктивностью растений.//Докл. АН ТаджССР, 1991, т.12, №2, с. 129-132.

5. Мирзорахимов А.К. Сравнительная характеристика РБФ-карбоксилазы различных по продуктивности форм хлопчатника. Множественные молекулярные формы фермента: Ав-тореф.дис. кан. биол.наук. - Душанбе, 1992, 22 с.

6. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Лебедева Т.П., Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Проявление рибулозобисфос-фаткарбоксилазой-оксигеназой других ферментативных активностей. //Апрельская научно-теоретическая конференция профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного национального университета: Тезисы докладов - Душанбе, 1993, с. 78.

7. Бабаджанова М.А., Лебедева Г.П., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Бакаева Н.П. Функциональный мульти-ферментный комплекс цикла Кальвина. // 1-ая Конференция биохимиков Таджикистана: Тез.докл. - Душанбе, 1993, с.78.

8. Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Бакаева Н.П., Лебедева Г.П. Множественные молекулярные формы рибулозо-бисфосфат- карбоксилазы из листьев хлопчатника. // Докл АН ТаджССР.- 19936, т.З, №3, с. 230-233.

9. Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Бакаева Н.П. Изучение активности РФИ, ФРК и РБФК/О хлопчатника при различных условиях хранения препаратов. //Труды Апрельской научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного национального университета. - Душанбе, 1994, с.76.

10. Бакаева Н.П., Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Определение ионизирующихся групп активных центров фосфорибуло-киназы и рибулозобисфосфаткарбоксилазы хлопчатника.//Труды Апрельской научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного национального университета.- Душанбе, 1994, с.74-77.

11. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Мирзорахимов А.К. Определение ионизирующихся групп активных центров фосфори-булокиназы и рибулозобисфосфаткарбоксилазы хлопчатника.// Наука в ТГНУ, Душанбе, Сино, 1994, Вып.17, с. 74-76.

12. Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.П., Бабаджанова М.П. Исследование условий для проявления высокой активности ферментов РФИ, ФРК и РБФК хлопчатника сорта 108-Ф// Труды Апрельской научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного национального университета - Душанбе, 1994, с.77.

13. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Мирзорахимов А.К. Тест-системы на высокую продуктивность фотосинтетического аппарата.// Фотосинтез, продукционный процесс и регуляция плодообразования у хлопчатника. - Душанбе, ТГНУ, 1996, с. 7-8.

14. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Бакаева Н.П. Динамические мультиферментные ассоциации цикла Кальвина. // Труды 11-ой научной конференции биохимического общества Республики Таджикистан - «Проблемы биохимии». -Душанбе, ТГНУ, 1996, с. 10-12.

15. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.П. Молекулярные формы рибулозобг/сфосфаткарбоксила-зы/оксигеназы из листьев гороха сорта «Крепыш». // Труды кафедры физиология человека и животных Таджикского государственного национального университета. «Морфологические и физиологические основы адаптации организма».-Душанбе, 1997, с. 32-33.

16. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К. Молекулярные формы рибулозобисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы из листьев различающихся по продуктивности форм арабидопсиса. //

Труды Республиканской конференции посвященное 50-летию Таджикского национального университета. - Душанбе, 1998, с. 7-8.

17. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Бакаева Н.П. Динамические мультиферментные комплексы цикла Кальвина: Тезис докладов Международной конференции «Физиология растений - наука Ш-го тысячелетия». -Москва, 1999, т.1, с. 20-21.

18. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П. Ферментативные активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина из листьев гороха.// Вестник. ТГНУ. -Душанбе, 2004, №3, с. 27-31.

19. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Нарзуллоев М.С. Определение молекулярной массы мультиферментного комплекса РФБК/О из листьев хлопчатника. // Материалы научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава и студентов посвященные «15-й годовщине Республики Таджикистан», «2700-летию города Куляба» и «Году арийской цивилизации». Душанбе, 2006, т.1, с. 104.

20. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Нарзуллоев М.С. Влияние кинетина на активность фосфорибулокиназы в экстрактах из листьев хлопчатника. // Докл. АН РТ. - Душанбе, 2007, т. 50, №4, с. 382-385.

21. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Влияние кинетина на активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы в ферментативных препаратах различной степени очистки. // Докл. АН РТ. - Душанбе, 2007, т. 50, № 8, с.711-715.

22. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Эсаналиева Ш.А. Активность мультиферментных комплексов цикла Кальвина листьев различающихся по продуктивности форм хлопчатника. // Докл. АН РТ. - Душанбе, 2007, т. 50, № 9, с. 789-801.

23. Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.А., Нарзуллоев М.С. Выделение и отчистка мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его высокопродуктивной линии Л-461. // Материалы научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава и студентов посвященные «800-летию поэта, великого мыслителя М.Д.Балхи» и «16-й годовщине Независимости Республики Таджикистан». - Душанбе, 2007, ч.1, с. 122-123.

24. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Эсаналиева Ш.А Образование различных мультиферментных комплексов в онтогенезе растений хлопчатника.// Достижения современной

физиологии растений: теоретические и практические аспекты. Материалы научной конференции, посвященной памяти академика АН РТ Ю.С. Насырова. - Душанбе, 2008, с. 15-17.

25. Бабаджанова М.А., Эсаналиева Ш.А., Мирзорахимов А.К Влияние кинетина на активность мультиферментного комплекса цикла Бенсона -Кальвина в экстрактах из листьев хлопчатника.// Состояние и перспективы развития биохимии в Таджикистане. Материалы Международной конференции, посвященной 35-летию кафедры биохимии Таджикского национального университета. - Душанбе, 2009,с. 31-33.

26. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Эсаналиева Ш., Алиев К.А. Выделение свободных мульти-ферментных комплексов цикла Кальвина в онтогенезе растений хлопчатника. // Докл. АН РТ, 2009, т.52, №2, с. 150-157.

27. Babajanova М.А., Mirzorakhimov А.К., Babajanova М.Р., Esa-nalieva Sh.A.. Development pattern in the formation of various myltienzyme complex associated with Benson-Kalvin cycle in cotton leaves. // Rus.Plant Physiol. 2010, т.57, №2, p.175-180.

28. Бабаджанова M.A., Мирзорахимов A.K., Эсаналиева Ш. Онтогенетическая зависимость образования различных муль-тиферментных комплексов цикла Бенсона-Кальвина. // Физиология растений, 2010, т.57, № 2, с. 186-191.

29. Мирзорахимов А.К. Зависимость от внешних факторов ферментативных активностей свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина в листьях исходной и мутант-ной форм хлопчатника.//«Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане». Материалы республиканской конференции,- Душанбе, 2011,с. 38-40.

30. Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.А., Эсаналиева Ш.А., Нарзуллаев М.С., Сайфутдинов А.К., Нематова К.Н. Онтогенетическая зависимость активирующего влияния кинетина на ферментативные активности свободного мультиферментного комплекса цикла Кальвина в листьях хлопчатника.// «Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане». Материалы республиканской конференции,- Душанбе, 2011,с. 48-50.

31. Мирзорахимов А.К. Активность мультиферментных комплексов цикла Кальвина, листьев исходной и мутантной форм хлопчатника.//Докл.АН РТ, Душанбе, 2011, т.54 №7, с. 614-617.

32. Мирзорахимов А.К. Регуляция фотосинтеза и активности ферментов цикла Кальвина. Изд-во ООО «Контраст», Душанбе, 2011 г., 48с.

Сдано в набор 21.10.2011 Подписано к печати 25.10.2011 Формат 60x84 Vi6. Усл.п.л. 3. Гарнитура Times New Roman. Тираж 150 экз.

ЛН^г 0ПЕРМШИ«« ШИГРА»««

J\Offl>ACT

Отпечатано ООО «Контраст» г. Душанбе, ул. Дехлави, 24

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мирзорахимов, Акобир Каримович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. 6

ВВЕДЕНИЕ. 8

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМАХ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

ФОТОСИНТЕЗА. 18

1.1. Надмолекулярная организация ферментов. 18

1 ^.Функциональные последствия объединения ферментов в надмолекулярные комплексы.19

1.2.1. Эффект сближения. 19

1.2.2. Защита метаболита и (или) клетки.

1.2.3.Уменьшение времени перехода.21

1.2.4. Активация физиологических и подавления нежелательных реакций

1.2.5.Координированные регуляторные эффекты.23

1.2.6.Роль мультифермептных комплексов в интеграции клеточного метаболизма.25

1.2.7.Метабол н.2

1.3.Мультиферментные комплексы цикла Кальвина и регуляция их активности. 30

1.4.Механизмы регуляции активности ферментов в онтогенезе.45

1.5.Механизмы регуляции интенсивности фотосинтеза.49

1.5.1.Механизмы онтогенетического контроля фотосинтеза. 491.5.1.1. Генетические механизмы контроля онтогенеза. 49

1.5.1.2.Гормональная регуляция фотосинтеза.51

1.5.2.Световая регуляция фотосинтеза. 55

1.5.3.Регуляция светом активности ферментов цикла Кальвина.56

1.5.4.Влияние температуры на фотосинтез и активность ферментов.59

1.6. Резюме.61

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.64

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 64

2.1. Объекты исследования.64

2.2. Реактивы.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Определение количественного содержания белка по методу Лоури и др.80

2.3.2. Микроопределение белка с биуретовым реактивом.

2.3.3. Определение неорганического фосфора.

2.3.4. Определение активности рибозофосфатизомеразы.82

2.3.5. Определение фосфорибулокиназной активности.

2.3.6. Определение карбоксилазной активности рибулозо-1,5-бисфос-фаткарбоксилазы/оксигеназы радиометрическим методом.

2.3.7. Определение карбоксилазной активности рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы спектрофотометрическим методом.

