Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индуцибельность ключевых ферментов метаболизма С4-кислот и их роль в фотосинтезе при водном дефиците

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Индуцибельность ключевых ферментов метаболизма С4-кислот и их роль в фотосинтезе при водном дефиците"

гго од $1/

'.} АКАДЕМИЯ наук украины

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

ШНЕКОВ Ахмед Кадималиевяч

ВДУЩЖМЬНОСТЬ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА С4-КЖЛ0Т И ИХ РСЙЬ В ФОТОСИНТЕЗЕ ПРИ ВОДНОМ ДЕФИЦИТЕ

/03.00.12 - физиология растений/

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Киев - 1993

Диссертация является рукописью.

Работа выполнена в лаборатории фотосинтеза Биологического НИИ Ленинградского государственного университета, на кафедре ботаники и физиологии растений Новгородского сельскохозяйственного института, отделе физиологии водного режима растен* Института физиологии растений и генетики АН Украины.

Научный консультант: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук,профессо;Е ШМАТЬКО Иван Григорьевич

доктор химических наук, член-корреспондент АН Украины ЯСНИКОВ Александр Алексеевич

доктор биологических наук,профессо{ ЖОЛКЕВИЧ Владимир Николаевич

доктор биологических наук,старший научный сотрудник СИЛАЕВА Алла Михайловна

Всероссийский научно-исследовательский, институт растениеводства им. Н.И.Вавилова, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится: "20 " января 1994 на заседании специализированного ученого совета Д 016.57.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растений и генетики АН Украины по адресу. 252022, Киев-22, ул.Васильковская, 31/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте физиологии растений и генетики АН Украины.

Автореферат разослан "18 "декабря 1993г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета

ТРУХАНОВ В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование механизмов и путей регу-яции фотосинтетической ассимиляции COg - одно из актуальных нап-авлений современной фитофизиологии. Оно представляет интерес в лане разработки принципов управления процессом фотосинтеза и полу-ения растений с высокоактивным фотосинтезом, способных создавать аиболее совершенные системы высокой продуктивности в условиях гло-ального потепления и аридизации климата.

В настоящее время высшие растения в соответствии с особенности механизма фотосинтетической ассимиляции COg условно разделятся на три группы.

К первой группе относятся С^-растения, продуцирующие трифос-эглицериновую кислоту (3-ФГК) в качестве первичного стабильного родукта фиксаций СО, на рибулозо-1,5-бисфосфате (РБ$) при помощи 5$- карбоксигеназы (РБ<$К/0); основу фотосинтетического метаболиз-1 углерода у данной группы, как у всех без исключения растений, зставляет общепризнанный цикл Кальвина (Calvin,Benson, 1948). эи этом функционирует и вторая карбоксилирувцая система с учас->ем фосфоенолпируваткарбоксилаза ($ЕПК) (Banduraky, 1955). По это-1 каналу восстанавливается около 20% от общей фиксированной угле-клоты с образованием органических кислот и аминокислот ( Bassam, 1964).

Во вторув группу вклвчены С^-растения, у которых С^-кислоты цавелевоуксусная, яблочная и аспарагиновая) являются первичными эодуктами фиксации COj на фосфоенолпнрувате (ФЕП) при участии 5ПК (Тарчевский, Карпнлов, I963;Kortschak et al., 1965;Hatch . lack, 1966; Магомедов, 1974). Эти кислоты выполняет роль источ-!ков СО2 для функционирования цикла Кальвина. В литературе гть углерода в фотосинтезе рассматривается как новая "надстрой-Iя к циклу Кальвина, возникшая в ходе адаптациогенеза растений >я дефиците COg, воды в сочетании с повышенной температурой (Жу-!Нко, 1988).

В трэт.ей группе объединены растения, с,так называемым, об->нои кисло* по типу толстянковых (САМ), фотосинтез которых имеет [д обцих черт как с Cj-, уак я С^-растеииям* (ïlng et al., 1972; jyae, 1976;Osmond , 1978). У представителей данной группы расте-(й, помимо атмосферной СС^, источником углерода для фотосинтеза 1ухит яблочная кислота, образовавшаяся при гетеротрофной фикса-га С02. -

- k -

До недавнего времени С^-путь углерода (С^-фотосинтез) исследовался как механизм концентрирования COg в центрах карбок-силирования РБ# при посредстве РБФК/0. Более того, как свидетельствуют многочисленные данные литературы, С^-растения характеризуются устойчивостью к засухе, повышенной температуре и засоление. В то же самое время специфические и неспецифические ai пекты сопряженной устойчивости С^-растений к различным условия) среды освещены в литературе далеко неполно. Поэтому необходимо изучение связи между функционированием (^-фотосинтеза и устойчивостью С^-растений к различным экстремальным факторам внешне! среды. С другой стороны, поскольку оптимальные условия функционирования Сц-фотосинтеза у С^-растений являются стрессорами дл) С^-растений, необходимо также выявление возможной общности механизмов адаптации С^- и С^-растений к неблагоприятным фактора! окружающей среды.

Современная теория биохимической адаптации уделяет основш внимание ферментным системам, обеспечивающим жизнь организма в стрессорных условиях (Хочачка, Сомеро, 1988). При этом биологическая роль ряда ферментов метаболизма С^-кислот, синтез котор! предшествует становлению С^-фотосинтеза у С^-растений изучена слабо у и САМ-растений.

К началу наших исследований (1973) было известно, что бол! шинство ферментов метаболизма С^-кислот представлены у Cj~, С^-и САМ-растений, причем в зависимости от типа углеродного метабс лизма активность и кинетическая характеристики их различаются (Hatch et al.,I969; Hatch , Slack, I970;Gra-iiam et el. ,1970;

Ting, Osmond, 1973 а.Ъ.с; Miziorto et al.,I974).

Можно было полагать, что пути регуляции активности ферментов ФЕП-карбоксилазной системы факторами внешней среды в листы С^-растений сильно отличаются от таковых у С^-видов. Представь лось важным выяснить сущность различий ферментов метаболизма Ct кислот у С3- и Cjj-растений при становлении фотосинтетического г парата листа и определить роль их в "фотосинтезе поддержания"Сс растений в условиях водного дефицита.

Основой для выполнения настоящей работы послужили наши да! ные (Юзбеков и др., 1978; 1985) о высокой степени гетерогенности и стойкости к повреждению некоторых ферментов йШ-карбоксилг ной системы у Cj- и С^-растений в различных условиях светового температурного режимов, а также водного дефицита. Можно было oi дать и специфические черты углеродного метаболизма, характерны«

для С^-растениЗ, определяемые экстремальными условиями рос.та и

* развития: использование С^-кислот в качестве источников СО2 для

. цикла.Кальвина, когда одним из факторов, лимитирующих '^отосинте-

• тический газообмен, является' увеличение устьичного сопротивления.

Особый интерес как. для полного понимания фотСсинтеза в целом так и-понимания эволюции углеродного'метаболизма у высших расте-

- ний представляет,исследования некоторых параметров сходства-в ме-■ таболизме С^-кислот у растений с -фотосинтезом -и САМ.

Решение этих .вопросов особенно актуально в связи с проблемами эволюции первичной фиксации-С02 У С^-растений, изучения мета- . болических -путей адаптации растений 'к.-водному дефициту .и поиска ' механизмов концентрирования-СО2 у (¡^-растений. • .

Цель -и основные задачи исследования» Основной цедью работы являлось внявлевие различий в функционировании -ключевых'ферментов метдболи-зма С^-кислот у С^- и С^-растений .при- становлений фото- -синтетического аппарата листа и установление ролитигв ^отосинте--зе С^-растениЯ.в условиях водного дефицита^ когда -одним из факторов, лимитирующих фотосинтетический -газообмен, является увели. 'чение ^с^ьиччого сопротивления.. При этом особое внимание' уделя- . ■лось изучению знзиматических механивмов устойчивости 'фотосинтети-ческогЬ аппарата С^-растений к воздействию различного по времени и силе обезвоживания, а также разработке нетрадиционных методов . оценки"з&сухоустойчивоети рас.тений. . . • '

В^ связи-с составленной целью в задачи исследования входило;

1. Сравнительное изуче'нре. индукции ключевых.ферментов мета-"болигиа С^-кислот и цикла Кальвина в зеленеющих. листьях-С^ и С^-.ра'стений 'в различных условиях" светового и температурного режимов.

2. Определение некоторых параметров сходства и различия в «

- метаболизме' С^-кислот у растений с С^-фотосинтезом и.САМ.-

3.. Исследование! активности и- внутриклеточной; локализации некоторых'ферментов'йП-карбоксилазной системы в листьях Ст-расте-ний. _ ' . . " - • . .

Выявление-тканесгецифич'еской активности ключевых фермен-. тов метаболизма С^-кислот и цикла Кальвина у С^-раствний при вод-» , ном дефиците.' , .

5-, 'Изучение воздействия различного по .времени и яйле обезвоживания нв, фотооинтетический газообмен и состав_продуктов фиксации .^СО'2 листьев С^-растений. . '.

• 6. Установление связи между степенью изменения активности

ферментов §ЕП-карбоксилазной системы и устойчивостью фотосинтетического аппарата листа к водному дефициту, а также разработка на этой основе экспресс-методов оценки засухоустойчивости растений.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Синтез de novo изоэнзимов клвчевых ферментов метаболиз ма Cjj-кислот и цикла Кальвина в листьях С^-растений при становлении фотосинтетического аппарата листа.

2. Сходство и различие в метаболизме С^-кислот у растений с С^-фотосинтезом и САМ.

3. Локализация §ЕПК в цитоплазме клеток мезофилла V CAI'! растений.

Избирательный характер действия водного дефицита на активность некоторых ферментов ®П-карбоксилазной системы и цикла Кальвина в листьях Cg- и С^-растений.

5. йндуцибельность ключевых ферментов метаболизма С^-кислс - один из факторов формирования специализированных механизмов устойчивости фотосинтетического аппарата к водному дефициту.

6. Связь между степенью изменения активности ферментов метаболизма С^-кислот, цикла Кальвина и параметрами водообмена.

7. Схема возможных реакций участия С^-кислот в фотосинтети ческом метаболизме (^-растений в условиях водного дефицита; об-сукдение гипотезы об использовании С^~кислот в качестве источни ков COg для "фотосинтеза поддержания", когда одним из факторов, лимитирующих фотосинтетический газообмен, является увеличение диффузионного сопротивления листа.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное многоплано! исследование активности и индукции ряда ферментов метаболизма С кислот и цикла Кальвина в листьях Cj-, С^— и CAM-растений в pas личных условиях светового и температурного режимов, а такке во/ ного дефицита. Установлено, что принципиальные различия в функционировании ферментов §ЕП-карбоксилазной системы у данных груг растений обусловлены различной ролью их в фотосинтетическом метаболизме. Доказано, что светоактквация ключевых ферментов метг болизма С^-тсислот - ФЕПК и НАДФ - специфичного маликэнзимаОЩЗ -МЭ) в зеленеющих листьях C/j-растений связана с синтезом ферме* tob ае novo, в частности, с появлением дополнительного изоэнзи-ма в электрофоретическом спектре ФЕПК- с относительной электро-форетичоской подвижностью (ОЭП) 0,25 и синтезом основного изо-

фермента НАДФ-МЭ.

