Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение протон-тритиевого обмена в хлоропластах в процессе фотофосфорилирования

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение протон-тритиевого обмена в хлоропластах в процессе фотофосфорилирования"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГАСПАРЯН Марине Эдуардовна

УДК 577.355.152.23:3

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТОН-ТРИТИЕВОГО ОБМЕНА В ХЛОРОПЛАСТАХ В ПРОЦЕССЕ ФОТОФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

03.00.02 — Биологическая физика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1992

Работа выполнена и лаборатории биоэнергетики и фотосинтеза Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук Л. С. ЯГУЖИНСКИИ.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук А. Н. ТИХОНОВ,

доктор биологических наук Ю. В. ЕВТОДИЕНКО.

Диссертация направлена на официальный отзыв в Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.'

гического Совета К 053.05.68 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском Государственном Университете по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

Защита состоится в часов на заседании Специализированного Биоло-

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совет) доктор биологических наук

Б. А. Гуляев

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопроо о механизме энергетического сопряжения в процессе фотофосфорилирования находится в центре биологических исследований последних лет. Наиболее актуальной является проблема путей переноса протонов между электронтранспортной цепью И АТР -синтетазой. В ряде лабораторий (Theg,Homann, 1982, Dllley, 1981,1982) било показано , что в мембранах тилакоидов существуют домены ионогешшх групп, способных связывать протоны так, что образующийся протонный пул не находится в равновесии с протонами водной фазы. Выход протонов из этих доменов резко ускоряется при световой энергизации мембраны или при добавлении протонофорных разобщителей. Эти данные, а также результаты опытов по предстационарной кинетике фотофосфорилирования (Dllley, 1987) указывают на важную роль протонных доменов в мехшшзме сопряжения. В то же время вопроо о отроении доменов и механизмах переноса протонов между доменами и ферментными системами, участвующими в фотофосфорилирования, остается открытым. Можно полагать, что в основе этих процессов лежат значительные информационные перестройки в мембранах хлоропластов.

Цель работы. В работа ставилась задача разработки методических подходов к изучению конформационных переходов в мембранах хлоро-пластоя, связанных о фотофоофорилированием, на основе метода протон - тритиевого обмена. Необходимо бшю выявить фракцию'мембранно-

Принятыё сокращения: AIP - аденозин - 5'.- дифосфат; АТР - аденозин - 5 - трифосфат; CPj - каталитический компонент АТРазы хлоропластов; СГ0 - мембранный компонент АТРазы. хлоропластов; ДЦКЦ -- N,n! - дициклогвксилкарбодиимид;'ЭДТА - этилендиаминтетраацетат) мКимилиюори (I09 расп/мин); мкКи - микрокюри (Ю6 расп/мин); расп/мин - распад в минуту; хл - хлорофилл; ДДС-Ый - додецилсуль-фат натрия.

-связанного трития, свойства которой зависели бы от функционального состояния мембраны. Особый интерес представляло выяснение возможностей прямого взаимодействия компонентов мембраны о АТР-сияте-тазой в ходе фотофосфоршшрования.

Научная новизна габотн. Впервые обнаружено, что при длительной инкубации хлоропластов в среде,содержащей Т20, образуется пул трития, прочносвязаниого с мембраной. Показано, что выход трития из этого пула резко ускоряется при световой энергизации или при добавлении протонофора - грамицидина. Установлено, что в условиях фо-тофосформирования происходит перенос трития из мембранного пула в каталитический компонент АТР-синтетазы (СЕ|), причем этот процесс • не включает стадии выхода трития в Боднуто фазу. Исследование обнаруженного эффекта показало, что ддя переноса трития необходимы как энергизация мембраны светом, так и функционирование АТР-синтетазы. Таким образом, впервые получены доказательства существования непосредственных контактов между и такими компонентами мембраны хлоропластов, которые участвуют в процессе переноса протонов при фото-фосфорилирования.

Практическое значение шботы. Разработанные методические подходы открывают новые возможности для изучения конформационных пере~ ходов в биологических мембранах. Использование метода протон - три-тиевого обмена позволяет выявить участие различных ферментных комплексов, таких, например, как АТР-синтетаза, в подобных переходах. Метод позволяет исследовать мембранные препараты в широком диапазоне условий и при различных воздействиях. Предлогаемый в работе мето-дичеокий подход позволяет исследовать взаимодействие протонов с мембраной и её отдельными компонентами, что особенно важно для изучения функционирования сопрягающих мембран,

Апробация габотц, Результаты исследований докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино,1986), Всесоюзном совещании "Энергетичео-кие аспекты клеточного метаболизме" (Пущино, 1988), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989).