2.3.8. Выделение и очистка свободного мультиферментного комплекса из листьев хлопчатника. 85

2.3.9. Определение гомогенности ферментных препаратов и их молекулярной массы.90

2.3.10. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ НА РАЗДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА И ИХ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ИЗ

ЛИСТЬЕВ ХЛОПЧАТНИКА СОРТА 108-Ф. 92

3.1. Выделение мультиферментных комплексов при рН 8.0 и ионообменной хроматографии при различных градиентах концентрации NaCl. 92

3.2. Выделение мультиферментных комплексов при рН 8.5 и ионообменной хроматографии при различных градиентах концентрации ЫаС1. 103

3.3. Резюме. 109

ГЛАВА 4. ОБРАЗОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ОНТОГЕНЕЗЕ ХЛОПЧАТНИКА. 111

4.1. Возрастные изменения активности свободных мультиферментных комплексов. 112

4.2. Резюме. 124

ГЛАВА 5. АКТИВНОСТЬ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ЛИСТЬЯХ ИСХОДНЫХ И МУТАНТНЫХ ФОРМ РАСТЕНИЙ.127

5.1. Активности свободных мультиферментных комплексов, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, его мутанта

Дуплекс и инбредной линии Л-461 . 128

5.2. Активности свободных мультиферментных комплексов из листьев арабидопсиса исходной расы Энкхайм и его мутантов триплекс, 58/15 . 138

5.3. Резюме.148

ГЛАВА 6. МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К ВНЕШНИМ ФАКТОРАМ АКТИВНОСТИ СВОБОДНЫХ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ЛИСТЬЯХ ХЛОПЧАТНИКА

И ГОРОХА. 151

6.1. Адаптация к высоким температурам и освещённости мультиферментных комплексов листьев хлопчатника в фазе бутонизации растений. 151

6.3. Активность мультиферментных комплексов, выделенных из листьев гороха в фазе вегетации, выращенных при пониженных температурах и освещённости.165

6.4. Резюме.167

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина у высших растений"

Эффективность функционирования фотосинтетического аппарата оказывает существенное влияние на рост, развитие и продуктивность растений. Ведущая роль фотосинтеза в продукционном процессе доказана работами многих исследователей (Ничипорович, 1956; 1967; 1982; 1988; Насыров, 1975; 1982; 1982а; 1986; Мокроносов, 1981; 1983; 1988; 1992; Тарчевский, 1977).

В процессе фотосинтеза синтезируются первичная энергия (АТФ, НАДФ Н) и первичные органические вещества, используемые для роста, развития и плодоношения растений. Какие по химической природе вещества, в каком количестве, на каком этапе онтогенеза и в какие органы они будут поступать, зависит продуктивность растений и качество урожая. Каждый из этих этапов подвержен действию имеющихся в живом организме различных типов регуляторных механизмов. Координация всех метаболических процессов и способность организма выполнять свои разнообразные функции осуществляется через регуляцию активности ферментов в клетке. Поэтому выявление регуляторных механизмов, действующих на уровне сложной кооперативной взаимосвязи между мерментной системой фотосинтеза и эпигенетическими процессами является актуальным.

Исследование активности фотосинтетического аппарата различных по продуктивности форм растений показало, что высокопродуктивные сорта обладают более высокой интенсивностью фотосинтеза, скорости транспорта электронов, фотофосфорилирования, генерации восстановительного потенциала (Насыров, 1975; Кумаков, 1967; 1988; Best et al., 1977; Красичкова, Гиллер, 1978; Володарский и др., 1980; Якубова, 1984; Якубова Юлдашев, 1983, 1984; Юлдашев 1989; 1996; Кренделёва, 1985; Быков, Земенский, 1987; авторы сборника «Фотосинтез и продукционный процесс», 1988 и др.).

В ряде работ была установлена положительная корреляция между интенсивностью фотосинтеза и активностью РБФК/О для листьев, находящихся на разных стадиях онтогенеза, в разных естественных и экспериментальных условиях (Smillie, 1962; Bjorkman, 1966; Андреева, Авдеева, 1970; Алиев и др., 1981; Андреева и др., 1982; Мокроносов, 1981; 1983; Бабаджанова, Гиясов, 1984; Фархади, Алиев, 1985).

С другой стороны показано, что у хлопчатника и других культур в процессе их многовековой эволюции и многолетней селекции уровень интенсивности фотосинтеза не претерпел существенных изменений (Абдуллаев Х.А., Каримов Х.Х., 2007; Каримов и др., 2009; Миракилов и др., 2009).

В связи с этим решение сложной проблемы, повышения продуктивности растений нельзя представить без всестороннего комплексного изучения фотосинтетических процессов, механизмов регуляции эндогенной активностью фотосинтетического аппарата и исследования его структурной и функциональной организации на различных уровнях - молекулярном, клеточном, тканевом, органном и организменном.

П.Д. Усмановым (1984) была установлена широкая генотипическая изменчивость признаков фотосинтетического аппарата высших растений.

В 1972-1990-тые годы М.М. Якубовой с сотрудниками и

М.А.Бабаджановой с сотрудниками были проведены комплексные исследования структурно-функциональных особенностей фотосинтетического аппарата у мутантных форм растений с низкой и 9 высокой интенсивностью фотосинтеза и продуктивностью. Было установлено, что высокопродуктивные мутанты хлопчатника и арабидопсиса характеризовались повышенной интенсивностью фотосинтеза, возрастанием эффективности фотосинтетического транспорта электронов, фотофосфорилирования, изменением количественного содержания продуктов фотосинтеза и скорости их оттока (Якубова и др., 1980; Якубова, Юлдашев, 1983; 1984; 1986; 1989; Юлдашев, 1984; 1996). Повышение эффективности протекания первичных процессов фотосинтеза не могло не сказаться на активности ферментов темновой фазы, снабжённых в достаточном количестве АТФ и НАДФ Н. Для продуктивных мутантов хлопчатника и арабидопсиса были выявлены структурные и функциональные особенности ключевых ферментов фотосинтеза - рибозофосфатизомеразы, фосфорибулокиназы, рибулозобмсфосфаткарбоксилаза/оксигеназы: более эффективное взаимодействие субъединиц между собой, возрастание сродства к субстратам, максимальной скорости реакций, числа оборотов и снижение энергии активации (Бабаджанова, 1990; Бакаева, 1996).

Таким образом, проведённые исследования показали, что фотосинтетический аппарат продуктивных мутантов характеризуются рядом физиолого-биохимических особенностей влияющих на его функциональную активность (Якубова и др., 1980; Якубова, Юлдашев, 1983; 1984; 1986; 1989; Бабаджанова, 1990; Бакаева, 1996).

Любое изменение в организме, в конечном счёте, связано изменениями, происходящими на молекулярном уровне. По современным представлениям, одним из ведущих регуляторных механизмов метаболизма на молекулярном уровне является образование разнообразных надмолекулярных комплексов ферментов. Такие комплексы обнаружены при протекании гликолиза, цикла Кребса, окисления жирных кислот, биосинтеза белков и нуклеиновых кислот. (Наградова и др., 1984; Фридрих, 1986; Курганов, 1978; 1984; 1986; 1986а; 1992; Курганов и др., 1986; 1989; 1991; Капрельянц, 1988; Каган, 1989;

Наградова, 1990; Наградова, Муромец, 1985; 1991; Ермаков, 1993).

С 1980-ых годов Бабаджановой М.А. с сотрудниками ведутся комплексные исследования молекулярно-кинетических свойств ключевых ферментов темновой фазы фотосинтеза-рибозофосфатизомеразы (РФИ, КФ 5.3.1.6), фосфорибулокиназы (ФРК, КФ 2.7.1.19) и рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О, КФ 4.1.1.39) из листьев арабидопсиса и хлопчатника. Была установлена кинетическая комплементарность этих ферментов и координированная регуляция активности одними и теми же эффекторами, что указывало на объединение их в функциональный кластер (Бабаджанова, 1981; 1981а; 1990; 1990а; Бабаджанова и др., 1985; Бабаджанова, Бакаева, Бабаджанова, 1998; Бабаджанова, Бакаева, Алиев, 1989; 1990). Объединение этих ферментов в структурно-функциональный кластер было доказано выделением из листьев хлопчатника электрофоретически гомогенного ферментного препарата с молекулярной массой 520 кД, у которого были определены рибозофосфатизомеразная, фосфорибулокиназная и РБФ-карбоксилазная активности (Бабаджанова, 1990а; Мирзорахимов и др., 1993; 1994).

Из листьев хлопчатника были одновременно выделены свободный и мембраносвязанный мультиферментные комплексы и проведено сравнительное изучение их каталитических свойств и кинетических параметров (Бабаджанова М.П., Алиев К. А. и др., 1999; 2001; 2001 а;2002;2003 ;2003а).

Для доказательства этого предположения необходимо было подобрать условия для получения сравнительно устойчивых мультиферментных комплексов цикла Кальвина, а затем из листьев одного вида растений в онтогенезе одним щадящим методом выделить мультиферментные комплексы.

Всё выше изложенное даёт основание' считать, что исследование молекулярно-функциональных свойств мультиферментных комплексов цикла Кальвина, выделенных в различные фазы развития растений и влияния на их ферментативную активность разнообразных факторов окружающей среды является весьма актуальным.

Целью настоящей работы являлось: сравнительное исследование возрастных изменений спектра (набора) и функциональной активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина в листьях хлопчатника, выявление регуляторных механизмов фотосинтетической ассимиляции С02 на основе анализа структурно-функциональных свойств мультиферментных комплексов у различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности исходных и мутантных форм растений, а так же изучение механизмов адаптации активности мультиферментных комплексов к изменяющимся факторам внешней среды.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи: подобрать для листьев хлопчатника и арабидопсиса такие условия выделения электрофоретически - гомогенных препаратов свободных мультиферментных комплексов, которые не вызывали бы денатурацию белков; выделить из листьев растений хлопчатника различного возраста свободные мультиферментные комплексы цикла Кальвина и определить у них величины молекулярных масс и активности трёх ферментов рибозофосфатизомеразы (КФ 5.3.1.6), фосфорибулокиназы (КФ 2.7.1.19) и рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназы (КФ 4.1.1.39); выделить из листьев трёх генотипов хлопчатника (сорт 108-Ф, мутант Дуплекс, линия J1-461,) и трёх генотипов арабидопсиса (раса

Энкхайм, мутанты - триплекс, 58/15), различающихся по интенсивности

13 фотосинтеза и продуктивности, мультиферментные комплексы, сравнить их содержание и величины ферментативных активностей; изучить влияние условий выращивания растений хлопчатника и гороха на спектр (набор) и ферментативные активности свободных мультиферментных комплексов.