Выявлены основные параметры сходства метаболизма С^-кислот у и САМ-растений. Последние выражаются в синтезе яблочной кислоты в листьях С^- и САМ-растений путем прямого ^ -карбокси-лирования $ЕП, локализации §ЕПК в цитоплазме и наличии среди САМ-растений, по аналогии с С^-растениями, третьей, ранее неизвестной, подгруппы с НАД-МЗ декарбоксшшрованием яблочной кислоты.

Установлено, что в листьях и частях колоса ппеници представлен комплекс ферментов метаболизма С^-кислот, включающий ФЕПК, НАД-специфичнуп малатдегидрогеназу (НАД-МДГ), НАДФ-МДГ, НАД41Э, НАД$-ИЭ, аспартатаминотрансферазу (АспАТ) и аланинамино-трансферазу (АлаАТ). Основными ферментами, осуществляющими восстановление оксалоацетата в малат и декарбоксилирование малата, являются соответственно НАД-МДГ и НАД-МЭ. Активность фосфоенол-пируваткарбоксикиназы (ФЕПКК) и оксалоацетатдекарбоксилазы не выявлена.

Показано, что при длительной засухе у С^-растений индуцируется активность ферментов метаболизма С^-кислот. В результате ее среди продуктов фиксации на свету и в' темноте усиливает-

ся образование С2-, С^- и С^-кислот (глицина, аданина, серина, треонина, аспарагиновой и яблочной кислот).

Полученные результаты свидетельствуют о возмозетсм механизме образования аланина на свету в результате метаболизма С^-кис-лот:

Аспартат —— Малат —«- Пируват-.-Алании

Выявлена аналогия начальных этапов хода этих реакций с реакциями в клетках обкладки проводящих пучков аспартатных форм С^--растений и некоторых представителей САМ с НАД-МЭ декарбокешшрованием яблочной кислоты.

Экспериментально установлено, что ферменты §ЕП-карбоксилаз-ной системы (ШК, НАД-МДГ, НАД-МЭ,АспАТ и АлаАТ) являются более стойкими к длительному действию водного дефицита, чем РБФК/О и НАД§~ГА$Д. Выявлена взаимосвязь незду активностью ключевых ферментов метаболизма С^-кислот, цикла Кальвина и длительностью

сохранения"фотосинтеза поддержания" у устойчивых к водному дефициту растений. Меньшая повреждаемость ферментов ФЕП-карбокси-дазной системы в условиях продолжительного обезвоживания, наряду о другими компенсаторными процессами обмена, составляет комплекс адаптивных реакций, обеспечивающих выживание растений

в экстремальных условиях. Именно таким комплексом адаптивных реакций обладают- С^-растения.. . • ' . . • . ,

На основании обобщения.результатов исследования впервые , предложена я^ема возможных реакций участия С^-кйсЛот в фотосин-тетическбм метаболизме, С^-растений при-водном дефиците. Выска-' зана- и экспериментально обоснована идея Ъ .возможном механизме . адаптации фртосинтетиче'ского аппарата Сд~расте.ний к,длительно- " му действию водного дефицита путем осуществления у них метаболизма Сд-кислот. Вероятно, последние мопут быть использованы в . качестве источников С0£ дйя "фотосинтеза поддержания", когда одним из факторов, лимитирующих фотосинтетический СО^-газообмен, является.увеличение диффузионного-сопротивления-листа. , * <

• * Научно-практическая значимость работы. - \ ' , '

Результаты .комплексного многопланового -исследования1 ферментов" метаболизма С^-кислот, цикла "Кальвина и их роли в фотосинтезе" важнейших' сельскохозяйственных культур имр'юг первостепенное значение для разработки принципов 'управления фотосинтезом в' условиях обостряющейся экологической ситуации (глобальное потепление и аридизация климата). - - ' . _ ' .

Они представляют интерес, в частности, для разработки способов выращивания растений в засушливых условиях, создания тестовых систем для селекциойного. отбора устойчивых'к засухе .видов и' сортов, а также для программирования урожая контрастных ,по засухоустойчивости расте'ний.

Результаты исследований -позволили разработать: .

а) способ оценки устрйчивости.растений к продолжительному обезвоживанию,' основанный на определении активности ключевых ферментов цикла Кальвина и метаболизма С^г-кислот (РБФ-карбокси-геназы, НД$-'глицеральдегидфоефатдегидрогеназы и 'ФЕПК) (Рац. предложение. £ 339 от\03.02.92г.);.

* 6) способ выращивания амаранта в-засушливых условиях (Приоритетная справка от" 15.12.92г; по заявке 16 93010077 на изобретение); ' , -

- " в) методическое-пособие: ''Спектрофотометрические способы, определения активности ферментов фотосинтетического метаболизма; углерода у С3- и С^-растёНий" (1990);

г) научно-обоснованные рекомендации производству. "Физиологические основы орошения и окучивания амаранта"(1993).

Полученные нами экспериментальные -результаты и выводы дис-

сертации включены в программу лекционного курса по физиолог биохимии растений в Новгородском сельскохозяйственном институте. Методические разработки используются при выполнении научно-исследовательских работ в Днепропетровском, Кабардино-Балкарском, Санкт-Петербургском, Томском государственных университетах, Новгородском сельскохозяйственном институте и институте физиологии растений и генетики АН Украины. (Акты о внедрении прилагаются). Материалы диссертации о механизме светоиндукции ключевых ферментов метаболизма С^-кислот и цикла Кальвина в зеленеющих листьях С-}- и С^-растений использованы при составлении монографии "Фотосинтез и органические кислоты" (Магомедов, 1988).

Апробация работы. Исследования проводились по плану научно-исследовательских работ лаборатории фотосинтеза Биологического научно-исследовательского института Ленинградского (Санкт-Петербургского) государственного университета (1973-1982 гг.), Новгородского сельскохозяйственного института (1983-1987 гг.), Института физиологии растений и генетики АН Украины (1988-1993 гг.) и являются составной частью государственных заданий и целевых комплексных программ.

Результаты, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались: на научных семинарах кафедры физиологии и биохимии растений Ленинградского государственного университета (1974,1978) лабораторий фотосинтеза Биологического научно-исследовательского института Ленинградского университета (1974, 1978, 1981) и ВИР им.Н.И.Вавилова (Ленинград-Пушкин, 1978), на юбилейной сессии кафедры физиологии и биохимии растений Ленинградского университета, посвященной 100-летию со дня рождения ак.С.П.Кос-тычева (Ленинград, 1977), на 13-ом научно-координационном совещании "Изучение первичных и вторичных продуктов фотосинтеза и нх метаболизма в растениях" (Душанбе, 1977), на Всесоюзном симпозиуме "Продуктивность фотосинтезирующих систем в экстремальных условиях" (Улан-Удэ, 1978), на научно-практических конфе- • ренциях профессорско-преподавательского состава Ленинградского и Новгородского сельскохозяйственных институтов (1983-1986),на Всесоюзной конференции по проблемам современной биотехнологии и физико-химической биологии (Москва-Звенигород, 1985), на научных семинарах отдела физиологии водного режима растений Института физиологии растений и генетики АН Украины (Киев, 1984, [985, 1988, 1990, 1991), на расширенной заседании кафедры фи-

- 10 -

экологии растений Московской сельскохозяйственной академии и» К.А.Тимирязева (1988), на Республиканской конференции "Метод! интенсификации селекционного процесса (Одесса, 1990), на II съезде Всесовзного общества физиологов растений (Минск, 1990] на научном семинаре группы экологии растений Биологического научно-исследовательского института Ленинградского государственного университета (1991), на научно-практической конферет. "Вклад молодых ученых в интенсификации сельского хозяйства УС (Киев-Чабаны, 1991), на Всесоюзной конференции "Физиолого-геи тические механизмы регуляции азотного питания растений (Киев, 1991), на объединенном оениивре отделов экологии фотосинтеза фиэиологии водного режима растений Института физиологии расте ний и генетики АН Украины (Киев, 1992),.на Международном симп зиуме "Амарант - кормовая, пищевая и лекарственная культура" (Чехо-Словахия, 1992), на III съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), на II съезде Украинского общества физиологов растений (Киев, 1993), на Специ лизированных научных семинарах Института физиологии растений генетики АН Украины (Киев, 1992, 1993), на научном семинаре л боратории фотосинтеза ВИР им.Н.И.Вавилова (Санкт-Петербург-Пу кин, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 р бот, 3 статьи находятся в печати. Приоритетная справка от 15. 92г. по заявке № 93010077 на изобретение; разработаны: I рац. предложение № 339 от 03.02.92г., научно-обоснованные рекомендации производству "Физиологические основы орошения и окучива ния амаранта" (1993), I методическое пособие "Спектрофотометр ческие способы определения активности ключевых ферментов фото синтетического метаболизма углерода у Cj- и С^- растений" (1991

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из вв дения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части (8 глав), заключения, вы. дов и библиографии, включающей 489 наименований, из них 319 на иностранных языках; работа изложена на 292 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц : 35 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись растения трех экологических групп, различающихся по типу углеродного метаболизма на свету и устойчивости к недостатку влаги: яровая пшеница (Irl-

icum aestivum L. ) сортов Саратовская 29 и ее изогенные линии ысар и Эгисар, Эритроспермум 841 (устойчивые) и Ленинградка неустойчивый) - С^-растения; кукуруза (Zea maya L.) - гибриды уковинский 3, Юбилейный 60 MB, Маиссинте 250 MB, в некоторых пытах - дикий сородич теосинте однолетний (Euchlaena' mexicana chard ) - малатные формы С^-растений; амарант метельчатый Amaranthus panículatus L., К-ВИР 40197) сорта "Атлант"- аспар-атная форма С^-видов; бриофиллум (Bryophyllum daigremontia-um в) - представитель растений с обменом кислот по типу тол-гянковых.

В опытах по изучению светоактивации и синтеза de novo лючевых ферментов метаболизма С^-кислот и цикла Кальвина ис-эльзовались 8-9 суточные этиолированные проростки пшеницы сор-i Ленинградка и кукурузы гибрида Буковинский 3, выращенные i полном питательном растворе Кнопа в темноте при 25° и 35°. кя последующего светоиндуцированного развития хлоропластов астья или отрезки листьев опытных проростков экспонировали на вету различной интенсивности (53, 190 и 430 Вт.м-^) при 25° и >° в течение 24 ч. Выбор экспозиции был произведен с учетом шных литературы (Sra-ham et al.,1970;Goatly et al. , 1975; юнров, 1975); Контрольными были листья или отрезки листьев, эстоянно находящиеся в темноте.

