Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлоропластах высших растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Формирование надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлоропластах высших растений"

Па прсвах рукописи УДК 581.19:577.15

1 ' и од

БЛЕАДа^ШОВЛ :Лалика Пулатовна

ФОРМИРОВАНИЕ НШОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ Ц^КЛА КАЛЬВИНА В ХЛОРОПЛАСТА! ШСШХ РАСТЕНИЙ

(специальность 03.ОС.12 - физиология растеши)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ДУБХИ.; - 1225

Работа выполнена в лаборатории'молекулярной биологии и генной инженерии Института физиологии и биофизики растений АН Республики Тадаикистан.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор К.А.Алиев.

(ШЦШШЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук A.A.Абдуллаев, кандидат биологических наук А.Э.Эргашев

Ведущая организация: Таджикский государственный : университет

Защита состоится " "___1996г.

в_час. на заседании Диссертационного Совета Д 013.ОБ.01

по защита диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии и биофизики растений АН Республики Тадаикистан (734С63,г. Дуыанбе, ул. Мни, 299/2).

С диссертацией ¡ю;.що ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики растений АН Республики Тадаикистан

Автореферат разослан " "_____1995г.

Ученый секретарь • Диссертационного Совета, доктор биологических наук

I.A.Абдуллаев

ОБЩАЯ XAPAKTEF11C TiIKA РАБОТЫ

Актуальность теми. В настоящее время есэ большое признание получает идея регуляции метаболизма путем образования динамических мультяфврмэнтшх ансамблей-ассоция-тов, составляющих надмолекулярный уровень организации форментов (Фридрих, 1986; Курганов, 1986; 1989; 1991;Кап-рельянц, 1968; Катан, 1989; Карзсев,Стефанов, 1991; Наг-радовэ, Мурокец, 1991; Ермаков, IS93). В связи с этим основной тенденцией развития современной онзимологии является переход от исследовашш изолированных фермэнтов к изучению их надмолекулярной организации и способов функционирования в состава клеток.

Рибулозобисфосфаткарбоксилаза-оксигеназа (К! 4.1.1. 39) - ключевой фермэнт восстановительного понтозофосфат-ного цикла автотрофной ассимиляции углохясле ти, открытой Кальвином с сотрудниками в начале 50-х годов нынешнего столетия. Роль карбоксплазной функции фермента з биосфэре исключительна, поскольку она является основные источником органического вещества на Земле в современную геологическую эпоху. Поэтому РБ5К0 с момента открытия и до настоящего времена остается наиболее интенсивно лзучсв;дг! ферментом. Большие успзхи достигнута в исследовании шв каталитического шета и активации, особенностей регуляции фермента in vivo и in vitro , механизма синтеза и сборки молекулы олигомера и генетики РБ£К0 (Романова,Iri°i.).

Однако, исследование надмолекулярного уровня организации ферментов цикла Кальвина началось только в посложнее десятилетие. Одной вз форм надмолекулярной организации ферментов являются мультиформентные комплексы. Предположение о существовании в строме хлоропластов тройного комплекса,, состоящего из рибозофосфатизомеразы (КФ 5.3.1. 6.), фосфорибулокиназы (КО 2.7.1.19) и рибулозобисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы высказывалось ранее рядом авторов ( Peierkofsky , Racker ., 1961; üacElroy et al. , 1968; Füller , 1972;Романова,1973). Подобный комплекс был выделен из листьев гороха ( Sainia , Harris ,1986) и шпината ( sainis et ai .,1989). Затем из листьев шпината был

выделан пятифврментньш комплекс ферментов цикла Кальвина ( Сог^его et а!,1938).

Из листьев хлопчатника и арабидопсиса также был выделен ыультиферыентнш комплекс (Бабадаанова,Насыров,1992)., состоящий из рибозофосфатизомаразы (РФИ), фосфорибулокина-аы (СРК) и рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РЕФКО). Молекулярная масса комплекса составила 520+30 кДа,.а не 8X2 1сДа, как ожидалось при сложении молекулярных масс ШИ (5? кДа), ФРК (240кДа) и РЕФКО (52СкДа). Таким образом, сово-кушюсть данных, получанных разными авторами, указывает на необходимость глубокого изучения структурной организации и функциональных свойств этого мультиферментного комплекса. Отсутствие комплексных исследований структурной организации и функциональных свойств мультиферментного комплекса ферментов цикла Кальвина делают эту работу актуальной,

Цоль и задачи исследования. Основной целью нашей работы япилось исследование особенностей формирования надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлоропласта х высших растений и выявление функционального и ре-гуляторного значения такой организации.

Для достижения поставленных целей необходимо было решать елодующие задачи:

- выделить электрофоретически гомогенные препараты ферментов 1М'И, ФРК и РБ1К0 из листьев хлопчатника ;

- определить молекулярные массы нахивных молекул ферментов ' Ра>И, С-РК ц РЕФКО и их субъединиц;

- установить, обладает ли ферменты РФИ, ФРК п РБФКО другими фермоьтативньш активностями;

- провести кинетические исследования различных ферментативных активностей, проявляемых ферментными препаратами РМ, ФРК и РЕФКО; ■

- на основании получонних дагаых выявить особенности и форглы надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлорошшолах высших растений.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые устаиовлапо, что электрофоретачоскр гомогенные ^орментныа препараты Р£1 и ФРК обладают треуч фармэнтатив-

ншз активности - рибозофосфатязоморззпой, фосфорибуло-киназной и рибулозоблсфосфаткарбоксилазной. РБ<мС0 проявляет шесть ферментативных активностей - рибозофосфатизоме-разную, фосфорибулокиназнук, рибулозобисфосфаткарбоксилаз-ную, глицеральдегядфосфатдегидрогеназную, фосфоглодератки-назную и фруктоз обисфосфзтаз щга. У субьедишщ ФРК с молекулярной массой 60 кДа и субъедатац РБФКО с молекулярной массой 52 кДа определены три ферментативное актизности : рибозофосфатизомеразная, фосфорибулокиназнаг и рабулозо-бисфосфаткарбоксилазная.