Научная новизна. Из листьев растений хлопчатника различного возраста с помощью методики щадящего выделения получены электрофоретически гомогенные препараты свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина. Впервые установлены возрастные изменения спектра (набора) и ферментативных активностей мультиферментных комплексов цикла Кальвина: в фазе 5-6 настоящих листьев обнаружен один мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 ± 20 кД, а начиная с фазы бутонизации два - с молекулярными массами 520 ± 20 кД и 480 ± 15 кД.

Установлено, что независимо от величины молекулярной массы мультиферментных комплексов наибольшая рибозофосфатизомеразная, фосфорибулокиназная и рибулозо-1,5-б«сфосфаткарбоксилазная активность этих комплексов, как и интенсивность фотосинтеза, проявлялась в фазах бутонизации и цветения растений, то есть в репродуктивную фазу. Такая закономерность свидетельствует о том, что необходимое при формировании репродуктивных органов увеличение количества ассимилятов связано с возрастанием функциональной активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина.

Обнаружено, что на всех фазах развития растений величины фосфорибулокиназной и рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилазной активности мультиферментных комплексов в присутствии собственных специфических субстратов были ниже, чем при использовании рибозо-5-фосфата субстрата первого фермента метаболической последовательности, состоящий из пяти ферментов - рибозофосфатизомеразы (КФ 5.3.1.6), фосфорибулокиназы (КФ 2.7.1.19), рибулозоб^сфосфаткарбоксилаза/

14 оксигеназы (КФ 4.1.1.39), фосфоглицераткиназы (КФ 2.7.2.3.) и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.13).

Полученные данные являются весьма существенным доказательством преимуществ работы комплекса ферментов в сравнении со свободными формами ферментов. Более высокая каталитическая эффективность работы ферментов в комплексе свидетельствует о проявлении таких механизмов регуляции активности ферментов в мультиферментном комплексе как -«направленный или туннельный перенос метаболитов», координированная и диссоциативная регуляция. Снижение РБФ-карбоксилазной активности по мере уменьшения величины молекулярной массы мультиферментных комплексов указывает на функциональную значимость диссоциативного механизма регуляции карбоксилазной активности РБФК/О, встроенной в мультиферментные комплексы с различной молекулярной массой.

Результаты проведенных исследований контрастных по интенсивности фотосинтеза и продуктивности трёх генотипов хлопчатника и трёх генотипов арабидопсиса дают основание считать, что повышение эффективности фотосинтеза у продуктивных мутантов хлопчатника, и арабидопсиса наряду с другими факторами обусловлено действием двух основных биохимических механизмов регуляции метаболизма: увеличением количественного содержания мультиферментных комплексов и возрастанием каталитической активности входящих в их состав ферментов, причём эти различия сохранялись при значительном изменении факторов внешней среды (понижение температуры и освещённости). Следовательно, содержание и функциональная активность мультиферментных комплексов являются важнейшими механизмами регуляции фотосинтеза и эпигенеза.

Впервые изучено влияние изменений факторов внешней среды -температуры и освещённости на количественное содержание и ферментативную активность мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника и гороха взятого в качестве классического объекта биохимических исследований.

Практическая ценность. Результаты полученных экспериментальных исследований имеют значение для понимания и дальнейшего изучения механизмов регуляции физиолого-биохимических процессов в течение жизни растения и его адаптации к постоянно меняющимся внешним факторам, при решении ряда теоретических и прикладных задач физиологии и биохимии продукционного процесса растений, при разработке тестов в биотехнологической и селекционной работе для оценки продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений, теоретических и прикладных аспектов энзимологии фотосинтеза, а так же для развития теории ферментативного катализа.

Полученные данные можно рекомендовать для чтения лекций по общим курсам биохимии, физиологи растений, спецкурсов по фотосинтезу, энзимологии и экологии на биологических факультетах ВУЗ-ов, а разработанные методы - использовать при проведении различных лабораторных практикумов, выполнении дипломных и диссертационных работ.

Положения, выносимые на защиту:

• ведущими биохимическими механизмами регуляции фотосинтетической ассимиляции углекислоты в онтогенезе растений являются изменения спектра (набора) мультиферментных комплексов цикла

Кальвина, их количественного содержания и функциональной активности ферментов, встроенных в эти комплексы;

• более высокая каталитическая эффективность ферментов цикла Кальвина встроенных в мультиферментные комплексы в сравнении со свободными формами этих ферментов обусловлена проявлением действия важнейших механизмов регуляции активности ферментов в мультиферментных комплексах - «направленный» перенос метаболитов («интермедиатов») координированная и диссоциативная регуляция;

2. возрастание каталитической активности этих мультиферментных комплексов.

3. появление нового типа мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400 кД.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мирзорахимов, Акобир Каримович

выводы

1. Подобраны оптимальные условия выделения электрофоретически гомогенных препаратов свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина из листьев хлопчатника и арабидопсиса позволяющие сохранить на достаточно высоком уровне ферментативную активность.

Раскрыты механизмы регуляции активности мультиферментных комплексов в зависимости от морфофизиологического состояния растений. Показано, что активизация метаболизма, необходимая при переходе растения с фазы вегетации к репродуктивной фазе развития осуществляется благодаря вступлению в действие следующих биохимических механизмов регуляции: 1- образования нового типа мультиферментных комплексов; 2-диссоциативного механизма регуляции активности фосфорибулокиназы и рибулоза-1,5-£шсфосфаткарбоксилазы в мультиферментных комплексах.

174 находится под генетическим контролем, регулируется дифференциальной экспрессией генов и обусловлено необходимостью обеспечения эпигенетических процессов большим количеством ассимилятов в период формирования репродуктивных органов.

5. Показано, что независимо от величины молекулярной массы и возраста растений величина активностей фосфорибулокиназы и рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у обоих мультиферментных комплексов при использовании в качестве субстрата рибозо-5-фосфата+АТФ были значительно выше, чем в присутствии собственных специфических субстратов: рибулозо-5-фосфата + АТФ для фосфорибулокиназы и рибулозо-1,5-бисфосфата для рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилазы/ оксигеназы. Меньшая скорость протекания фосфорибулокиназной и РБФ-карбоксилазной реакций при использовании собственных специфических субстратов в сравнении с суммарной реакцией при добавлении рибозо-5-фосфата - первого субстрата метаболической цепи из пяти ферментов, свидетельствует о «каналировании» интермедиатов без выхода их за приделы микрокорпартмента мультиферментного комплекса Выявлены важнейшие механизмы регуляции активности ферментов в мультиферментных комплексах цикла Кальвина: «направленный» перенос метаболитов (интермедиатов), координированная и диссоциативная регуляция. Эти механизмы обеспечивают более высокую каталитическую эффективность ферментов, встроенных в мультиферментные комплексы в сравнении со свободными формами этих ферментов.

6. Установлено, что для различных генотипов хлопчатника, арабидопсиса и гороха - растений относящихся к разным семействам, спектр (набор) свободных мультиферментных комплексов одинаков. Имеющиеся в литературе данные и полученные нами результаты дают основание полагать, что свободные мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520±20кД и 480±15кД являются, по-видимому универсальными и характерными для всех видов высших растений.

175

7. Показано, что у трёх генотипов хлопчатника и трёх генотипов арабидопеиеа продуктивные мутанты превосходили исходные формы по содержанию и количеству водорастворимых белков в экстрактах из листьев, количеству электрофоретически гомогенных мультиферментных комплексов с молекулярной массой 520±20кД и 480±15кД, и по их ферментативной активности. Следовательно у мутантов произошло возрастание биосинтеза белков, в том числе белков - ферментов, а так же на модификационные изменения молекул ферментов, обусловивших повышение их каталитической активности. Об этом свидетельствует изменения кинетических параметров РБФК/О мутанта - возрастание максимальной скорости реакции Утах и сродства фермента к обоим субстрат, т.е. уменьшение величин константа Михаэлиса Км. Таким образом, повышение продуктивности мутантов обусловлено наряду с другими факторами (форма куста, расположение листьев на нём, возрастание синтеза АТФ и НАД-Н, улучшение донорно-акцепторных отношений и т.д.) состоянием ферментативной системы цикла Кальвина.

Установлено, что при дальнейшем понижении освещённости и температуры воздуха на 8-9°С (днём в тени 15-20°С, ночью 8-12°С) в листьях хлопчатника наряду с мультиферментным комплексом с молекулярной массой 520±20кД обнаружен свободный мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400±10кД. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400кД был обнаружен и в листьях гороха при зимнем февраль) выращивании растений. Обнаружение в листьях хлопчатника и гороха, относящихся к различным генотипам, мультиферментного комплекса

176 с молекулярной массой 400кД даёт основание считать, что появление этого нового типа мультиферментного комплекса связано по всей вероятности, с адаптацией растений к пониженным температурам и освещённости.

10. Предложена схема механизмов регуляции активности ферментов цикла Кальвина и их мультиферментных комплексов при адаптации фотосинтетического аппарата растений к постоянно изменяющимся температуре воздуха и освещённости (рис. 32) с учётом литературных данных и собственных результатов.

Рис. 32. Механизмы адаптация активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина к изменяющимся температуре и освещённости.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты подтверждают данные об онтогенетических изменениях интенсивности фотосинтеза и количества образующегося продукта реакции карбоксилирования ФГК у хлопчатника (Якубова, Юлдашев, 1983; Якубова, 1984; Юлдашев, 1996). Образование различных типов мультиферментных комплексов цикла Кальвина вызвано необходимостью увеличения фотосинтетической фиксации С02 в период формирования репродуктивных органов и их созревания, так как активность ферментов фосфорибулокиназы и РБФ-карбоксилазы/оксигеназы, встроенных в мультиферментные комплексы, значительно выше, чем у свободных форм ферментов. Это обусловлено действием в мультиферментных комплексах особых регуляторных механизмов -«направленного или туннельного переноса метаболитов», координированной регуляции одними и теми же эффекторами и диссоциативного механизма регуляции.

