Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретическое исследование рН-зависимой регуляции электронного и протонного транспорта в хлоропластах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Теоретическое исследование рН-зависимой регуляции электронного и протонного транспорта в хлоропластах"

На правах рукописи

ь%

ФРОЛОВ АЛЕКСЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ рН-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭЛЕКТРОННОГО И ПРОТОННОГО ТРАНСПОРТА В ХЛОРОПЛАСТАХ

Специальность 03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2009

003473355

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

доктор физико-математических наук, профессор Тихонов Александр Николаевич

доктор физико-математических наук, профессор Караваев Владимир Александрович

кандидат физико-математических наук, Черепанов Дмитрий Александрович

Институт химической физики имени Н.Н.Семенова РАН

Защита состоится

'Л.

июня 2009 года в п>_на заседании Совета по защите

диссертаций Д501.002.11 по физико-математическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: Москва, ГСП-1, 119992, Ленинские горы 1-2, МГУ, физический факультет, аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан мая 2009 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 501.002.11 доктор физико-математических наук

Г.Б. Хомутов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Изучение механизмов регуляции процессов электронного и протонного транспорта в клетках фотосянтезирующих бактерий, водорослей и в хлоропластах высших растений - актуальная задача биофизики фотосинтеза. Фотосинтез играет исключительно важную роль в круговороте веществ и энергии в биосфере. Известно, что в цепи электронного транспорта фотосинтезирующих организмов оксигенного типа имеются несколько участков, скорость электронного транспорта на которых контролируется значениями рН внутритилакоидного пространства (люмена) и стромы. Протолитическая реакция окисления пластохинола цитохромным ¿(/-комплексом - лимитирующая стадия переноса электронов между фотосистемами 2 и 1 (ФС2 и ФС1), скорость которой зависит от рН люмена (рЩ- Скорость электронного транспорта на акцепторном участке ФС1 зависит от активности ключевых ферментов цикла Кальвина, которая, в свою очередь, контролируется величиной рН стромы (рН0). Таким образом, фотоиндуцированные изменения рН; и рН0 могут оказывать существенное влияние на кинетику световых и темновых стадий фотосинтеза в фотосинтетических системах оксигенного типа. Математическое моделирование рН-зависимых стадий электронного и протонного транспорта в хлоропластах высших растений может играть важную роль в анализе механизмов регуляции световых и темновых стадий фотосинтеза.

Цель и задачи исследования

Основной целью данной диссертационной работы является теоретическое исследование рН-зависимой регуляции электронного и протонного транспорта в хлоропластах. Для решения этой задачи в диссертационной работе были выполнены теоретические исследования, направленные на решение двух конкретных задач.

1) Построение математической модели электронного и протонного транспорта в хлоропластах высших растений, учитывающей фотоиндуцированные изменения рН в люмене и в строме хлоропласта.

\

V

2) Квантово-химическое моделирование реакции окисления пласгохинола в активном центре Q0 цитохромного ¿^комплекса, являющейся лимитирующей стадией в цепи электронного переноса между двумя фотосистемами.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые построена математическая модель процессов электронного и протонного транспорта в хлоропластах, учитывающая наряду с изменениями рН; фотоиндуцированные изменения рН в строме, влияющие на скорость оттока электронов от ФС1 за счет активации ферментов цикла Кальвина. Эта модель описывает основные закономерности сложной кинетики фотоиндуцированного окисления Р700 в интактных хлоропластах.

Построены две модельные системы для квантовомеханического исследования реакции двухэлектронного окисления пластохинола в Q0 центре цитохромного ¿^/-комплекса. Результаты расчетов свидетельствуют о том, что первая стадия окисления хинола (переноса атома водорода от хинола к железо-серному центру Риске) является эндоэргическим процессом, скорость которого лимитирует время оборота ¿^комплекса.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы представлены на Международной конференции «Ломоносов-2004», серия «Физика» (Москва), Vth Meeting of Russian Society for Photobiology and the International Conference "Light Energy Conversion in Photosynthesis" (Pushchino, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК - 2, тезисов докладов на Российских и международных научных конференциях - 2.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав, включая обзор литературы и методы, заключения и выводов. Общий объем работы составляет стр. текста, включая <Ь<5~рис., 2 таблицы и список литературы, содержащий \ Ь£> наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Рассмотрена актуальность темы диссертационной работы, сформулирована цель работы и определены основные задачи исследования.

Глава 1. Обзор литературы

В первом разделе Главы 1 даны краткие сведения о фотосинтезе, рассмотрена схема строения хлоропластов. Следующий раздел содержит описание цепи электронного транспорта в фотосинтетических системах оксигенного типа, рассмотрена схема расположения электрон-транспортных комплексов (ФС1, ФС2 и ¿^комплекса) и их взаимодействие в тилакоидной мембране. Обсуждаются механизмы сопряжения электрон-транспортных процессов с процессами трансмембранного переноса протонов, особое внимание уделено роли пластохинона в этих процессах. Рассмотрено сопряжение энергодонорных реакций электронного транспорта с энергоакцепторными процессами синтеза АТР.

Третий раздел Главы 1 посвящен регуляции фотосинтеза в хлоропластах. Основное внимание уделено анализу двух механизмов рН-зависимой регуляции, имеющих непосредственное отношение к теме диссертационной работы.

1. Регуляция электронного переноса на донорной стороне ФС1, обусловленная замедлением электронного транспорта в результате снижения рН;.

2. Ускорение оттока электронов от ФС1 вследствие индуцированной светом активации ферментов цикла Кальвина.

В четвертом разделе описана структура и особенности функционирования цитохромного b(f комплекса. Основное внимание уделено реакции окисления пластохинола, являющейся лимитирующей стадией в работе цепи фотосинтетического транспорта электронов.

В пятом разделе кратко рассмотрены теоретические работы по математическому моделированию электронного транспорта в фотосинтетических системах, которые наиболее близки к теме настоящей диссертационной работы. В последнем разделе Главы 1 рассмотрены теоретические аспекты электронного и протонного транспорта в биологических системах.

Глава 2. Методы

В главе 2 приведены краткие сведения о методе функционала плотности. Описана программа «Природа» (автор Д.Н. Лайков), которая позволяет проводить расчеты методом функционала плотности для достаточно больших систем. Все основные расчеты были выполнены с использованием обменно-корреляционного функционала РВЕ и наборов базисных функций 3z и 4z.

Глава 3. Моделирование электронного и протонного транспорта в хлоропластах с учётом активации цикла Кальвина и изменений рН стромы

В этой главе описана разработанная в диссертации математическая модель электронного и протонного транспорта в хлоропластах высших растений и клетках цианобакгерий, учитывающая фотоиндуцированные изменения внутритилакоидного рН (pHj) и рН стромы (рП0). Наряду с нециклическим транспортом электронов от ФС2 к конечному акцептору ФС1, в модели учитываются процессы синтеза АТР, сопряженного с трансмембранным переносом протонов через АТР-синтазу, а также потребление АТР и NADPH в цикле Кальвина. Учет фотоиндуцированных изменений рН в строме и в люмене позволил описать влияние рН-зависимых процессов регуляции электронного транспорта на донорной и акцепторной сторонах ФС1 на кинетику фотоиндуцированных редокс-превращений ряда переносчиков электрон-транспортной цепи.