Публикаши. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуздения,выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 12 рисунками и фотографиями,9 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЦ ИССЛЕДОВАНИЯ

Хлоропласт веделяли по методу Аврода ( Arron, i960) из лиотьев гороха (10-14 дневного возраста) или шпината (30-40 дневного возраста) выращенных в контролируемых условиях в теплице. Для получения тилакоидных мембран хлоропласты ресуспендировали в 100 кратном объёме низкоосмотической среды, содержащей 1СШ КОД, 5 Ш трис - HCl (pH 7,8), После пятиминутного осмотического шока тилакоиды осаждали центрифугированием и инкубировали в течение 14 - 16 ч при 4°С в среде, содержащей 200 мМ сахарозу, 50 vffvl ЫаИ, 2,5 мМ MgOlg , 10 мМ трио-HCl pH 7,8 (стандартная среда), 20 M аскорбата натрия и 1,Ъ% бычьего сывороточного альбумина. Там,где указано, в среду .добавляли Т20. Концентрацию хлорофилла определяли по Арнону ( Am on , 1949),

Скорость циклического и нециклического фотофосфорилирования контролировали до и после инкубации хлоропластов потенцометричео-ким методом (Заботин, 1970), В'качестве акцепторов электрон-траНо-портной цепи использовали феназииметосульфат (циклический транс- 3 -

порт электронов) и метил вислоген (нециклический транспорт электронов).

Сопрягающий фактор (CPj) выделяли по методу Лиена и Рэкера (Lien , Raoker , 1971) из небольших порций хлоропластов, содержащих 4 мг хлорофилла. Фракции, содержащие белок (CPj), обесооливали и одновременно отделяли от слабосвязанного трития на колонках о се-фадексом о -25 (12'1,5 см, скорость тока 0,2 мл/мин), уравновешенных буферным раствором, содержащим 2 M ЭДТА, I Ш АТР, 3 Ш азид натрия и 20 M трио-HCl (рН 7,5),

Концентрация белка определяли по методу Бредфорц ( Bradford, 1976).

Для определения чистоты препаратов белка (CPj) проводили элек-трофоретический анализ на полиакрилашдном геле (15$) в присутствии ДДС - Ыа (0,1%).

Для определения количества трития, связанного с тилакоидными мембранами, суспензию хлоропластов объемом I мл нагревали до 100°С, после чего центрифугировали. Прозрачную надосадочную жидкость помещали во флаконы, содержащие нафталин-диоксановый сцинтиллятор,и считали на жидкостно-сцинтиллядаонном счетчике в«о>саап ЬН _Ю0 (США.). На таком же счетчике считали водные раотворы белков (CEj), используя в этом случае толуол-тритоновый сцинтиллятор. Эффективность счета в обоих случаях составляла 25-30$, - ошибка счета I--1,5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I, Ирследованид иротон-тштиевого обмена в мембранах • хлоропластов;

Для изучения конфорыационных переходов в мембранах тилакоидов в настоящей работе исследовали обратный иротон-тритиовнй обмен.

Суспензию свожевццеленшх хлоропластов гороха (содержание Хлорофилла 3-3,5 мг/мл) инкубировали в течение 14-16 часов в буферной ■ среде (см. методы), содержащей 2 мКи Т2°/мл при 4°С. После инкубации меченые тритием хлоропласта многократно промывали буферной средой,не содержащей Т2О. Для этого в каждую пробу брали густую суспензию хлоропластов, содержащую 20 мг хлорофилла, ресуспендаро-валя её в 20 мл буферного раствора и центрифугировали в течение 25 мин при 4°С.

При ¡саадой очередной отмывке осадок хлоропластов (объем осадка 2 мл) суспендировали в 10-кратном объеме нерадиоактивной среды так, чтобы концентрация хлорофилла составляла I мг/мл, и центрифугировали. Измерение радиоактивности проводилось в надосадочной." жидкости после осадцения хлоропластов. Проводили 10 последовательных отмывок продолжительностью 35 мин каждая (25 мин центрифугирование и 10 мин ресуспендирование). На рис.1 приведена зависимость скорости отмывки трития из мембран тилакоидов от времени. Видно, что в начале (первые 4 отмывки), содержание трития в супернатанте после каадой из отмывки уменьшалось в 10 раз. Начиная с пятой отмывки, скорость выхода трития из хлоропластов резко замедляется и вплоть до десятой остается практически постоянной. Разумно поло-гать, что при первых отмывках наблюдаемая скорость отмывки в основном определяется разбавлением метки в среде. В конце опыта количество метки в супернатанте определяется скоростью тритий-протонного обмену происходящего на мембранах тилакоидов.

В аналогичных экспериментах измеряли радиоактивность, которая остается в мембранах после каждой отмывки (см. методы). Из рис.2 можно видеть, что после 6-ой отмывки содержание трития в мембранах при каждой следующей отмывке снижается на столько же, сколько его выходит в надосадочную жидкость. Эта величина составляет около

- 5 -

2,0 . 104 расп/мин мг хл за 35 мин (одну отмывку).

В дальнейших экспериментах мы 'иооледовали действие яонофорного разобщителя фотофосфоршшрования грамицидина А. на выход трития из мембран тилаковдов, уравновешенных в Т2О. В опытах использовали те концонтрации грамицидина (1СГ9, 1СГ8 М), которые полностью ингиби-рузот нециклическое фотофосфорилирование,

При хранении хлоропластов в течении 14-16 часов в стшщартной среде (см. методы), содержащей ^О, скорость циклического фотофоофо-рилирования йадает на 2С$, а нециклического - на 35$. При этом характер кривых, отражающих зависимость скорооти фосформирования от концентрации грамицидина, в обеих случаях не меняется.

Проинкубированные с Т2О хлоропласты (16 ч) отмывали семь раз, после чего разделяли на 2 части и одну из них инкубировали 5 мин с грамицидином (конечная концентрация 1СГ8 М), затем проводили еще три последовательные отмывки. На рис.2 приведет данные по содержанию трития в мембранах после пятой отмывки. Как видно из рисунка, после добавления грамицидина содержание трития в мембранах снижаем ся на 4,5* расп/мин мг хл.

Эффект грамицидина мы наблюдали также по выходу трития в надо-садочную жидкость (табл.Х). Добавление грамицидина приводит к выходу дополнительно 6,0

•104 расп/мин мг хл трития из мембран, длительно инкубированных в среде,содержащей Т£0, в то время как не влияет на количество трития в мембранах, уравновешенных в той же ореде в течение 20 мин.

Эти данные указывают на то, что при длительной инкубации тила-коидннх мембран а среде, содержащей Т«>0, образуется фракция мемб-ранно-связанного трития, обмен которого резко ускоряется грамицидином з низких концентрациях. Таким образом при более длительной

РисЛ, Выход тритиевой метки в водную фазу в ходе последовательных переосажденнй хлоропластов, которые в течение 14 ч инкубировали в буферном раствора, содержащем 2 ыЯи ТоО/мл. Продолжительность каждой отмывки 35 мин. с

1,5'Ю5-

-Г"---Г---1—- I -

6 7 ,8 9 10 Номер отмывки

Рис.2. Влиянже грамицидина А на количество тркивьой метки в хло-ропластах, преинкубированных в среде, содержащей 2 иКн Т«0/ /мл в течение 14 ч при 4иС< л

Таблица I

Влияние грамицидина А на выход тритиевой метки из мембран хлоропластов, ггреинкубированных в среде, содержащей 2 мКи/мл Т?0 в течение 14 чаоов.

Время пре- 1 1 ■ " ! ! Условия ! Количество трития в надосадочной

инкубации ; жидкости (10° шсп/мин мг хл)

в Т20 1 { номере 1 отмывок

1 1 5 ! 6 I 7 ! 8 1 9 ! 10

20 мин Контроль + 10~8 и гра- 44 30 17 13 13 12

мицидина 45 31 16 13 13 12

14 ч Контроль + 1СГ8 М гра- 60 45 36 33 32 30

■ мицидина 59 105 25 15 15 14

Примечание: Хлоропласты отмывали 5 раз буфером и на 6-ой отмывке инкубировали 5 мин с грамицидином.

инкубации мембран в Т20 не просто увеличивается количество мембран-но-связанного трития, но происходит связывание метки с качественно иными компонентами мембраны, где протон-тритиевый обмен происходит значительно «едленно.

На следующем этапе работы иоследовалось влияние световой энер-гизации мембран на количество мембранно-связанного трития в хлоро-пластах. Хлоропласты инкубировали в среде, содержащей 2 мКи Т2ОДщ, в течение 16 ч, после чего переосаздали 5 раз в стандартном буфере (при меньшем числе отмывок в системе присутствует значительное количество несвязанного и слабосвязанного трития). Затем хлоропласты разделяли да 2 части , одну из них освещали белым светом в течение 2 мин, при концентрации хлорофилла I мг/мл,и .продолжали последовательные отмывки обеих проб одновременно. После 7-ой отмывки к неоо-вещенным хлоропласта« добавляли 10"^ М грамицидина. Далее параллсль-

но продолжали отмывки трех проб:!.неосвещенные хлоропласта; 2.неосвещенные хлоропласта, инкубированные 5 мин о грамицидином; З.оо-вешенные хлоропласта. В конце опыта число отмывок равнялось 10. Из рио; 3 можно видеть, что после освещения меченых тритием хлоро -пластов значительно снижается количество мембранно-связанного трития по сравнению о темновым контролем. Примерно на столько же снижается количеово мембранно-связанного трития при добавления к неосвещенным хлороплаотам грамицидина.

Раочет, сделанный на основания данных на Рио.7 и табл.1, показал, что при добавлении грамицидина из мембраны выходит 1200 нМ трития на мг хлорофилла. Эта величина составляет, по видимому, лишь часть всего грамицидин чувствительного пула, так как добавка грамицидина в этих опытах делалась через 3 часа после отмывки основной части несвязанного трития (после 5-ой отмывки). Как следует из работ Дили и сотр. (ЕШеу ,1981,1982), а также группы Хомана (Ноаапп ,1982,1983), выполненных с помощью различных методов, величина мембранного протонного пула не превышает 50-100 нМ Н*/мг хлорофилла. Такое значительное расхождение связано, по-видимому, о тем, что основную часть пула трития образуют амидные группы пептидных связей в мембранных белках.Скорость протон-тритиевого обмена определяется как доступностью и реакционноспособностыо групп, связывающих тритий, так и активностью протонов, катализирующих обмен. Можно полагать, что обнаруженный тритиевый пул находится в непосредственном контакте с протонными доменами в мембране. Катализ протон-тритиевого обмена в грамицидин чувствительном пуле осуществляют протоны из этих доменов, которые не находятся в равновесии с протонами среды. Этим и определяется совпадение свойств пулов трития и протонов.

Дальнейшее изучение свойств тритиевого пула выявило его непосредственную связь с системой оинтеза AIP в хлороплаотах. На рио.4 приведены данные опытов по исследованию протон-тритиевого обмена в мембранах хлоропластов в условиях фотофосфорилирования. Хлоро-плайты инкубировали в течение 14 часов в среде, содержащей 2 мКи/ /мл трития, после чего переосаждали 5 раз в стандартном буфере; Затем часть хлоропластов освещали в течение 2 мин в буфере в отсутствий субстратов фосфорилированйя, а другую часть - в присутствии 2 М аир иЗ Ш арсената натрия, и продолжали последовательные отмывки. После 7-ой отмывки каждую пробу разделяли на 2 части и к одной из них добавляли грамицидин до конечной концентрации

10"®'М и продолжали отмывать мембраны до 10-ой отмывки. Из рис.4 можно.видеть, что в присутствии adf и арсената натрия не происхо-1 дат светозависимый выход трития из мембраны, Освещение в условиях фотофосфорилирования предотвращает действие грамицидина на выход трития из мембраны.

Эти наблюдения показывают, что освещение меченых тритием мембран в присутствии абр и арсената вызывает перераспределение метки между различными компонентами тилакоддшх мембран. Возможно, в этих условиях тритий оказывается связанным о белками, которые не имеют непосредственного отношения к грамицидин - чувствительным компонентам тритиевого пула.

В заключение первой главы следует отметить, что не решенным оо-тается пока вопроо о механизмах, определяющих прочное связывание трития с компонентами мембраны хлоропластов. Тем не менее, обнаруженная в настоящей работе зависимость свойотв мембранного пула трития от функционального состояния хлоропластов и, преаде всего, его чувствительность к низким концентрациям грамицидина указывают ш то,что этот пул служит надежным индикаторем взаимодействия протонов с мембранами.

I,5«I0

у Ю

8

0,5*10®

T 9 Номер отмывки

Рис.3.

Влияние света и грамицидина А на количество трития в хлоропластах, инкубированных 14 ч в среде содержащей 2 мКи ТоО/млгнвосвещенные хло-ропласты (в), на 6-ой отмывке хлоропласта освещали 2 мин (Ж), на 8-ой отмывке к неосвещенным хлоропластам добавляли 10 нМ грамицидина (о) .

1,5.10

Рис А

Количество трития в хло-ропластах> инкубированных 14 ч в среде.содержащей 2 мКи ТрО/мл. На 6-ой отмывке хлоропласта освещали в отсутствие fo,») и в присутствии (А,Ж) 2 нМ АШ? И 3 мы th-CHAiO^, после чего на 8-ой отмывке к препаратам соответственно добавили 10 нМ грамицидина А (•,▲).

8 9 . 10 Номер отмывки

Глава 2, Переноо мембранно-связанного трития в CPj хлороплао-тов в уоловиях ФотойосФорилирования.

В предыдущем разделе работы был обнаружен пул мембранно-связанного трития, свойства которого менялись при энергизации хлоро-пластов светом, Это обстоятельство позволяло душть о том, что реакции протон-тритиевого обмена сопряжены с процессами переноса энергии в хлоропластах в процессе фосфорилирования. Поскольку свойства пула трития зависели от функционального состояния АТР-синте-тазы, чрезвычайно важным представлялось исследование связывания трития с этим ферментом. Ранее в работах Рирье и Ягевдорфа (1971,1972)' было показано, что при освещении хлоропластоэ происходит включение трития из водной фазы в каталитический компонент. АГР-сшгтетазного комплекса - фактор СРр Связавшийся с CPj тритий сохранялся в белке после отделения его от мембраны и крайне медленно обменивался о протонами среды. В экспериментах, описанных в данной главе, мы применили аналогичный подход к хлоропластам, уравновешенным о Т20 и отмытым от слабосвязанного трития.

Хлоропласты после выделения ресуспендировали в буфере, содержащем 3,3 мКи/мл T¿>0 (концентрация хлорофилла 3,0 мг/мл), и инкубировали в течение 14-16 ч при 4°С. Затем хлоропласты промывали 2 раза в 10-кратном объеме водного стандартного раотвора, ресуспендировали в той же среде при концентрации хлорофилла 0,2 мг/мл и освещали 2 мин. Суцернатант во время освещения содержал относительно мало трития (33 мкКи/мл). Контрольные.эксперименты показали, что освещение хлоропластов в среде, содержащей 100 мкКи TgO/un, не приводит к заметному изменению количества трития в CCj- по сравношю с темновыы фоноЛ Поело освещения хлоропластов выделяла Cí^ и считали количество трития в болко.

Из табл.2 видно, что освещение хлоропластов в отсутствие субо-

Таблица 2

Включение трития в сопрягающий фактор СР^- в хлоропластах, премированных в ореде, содержащей 3,3 мКи в течение 14 ч .

Добавки

Включение трития в СР^ (расп/мин мкг белка)

темнота { свет

- 16,0 + 1,2 16,7 ± 1,3

)Р 18,0 ± 1,4 17,2 ± 1,3

р , арсенат 18,0 ± 1,4 24,2 ± 2,1

СГ^ М грамицидин, ✓

р, арсенат 18,0 ± 1,4 18,7 + 1,4

СГ4 М ДЦКД,

р , арсенат 18,2 * 1,3 18,3 ^ 1,4

мечание: Хлороплаоты посла инкубации отмывали 2 раза стандарт- ■ ным буфером, вносили добавки и освещали (где указано) в течение 2 мин. Концентрация лор и арсената составляла 2 М и 3 Ш соответственно. Приведены средние результаты 10 экспериментов.

гов фотофосфорилирования не влияет на количество прочносаязан-5 трития в по сравнению с темновым контролем. Освещение хло-тстов в присутствии одного авр (без арсената) также не вызыва-юполнительного включения в СГ^- по сравне1шю с темновым кон-чемг; Лишь только в фосфорилирующих условиях, в присутствии в ере-др и арсената, освещение хлоропластов приводит к значительно-ювышению содержания прочиосвязанного трития в СЕр Это включе-подностыо подавляется темя концентрациями грамицидина, которые юстью блокируют нециклическое фотофоофорилирование.Подавление ошительного включения трития в наблюдается при инкубация ¡ран с ДЦКД в течение; 5 мин.

Таблица 3

Действие грамицидина в низких концентрациях на скорость фотофосфорилирования и светоивдуцированного включения

трития в в присутствии лир и арсената натрия;--г

Условия опыта

I Концен- {Скорость фо—[ Включение трития в СР^

1 трация 1тофосфорили-! расп/мин мкт белка

| грамици- ¡рования \двз £ычега гш,0 ВЫЧетом та

I динаМ ^^АТР/о|нового фона |новогофона

Эксперимент I

темнота - р» 42,6 -

темнота 1СГ8 0 42,6 0

свет 0 135 52,4 9,8

свет б'ЛСГ10 56 46,7 4,1

свет 1СГ9 0 42,8 0,2

Экспешмант 2

темнота - •■ С 47,2 -

темнота 10*8 0 47;2 0

свет 0 85 56,6 9,4

свет 10-10 85 52,9 5,7

свет Б. 1СГ10 0 47,9 0.7

свет 1СГ9 0 47,2 0

Примечание: Хлоропласты освещали 2 мин пооле удаления из среды ре диоактивности. В эксперименте I хлоропласты преинкубг ровали в среде, содержащем 5,6 мКи Т2<Умл в течение 17,5 ч, а в эксперименте 2 - 6,0 мКи Т20/мл, 19 ч.

•В табл.3 представлены данные о влиянии грамицидина в низких

концентрациях- на скорость фотофосфорилирования и на включение мег.

бранно-связанного трития в СЕ^ Хлоропласты метились тритием в щ

цессе темновой инкубации. Затем их отмывали стандартным буфером

(см. вкше), после чего освещали. Из данных табл;3 видно, что сни-кение включения трития в СР| коррелирует со снижением скорости нециклического фотофосфорилирования.

Таким образом, из описанных данных следует, что в фосфорилиру-одих мембранах хлоропластов происходит перенос мембранно-связанно-го трития в СРр Вопроо о том каким путем вдет перенос связанного грития в СЯ?2 имеет принципиальное значение. Этот перенос может осуществляться двумя путями: I) непосредственно из мембраны в игл 2) по пути мембрана-водная фаза-СРр Поэтому представлялось гаобходимым определить степень включения трития в СР^- под действи-)М света из водных растворов о низким содержанием Т^О. Для этого ¡9 меченые тритием хлоропласта освещали в стандартной среде,оодер-юдержавшей I мКи Т2О/МЛ (Гл.З, табл.5). Несмотря на то, что мечен-гко тритием хлороплаоты освещали в буфере, где радиоактивность среда в 30 раз ниже (33 мкКи/мл), чем радиоактивность среды , в кото-гай освещались не меченые тритием мембраны, включение трития в Сй^ I условиях фотофосфорилирования в первом случае в 3 раза выше, чем ю втором. Поэтому можно полагать, что тритий переносится в СРр непосредственно из мембранных компонентов, минуя водную фазу.

Грамицидин действует на переноо трития в СРр как путем тор-ожения фосфорилирования, тая и индукцией быотрого выхода части вязанного трития из мембранного пула, описанного наш в первой яавет.

Действие другого блокятора переноса трития ДЦКД направлено, о-видимому, непосредственно на АГР-синтетазу. Как известно, мй-енью действия этого ингибитора является небольшой (М.В. 8000) гид-офобный белок,входящий в состав мембранного компонента этого фер-онта (СГЛ) и участвующий в формировании пути переноса протона — • го работе ( !*»1яатг, 1376). Наши результаты позволяют предположи ■.

что ДЦКЦ-связывающий белок может принимать участие в образовании пути переноса протонов между мембранным тритиевым пулом и АТР-сшь тетазой. Этот путь не включает стадии выхода трития в водную фазу; он формируется лишь в условиях фотофосфорилирования и является важным элементом системы энергетического сопряжения.

Далее исследовали светозависиьую миграцию трития в меченых мембранах хлоропластов в зависимости от удельной радиоактивности в водной фазе.

Хлоропласта инкубировали в среде, содержащей тритий, после чего их промывали и ресуспендировали в стандартной сред« Радиоактивность суспензии составляла. 270 мкКи/ьш. Затем суспензию хлоропластов делили на две порции и к одной из них добавляли тритие-вую воду до конечной концентрации 1,6 мКи Т£0/мл. В табл.4 приведены в сравнении данные по светоиндуцированному включению трития в СР^ для каждого из этих препаратов. Видно, что в присутствии айр и арсената включение трития в СЗ^ в обеих пррциях было примерно одинаковым и слабо зависело от уровня радиоактивности водной фазы*. В то же время в отсутствие субстратов фотофосфорилирования наблюдается качественная иная картина.В этил случае при высокой концентрации трития в водной фазе (1,6 мКи/ыл) в СР^ после освещения включалось дополнительно 5,1 расп/мин мкг белка по сравнению с темновым контролем. Согласно данным табл.5 при освещении свежев-выделенных хлоропластов в среде, содержащей I мКи Т^О/мл в отсутствие абр и арсената,в (Я^ включается приблизительно такое же количество трития - 5,4 расп/мин мкг белка.

•Таким образом, можно полагать, что существуют два пути переноса трития через АТРазный комплекс - фосфорилируиций и нефосфорили-рующий. При освещении тилакоидных мембран в отсутствие субстратов фотофосфорилирования тритий попадает в СР^ из водной фазы, минуя

Таблица 4

Светоиндуцированное изменение количества трития в СГ--^

в хлоропластах, уравновешенных в течение 13 часов в срода, содержащей 5,5 мКи Т20/мл, в зависимости от удельной радиоактивности среды.

Условия 1 Включение трития в СР| (расп/шн миг ! белка) при концентрации Т20 в водной фазе

! | 270 мкКи/мл 1,6 мКм/мл

Темнота 36,2 г 37,4

Свет 35,2 42,5

Свет + 2 Ш АКР +

+ 3 Ш арсенат 42,6 44,0

<ембраяный пул. При этом сам пул не контактирует о ССр дар и фсоиат (или фосфат) меняют конформацшо мембраны таким образом, [то при совещании уотанавливаетоя контакт между пулом момбраяно-даязанного тригшг и АГР-статетазой, и предотвращает выход трития 13 пула в водную фазу.

Таким образом на основании данных экспериментов, описанных в 'л.можно предложить модель двух путей переноса протонов: I) из омбраны в (£¡2 (фосфорйлирующий) или 2) из мембраны в водную (|а-у и затем в СЗ^ (нефосфорилирутащй).

. Глава 3. ИосугедоЕздда <?Ё?уои{щудирор{щргр утп^Ш ,ШШ аз водной Фазы в сопшгаший (Ьактор хлоропластов

Для исследования оветоиндуцированного включения трития в СР| из родной фазы использовали свежевыделенные хлорошшсты, в которых контролировалась скорость нециклического фотофосфорилирования. Хло-лоропласты суспендировали в концентрации 0,2 мг/мл в стандартном буфере, содержащем I мКи ТдО/мл, освещали в течение 2 мин (объем проб составлял 20 мл), выделяли СРт и считали количество трития