При установлении синтеза de novo ферментов метаболизма j-кислот и цикла Кальвина в зеленеющих листьях пшеницы и куку-гзы последние инкубировали в растворах специфических ингиби->ров биосинтеза белка на 80s рибосомах цитоплазмы - циклоге-;имида (Ц) и - 70s рибосомах хлоропластов - хлорамфеникола САФ) (Ашмарин, Ключарев, 1975). Концентрация ингибиторов син-¡за белка подбиралась экспериментально и составляла соответ-гвенно 50 и 150 мкг-мл~* ХАФ для пшеницы и кукурузы, 1-2 сг-мл"1 Ц для обоих растений (Юзбеков, 1978). В качестве ме-шого предиестзенника белка применялся 2-"^ С -глицин.

Пшеница сортов Эритроспермум 841, Саратовская 29 и ее югенные линии Пысар и Эгисар использовалась для опытов в фа-t колошения-цветения, кукуруза(гибриды Юбилейный 60 MB, Маис-ште 250 MB) и теосинте - выметывания метелки и цветения попка, амарант - выметывания метелки, бриофиллум - 1,5, 2,5 и 5 месячные растеняя. Биологический контроль генеративного »стояния растений паеницы осуществляли по Куперману (1969).

- 12 -

Растения выращивали в вегетационном домике в сосудах Вагнера емкостью 8, 10 и 16 кг сухой почвы. В период всходов производили прореживание и оставляли в свсудах по 15 растений пшеницы, 1-2 кукурузы, амаранта и бриофилума. Влажность почвы поддерживали на уровне 60,? от полной влагоемкости (ПВ). Опытные растения в исследуемые фазы роста и развития подвергали воздействию засухи. При этом полив растений прекращали и влажность почвы в сосудах доводили до Ъ0% ПВ, растения находились в состоянии устойчивого завядания. Водный дефицит в состоянии максимального завядания составлял 29,6 - 32,4%. Длительность бесполивного периода зависела от цели опытов и от степени устойчивости растений к водному дефициту, и составила 2-22 сут, после чего полив возобновляли. Образцы для анализа отбирали в одно и то яе время суток (10ч).

Общее содержание воды в листьях и оводкенность листьев (ОВ) определяли высушиванием их до постоянной массы при 105°, водный дефицит листьев (ВД) - по Штокеру-Литвинову (1951),осмотическое давление (ОД) - криоскопическим методом в модификации Кармадонова (1986), относительную тургесцентность, инте! сивность транспирации и водоотдачу листьев (потерю воды за пе] вые 3-5 мин эксперимента) - весовым методом (Иванов и др.,1951 состояние устьичного аппарата и диффузионное сопротивление ли* та (ДСЛ) - с помощью порометра (Гуляев, Шведова, 1984).

Интенсивность фотосинтеза измеряли у неотделенного от cti ля флагового листа пшеницы (фаза начала цветения) и у целых р, тений кукурузы (фаза выметывания метелки и цветения початка), амаранта (фаза выметывания метелки) на установках, разработан них в отделе физиологии и экологии фотосинтеза Института физиологии растений и генетики АН Украины, позволяющих производить синхронную регистрацию газообмена COg с помощью оптико-акустического газоанализатора OA 5501 и HgO с помощью микропсихрометра (Гуляев, 1983). В опытах о пшеницей использовали термостатируемую листовую камеру с рабочей площадью 14 см ,в которой поддерживалась температура 25°.

Активность ФЕПК, НАД-ВДГ, НАДФ-МДГ, НАД-ВДГ, НАД-МЭ, НМ ИЗ, §ЕПКК, РБФК/0 и НАДФ-ГАЗД определяли спектрофотометричес» по стандартным методикам (Романова, 1980), модифицированным г ми применительно к объектам исследования (Магомедов, 1978; С: беков, 1990), окоалоацетатдекарбоксилазы - по Хэтчу ( Hatch,

1973) в модификации йванищева (1990). АспАТ и АлаАТ - по Хэт-чу и May (Hatch, Mau 1973).

Изоферментный состав НАД- и НАДФ-МДГ, НАД- и НАДФ-МЭ исследовали тетразолиевым методом (Гааль и др., 1982), ФЕПК- по Магомедозу и Тищенко (1974), АспАТ - по Тищенко (1978), РШ/О - по Монаховой и др. (1987) после электрофореза белков в поли-акриламидном геле ( Davis,1964; Сафонов, Сафонова, 1968; Ьаеш-mli,l970). §отометрирование гелей производили на микрофотометре М-4 и спектрофотометре Д-8 (фирма "Beckman").

Экстракцию меченых белков и изогнзк*ов ферментов из сегментов полиакриламидного гзля осуществляли методами ( Fishbein, 1972; Аксенова, Кожанова, 1976) з нашей модификации (Юзбеков, 1976). Результаты счета радиоактивности выражали в кмп.мин"*^г~^

т т

сырого вещества и имп-мкн"-1 >мг белка. Измерение радиоактивности вели на сцинтилляцконных счетчиках bS-ICOC, СБС-I, установках для радиобиохимических исследований ESTA-2 и с приставкой БС-3. Эффективность счета определяли по Симоннэ (1972).

Содержание белка оценивали по Лоури и др. ( Ьоягу et al., 1951) в модификации Бейора (1976).

Фотосинтетический метаболизм углерода при водном дефиците исследовали радиометрически при концентрации1 COg 0,04;? (удельная активность 5,30 мкки • мкМ-*^). Кинетику включения ^С02 изучали при коротких и длительных экспозициях (30с, 60с, Змин, 5мин, 10мин, 1ч). После экспозиции в ^COg листья фиксировали в парах кипящего этанола. Экстракцию продуктов фотосинтеза проводили растворами этанола последовательно убывающей концентрации. Суммарный экстракт разделяли на кислую, основную и нейтральную фракции путем колоночной хроматографии, используя ка-тионообменную и анионообменную сролы (Солдатенков, Мазурова, 1962; Вознесенский и др., 1965). Аминокислоты, содержащиеся в основной фракции, разделяли двумерной хроматографией в тонком слое цэл.июлозы: бутанол-муразьиная кислота-вода (6:1:2) - 1-ое направление, пропанол-изоаропанол-аммиак (1:1:1) - П-ое направление (Plllay.Mehdl, J970; Заленский и др.,1981). Из кислой фракции выделяли органические кислоты и фосфорные эфиры Сахаров одномерной хроматографией в системе пропанол-аммиак (.7:3). Размещение меченых соединений в тонком слое целлюлозы определяли пс радаоавтограммам.

Декарбоксилирсвание 4 - **С~ябдочной кислоты проводили по методу Х'этча (Hatclj 1972), выделение и очистку НАДФ-413 -

по Персанову (1976).

Результаты всех опытов, в том числе и тождественность зо белков (ферментов) в полиакриламидном геле, оценивали статистически (koghard,Chromtach, 1974; Аикарик и др., 1975; Доопе хэв, 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Индуцибельность ключевых ферментов метаболизма С^-кислот в зеленеющих листьях Cj- и С^-растений.

I.I. Сравнительное изучение влияния света и температуры на развитие активности ФЕПК и НАДФ-МЭ в зеленеющих листьях кукурузы и пшеницы

К началу наших исследований из работ Хэтча и др. ( Hatch < al. , 1969; Graharo et al., 1970) было известно о светоиндуциро: ном увеличении активности ПФДК, ФЕПК и НАДФ-МЗ в зеленеющих л: тьях кукурузы.

Было также известно, что С^-растения характеризуются пов! иенной температурной оптимума фотосинтеза (30-40°) и высоким уровнем освещенности, необходимой для его светового насыщения у Сд-растений параметры оптимальной температуры фотосинтеза и уровня его светонасыдения составляют соответственно 20-25° и 30000-40000 лк ( Black, I97I;I973). В то же самое время данны: о влиянии повышенной температуры и света различной интенсивна ти на развитие активности ферментов метаболизма С^-кислот в з< ленеющих листьях Су и С^-растений не было.

В начале исследований по светоактивации ФЕПК и НАДФ-МЭ mi изучали особенности биосинтеза водорастворимого белка в зелен! щих листьях пшеницы и кукурузы в различных условиях светового температурного режимов.

Из данных, приведенных в табл.1, следует, что содержание белка в этиолированных листьях пшеницы (темнота) в два раза bi ше, чем в листьях кукурузы при этих же условиях. В зеленеющих листьях это соотношение сохранялось. При 25° у пиеницы и кукурузы увеличение количества белка на овету (53 Вт>м~ ) составляло соответственно 23 и 16$, при 35° - 9 и 17%. Следователь! скорость биосинтеза бедка в зеленеющих листьях кукурузы не зависела от температуры; у пшеницы при 35° скорость синтеза бел( была ниже, чем при 25°.

Таблица I

Влияние света и температуры на биосинтез белка в зеленеющих листьях кукурузы и пшеницы ( в скобках - %)

Объекты и Количество белка, мг-г-^ сирого вещества

варианты -

опытов 25° 35°

Кукуруза

Темнота 16,0 £ 0,8(100) 14,5 ± 0,5(100)

Свет 53 Вт' ■и"2 18,6 - 0,5(116) 17,0 t 0,4(117)

190 -"• 20,0 ± 1,0(125) 16,6 i 0,7(114)

430 12,3 i 0,4(77) 13,0 ± 1,0(90)

Пшеница

Темнота 33,0 - 1,1(100) 32,1 i 0,6(100)

Свет 53 Вт* .м-2 40,7 - 0,9(123) 35,0 ± 1,0(109)

190 -»• 35,0 s 1,0(106) 29,3 £ 0,8(91)

430 24,3 ± 0,7(74) 20,7 ± 0,4(64)

Свет интенсивностью 53 Вт*м~2 индуцировал биосинтез белка в зеленеющих листьях пшеницы и кукурузы. С увеличением интен-зивности света до 190 Втнаблюдалось уменьшение коди^ства 5елка в листьях пшеницы и кукурузы как при 25°, так и -35 ;ис~ уизчение составило некоторое увеличение содержания белка у ку-сурузы при 25°. Наибольший ингибирувщий эффект на биосинтез бел-са оказывал свет интенсивностоЮ 430 Вт-м : количество белка в 1истьях обоих растений снижалось до значений меньше контроль-шх (темнота).

Таким образом, оптимальными условиями биосинтеза белка в (еленеющих листьях пшеницы являются температура 25° и освещен-юсть 53 Вт.м-2, для кукурузы -25° и -190 Вт.м"2.