Для оценки фотоиндуцированных изменений рН в строме хлоропласта рассмотрена модель, предполагающая наличие трех замкнутых компартментов (рис.1). Мы принимаем, что все электронные переносчики, встроенные в тилакоидную мембрану (ФС1, ФС2, цитохромный ¿»^комплекс, АТР-сшггаза), равномерно распределены в мембране. Подвижные переносчики, связывающие ФС2 и ФС1, также равномерно распределены в системе - в тилакоидной мембране находятся молекулы пластохинона, во внутритилакоидном объеме -пластоцианин, в строме находятся терминальные акцепторы ФС1. Электронный перенос на участке ¿^комплекс пластоцианин -» ФС1 не является лимитирующим звеном в цепи нециклического транспорта электронов.

Считается, что скорость окисления пластохинола контролируется величиной внутритилакоидного pHj.

Рис. 1. Схема компартментализации фотосинтетического аппарата в хлоропласте.

Рассматриваются следующие процессы протонного транспорта. Появление протонов внутри тилакоида происходит за счет разложения воды в ФС2 и окисления пластохинола ¿./-комплексом. Изменение концентрации ионов водорода в строме происходит вследствие связывания протонов молекулами пластохинона, восстанавливаемыми ФС2, а также восстановленными молекулами NADP. Кроме этого, учитывается связывание протонов буферными группами, расположенными в строме и на обеих поверхностях тилакоидной мембраны (рис.2). Рассматриваются трансмембранный перенос протонов, сопряженный с синтезом АТР (поток JAТР), а также пассивная утечка протонов из тилакоида в строму (поток Ураи), не связанная с синтезом АТР, и поток протонов из стромы в цитозоль (поток Jce||). Локализованный в строме восстановленный терминальный акцептор электрона А~ принимает протоны из стромы.

ATP ADP.+Pj

. Строма.

ГА

ADP+P

. . (P'sbo

Внутритилакоидное пространство

Протонированная форма этого переносчика (АН) потребляется в реакциях цикла Кальвина. Схема редокс-превращений конечного акцептора электрона А показана на рис. 2.

Рис. 2, Схема электрон-транспортных и протон-транспортных процессов, рассматриваемых в модели.

I

Для описания электрон-транспортных процессов введены следующие переменные: 1) [-Р,„0] - концентрация окисленных реакционных центров, 1 входящих в состав комплексов ФС1; 2) [Рс] - концентрация окисленного пластоцианика; 3) [Q] - концентрация окисленного пластохинона; 4) [P6g0] -концентрация окисленных центров ФС2; 5) [А] - концентрация окисленной J формы конечного акцептора электрона; 6) [АН] - концентрация 1 восстановленной протонированной формы конечного акцептора электрона, [ [АТР] - концентрация АТР. Для описания протон-транспортных процессов ' введены переменные [Я,+ ] и [Н*] - активности ионов водорода внутри тилакоида и в строме, соответственно. Система уравнений, описывающая кинетику редокс-превращений электронных переносчиков, имеет следующий 1 вид:

в

= ¿л [л]([/>700 ]0 - [p/00 ]) - kn [/>,;„ ]([Pc]0 - {Pc}), (i)

= -4~ к,ШАРс1{и: ])+2kf{p;n ]([Лс10 -[A:]), (2)

d{Q\

dt - 2

(4)

где ¿,,¿2" числа квантов света, попадающих к первичным донорам ФС1 и ФС2 в единицу времени; к1гкг ,кп,кн^~ эффективные константы скоростей соответствующих реакций, аЬ[- поверхностная плотность ^комплекса, / -толщина внутритилакоидного пространства (рис. 1,2). Функция Kg(\Q],[Pc],[H*]) характеризует совокупность процессов, связанных с окислением молекулы пластохинола цитохромным ¿^комплексом.

Следующие два уравнения описывают изменения концентраций окисленной (А) и восстановленной протонированной (АН) форм конечного акцептора электрона ФС1:

= ^[Л\{\Рт\~\Р^\)+к^{АЩХЛТР\)^к{)ЛА}0-[А]-[АН]), (5) at I

^^ = кт[1ГМА1-\А}-[Ат)-к^[АН)-ксс(\АН},[АТР)), (6)

где кАН,кА.~ константы скоростей реакций превращения конечного акцептора, ¿о, - константа скорости окисления восстановленной формы конечного акцептора электрона {А~) кислородом; е - отношение внутреннего объема тилакоида к объему стромы.

Функция (7) описывает в обобщенной форме потребление NADPH и АТР в различных процессах биосинтеза (цикл Кальвина, синтез жирных кислот и т.д.).

к^Аиилт)-*сс (7)

Множитель Rcc является функцией, феноменологически описывающей процессы pH-зависимой активации ферментов цикла Кальвина. Для описания этих процессов была выбрана функция, имеющая следующий вид:

шах , к* РН.-Х, т%ш

U + e

(8)

При выборе этой функции мы исходили из литературных данных о зависимости активности ключевых ферментов цикла Кальвина от рН стромы.

Синтез АТР из ADP и ортофосфата АТР-синтазными комплексами и их расход в реакциях биосинтеза описывали уравнением:

at iid £J2

(9)

где П2 и П2 - стехиометрические коэффициенты соответствующих реакций.

Система уравнений, описывающая протон-транспортные процессы, имеет

вид:

J | у ZK'mBL

d[H;) 2 dt I

~ Т[Am]+2crtl/Kg - Jp.

(10)

1+-

2 eKK , KVBV KK+UO)2 (К"+1К1)2

d{Ip-=+J«, - J- - ¿А, [2][ЯЛ([Р680]0 - [р;ю])]+ at I

+k^[AH}-kM[H:]([A]0-\A)-[AH)) + £-kcc([AHUATP])

2ne .

QJ

J ЛТР

(П)

Параметры К'а, К'Ш,КУ, В*а,В'„, 5" характеризуют буферные свойства системы. Функция (12) определяет пассивную утечку протонов через тилакоидную мембрану:

" КИн, +[я;])+^(А',л +[я;]>

(12)

Здесь аи - поверхностная плотность протон-проводящих групп тилакоидной мембраны; к,, ка - константы скоростей, характеризующих перенос ионов водорода через тилакоидную мембрану; К,,, Ки - константы равновесия, характеризующие взаимодействие протонов с буферными группами на внутренней и внешней

сторонах тилакоидной мембраны. Аналогичным образом задаются потоки протонов черезАТР-синтазу(J„P)n междустромойицитозолем(J„„).