■ I

в водных растворах белка. Как видно из табл. 5 , ра время опыта в

темноте происходит включение трития в СР^ (2-,6 расц/мин мкг белка), которое не меняется при добавлении в среду лор и арсената. При оо-вещении хлоропластов происходит дополнительное включение трития в СЗРд-.Из табл.5 видно, что в присутствии аир и арсената в СР^- включается примерно в 3 раза, а в присутствии АОТ и фосфата в 2 раза меньше трития, чем при освещении хлоропластов в нефосфорилирующих условиях. Бпокатор протонного канала АТРазы ДЦКД в тех концентрациях, в которых блокирует фотофосфорилирование, предотвращает ове-тоиндуцированное включение трития в СЖ^лЭти данные указывают на то, что при освещении хлоропластов протонный канал АТРазы контролирует обмен трития в СРр ] Далее мы исследовали влияние низких концентраций грамицидина

на светоиндуцированное включение трития в СРр На рис.5 (А) пока-

9 ТО

аано, что низкие концентрации грамицидина (1СГ , 1СГА М), которые полностью блокируют нециклическое фосфорилирование, не влияют на величину оветоиндуцированного включения трития в СР^, если при освещении хлоропластов в среде отсутствуют Аир и арсенат. Лишь значительно более высокие концентрации грамицидина (10""', 1СГ® М) снижают включение почти до темпового уровня; При освещении хлоропластов в буфере, содержаще* 2 иМ аир, без арсената,количество

Таблица 5

Светозависвмое включение трития в СР^ хлоропластов в фоофорилирующих и нефоофорилирующих условиях

Количество трития в СРТ

Добавки

| темнота | свет

— 2,5 8,0

дцкд (г^'кг4 м) 2,4 2,6

аир 2,6 7,3

арсенат 2,6 7,9

абр , арсенат 2,7 4,8

авр , фосфат 2,7 . 5,7

римечанме: Коночное концентрации добавленных веществ составляли - 2 мМ АИР , 3 мМ арсенат, 5 ьМ фосфат.

рития, включаегося в , оказывается несколько меньшим (при-:ерно на 0,7 расп/мин мкг белка) и не снижается в присутствии О"9, 10"® М грамицидина.

На рис,5(Б) приведены данные по влиянию низких концентра-ий грамицидина на светоиндуцированное включение трития в <5?^ в оловиях фотофосфорилировшшя. Видно, что в этих условиях низкие онцентрации грамицидина ингибируют включение трития в СР^- та 50?, нециклическое фосфорилирование - на 10С$, Для полного подавле-ия включения метки в СР} в последнем случае требовалось 1СГ Я рамицидина». Появление чувствительности к низким концентрациям рамицидина показывает, что в условиях фотофосфорилированля меня-гся путь переноса трития из водной фазы в СЕр На это же указывает шчительное онияение количества трития, связывающегося с СР^- пос-э внесения в реакционную среду авр и арсената.

О)

о

Я О.

о <-

0J

ш о

К

С1

со

Рч

о 0,1 I 10 100 Концентрация грамицидина (нМ)

Рис.5. Влияние грамицидина А на светозависимое вклвчение трятия в 1 С?т,Хлоропласта освещали в течение 2 мал в среде, содержа-

щей I мКи ТоО/вст. Скорость фотофосфорилирования измеряли в присутствии метилвиологена,за 100% принимали скорость в отсутствие грамицидина(150 мкмоль АТР «г хд/ч).(д).

А - хлоропласта освещали в присутствии (О) или в отсутствие ADP (•).

Б - хлоропласта освещали в присутствии 2 мМАДР и 3 ыЫ KgHPO^ (») или 2 ыМ A DP И 3 uM Na2AeO+ (Ö).

Далее исследовали выход тритиевой метки из C£j при повторном зсвещении хлоропластов. tí табл.6 приведены данные по содержанию ?ритиевой метки в CPj, ввдвленнол из хлоропластов после двухкрат-юго освещения. Свежеввделенные хлоропласты первый раз освещали i среде, содержащей I мКи/мл Т2О, Затем хлоропласты отмывали ( см, Vr.I) .ресуспендировали в стандартной среде и освещали второй раз. I результате отмывки радиоактивность в среде падала в 10 раз и ¡оставляло ICO мкКи/мл. Из табл.6 видно, что повторное освещение лоропластов в отсутствие ajdp и арсената приводит к снижению сокрушил радиоактивной метки в Cfj примерно на 60$. Обработка хло~ юпластов перед вторым освещением ДЩП в концентрациях, при которых он полностью блокирует фотофосфорилирование-, практически пред-твращает -оветозависимый выход метки из CPj. Повторное освещение пикает на 55^ количества метки, включенной в CPj во время первого сведения хлоропластов в фосфорилиругощих условиях-.

дер и арсенат предотвращают выход метки из CSPj при повторном свещешш хлоропластов, независимо от того в каких условиях - фос-оршшрузздих или нефосфоршшругацих происходит включение трития во ремя первой стадии освещения. Возможно в этих уоловиях молекула CSPj играет роль резервуара протонов с узким входом (роль которого моает играть активный центр фермента). Тритий, распределении?, по ЗсишаоЙ молекуле белка,может относительно медленно обмениваться с протонами в активном центре, что и определяет малую скорость его выхода. В отсутствие субстратов фотофосфорилирования выход трития, по-видимому, происходит другим путем, минуя активный центр.