Высокопродуктивные мутанты хлопчатника и арабидопсиса отличались от

169 низкопродуктивных форм более высоким содержанием мультиферментных комплексов и их большей каталитической активностью.

Результаты наших исследований подтверждают данные, полученные in vivo при комплексных исследованиях листьев хлопчатника, что генотипическое разнообразие и онтогенетическая динамика фотосинтетической фиксации листа обусловлена, главным образом, концентрационными изменениями в единице листовой поверхности активного фермент - субстратного комплекса, осуществляющего первичную фиксацию С02 (Расулов, 1994; Каспарова, 2006).

Полученные данные свидетельствуют о том, что возрастание активности ферментов фазы карбоксилирования является необходимым условием для повышения фотосинтетической фиксации С02 растения наряду со многими другими факторами. К таким факторам относятся, прежде всего, морфофизиологические особенности растений, например, форма листьев и такое расположение их на стебле, которое способствовало бы лучшему радиационному режиму в посеве и повышению интенсивности фотосинтеза; близость плодовых органов к донорным, что оптимизировало бы донорно-акцепторные отношения и т.д.

Величины РБФ-карбоксилазной активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина, выделенных в начале июля

170 фаза бутонизации), когда была высокая освещённость, а температура воздуха днём в тени достигала 30-36°С, были значительно ниже величин РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов, выделенных в начале октября, когда освещённость была ниже, а температура воздуха днём в тени достигала 24-29°С. Аналогичные результаты были получены в искусственной камере (Магомедов и др., 1991.; Абдуллаев , 1994), где растения хлопчатника выращивали при температурах 25 и 35°С комбинируя низкую и высокую освещённость. Длительное охлаждение растений (от нескольких суток до месяцев) при неповреждающей температуре, сопряжённое, как правило, с ростом их холодоустойчивости, приводит к существенным изменениям активности рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназы (Филимонов, 1984). У целого ряда объектов с различными путями ассимиляции углерода, адаптации к холоду сопровождалось ускорением карбоксилирования РБФ. Подобная закономерность показала и для растений хлопчатника (ОочупШп, 81а1уег, 1972).

В работе А. Эргашева (1997) также установлено, что температуры выше 37°С в сочетании с воздушной засухой в период от начала бутонизации до массового формирования коробочек приводили к существенным сдвигам физиолого-биохимических процессов: снижалось содержание водорастворимых белков, хлорофилла, аскорбиновой кислоты, интенсивность фотосинтеза, сухого вещества, при этом одновременно повышалась интенсивность темнового дыхания и активность катал азы.

Они могут появиться даже тогда, когда температура среды колеблется в пределах всего лишь 8-6°С.

Снижение освещённости и температуры воздуха днём до 15-20°С приводило к появлению новой разновидности мультиферментного комплекса, что является, по всей вероятности, одной из защитно-приспособительных реакций хлоропласта (Мирзорахимов, 2011).

Результаты наших исследований согласуются с данными, полученными К.А.Алиевым и Ш.А.Эсаналиевой (2010) при изучении у четырёх генотипов хлопчатника влияния пониженных температур и освещённости на РБФ-карбоксилазную активность свободных мультиферментных комплексов. У продуктивных инбредных линий хлопчатника Л-461 и Л-601 мультиферментные комплексы цикла Кальвина оказались более устойчивыми к продолжительному действию положительных пониженных температур и освещённости, компенсируя их влияние на скорость реакций мультиферментного комплекса двумя путями - снижением каталитической активности ферментов в пределах физиологической нормы и увеличением содержания ферментов в единице площади листа.

Познание регуляторных механизмов адаптации растений к изменяющимся факторам внешней среды имеет важное значение для

172 управления продукционным процессом. Фотосинтез не только обеспечивает строительным материалом и энергией процессы роста, но и генерирует вещества гормональной и ингибиторной природы, которые сами являются регуляторами дифференциальной активности генов, т.е. фотосинтез участвует в реализации генетической программы развития и, следовательно, активно воздействует на процессы эпигенеза. Таким образом происходит интеграция фотосинтеза и роста (Мокроносов, 1981; 1981а; Кефели, 1992; Кузнецов, Дмитриева, 2006; Алёхина, Балнокин и др., 2007; Якубова, 2011).

Совокупность литературных данных и полученных нами результатов экспериментальных исследований позволяет заключить, что в селекционной работе на высокую продуктивность растений необходимо сочетать генетико-селекционное совершенствование различных функциональных систем хлоропласта методами направленной мутационной селекции с традиционными методами селекции на улучшение морфофизиологических особенностей растения, оптимизации донорно-акцепторных отношений и повышение устойчивости (приспособляемости) к различным факторам внешней среды и т.д.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мирзорахимов, Акобир Каримович, Душанбе

1. Абдуллаев A.A. Карбоксилирующие ферменты и регуляция ассимиляции С02 у высших растений: Автореф.дис. д-ра биол.наук. -Душанбе, 1994.-48 с.

2. Абдуллаев A.A., Горенкова Л.Г., Прусакова Л.Д., Каспарова И.С. Влияние смеси жирных спиртов на некоторые физиолого-биохимические характеристики хлопчатника // Физиология растений. 1991, т.38, №6, с.1181-1187.

3. Абдуллаев Х.А.; Каримов Х.Х. Изменение показателей фотосинтеза, донорно-акцепторных отношений и продуктивности в процессе многолетней селекции новых сортов хлопчатника Изв. АН.РТ. Отд. биол. и мед. наук, 2007, № 4 (161), с.31-39.

4. Акимова Т.В, Дроздов С.Н., Титов А.Ф., Гиаланова В.В. Влияние закаливающих и повреждающих температур на терморезистентность и некоторые физиологические показатели листьев томата. // Биол.науки, 1982, с. 16.

5. Алёхина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф. и др.// Физиология растений, под ред. И.П.Ермакова. 2-е изд., - М.: Академия, 2007. - 640 с.

6. Алиев К.А. Молекулярные механизмы биогенеза фотосинтетического аппарата растений, Душанбе; Дониш, 1998, 72 с.

7. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки . 2-е изд., - М.: Москва, 1986, 312 с.

8. Андреева Т.Ф., Авдеева Т.А. Белок фракции I и фотосинтетическая активность листьев. // Физиология растений. 1970, т. 17, вып.2, с.225-228.

9. Бабаджанова М.А. Об энзимах карбоксилирующей фазы фотосинтеза и их связи с интенсивностью процесса: Автореф. дис. канд.биол.наук. М., 1972. - 32 с.

10. Бабаджанова М.А. Об энзимах карбоксилирующей фазы фотосинтеза мутантных и гибридных форм растений: Тез.докл. 1Х-го Всесоюзного генетического съезда, Кишинёв, 1980, с.33-34.

11. Бабаджанова М.А. О регуляции активности энзимов карбоксилирующей фазы фотосинтеза. // Всесоюз.совещ. «Энергетика,метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе»: Тез.докл. Пущино, 1981, с.4.

12. Бабаджанова М.А. Активность и свойства энзимов карбоксилирующей фазы фотосинтеза в связи с фотосинтетической продуктивностью растений // Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана: Тез.докл. Душанбе, 1981а, с. 136.

13. Бабаджанова М.А. Молекулярно-кинетические свойства ключевых ферментов фотосинтеза продуктивных форм хлопчатника и арабидопсиса. // 2-й Всесоюз. Съезд физиологов растений: Тез.докл. -Минск, 1990, с.12.

14. Бабаджанова М.А. Исследование процессов регенерации и карбоксилирования акцептора С02 в связи с фотосинтетической продуктивностью растений: Автореф.дис. д-ра биол.наук. Душанбе, 1990а. -40 с.

15. Бабаджанова М.А., Бабаджанова М.П., Бакаева Н.П., Мирзорахимов А.К. Функциональный мультиферментный комплекс цикла Кальвина. // Труды 1-ой научной конференции биохимического общества РТ «Проблемы биохУимии». Душанбе, 1993, с.11.

16. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П. Рибозофосфатизомераза листьев исходных и мутантных форм растений, различающихся по продуктивности. //-Пущено, 1985, с. 100.

17. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П. Онтогенетические изменения содержания и активности рибозофосфатизомеразы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. // Докл. АН Тадж ССР. -1986, т.29, №2, с.120-123.

18. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П. Четвертичная структура и некоторые свойства рибозофосфатизомеразы из листьев арабидопсиса расы Энкхайм и его мутантов триплекс, 58/15. // Биохимия. 1987, т.52, №1, с.146-153.

19. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П. Влияние рибулозобисфосфата на активность рибозофосфатизомеразы. // Докл.АН Тадж ССР. 1988, т.31, №6, с.415-418.

20. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Алиев К.А. Влияние субстратов и температуры на активность фосфорибулокиназы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. // Докл.АН Тадж ССР. -1989, т.32, №10, с.702-705.

21. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Алиев К.А. Влияние 3-фосфоглицериновой кислоты на активность рибозофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы листьев хлопчатника сорта 108-Ф. // Докл.АН Тадж ССР, 1990, т.33,№1, с.57-60.

22. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Бабаджанова М.П. Функциональные свойства мультиферментного комплекса ключевых ферментов цикла Кальвина. // Физиология растений. 2000, т.47, №1, с.27-36.

23. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Мирзорахимов А.К. Определение ионизирующихся групп активных центров фосфорибулокиназы и рибулозобисфосфаткарбоксилазы хлопчатника. Наука в ТГНУ, Душанбе, Сино, 1994, Вып. 17. с.74.

24. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Мирзорахимов А.К. Изучение активности РФИ, ФРК и РБФК хлопчатника при различных условиях хранения препаратов. // Наука в ТГНУ, Душанбе, Сино, 1994а, вып. 17, с. 76.

25. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Мирзорахимов А.К. Тест-системы на высокую продуктивность фотосинтетического аппарата. Фотосинтез, продукционный процесс и регуляция плодов у хлопчатника. // Душанбе, ТГНУ, 1996, с. 7-8.

26. Бабаджанова М.А., Горенкова Л.Г., Хаитова Л.Т. Фиксация Си02 ферментативными препаратами, выделенными из листьев различных мутантов гороха и резушки Таля // II Всесоюзный съезд биохимиков: Тез.докл. секция 19, Ташкент, 1969, с.49.

27. Бабаджанова М.А., Горенкова Л.Г. Effect of kinetin and leucine on the 14C02 fixation by enzyme preparation from wild and mutant forms Arabidopsis thaliana: Тез. докл. Душанбе. 1972, c.41-42

28. Бабаджанова М.А., Доман Н.Г., Чекина Н.Г. Выделение и очистка препаратов карбоксилазы рибулозодифосфата из листьев гороха и фасоли в атмосфере инертных газов. // Фотосинтез и использование солнечной энергии. Л.: Наука, 1971, с.222-226.

29. Бабаджанова М.А., Лебедева Г.П., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Бакаева Н.П. Функциональный мультиферментный комплекс цикла Кальвина. //1 Конф.биохимиков Таджикистана: Тез.докл. -Душанбе, 19936, с.11.

30. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Влияние кинетика на активность рибулозабисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы вферментативных препаратах различной степени очистки. // Докл. АН РТ. Душанбе, 2007 ,т.50, №8.,е.- 711-715.

31. Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К., Алиев К.А. Некоторые кинетические свойства рибулозабисфосфаткарбоксилазы листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. Докл. АН Тадж. ССР, 1990, т.ЗЗ, №2, с. 230-234.

32. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П. Ферментативные активности мультиферментных комплексов цикла Кальвина из листьев гороха: Вестник. ТГНУ. Душанбе, 2004,№3, с. 2731.

33. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Бакаева Н.П. Динамические мультиферментные ассоциации цикла Кальвина. // Труды 11-ой научной конференции биохимического общества РТ «Проблемы биохимии». Душанбе, ТГНУ, 1996.

34. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Бакаева Н.П. Динамические мультиферментные комплексы цикла Кальвина: Тезисы докладов Международной конференции физиологов растений «Наука Ш-го тысячелетия». - Москва, 1999, т. 1, с. 20-21.

35. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Эсаналиева Ш.А., Алиев К.А. Выделение свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина в онтогенезе растений хлопчатника. // Докл. АН РТ, 2009, т.52, №2, с. 150-157.

36. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Эсаналиева Ш.А. Онтогенетическая зависимость образования различных мультиферментных комплексов цикла Бенсона-Кальвина в листьях хлопчатника.// Физиология растений. 2010, т., №. 2, с. 1-6.

37. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.П. Исследование условий для проявления высокой активности ферментов РФИ, ФРК и РБФК хлопчатника сорта 108-Ф. Наука в ТГНУ. Душанбе, Сино, 1994, Вып. 17, с. 77.

38. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Нарзуллоев М.С., Эсаналиева Ш.А., Нематова К.Н., Сайфудинов А.К. Влияние кинетина на активность фосфорибулокиназы в экстрактах из листьев хлопчатника.// Докл. АН РТ. Душанбе, 2007, т.50, №4, е.- 382-385.

39. М. А.Бабаджанова, А.К.Мирзорахимов, М.П.Бабаджанова, Ш.А.Эсаналиева. Онтогенетическая зависимость образования различных мультиферментных комплексов цикла Бенсона-Кальвина в листьях хлопчатника. // Физиология растений, 2010, т.57. № 2. с. 186-191.

40. Бабаджанова М.А., Насыров Ю.С. Мультиферментный комплекс ключевых ферментов фотосинтеза. // Физиология растений. 1992, т.39Б, вып.4, с.753-759.

41. Бабаджанова М.А., Хаитова Л.Т., Горенкова Л.Г. Потенциальная интенсивность фотосинтеза и активность ферментов карбоксилирования у исходных и мутантных форм растений. // Докл. АН Тадж.ССР. 1971а, т.14, №4, с.74-77.

42. Бабаджанова М.А., Хаитова Л.Т., Касьяненко Л.Г. Действие лейцина на потенциальную интенсивность фотосинтеза и активность ферментов, ответственных за фиксацию С02 у исходных и мутантных форм арабидопсиса. // Докл. АН Тадж ССР. 19716,т. 14, №5, с.50-51.

43. Бабаджанова М.П. Свободные и мембраносвязанный мультнферментные комплексы цикла Кальвина и регуляция их ферментативных активностей: Автореф. дис. докт. биол. наук. Душанбе, 2003, 45с.

44. Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев К. А. Свободный и мембраносвязанный мультиферментные комплексы цикла Кальвина листьев хлопчатника. // Физиология растений. 2002. т.49, №5, с.663-667.

45. Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев К.А. Онтогенетические изменения ферментативных активностей свободных мультиферментных комплексов цикла Бенсона-Кальвина. // Физиология растений. -2006, т.53, №1, с.38-44.

46. Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К., Алиев К. А. Некоторые кинетические свойства рибулозоЁшсфосфаткарбоксилазы листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. // Докл. АН Тадж. ССР, 1990, т.ЗЗ, №2, с. 69-73.

47. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Бабаджанова М.П., Эсаналиева Ш.А., Алиев К.А. Активность мультиферментных комплексов цикла Кальвина листьев различающихся по продуктивности форм хлопчатника. // Докл. АН РТ. 2007а, т.50, № 9-10, с. 798-801.

48. Бабаджанова М.П., Мирзорахимов А.К. Бакаева Н.П., Лебедева Г.П. Множественные молекулярные формы рибулозобисфосфаткарбоксилазы из листьев хлопчатника. // Докл. АН Тадж.ССР.- 1993, т.36, №3, с. 230-233.

49. Бакаева Н.П. рН-зависимые изменения и роль сульфгидрильных групп в проявлении активности фосфорибулокиназы хлопчатника. // V Конференция биохимиков республик Средней Азии и Казахстана: Тез.докл. Ташкент, 1991, с. 148.

50. Бакаева Н.П. Проявление, функционирование и местоположение сульфгидрильных групп РФИ, ФРК и РБФК. // Конференция профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного университета: Тез.докл.(естественные науки) -Душанбе, 1995. -С.41.

51. Бакаева Н.П. Структурно-функциональные особенности мультиферментного комплекса цикла Кальвина: Автореф. дис. докт. биол. наук. Душанбе, 1996, 45с.

52. Бакаева Н.П., Бабаджанова М.А. Очистка РФИ из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. // Известия АН ТаджССР. отделений, биол. наук. 1984, №4, с.50-55.

53. Бакаева Н.П., Бабаджанова М.А. Регуляция активности рибозо-фосфатизомеразы рибулозодифосфатом//1У Конф. биохимиков республик Средней Азии и Казахстана: Тез.докл. Ашхабад, 1986, с.234.

54. Бакаева Н.П., Бабаджанова М.А. Влияние рН на активность рибозофосфатизомеразы из листьев исходных и мутантных форм хлопчатника и арабидопсиса. // Биохимия. 1986. - Т.51, №6. - С.926-930.

55. Бакаева Н.П., Бабаджанова М.А. Влияние рибулозобисфосфата на активность рибозофосфатизомеразы. // Докл. Академии наук Республики Таджикистан Тадж.ССР. 1988. - Т.31, №6. -С.415-418.

56. Бакаева Н.П., Бабаджанова М.А. Ионизирующиеся группы активного центра фосфорибулокиназы хлопчатника. // Докл. Академии наук Республики Тадж.ССР. 1995, т.38, №9/10, с.67-72.

57. Бакаева Н.П., Бабаджанова М.А., Бабаджанова М.П. Различные формы структурно-функциональной организации ферментов цикла Кальвина. // Докл. АН РТ 1994. -Т.37, №9-10. - С.41-44.

58. Бикасиян Г.Р., Усманов П.Д. Мутант Дуплекс. // Докл. АН Тадж.ССР. 1973, т. 16, №9, с.69-72.

59. Борзенкова P.A., Мокроносов А.Т. Роль фитогормонов в биогенезе хлоропластов. // Физиология растений. 1976, т. 23, № 3, с. 490-496.

60. Воскресенская Н.П. Принципы фоторегулирования метаболизма растений и регуляторное действие красного и синего света на фотосинтез В. кн.: Фоторегуляция метаболизма и морфогенеза растений. М.: Наука, 1975, с. 16-36.

61. Володарский А. Д., Тихоновская Н.Г. Иммунохимическое изучение интеграции генетических систем клетки с нормальным и нарушенным пластомом. // Первое Всесоюз. Совещание «Генетика развития растений»: Тез. докл.-Ташкент,1980, с.

62. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. М.: Высш. шк., 1975. -392 с.

63. Генетика и наследственность. -М.: Мир, 1987, 300с.

64. Генетическая коллекция арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) // Ред. состав. Усманова О.В.- Душанбе, 2010, 96 с.

65. Гиясидинов Б.Б. Показатели фотосинтеза и донорно-акцепторных отношений у разных генотипов хлопчатника примоделировании плодоношения: Автореф. дис. канд. биол. наук. Душанбе, 2007, 24 с.

66. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. -М., Мир, 1986.-393с.

67. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты . -М. «Мир», 1966, 814с.

68. Ермаков Г. Л. Надмолекулярная организация ферментных систем. I. Структурный аспект проблемы. // Биохимия. -1993, т.58, вып.5, с.659-674.

69. Иванищев В.В. Физико-химические свойства и структура рибозофосфатизомеразы: Автореф. дис.канд.биол.наук. -М., 1982, 20 с.