Результаты опытов по изучению влияния света и температуры [а развитие активности ФЕПК и НАДФ-МЭ в зеленеющих листьях ку-:урузы и пшеницы представлены на рис.1.

Из приведенных данных видно, что этиолированные листья ку-:урузы и пшеницы обладают значительной активностью ФЕПК и НАДФ-[3. При освещении листьев кукурузы активность их увеличивалась, ричем светоактивация ФЕПК и НАДФ-МЭ усиливалась при 35°. На-ротив, свет и температура не оказывали существенного влияния

Лулгрум 25' 35°

йшенща 25° 35•

3200 £+00 1600 800 О

ФЕПК

ч

«¿1

«00 3200 2400 1600 600 а

Ж

нт-мэ

Я

1200

600 400 О

И

нт-тг

Е53 ~ тетотл

О - ае'т (190 Вт -м'*) ЁШ ~сжт * Ц (2. тг мл~')

~свет + ХАФ ( 150 к 60 тг • мл' соопетспето цлз кгш пы я тещи)

.Рис. 1. Влияние света и температуры на развитие активности ключевых ферментов метаболизма С4-кислот в зеленеющих листьях кукурузы а пшеницы

на развитие активности ключевых ферментов метаболизма С;.-кислот в зеленеющих листьях пшеницы. Полученные результаты подтвердили данные ряда авторов (Hatch et al. ,I969íTreharne, Cooper, 1969; Graham et al.,1970).

Вышеизложенное позволяет заключить, что ФЕПК и НАДФ-МЭ -ключевые ферменты метаболизма С^-кислот, активируются светом только у кукурузы и, следовательно, только у С^-растений они являются ключевыми ферментами фотосинтеза; у С^-растений с участием этих ферментов осуществляется нефотосинтетический метаболизм С^-кислот. Оптимальной температурой для проявления максимальной светоактивацяи ФЕПК и НАДФ-МЭ при становлении фотосинтетического аппарата листа кукурузы является 35°.

Для выяснения причин светоактивации ФЕПК и НАДФ-МЭ и установления возможности синтеза их на 70S рибосомах хлоропластов и 80s рибосомах цитоплазмы мы использовали специфические ингибиторы биосинтеза белка - циклогексимид (Ц) я хлорамфеникол (ХАФ).

Как видно на рис.Х, светоиндуцированное увеличение активности ФЕПК и НАДФ-МЭ в зеленеющих листьях кукурузы резко снижа- . лось в присутствии Ц и ХАФ. При этом чувствительность ферментов к данным ингибиторам была различной. ФЕПК оказалась более чувствительной к Ц, чем - ХАФ. Так, активность ФЕПК в прис)тствии Ц и ХАФ на свету интенсивностью 190 Вт»н"^ и 25° составляла соответственно 800 и 1550 мЕ«г~^ сырого вещества. Известно, что Ц -- специфический ингибитор синтеза'белка на 80s рибосомах (Аш-марин, Ключарев, 1975), поэтому можно предположить, что светоак-тивация ФЕПК у кукурузы обусловлена синтезом de novo ферментного белка на рибосомах цитоплазмы. Не исключены также и другие причины светоактивации ФЕПК в условиях повышенной температуры (35°); изменение конформации молекул белков, сдвигов в соотношении активаторов и ингибиторов ферментов и др.

НАДФ-МЗ оказался более чувствительным к ХАФ, чем - Ц. Поскольку ХАФ ингибирует синтез белка на 70s рибосомах (Boulter et al., 1972), можно сделать вывод, что светоиндуцированное увеличение активности НАДФ-МЭ в зеленеющих листьях кукурузы, вероятно, обусловлено синтезом de novo ферментного белка на рибосомах хлоропластов. Согласно Ю.С.Карпилову и др. (1977) синтез НАДФ-МЗ осуществляется, по-видимому, на рибосомах цитоплазмы,а действие ХАФ - опосредованно, через синтез белков, использующихся при формировании хлоропластов, с которыми связано развитие активности ферментов автотрофной ассимиляции С02.

Ц-и ХАФ не оказывали существенного .влияния на развитие активности ключевых фермецтор метаоолизмй -кислот в-'зеленеющих • листьях пяешщн. ' ■ • • / *. -

* Для подтверждения результатов .ийгибиторного анализа мы исследовали включение 2- ' С-глицина-в белки'изоферментов ФЕПК и НАДФ-МЗ-из этиолированные и зеленеющих диствев кукурузьС и пшени

'ЦЫ> - ' - ' ' и- • ' ' •

В предварительных опытахс2- С-глицином нами было* установлено, что оптимальной температурой;для синтеза-белка,у кукурузы - являетой 35°, у пшеницы. - 25°. Принтом б.олее' ийтёноивный'оин-. тез и высокое'содержание растворимогр беЛка, а также белка фрак 'ции 1(РБФК/0) йаблвдали'сб у пшеницы, чем'у' кукурузы (Юзбеков, • 1978). Прлученные данные .согласуются с литературными, в,'которых -показано высокое содержание 'растворимого- белка .и .бе^ка фракции I у С^-растений по сравнение с С^-видами'(Андреева, Авдеева, 1976

. , ' . Г.2. Включение 2-^С-глицина в белки изофэрменто: ФЕПК и НАДФ-МЭ' из листьев кукурузы и пшениц. ; - при различных условиях светового' и темпера-

• , - * турноРо .режимов; ' " ' •. - -

Электрофорети'чеокий спектр ФЕПК из'Этиолированных листьев '* кукурузы представлен 'одним изофёрменто(ч с относительной эл£к'тро 'форетичеокой подвижность»- (ОЭП) - ,0,28 (рис.2);,радиоактивность его увеличивалась от, 201 в' темно*е,- до^^Э^имп* Ю »мин'.-мг ... белка на свету .интенсивностью'53 Вт->Г и температуре '25°(ркс.Э

. В -листьях кукурузы, ;зелёнеющлх, на свету- интенсивностью . *190 Вт-'м , отйечалйсь высчкая'степень гетерогенности. ФЕПК^ ко, торая выражалась ь образовании дополнительного и?оэ>гэима с ОЭ'П— -0,25, причем радиоактивность и содержаниё .белка в изо<|ермен-тах-ФЕПК из зеленеющих листьев значительно'превыиали'их исходные величины (рио.2,3). Образование-дополнительного изофёрмен-; ' та в электрбфоретическом 'спектре ФЕПК W зеленеющих листьев, С^-растений ^(сахарного тростника) ранее было обнаружено и другими авторами (Goatly et-aj... t "Х975)„ Одрако причины этого "явления, одной из которых мог "быть синтез dé. n°vo ' белка ФЕПК; оставались нераскрытыми, . '

. При освещенности 430 Вт-м~^' изменения в электрофоретичес-

I ^

КУКУРУЗА, . ' , • - .ПШ'ГСЩА

.1 1 - . I П:| | ( Г I | ' || ' -1 II Г I III' I I!- I I 11,1 . -I '

„ч

т (о ог »« с« 91 <0 ) ' ее О* 01 не 10 оо о? о* сь не «ю ■ оо и .ва о> о» <о оо о; «» оо 58 1

|| '-; I |п • •. I I ' I си

II ■ . . ' . ' ' '' '

- •- >■ > + - .. +

И I ,111: , 1 Г! и- ! 1!1М \ . | .

I •

Рис.-2 . Г)пектрофоретйческ1-:е-спектры 5Э1К(1) и !!АДО-ЬП "(II) из зеленеют,«, листьей кукурузы и пшеницы: а/ - темнота, б/ - свет, в/ - свет +Ц, г/.- срг;т +ХАФ. '. "'кспозиция на свету - 24ч; освещенность ^ 130 Вт-м . ,

ком спектре, содержании белка и распределении метки между I и П-ой изоформами ФЕПК не наблюдались. Повышенная температура (35°) и свет различной интенсивности не усиливали светоиндук-цию ФЕПК из зеленеющих листьев кукурузы (рис.Э).

Изозимный спектр ФЕПК из этиолированных и зеленеющих лист ев пшеницы при различных условиях светового и температурного р жимов представлен одним изоферментом с ОЭП - 0,28; радиоактивность его на свету несколько снижалась по сравнению с исходной величиной.(в темноте) (рис.3).

Электрофоретический спектр НАДФ-МЗ этиолированных и зеленеющих листьев кукурузы состоит из двух изоэнзимов: первый,ОЭП которого - 0,18 является основным, второй с ОЭП - 0,20 - минор ным (рис.2). С увеличением освещенности до 190 Вт.м-^ радиоактивность и содержание белка в основном изоферменте из зеленеющих листьев возрастали пропорционально ее интенсивности. Актив ность минорного изофермента в этих условиях практически не изменялась (рис.U).

В случае же пшеницы суммарная радиоактивность изоэнзимов НАДФ-МЭ из этиолированных листьев была сравнима с таковой в-зе ленеющих листьях при различных условиях светового и температур ного режимов (рис.4).

Таким образом, результаты исследова!ия электрофоретически спектров и включения 2- С-глицина в белки ключевых ферментов метаболизма С^-кислот из зеленеющих листьев кукурузы подтвердили выводы, сделанные нами на основании ингибиторного анализа о том, что светоактивация ФЕПК обусловлена синтезом do- novo дополнительного изоэнзима с ОЭП - 0,25. Наличием данного изоэн зима С^-растения отличаются от Cj-видов. Этот вывод позднее на шел подтверждение в работе Хэйга и Симса ( Hague,Sims, 1980) и противоречит данным Гоатли и др. ( Goatly et al., 1975), согласно которым образование дополнительного изофермента ФЕПК является результатом изменения ионных свойств фермента (распада мономера на димеры) при становлении фотосинтетического аппарата С^-растений. в зеленеющих листьях пшеницы новообразование дополнительных и усиление синтеза основных или минорных изоэнзимов ФЕПК и НАДФ-МЭ не происходило, а активность их на свету нисколько снижалась. Это подтверждают и другие авторы (Ting, Oaraond, 1973в; Карпиаов и др., 1977; Оманн, I9Y7; Petropoulou, Manetas , 1990). Следовательно, выявленные различия в светоак-

<м

I

ш

зоо

200 й

100 ¡(¡л

0 —

1 2

400 • 300

еоо 100 о

Кукуруза

гЬ

Ш М.

12 12 12 12

гЬ

Г^Ь

25

35

Пшеница

гЬ А РН

12 1 2 . 1 2' 1 2

| 1 Г*1 +]

Ш 1Й

1 - ( изоферменты

2 - \ФЭП - на^оксиюзы Д - темнота

| | - свет, 55 Д сеет. 190 б/п-м ^ Щ - сьет, 450 5т м'г

12 12 12 12

12 12 12 12

Рис.3. Включение 2-^С~глицина в белки изоферментов ФЕПК из зеленеющих листьев кукурузы и пшеницы в различных условиях светового и темпепатупнпгп пеж™гш

см

. СМ

лоо

■300 200 100 о

Киыеиза ей

4

• 1| 1 2

'Ш

''ф

400

500

аоо й

1

100

н

Н

0 ¡•Й-

1 2

\ г 12 12

Л

12 12 А 2

25'

35

/7щешЦа

Рис.

4. Включение 2-^С -глицина в белйи изоферментов НАДФ-МЗ из' зеленеющих листьев кукурузы и пшеницы в различных условиях светового и температурного режимов.

11

Л

л г < г 12,12

т

Ш

V/. %

12 12 12 12

1 - Г ийофермеяты

2 - I НАДФ- чалил-энзим

||р - темнота ■,

| | - свет,. 63 &/тм* Д - свет, 190 Ьт м~й ВЦ - сьет, 430 Вт - м'*.

тивации ключевых ферментов метаболизма С^-киолот при становлении фотосинтетического аппарата листьев кукурузы и пшеницы свидетельствуют о ведущей' роли ФЕПК и НАДФ-МЗ в фотосинтезе С^--растений.■

2. Активность некоторых ферментов метаболизма • С^-кислот у САМ-растений 2.1. Активность и внутриклеточная локализация ферментов декарбоксилирования С^-кислот в листьях ВгуорЬуНига д-а^вгетоп-^агшт В.

Как уже отмечалось, ферменты метаболизма С^-кислот пред-• ставлены и у САМ-растений, произрастающих в более жестких аридных условиях, чем С^-растения. К началу наших исследований(1973) былб известно, что растения- с САМ в зависимости от фермента, участвующего в декарбоксилировании С^-кислот, условно разделяются на НАДФ-МЗ и ФЁПКК группы (Б11:1:г1с1г et а1.,1973. ). Для-определения принадлежности бриофиллума к перечисленным группам мы изучили активность и локализацию НАДФ-МЗ и ФЕПКК в-листьях -этого вида. Предположив, что по аналогии с С^-растениями декар-боксилирование яблочной кислоты "у бриофиллума может быть связано' с функционированием НАД-МЭ, одновременно- исследовали и активность данного фермента. '" . ■ »

• Сравнительный анализ активности НАД-МЭ .и,НАДФ-МЭ во фракциях цитоплазмы, легко- и труднорастворимых белков хлоропластов и митохондрий из листьев бриофиллума (табд!2) показал, „что значительная активность НАД-МЭ связана с фракцией легкорастворимых белков митохондрий,НАДФ-МЭ - с фракцией легкорастворимых белков хлоропластов.' При этом активность НАДФ-МЗ в листьях бриофиллума ниже(почти в два-раза)активности НАД-МЗ. Обнаружение некоторой активности НАД- и НАДФ-МЗ в других фракциях, вероятно, обусловлено вымыванием ферментов в ходе процедур выделения. Активность НАД-ВДГ определялась для установления чистоты фракций митохондрий.

Таблица 2

Активность НАД- и НАДФ-МЗ во фракциях цитоплазмы,-легко- и труднорастворимых белков хлоропластов и митохондрий из листьев ВгуорЬуНшп йа1ёгетоп-Иетиш В.

Активность в мЕ-мг"-*- белка

$Ракции ИАД-МЗ НАДФ-МЭ НАД-ВДГ

____Сж^о^ , '

Цитоплазма 44 £ 3 63 + 4 ■ 51 + 7

Легкорастворимые

белки хлоропластов 33 ± 4 179 + 10 29 + 4

Труднорастворимые

белки хлоропластов 27 ± 2 31 + 3 17 + 2

Легкорастворимые

белки митохондрий 373 £ 8 50 + 6 187 + 7

Труднорастворимые

белки митохондрий 106 ± б 17 + 2 51 + 4

Активность ФЕПКК в наших опытах не выявлена как в ходе прямой, так и обратной реакций (табл.3). В то же самое время наблюдалось функционирование ФЕПК, активность ее увеличивалась в присутствии глюкозо-6-фосфата в 1,7 и 2 раза соответственно при рН 7,0 и 8,0 по сравнению с контролем.

Таблица 3

Активность ФЕПКК в листьях

ВгуорНуНит <1ахегетоп1;1агтт В,

мк М Н^СО^.г"* сырого вещества

Способ Компоненты рН

определения реакционной —

7,0 8,0

смеси * '

Прямая реакция Н^СО" Т79 + 20 173 + I?

(реакция карбо- ц, _ ^ ксилирования) Н С03 + $ЕП Н14С05+ФЕП+АДФ 2763 + 258 1639 + 115

2697 + 367 1549 + 119

Н14С05+ФБП+Гл-6-ф 4843 + 103 3403 288

Эти результаты согласуются с данными Тинга и Осмонда(т1п§, ОатопйД973а ) об активации ФЕПК глюкозо-б-фосфатом у САМ-рас-тений.

А

Б

В

Г

1Л,-

I

0.

0,2 0,4

0,6

0,8

1,0.

оэп

2 3 4 5

123.45 12345 12345

Рис. 5 . Изоферментные.спектры ФЕПК (А), НАД-МДГ (Б), НАДФ- и НАД-специфичных малик-энзимов (соответственно В, Г) ИЗ листьев ВгуорЬу11и!П <1а1Егетоп11апда Обозначения: I - цитоплазма,

2 - легкорастворимые белки хлоролластов,

3 - труднорастворимые белки хлоропластов,

4 - легкорастворимые белки митохондрий,

5 - труднорастворимые белки митохондрий.

Данные сравнительного анализа активности ферментов декар'--боксилирования С^-кислот в различных фракциях белков из листц, ВгуорЬуИит ^ахегетоп-Щпит 2. дополняются ре'зультатми изучения' их электрофоретйческих спект'ров' (рис.5).' НАДФ-МЗ представлен, двумя изоферментами-, локализованными, в основном, в хлоропластах. После Расовой инкубации гелей в-реакционной смеси для.выйвле- . ния НДДФ-МЭ "во фракции "цитоплазма"' обнаруживалось окрашивание изоэнзимбв,-ОЭП которых соответствовала й ЭП.третьей и четвертой изофарм НАД-МДГ. Гистохимическая реакция в присутствии НАДФ' и Mgt2 развивалась медленно (в, течение 1,5ч), .тогда как с. НАД и 30-35-мин. Наиболее-сильно'эта-реакция развивалась во-

фракциях/белков.митохондрий. Это свидетельствует .о том, что трег туй и четвертый изоферменты -НАД-МДГ-, по-видимому', выполняют", ,функцию-НАД-МЭ,-который нестрогоспецифичен к.НАД (Диксон, Уэбб, 1961; Масгае, 1971 ).,Электрофоретический .спектр ФЕЦК пред-ставлен_ двумя ,из^энз,имами, 'локализованными, в, основном, -в цитоплазме-клетки. • - •

Таким «образом, получ'енные результаты позволяют'заключить, что в дек^рбоксилйровании яблочной кислоты в листьях ВгуорЬуЗ,-1ш1 daigremoI>ti'anum В» основная роль привадлеиит~.НАД-МЭ, лока-' лизованному митохондриях .< Следовательно, по аналогии с С^-рао-тениями, среди САМ-растений можнб. выделить третью, ранее-неизвестную-подгруппу с НАД-МЗ-типом декарбоксилирования яблочной кислоты; при этом возможно также л участие НАДФ-МЭ,. значительная активность которого" связана с хлоропластики. Вклад каждого из них.в дека$боксилирсгвание яблочной .кислоты, вероятно, зависит от конкретных условий' произрастания (Глаголеву, Чуланов' екая, < 1992)'. ' ' . . , '..".'■,' ^ -

2.2. Динамика активности ключевых ферментов , . 'метаболизма С^-кцслот•в онтогенезе листа

- . • ВгуорЬуЦит йа^агетоп-ЬХапит В.

Известно, что" своеобразный процесс суточной ритмики содержания кислот в либтьях САМ-растений' определяется, в основном', Яблочной кислотой'и осуществляется только в полностью сформировавшиеся лцст'ьйх .(Солдатенков, 1971;'Чесноков4 Мирославов^, 1971; Бело зерова-, 1965;дате^ е-ь си,, ,1976а). Это определило необходимость изучения активности- ферментов метаболизма -яб-

лочней кийлота в онтогенезе листа брйофиллума. , ; . , - • ( Наименьшая активность, ФЕПК и-НАД-$Д1\ ответственных за синтез яблочной кислоты, наблюдалась в 'относительно молодых (1,5 Месячных') лйстьях, наибольшая - у зрелых (3v5* месячных)'лис/ьев Огабл.4'). Аналогичная" зависимость была: характерна-и. для ^ермен-. тов .-декарбоксилирования,яблочной кислоты'(НАДФ-МЭ,* _НАД-МЭ>. .

, " " • ■', • „ • Таблица'4

Динамика активности«ключевых ферментов.' ■ ■.,'<". , метаболизма яблочной кислоты в онтогенез? . 1

листа -Bryophyllum daigremontiänum. 3}. .

Фермент

•Активность' ферменто,в в мЕ-мг белка _ Возраст,растений(месяц)

Г,5.

•2,5

3,5-

,ФЕПК ^ , . НАД-МДГ \ . ' НАДФ-МЭ (iig2+)'

НАД-МЭ(.11п ,

2-е

92 2 5, 1280 2 43 ' 77 t 3 НО 2 -15

210 -i 15. ' '290 i 20' 123 i,16 370 i'35 ' 5220' 2 30 ¿800-2 60

96 2 6 ' ' 150 '2 II- 105 2 7 , • » „.

■180 ¿9 ' 280 2 15 213 2 7

, С подобных изменениях" активности ферментов* метаболизма С^-кислот у С^-л С^-рдотений в зависимости от. возраста листа'особ-' щено~ также-в работах (Кеппйу, Ьеа1:эс;1',1973;/21п1а,3е^ас, 1979; ^

• , Мокроносбв, 1981), ,что указывает на общность- этого явления* у 'С3-. С^- и САМ> растений. , *•' "_ 1 , - ■

Полученные 'результаты-свидетельствуют .о том, что всзраст лийта и связанное с ним увеличение активности ферментов метаболизма С^-кцслот Являются факторами,- обусловливающими'обм'ен кислот ПО типу-толстякозых'.в зрелых листьях ВгуОрЬуНит аа1ггешопт

•Ыатага. В. ' - ^ - - " '

. В связи- с вышеизложенным _мы изучили суточную ритмику содержания, кислот и механизм темнового тл светсгзавйсимого образования яблочной кис'лоты в'листьях 3-4. месячны-х растений ВгуорЬуНшл' dai'gremontian"um В. •

Как видно на рис.б, зрелые -листья ВгуорЬуИит ааХе^етоп- < Лапта в течение-суток характеризуют/^ различным уровнем кислотности: минимальное'содержание яблочной кислоты (0,13# в расчете

на I г' сырого вещества) наблюдалось в конце светового периода (7ч ЗОмин). Б результате энзиматической деградации ^С-яблочг. ной кислоты, синтезированной в листьях ВгуорЬуНиш аа1егепоп-•^ашдт В. в различное время суток оказалось, что свыше 90$ ^С, ассимилированного в темноте за 30 с, включается в 4-С00Н(^-кар-боксил) молекулы яблочной кислоты; высокое содержание метки в 4-СООН сохраняется и при увеличении экспозиции до 5 мин.

Рис.6. Процент ^С в 4-С00Н молекулы яблочной кислоты, синтезированной в листьях ВгуорЬуНит 4а1вгето^1апиш В.на свету И в темноте.

Длительность экспозиции в ^С02 : I - 30 с, 2-5 мин, 3 - I ч

На свету наблюдалось снижение включения ^С в 4-С00Н молекулы яблочной кислоты как при коротких (30с, 5мин), так и -более длительных (1ч) экспозициях;

Т ¿1

Результаты опытов по кинетике включения СО2 в молекулу яблочной кислоты позволяв заключить, что в темноте синтез ее осуществляется путем прямого карбоксилирования ФЕП при участии ФЕПК, локализованной в цитоплазме.

Таким образом,экспериментально была подтверждена гипотеза о прямом, по аналогии с С^-растениями, карбоксилировании ФЕП в листьях ВгуорЬуНит с^ггетпопиапил в. (Магомедов, 1974).

Значительное перераспределение метки между 4 и I атомами углерода (близкое к отношению 2 : I) молекулы яблочной кислоты, синтезированной на свету, свидетельствует о функционировании второго механизма ее образования-путем двухступенчатого карбок-силирования с помощью РБФК/0 и ФЕПК. Мы допускаем также возможность образования яблочной кислоты на свету путем одноступенчатого карбоксилирования ФЕП (рис.б). Вероятно, ФЕП в этом случае регенерируется из ПВК при участии пируват-Фн-дикиназы,активность которой обнаружена в листьях некоторых суккулунтов ( Dittrich et аЗ.,19ГЗ)

Наши результаты о механизме темнОЕОго и светозависимого образования яблочной КИСЛОТЫ в ЛИСТЬЯХ Bryophyllum daigremontianum з. подтверждают данные ряда авторов ( Sutton, Osmond,1972; Kluge et а1,1974),использовавишх для декарбоксилирования яблочной кислоты высокоочищенный малик-знзим и противоречат результатам (Bradbeer et al.,I958 ), полученным путем применения неочищенного ОТ фумаразн фермента ИЗ Lactobacillus arabinosua , что И явилось причиной ошибочных результатов (Dittrich, 1976 а,ь).

Следовательно, ассимиляция СО^ в зрелых листьях Bryophyl-1ш1 daigremontianum Вз темноте осуществляется аналогично С^-фотосинтезу, на свету - подобно фотосинтезу С^-растений.

3. Роль ферментов метаболизма С^-кислот в фотосинтезе Cj-растений при водном дефиците

Одним из наиболее существенных факторов, оказывающих губительное воздействие на жизнедеятельность растений, является засуха. Всесторонние исследования водообмена и метаболизма растений при ухудшении водообеспеченности и повышении температуры обстоятельно освещены в ряде работ отечественных и зарубежных авторов (Максимов, 1939; 1952; Алексеев, 1948; Гусев, 1959; Тарчевский, 1964; Кушниренко, 1967; 1964; Жолкевич, 1968; 1ол-кевяч и др., 1989; Слейчер, 1970;Hsiao,1973 ; Александров, 1975; 1985; Проценко и др., 1975; Шматько, йведова, 1977; Имать-ко и др., 1983; 1989; Сатарова, 1978;Kramer, 1980; bevitt , 1980; Альтергот, 1981; Мокроносов, 1981; Генкель, 1982; Мусиенко и др., 1985; Jones,IS85 ; Гкачук, 1986; Жученхо, 1988; Рекослав-ская, 1989; Блэхман, 1991; Пустовойтова, Жолкевич, 1992; Шматько,, Григорвк, 1992).

Поскольку при исследовании ферментов метаболизма С^-кис-лот у Сц- и САМ- растений были обнаружены увеличение активное-

ти и индукции их в различных условиях светового и температурной режимов, а также®зависимости от возраста листа, важно было npoai лизировать возможность усиления потока COg через реакции ФЕП-ка] боксилазной системы у Cj-растений при длительном действии водно! дефицита.

Приступая к работе, мы имели ввиду общепринятое мнение о незначительной роли ФЕП-карбоксилирующей системы реакций в углеродном метаболизме С^-растений: по этому каналу восстанавливается около 20$ от общей фиксированной углекислоты с образованием органических кислот И аминокислот ( Bundursky,I955; Bassham, 19%)• S то же самое время было известно об увеличении активности ФЕПК и индукции САМ в листьях некоторых С^-растений в условиях засоления и водного дефицит^ СSteichel et al.,1974; Willert, 1975; Winter, LUttge,1976a,Ъ; Winter et al.,1978; Vazquez-Moreno et al., 1987; Zhang et al.,1987; Huerta, Ting,I9S8), что,по данным ряда авторов, обусловлено синтезом de novo ®П1 -ключевого фермента САМ ( Bohner,I989; Pilon-Smits et al.,1990; Brulfert et al.,1991).

Для определения роли реакций ФЕП-карбоксилирующей системы в фотосинтезе С^-растений в стрессорнюс условиях мы изучили тканеспецифическую активность некоторых ферментов метаболизма С^-кислот и состав продуктов ассимиляции * COg листьями пшеницы при длительном действии водного дефицита. Полученные данные (рис.7) свидетельсвуют о наличии активности ряда ферментов ФЕП-карбоксилазной системы (ФЕПК, НАД-МДГ, НАДФ-МДГ, НАД-МЭ, НАДФ-МЭ, АспАТ и АлаАТ) во флаговом листе и частях колоса пшеницы. Причем, значительная активность ферментов метаболизма С^-кис-лот определялась в колосковых чешуях, остях и перикарпиях,чем в листьях. Несмотря на значительные изменения абсолютных величин активности ферментов метаболизма С^-кислот в листе и частях колоса, соотношение активности их практически не изменялось в разных структурах. О высокой активности ФЕПК, НАД-МДГ, НАДФ-МДГ, НАД-МЭ, НАДФ-МЭ, АспАТ, АлаАТ в частях колоса пшеницы сообщено также в работах ряда исследователей ( wirth et al., 1977;Singal et al., 1986; Caley et al.,1990).

Согласно предположению Сингала и сотр. ( Singal et al.¿SB6) ФЕПК в перикарпиях участвует в рефиксации COg, высвобождающейся в результате дыхания эндосперма, ввиду незначительного числа устьиц в этих структурах.

АспАТ

ИАД-МЭ

480-

320

16 суг

16 СУ7

Рис.7 . Тканеспецифическая акти. ность некоторых ферментов метабол! ма С^-кислот у яичницы при водном дефиците, нмоль•мин-^*мг-^ белка

о - флаг-лист 60% ПВ

а - флаг-лист 30% ПВ

$ - колосковые чешуи 60?

ф - колосковые чешуи 30?

А - ости 60£ ПВ

д - ости 30$ ПВ

О - перикарпии 60$ ПВ

О - перикарпии 30% ПВ

Анализ активности НАД-МДГ и НАДФ-МДГ во флаговом листе, колосковых чешуях, остях и перикарпиях показал, что активность НАД-МДГ почти в 6 раз выше активности НАДФ-МДГ в исследуемых структурах как при оптимальной, так и недостаточной водообес-печенности. Аналогичная зависимость наблюдалась также для акти ности НАД-МЭ и НАДФ-МЭ.

Длительное воздействие дефицита влаги (16 сут 30% ПВ против 16 сут 60# ПВ) повышало активность АспАТ в листе, остях и перикарпиях и снижало ее в колосковых чешуях. Активность АлаАТ выше в листе в течение всего бесполивного периода, тогда как в колосковых чешуях аналогичная тенденция имела место в вариантах 4, 8 и 12 сут 30% ПВ против, соответственно, 4, 8 и 12 сут 60$ ПВ. При длительной засухе (16 сут) различия в активности АлаАТ из частей колоса относительно контроля отсутствовали.

Наблюдаемое увеличение активности аминотрансфараз во флаговом листе и частях колоса пшеницы можно объяснить возможным формированием механизма ассимиляции избытка аммония, накаплива! щегося в тканях растений при засухе (Тарчевский,1964).

Сравнительное исследование активности ферментов метаболи: ма С^-кислот в листе и частях колоса при засухе позволили установить, что индуцируемое водным дефицитом изменение активности ферментов зависит как от экспозиции, так и длительности стрессового воздействия. При этом активность ферментов метаболизма С^-кислот (ФЕПК, НАД-МДГ, НАД-МЭ, АспАТ и АлаАТ) в листе при длительной засухе /16 сут 30% ПВ/ выше, чем в контроле /16 сут 6055 ПВ/.

Наличие активности ряда ферментов ^¿ПК-системы в листьях частях колоса пшеницы, а также увеличение активности их в уело ях длительного воздействия водного дефицита служат основанием предположения возможности осуществления метаболизма С^-кислот Сд-растений и использования последних в качестве источников СО для цикла Кальвина, когда одним из факторов, лимитирующих фото тетический газообмен, является увеличение устьичного сопротивл' ния.

Для экспериментального подтверждения настоящей гипотезы нами проводилось исследование продуктов кратковременного фото! теза флагового листа пшеницы Саратовская 29 в условиях водног» дефицита.

Анализ продуктов фиксации *4С02 показал (табл.5), что в 1 лэвиях длительного действия водного дефицита среди меченых ме: литов снижается доля углеводов и органических кислот,

но увеличивается процентное содержание аминокислот: аланина, треонина, аспарагиновой кислоты, глицина и серина.

Таблица 5

Содержание радиоактивного углерода в продуктах фотосинтеза флагового листа пшеницы Саратовская 2? при водном дефиците, % от общей радиоактивности. Длительность засухи - 16 сут от начала цветения; экспозиция - 3 мин.

Фракции Влажность почвы в сосудах

60$ пв 30$ ПВ

Аминокислоты 26,2 ± 1,4 41,0 ± 3,1

Органические кислоты 37,4 ± 2.3 30,2 ± 3.0

Углеводы 12.3 ± 0,9 4,7 ± 0,2

Таблица 6

Распределение радиоактивного углерода в аминокислотах флагового листа пшеницы Саратовская 29 в условиях длительной засухи (16 сут), имп-Ю3-мин~''' образец. Экспозиция 3 мин. Фаза развития: 16 сут от начала цветения.