На рис. 3 показана кинетика изменений рН„ рН0 и концентрации АТР после включения света. Стационарное состояние достигается, когда [АТР]/[АТР]0 —> 1, при этом поток ионов водорода через АТР-синтазу существенно уменьшается. На рис. 4 показаны для примера кривые фотоиндуцированных изменений концентраций Р*00 и различных форм конечного акцептора электрона. Теоретически рассчитанная кинетика изменений [ Р7да J имеет немонотонный вид, характерный для нативных фотосинтетических систем оксигенного типа (кривая О-P-M-S-T-F). Сравнительный анализ кинетических кривых для разных электронных переносчиков и фотоиндуцированных изменений рН| и рН0 позволил выделить два основных фактора рН-зависимой регуляции электронного транспорта, определяющих немонотонную временную зависимость [P.,^]: а) торможение электронного транспорта между фотосистемами вследствие уменьшения pHj, и б) ускорение оттока электронов от ФС1 вследствие увеличения рН0.

t, с

Рис. 3. Кинетика фотоиндуцированных изменений рНо(0, рЩ/) (наверху) я концентрации [А7Р](/)/[АТР]0 (внизу).

0.0

О 5 10 15 20 25 30

Рис. 4. Кинетика фотоиндуцированных изменений концентраций

[^КОЛЛЛ (наверху), [Л](0/[Л]0 и [>Г](/)/[Л]0 (внизу).

Глава 4. Квантовохимическое моделирование реакции окисления пластохинола в <20 центре цитохромного ¿^-комплекса

4.1. Расчет спектров ЭПР для пластосемихтона и его аналогов

В данном разделе приведены результаты расчетов спектров ЭПР методом функционала плотности для анион-радикалов пластохинона и его аналогов, проведено сравнение расчетных и экспериментальных спектров (рис. 5). Модельные системы, построенные для анализа двух последовательных одноэлектронных шагов окисления хинола (рис. 6,7 и 8) содержат триметил-1,4-бензохинол (ТМ<ЗНг) - аналог пластохинола без изопреновой цепи. Окисление ТМ<ЗН2 рассматривается как модельная реакция для окисления пластохинола в активном центре 0>о. Расчеты спиновой плотности на атомах, на основании которых был смоделирован спектр ЭПР анион-радикала молекулы триметилхинона, дали хорошее согласие с экспериментом (рис. 5). Это свидетельствует об адекватности использованного нами метода расчета электронных характеристик молекул хиноидной природы.

4.2. Квантовохимическое моделирование реакции окисления пластохжола до пластосемихинона в активном центре Q„ bff-комплекса

На рис. 7 показана модельная система, использованная для расчетов изменения энергии для первой стадии окисления хинола (QH2 + ISP0X —► QH' + H+ISPrMj), включающая в себя дважды восстановленный триметил-1,4-бензохинол (TMQH2), железо-серный кластер [Fe2S2] и ближайшие к нему фрагменты полипептидной цепи С, окружающей железо-серный кластер (Cysl34-Thrl35-Hisl36-Leul37-Glyl38-Cysl39, Cysl54-Hisl5S-Glyl56-Serl57, Cysl52 и Туг159). Исходная геометрия этой системы была построена на основе рентгеноструктурных данных для ¿^комплекса из Chlamidomonas reinhardtii (код структуры 1Q90).

Энергетические профили реакции окисления хинола до семихинона

Первая стадия окисления пластохинола обычно рассматривается как лимитирующая стадия, которая определяет скорость работы b(f комплекса. Знание энергетических характеристик этого процесса было использовано для оценки константы скорости окисления QH2. Нами было рассчитано, как энергия модельной системы меняется при перемещении атома водорода от QH2 к Nc атому His-155 железо-серного белка Риске (ISP). В качестве координаты реакции (О-Н—Ne —> О—H-N£) выбрано расстояние между атомами Н и Ne (параметр Лм-н). Нами были выполнены расчеты для четырех конформаций модельной системы: 1) исходная (неоптимизированная) система, построенная на основе рентгеноструктурных данных (модель Х-1), 2) частично оптимизированная система, полученная на 35-м шаге процедуры оптимизации (модель А-1), 3) частично оптимизированная система, полученная на 257-м шаге процедуры оптимизации (модель В-1), и 4) полностью оптимизированная система (модель С-1). Конформация частично оптимизированной системы А-1 близка к геометрии исходной системы, она была использована в качестве базисной модели для описания первой стадии окисления TMQH2.

На рис. 9 показаны энергетические профили реакции переноса атома водорода от TMQH2 к Nr, атому имидазольного кольца His-155, рассчитанные для трех конформаций модельной системы (модели А-1, В-1 и С-1).

Показанные энергетические профили описывают перенос атома водорода вдоль пути наименьшей потенциальной энергии. Эти пути были найдены путем «точечных» расчетов, полученных для различных положений атома водорода между TMQH2 и His-155.

Для частично оптимизированной системы А-1 энергетический профиль имеет локальные минимумы, соответствуют координатам реакции ÄN _н= 2,64 и

1,05 Ä. Перенос атома водорода 0-H-N6. —> О—H-NE идет с повышением энергии (АЕ~ 10,6 ккал/моль). Энергетический барьер реакции равен £/= 25.4 ккал/моль. При дальнейшей оптимизации геометрии системы, сопровождающейся понижением энергии, водородная связь между атомами HI и Ne становится короче. В то же время перенос атома водорода от TMQH2 к ISP становится менее выгодным. В системе В-1 реакция CHH-N,;—► О—H-Ne идет с повышением энергии АЕ~ 18.6 ккал/моль, а энергетический барьер £/= 26,6 ккал/моль. Для полностью оптимизированной системы (модель С-1) был найден только один локальный минимум энергии при _н = 1,65 Ä, соответствующий ковалентной связи атома водорода в молекуле TMQH2- Это означает, что в полностью оптимизированной системе перенос атома водорода от QH2 к His-155 невозможен.

Константа скорости и энергия реорганизации первой стадии окисления хинола

Знание разности энергии ДЕ для переноса протона от TMQH2 к ISP позволяет оценить константу скорости для первой стадии окисления TMQH2. Скорость окисления хинола можно оценить в рамках подхода, предложенного Крофтсом для вычисления константы скорости электронного переноса (¿рсет), сопряженного с переносом протона (Crofts, 2004). В этом случае константу скорости fcpcET можно оценить из уравнения

log,. kKET = -3,6) -у ^SJiL _ ДрК, (13)

где R - расстояние (Ä) между донором (QH2) и акцептором электрона (атом Fei железо-серного кластера), ß = 1,4 (А'1), 3,1 (эВ1), AGe (эВ) - разность энергий конечного и начального состояний для реакции электронного

переноса, ДрК = (pKQlli-pKISIV_ ) - разность значений рК донора (хинол) и

акцептора (His 15 5) протона, Л - энергия реорганизации (эВ). Наши расчеты показали, что с достаточно высокой точностью можно использовать соотношение AG^ « ДЕет, гДе А^пт - вклад электронной компоненты в

изменение потенциальной энергии при переносе протона от хинола к [Fe2S2] кластеру.