70. Иванищев В.В., Насыров Ю.С. Об олигомерной структуре рибозо-5-фосфатизомеразы. // Докл. АН. Тадж СССР.- 1981, т. 1, №12, с. 751-754.

71. Иванов В.И. Радиобиология и генетика арабидопсиса. -Проблемы космической биологии. -М.: Наука, 1974,т. 27, 183с.

72. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции М.: Высш. шк., 1989.-591с.

73. Каган З.С. Аллостерическая регуляция ферментов и регуляторные энзимопатии. // Итоги науки и техники. Серия биологическая химия. -М.:ВИНИТИ, 1989, т.28, 148 с.

74. Капрельянц А. С. Пространственно-динамическая организация ферментов в клетке и регуляция метаболизма. //Биол.науки. 1988, №6, с.5-12.

75. Каримова М.А., Романова А.К., Доман Н.Г. Карбоксилаза рибулозо-1,5-дифосфата, ее свойства и роль в фотосинтезе//Всесоюз. Конф. "Фотосинтез и использование солнечной энергии": тез.докл. Душанбе, 1967, с.56-57.

76. Каримова М.А., Школьник Р.Я., Доман Н.Г. Карбоксидисмутаза и сопутствующие ей ферменты из листьев гороха, люцерны и Резушки Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Him). // Исследования по фотосинтезу, г.Душанбе, 1967, с.66-77.

77. Каспарова И.С. Эпигенетическая регуляция фотосинтетической ассимиляции ССЬ у хлопчатника. Автореф. дис. Канд. биол. Наук. Душанбе, 2006, 25 с.

78. Кефели В.И. Фотоморфогенез фотосинтеза и рост как основа продуктивности растений. Пущено: ОНТИ ПНЦ АН СССР, 1991, 133с.

79. Конев C.B. О принципах и механизмах регуляции в биологических системах. // Методологические и теоретические проблемы биофизики. М.: Наука, 1979.-С.78-89.

80. Кононенко JI.A. Физиолого-биохимические особенности фотосинтетического аппарата продуктивного мутанта хлопчатника Gassypium hirsutum: Автореф. дис. канд. биол. наук. Казань, 1982.-23с.

81. Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высш.шк.,1980, 272с.

82. Красичкова Г., Гиллер Ю. Сравнительная характеристика фотохимической активности хлоропластов некоторыхсортов и гибридов хлопчатника. // Физиология растений. 1978, т. 26, №2, с. 270-275.

83. КренделёваТ.Е.Структурно-функциональная гетерогенность первичных процессов фотосинтеза высших растений: Автореф. дис. докт. биол. наук. М. МГУ, 1985, 48 с.

84. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г. А. Физиология растений//2-е изд., М.: Высш. шк., 2006, 742с.

85. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция//М.: Наука,-1973, 263 с.

86. Кумаков В. А. Показатели фотосинтеза как селекционный признак у пшеницы. // Сельхоз. биология, 1967, №2, с. 551-558.

87. Курганов Б.И. Принципы интеграции клеточного метаболизма //Молекуляр.биология. 1986, т.20, вып.2, с.369-386.

88. Курганов Б.И. Роль мультиферментных комплексов в интеграции клеточного метаболизма. // Молекуляр. биология. 1986а, т.20, вып.6, с.1530-1538.

89. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. М.: Наука, 1978.-247с.

90. Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов. // Физико-химические проблемы ферментативного катализа/Под ред. Ю.М.Торчинского. -М.: Наука, 1984. -С.97-103.

91. Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов. М.: Наука, 1992. - 62 с. - (46-е Баховское чтение).

92. Курганов Б.И., Любарев А.Е. Принципы организации и функционирования микрокомпартмента метаболона. // Биохимия. -1989, т.54, вып.5, с.716-718.

93. Курганов Б.И., Любарев А.Е. Проблемы биохимической организации. // Биохимия. 1991, т.56, вып.1, с.19-32.

94. Курганов Б.И., Сугробова Н.П., Вильман Л.С. Надмолекулярная организация ферментов гликолиза // Молекуляр. биол. -1986, т.20, вып. 1, с.41-52.

95. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. - 353 с.

96. Лененджер А. Основы биохимии.-М.: Мир. 1985, т. 1, 365 с.

97. Лобашов М.Е., Ватти К.В., Тихомиров М.М. Генетика с основами селекции 2-е изд., -М.: Просвещение, 1979, 304с.

98. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Надмолекулярная организация ферментов цикла трикарбоновых кислот. // Молекуляр. биология. 1987, т.21, вып.5, с.1286-1296.

99. Льюин Б. Гены. М.: Мир. 1987. -544с.

100. Магомедов И.М., Горенкова Л.Г., Калер В.Л. Джумаев Б.Б.,. Абдуллаев А. Влияние внешних факторов среды и их взаимодействия на активность карбоксилирующих ферментов. Вестник ЛГУ, 1991,. №1, с. 73-77.

101. Маурер Г. Диск-электрофорез. М.: Мир. 1971.-360с.

102. Методы биохимического анализа растений. // Под ред. Полевого В.В., Максимова Г.Б. Л.: изд-во ЛГУ, 1978. - 163 с.

103. Миракилов Х.М., Абдуллаев Х.А., Каримов Х.Х. Изучение интенсивности фотосинтеза у некоторых видов растений. Изв. АН. РТ. Отд. биол. и мед. наук, 2009, № 1 (166), с.50-61.

104. Мирзорахимов А.К. Регуляция фотосинтеза и активности ферментов цикла Каливина. Изд-во ООО «Контраст», Душанбе, 2011 г., 48с.

105. Мокроносов А.Т. Онтогенетический аспект фотосинтеза. -М.: Наука, 1981. -196 с.

106. Мокроносов А.Т. Фотосинтетическая функция и целостность растительного организма. М.: Наука, 1983. - 64 с.

107. Мокроносов А.Т. Фотосинтез и продукционный процесс. //Физиология растений на службе продовольственной программы. -М.: Знание, 1988. 64 с.

108. Мокроносов А.Т., Гавриленко В.Ф. Фотосинтез, Физиолого-экологические и биохимические аспекты. М.: Изд-во Моск. гос. ун-та, 1992. - 320 с.

109. Наградова Н.К. Белок-белковые взаимодействия в функционировании НАД -зависимых дегидрогеназ. М.: Наука, 1990. - 56 е.- (44-е Баховское чтение).

110. Наградова Н.К., Муромец В.И. Белок-белковые взаимодействия в функции пиридиннуклеотид-зависимых дегидрогеназ. //Успехи биол.химии. -1985.-Т.26.-С.83-107.

111. Наградова Н.К., Муромец В.И. Мультидоменная организация ферментов. // Итоги науки и техники. Серия биол.химия. -М.: ВИНИТИ, 1991,- Т.38,- 168 с.

112. Насыров Ю.С. Фотосинтез и генетика хлоропластов. М.: Наука, 1975.-261 с.

113. Насыров Ю.С. Генетика фотосинтеза и селекция. М.: Знание, 1982. - 64 с.

114. Насыров Ю.С. Генетическая регуляция формирования и активности фотосинтетического аппарата. // Физиология фотосинтеза. -М.: Наука, 1982а. -С.146-164.

115. Ничипорович A.A. Пути управления фотосинтетической деятельностью растений с целью повышения их продуктивности. //Физиология сельскохозяйственных растений. М.: МГУ, 1967. - С.309-353.

116. Ничипорович A.A. Физиология фотосинтеза и продуктивности растений. // Физиология фотосинтеза. -М.: Наука, 1982. -С.7-33.

117. Ничипорович A.A. Фотосинтетическая деятельность растений как основа их продуктивности в биосфере и земледелии //Фотосинтез и продукционный процесс. М.: Наука. 1988 - С.5-28.

118. Ньюсхолм А., Старт X. Регуляция метаболизма. М.: Мир, 1977. -273с.

119. Павловец В.В., Романова А.К. Межмолекулярные взаимодействия НАДФ-маликэнзима и ферментов фазы карбоксилирования в экстрактах из листьев кукурузы. // Физиология растений. 1997, т.44, с.325-330.

120. Парина Е.В., Калиман П.А. Механизмы регуляции ферментов в онтогенезе. Харьков.: Изд-во Харьковского государственного университета и издательского объединения «Высшая школа», 1978, 204с.

121. Пинхасов Ю.И. Транспорт ассимилятов в зависимости от дистанции между листом и плодом. // Физиология растений. 1981, т.28, № 6, с. 1134-1141.

122. Расулов Б.Х. Регуляция фотосинтетического газообмена в интактных листьях хлопчатника: Дис. док. биол. наук. Душанбе. - 1994. -68с.

123. Розен Р. Принципы оптимальности в биологии. М.: Мир, 1969. -128 с.

124. Романов Г.А. Как цитокинины действуют на клетку. // Физиология растений. -2009, т.56, №2, с.295-319.198

125. Романова А.К. Методы выделения ферментов фазы карбоксилирования восстановительного пентозофосфатного цикла. // Методы выделения белков-компонентов фотосинтетического аппарата. -Пущино-на-Оке, 197Э.-С.ЗЗ-52.

126. Романова А.К. Регуляция автотрофной ассимиляции углекислоты при фотосинтезе и хемосинтезе. // Успехи микробиологии. М., 1975, т.10, с.27-40.

127. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. -М.: Наука, 1980. 160 с.

128. Романова А.К. Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза-оксигеназа // Успехи биол.химии. 1991, т.32, с.87-113.

129. Романова А.К., Павловец В.В. Надмолекулярные комплексы ферментов автотрофной ассимиляции углекислоты при фотосинтезе. // Физиология растений. 1997, т.44, с.264-274.

130. Страйер Л. Биохимия. -М. «Мир», 1984,т. 1, 227с.1 72. Тарчевский И.А. Основы фотосинтеза. М.: Высш. шк., 1977. -255с.

131. Удовенко Г.В. Механизмы адаптации растений к стрессам. // Физиология и биохимия культурных растений, 1979, т. 11, № 2, с. 99-107.

