Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферментные системы обмена глутаминовой и яблочной кислот сухих семян пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маликов, Вячеслав Филиппович, Москва

Российская Академия Наук Институт биохимии им. А. Н. Баха

л ~ 3 Я На правах рукописи

УДК 577.152.1

МАЛИКОВ Вячеслав Филиппович

Ферментные системы обмена глутаминовой и яблочной кислот сухих семян пшеницы.

03.00.04 - биохимия

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биол. наук, профессор Шатилов В.Р , старший научный сотрудник, канд. биол. наук Сергеев Н.С.

Москва 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

введение 4

обзор литературы 8

1. ОБРАЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТАМИ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР:

ИХ ТИПЫ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ 8

1.1. Классификация известных ферментных систем 8

1.2. Механизмы действия 13

1.3. Кинетические эффекты 18

1.4. Концепция метаболона 2.0

2. ОБЗОР МЕТОДОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ДОКАЗАТЕЛЬСТВА ФИЗИЧЕСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ И

КОМПАРТМЕНТАДИИ МЕТАБОЛИТОВ 24

2.1. Методы, не нарушающие интактности клетки 26

2.2. Использование обычных хроматографических методов для

выделения комплексов ферментов 29

2.3. Методы, демонстрирующие физическое взаимодействие ферментов in vitro ;0

2.4. Методы анализа кинетики взаимодействующих ферментов .'3

экспериментальная часть 39

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ . 9

Материалы 9

Методы 40

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48

1. Пути сопряжения азотного и углеродного метаболизма на ранних стадиях прорастания семян злаковых 49

2. Характеристика изоферментного состава МДГ и ААТ покоящихся семян пшеницы г* 5

3. Выделение и очистка биферментных комплексов МДГ - ААТ.

Их стабильность in vitro при различных условиях ( 0

4. Изучение состава комплексов. (>6

5. Молекулярные массы комплексов и образующих их изоферментов ( 7

6. Кинетические эффекты комплексов "0

7. Доказательства, свидетельствующие о существовании комплексов МДГ-ААТ в семенах других злаковых "3

выводы 77

литература 78

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ААТ - аспартатаминотрансфераза (КФ 2.6.1.1)

МДГ - малатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.37)

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37, МДГ) и аспартатаминотрансферазы (КФ 2.6.1.1, ААТ) функционируют как малат-аспартатный шунт, исключительно важную роль эти ферменты играют у растений с С4 фотосинтезом (Гудвин Т., 1986). Общую последовательность реакций, которую катализируют эти ферменты, можно представить следующей схемой:

Очевидно, что для эффективного функционирования этой системы необходимо поддержание относительно высокой внутриклеточной концентрации оксалоацетата. Однако in vixo оксалоацетат легко превращается либо в малат (Palmer J.M., 1984), либо в фосфоенолпируват (Davies D.D., 1979), либо в ЦТК и т.н. Более того, достоверно установлено, что его внутриклеточная концентрация поддерживается на низком уровне (Naik M.S., 1986).

По-видимому, в клетке может осуществляться другой принцип сопряжения работы МДГ и ААТ - через взаимодействие молекул этих ферментов с образование канала между их активными центрам к. Такой физический контакт способен предотвратить выход оксалоацетата в окружающий систему раствор. Вследствии этого его концентрация внутри системы (а точнее в микрокомпартмент е системы), будет достаточно высокой для ее эффективного функционирования.

Ь-Аспарта^-- Оксалоацет?^-Малат

ОС-Кетоглутарат L-Глутамат НАДН НАД+

Экспериментальные попытки доказательства существования физического взаимодействия между МДГ и ААТ, а также демонстрации туннелирования оксалоацетата между этими ферментами предпринимались неоднократно. Краткая характеристика этих исследований приведена ниже.

БазеНа Р. и др. обнаружили комиграцию в крахмальных гелях зон активностей ААТ и МДГ семян хлопчатника ((Уош/ш/и ЫгъиШт I ) после частичной очистки (в 2730 раз). В препаратах, содержащих 8 белковых полос, авторы детектировали ААТ по окислению НАДИ посредством ее сопряжения с МДГ. Проявление трех центров окисления НАДН в геле зависело не только от субстратов ААТ и добавления экзогенной МДГ, но могло происходить и в присутствии НАДН и оксалоацетата (БаБеЛа Р., 1966).