Электронная компонента изменения энергии (Д£ет) может быть выделена из полного изменения энергии ДЕ = £oh>:SPmH - £QHi.,SPm с помощью соотношения

= А£-2.303ЛГ(рКдНз-pK,SPox), (14)

где pKQHi и pKISpm соответствуют значениям рК донора протона (QH2) и его акцептора (Hisl55). Для TMQH2 значение рК0Н] диссоциации протона в гидрофобную среду (QH2 —* QH~ + Н+) составляет величину pKQHi = 10,7 (Rich, 1984). Значение pKISP = 6,5 взято из литературных данных по титрованию комплекса из Chlamidomonas reinhardtii.

На рис. 10 показаны зависимости log,0 кКЕ1 от -ДСЗ^, рассчитанные для различных значений энергии реорганизации Л и параметра R = 6.7 А, соответствующего расстоянию между атомом HI молекулы QH2 и атомом Fei [Fe2S2] кластера. Из семейства парабол, рассчитанных по уравнению (13) для различных значений Л (рис. 10), можно выбрать кривые, одновременно удовлетворяющие кинетическим данным (log10/tpcf,t = 2,44; горизонтальная линия), известным из литературы, и полученным нами теоретическим значениям -AG^ET. Анализ результатов наших расчетов показал, что хорошее согласие с экспериментом может быть достигнуто при низких (Л, ~ 0,02-0,05 эВ) или при относительно высоких (Л2~ 1-2,8 эВ) значениях энергиях реорганизации. Абсолютные значения Л, и Л2 зависят от конфигурации системы и от длины пути переноса электрона.

Относительно низкие значения энергии реорганизации, определяемой изменениями парциальных зарядов на атомах модельной системы, были получены на основе классической теории Маркуса (Marcus, 1956). Для оценки энергии реорганизации Ла была использована формула:

1 1 М 1 11

= ( ~ )г (г— + „ -}-) (15)

Е0 Е3 1 а0 2в| Я,

Здесь Д^ - изменение заряда на г'-м атоме в результате переноса протона от РН2 к Н1в155, а0 и а{ - радиусы атома 01 молекулы <ЗН2 и /'-го атома соответственно, е0 и с5 - оптическая и статическая диэлектрические проницаемости, ^ - расстояние между атомом 01 и г-м атомом. Показано, что при значениях ^ в интервале от 4 до 10 энергия реорганизации Я,, попадает в интервал от 0,035 до 0,070 эВ.

4.3. Квантово-химическое моделирование реакции окисления пластосемихинона

На рис. 8 показана модельная система, использованная для расчетов изменений энергии на втором шаге окисления хинола (ТМС^Н + (ох) —► ТМС> + Н+А6' (гес1)). Данная система включает в себя семихинон ТМ(2Н, низкопотенциальный гем Ьи ближайшие аминокислотные остатки полипептидной цепи В, окружающие гем Ь61' (НЬ86, Аг§87, ТЬг134, 01у135, Туг136, 1115187). Карбоксильная группа 01и78 рассматривается как акцептор протона, отдаваемого молекулой ТМСЩ. Расстояние между атомом водорода Н2 молекулы ТМ0Н и ближайшим атомом кислорода карбонильной фуппы 01и78 составляет 3,5 А. Исходная геометрия этой системы была построена на основе рентгеноструктурных данных для кристаллизованного ¿(/-комплекса (структура Х-2). Структура, соответствующая частично оптимизированной геометрии модельной системы, обозначена как А-2. Для этой системы нами было показано, что перенос протона от ТМрн на депротонированную карбонильную группу 01и78 является экзотермичным процессом, характеризующимся значительным понижением энергии ДЕг = £(ОН...Е78) - ДО-.-Н^з) - -20,4 ккал/моль.

Магнитное поле (Э)

Рис. 5. Экспериментальный спектр ЭПР (пунктирная линия) анион-радикала триметилхинона, растворенного в диметилсульфоксиде, и расчетный спектр того же радикала (сплошная линия).

Рис. 6. Схема моделируемых процессов электронного и протонного транспорта.

О'-

о

Рис. 7. Строение модельной системы для описания первой стадии окисления хинола.

Рис. 8. Строение модельной системы для описания второй стадии окисления хинола.

Н0Н...13РПУ < * НО.-НМвР,

Рис. 9. Энергетические профили реакции переноса атома водорода от ТМ0Н2 к Н, атому имидазольного кольца Н)з-155, рассчитанные для трех конформаций системы, моделирующей реакцию окисления пластохинола до пластосемихинона (модели А-1, В-1 и С-1).

о

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2

Рис. 10. Графики зависимости logl0 ¿PCFT от - AG£CE1., рассчитанные по уравнению (13) для различных значений энергии реорганизации Л при R = 6,7 А.

Рис. 11. Изменения энергии для двух шагов окисления ТМ<ЗН2, вычисленные для модельных систем А-1 и А-2.

На рис. 11 приведены диаграмма изменений энергии для двух стадий окисления ТМ(^! Ь, вычисленные для модельных систем А-1 и А-2. На этой диаграмме выравнены уровни энергии, соответствующие «продуктам» первой реакции (18Рге(111...ТМ(5Н) и «субстратам» второй реакции окисления хинола (ТМрН...С1и78-Л01;). Видно, что поглощение энергии на первом шаге окисления ТМ0Н2 до ТМС>Н (Д£,= 10,6 кк&Умоль) компенсируется значительным понижением энергии на шаге окисления ТМОН до ТМ(2 (Д£= -20,4 ккал/моль).

30

TS

Общее изменение энергии для двух шагов окисления хинола, полученное из независимых расчетов энергий конфигураций А-1 и А-2, является отрицательной величиной: АЕ£ = А£, + Д£2~ -9,8 ккал/моль. Отметим, что вычисления ДEt относятся только к первичным стадиям окисления хинола (перенос атома Н), которые не учитывают дальнейших изменений системы, связанных с возможными конформационными перестройками и последующей диссоциацией в водную фазу протонов, перенесенных на аминокислотные остатки Hisl55 и Glu78.

Эффективная константа скорости двухэлектронного окисления хинола до хинона ( kQHi) была рассчитана в рамках простой схемы, включающей две последовательные реакции переноса атома водорода:

и ' HQH- b^ jr > ISPreJH ■ QH ■ -b^ — -» ISPrrfH • -Q• 'bJ;dH (16)

Константа скорости обратного переноса протона от 1SP на семихинон связана с константой скорости прямой реакции кх соотношением кл =а-к^ею''к"т. Поправочный коэффициент а < 1 введен для учета влияния конформационной подвижности ISP на вероятность обратного переноса протона (HQ...H-ISPred —> HQH...ISP0X). Эффективность полного окисления хинола до хинона вычисляли по формуле:

V, + (17)

Расчеты отношения kQHj / к,, вычисленного для значений параметров AG°= 10,7 ккал/моль (модель А-1) и 280 с'1 при различных величинах поправочного коэффициента а, показали, что при медленной диффузии ISP (г, =1 /к,«тт, где тт - характерное время смещения ISP от Q0 центра к цитохрому f) эффективное окисление хинола (kQiu /¿,>0,5) может происходить только при условии к2 > Ю10 с"'. С увеличением подвижности ISP (г, lrm » 1) эффективное окисление хинола может происходить при более низких скоростях второй стадии окисления хинола (к2 ~ 10б-109 с"1). Оценки диапазона возможных значений константы скорости к2 показали, что в широком диапазоне энергий реорганизации (0,25 < Я < 2,8 мВ) значения к2 оказываются достаточно

большими (10б < к2 < 2-Ю1' с '), чтобы удовлетворить условию эффективного

окисления хинола в центре в ходе двух последовательных стадий переноса

электрона на высоко- и низкопотенциальные акцепторы ¿¿/"-комплекса.

Заключение.

В заключении подведены основные итоги выполненного исследования.

ВЫВОДЫ

1. Построена математическая модель процессов электронного и протонного транспорта в хлоропластах, впервые учитывающая не только фотоиндуцированные изменения рН внутритилакоидного пространства (рН;), но и изменения рН в строме (рН0), влияющие на процессы активации реакций цикла Кальвина.

2. Выделены два основных фактора рН-зависимой регуляции электронного транспорта, определяющие немонотонную временную зависимость редокс превращений Р700 и других электронных переносчиков:

а) торможение электронного транспорта между фотосистемами вследствие уменьшения рН;;

б) ускорение оттока электронов от ФС1, обусловленное увеличением рН„.

3. Построены модельные системы для описания методом функционала плотности двух стадий окисления пластохинола в хинон-связывающем центре (}0 цитохромного ¿^комплекса фотосинтетической цепи переноса электронов.

4. Расчеты спиновой плотности на ядрах атомов водорода анион-радикала триметил-1,4-бензохинона дали хорошее согласие с экспериментом, что свидетельствует об адекватности использованного метода расчета электронных характеристик молекул хиноидной природы.

5. Впервые рассчитаны энергетические диаграммы для двух элементарных стадий реакции окисления триметил-1,4-бензохинола (аналог пластохинола) в центре <3„, сопряженных с процессами последовательного переноса электронов от молекулы хинола к железо-серному центру Риске и цитохрому ¿б1*. Полученные результаты хорошо согласуются с представлениями о том,

что лимитирующей стадией в работе цепи электронного транспорта между фотосистемами является первая стадия окисления хинола в хинон-связывающем центре Q0 цитохромного ¿^комплекса.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фролов A.È., Тихонов А.Н. «Влияние фотоиндуцированных изменений рН стромы и внутритилакоидного пространства на кинетику электронного транспорта в хлоропластах. Математическая модель» - Биофизика, т. 52, №4, стр. 656-665 (2007).

2. Фролов А.Е., Тихонов А.Н. «Окисление пластохинола цитохромным b(f комплексом/ Исследование методом функционала плотности» - Журнал физической химии, т. 83, №3, стр. 593-595 (2009).

3. Фролов А.Е. «Математическая модель тилакоида как распределенной гетерогенной- системы электронного и протонного транспорта» - Сборник тезисов Международной конференции «Ломоносов-2004», серия «Физика», т. 1.стр.89-90(2004).

4. Frolov А.Е., Ptushenko V.V., Trubitsin B.V., Tikhonov A.N. «pH-dependent régulation of electron transport in chloroplasts». Abstracts of V"1 Meeting of Russian Society for Photobiology and the International Conférence "Light Energy Conversion in Photosynthesis'\ Pushchino, P. 75 (2008).

Подписано к печати Ц.05-09 Tiipаж JOC Заказ У?

Отпечатано в отделе оперативной печгп! физического факультета МГУ

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Фролов, Алексей Евгеньевич

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Общие представления о фотосинтезе.

1.2. Цепь электронного транспорта хлоропластов.

1.3. Регуляция фотосинтеза в хлоропластах.

1.4. Цитохромный /^комплекс.

1.5. Математическое моделирование электронного транспорта в фотосинтетических системах.

1.6. Некоторые аспекты теоретического описания электронного транспорта, сопряженного с перносом протонов в биологических системах.

2. Квантово-химические методы расчетов.

2.1. Теоретические основы метода функционала плотности.

2.2. Метод квантово-химических расчетов (программа «Природа»).

3. Моделирование электронного и протонного транспорта в хлоропластах с учётом активации цикла Кальвина и изменений рН стромы.

3.1. Структура модели.

3.1.1. Геометрические характеристики модели.

3.1.2. Функциональные характеристики системы.

3.2. Система уравнений и методы решения.

3.3. Результаты расчётов и их обсуждение.

3.3.1. Поведение системы в ответ на включение света в различных метаболических состояниях.

3.3.1.1. Метаболическое состояние 3.

3.3.1.2. Активность ферментов цикла Кальвина максимальна.

3.3.1.3. Метаболическое состояние 4 (АТР-синтаза неактивна).

3.3.1.4. Метаболическое состояние 5 (разобщенные хлороппасты).

3.3.2. Влияние начальных условий на кинетическое поведение системы.

3.3.2.1. Метаболическое состояние 3.

3.3.2.2. Активность ферментов цикла Кальвина максимальна.

3.3.2.3. Влияние начальной концентрации окисленной формы конечного акцептора электрона на кинетическое поведение ФС1.

3.3.3. Влияние параметров модели на поведение системы.

3.3.3.1. Влияние кислорода.

3.3.3.2. Влияние параметров активации цикла Кальвина.

3.3.3.3. Влияние ДрНна активность ферментов цикла Кальвина.

4. Квантово-химическое моделирование реакции окисления пластохинола в активном центре Q0 цитохромного б^комплекса.

4.1. Квантово-химические расчеты спектров ЭПР аналогов пластосемихинона

4.2. Энергетика реакции окисления триметил-1,4-бензохинола.

4.2.1. Квантово-химическое моделирование реакции окисления TMQH2.

4.2.1.1. Описание модельной системы.

4.2.1.2. Оптимизация геометрии модельной системы.

4.2.1.3. Энергетический профиль первой стадии реакции окисления TMQH2.

4.2.1.4. Перераспределение зарядов.

4.2.1.5. Оценки константы скорости и энергии реорганизации

4.2.1.6. Сродство триметш-1,4-бензохинола к железо-серному белку Риске &

4.2.1.7. Редуцированная модельная система.

4.2.2. Квантово-химическое моделирование реакции окисления TMQH.

4.2.2.1. Описание модельной системы.

4.2.2.2. Оптимизация геометрии модельной системы.

4.2.2.3. Энергетика реакции окисления TMQH.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Теоретическое исследование рН-зависимой регуляции электронного и протонного транспорта в хлоропластах"

Математическое моделирование давно применяется для анализа световых и темновых стадий фотосинтеза. Моделирование процессов электронного и протонного транспорта с учетом структурных и функциональных особенностей тилакоидных мембран может играть важную роль для количественного анализа механизмов регуляции электронного транспорта и энергетического сопряжения в хлоропластах. Это связано с тем, что непосредственные измерения рН внутри компартментов малых размеров (например, в узкой межтилакоидной щели) с помощью рН-чувствительных зондов затруднены. Однако количественное описание биоэнергетических процессов в фотосинтетических системах осложняется высокой степенью компартментализации фотосинтетического аппарата на разных уровнях структурной организации.

В первой части диссертационной работы рассматривается математическая модель электронного и протонного транспорта в хлоропластах высших растений, учитывающая фотоиндуцированные изменения рН во внутритилакоидном пространстве и в строме хлоропласта (Глава 3). В этой модели наряду с нециклическим (линейным) транспортом электронов от ФС2 к конечному акцептору ФС1, учитываются процессы синтеза АТФ, сопряженного с трансмембранным переносом протонов через АТФ-синтазу, потребление АТФ в цикле Кальвина, а также окислительно-восстановительные превращения конечного акцептора электрона ФС1. В данной модели феноменологически описываются процессы активации цикла Кальвина, обусловленные зависимостью скоростей реакций цикла Кальвина от рН стромы хлоропласта. Результаты численного эксперимента показали, что процессы светоиндуцированной активации ферментов цикла Кальвина, влияющие на скорость оттока электронов от ФС1, могут заметным образом сказываться на кинетике электрон-транспортных процессов в интактных хлоропластах. В частности, рН-зависимое ускорение оттока электронов на акцепторном участке ФС1 за счет активации цикла Кальвина может быть причиной многофазной (немонотонной) кинетики окислительно-восстановительных превращений Р700 при освещении адаптированных к темноте хлоропластов, которая наблюдается в опытах с интактными хлоропластами in situ.

Во второй части диссертации описаны свойства двух модельных систем, построенных для квантовохимического моделирования двух элементарных стадий реакции окисления хинола в хинон-связывающем центре Qc цитохромного /^комплекса, являющейся лимитирующей в цепи электронного транспорта в хлоропластах (Глава 4). Обе модели основаны на рентгеновской кристаллической структуре цитохромного 6^комплекса зеленой водоросли Chlamodomonas reinhardtii. Методом функционала плотности рассчитаны энергетические диаграммы для двух элементарных стадий реакции окисления триметил-1,4-бензохинола (аналог пластохинола) в центре Q0, сопряженных с процессами переноса протона от молекулы хинола к железо-серному центру Риске и высокопотенциальному цитохрому Показано, что построенные модельные системы дают корректное описание реакции окисления хинола в центре Q0, согласующееся с представлениями о бифуркационном характере этой реакции в соответствии с механизмом Q-цикла Митчелла. Результаты расчетов хорошо согласуются с известными представлениями о том, что лимитирующей стадией в работе цепи электронного транспорта между двумя фотосистемами является первая стадия окисления хинола в хинон-связывающем центре Q0 цитохромного б^комплекса.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Фролов, Алексей Евгеньевич

ВЫВОДЫ

1. Построена математическая модель процессов электронного и протонного транспорта в хлоропластах, впервые учитывающая не только фотоиндуцированные изменения рН внутритилакоидного пространства (pHj), но и изменения рН в строме (рН0), влияющие на процессы активации реакций цикла Кальвина.

2. Выделены два основных фактора рН-зависимой регуляции электронного транспорта, определяющие немонотонную временную зависимость редокс-превращений Р700и других электронных переносчиков: а) торможение электронного транспорта между фотосистемами 2 и 1 вследствие уменьшения рН;; б) ускорение оттока электронов от ФС1, обусловленное увеличением рНо.

3. Построены модельные системы для описания методом функционала плотности двух стадий окисления пластохинола в хинон-связывающем центре Qc цитохромного Ьф комплекса фотосинтетической цепи переноса электронов.

4. Расчеты спиновой плотности на ядрах атомов водорода анион-радикала триметил-1,4-бензохинона дали хорошее согласие с экспериментом, что свидетельствует об адекватности использованного метода расчета электронных характеристик молекул хиноидной природы.

5. Впервые рассчитаны энергетические диаграммы для двух элементарных стадий реакции окисления триметил-1,4-бензохинола (аналог пластохинола) в центре Q0, сопряженных с процессами последовательного переноса электронов от молекулы хинола к железо-серному центру Риске и цитохрому be'. Полученные результаты хорошо согласуются с представлениями о том, что лимитирующей стадией в работе цепи электронного транспорта между фотосистемами 2 и 1 является первая стадия окисления хинола в хинон-связывающем центре Q0 цитохромного /^комплекса.

Заключение

В диссертационной работе построена математическая модель электронного и протонного транспорта в хлоропластах высших растений и клетках цианобактерий, которая является развитием созданных ранее моделей фотосинтеза, посвященных рН-зависимой регуляции фотосинтеза [72-80]. В этой модели вместе с нециклическим (линейным) транспортом электронов от ФС2 к конечному акцептору ФС1, учитываются процессы синтеза АТР, сопряженного с трансмембранным переносом протонов через АТР-синтазу, а также потребление AIP и NADPH в цикле Кальвина. Наряду с фотоиндуцированными изменениями рН во внутритилакоидном пространстве, влияющими на скорость электронного переноса на пластохиноновом участке цепи электронного транспорта, были смоделированы рН-зависимые процессы электронного переноса на акцепторном участке ФС1, а также рассмотрено (в рамках феноменологического подхода) влияние фотоиндуцированных изменений стромального рН на потребление терминального акцептора ФС1 в реакциях цикла Кальвина. Учет фотоиндуцированных изменений рН в строме и во внутритилакоидном пространстве позволил описать влияние процессов активации ферментов цикла Кальвина на кинетику фотоиндуцированных окислительно-восстановительных превращений ряда переносчиков электрон-транспортной цепи хлоропластов. Сравнение результатов численных экспериментов, выполненных для различных метаболических состояний хлоропластов, с известными из литературы экспериментальными данными для листьев высших растений и клеток цианобактерий показывает, что модель адекватно описывает основные закономерности сложной немонотонной кинетики фотоиндуцированных окислительно-восстановительных изменений первичного донора электронов ФС1 (Р700), а также фотоиндуцированные изменения рН„ и рН;.

Во второй части диссертационной работы описаны свойства двух модельных систем, построенных для квантово-химического моделирования окисления хинола в хинон-связывающем центре Q0. Обе модели основаны на рентгеновской кристаллической структуре цитохромного комплекса b(f зеленой водоросли Chlamodomonas reinhardtii. Одна из модельных систем (рис. 3) построена для моделирования окисления хинола в центре Q0; для этой системы рассчитан энергетический профиль первой стадии реакции окисления хинола - перенос атома водорода от аналога пластохинона триметил-1,4,бензохинол (TMQH2) на железо-серный белок Риске. Вторая модельная система (рис. 4) построена для моделирования переноса протона от семихинона (TMQH) на низкопотенциальный гем цитохрома be,. Обе стадии окисления хинола рассматриваются как процессы, в ходе которых атом водорода, отдаваемый одной из гидроксильных групп TMQH2, идет к одному из акцепторов депротонированный остаток (Hisl55 или Glu78) по дну энергетической "долины", определяемой фиксированными атомами модельной системы.

Среди факторов, влияющих на энергетику реакций переноса атома водорода в модельных системах, описанных выше, выделим положение хинола и ближайших групп, принимающих протон (Hisl55 и GIu78). Вероятность переноса протона от TMQH2 на депротонированный остаток Hisl55, координирующий атом Fe (ТегЗг^кластера ISP, очень чувствительна даже к незначительным структурным изменениям комплекса. Варьирование расстояния туннелирования и ориентации донора (TMQH2) и акцептора протона (Hisl55-[Fe2S2]) может заметно влиять на энергетические профили реакции переноса протона (рис. 9). Сравнительный анализ энергетических профилей для структур с различными атомными конфигурациями позволил выбрать наиболее приемлемую, на наш взгляд, конфигурацию модельной системы для адекватного описания первой (лимитирующей) стадии окисления хинона. Анализируя изменение геометрии исходной (рентгеновской) системы в ходе оптимизации, было обнаружено, что одна из частично оптимизированных систем (обозначенная как А—1) может быть использована как базовая структура для расчетов первой стадии окисления TMQH2. Атомная конфигурация системы А—1 близка к геометрии исходной системы, построенной на основе рентгеноструктурных данных. В этой системе энергия формирования фермент-субстратного комплекса определяется как понижение энергии при взаимодействии TMQH2 со свободной частью системы, которое составляет относительно малую величину, SE ~ -2 ккал/моль.

Результаты расчетов показали, что модельные системы, представленные на рис. 3 и 4, в принципе дают правильное объяснение энергетики РСЕТ реакции окисления окисления хинола в центре Q0. Первый шаг окисления хинола, моделируемый как перенос протона от TMQH2 к Hisl55, представляет собой эндогенный процесс (AG° — 10.7 ккал/моль при 298 К) с относительно большим активационным барьером (24,36 ккал/моль при 298 К). Этот результат хорошо согласуется с известными предположениями о том, что перенос первого электрона при окислении хинола в цитохромном комплексе be 1 является энерго-акцепторным процессом [65,66,152,157,162-166]. Следующий шаг окисления хинола (QH —* £6L), рассматриваемый в рамках второй модельной системы (рис. 4), является экзогенным процессом (АЕ2~ -9,6 ккал/моль), что указывает на то, что перенос второго протона происходит значительно быстрее, чем перенос первого протона.

Эти результаты согласуются с общепринятой точкой зрения, что первый шаг окисления хинола является лимитирующим процессом, определяющим скорости родственных цитохромных комплексов b(f и Ъс\ [65,66,162-173].

Интерпретация полученных результатов, основанная на использовании уравнений классической теории электронного транспорта Маркуса, находится в хорошем согласии с кинетическими данными, доступными в литературе, что подтверждает вывод об эндогенной природе первого шага окисления хинола в центре Q0. Рассматривая первый шаг окисления TMQH2 как лимитирующую реакцию электронного транспорта, сопряженной с переносом протона вдоль водородной связи между -ОН группой TMQH2 и соседним атомом Nc остатка гистидина Hisl55 окисленного железо-серного центра, была сделана оценка общей константы скорости &рсЕТ окисления хинола. Значение &рсЕТ было вычислено на основании структурных данных и рассчитанного энергетического профиля для первой стадии окисления хинола. Были рассчитаны изменение свободной энергии A G° и высота барьера реакции AGpCET. Согласие значений расчетной и экспериментальной констант скоростей 280 с-1 [149-151]) было получено в предположении, что реакция переноса водорода характеризуется сравнительно малыми значениями энергии реорганизации Я ~ 0,9-1,4 ккал/моль (40-60 мэВ).

Большое значение константы скорости для второй стадии окисления хинола (&рсет 109-10п с"1), полученное на основании расчетных данных, может обеспечить условия для высокой эффективности бифуркционной реакции концертного двуэлекгронного окисления хинола до хинона, объясняющая механизм переноса второго электрона исключительно по высоко-потенциальную цепь. В этом случае, энергетически выгодная стадия окисления TMQH, вообще говоря, не требует обязательного смещения семихинона внутри полости Q0 в сторону цитохрома . Иными словами, можно предположить, что обе стадии переноса протона в реакции бифуркационного окисления хинола до хинона могут происходить «концертно» и без вращения семихинона в полости Q0. Разумеется, что этот механизм вовсе не исключает того, что первичные элементарные стадии окисления хинола в каталитическом центре фермента сопровождаются конформационной релаксацией белковой глобулы и релаксационными процессами в его ближайшем окружения (см., например, [175]). Нельзя также исключить того, что после переноса протона на Glu78 может происходить вращение протонированного амиокислотного остатка Glu78, которое, как предположил Крофтс с сотрудниками [65,66], необходимо для выхода протона из центра Qc цитохромного ^-комплекса. Несомненно, что более глубокое понимание механизмов работы цитохромного й^комплекса невозможно без изучения динамических особенностей этой системы методами молекулярной динамики. Однако детальный анализ этих процессов выходит за рамки задач, поставленных в данной диссертационной работе. Касаясь дальнейших перспектив нашей работы, можно предположить, что описанные выше модели могут быть использованы как базовые структуры для исследования окисления хинола в более сложных системах с использованием современных методы компьютерной химии (таких как, QM/MM метод).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Фролов, Алексей Евгеньевич, Москва

1. E.I. Rabinovitch, Photosynthesis and related processes, v.I, Chemistry of photosynthesis, chemosynthesis and related processes in vitro and in vivo, Interscience Publ. Inc., N. Y., 1945.

2. A.K. Кукушкин, A.H. Тихонов, Лекции по биофизике фотосинтеза высших растений. Изд-во МГУ, Москва, 1988.

3. А.Б. Рубин, Биофизика, тт. 1 и 2, Книжный дом «Университет», Москва, 1999.

4. R.E. Blankenship, Molecular Mechanisms of Photosynthesis, Blackwell Science, 2002.

5. D.G. Nickolls, S.J. Ferguson, Bioenergetics 3, Academic Press, Inc., N.Y., 2002.

6. D.L. Nelson, M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry. Fourth Edition, Worth publishers, N.Y. 2005.

7. P. Jordan, P. Fromme, H.-T. Witt, O. Klukas, W. Saenger, N. KrauB, Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution. Nature, 411 (2001) 909-917.

8. Ben-Shem, F. Frolow, N. Nelson, Crystal structure of plant photosystem I, Nature 426 (2003) 630-635.

9. Zouni, H.-T. Witt, J. Kern, P. Fromme, N. KrauB, W. Saenger, P. Orth, Crystal structure of photosystem II from Synechococcuselongatus at 3.8 A resolution, Nature 409 (2001) 739743.

10. Kamiya N., Shen J.-R. (2003) Crystal structure of oxygen-evolving photosystem II from Thermosynechococcus vulcanus at 3.7-A resolution Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 100, 98103.

11. D. Stroebel, Y. Choquet, J.-L. Popot, D. Picot, An atypical heam in the cytochrome b<f complex, Nature 426 (2003) 413-418.

12. G. Kurisu, H. Zhang, J.L. Smith, W. A. Cramer, Structure of the cytochrome b<f complex of oxygenic photosynthesis: tuning the cavity, Science 302 (2003) 1009-1014.

13. J.P. Abrahams, A.G.W. Leslie, R. Lutter, J.E. Walker, Structure at 2.8 A resolution of Fl-ATPase from bovine heart mitochondria, Nature 370 (1994) 621-628.

14. D. Stock, A.G.W. Leslie, J.E. Walker, Molecular architecture of the rotary motor in ATP synthase, Science, 286 (1999) 1700-1705.

15. Biochim. Biophys. Acta, V. 1458 (2000) № 2-3 (Special Issue. Guest Editor: J. Walker).

16. J. Bioenerg. Biomembr., V. 32 (2000) № 4 and № 5 (Minirevievv series, ATP synthesis in the Year 2000: current views about structure, motor components, energy interconversions and catalytic mechanisms, Parts I and П).

17. C.H.Foyer, G. Noctor, Homeostasis of adenylate status during photosynthesis in a fluctuating environment, J. Exp. Botany 51 (2000) 15-19.

18. J.F. Allen, State transitions a question of balance, Science 299 (2003) 1530-1532.

19. A.R. Grossman, D. Bhaya, Q. He, Tracking the light environment by cyanobacteria and the dynamic nature by light harvesting, J. Biol. Chem. 276 (2001) 11449-11452.

20. A. Haldrup, P.E. Jensen, C. Lunde, H. V. Scheller, Balance of power: a view of the mechanism of photosynthetic state transitions, Trends in Plant Science 6 (2001) 301-305.

21. A.H. Тихонов, Регуляция световых и темновых стадий фотосинтеза, Соросовский Образовательный Журнал, № 11 (1999) стр.8-15.

22. В. Rumberg, U. Siggel, рН changes in the inner phase of the thylakoid during photosynthesis, Naturwissenschaften 56 (1969) 130-132.

23. A.N. Tikhonov, G.B. Khomutov, E.K. Ruuge, L.A. Blumenfeld, Electron transport control in chloroplasts. Effects of photosynthetic control monitored by the intrathylakoid pH, Biochim. Biophys. Acta 637 (1981) 321-333.

24. A.H. Тихонов, JI. А. Бшоменфельд, Концентрация водородных ионов в субклеточных частицах: физический смысл и методы определения, Биофизика 30 (1985) 527-537.

25. L.A. Blumenfeld, A.N. Tikhonov, Biophysical Thermodynamics of Intracellular Processes. Molecular Machines of the Living Cell, Springer-Verlag, New York (1994).

26. D.M. Kramer, С.A. Sacksteder, J.A. Cruz, How acidic is the lumen? Photosynth. Res. 60 (1999) 151-163.

27. В. V. Trubitsin, A.N. Tikhonov, Determination of a transmembrane pH difference in chloroplasts with a spin label Tempamine, J. Magn. Reson. 163 (2003) 257-269.

28. A.N. Tikhonov, R.V. Agafonov, I.A. Grigor'ev, I.A.Kirilyuk, V.V. Ptushenko,

29. В. V. Trubitsin, Spin-probes designed for measuring the intrathylakoid pH in chloroplasts, Biochim. Biophis. Acta 1777 (2008) 285-294.

30. H.H. Stiehl, H.L. Witt, Quantitative treatment of the function of plastoquinone in photosynthesis, Z. Naturfor'sch. 24b (1969) 1588-1598.

31. Witt H.T. Coupling of quanta, electrons, fields, ions and phosphorylation in the functional membrane of photosynthesis. Results of pulse spectroscopic methods, Q. Rev. Biophys. 4 (1971) 365-477.

32. U. Siggel, The function of plastoquinone as electron and proton carrier in photosynthesis, Bioelectrochem. Bioenerg. 3 (1976) 302-318.

33. W. Haehnel, Photosynthetic electron transport in higher plants, Ann. Rev. Plant Physiol. 35 (1984) 659-693.

34. W. Haehnel, The reduction kinetics of chlorophyll ax as an indicator of for proton uptake between the light reactions in chloroplasts, Biochim. Biophys. Acta 440 (1976) 506-521.

35. A.N. Tikhonov, G.B. Khomutov, E.K. Ruuge, Electron transport control in chloroplasts. Effects of magnesium ions on the electron flow between two photosystems, Photobiochem. Photobiophys. 8 (1984) 261-269.

36. M. Nishimura, T. Ito, B. Chance, Studies on bacterial phosphorylation. Ш. A sensitive and rapid method of determination of photophosphorylation, Biochim. Biophys. Acta 59 1962) 177-182.

37. H.W. Heldt, K.Werdan, M. Milovancev, G. Geller, Alkalization of the chloroplast stroma caused by light-dependent proton flux into the thylakoid space, Biochim. Biophys. Acta 314(1973)224-241.

38. P.R. Rich, D.S. Bendall, The kinetics and thermodynamics of the reduction of cytochrome с by substituted p-benzoquinols in solution, Biochim. Biophys. Acta 592 (1980) 506-18.

39. P.R. Rich, Electron transfer reactions between quinols and quinones in aqueous and aprotic media, Biochim. Biophys. Acta 637 (1981) 28-33.

40. P.R. Rich, Electron and proton transfers through quinones and cytochrome be complexes, Biochim. Biophys. Acta 768 (1984) 53-79.

41. P.R. Rich, The quinone chemistry of be complexes, Biochim. Biophys. Acta 1658 (2004) 165-171.

42. U. Brandt, J. Okun, Role of deprotonation events in ubihydroquinone:cytochrome с oxidoreductase from bovine heart and yeast mitochondria, Biochemistry 36 (1997) 1123411240.

43. T.A. Link, The role of the "Rieske" iron sulfur protein in the hydroquinone oxidation (Qp-) site of the cytochrome bc\ complex: the "proton-gated affinity change" mechanism, FEBS Lett 412 (1997) 257-264.

44. U. Brandt, The chemistry and mechanics of ubihydroquinone oxidation at center P (Q„) of the cytochrome bcx complex, Biochim. Biophys. Acta 1365 (1998) 261-268.

45. P. Horton, A.V.Ruban, R.G. Walters, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47 (1996) 655-684.

46. K.K. Niyogi, X.P. Li, V. Rosenberg, H. S. Jung, J. Exp. Bot. 56 (2004) 375-382.

47. H.B. Карапетян, Биохимия 72 (2007) 1385-1395.

48. D.S. Bendall, R.S. Manasse, Cyclic photophosorylation and electron transport, Biochim. Biophys. Acta 1229 (1995) 23-38.

49. P. Joliot, A. Joliot, Cyclic electron transfer in plant leaf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 10209-10214.49.