132. Удовенко Г.В. Физиологические механизмы адаптации растений к различным экстремальным условиям. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. Ленинград, 1979а, т.64, вып.З, с. 5-22.

133. Усманов П.Д Генетическая изменчивость признаков фотосинтетического аппарата высших растений: Автореф. дис. докт. биол. наук. , 1984, с.45.

134. Усманов Т.П. Влияние мутантных генов в различной генотипической среде на физиологические функции. Автореф. дис. канд. биол. наук. Душанбе, 2007, 23 с.

135. Урбах В.Ю. Биометрические методы М.: Наука. 1964.415с.

136. Фархади З.Н., Алиев К.А. Накопление и активность РДФ-карбоксилазы в онтогенезе листа хлопчатника: Тезисы докладов «Всесоюзного симпозиума углерода и азота при фотосинтезе», Пущено, 1985, с. 76-77.

137. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. -М.: Мир, 1980.-432с.

138. Филимонов A.A. Влияние температуры на структуру и функцию РДФ-карбоксилазы- оксигензы. Терморезистентность и продуктивность сельскохозяйственных растений. Петрозаводск, 1984, 145 с.

139. Фотосинтез. // Под ред. Говинджи. М.: Мир, 1987. - 470с.

140. Фотосинтез и продукционный процесс. // Ответственный. ред. А.А.Ничипорович. -М. Наука, 1988, 276 с.

141. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. М.: Мир, 1986. - 374 с.

142. Хамрабаева З.М. Функциональная характеристика хлоропластной Н+ АТФ-азы высших растений: Автореф. дис. канд. биол. наук. Душанбе, 1992.-24с.

143. Хасанов И.К., Ахмедов Ю.Д. Некоторые кинетические свойства фосфорибулокиназы из листьев шпината. // Докл. АН Тадж ССР. 1982, т.25, №9, с.554-560.

144. Хасанов И.К., Ахмедов Ю.Д. Влияние pH и температуры на активность фосфорибулокиназы. // Докл. АН Тадж ССР. 1983, т.26, №2.с.110-112.

145. Хасанов И.К., Ахмедов Ю.Д. Влияние субстратов на активность фосфорибулокиназы. // Докл. АН Тадж ССР. 1983а, т.26, №6, с.392-394.

146. Хасанов И.К., Иванищев В.В., Доман Н.Г. Кинетические исследования влияния субстратов на активность фосфорибулокиназы //Биохимия. 1986. - Т.51, №8. - С. 1242-1248.

147. Хасанов И.К., Иванищев В.В., Курганов Б.И. Ингибирование фосфорибулокиназы из листьев бобов продуктами ферментативной реакции. // Биохимия. 1987. - Т.52, вып.4. - С.531-538.

148. Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир, 1977.-398 с.

149. Чугунова Н.К., Карташов И.М., Холоденко Н.Я., Музафаров E.H. Влияние кинетина на активность растворимой и мембраносвязанной рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы хлоропластов гороха. // Физиология растений. 1993. - Т.40. - С.16-31.

150. Эдварде Дж., Уокер Д. Фотосинтез С3 и С4 растений: механизмы и регуляция. М.: Мир, 1986. - 598 с.

151. Эсаналиева Ш.А. Формирование мультиферментных комплексов цикла Кальвина и регуляция их ферментативной активности в листьях хлопчатника: Автореф. дис. канд. биол. наук.-Душанбе, 2010,24с.

152. Эргашев А.Э. Влияние высоких экстремальных температур на физиолого-биохимические процессы и продуктивность хлопчатника: Автореф. дис. докт. биол. наук. Душанбе, 1997, 44 с.

153. Эргашев А. Влияние высоких экспериментальных температур на физиолого-биохимические процессы и продуктивность хлопчатника: Обзорная информация. // НПИЦентр. Душанбе, 1997, 44 с.

154. Юлдашев X. Особенности фотосинтетического аппарата у гетерозисных форм хлопчатника: Автореф. дис. канд. биол. наук. -Душанбе, 1984, 19 с.

155. Юлдашев X. Фотосинтетический метаболизм углерода у мутантов Arabidopsis thaliana. // Сб. тр. Респуб. научн. практ. конф. молодых учёных и специалистов. Тадж. ССР, Душанбе, 1989,с. 62-65.

156. Юлдашев X. Физиолого-биохимические параметры активности фотосинтетического аппарата хлопчатника: Автореф. дис. док. биол. наук. Душанбе, 1996, 43 с.

157. Юлдашев Х.Ю., Якубова М.М. Онтогенетические изменения фотосинтетического метаболизма углерода у гетерозисных форм хлопчатника. // Докл.Академии наук Республики Таджикистан ТаджССР. -1983. -Т.26,№11. С. 730-733.

158. Якубова М.М. Функциональные особенности и структурная организация фотосинтетического аппарата с высокой активностью: Автореф.дис. док. биол.наук. М., 1984. - 46 с.

159. Якубова М.М. Экологические аспекты биохимической адаптации. // Известия АН РТ, 2011, №1, с. 77-89.

160. Якубова М.М., Назарова З.А., Кренделёва Т.В. Структурные и функциональные особенности фотосинтетического аппарата мутантов АгаЫс1ор815 ТЬаНапа (Ь.). // Биохимия -1980, т.45, вып.5, с.864-872.

161. Якубова М.М., Юлдашев Х.Ю., Кононенко Л.А. Фотосинтетический метаболизм углерода у растений различающихся по продуктивности. // Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в С3 растениях. -Талин, 1983, с. 5.

162. Якубова М.М., Юлдашев Х.Ю. Фотосинтетический метаболизм углерода в онтогенезе листа хлопчатника. // Научные доклады высшей школы, сер.биол.наук. -1984, №6, с.60-63.

163. Якубова М.М., Юлдашев Х.Ю., Хамрабаева З.М. Характеристика фотосинтетического аппарата гибрида хлопчатника в связи с эффектом гетерозиса. // Тез. докл. IV конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана, Ашхабад, 1986, с. 322-323.

164. Якубова М.М., Юлдашев Х.Ю. Фотосинтетический метаболизм углерода у хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. // Изв.АН ТаджССР. отд. биол. наук 1989,№1(114), с. 36-43.

165. Adler K., Arcona C., Maunteufell R., Suss K.-H. Electron-microscopical localization of chloroplast proteins by immunogold labeling of cryo-embedded spinach leaves. // Cell.Biol.Yutem. 1993. - V.17. - P.213-220.

166. Anderson L.E. Chloroplast and cytoplasmic enzymes. Pea leaf ribose-5-phosphate isomerase. // Biochem.Biophys.Acta. 1971. - V.235. - N 1. -P.245-249.

167. Anderson L.E. Ribose-phosphate isomerase and ribulose-5-phosphate show apparent specificity for a specific ribulose-5-phosphate species.// FEBS Lett. -1987.-V.212.-P.45-48.

168. Anderson L.E., Goldhaber-Gordon L.M., Li D., Tang X.Y., Pracosh W. Enzyme-enzyme interaction in the chloroplast: glyceraldehyde-3-phosphate isomerase and aldolase. // Planta. 1995. - V.196. - P.245-255.

169. Anderson L.E., Worten L.E., Fuller R.C. The role of ribose-5-phosphate isomerase in regulation of the Calvin cycle in Rhodospirillum rubrum/fin: Comparative Biochemistry and Biophysics of Photosynthesis. -Tokyo. 1968. -P.379-386.

170. Atkinson D.E. Enzymes as control elements in metabolic regulation. // The enzymes. (Boyer P.D., ed.). Academic Press, New-York-London. 1970. -V.l.-P.461-489.

171. Axelrod B., Jang R. Purification and properties of phosphoribulokinase from alfalfa. // J.Biol.Chem. 1954, v.209, № 2, p.847-855.

172. Axelrod B. Pentose phosphate isomerase. // Methods in enzymol. 1955. -V.L - P.363-366.

173. Bassham Y.A., Benson A.A., Kayl L.D., Harris A.Z., Wilson A., Calvin M. The path of carbon in photosynthesis XXI. The cede generation of carbon dioxide acceptor. // S. Amer. Chem. Soc. 1954, v. 76, p. 1760-1770.

174. Bjorkman O. Carboxydismutase activity in relation to light saturated rate of photosynthesis in plants from exposed and shaded habitats. // Annual report of the director department of Plant Biology. 1966, №94, p.305.

175. Cerff R. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (NADP) from Sinapis alba L. NAD(P)-induced conformational changes of the enzyme. //Eur.J.Biochem. 1978. - V.82. -P.45-53.

176. Cerff R. Quartemary stmcture of higher plant glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase. // Eur.J.Biochem. 1979. - V.94. -P.243-247.

177. Clasper S., Easterby J.S., Powls R. Properties of two high-molecular-mass forms of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from spinach leaf. One of which possesses latent phosphoribulokinase activity. // Eur.J.Biochem. 1991. -V.202.-P.1239-1246.

178. Dische Z., Borenfreund E.A. a new. spectrophotometric method for the detection and determination of the ketosugars and trioses. // J.Biol.Chem. 1951, v.192, №2, p.583-587.

179. D6ownton I., Statyer R.O. Temperature dependence of photosynthesis in cotton. -Ibed, 1972, v. 56, № 4, p. 518-522.

180. Gontero B., Cardenas M.L., Ricard J.A. A functional five-enzyme complex of chloroplast involved in the Calvin cycle. // Eur.J.Biochem. 1988, v.173, p.437-443.

181. Gontero B., Guidici-Orticoni M., Ricard J. A. The modulation of enzyme complexes. 2. Information transfer within a chloroplast multi-enzyme complex containing ribilose-l,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase. // Eur.J.Biochem. -1994, v.226, p.999-1006.

182. Gontero B., Lebreton S., Graciet E. Multienzyme Complexes Involved in the Benson-Calvin Cycle and in Fatty Acid Metabolism. // Ann. Plant. Reviews. Ads.Mc. Manus M.T., Laing W. et Allan A.Sheffield. Acad.Press. 2002, v. 7, p. 120-150.