Эти данные , а также результаты, описанные в предыдущей глазе, указывают на го, что существуют два разных механизма овето-зависимого протоп-тритиевого обмена в CPj в сопрягающих мембранах хлоропластов'. Первый механизм реализуется в отсутствие субстра-

Таблица 6

Влияние повторного освещещш хлоропластов в фосфорилирующих

и нрфо сформирующих. условиях на количество трития включенного в GPj на свету

I стадия

Условие опыта '■ I-

II стадия

¡Количество трития -1в CEj (раси/мин Imkx* белка)

темнота .• ■ темнота 2,7

темнота свет , ■ 3,0

свет темнота ! 0,4

свет свет | ' 4,8

свет свет + ДЩ (¡МОГ^М) 8,0

свет свет + АВР + арсенат 8,5

свет + авр + арсенат темнота 5,2

свет + акр + арсенат свет 3,8 '

свет + аир + арсенат темнота +абр + арсенат 457

свет + аир + арсенат овет + авр + арсенат 4,6

Примечание: Хлоропласты в первый раз освещали в среде, содержащей

I мКи Т20/мл, затем их отмывали и оовещаля второй раз при содержании трития в среде 100 мкКи/мл. Оба освещения проводили в течение 2 мин. Ifte указано добавляли 2 М AIP и 3 liJ арсената натрия;

тов фотофосфорилирования и характеризуется высокой величиной включения трития в CP-J-. Это включение быстро обратимо в условиях повторного освещения и не чувствительно к низким концентрациям грамицидина . Второй механизм включения трития в GPj наблюдается в присутствии субстратов фотофосфорилирования. В этих условиях включается значительно меньше метки и не происходит её быстрого выхода при повторном освещении. Включение трития в CSj в фосфорилиру-

вдих условиях чувствительно к низким концентрациям грамицидина.

ВЫВОДЫ

IV Длительная (14-16 ч) инкубация хлоропластов в среде, содержащей ТдО, приводит к образованию фракции трития, прочно связанного с мембраной, которая не находится в равновесии с водной фазой. Выход трития из обнаруженного пула резко ускоряется при онер-гизации хлоропластов светом и при добавлении мембранного протон офора - грамицидина.

Освещение хлоропластов в присутствии субстратов фотофосфорилм-рования приводит к перераспределению прочно связанного трития, в результате чего тритиевый пул утрачивает чувствительность к грамицидину. Одновременно возрастает количество трития, связгш-ного с фактором й^.

» Перенос трития из мембранного пула в СЗ^ происходит в условиях фотофосфорилкрования и не включает стадии выхода метки в водную фазу. Этот процесс блокируется грамицидином и ингибитором протонного канала в А'ГР-оиптетазе ~ Д1ВД.

. Эпоргозавиоимое включение трития из водной фазы в СР^. происходит различными путями в :кшлсимостя от функционального состояния хлоропластов. В отсутствие субстратов фотофосфорилирова-ния свеголицуцирояанное включение не ингябируетоя грамицидином в низких концентрациях. В условиях фотофосфорилированля этот процесс подавляется грамицидином так же эффективно, .¡®к и синтез ЛГР.

СПИСОК РАБОТ, (ПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Золотарева Е.К., Кузьмина В,П„ Гаспарян М.Исследование cbj зывандя протонов с тилакоадными мембранами методом тритяево-го обмена,//Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена". Тезиоы докладов. - Пущино, 1986. ^ С. 30.

2. Гаспарян М.Э., Золотарева Б.??.-, Яхужшзский if.Ctf Обмен прочно-связанного трития в мембранах хлоропластов.//Всесоюзный сш.тClan jai "Энергетические аспекты клеточного метаболизма". Труды.

- Пущино, 1988. - С.

3. Гаспарян М.Э., Золотарева В.К., Ягулишский Л.С. Исследование протон-тритиевого обмена в тилакоидных мембранах.// Биолэги-ческие мембраны. - 1989. - Т. 6. - С. 814-818,

4'. Золотарева Е;К., Гаспарян М.Э-;, Ягужинский Л,О. Дереноо мемб-ранно-связанного трития в оопрягающий фактор хлоропластов*. // Биологические мембраны. - 1989. - Т. 6. - С. 819-825.

5. (Jaeparyan И.Б., Zolotarev* В.К., laguehlneky 1,8, Ь:« wcohane of tightly bound tritlua la ohloroplaat membrane,//Internet!о nal symposium "Molecular organization of blologloal etruoturei Abstract book, - Moeoov, 1989. - 0, 36,

6. Zolotareva E.K., Gasparyan M.E., Yaguzhinsky L.S. Trar of tightly-bound tritium from the chloroplast membrane CF ^ is activated by photophosphorylation process.// Lett. - 1990 - v.272. - p. 184-186.