Мипкгез К.Б. выделили МДГ из МеигоБрога зр. и охарактеризовал

этот фермент как тетрамер со структурой аософ. Оказалось, что он

имел две активности - ААТ и МДГ, которые были ассоциированы с а

и Р субъединицами соответственно (МипкгеБ К.Б., 1965). Дальнейшее исследование показало, что этот тетрамер был способен образовывать малат из аспартата, 2-оксоглутарата и НАДН без обмена оксалоацетата с реакционной смесью (Вепуеш^е К., 1970).

Вгусе С. и др. изучал кинетику и туннелирование оксалоацетата в последовательности реакций ААТ и МДГ из сердца свиньи (Вгусе С.Б., 1976). Данные этого исследования, свидетельствующие о переносе оксалоацетата с активного центра ААТ на активный центр МДГ без высвобождения в окружающий раствор, в последующем были поставлены под сомнение (Мап1еу Е.Я., 1980).

Васкшап Ь. и др. показали, что у митохондриальных и цитозольных изоферментов ААТ и МДГ из сердца свиньи профили активностей при проведении противоточного распределения в

двухфазной водной системе декстран-триметиламинополиэтилен-гликоль совпадали только в том случае, если их элюировали парами одинаковой внутриклеточной локализации (Backman L., 1976).

Beekmans S. и др. обнаружили, что колонка с сефарозой, на которой была предварительно иммобилизована МДГ из сердца свиньи, при низкой ионной силе буфера (1 мМ) способна задерживать ААТ из разных источников животного происхождения. Однако больший коэффициент связывания для ААТ был получен в случае, если ока была из того же источника и той же внутриклеточной локализации, что и МДГ (Beekmans S., 1981).

Fahien L.A. и др. наблюдали образование комплекса ААТ с 2-оксоглутаратдегидрогеназным комплексом и МДГ при преципитации этих ферментов полиэтиленгликолем (Fahien L.A., 1988).

С нашей точки зрения особого внимания заслуживают случаи выделения и очистки комплексов МДГ и ААТ в условиях, в которых не происходит их разрушения. Они могли бы стать хорошей модельной системой для исследования общих закономерностей сборки структуры комплексов, а также особенностей их организации взависимости от выполняемой функции и т.п. В этой связи особенно интересным было бы сравнение третичных структур комплексов ААТ и МДГ (или других ферментов), локализованных из тканей с разными типами метаболизма.

Кроме этого, выделение и исследование свойств комплексов могло бы способствовать установлению направленности метаболических потоков в клетках организма, например, на разных стадиях его развития.

Поэтому основной целью настоящей работы стало: - выделение и очистка бинарных комплексов МДГ-ААТ из сухих семян пшеницы сорта Саратовская 29 R2;

- изучение изоферментного состава и некоторых свойст в образующих их ферментов;

изучение изменения активностей ферментов обмена глутаминовой, яблочной кислот и глутамина на фоне изменения содержания свободных аминокислот на ранних стадиях прорастания семян злаковых.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОБРАЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТАМИ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР: ИХ ТИПЫ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ

Рассмотрение проблемы в виде обобщения доступного экспериментального материала было сделано в ряде интересны х обзоров (Srere Р.А., 1987; Kirschner К., 1976; Hrazdina G., 1992). Значение объединения ферментов в комплексы in vitro давно переросло в понимание этого явления как одной из важных проблем биохимической организации метаболизма (Курганов Б. И., 1991; Любарев А.Е., 1994).

Данный обзор не претендует на исчерпывающее описание достижений в этой области, что может быть найдено в известной монографии (Фридрих П., 1986). Его целью является изложение состояния проблемы в рамках, необходимых при работе с комплексами ферментов.

1.1. Классификация известных ферментных систем

терминология

Взгляд на проблему биохимической организации метаболизма in vivo как на систему реально существующих упорядоченных взаимосвязей между отдельными ферментами продолжительное время не находил должного понимания. Наиболее достоверные экспериментальные сведения, как правило, получали только о стабильных объединениях ферментов, а случаи идентификации слабо взаимодействующих ферментов (редко болше двух сразу) не всегда

строились на основе строгой доказательной базы, что было обусловлено известными трудностями при работе с такими структурами (Batke J., 1991).

В этих условиях четкая классификация мультиферментны х образований долгое время оставалась без внимания. Количество их названий, которое можно найти в литературе, нельзя назвать небольшим. При этом была неизбежна неопределенность в вопросах их выбора и дублирование одних и тех же феноменов разными названиями. Однако, при этом основным отличительным признаком структур взаимодействующих ферментов была устойчивое! ь взаимодействия in vitro.

Для обозначения взаимодействия ферментов центральным стало понятие о мультиферментном комплексе. Srere Р. определил эту структуру как "функциональный комплекс, в котором отдельные полипептидные цепи остаются тесно связанными при использовании обычных процедур выделения" (Srere Р., 1987). К другим определениям, которые обозначают то же самое, он отнес "белковые машины, кластеры, надмолекулярные комплексы, аггрегаты и метаболоны". Отдельно были выделены только

мультифункциональные белки - "белки, которые содержат два или более каталитических центра на одной полипептидной цепи."

Однако Фридрих П. при определении мультиферментного комплекса указывал на то, что "эти структуры состоят из двух или более ферментов с различными каталитическими активностями, объединенных посредством нековалентных взаимодействий" (Фридрих П., 1986). По-видимому, это определение более точно отражает понятие мультиферментного комплекса с позиции характера связей между образующими его ферментами. Другой принципиальной особенностью этой структуры является функциональное! ь

взаимодействия ферментов т.е. изменение кинетических параметров системы по сравнению со свободными ферментами, наличие специфических регуляторных эффектов и т.п.

Структуры, состоящие из двух или более ферментов, объединенных с помощью ковалентных взаимодействий относят к мультиферментным конъюгатам (Фридрих П., 1986). При этом если они состоят из одной полипептидной цепи, то становятся аналогичными мультифункциональным ферментам.

Ферментные ансамбли - объединения ферментов, поддерживаемые за счет какой-либо опоры. Среди них различают адсорбционные ансамбли, если их ферменты присоединены к поверхности мембраны или другой макромолекулы, и интегральные ансамбли, включающиеся в липидный бислой мембраны (Фридрих п , 1986).

Термин "аггрегаты" обычно применяют по отношению к неспецифически ассоциировавшим белкам. Такие образования не несут никакой функциональной нагрузки в клетке и являются артефактами, образующимися в результате перемешивания клеточного содержимого при ее разрушении. При этом образующие их белки могут демонстрировать друг к другу сродство, сравнимое по силе со сродством ферментов при образовании мультиферментных комплексов (BatkeJ., 1991).

типы мультиферментных комплексов

Давно известны стабильные ("static") мультиферментны е комплексы (Ovadi J., 1991). Как следует из названия, in vitro они достаточно трудно распадаются на составляющие их ферменты. Поэтому их высокоочищенные препараты успешно получают

обычными методами колоночной хроматографии. Связи между ферментами в таких комплексах по устойчивости сравнимы с мультифункциональными белками. Для их разрушения необходимо применение жестких условий: хроматографирование в буферах с кислым значением pH, присутствие сильных детергентов, высоких концентраций мочевины или гуанидинхлорида. Иногда для полного разрушения комплекса требуется суммарное воздействие перечисленных условий, а применение одного из них приводит к диссоциации только отдельных ферментов.

Например, хорошо изучены следующие стабильные мультиферментные комплексы, а также охарактеризованы составляющие их ферменты: пируватдегидрогеназный и 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплексы из Е. coli (Reed L.J. et al , 1966; 1969), триптофансинтаза из Neurospora crassa (Matchett W.H , 1974; 1975).

Существуют многочисленные примеры демонстраци и ассоциации in vitro двух или, реже, трех очищенных ферментов, катализирующих последовательные метаболические реакции и, как правило, имеющих общую внутриклеточную локализацию. Для этого применяют специальные методики, которые, как полагают, больше соответствуют внутриклеточным условиям. К ним относят, прежде всего, высокую концентрацию белка (45-50%) (Srere P.A., 1981), присутствие специфических веществ, благоприятствующих сохранению слабых взаимодействий между ферментами (Srere Р.А , 1990), в том числе субстратов и продуктов реакций, катализируемых соответствующими ферментами и др. Образующиеся при этом комплексы крайне нестабильны в обычных буферных растворах, иногда даже при условиях, близких к физиологическим (pH 7,4; 150 мМ NaCl) (Beeckmans S., 1981). Кроме того, специфичность

такого взаимодействия, а также функциональная активность получаемых комплексов требуют дополнительного доказательства. Такие комплексы относят к группе диссоциирующих ("dinamic) мультиферментных комплексов (Ovadi J., 1991).

Обычно их также делят на две группы, принимая во внимание эффективность переноса интермедиата между активными центрами и, как причину этого, устойчивость связей между составляющими их ферментами.

"Жесткие" (tight) мультиферментные комплексы настолько устойчивы, что их все-таки удается иногда получить в высокоочищенном или даже гомогенном состоянии с помощью обычных хроматографических методов (Batke J., 1991). Однако количество примеров такого рода мало.

Достоверно известно о получении гомогенного препарата и кристаллов для мультиферментного комплекса, включающего ферменты фазы карбоксилирования цикла Кальвина рибулозобисфосфат карбоксилазу, рибозо-5-фосфат изомеразу и фосфорибулокиназу. Об установлении особенностей третичной структуры этого комплекса пока ничего не сообщается (Gontero В , 1988).

В "рыхлых" (loose) мультиферментных комплексах (Batke J , 1991) устойчивость связей между ферментами такова, что время их жизни сопоставимо или меньше продолжительности каталитической реакции, которую они осуществляют. Соответственно, эта реакция будет отличаться меньшей эффективностью, так как часть промежуточного продукта не сможет связаться со вторым ферментом и будет освобождаться в окружающий раствор (Weber J.Р., 1982; Srivastava D.K., 1987). Выделение таких комплексов in vitro практически невозможно. По-видимому, они насколько неустойчивы,

что способны легко диссоциировать на составляющие их ферменты и в клетке.

Таким образом, разделение мультиферментных комплексов на стабильные и диссоциирующие отражает только их различия в устойчивости in vitro. Это предопределяет технику их получения и способы доказательства взаимодействия между составляющими их ферментами.

По-видимому, они выполняют различные функции и в клетке,. Если эффективность работы комплекса регулируется по типу ассоциации-диссоциации, то его чувствительность к внутриклеточным сигналам у диссоциирующих комплексов должна быть выше, чем у стабильных (Рязанов А.Г., 1989).

1.2. Механизмы действия

Известно, что в основе механизмов функционирования всех типов мультиферментных комплексов, а также мультифункциональных конъюгатов заложен один принцип. Он определен как эффект микрокомпартментации (Ovadi J., 1991). В основе лежит представление об особом взаимном расположении активных центров ферментов, составляющих комплекс. При этом создаются условия для переноса промежуточного продукта (интермедиат или промежуточный метаболит) с одного активного центра системы на другой без уравновешивания с окружающим раствором.

Существует несколько конкретных механизмов реализации этого принципа. Интермедиат может быть ковалентно прикреплен к специальной группе комплекса, например, посредством образования с ней -S-S- связей. Эта группа должна иметь доступ ко всем активным центрам составляющих его ферментов. При катализе происходит последовательное перемещение промежуточного продукта между

активными центрами без его освобождения в окружающий раствор, а связывающая его группа выполняет роль "поворотной стрелы" (Perham R.N., 1981). Если комплекс образован двумя ферментами, то схематически этот механизм можно передать следующим образом (OvadiJ., 1991):

S + Е2Е2 S ЕхЕ2 = EjX Е2 = Е^Р = EjE2 + Р

»

где Е, и Е2 - это образующие комплекс ферменты;

EjE2 - образуемая ими мультиферментная система;

S, X и Р - субстрат, продукт первого фермента и продукт второго

фермента и одновременно всей системы соответственно.

Таким образом, этот механизм предполагает наличие достаточно прочного взаимодействия между ферментами, которое характерно для стабильных комплексов и конъюгатов. Дополнительно стоит отметит]., что его действие пока обнаружено только в случаях, когда комплекс образуют больше, чем два фермента. Например, по такому п