183. Horecker B.L., Hurwitz J., Weissbach A. The enzymatic synthesis and properties of ribulose -1,5- diphosphate. // J.Biol.Chem. 1956, v. 218, №2, p. 783-794.

184. Howard TP., Metodiev M., Loyd JC., Raines CA. Thioredoxin mediated reversible dissociation of a stromal multiprotein complex in response to changes in light availability. // Proc.Natl Acad. Sci. USA -2008, v. 105, p.4056-4061.

185. Hurwitz J., Weissbach A., Horecker B.L., Smyrniotis P.Z. Spinach phosphoribulokinase || J. Biol. Chem. 1956, v.218, .№2, p.769-783.

186. Kawashima N. Comparative studies on fraction I protein from spinach and tobacco leaves. // Plant cell Physiol. 1969, v. 10, p.31-40.

187. Kawashima N., Tanabe Y. Purification and properties od D ribose phosphate isomerase from tobacco leaves. // Plant and Cell Physiol. -1976, v.17, №4, p.757-764.

188. Kawashima N., Tanabe Y. Stabilization of ribose-5-phosphate isomerase from tobacco. // Plant and Cell Physiol. 1976a.

189. Keleti T., Ovadi J., Batke J. Kinetic and physico-chemical analysis of enzyme complexes and their possible role in the control of metabolism. // Prog.Biophys.Mol.Biol. 1989, v.53, p.105-152.

190. Krieger T.J., Miziorko H.M. Affinity labeling and purification of spinach leafribulose-5-phosphatekinase. // Biochemistry. -1986, v.25, p.3496-3501.

191. Leegood R.C. Enzymes of the Calvin cycle. // Methods Plant Biochem. -1990, v.3, p.15-37.

192. Lim R., Cohen S.S. D-phosphoarabinolisomerase and D ribulokinase from Escherichia coli K-12. // J.Biol.Chem. 1956, v.241, №19, p.4304-4315.

193. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J.Biol.Chem. 1951. - V.I 93. -N2. -P.265-275.

194. Mayandon J. Benson A.A. and Calvin M. Ribulose-1,5-diphosphate from and C02 fixation by Tetragonia expausa leaves extract. // Biochem. et Biophys. Acta.-1957,v.23, p.342.

195. McElroy R.D., Johnson E.J., Johnson M.K. Characterization of ribulose diphosphate carbpxylase and phosphoribulokinase from Thiobacillus thioparus and T.neapolitanus. II Arch.Biochem.Biophys.Communs. 1968. -V.127. - N1-3. -P.310-321.

196. Mendes P., Kell D., Westerhoff H.V. Channeling can decrease pool size. // Eur.J.Biochem. 1992. - V.204. -P.257-266.

197. Mendiola L., Akazawa T. Partial purification and the enzymatic nature of fraction I protein of rice leaves. // Biochemistry. 1964. - V.3. - N 2. -P.173-179.

198. Muller B. A labile C02-fixing enzyme complex in spinach chloroplasts. // Z.Naturforsch. 1972, v.276, № 8, p.295-303.

199. Ovadi J. Physiological significance of metabolic channeling. // J.Theor.BioL 1991,v.152. p.1-22.

200. Ovadi J., Keleti T. Kinetic evidence for interaction between aldolase and D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. // Eur.J.Biochem. -1978. v.85. p.157-161.

201. Pawlitzki K., Latzko E. Partial separation and interconversion of NADP and NADPH linked activities of purified glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from spinach chloroplasts. // FEBS.Lett. 1974, v.42, p.285-288.

202. Peterskofsky A., Racher E. The reductive pentose phosphate cycle. LLI. Enzyme activities in cell-free extracts of photosynthetic organisms //Plant Physiology. 1961. -V.36. -P.409-413.

203. Porter M.A., Milanez S., Hartman F.C. Purification and characterization of phosphoribulokinase from spinach //Arch.Biochem.Biophys. 1986, v.245, p. 14-23.

204. Porter M.A., Stringer C.D., Hartman F.C. Characterization of the regulatory thioredoxin site of phosphoribulokinase //J.Biol.Chem. -1988, v.263, p.123-129.

205. Portis AR. Jr., Li C., Wang D., Salvucci ME. Regulation of Rubisco activase and its interaction with Rubisco. // J. Exp. Bot. 2008, v.59, p.1597-1604.

206. Rault M., Giudici-Orticoni M.-T., Gontero B., Ricard J. Structural and functional properties of multi-enzyme complex from spinach chloroplasts. 1. Stochiometry of the polypeptide chains. // Eur.J.Biochem. -1993, v.217, p.1065-1073.

207. Ricard J., Giudici-Orticoni M.-T., Gontero B. The modulation of enzyme reaction rates within multi-enzyme complexes. 1. Statistical thermodynamics of information transfer through multi-enzyme complexes. // Eur.J.Biochem. 1994, v.226, p.993-998.

208. Ruffer-Timer M.E., Bradbeer J.W. The regulation of activity of Zea mays phosphoribulokinase. // Advances in photosynthesis Research (Sybesma (ed.). -1984, v.3, p.597.

209. Rutner A.G. Spinach 5-phosphoribose isomerase. Purification and properties of the enzyme //Biochemistry. -1970, v.9, № 1, p.178-184.

210. Rutner A.G., Lane M.D. Non-identical subunits of ribulose diphosphate carboxylase. // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1967, v.26, p.531-537.

211. Sainis J.K., Harris G.C. The association of ribulose-1,5 bisphosphate carboxylase with phosphoriboisomerase and phosphoribulokinase. // Biochem. And Biophys.Res.Commun. 1986, v.139, № 3, p.947-954.

212. Sainis J.K., Marriam K., Harris G.C. The association ofd-ribulose-1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase with phosphoribulokinase // Plant Physiol. -1989, v.89, №1, p.368-374.

213. Salvucci M.E., Werueke J.M., Ogren W.L., Portis A.R. Purification and species distribution of rubisco activase. // Plant Physiol. -1987, v.84, №4, p. 930-936.

214. Schmid M., Davison TS., Henz SR., Pape UJ., Demar M., Vingron M., Scholkopf B., Weigel D., Lomhann Ju. A gene expression map of Arabidopsis Thaliana development. // Nat Genet. 2005, v.37, p.501-506.

215. Smillie R.M. Photosynhetic and respiratory activities of growing pea leaves. // Plant Physiology. 1962, v.37, №6, p.716.

216. Srere P.A. The metabolon. // Trends Biochem.Sci. 1985, v.10, p.109-110.

217. Srere P.A. Complexes of sequential metabolyc enzymes. //Annu.Rev.of Biochem. 1987. - V.56. -P.89-124.

218. Srere P.A., Ovadi J. Enzyme-enzyme interactions and their metabolic role. // FEBS Lett. 1990. - V.268. - P.360-368.

219. Sugiyama T., Akazawa T. Structure and function of chloroplast proteins. 1. Subunit structure of wheat fraction I protein //J.Biochem. 1967, v.62, p.478-482.

220. Sugiyama T., Tomoko J., Akazawa T. Subunit structure of ribulose 1,5-diphosphate carboxylase from Chlorella ellipsoidea. // Biochem. 1971, v.10, p.3406-3411.

221. Suss K.-H., Arcona C., Manteuffel R., Adier K. Calvin cycle multienzyme complexes are bound to chloroplast thylacoid membranes of higher plants m situ II Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1993, v.90, p.5514-5518.

222. Traverso JA., Vignols F., Cazalis R., Serrato AJ., Pulido P., Sahrawy M., Meyer Y., Cejudo FJ., Checa A. Immunocytochemical localization of Pisus sativum TRXs f and m in non-photosynthetic tissues. // J. Exp. Bot. 2008, v.59, p.1267-1277.

223. Ushiroyama T., Fukushima T., Styre J.D., Spivey H.O. Substrate channeling of NADH in mitochondrial redox processes. // Curr.Top.Cell.regul. -1992.-V.33.-P.297-307.

224. Vitto A., Gaertner F.H. Proteolytic inactivation of a pentafunctional enzyme conjugate: coordinate protection by the first substrate // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1978. -V.82. -P.977-981.

225. Wara-Aswapati, Kemble R.I., Bradbeen I.W. Activation of glyceraldehydephosphate dehydrogenase (NADP) and phosphoribulokinase in

226. Phaseolus vulgaris leaf, extracts involves the dissociation of oligomers. // Plant Physiol. 1980. - V.66. -N 1. -P.34-39.

227. Wedel N., Soil G., Paap BK. Cpl2 provides a new mode of light regulation of Calvin cycle activity in higher planta. // Proc. Natl Acad. Sci. USA.-1997, v.94, p.10479-10484.

228. Welch G.R. On the role of organized multienzyme systems in cellular metabolism: A general synthesis. // Prog.Biophys.Molec.Biol. 1977. -V.32. -P.103-191.

229. Weissbach A., Smyrniotis F.I., Horecker B.L. Pentose phosphate and fixation with spinach extracts. // J. Amer.Chem. Soe. 1954, v.76, p. 3611-3612.

230. Weissbach A., Horecker B.L., Hurwitz Y. The enzymatic formation phosphoglyceric acid from ribulose diphosphate and carbon dioxide. // J. Biol.Chem. 1956, v.258, p. 795-800.

231. Wolosiuk R.A., Buchanan B.B. Studies on the regulation on chloroplast NADP-lmked glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. // J.biol.chem. 1976. -V.251.-P.6456-6461.

232. Wolosiuk R.A., Buchanan B.B. Regulation of chloroplast phosphoribulokinase by the ferredoxin/thioredoxin system. // Arch.Biochem.Bio-phys. 1978, v. 189, p. 97-101.

233. Yonischot G.R., Ortwerth B., Koeppc O.J. Purification and properties of nicatinamide adenine dinucleotide phosphate requiring glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from spinach leaves. // J.Biol.Chem. 1970, v.245, p.4193-4198.

Информация о работе

Мирзорахимов, Акобир Каримович
доктора биологических наук
Душанбе, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Регуляция активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина у высших растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы