Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлоропластах высших растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Формирование надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлоропластах высших растений"

На правах рукописи

УЛ.Ч 081,19:577.15-

■1ЮР;.'Е ГРСВАГГ;-1Е !{АД-.ЮЛЕКУЛЯРНОЯ ОРГАНИЗАЦИИ •Ж.ЁпЮВ -оГгЛА ли;Ы,П1А В ХЛОРОИЛАСТАХ ВиСИМХ РАСАМИ

(.специальность c3.Co.I2 - физиология раст-э;..

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

ДУШАНЫ - 1255

Работа выполнена в лаборатории 'молекулярной биологии и генной инженерии Института физиологии и био$азики растений АН Республики Таджикистан.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор К.А.Алиев.

сшцшше оппоненты:

доктор биологических наук A.A.Абдуллаев, кандидат биологических наук А.Э.Эргашев

Ведущая организация: Таджикский государственный : университет

Защита состоится " 6 ". ¿У*_1596г.

в /0 час, на заседании ^ссертационного Совета Д 013.08.01 по заадте диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии и биофизики растений АН Республики Таджикистан (734063,г.Дуыанбе, ул. Мни, 299/2).

С диссертацией шэащо ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики растений АН Республики Таджикистан

Автореферат разослан " мфъМ__1995Г.

7ченый секретарь . Диссертационного Совета, доктор биологических наук

Х.А.Абдуллаев

ОБОДЯ ХАРАКТЕПКККА РАБОТЫ

Актуальность теш. 3 настоящее время все большее • признание -получает-идея"рзгуляппи ЧйтаболизШ 'ayïcif образования динамических мультиформонтних ш!сс;.тблоЙ-сг.~о:яр.-ïob, составляющих надмолекулярный уровень оргянт'звт^? формантов (Фридрих, 1986; Кургане?, 1236; ISB9; 1Э91";Кэп-рельянц, I9UÖ; Каган, 1229; Карасе в, Стефанов, IS9I; Наг-радова, Мурокец, 1291; Ермаков, 1993). В связя с основной тавдонцие»$ развития соврвксшюл зкзачолегая яеля-ется переход ох исследования изолированных формантов к изучении их надмолекулярной z сгсссЗзз

цаонироваяия в состава клеток.

Рибулозобисфосфаткарбоксилаза-оксигеназа (КЗ 4.I.I. 39) - ключевой формэпт восстановительного понтоэофосфат-ного цикла автотрофной ассимиляции углокислсты, открытого Кальвином о сотрудниками в начало 50-х годов нынеанэго столетия. Роль карбоксила зной функции фермента в баосфэре исключительно, поскольку она является основным источником органического взщвстяа на Зсьпэ з согрей? i »олог;; кую эпоху. IlosTCîvry РБ5К0 с исшита открыл s1, wr"

ssoro времени остается наиболоо шпгчюазко г.гтч-е ...... . "

зонтом. Ьольшие уездхи досаигиут:: а лсслсдогглпг.:

..'.О') СКОГО uIvTO ~п Г:." _ i < ; ^ , '-Ч.'О' '.'.'i.". ..........

дяции фермента in vivo a in vixro , мкжшу.-» »\*. : -cöopiai молекулы олигомера и генеглкп ¿BVt'Jj г.:. '"•*•*..

Однако, исследование иадаслекул^рно х- •/; ? - у -; ■-завда ферлентов цикла Кальшна началось только в послед- нее десятилетие. Одной нэ форм ¡гздг.'ол'зкгглрт^" orr~rr~?-ции ферментов являются глульта^ср^он^ше . ¡loc-r-

полокение о существовании в строме хлоропластов тройного комплекса,, состоящего из рибозофосфатизомеразы (КФ 5.3.1. 6.), фосфорибулокиназы (КФ 2.7.1.19) и рлбулозобисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы высказывалось ранее рядом авгоров ( Рп lerkofeky .Hacker ., 1961; UacEli-oy st al., ISStí; duller ,' 1972;Рошнова ,1973). Подобшй комплекс бил зидедои ИЗ листьев гороха (Sainis , Harris ,1236) и шпината ( Sainis et ai .,1989). Затем из листьев шпината был

выделен пятафериентний комплекс ферментов цикла Кальвина ( Gontero et а},1938).

Из листьев хлопчатника и арабидопсиса также был выделан щулмиферментный комплекс (Бабадаэнова,Насыров,1992)., состоящий из рнбозофосфатвзомеразы (РФИ), фосфорибулокина-8Ы (СРК) и рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксагеназы (РЕФКО). Молекулярная масса комплекса составила 520+30 кДа,.а на 812 кДа, как ожидалось при сложении молекулярных маос РФй (5? кДа), ФРК (240кДа) и РБФКО (52СЗДа). Таким образом, совокупность данных, полученных разными авторами, указывает на необходимость глубокого изучения структурной организации и функциональных-свойств этого мультиферментного комплекса. Отсутствие каохлексных исследований структурной организации и функциональных свойств мультиферментного когшлекса ферментов цикла Кальвина делают эту работу актуальной,

Цель и задача исследования. Основной целью нашей работы явилось исследование особенностей формирования надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлоро-цластах высших растений и выявление функционального и ре-гуляторного значения такой организации.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

- выделить электрофоретически гомогенные препараты ферментов ШГ, ФРК и РВЖО из листьев хлопчатника ;

- определить молекулярные массы нативных молекул ферментов ' Ш, ФРК и РБФКО и их субъединиц;

- установить, обладают ли ферменты РФИ, ФРК п РБФКО другими ферментативные активностями;

- провести кинетические исследования различных ферментативных активностей, проявляемых ферментными препаратами РФИ, ФРК и РБФКО; '

- на основания иолучошшх данных выязать особенности а формы надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвя-ка в хлороилаолах высших растений.

Научная новизна и поактячеог.ая значимость работы. Впервые установлено, что электрофоретичоокп гомогенные ферментные препараты Р-£1 и ФРК обладают тремя фар^антнтив-

ними активностями - рбозофосфатпзокорззпой, фосйорибуло-киназяой и рябулозобисфосфаткарбоксалазисй. ШеКО црояшл-ет шесть ферментативных активностей - рибо?0!?осф9тт<ясмс;--разную, фосфорибулокиназную, рибулозойис.Т/ос^атйас^о-'.сялл.э-цую, глицоральдогадфосфатдегидрогеназнуд), фосолглицвратки-назную и фруктозобисфосфатазиуо. У субьолапзи 5РК с молекулярной массой 60 кДа и субъедшгац РБйчО с молекулярнс-а тосой .52 кДа опродзленн три форшшатипнш активности г рибозофосфатизомеразная, фосфоонбулокчназнат и р::булозс-бисфосфаткарбоксилазная.

Кинетитесото псслсдогаппя йак»бка*ати>ш.)ч

тавностя, щзоявлясмзй фариинъ.««! врадараташ ЬЫ, н&Рд я РБФКО в присутствии различных субстратов,позволили обнаружить у РФИ, ФРК я РБФКО функциональные свойства, характерные для мультифермэнтных комплексов - "облегченный катализ" и координированные регуляторные эффекты.

Обнаружение у субъеданив, ФРК и РБФКО ц у катлвных форм ферментов ИМ, ФРК и РБФКО различных фермэнтатвв;?кх активностей и результаты канстячсских ясследо?ак:*:л лили нам сформулировать новые лрадстаяюьяя оо э'.-лх ¡.ер-ментах : субъедшица Р*»1 являемся лвухдомвывдо я -зоето*«-ческим ферментом ; фермент Р*И - мультпдокскл ^ полифункционашшй фермент ; ФРК и РБФКО - дйкггте^г-мультиферментные комшшксн-ассоэдаты, способ».;* • ^с. .даваться в мембрану, образуя метаболой.

Физиологический смысл существования фгр."-.г/ч • Кальвина в трех формах - свободной,

плексов ж штаболояа, находящихся в динамическом шпшда1-сии друг с другом, заключается в реализаций рогуле с. механизмов различных уровней : механизмов гоцасстаза механизмов слежения. Свободные растворимые ферменты участвуют в поддержании клеточного гомеостаза с помощью механизмов изосторической и аллостерьческой регуляции. 3 муль-тиферментных комплексах и метаболонах осуществляется регуляция каждой ферментативной активности в отдельности и всей метаболической системы как единого целого через механизмы сложения. Благодаря механизмам сложения арснсхс-

дат нереклхчениа метаболической системы на новый режим функционирования в соответствии с требованиями внешней среды.

На основании всей совокупности полученных наш я имеющихся в литературе экспериментальных данных предложена схема формирования надмолекулярной организация ферментов цикла Кальвина в хлоропласта;: высших растений.

Получанные. результаты дают основание предложить в качестве физиологического тэста прл отборе растений дая ге-нетико-селокционшх работ определение одной из ферментативной активностей ыулътиферментного комплекса, например, рибозофосфатизоморазной.

Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены (или представлены) на Первой научной конференции Биохимического общества Республики Таджикистан (Душанбе, 1993), ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава Таджикского госу-ниварсктета (Душанбе,1993,1994), совместных научных сема-нарах Общества физиологов растений и Биохимического общества Республики Таджикистан, лабораторий молекулярной ензи-мологии и молекулярной биологии и генной инженерии Института физиологии и биофизики растений АН Республики Таджикистан (Душанбе,1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5. работ .

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ЮЗ страницах машинописного текста, содержит 2Б ри-оунков, У таблиц и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей две главы, заключения, выводов п списка цитированной литературы работ) . . '

ЭШШИЕ£ЕНТАЛЫШ1 ЧАСТЬ Обгект, условия и методы исслодоваш'я

Источником получения ферментных препаратов РФИ, ФГК •' и РЕФКО б^ти 15-25-дшвнке листья хлопчатника ( йог-урши

hireutuni CS!5eiiCTB0 b'AiV'iC*-:." I ср.'й n

зития растений 5-6 н^стояи;!?: мстьеа.

- —Хлспча?;шГ вкрадывался с '^рс .о.с,:,:--

чвских меропраятлл в полевых ycrj-r/.'.r.z ч; :>;:,: uf.,1. участка Института /Тчзиолоиги я "Ч; -

публикн Таджикистан.

Определенна содержания белка поовотадост. т?п "Тс—

ури ( Lov/гу et q, 1,1951).

Определение карбокс»ияагаол a::iai3Uo«ii«i приводила при 30°С радиометрическим методом (Романова.19ЯГЛ по

ТА

{ОДтицчия Н^СС^ " ilninvirro роот.т,,,,.

Определение активности $РК проводилось пс модифицированному методу Гурвнтца ( Kurwit?, «t aitl„56). Лабильные фосфорные соединения определяли по методу й/ске-Суббароу (Лоури-Лопес) в модификации Скулачова (Кочетов,1981).

Определение активности P2/I проводила-по модифицированному методу Аксельрода и Янг (Axelrcd.YanG .j.954") . Определение продукта реакции - кетосэуярр презздзлз

ЭОДЫШМ меТОДОМ ПО pO.'iKI,г; Г" .'о,..; 'г-' •-•„.

Акт и рис с??.. РАФ.!," ^псог;гччг:ч ■ ц

чп определяли по . :i''—v-oг; u*t"< ;

(1951).

АКТИВНОСТЬ '^руктезобпето^ разработанному лад вкеаях рг»сюн>:3 i?c • 'ч,- .

Выделение а счг.сткя фер-кнтия. наг..''? . о-.--, нама по методам, раэрэоо-ганьот с учсао- -п- . _ ••• .. хлопчатника (Бакаева ,Баоадаакоза, 1984;Бабадааном, Г; -.cos, 19В4;Бсбад.тзПОЕа.Ггл<аб;л ..'..т.--.. . ;.с: по.т.'чзла nj,i обработка ч . . •

додецилсульфатом натрия.