Кинетические исследования каждой ферментативной активности , проявляемой ферментными препаратами НИ, ФРК я РБФКО в присутствии различных субстратов, позволили обнаружить у РФй, ФРК и РБФКО функциональные свойства, характерные для мультифермантных комплексов - "облегченный катализ" и координированные регуляторные эффекты.

Обнаружение у субъеданиц ФРК и РБ1КО и у нативных форм ферментов РФИ, ФРК и РБФКО различных ферментйгизпггс активностей и результаты кинетических исследований позволили нам сформулировать новые представления об этих ферментах : субъединица Рй1 является двухдомошшм аллоетощ-ческлм ферментом ; фермент РФИ - цультпдоменшй дииэршШ полифункциональный фермент ; ФРК и РБФКО - диншиче^кго мультиферментные комллвксы-ассоциаты, способные встраиваться в мембрану, образуя метаболой.

Физиологический смысл существования фгргонтов цикл о Кальвина в трех формах - свободной, мультиферг.:енгяцх ком • Алексов и метаболояа, находящихся в динамическом рзЕшззс -сии друг с другом, заключается в реализации регулятор; их механизмов различных уровней : механизмов гомеостаза г механизмов слежения. Свободные растворимые ферменты участвуют в поддержании клеточного гомеостаза с помощью механизмов изостерической и аллостерьтеской регуляции. В муль-тиферментнык комш(ексах и метаболонах осуществляется регуляция каждой ферментативной активности в отдельности и всей метаболической системы как единого целого через механизмы слежения. Благодаря механизмам слежения проясхо-

дат переключение метаболической системы на новы!! реши функционирования в соответствии с требованиями внешней среды.

На основании всей совокупности полученных нами и имеющихся в литературе экспериментальных данных предложена схема формирования надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлоропластах высших растений.

Полученные.результаты дают основание предлогшть в качество физиологического тэста пря отборе растений ддя ге-иетико-селокционных работ определение одной из фермента-тинной активностей ыультифармонтного комплекса, налример, рибозофосфатизомеразной.

Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены (или представлены) на Первой научной конференции Биохимического общества Республика Таджикистан (Душанбе,1993), ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава Таджикского госу-нивэрсктета (Душанбе,1993,1994), совместных тучных семинарах Общества физиологов растений и Биохимического общества Рейпубликд Таджикистан, лабораторий молекулярной энзи-иологии и молекулярной биологии и гецной инженерии Института физиологии и биофизики растений АН Республики Таджикистан (Душанбе,1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ .

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ЮЗ страницах машинописного текста, содержит 26 ри-оунков, таблиц и состоит из введения, обзора литературы, ¡экспериментальной части, включающей две главы, заключения , выводов и списка цитирова1шой литературы ( работ) . '

ЭКСЮЗЧтЧТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Обгект, условия и методы исследования

Источником получения ферментных прзпаратов Р&И, ФГК и РБФКО бхти 15-25-днэвные листья хлопчатника ( аоссур1ша

Мгои1;ит . , С9М9ЙСТВ0 1."а1уасеа«з ) сорта 103-5 В фазе развития растений 5-6 настоящих листьев.

Хлопчатник выраядезался с выполнен:!ом всех агротехнических мероприятий в полевых условиях на экспериментальном участке Института физиологии и биофизики растений АЯ Республики Таджикистан.

Определение содержания белка проводилось по методу Ло-ури ( Ьог.ту е! ¡13,1951).

Определение карбоксилазной активности проводили при 30°С радиометрическим методом (Романова,1930) по скорости включения Н^СО^ в кислотоустойчивые продукты .реакции.

Определение активности ФРК проводилось по модифицированному методу Гурштца ( Ниг,;! г г, ^ п!,1„56). Лабильные фосфорные соединения определяла по методу ^ске-Суббароу (Лоури-Лопес) в модификации Скулачева (Кочетов,1931).

Определение активности РЗЛ проводили-по молфвдрозан-ному методу Аксольрода и Пнг (лха1гс(>, Уапс , ¿954^. Определение продукта реакции - кетосахара проводили карба-зольным методом по рзакцаа Даше ( 018сЬч,ВогепГгеип<1, 19531).

Активность ГАФД в восстановительной фазе ш'нла Кельвина определяли по мэтоду, предло.ченьсму Петровой и Рс.''::ог<ой (1951).

Активность фруктозобпсфссТ-атазы опреде.г:.'г: по разработанному для высших растений (Ромл:-ова,1980).

Ввделение ц очистка фер:.к::т:п;х грепаратеи проводились нами по методам, разработаны:.! с учетом гпец,,с:.!:с! л:к'. :.1г-; хлопчатника (Бакаева ,Баиадоакоза, 1984 ;Еэбадзз пою.Г*::7ес:;. 1984 ;Бабаддакова,Бакаева,Али ев, 1989). Субьсушшг.» гт-т;* получали при обработке ферментных препаратов -

додецилсулъфатом натрия.

Для опраделенил гомогенности формат:,',: а^::<г>:,>.......

молекулярной кассы Лермонтов а ;:х суС7,о;;::к:г.; лси^-лзо^л.-и аналитический диск-элэктро|орез в под^акргляглдн'.: к;-. ..

Полученные результаты обработаны сгаъижчвс.« 1964;Лакин, 1960). Представленные данные достемрп арч доверительной вероятности 95-98^.

КССЛЗДОЕЛЕЕ ¿SPJSSSttGSBUX АКТИВНОСТЕЙ.ПРОЯВЛЯВ-

i-Щ vJT'i ИШТНЫлП ПР£КАРАТА:,И РБЖО, ФРК И РФЙ из ЛЛСТЪЗЗ ШШЧАТША. СОРТА 108-Ф

Быделекие и очистку ферментов повторяли многократно в течение нескольких лег. Содержание белка и ферментативные активности различных ферментных препаратов определяли в трех повторпостлх. Поскольку во всех случаях были получены очень близкие результаты, наш приведены типичные примеры.

Определение ферментативных активностей, проявляешь 'Т.ермэнтниля препаратами РБФКО, ФРК и РФИ

Полненные наш электрофоретически гомогенные ферментные препараты FM, ФРл и РЬЖО были использованы для определения молекулярной массы и наличия у них других ферментативных активностей в щ /тствии свойственного для данной реакции субстрата и субстрата предшествующей или последующих реакций. Из представленных в таблице I данных видно, что ферментные препараты P<KiÇ ФРК и РБФКО и субъединлцц ФРК и PEiKO проявляют по три ферментативные активности - рибо-зофосфатизомеразную, фосфорибулокиназную и рибулозоблсфос-фаткарбокс.ил831./ю. Субъединицы РШ проявили только одну ри-бозо~осфатязомеразную активность, причем вдвое меньшую в сравнении с нативным ферментом. На основании полученных данных мокко предположить, что при объединении двух идентичных субъединиц в димер в области контактирующих поверхностей формируется новый активный центр или центры, на котором или которых происходит последовательное превращении ?и5-Ф б РЕФ и фиксация ча РЕФ углекислоты с образованием 3-ФГК. В таком случае, ферментный препарат РФХ с молекулярной массой 52 кДа монет представлять собой мультиферментный комплекс и'л коныогат, обладающий тремя ферментативными активностями .

Б ферментном препарате РБФКО были определены так&е активности вакнейшх ферментов цикла Кальвина - глицеральде-гидфосфатдегвдрогенапнат: и фруктозобисфосфатазная, величины ферментативных активностей оказались равными 32+0,7 и а 1,6v0,4 мкмоль продукта з минуту на кг белка соответст-

5ермвнтатив1ше активности, тюявляешга йей..9нтнь-'Л яре^а-ратаг.га РФ:-!, ФРК а РБФХО из листьев >:лог.ч2Т1^.;.а ост)?г> 106-'; (фаза развития састеннП 5-Г настоя:';::-: л;:стыэлГ

Форментнкл —г..... ..... --1 ] Фер:.:е::тат::вная Субстрат ; л-г ах

препарат кДа ! активность 1 { | •гт л ОСТЬ ГИН

\гР г '..'..о II та з ...г со.

РФП 52+2 рпбозофосфат- Р-5-3 '¿С 70+1?

субъедлницк 26+1 изомеразкая X'- 1С ¿12

Ф?К 240+10 н __ 2в "г • о -т С-Ъ+ЙХ

субьеданицы 60+2 ■ оО н.6

РБФКО 520+30 •* О:) 0 ^ г ^ О 0-±т/С.0

субъедишщы 52~2 ¿С £8+31

гаи 52+2 ф>0 сфори бул ОКИ - ?-5—5 2861+:э

на зная .. . г л 5-0 34 5с+17

ФРК 240+10 Р-5-4 35 23+16

Рп5-2 ЗхСЗ-11ч

субъединицы 60+2 по

РКЖО 520+30 Р-5--Ф 37 "¿С+21 3157+19

субъединицы 52+2 Р-5-С> Рл5-3 5 / 3-'! С

РФИ 52+2 рт"булозоблс- Р-5-5 г* ь, 05 ч',

фссфаткарбок- ?РФ с, о '-»¿и,* - ~

ФРК 240+10 силазнал Р-5-^ РГО 1, С, -Л , 1

РЕ'ЖО 520+30 п Р-5-3 х > 0 ( о

РЕФ X, х 2 и С 5

о

ценно. Llera;; определения активности ГАФД предполагает предварительное действие фосфоглицераткинази, что позволяет считать РБ1К0 стабильным мультиферментным комплексом, проявляющим шесть ферментативных активностей цикла КальЕИНа.

Из приведенных в таблице I результатов видно, что величины удельных фосфорибулокиназной в рзбулозобисфосфаткар-боксилазкой активностей ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО, определенные при использовании в качестве субстрата Р-5-Ф на II-Iвыше в сравнении с величинами удельных активностей, полученными при использовании собственных специфических субстратов - Ри5-Ф и РБФ. Полученные результаты свидетельствуют о проявлении РБФКО, ФРК и РФИ одного из вакнейших функциональных свойств, характерных для мульти-шерментных комплексов -"облегченного катализа"."Облегченный катализ" состоит в что частичные реакции в комплексе протекают намного медленнее при добавлении промежуточных субстратов, чем начинающаяся с первого субстрата полная реакция (Фридрих,1986).

Другим свойством, характерным для мультиферментных комплексов, являются координированные регуляторнда эффекты, обнаруживаемые лри кикьтических исследованиях. Поэтому нами было изучено влияние длительности реакций, концентраций белка-фермента и субстратов на различные ферментативные активности, проявляемые ферментными препаратами РБФКО, ФРК и РФИ.

IííuETIHECKÍ'LE ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛИЯНИЯ СУБСТРАТОВ НА РАЗЛИЧИЕ ciEPMEilTATilBHUE АКТИВНОСТИ, ПРОЯВЛЯЕТЕ Ф2Р-itliíIixíilVLI ПРЗХЛРАТА.М РФИ, ФРК И РБЖО ТАЗ'ШШЗ ХЛОЯЧАТНгЕСА. СОРТА 108-5 Зависимость от концентрации субстрата рибозртоеггат-пзс^шзной активности ферментных препаратов РОИ, ФРК и РБФКО из листьев хлопчатника сорта 108-Ф

Из представленных на рис.1 данных видно, что фор.\а кв-нетлческих кривых одинакова для различных ферментных препаратов: Pin (pnc.IA), ФРК и РБФКО (рис.Щ. Для ферментных прегар.л'си Г «л, ФРК и РЕГ'КО зависимость накопления rnS-T? от

э

ь-о

'Нуги

2

Рис.1. Кинотика образования Ри5-3 при действии ферментных препаратов: Л - Р5И, Б - <ЗРХ и РЕЖО из листьев хлопчатника сорта 108-Ф.

длительности реаш.,.ш не является линейной. Нелинейность не монет быть объяснена исчерпанием субстрата реакции, поскольку концентрация Р--5-Ф была наседающей. Б данном случае нелинейность является кинетическим проявлением аллостеричес-ких взаимодействий, характерных для гистерезисных ферментов.

На оснований полученных данных опыты по изучению влу •.-ния различных концентраций субстрата на рибозофосфатизоме-разную активность ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО, выделенных из листьев хлопчатника сорта 1С8-Ф, проводились в течение одной минуты.

Из представленных на рис.2 данных о зависимости от концентрации субстрата рибозофосфатизомеразной активности ферментных препаратов . УЛ, ФРК и РБФКО видно, что независимо от ферментного препарата наибольшая рибозофосфатизоме-разная актив 'ость прояг тся при содержании в реакционной среде 0,5 ¡¿Л Р-5-Ф. При этой оптимальной концентрации рибо-зо-С-фосфата ферментные препараты РФИ, ФРК и РБФКО почти не различаются по УЕ.ах. При концентрациях субстрата, превышающие 0,5 мМ,наблюдается снижение рибозофосфатизомеразной активности , которое больше проявляется на ферментном препарате РФИ. Результ гы, полученные при исследовании зависимости от концентрации Р-5-Ф в реакционной среде рибозофосфатизомеразной активности ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО, были использованы для расчетов величин^ 5. .Величины [з^ ^ для Р-5-Ф ферментных препаратов РФИ, ФРК и РЕФКО при проявлении ими рибозофосфатизомеразной активности приведены в

таблвце 2" Таблица 2

Величины д(мЫ) для Р-5-Ф ферментных препаратов РФИ, ФРК и ЙЖО из листьев хлопчатника сорта 103-Ф при проявлении ими рибозофосфатизомеразной активности

Ферментный препарат ! КЬ,5 ' ь£Л

РФИ 2,2 + 0,04

ФРК 1.9 + 0,03

РБФКО 1.8 + 0,03

Из приведенных в таблице 2 данных видно, что при проявлении рибозофосфатизомеразной активности с увеличением молек/лнрной массы ферментных чрепаратов сродство к Р-5-0 улучшается.

i-орма кривой зависимости от концентрации субстрата ри-бозофосфатизомеразной активности, проявляемой фер.леити:-ы препаратом РОЛ. не является сигмоидной, как было получено ранее другими авторам! (Бакаева,Еабадаанова,1988) для фермента из этого ко объекта. Для полученных нами кривых заач-симости рибозофосфатизомеразной активности от концентрации субстрата характерны резкие вкходы на плата насьщензяСрис. 2А). Разная форма кривых обусловлена тем, что авторы изучали ли зависимость активности РЗИ от концентрации субстрата при высокой концентрации белка-фермента - 2 глсг белка-фермекта на мл реакционной среды. Наши экспзрименты проводились' при низких концентрациях белка-фермента - 0,2-ыкг белка-фермента на мл реакционной среды. Зто позволило обнаружить инги-бирование активности фермента при высоких концентрациях субстрата.

Ранее было обнаружено активирующее действие физиологических концентраций РБФ на натизную форму фермента и ка отдельные субъеданицы РФИ из листьев хлопчатника сорта 103-3 (Бакаева.Бабадканова,1988).

Дня РФИ из листьев хлопчатника обнаружена tûi~zb рбгт-~ ляция активности З-ЗГК (Еабаднанова,Бакаева,^ез,13'гО;Еи-бадаанова,Насыров,1992).

Совокупность нолучанных нами а другими авторами дэккых указывают на аллостерлчэскую природу ангябхроааюя F "Л "л-бытком субстрата.

Таким образом, нелинейность кривых заЕлсамостл нзхоп-ления продукта рибозофосфатизсмераз.;ой реакции от ее длительности, субстратное ингабировакие, проявляло с.ч лрл низких ковдентрациях белка-фермента, активзруггее действие РБФ на нативнуа форму фермента .i из отдельные суоъед^гнцк №!, регуляция активности фермента 3-4ПС по прзнцигту обратной связи дают нал основание считать, что ?1>И относи";ai к регудяторнш ферментам, субъединиц:; которой имеют аллоегб-

p:--:. центр.

Одинаковая с ферментным препаратом РФИ форма кинетических кривых зависимости накопления продукта рибозофосфат-нзэ:.;ераз:-юй реакции от ее длительности и зависимости от .юкцентрации сусстрата рибозофосфатизомэразной активности, проявляемой ферментными препаратами ФРК и РБФКО, свидетельствует о том, что, по-вздимо!..у, ФРК и РБФКО могут представлять собой ассоцнаты, в состав которых входит мультидомен-ный полифушсц:;ональнци фермент РФИ.

¿лаяние различных концентраций Р-5-Ф и Ри5-Ф'на фосфо-рибулокиназкую ат*вность различных шерментных препаратов

Кз представленных па рис.3 данных видно, что для ферментных препаратов РФИ, "^К и РБФКО зависимость накопления РЕФ от длительности фосф ¡булохиназной реакции не является линейной при использовании в качестве субстрат,., как Ри5-Ф, так и Р-5-Ф. Все ферментные препараты проявляют значительно более высокую фосфорибулокиназную активность при использовании в качества субстрата Р-5-Ф,

Сравнение ачений фосфорибулокиназной активности ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО показывает, что наиболь-цую активность проявляет ферментный препарат РФИ при использовании и Р—5-Ф, и Ри5-Ф. Полученные результаты согласуются с данными других авторов о том, .что низкомолекулярные формы ФРК обладают более высокой активностью в сравнении с высоко ко; юлекулярнц:.'д формами фермента (Хасанов,Иванищэв,Доман, 19Б6; Porter ,ISt3).

ла основании получен. !.ых данных опыты по изучению влияния различных концентраций Р-5-Ф или Ри5-Ф на фосфорибуло-к;>_азную активность ферментных препаратов РФИ, ФРК и РЕФКО проводились : течение одной минуты.

Из представленных на рис.4 и 5 данных видно, что наибольшая фосфорпбулоквназная активность (фармзнтных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО проявляется пр:; содержании в реакционной среде 0,25-0,5 гЛ Р-5-Ф или Ри5-Ф. При sтих оптимальных ко!"цэнтрациях Р-5-Ф . ._а Ри5-Ф фосфорнбулокиназная активность ферментного препарата РФИ значительно превышает ак- .

Рис.3. Зависимость от субстрата Р-5-Ф (о-о-о) или Ри5-Ф (о-о-э) гаигтики образования РБ5 при действии ферментных препаратов: А - РФИ, Б - ФРК, В - РБЕКО, из листьев хлопчатника сорта 108-Ф.

2 4 и 12 4

1.И ыМ

Рте. 4. Влияние различных концентраций субстрата Р-5-Ф (о-о-о) или Ри5-Ф(*-о-в) на проявление фосфори-булоканазной активности ферментными препаратами: А - РФИ, Б - ФРи из листьев хлопчатника сорита 108-Ф.

Рис.5. Влияние различных концентраций субстрата Р-5-Ф

(о-о-о) и Ри5-3 («-•-•) на проявление фосфора-

булокиназной активности ферментным препаратом РЕЖО аз лзстьяв хлопчатника сорта 106-Ф

тивность препаратов ФРК в РБФКО. Для кривых зависимости от концентрации Р-5-Ф фосфорибулокиназной активности фермент-нъг препаратов РМ, ФРК и РБФКО характеренрезкий выход на плато насыщения уже при 0,25 мМ субстрата со спадом активности в пределах концентрации субстрата 0,5-1 мМ. Для кривых зависимости от концентрации Ри5-Ф фосфорибулокиназной активности ферментных препаратов Б ФИ и ФРК характерно плато насыщения при 0,25-1 ыМ субстрата со спадом активности в пределах концентрации субстрата 1-2 мМ. Спада активности не наблюдается только для ферментного препарата РБФКО.

Таким образом, для ферментных препаратов РФ" и ФРК наблюдается ингибирование фосфорнбулокиназной активности при использовании высоких концентраций как Р-5—5, так и Риб-Ф.фосфорибулчкиназная активность ферментного препарата РБФКО мнгибируется высокими концентрациям! Р-5-Ф. 3 случав же использования в качестве субстрата Ри5-Ф ингибяровашя на ;:э наблюдалось.

Форма кривой зависимости от энцвнтрацииРиб-Ф фосфорнбулокиназной активности, проявляемой фёрментными препаратами РФИ, ФРК и РБФКО,не является сигмоидной и не имеет промежуточного плато, как было получено ранее другими автора-га для фермента ФРК из этого же объекта (Еабоджлова,1980; Бабадаанова.Автомонова,1983;БабадааноЕа,Бакаева,Али в,1989). 5-образные кривые с наличием промежуточного плато были получены также для ФРК из листьев бобов (Хасанов,Иванищев,До-ман,1986). Разная форма кривых обусловлена том, что авторы-изучали зависимость активности ФРК от концентрации Рв5-1> при высокой концентрации белка-фермента - I мкг белка-фермента на мл реакционной среды. Наши эксперименты проводились при низких концентрациях белка-фермента - 0,2 мкг на Ш1 реакционной среды. Согласно модели диссоциирующего регу-ляторного фермента по Курганову (1978), форма кривых зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата зависит от концентрации ферментного белка. Поэтому можно считать, что полученные нами и другим авторами результаты указывают на соответствие ферментов РФИ, ФРК и РЕФКО модели медленно'диссоциирующего аллостерического

форманта до Курганову.

Для мультиферментных комплексов (коныогатов) характерно наличие координированных регуляторных эффектов. Одним из проявлений этих эффектов является повышение субстратом первого фермента комплекса(коньюгата) величины К,, максимальной скорости Утахпоследунцзх реакций и снижение величины Кц для соответствующих субстратов ферментов, катализирующих последующие стадии метаболического цути.

Из представленных на рис.4 и 5 данных видно, что скорость фосфорибулокиназной реакции, катализируемой фермент-ннш препаратами РФИ, ФРК и РБФКО,действительно значительно выше при использовании в качества субстрата Р-5-Ф, а не Ри5-ф. Следовательно, полученные наш результаты свидетельствуют о том, что в данном случае Ри5Ф является промежуточным субстратом комплекса (коньюгата) ферментов, катализирующих последовательные реакции метаболического пути. Р-5-Ф повышает скорость фосфорибулокиназной реакции, являющейся второй после рибозофосфатизомеразной в данной мебаболачеспой цепи. Приведенные в таблице 3 величины Гз^ ^ указывают на большее сродство ферментных препаратов ФРК и РБФКО к Р-5-Ф, субстрату первой реакции метаболической последовательности:

Р-5-Ф-,-Ри5-Ф Ар .-.РБФ 3-ФГК,

Таблица 3

Величина [й^ 5 ддя РФИ, ФРК и РБФКО из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, проявляющих фо сфера булоки-г. газные активности

Ферментный препарат ; Субстрат ; ^0,5 , ю-4

РФИ Р-5-Ф 2,66 4 0,03

Ри5-Ф 3,03 + 0,04 .

ФРК Р-5-Ф 2,17 + 0,02

Ри5-Ф 3,04 + 0,04

РБФКО Р-5-Ф 2,16 + 0,02

Ри5-Ф 3,34 + 0,05

Зависимость от концентрации субстрата карбоксилазноА ак холоста <ретыентных пьопаратов РФИ, ФРК и РЕ'КО

Кинетическое поведение диссоциирующих аллостерических ферментов зависит от концентрации фермента (Курганов,1978). Поэтому нами было исследовано при фиксированных концентрациях субстрата влияние различных количеств белка-фермента в реакционной среде на карбоксилазную активность ферментных препаратов РФИ, ФРК и РЕФКО из листьев хлопчатника сорта 108-Ф. В таблице 4 приведены данные о зависимости от концентрации белка-фермента удельной карбоксилазной активности ферментных препаратов РФ Л, ФРК и РБГКО при г ^пользовании в качестве субстрата.Р-5-Ф (2 м'Л на мл реакционной иреды).

Таблица 4

Зависимость от концентрации белка-фермента удельной карбоксилазной активности ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБЖ0«из листьев хлопчатника сорта 1С8-Ф

Белок-фермент,! УА, мкмоль COg/MHH на мг белка

; РФИ ! ФРК ! РЕЖО

0,01 2,50 . 3,50 4,40

0,025 0,72 1,34 1,60

0,05 0,63 0,68 0,80

од 0,32 0,33 0,43

0,15 0,31 0,22 0,26

Как видно из прздставлонных в таблице 4 данных, зависимость от концентрации белка-фермента удельной карбоксилазной активности ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО не является линейной. Наибольшая карбоксилазная активность всох ферментных препаратов проявляется при содержании в ре-акцпошгой среде 0,01 мг белка-фермента. При этой оптимальной концентрации белка-фермента карбоксилазная активность ферментного препарата РБФКО на 25% превышает карбоксилазную активность ферментного препарата ФРК и на 7G% - ферментного препарата РУЛ.

Влияние концентрации субстрата на карбоксилазную активность ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО было изучено наг.ш при содержании d реакционной среде 0,05 мг белка-фермента.

Из представле;шых на р:'с.6 результатов видно, что при

Рис.6. Влияние различных концентраций Р-5-Ф на проявление РБФкарбоксилазной активности ферментными препаратами ВФИ (а) и ФРК (б) из листьев хлопчатника сорта 108-Ф.

2 3

субстрата

Рис.7. Влияние концентраций субстрата Р-5~Ф(а) или РБФ(б) на карбоксилазную активность ферментного препарата РБФКО рз листьев хлопчатника сорта 108-Ф.

низких концентрациях Р-5-Ф разлитая мезду ферментными препаратами РФИ и ФРК при проявлении ими карооксилазной активности незначительны. С возрастанием концентрации Р-5-Ф возрастают и различия между ферментный] препаратами РФИ и ФРК при проявлении ими карбоксилазной активности. Наибольшая карбоксилазная активность ферментных препаратов РФИ и ФРК проявляется при содержании в реакционной среде 2 пМ Р-5-Ф. При этой оптимальной концентрации Р-5-Ф карбоксилазная активность ферментного препарата ФРК на 13% прэвыаает карбок-силазную активность ферментного препарата РФИ.

Из приведенных на; рис.7 данных видно, что карбоксилазная активность РБФКО при использовании в качестве субстрата Р-5Ф на 30% вше, чем в присутствии собственного субстрата - РБФ. Дашше о зависимости карбоксилазной активности ферментных препаратов РФИ, ФРК и РБФКО были использованы при расчете величин ^ ^ для Р-5-Ф и РБФ. Величины ^ ^(мМ) для РФИ, ФРК и РБ5К0 приведены в таблице 5.

Таблица 5

Величины [в]д д(мМ) при проявлении карбоксилазной активности препаратами РФИ, ФРК и РБФКО из листьев

хлопчатника сорта 108-Ф

Ферментный препарат ; 1 Субстрат 1 ^0.5 • И"4

Р2И Р-5-Ф 0,76 ± 0,03

ФРК Р-5-Ф 0,62 + 0,03

РБФКО Р-5-Ф 0,54+0,02

РБФ 0,66 + 0,02

Как видно из приведенных в таблице 5 величин 5, при проявлении карбоксилазной активности РБФКО значительно превосходит РФИ и ФРК по сродству к Р-5-Ф: ФРК - на 14%, РФЛ -на 40$. Сродство РБФКО к РБФ на 22^ ниже, чем к Р-5-Ф.

Таким,образом, с узэлич-яием молекулярной массы фермент тных препаратов наблюдается возрастание их карбоксилазной активности и сродства к Р-5-Ф - субстрату первой реакции последовательно действующих ферментов цикла Кальвина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные'наш исследования показали, что отдельные

субъедикицы РФИ о молекулярной массой 26+1 кДа проявляют только одну рибозофосфатизоморазную активность, нативная же форма фермента - три ферментативные активности:рабозофос-фатизомеразную, фосфорибулокиназную и рибулозобисфосфаткар-боксилазную.

Проявление субъединидей с молекуяярпой массой 26 кДа рибозофосфатизомеразной активности и регуляторных свойств (Бакаева,Бабадканова,1988) дает основание считать, что субъединица представляет собой двухдоменный мономерный фермент РФИ, имеющий один активный и один аллостерический центр.

При объединении двух мономерных фермантов,по-видимому, через дисульфидную связь (Иванищев,1982) в димернуш форму в результате специфических белок-белковых взаимодействий в области контактов соседних доменов формируются новыа активные и аллостеряческие центры. Таким образом, монофункциональный фермент превращается в мультидоменяый полифункциональный фермент с тремя ферментативными активностями. Катализ данным полифункциональным ферментом последовательных реакций цикла Кальвина: РБФ \°2.. 3-ФГК,

дает основание считать, что происходит туннелирование Р-5-Ф по конвейеру активных центров без'выделения интермедаатов в окружающую среду. Ванным следствием такой структурной организации становится приобретение поллфункциовальным ферментом способности воспринимать весьма тонкие регуляторныо сигналы, отвечая координированным изменением разных активностей. Действительно, результаты кинетических исследований свидетельствуют о том, что этот полифункциокальный формант относится к гйстерезисншл регуляторным ферментам, характеризующимся сложными гомо-и гетаротрогшыми взаимодействиями активных и аллостерлче'ских центров.

Нами обнаружено, что электрофоретически гомогеннна ферментные препараты ФРК и РЕФКО обладают а другими ферментативными актагпостями. ФРК с молекулярной массой 240+ЮкДа и ее субъедикицы с молекулярной массой 60+2кДа проявляют 3 ферментативные активности:рибозофосфатизо/.еразную, фосфори-було<иназн>ю и рабулозобисфосфаткарбодсалазну». РБ5К0 с молекулярной массой 520+30кДа проявляет шесть ферментативных

активностей: рабозайосбатизомеразнуто, фссф'орнбулокяназную, рибулозобисфосфаткарбоксилазную, глзцератьдог1дфосфатдбгад-роганазну», фосфоглицераткпназнуз и фруктозобиососМтэзнуго. У субъединиц РЕйУО с молекулярной массой 52+2 кДа определены три. ферментативные активности: рибозсфосфатизсглэразяая, фосфорибулокиназкая и рибулозобасфосфаткарбоксилазная.

Результаты кинетических исследований каедой фермента-'тивной активности, прояз тяемой ферментнк?.*и пропаратака Рй1, ФЕК и РБФНО. указывают ка соответствие кинетического поведения ферментов модели мадленно.дассоцзгрующего аллоотерд-ческого фермента по Курганову. Это дает основание считать, что ОРК и РБФКО являотся мультиферментннми кодялексами-ас-соцватамз. У Р5Л, ФРК и РБФКС обнаружены ..„/нкционгльныэ свойства, характерные для мультаферментных кс.\шлексоЕ-''иб-легченный каталпз"и координированы:'е регуляторные эффекты. "Облегченный каталяч" проявляется в том, что скорость фсс-форибулокиназной и рибулог;обпсфосфаткарбо::салазно2 реакций вьше при использовании в качестве субстратовР-5-Ф, а не собственных субстратов - Ри5-Ф и РБЗ. Проявлением координированных регуляторных эффектов является повышение рибозс-5-фссфатсм - субстратом первого фермента комллексаСконьюгатз) величины максимальной скорости последующих реакций а снижение величины К, для субстратов второй я третьей реакций данной метаболической цепи.

Выделение из листьев хлопчатника различна;: форм РБЖО - 160,400,480 и 520 кДа, проявление которых обусловлено (физиологическим состоянием растекич, т.е. зависит от фаза развития растений и условий их выращивания (БабадааноБа, Мирзорахимоз,Бакаева,Лебедева,1993), позволило к?м сделать заключение об образовании в хлоропласта* динамичаских муль-тиферментннх ко:.шле::сов-ассоцнатов.

На протяжении двух последних десяталатзЗ появились сообщения о существовании мэмбраносвчзаннол РЬФКО (Русакова, Ле Тхи Лань Сань ,Домэн, 1081 ;Шсг^ева,'1архалт,Лл^аз,1%7). Предполагается, что связи РБФКО с менбрааачз сяг^к и могут возникать и распадаться в зависимости от фкзпслоглчаслсгэ состояния растений и условий среды (Романова,1551;.

Совокупность полученных нами результатов исследований и анализ имеющихся в литературе данных по этой проблеме дает основание предложить следующую схему формирования надмолекулярной организации ферментов цикла КальЕКна в хлороплас-тах высших растений (рис.8).