Для определения гомогенности ферглзншл: w r-'.v:-> иолекуляраои ыасси ферментов и их сусч-иячм™ —

аналитический диск-э.гзх-тго ггх-л в лчч'ч-у ...

Полученные результат:.-I9S4;Лакин,I960) . Првдстзазошг^.« д. .. верительной вероятнеггз

исслздсва^'е оекштатгшкых активностей,проявляе-

ьсх препарата:® рбжо, фрк и р$и из

ллотъез иопчатжка. сорта 1ш-ф

Выделение и очистку ферментов повторяла многократно в течение нескольких лет. Содержание белка и ферментативные активности различных ферментных препаратов определяли в трех повторностчх. Поскольку во всех случаях были получены очень близкае результаты, нами приведены типичные примеры.

Определение ферментативных активностей, проявляемых ферментными препаратами РБФКО, ФРК и РФИ

Полученные наш электрофоретически гомогенные ферментные препараты РФИ, ФЕл и РЫ>КО были использованы для определения молекулярной массы и наличия у них других ферментативных активностей в присутствии свойственного для данной реакции субстрата и субстрата предшествующей или последующих реакций. Из представленных в таблице I данных видно, что ферментные препараты РФИ$ ФРК и РБФКО и субъединицы ФРК и РБ5К0 проявляют по три ферментативные активности - рабо-зофосфатизоыерачную, фосфорибулокиназную и рибулозобясфос-фаткарбоксилазьую. Субъединицы РФИ проявила только одну ри-бозофосфатизомеразную активность, причем вдвое меньшую в сравнении с нативным ферментом. На основании полученных данкых можно предположить, что при объединении двух .идентичных субъединиц в димер в области контактирующих поверхностей формируется новый активный центр или центры, на котором или которых происходит последовательное превращение Ри5-Ф в .РБФ и фиксация ча РБФ углекислоты с образованием 3-ФГК. 3 таком случае, ферментный препарат РФИ с молекулярной массой 52 кДа может представлять собой мультиферментный комплекс и1и коньюгат, обладающий тремя ферментативными акта вностяшь

В ферментном препарате РБЖО были определены такяе активности важнейших ферментов цикла Кальвина - глицеральде-гвдфосфатдегвдрогенапнач и фруктозобисфосфатазная, веллчи-ны ферментативных активностей оказались равными 32+0,7 и ¡1 1,6-гО,4 ыкмоль продукта з минуту ка мг белка соответст-

Таблица I

^_____ , .;з ллетьсз --рг«* 1ио-Ф

(фаза оззвгггля састанлл 5-С казгоадах ляс?**???

Ферментативные активности,

раташ Р(М, г-РК а РКХО аз

Ферментный

препарат

кДа

.активность

!

РФП 52+2

СубЪОДТ!>!;!ЦЬ! 26+1

¿РК 240+10

субъедзшщы 60+2

РККС 52С+30 субъединяцы 52+-2

ртбозоТос^йг-

ак

1.ЦС+12

¿.5 С с+16

2:334+23 2с58+31

ИМ

ФРК

52+2

240+10

фосфорабулока-назная ....

субъедктпщы 60+2 РБ5К0 52С+30

субъединицн 52+2

РФИ

й?К

РШС0

52+2

240+10

520+30

асс^аткзрСо:-. силазаая

Р-5-Ф Р~5-1>

Г . .',

гЛ'-О

3861+19 3455+17

РВ^ 0,6'>»-С,05

р-б-г

ТЕ*

1,3 + и,05 ¿,1 + 0,0-

/ ¿1.+

о

ix¡то. Метод определения активности ГАФД предполагает предварительное действие фосфоглицераткяназы, что позволяет считать РБЖО стабильным мультиферментным комплексом, проявляющий шсть ферментативных активностей цикла Кальвина.

Из приведенных в таблице I результатов видно, что величины удельных фосфорибулокзназной и рибулозобясфосфаткар-боксилазноЛ активностей ферментных препаратов Р$И, ФРК и РБФКО, определенные при использовании в качестве субстрата Р-5-Ф на 11-13% выше в сравнении с вели чина:,га удельных активностей, полученными при использовании собственных специфических субстратов - Ри5-Ф и FES, Полученные результаты свидетельствуют о проявлении РБФКО, ФРК и РФИ одного из важнейших функциональных свойств, характерных для мульти-ферментных комплзюзов -"облегченного катализа". "Облегчен-: вый катализ" состоит в ТШ, что частичные реакции в комплексе протекают намного медленнее при добавлении промежуточных субстратов, чем начинающаяся с первого субстрата полная реакция (Фридрих ,1986).

Другим свойством,'характерным для ыультиферкентных комплексов, явлтгася координированные рогуляторнда эффекты, обнаруживаемые лрз кикьтических исследованиях. Поэтов нами бкло изучено влияние длительности реакций, концентраций белка-фермента ч субстратов на различные ферментативные активности, проявляешь фергланзныыи препаратам РБФКО, ФРК и РФЛ.

КШЕИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛИЯНИЯ СУБСТРАТОВ НА РАЗ-JLWfHE ФЖИШЯШНЫЕ АКТИВНОСТИ, ПРОЯВМЕШЕ Ф2Р-i,EHTrK£I ПРЕПАРАТАШ РФЛ, ФРК И РБФКО №'1ШСШВ ХЛОПЧАТНИКА СОРТА 108-5 Зависимость от концентрации субстрата рибозотооМт-11 зО'-'-рразной активности ферментных препаратов РОИ, ФРК и РБЖО из листьев хлопчатника сорта 108-Ф

;;з представленных на рис.1 данных вздно, чаю фор,та кинетических кривых одинакова для различных ферментных препаратов: PIÜ (pac.IA), ФРК и РБФКО (рисЛБ). Для ферментных rj9nap..TOB Г«Л, ФРК и PESK0 зявиеииость• накопления г'у5-Ф от

«

п о

I

ю

__—-я

А*

/О

//

I //

1 °.50

I

-4:—¡1-

минуты

2

минута

Рис.1. Кинетика образования Р:;5-5 при действия ферментных препаратов: Л - РФИ. Е - г

иг листьев хлоп'хатжг.з сс

- .. ^ V.

1,5

0,5 Гас.2.

I 1« ¡1

м'Д Р-

и , и I

с£Л2си,;сстэ от ко-Г'-тт:,-« суЗс.г^-га 3 ЬэтгзомоьазпоЛ акт7?ксота йе^оятЕ:»/ А - РОЯ,"Б - 5?К(о-с-о) л Г!? _

хяокчатш.кз со->те IX-*.

гос-

~ г

у; Л<5Ь

длительности реагади не является линейной. Нелинейность не исяет быть объяснена исчерпанием субстрата реакции, поскольку концентрация Р-5-Ф была наседающей. В данном случае нелинейность является кинетическим проявлением аллостеричес-ких взаимодействий, характерных для гистерезасных ферментов.

На основании полученных данных опыты по изучению вли ная различных концентраций субстрата на рибозофосфатязоме-разную активность ферментных препаратов ШЛ, ФРК и РКЖО, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, проводились в течение одной минуты.

Из представленных на рас.2 данных о зависимости от концентрации субстрата рибозофосфатизомеразной активности ферментных препаратов . УЛ, ЗРК и РБЖО видно, что независимо от ферментного препарата наибольшая рибозофосфатизоме-разная актив ;ость прояв тся при содержании в реакционной среде 0,5 мУ Р-5-Ф. При этой оптимальной концентрации рибо-зо-5-фосфата ферментные препараты РЖ, ФРК и РШСО почти не различаются по \ах. При концентрациях субстрата, превышающие 0,5 мМ,наблюдается снижение рибозофосфатизомеразной активности , которое больше проявляется на ферментном препарате Р5И. Резулы .гы, полученные при исследовании зависимости от концентрации Р-5-Ф в реакционной среде рибозофосфатизомеразной активности ферментных препаратов РФИ, ВЕК и РВ5К0, была использованы для расчетов велияинГз]^ .Взличины § для Р-5-Ф ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО при проявлении ИШ'! рибозофосфатизомеразной активность приведены в

та<3лкце 2- Таблица 2

Величины Бд д(Ш) для Р-5-Ф ферментных препаратов

, ФРК и РК'КО из листьев хлопчатника сорта 108-Ф при проявлении ига рибозофосфатизомеразной активности

Ферментный препарат | Цэ,5 ' ^

РЭД 2,2 + 0,04

ФРК 1,9 + 0,03

РБ2К0 1,8 + 0,03

Из приведенных в таблице 2 дднких видно, что пра проявлении рис>озофосфатязо:.:еразяо1" активности с узелзчо:«:е:л молекуляркой массы - ферментннх трепаратов средство ~:г 5^""

улучшается.

¿орш кривой зависимости от концентрации субстоата ри-бозсфосфзтизомеразиол активности, лроллг^кл'л . препаратом РОЛ, не яааяотся сиг.ссгдн02, .толуионо

ранее друмив авторзга (Бакаева,Басадеа^оы, г.:р-

г.:ента аз этого ко объекта. дяг долученщк -ззл-

симости рибозофосфатизомеразной активности от концентрации субстрата 'харалтеиаы ре экий дооцч нч ».п»т» н»с™1,5кт?<:<р?с. 2А.). Разная фоума кривых обусловлена тем, что авторы изучав ли зависимость активности РЗИ от концентрации субстрата при высокой концентрации белка-фермента - 2 ;/кг белка-фермента на мл реакционной среды. Наши эксперименты проводились при низких концентрациях белка-фермента - 0,2-мкг белка-фермек-та на мл реакционной среды. Зто позволило обнаружить инги-бирование активности фермента при высоких концентрациях субстрата.

Ранее было обнаружено актлвлругдо«; •• т-ог,?.-::-

ческих комгентрацзд РБ5 на нзтизкуп фор-„7 ..'.>кг> . к • делыше субъедлницч РГм лз листьев хлопчатника "(.о-^

(Бакаева,Бабад.7ллова, 1088).

Для РФИ из листьев хлопчатника обтрясла тег-у- :, лядая активности 3—ФГК (БаОадаэиэва,Бакаева, Ал."':. ■- • бадкаиова,Наскров,1932).

Совокупность полученных нама а другими авторами данных указывают на аллостеричвскую природ як^й-т^гл:— л;, бытком субстрата.

Таким образов, нелинейность кривых завлсзмостл накопления продукта рибозофосфатпзсмеразлой реакции от ее длительности, субстратное ингибяровакне, проявл-о^сое*: лрл низких концентрациях бодла-фермента, актива??».-» до Летая з РБ5 на нативную форму фермера л на отдельное сус.гед^гя:^ Р1И, регуляция активности фермента 3-21?; по прзггкпу с ной связи дают нал основание считать, что ?УЛ относи тех к рбХ7ляторнш ферментам, субгедиялц:; которой имеют аллосхв-

рически;! центр.

Одинаковая с ферментным препаратом РЖ форма кинетических криви: зависимости накопления продукта рибозофосфат-изо:,»разной реакции от ее длительности и зависимости от -сонцентрацаи субстрата рибозофосфатизомвразной активности, проявляемой ферментными препаратами ФРК и РБФКО, свидетельствует о том, что, по-вздш,:о!..у, ФРК и РБФКО могут представ-•ллтъ собой ассоциаты, в состав которых входит мультидомен-ней шлифункнпональный фермент РФИ.

Влияние различных концентраций Р-5-Ф и Ри5-Ф на фосфо-рябулокиназкую активность различных ферментных препаратов

Из представленных на рис.3 данных видно, что для ферментных преларатоз РФИ, f^K и РБФКО зависимость накопления РЕФ от длительности фосфошбулокиназной реакции не является линейной при использовании в качестве субстрат^, как Ри5-Ф, так и Р-5-Ф. Все ферментные препараты проявляют значительно более высокую фосфорибулокиназную активность при использовании в качестве субстрата Р-5-Ф,

Сравнение " ачений фосфорибулокиназной активности ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО показывает,.что наибольшую активность проявляет ферментный препарат РФИ при использовании и Р-5-Ф, и Ри5-Ф. Полученные результаты согласуются с данными других авторов о том, что низкомолекулярные формы ФРК обладают более высокой активностью в сравнении с высоко кошолекулярнььга формами фермента (Хасанов.Иванвщев.Доман, 1966; Porter ,1990).

На основании полученных данных опыты по изучению влия-Ш1я различных концентраций Р-5-Ф или Ри5-Ф на фосфорибуло-кшазную активность ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО проводилась : течение одной шнуты.

Из представленных на рис.4 и 5 данных видно, что наибольшая фосфорабулокиназная активность фермзнтных препаратов РФИ, ФРК и РБЖО проявляется пр:-; содержании в реакционной среде 0,25-0,5 ь£Л Р-5-Ф или Ри5-Ф. При этих оптимальных концентрациях Р-5-Ф ..:¿a. Ри5-Ф фосфорибулокиназная активность ферментного препарата РФИ значительно превышает ак- .

0,4 Р

¡3 о.з

п.

о

О Л о

0,1

МИН

мин

Рис.3. Зависимость от субстрата Р-5-Ф (о-о-о) или Ри5-Ф (в-в-о) кин-'тшси образования РБ$ при

.•»шстзмк £эр:.'ентш;у пргнаратов: А - Р5Л, Д - ФРК, В - ГБ;К0, из листьев хлопчатника сорта 1С8-<1>.

О"-Т"

О. -к м -ж

¡м ш

Рте.4. Влияние различных концентраций субстрата Р-5-Ф (о-о-о) или Ри5-Ф(е-в-в) на проявление фосфори-булокиназной активности ферментными препаратами^ - №1, Б - ФРл из листьев хлопчатника сор; та 108-Ф.

Рас.5. Влияние различных концентраций субстрата Р-5-Ф

(о-о-о) и Ри5-£ (•-•-•) на проявление фосфорз-

булокиназноЁ активности ферментным препаратом ?БШ аз листьев хлопчатника сорта 106-Ф

тивность препаратов ФРК а РЕЗКО. Для кривых зависимости от концентрации Р-5-Ф фосфорибулокиназной_ активности фермент-нк" препаратов РФИ, ФРК и РБФКО характеренрезкий выход на"" плато насыщения уже при 0,25 ¡¿.I субстрата со спадом активности в пределах концентрации субстрата 0,5-1 мМ. Для кривых зависимости от концентрация Ри5—5 фосфорпбулокиназной активности ферментных препаратов FiH и ФРК характерно плато насыщения прл 0,25-1 м'Л субстрата со спадом активности в пределах концентрации субстрата 1-2 мМ. Спада активности не наблюдается только для ферментного препарата РБФКО.

Таким образом, для ферментнпх препаратов РФП и ФРК наблвдается ингибирование фосфорибулокиназной активности при использовании высоких концентраций как Р-5-Ф, так и Ри5-Ф,фосфорибул$киназная активность ферментного препарата РБФКО ингибируется высокими концентрациями Р-5-Ф. 3 случае же использования в качестве субстрата Ри5-Ф ингибярования на наблюдалось.

Форма кривой зависимости от -> :шце.нтрацииРи5-Ф фосфори-булокинззной активности, проявляемо.» '?6рментиыма препаратами РФИ, ФРК и РБ:70,но является сип.:о:!Дной и не имеет про-мejsyro4Ht.ro плато, как было получено ранее друг:!:« автора-ш для фермента ФРК из этого же объекта (£абадж:юва,1900; Бабадканова.Автомонова, 1983;БабадлсанОЕа.Бакаева,Али в, 1969). S-образные кривые с наличием промежуточного плато были получены татке для ФРК из листьев бобов (Хасэнов,йванпщев,До-ман,1986). Разная форма кривых обусловлена тем, что авторы изучала зависимость активности ФРК от концентрации Ри5-Ф при высокой концентрации белка-фермента - I лг белка-фермента на мл реакционной средн. Наши эксперименты проводились при низких концентрациях белка-фермента - 0,2 :лкг на мл реакционной среды. Согласно модели диссоциирующего регу-ляторного фзрмента по Курганову (I978")f Форма кривых зависимости скорости ферментативной реакции о? концентрации субстрата зависит от концентрации ферментного белка. Поэтому можно считать, что полученные nat.ni и другими авторами результаты указывают на соответствие ферментов РФЛ, ФРК и РБФКО модели медленно'диссоциирующего аллостерического

фермента по Курганову.

Для мультиферментных комплексов (коньюгатов) характерно наличие координированных регуляторных эффектов. Одним из проявлений этих эффектов является повышение субстратом первого фермента комплекса(конькгата) величины К^ максимальной скорости Утахпоследущих реакций и снижение величины К^ для соответствующих субстратов ферментов, катализирующих последующие стадии метаболического нути.

Из представленных на рис.4 и 5 данных видно, -что скорость фосфорибулокиназной реакции, катализируемой ферментными препаратами РФИ, ФРК и РБФКО,действительно значительно выше при использовании в качестве субстрата Р-5-Ф, а не Ри5-Ф. Следовательно, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в данном случае Ри5Ф является промежуточным субстратом комплекса (коньюгата) ферментов, катализирующих последовательные реакции метаболического пути. Р-5-Ф повышает скорость фосфорибулокиназной реакции, являющейся второй после рибозофосфатизомеразной в данной мебаболичесной цепи. Приведенные в таблице 3 величины [Зд 5 указывают на большее сродство ферментных препаратов ФРК и РБФКО к Р-5-Ф, субстрату первой реакции метаболической последовательности: Р-5-Ф-*-Ри5-Ф РБФ 90?»,. 3-ФГК.

Таблица 3

Величина[э^ для РОИ, ФРК и РБФКО из листьев

хлопчатника сорта 108-Ф, проявляющих фосфорибулокит-. __казные активности

Ферментный препарат ; Субстрат М0,5 • И"4

РФИ Р-5-Ф 2,68 + 0,03

Ри5-Ф 3,03 + 0,04 .

ФРК Р-5-Ф 2,17 + 0,02

Ри5-Ф 3,04 + 0,04

РБФКО Р-5-Ф 2,16 + 0,02.

Ри5-Ф 3,34 + 0,05

Зависимость от концентрации субстрата карбоксилазной активности ферментных препаратов РуИ, ФРК и РЕЗКО

Кинетическое поведение диссоциирувдях аллостврпчеаах 4»рментов" загасит от концентрации фермента..(Курганов,ISV'b). Поэтому наш было исследовано при Таксированных концентрациях субстрата влияние различных количеств белка-£ер;лента в реакционное среде на карбоксилазную активность фер.ментнкх пренаратов РФИ, ФРК и РЕЖО из листьев хлопчатника сорта 108-Ф. 3 таблице 4 приведены данные о зависимости от концентрации белкэ-фер«ента удельно;: карбокснлазнон активности ферментных препаратов WA, ФРК и РБФКО при гснользованиа в ничйстго суострятэ Р-5-i С2 J.-.1 на мл реакционной среды).

Тяблиаа 4

Зависимость от концентрации белка-фермента удельной карбоксилазной активности ферментных препаратов РФИ, _ФРК и РЫ>К0»из листьев хлопчатника сорта 108-Ф _,

Белок-фермент,! УА, мкмоль ССР/тн на мг белка

иг 4-—------—

РФИ ! ФРК ! РЕЖО

0.01 2,50 .3,50 4,40

0,025 0,72 1.34 1,60

0,05 0,63 0,68 0,60

0,1 0,32 0,33 0,43

0,15 0,31 0,22 0,26

Как видно из представленных в таелкце 4 даикк". зависимость от концентрации белка-херлонтз удельной карбокез-ллгкел актпзностл ферментных препаратов ГИ, 1РК л РЕ4К0 но айяйбхсл . Наибольшая карбоксплэзная актнкпость

«лях Фэшентных препаратов проявляется при содержании в ре-• •!;:,..'. • • .!'." "т п' . .. ТТГ'Н п"ти^яль—

пи и О'МЧ'.' ,лу.г, ' - :,'.:г.:Ю(ЛЬ

ферментного препарата РБФКО на 2Ь% превышает кароикомлаапуа активность ферментного препарата ФРК и на 76% - ферментного

•ь •.!!;<;,ГГ!.

чс^ц-злтра;^:;' оуС^.а г.^рс'око.лознун ак-•тарчпеть шерментних првааразоз ?:л, 1-ГК •/, РПКУ бкло изучено нами при содержании в реакционной среде 0.С5 г/ср белка-^ар-вята.

Из представленных на рис.6 результатов видно, что при

УА

18

0,4 -

Рис.6. Влияние различных концентраций Р-5-Ф на проявление ■ . РБФкарбоксилазной активности фер- 0,2 ментными препаратами Ш! (а) и ФРК (б) из листьев хлопчатника сорта 108-Ф.

2 3

¡v¿I субстрата

Рис.7. Влияние концентраций субстрата Р-5-Ф(а) или РБФ(б) „.на карбоксялазную активность ферментного препарата '•¡Л РБЖО рз листьев хлопчатника сорта 103-$.

низких концентрациях Р-5-Ф различия между ферментными препаратами РФИ 1ГФРК при проявлении ими карбоксилазной активности незначительны. С возрастанием концентрации Р-5-Ф возрастают vi различия между ферментными препаратами РФИ и ФРК при проявлении игла карбоксилазной активности. Наибольшая карбоксмлазная активность ферментных препаратов Р±-И и ФРК проявляется при содержании в реакционной среде 2 п.М Р-5-Ф. При этой оптимальной концентрации Р-5-Ф корбоксалазная активность ферментного препарата ФРК на 13$ превышает карбок-силазную активность ферментного препарата РФИ.

Из приведенных на рис.7 данных видно, что карбоясилаэ-ная активность РБФКО при использовании в качестве субстрата Р-5Ф на 3Q% выше, чем в присутствии собственного субстрата - РБФ. Данные о зависимости карбоксилазной активности ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО были использованы при расчете величин Sq 5 для Р-5-Ф и РБФ. Величины Sq 5(мМ) для РФИ, ФРК и РБФКО приведены в таблице 5.

Таблица 5

Величины [s]q g(r.ül) при проявлении карбоксилазной активности препаратами Р*й, ФРК и РБФКО из листьев __хлопчатника сорта 108-Ф_____ _

Ферментный п"«парат ; Субстрат j [s]q g , 10" ___

Фх'К РБФКО

Как видно из приведенных в таблице 5 вел'-зчш; д 5,при проявлении карбоксилазной активности РБФКО значительно превосходит РФИ и ФРК по сродству к Р-5-Ф: ФРК - на 14/£, РФИ -на 40$. Сродство РБФКО к РБФ на 22$ ниже, чем к Р-5-Ф.

Таким,образом, с ¿зэлич .наем молекулярной массы фермент-тпых препаратов наблюдается возрастание их карбо:г -'лазной активности и сродства к Р-5-Ф - субстрату первой реакции последовательно действующих ферментов цикла Кальвина.

ашжш

Проведенные'нами исследования показали, что отдельные

Р-5-Ф 0,VG +0,03

Р-5-Ф 0,62 + 0,03

Р-5-Ф 0,54+0,02

РБФ 0,66 + 0,02

субъединяцы РФИ с молекулярной массой 26+1 кДа проявляют только одну рибозофосфатизомеразную активность, нативная ке форма фермента - три ферментативные активности:рибозофосфатизомеразную, фосфорибулокиназнум и рибулозобисфосфаткар-боксилазную.

Проявление субъединицей с молекулярной массой 26 кДа рибозофосфатизомеразной активности и рвгуляторных свойств (Бакаева,Бабадаанова,1988) дает основание считать, что субъединица представляет собой двухдоменный мономерный фермент РФИ, имеющий один активный и сдан аллостерический центр.

При объединении двух мономерных ферментов,по-видимому, через дасульфидную связь (Иванищев,1982) в димерную форму в результате специфических белок-белковых взаимодействий в области контактов соседних доменов формируются новые активные и яллостеричеекие центры. Таким образом, монофункциональный фермент превращается в мультидоменный полифункцао-нальный фермент с тремя ферментативными активностями. Катализ данным полифункциональным ферментом последовательных реакций цикла Кальвина: ^5_ф рбф . з_фгк,

дает основание считать, что происходит туннелирование Р-5-Ф по конвейеру активных центров без'выделения интермедиатов в окружающую среду. Важным следствием такой структурной организации становится приобретение полифункциональным ферментом способности воспринимать весьма тонкие регуляторныо сигналы, отвечая координировании:,5 изменением разных активностей. Действительно, результаты кинетических исследований свидетельствуют о том, что этот поли функциональный фермент относится к гйстерезисным регуляторным ферментам, характеризующимся слоеными гомо-и гетеротропными взаимодействиями активных и аллостеричеСких центров.

Нами обнаружено, что электрофоретически гомогеннна ферментные препараты ФРК и РЕФКО обладают и других! ферментативными актлгностяш. ФРК с молекулярной массой 240+10кДа и ее субъеданицы с молекулярной массой 60+2кДа проявляют 3 $®рменгативаые активностирибозофосфатизомеразную, фосфори-було-шназную, и рибулозобисфосфаткарбоксадазную. РБ5К0 с молекулярной массой 520+30к^а проявляет шесть (.ферментативных

активностей: рибозо1:>оо,Т:атпзс;.;ьразнило, JccJop-x;; зку>о,

рибуяозЬ^ясфбсфаткарбоясилазкуяг глйцералъдеглдфосХатдеглд-рогвназнуто, фос^оглиаврвгкпнагчузэ и й,р;~-:тсзоб::с.''ос чт£>ьгу;о. У еубъединиц РЕЙКО с ыолехулярйо» ыаасо! 52+2 :--J>& о%одэл9-нк три ферментатввккв актагносг.:: рябозсХос^стазс:s-зразчак, фосфоргбулоканазкая л рлбулозои2с;:ос,];аг:-:арбоколлаг,;.тл.

Результат;,? кинетических ясслодслеггл" гзаоЗ '7тр:.-<?нта-тавной а:г?аэнсс?а, проявляемой ¿ер'лонтныч:! пршзра",";:.:.: Р*л», ФРК и РВ5К0, указывают ка соответствие кинетического дове-данзя ферментов годеля медленно дасссцпгр^ето ?ллолтер-л-ческого фермента по Курганову. Ото даст основание с^тать, что ОГК и РБФКО являются мультиферментннми кохялвксами-ас~ соцнатаыи. У PSI, ФРК и РЕФКС обнаружены функциональные свойства, характерные для мультпферментных ксшлекссв-'Чб-легченным каталаз"и координированное регуляторниэ эффекты. "Облегченный каталиV проявляется в том, что скорость фос-фор^булокиназкой а радулочобпофосфаткарбоисвлазноЗ реакций выше при использовании в качестве субстрптовР-5-J, а не собственных субстратов - Ри5-0 а PES. Проявление:.: коордоаэ-рованных регуляторннх эТурзктов. яятяется i:oBure:rje рпсозо-5-фссфатсл - субстратам первого чорлонта ко*гзяехса(конь? гатз) величины максимальной сксростп v..,a , последуге^х реакций л снижение величины К, для субстратов второй и третье:' реакций данной метаболической цепи.

Вццеленяе из листьев хлопчатника различны:: iop-д PF-'F.O - 160,400,480 л 520 кДа, проявление которш. обусловлено £¡1-зиологачоскпм состоянием растения, т.е. зависит от фавн развития растений и условий их выравдюкия (Eacia чканоъа, Мярзорахимоз,Бакаева .Лебедева, I9S3), аоззэллло к<?:л сд-элагь заключение об образовании в хлоропласта* данапическлх муль-тиферментнкх. ко.мпле■ :со в-ас с оцнатов.

На протяжении двух последних досятглв-тзЗ то^в* isrc* со-общэнзя о существовании ;,-.эл!браносв ¡заниол РЬКСС С Русакова, Ле Тхи Лань Сакь.Дсмзи,ГС81;ВзсгчьеваД*рхалч,Ал1;ав,1%7).. Предполагается, что связи РК-ХО с нб!/брааа\п сл-i'i-; ~л могут возникать и распадаться в зависааоста от 1.2 зле логп час чего состояния растений а условий среды (Романова,ISSC>.

Совокупность полученных нами результатов исследований и анализ имеющихся в литературе данных по этой проблеме дает основание предложить следующую схему формирования надмолекулярной оргакизацин ферментов цикла Каяьвхша в хлороплас-тах высших растений (рис.8).

Существование ферментов цикла Кальвина в разных формах обеспечивает реализацию регуляторньк механизмов различных уровней, Свободные ферменты участвуют в поддержании клеточного гомеостаза с помощью механизмов изостеряческой и алло-стерической регуляции. Эти механизмы регуляции реализуются с участием субстратов и других клеточных метаболитов, обеспечивая саморегуляцию метаболических путей. Мультифермент-ные ксмплексы-ассоциаты функционируют как единые кооперативно действующие системы, Меспечивая слежение за сигналами, поступающими от более в. ких уровней контроля метаболизма. Роль сигналов выполнит ьторыв посредники,например, гормоны.

При встраивании мультиферментных комплексов в мембраны возникает новый вид регуляции по типу включение-выключение или переключение системы на новый режим функционирования в соответствии с тпебованиями внешней среды. Метаболоны являются динамическими структурами и положение равновесия между свободными ферментами, мультиферментными комплексами и ме-таболокем зависит от функционального состояния клетки (Курганов,Любарев ,1991).

вывода

1. Установлено, что отдельные субтединицы РФИ с молекулярной массой 26+1 кДа обладают только одной рибозофос-фатизомеразнои активностью. Нативная ке форма фермента с молекулярной массой 52+2 кДа проявляет три ферментативные активности : рябозофосфатизоморазную, фосфорибулоккназную и рибулозоблсфосфаткарбоксилазную. Результаты кинетических исследований каздой ферментативной активности свидетельствуют о том, что этот полифункциональный фермент относится к гистерезпсным регуляторным ферментам, характеризующимся слоеными гомо-и гетеротропными взаимодействиями активных и ьллостерических центров.

2. Обнаружено,чте электрофоретачески гомогешг - фер-

.Л4

лц лц

дц S Мулътздоментй

! у колдун кцаональний

АлЦ 'АлД фермент

^армент гал

•11 1?

ácí <-

t?

Vi

-400

у \\ Мультафармэктч"р

ко :.'ji л в к с кт -& с с оци а с ы

I80&---- 24Ü

Мультаферментные ко1Яшексы-аооодЕаты

ч M К M Е Р A H А

НИ ФРК PIÍK0 S ФГК-^з ТЛТ'Л ФВФ-за

, MEÏAEQJIGH

Рис. 8 . Формирование надмолекулярной организма Лермонтов ЦИ1oif. Кальвина в Енетих растении.

менткые препараты ФРК и РБФХО обладают к другими фермекта-тавшак активностями :£РК с молекулярной" масс ой 240+10 кДа и ее субъедчгацк с молекулярной кассой 60+2 кДа проявляют три ферментативные ахяазноста :рз бозофосфатизоьгаразвую, фосфори-булогалазнуя и рибулозобисфосфаткарбоксилазнуа. РШШ с молекулярной массой 5£0+30:<Да проявляет шесть ферментативных активностей:?::бозсфссфатазокиразиую, фосфорибулокинаэную, рлбулозоб;;сфосй.аткарбоксилазную ,глицеральдегидфосфатдегзд-рогеназнуэт, фосфоглицераткиназную и фруктозобисфосфатазную. 7 субъединиц РБ5КС с молекулярной массой 52+2 кДа определены три ферментативные актлвггости:рзбозофосфаткзодаразная, фосфорибулокиназкгя и рибулозобисфосфаткарбоксилазная.

3. Установлено, \.о Р£Л, ФРК и РБФКО обладают функциональными свойствами, характерными для мультиферментных комплексов- "облегченным вдтеишзом" и координированными регу-ляторными эффектам.

4. Кинетическое поведение ферментов РФИ, ФРК и РБЙСО соответствует'модели -.:эдленно диссоциирующего аллостеричзс-кого фермента по Курганову.Зто дает основание считать, что ЙРК и РБЖО являются мультифзрментными ко1«шлексаш&г.асссциа-тами.

5. На основании результатов экспериментальных исследований и анализа имеющихся в литературе данных предложена схема формирования надмолекулярной организации ферментов цикла Кальзина в хлоропластах высших растений.

Материалы диссертации изложены в следующих публикациях;

1. Бабадаанова U.A., Еаказва H.H., Лебедева ГЛЬ, Ба-бадаакова М.П., Мирзорахимов А.К. Проявление рибуяозобис-фосфаткарбсксплазой-оксиганазой других ферментативных активностей .'/ Апрельская научно-теоретическая конференция профессорско-преподавательского состава Таджикского гос- -университета: Таз:до ich - Душанбе, 1993. - С.78

2. Бабадкановг М.П.,-Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.П.. Изучение активности РФй, ФГК и РБЖО хлопчатника при раз-гдчных условиях хранения препаратов Ц Апрельская научно-теоретическая конфер^'нщя^хфЬфёссорско-нреподаватольского -

состава Таджикского госуниверсяшта; Тез,докл. - Душанбе. 1994. - С-76,

3. Бабаджанова М.А., -йёбядева Г.П., Мирзорахимов А.К., Бабадданова iM.II.. Бакаева H.II- Функциональный мультафермев--тннй комплекс цикла Кальвана jj Первая научная конференция Биохимического общества Республики Тадаякистан г'Прсблеш* биохимии"; Тез докл. - Душанбе, 1993. - С.II.

4. Мирзорахямов А.К., Бакаева H.1L, Бабаджанова М.П. Исследование условий для проявления высокой активности фар-ментов РФИ, ФРК и РБФК хлопчатника сорта 106-4 // Апре/ш--екая научно-теоретнческая конференция профессорско-преподавательского состава Таджикского госуниверситета: Тез. докл. - Душанбе, 1994. - С.77.

5. Бакаева Н.П., Бабаджанова М.П., Мирзорахямов А.К. Определение ионизирующихся групп активных центров фосфори-булокиназн и рибулозобисфосфаткарбоксилаэы хлопчаткам // Апрельская научно-теоретическая конференция профессорско-преподавательского состава Таджикского госунаварсчтетз. Тез.докл. - Душанбе, 1994. - С.74.

4/1-1996 г. ТГУ. Зак. 2. Тир.

100.