Существование ферментов цикла Кальвина в разных формах обеспечивает реализацию регуляторных механизмов различных уровней, Свободные ферменты участвуют в поддержании клеточного гомеостаза с помощью механизмов изостерической в алло-стеряческой регуляции. Эти механизмы регуляции реализуются с участием субстратов и других клеточных .метаболитов, обеспечивая саморегуляцию метаболических путей. Мультифермент-нке ксмплексы-ассоциаты функционируют как единые кооперативно действующие системы, обеспечивая слежение за сигналами, поступающими от более в. ких уровней контроля метаболизма. Роль сигналов выполнит Еторые посредники,например, гормоны.

При встраивании глультиферментных комплексов в мембраны возникает новый вид регуляции по типу включение-выключение или переключение системы на новый режим функционирования в соответствии с ^оебованиями внешней среды. Метаболоны являются динамическими структурами и положение равновесия между свободными ферментами, мультиферментныш комплексами и ме-таболоном зависит от функционального состояния клетки (Курганов, Любарев,1991} .

вывода

1. Установлено, что отдельные суб:-диницы РФИ с молекулярной массой 26+1 кДа обладают только одной рибозофос-фатизокеразной активностью. Нативная же форма фермента с молекулярной массой 52+2 кДа проявляет три ферментативные активности : рибозофосфатизоиеразную, фосфорибулоккна зную и рибулозоблсфосфаткарбоксилазную. Результаты кинетических исследований каждой ферментативной активности свидетельствуют о том, что этот полифункцповальный фермент относится к гастерезпсным регуляторным ферментам, характеризующимся сложными гомо-и гетеротропнами взаимодействиями активных и ьллостерических центров.

2. Обнаружено,что электрофсретически гомогенн:•<■ фер-

Фэрмент РФИ

uni

_дц Мулътадоменшй

полчфункциональнкй АлЦ фермент

•11 11 i?____

v¡

520_____4ё0 <___1 ■;."*''СО

/ \\ Мультяфермэнтнке

комплоксы-ассоциатк

180«----240

Мультиферментные комплэксы-асооциаты

ч МЕМБРАНА

МЕТАБОЛОЙ

Ряс.8 . Формирование надмолекулярной организации ферментов цикле. Кельвина в хлоропласта? выспгах растении.

менткые препараты ФРК и РБФКО обладают и другими фермента-тавнкма активностями :<1РК с глолокулярной" массой 240+10 кДа и ее субъедчплщ: с молекулярной масоой 60+2 лДа проявляют три ферментативные активности:рибозофосфатизомеразкую, фосфори-булоганазнуэ л рибулозобисфосфаткарбоксилазкую. РБФКО с молекулярной массой 5£0+30кДа проявляет шесть ферментативных актавностэй:ргбозофссфатазок„-разную, фосфорибулокиназную, рл булозоб:; сфосфаткарбоксилазную,глгцеральдегидфосфатдегид-рогепазпую, фосфоглидераткиназну» и фруктозобдсфосфатазную. У субъединац РБФКО с молекулярной массой 52+2 кДа определены три ферментативные активности;рзбозофосфатвзодаразная, фоофорибулокиназкая и рибулозобисфосфаткарбоксилазная.

3. Установлено, ч.о РФЛ, ФРК и РБФКО обладают функциональными свойствам, характерными для мультзферментных комплексов- "облегченным г лззсгм" и координированными регу-ляторными эффектами.

Кинетическое поведение ферментов РФИ, ФРК и РБФКО соответствует "модели :.:«дленно диссоциирующего аллостеричес-кого фермента по Курганову.Это дает основание считать, что ФРК и РБФКО являются мультиферментнкди кошлексаив-асесонатами . " ■*

5. На основании результатов экспериментальных исследований и анализа имеющихся в литературе данных предложена схема формирования надмолекулярной организации ферментов цикла Кальвина в хлоропластах высших растений.

Материалы диссертации излокены в следующих публикациях:

1. Бабадаанова Ы.А-, Еакаэва Н.П., Лебедева Г.П., Ба-бадасанова М.П., Мирзорахимов А.К. Проявление рибулозобис-фосфаткарбокснлазой-оксагеназой других ферментативных активностей Ц АлрельОкая научно-теоретическая конференция профессорско-преподавательского состава Таджикского госуниверситета: Тез:докл - Душанбе, 1993. - С.73

2. Бабадканова М.П., Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.П. Изучение активности РФИ, ФГК и РБФКО хлопчатника при различных условиях хранения препаратов // Апрельская научно-теоретическая конференция профессорско-преподавательского

состава Таджикского госуниверситета: Тез.докл. - Дуаакбэ, 1994. - С.76.

3.. Бабадаанова М.А., !&<5рдвва Г.П., Мирзорахимов А.К., Бабадаанова М.П.„ Бакаева Н.11. Функциональный мультифермэн-тный комплекс цикла Ка льва на // Первая научная конференция Биохимического общества Республики Таджикистан "Проблемы биохимия"; Тез докл. - Душанбе, 1993. - С.II.

4. Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.Н., Бабадаанова М.П. Исследование условий для проявления высокой активности ферментов РФИ, ФРК а РБФК хлопчатника сорта 108-Ф // Апрельская научно-теоретическая конференция профессорско-преподавательского состава Таджикского госуниверситета: Тез. докл. - Душанбе, 1994. - С.77.

5. Бакаева Н.П., БабаДжанова М.П., Мирзорахимов А.К. Определение ионизирующихся групп активных центров фосфори-булокиназы и рибулозобисфосфаткарбоксилаэн хлопчатника // Апрельская научно-теоретическая конференция профессорско-преподавательского состава Таджикского госуниверситета: Тез.докл. - Душанбе, 1994. - С.74.

4Л-1996 г. ТГУ. Зак. 2. Тар. 1С0.