Аминокислоты 60$ ПВ 3« ' ПВ % от контроля

Аланин 12,5 ^ 0,7 24,6 ± 1.2 197

Аспарагиновая кислота 4,8 £ 0,3 7,1 £ 0,2 148

Треонин 9,6 ± 0,4 16,0 £ 0,5 167

Глицин + серии 7,3 ± 0,2 15,8 ^ 0,5 216

Особый интерес представляли аланин, треонин и аспарагиновая кислота, поскольку метаболизм глицина и аерина мало связан с обсуждаемой проблемой. Треонин является аминокислотой, предшественником которой считают аспарагиновую кислоту. Образование последней, как и малата, связано о-карбоксилированием фосфоенол-пирувата. Следовательно, при длительной засухе' этот путь усиливается.

Более того, в условиях водного дефицита усиливалось включение ^С в аланин (табл. 6 ). Соглавно И.А.Тарчеввкому (1964), аланин образует* из 4ГК - интермедиата цикла Кальвина: ФГК—ФЕП —«- Аланин

-J4-

TJi

Мы изучали включение С в аланин (табл.7 ) в течение 3 мин Экспозиции листьев контрольных и опытных растений на свету, при этом часть образцов фиксировали, а часть - помещали в различные условия.

Таблица 7

Радиоактивность аланина во флаговом листе пшеницы Саратовская 29 после 3-мин фотосинтеза в атмосфере ^С02 и последующего выдерживания в различных условиях, имп- ICЙ•мин-'''• образец

Условия опыта 60% ПВ Ж ПВ

3-мин фотосинтез 12,5 + 0,7 24,6 + 1.2

15 мин овета с СО2 3,5 + 0,2 4,8 + 0,1

15 мин света без СО2 7,8 + 0,3 14,0 + 0,6

15 мин темноты 11,0 + 0,5 32,3 + 1,8

Как видно из табл.7 , интенсивное образование аланина в листьях при недостаточной водообеспеченности сопровождалось усилением рбмена его на свату, особенно в вариантах с С0£ в атмосфере. В темноте наблюдалось накопление аланина. Аланин может образовываться при аминировании ФЕП (Тарчевский, 1964). Однако этот фонд малоподвижен. Более вероятно его образование в результате метаболизма С^-кислот:

Аспартат-— Малат-- ПВК--- Аланин

Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о пластичности фотосинтетического метаболизма, позволяет высказать предположение о возможном механизме адаптации фотооинтетического аппарата С^-раотений к длительному воздействию засухи путем осуществления метаболизма С^-киолот, сходного о реакциями в клетках обкладки проводящих пучков аспартатных форм С^-растений и некоторых представителей САМ-растений с НАД-МЗ декарбоксилированием малата.

Экспериментальные данные о метаболизме С^-кислот у С3- растений обобщены в виде схемы /рис.8/.

Рис.8. Возможные реакции участия ферментов метаболизма С4-кислот в фотосинтетическом метаболизме Сд-растений при водном дефиците

ЗАЮШЧЕНИЕ

Результаты сравнительного исследования индукции и роли клю чевых ферментов метаболизма С^-кислот в фотосинтезе Сд-, С^- и САМ-растений выявили принципиальные различия в их функционировании у данных групп растений. Эти различия обусловлены, прежде всего, различной ролью ферментов ФЕП-карбоксилазной системы в метаболизме углерода у растений различных экологических групп.

В настоящей работе обосновывается концепция об индуцибель-ности ключевых ферментов метаболизма С^-кислот и возможности усиления потока СОр у С^-растений через реакции ФЕП-карбоксили-рующей системы при длительном действии водного дефицита. Выдвигается положение об осуществлении в листьях С^-растений метаболизма С^-кислот. Эти кислоты могут быть использованы в качестве источников СО2 для функционирования цикла Кальвина, когда фотосьнтетический СС^-газообмен снижен до уровня, соответствующего "фотосинтезу поддержания" из-за увеличения диффузионного сопротивления листа.

Полученные результаты обобщены на схеме (рис.8). Предпосыл ки для осуществления такой модели у С^-растений имеются: аналогичная последовательность реакций в принципе характерна для кле ток обкладки проводящих пучков аспартатных форм С^-растений и некоторых представителей САМ-растений с НАД-МЭ-типом декарбокси лирования малата, эволюционно близких к С^-растениям; меньшая повреждаемость ключевых ферментов метаболизма С^ -кислот в условиях длительного обезвоживания и повышенной температуры; индукция ФЕПК и переключение углеродного метаболизма с С^ - на САМ в условиях засоления и водного дефицита у некоторых суккулентов с Сд-путем ассимиляции СО^.

Однако поток СО^ через эти ферментативные реакции в листьях С^-растений весьма незначительный и составляет около 15-20$ от общей фиксированной углекислоты с образованием органических кислот и аминокислот (ВадзКа.т,1964). Тем не менее, полученные результаты свидетельствуют о существовании в генотипе С^-расте ний наследственного аппарата, ответственного за развитие биохимических параметров С^-синдрома в зависимости от условий их произрастания. Эти параметры, по аналогии с С^- и САМ-растения-ми, обеспечивают, вероятно, гомеостаз С^-растений в экстремальных условиях.

--"ВЫВОДЫ . , ' '

- I1. Проведено сравнительное й многоплановое исследование :тивности и индукции ключевых' ферментов метаболизма С^-кислов цикла Кальвина.в листьях C-j-, С^- и САМ-растениЙ.в различных ловУ.ях светового, и температурного режимов, а также водного де-[цита. Экспериментальные данные и'теоретические-предпосылки зволили доказать, чте^ принципиальные различия в функци'ониро-нии'ферментов ,ФЕП~карбоксилазн'ой системы у. данных групп расте-;й обусловлены различной ролью их в фотосинтетическом метабо-:"зме„ ' - - .

2. ФЕПК и НАДФ-МЭ ключевые-ферменты м.етабоЛизма С^'-кис-т индуцируются йветем в зеленеющих листьях только у С^-рас-' ний и, следовательно, ,у С^-растений, они являются основными . рментами фотосинтеза; у С^-р&стений с участием' ФЕПК осуществится нефотосинтетическчй метаболизм С^.-кислот.

РБФК/0 и'НАД§«-ГА$Д. -'ферменты цикла Кальвина-- активируют-светом при,становлении фотосинтетического аппарата листа'как растений с €3-, так' и Р^-путем фотос.интеза, и поэтому являют-• ключевыми ферментами обоих типов фиксации COg; однако актив-сть РБФК/0 в -расчете на площадь' листа,, массу и хлорофилл in -tro'- у С^-растений выше, чем. у С^-видов.

3.' В ранние стадии ееленения листа Cg- и С^-растений на(£~ да.ется- положительная' корреляция, между светоактивацкей НАДФ-Э,, РБФК/0, -НАДФ-ГАФД и содержанием, хлорофилла.

,Оптимальной температурой для проявления максимальная етоактиващм ключевых ферментов ФЕЦ^-карбоксилазной оистемы и ^становлении, фЬтосинтетического- аппарата листа С^р^стений ляется 35°.'Вероятно, -повышенный температурный оптимум фото-нте.за' у С^.-растений (30-40°) .объясняется в значительной степе-действием ее на активность ферментов, метаболизма С^-кисл9Т

5." Светоактивация ФВПК_ и НАДФт-МЭ в зеленеющих листьях астений обусловлена- синтезом de novo ферментных- белког, в ( стности, образрванием дополнительного избэнзима ФЕПК с ОЭП-3,25 и синтезом основного изофермента НАДФ-МЭ. , * ^

6. Декарбоксилирование С^-кислот в листьях Bryopbyiluni ligremontianum Влсуществляетея при участии НАД- и. НАДФ-МЭ, * к&ЛизованНых -соответственно в митохондриях и хлоропластах; • и этом активность НАДФ-МЭ нйже (в два раза) активности "НАД. Следовательно, по'аналогии с С^-растениями,,среди САМ-рас-«ий можно выделить третье, ранее неизвестйую подгруппу fl

НАД-МЗ декарбоксилированием С^-кислот.

7. Возраст листа и связанное с ним увеличение активности ферментов метаболизма С^-кислот составляют два механизма, рег} лирувщие суточную ритмику содержания кислот в зрелых листьях ВгуорЬуНип йа^гетогг^апит В.

8. Синтез яблочной кислоты в листьях ВгуорЬуНшп аахзге-шоп11апиш в. происходит как в процессе темновой, так и фотос! тетической фиксации СО2. При этом синтез яблочной кислоты в т< ноте осуществляется путем прямого ^-карбоксилирования ФЕЛ п] участии ФЕПК, локализованной в цитоплазме; на свету же механи: образования яблочной кислоты включает два пути: одноступенчат<

. карбоксилирование ФЕП при посредстве ФЕПК и двухступенчатое -с помощью РБФК/0 и ФЕПК. Прямое карбоксилирование ФЕП с образованием яблочной кислоты в листьях бриофиллума указывает на сходство САМ с С^-фотосинтезом.

9. В листьях и частях колоса пшеницы представлен комплек( ферментов метаболизма С^-кислот, включающий ФЕПК, НАД-МДГ, НА. МДГ, НАД-МЭ, НАДФ-МЭ, АспАТ и АлаАТ; причем значительная акти: ность их проявляется в колосковых чешуях, остях и перикарпиях Основными ферментами, осуществляющими восстановление оксалоац! тата в малат и декарбоксилирование малата, являются, соответственно, НАД-МДГ и НАД-МЭ. Активность ФЕПКК и оксалоацетатде-карбоксилазы не выявлена.

10. При длительной засухе у пшеницы индуцируется активно! ферментов ФЕП-карбоксилазной системы. В результате ее среди продуктов фиксации ^С02 на свету и в темноте усиливается образование С2-, Сд- и С^-кислот (глицина, серина, аланина,треонина, аспарагиновой и яблочной кислот). Интенсивное образова ние аланина в условиях длительного воздействия водного дефици та сопровождается активным обменом его на свету. Алании может образовываться из ФГК - интермедиата цикла Кальвина, однако, этот фонд малоподвижен. Более вероятно его образование на све ту в результате метаболизма С^-кислот:

Аспартат—Малат —- Пируват —- Алании

Выявлена аналогия начальных этапов хода этих реакций в клетках обкладки проводящих пучков аспартатных форм С^-расте-ний и некоторых представителей САМ с НАД-МЭ декарбоксилированием малата.

11. Экспериментальные данные о больией стойкости ферментов метаболизма Сд-кислот (ФЕПК, НАД-Н&Г, НАД-МЭ, АспАТ и Ала

ЛТ) к длительному действию водного дефицита, о взаимосвязи кежду активностью ферментов ФЕП-карбоксилазной системы, цикла Кальвина и длительностью сохранения "фотосинтеза поддержания" у устойчивых к засухе растений позволяют нам обосновать вывод э возможности использования параметров активности ферментов метаболизма С^-кислот наряду с активностью РБФК/0 в качестве критериев для оценки устойчивости фотосинтетического аппарата к водному дефициту.

12. На основании полученных результатов рассматривается возможный механизм адаптации фотосинтетического аппарата к длительному действию водного дефицита. Делается заключение об осу-цествлении в листьях С^-растений метаболизма С^-кислот, сход? ioro с реакциями в клетках обкладки проводящих пучков аспар-гатных форм С^-видов и некоторых представителей СМ с НАД-МЭ цекарбоксилированием малата. Вероятно, последние могут быть ;*спользованы в качестве источников углекислоты для "фотосинтеза поддержания", когда одним из факторов, лимитирующих фото-зинтетический COg-rasooÖMeH, является увеличение диффузионного ¡опротивления листа.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Солдатенков C.B., Ковалева 1.Б., Юзбеков А.К. Механизм гемнового и светозависимого образования яблочной кислоты в ШСТЬЯХ Bryophyllum daigremontianum В.//ВеСТН.ЛвНИНГр. ун-та.-;97б.-Вып.З, H5.-C.II3-II7.

2. Тищенко H.H..Магомедов И.М.,Юзбеков А.К. Влияние азот-юго дефицита на активность ферментов углеродного метаболизма

з листьях кукурузы и бриофиллума//йзучение первичных и вторич-1ых продуктов фотосинтеза и их метаболизма в растениях:Тез. 1.окл.13-го научно-координац.совещ. и симп.СЭВ по теме I-I8.I.-1ушанбе, I977.__C.30.

3. Юзбеков А.К. Светоиндуцированный синтез основных фер-1ентов С^-фотосинтеза//Юбилейная сессия кафедры физиол. и био-:им.растений Ленингр.ун-та,посвящен.IOO-лет.со дн.рожд.С.П.Кос-:ычева.-Л.,1977.-2с.

4. Магомедов И.М., Даниэль-Фалуды А., Юзбеков А..К. О двух >еакциях декарбоксилирования яблочной кислоты в листьях Bryophy-.lum daigremontianum в. //Продуктивность фотосинтезирующих

V * * . • * ' *

- сист'ем в экстремальных .условиях: Тез.докл.Всесосзь!.скип.-- • Улан-Удэ,1978.-С.99-192.. ' • ; - ' ' ■

5. CsöeKoB A.K. Светоиндуцированный синтез ферментов -С^-путн фотосинтеза в этиолированных листьях кукурузы// Вестн,Ленингр.ун-та.-197&.-Вып.I,*3.-С.III-II5.

6. Магомедов И.М., Тищенко'H.H., Юзбеков А.К. Концентри _ рование COg в клетке-- путь повышения продуктивности Сд-раст

ний//Труду по прикл.'ботан. ,генет. и селекции ВНИИ растениево, ства.-1980.-Т.67,Вып.2;-С.100-106. . _ -

7. Тйщенко-H.H., Мдг-омедов И.М., Юзбеков А.К. -Влияние • азотного, дефицита на активность ферментов углеродного метаболизма в листьях кукурузы и бриофиллума//Фотосинтез, дыХание :

обмен* органических кислот.-Воронеж,I980-.-С;20-26". ' . * '8. Юзбеков А.Д., Магомедов И.М. Влияние температура Hai

• синтез карбоксилирующих ферментов в этиолированных листьях pi тений.с Zy. и Gjj- путем фотосинтеза на сЬету/УФотосинтеэ/дых!

* ние и- обмен органических кислот.-Воронеж,' 1980.-0.37-42. -

, 9. Юзбеков А.К;, Магомедов-И.М, Влияние с.вета ра-зличной интенсивности на -активность ферментов синтеза и распада ябло< «ной кислоты 9 зеленеющих листьях C-j-'и С^-растений//Вёс'тн. ' Ленрнгр.ун-та.-1981.-Вып.3,№15.ДС.91г94. ' ' ' IÖ.

• Юзбеков А.К., Магом'едов'И.М. Активность и'локализация НАД и НАДФ-специфичных маликт-энзиков в листьях бриофиллу-ма//Р,егудяция физиологических процессов.-Воронеж ,-1982.-С. 110-

11. Юзбеков А.К.; Магомедов И.М.; Воликов А.Г. Локализация'НАД-малик-фёрйента' в листьях. суккулентов//Труды Лениигр. .сельс-ко'хозяйственного ин-^та.-Пушкин, 1982.^0.112-115-,

12. Узбеков А.К., Магомедов И.М., Быков О ".Д..-Влияние noi шенной концентрации СО^ -на синтез карбоксилирующих ферментов' в зеленеющих листьях Cj- и_С^-растени?//Физиологическ0е дейст

. твие экстремальных факторов на организм животных и растений.--Томск-,1984.-С.107-Ш.^ • _' .

и 13. Юзбеков А.'К.,. Воликов чА.Г., Шматько И.Г., Шведова'О-Влияний засухи на активность'ключевых ферментов фотосинтеза i листьях пшеницы и кукурузы// Современные проблемы биохимии.и физико-хим'ической-биологии: Тез.докл.Всесоюзн.конф.-М.,1985.-■ -С .I7„ ^ , ' ' .

14. Юзбеков А.К., Шишов А1Д,, Абдушаева Я.М. Хозяйствен-

но-биодогическая оценка сортов и гибридов С^-растений в условиях защищенного грунта.-Новгород: Межотраслевой территориальный центр научно-технической информации и пропаганды,1988.~4с.

15. Шведова O.E., Шматько И.Г., Яаташенко О.П., Красник Т.Р., Юзбеков А.К. Реакция изогенных линий яровой пшеницы сорта Саратовская 29 на недостаток влаги и повышенные температуры//Физиология и биохимия культ.растений.-1989.-Т.21,№6.-С.577-582.

16. Юзбеков А.К., Шиатько И.Г., Зведова O.E..Латашенко О.П. Активность ключевых ферментов фотосинтеза и особенности азотного метаболизма у Су и С^-растений в условиях водного стресса//Фи-зиология и биохимия культ.растений.-1989.-Т.21,№6.-С.523-527.

17. Юзбеков А.К. Влияние засухи на активность ключевых ферментов фотосинтеза у различных гибридов кукурузы //Методы интенсификации селекционного процесса.-Одесса,1990.-С.68-69.

18. Юзбеков А.К. Спектрофотометрические способы определения активности ключевых ферментов фотосинтетического метаболизма углерода у Су и С^-растений/Методическое пособие/.-Киев,1990.-32с.

19. Юзбеков А.К. Направленность фотосинтетического метаболизма пшеницы Саратовская 29 при водном стрессе//Воад молодых ученых в интенсификацию сельского хозяйства УССР:Тез.докл.Всесо-юзн.конф.-Киев-Чабаны,1991.-С.56.

20. Юзбеков к.. . Активность ферментов фотосинтетического метаболизма у Су и С^-растений при дефиците азота//Физиолого-генетические механизмы регуляций азотного литания растений: Гез.докл.Всесоюзн.конф.-Киев,1991.-0.44-45.

21. Юзбеков А.К. Способ оценки устойчивости растений к продолжительному обезвоживанию//Рац.предложение №339 (03.02.92г.).

22. Юзбеков А.К. Некоторые параметры водообмена и фотосин-гетичеокого метаболизма у представителей рода Aw.r4i.nt/iu.st,. Актуальные проблемы физиологии растений н генетики:Тез.докл. сонф.молодых ученых.-Каев,1992.-С.23.

23. Юзбеков А.К., Шматько И.Г. Направленность фотосинтети-(еского метаболизма Су и С^-растений при разных условиях водо-|беспеченковтн//Второй съезд Всесовзн.об-ва физиологов растений: 'ез.докл.4.2.-Пущинекий науч.центр РАН, I992.-C.24I.

24. Зайцева H.A., Юзбеков А.К. 1ндукц1я активност! фосфое-олп1руваткарбоксилази та НАДФ-гл1церальдег1д~3-фосфатдег1дро-енази в кугурудзи при дН препарату (г* Зп) ЛС/Д1 Укра1нсь-иЯ бЬх!м1чний з'1зд: Тез.доп.Ч.Ш.-К1ев,1992.-С.22.

25. Юзбеков А.К. Направлен1сть фотосинтетичного метабол1зму Cj- I С^-рослин при р1зних р1внях водозабезпечения/Д1 УкраТ.нь-ський 61ох1м1чний з • 1'зд: Тез .доп. Ч ЛII. -К1ев, 1992. -С. 75.

26. Юзбеков А.К. К вопросу о возможной рола ферментов метаболизма С^-кислот в фотосинтезе пшеницы при водном дефиците// Актуальн! питания ботан!ки та екологП:Тез.доп.-Полтава, 1992,-С.ЗО.

27. Yuzbekov А.К., Uagomedov I.M. Physiological and biochemical characterisation of some representatives of the genus Ama-ranthus L. with different productivity.-Abstracts of Int.Symp. "Amaranth as food, forage and medical culture". Olomouc - Kitra. Czech and Slovak Federal Republic. 1992.P.21.

28. Шматько И.Г., Юзбеков А.К., Шведова О.Е., Латашенко О.Л Водообмен и активность ферментов фотосинтетического метаболизма у гибридов кукурузы и теосинте при разных уровнях водообеспечен-ности//Физиология и биохимия культ.растений.- 1993.-Т.25,№2.--С.I5I-I58.

29. Юзбеков А.К., Магомедов И.М., Шматько И.Г. Способ выращивания амаранта в засушливых условиях//Заявка на изооретение

И 93010077:Приоритетная справка от 15.12.92г.

30. Юзбеков А.К., Шматько И.Г. Тканеспецифическая активное! некоторых ферментов метаболизма С^-кислот и цикла Кальвина у пше иицы при водной дефиците//Физиологкя растений. -1993.-Г. Ч0,№>. -С.902-908.

31. Юзбеков А.К. Роль ферментов метаболизма С^-кислот в фотосинтезе С^-растений при водном дефиците//Третий съезд Всероссийского об-ва физиологов растений: Тез.докл.4.7.-Санкт-Петербург, 1993.-С.774.

32. А.К.Юзбеков, 1.Г. Шматько. Вивчення систем реасимХля-цП СО2 в метабол1зм1 вуглецв у С^-рослин при водному деф1цит1 //Съезд Украинского об-ва физиологов растений:Тез.докл.-Т.2.--Киев,1993.-С.144.

33. Юзбеков А.К. Физиологические основы орошения и окучивания амаранта (Научно-обоснованные рекомендации).-Новгород, 1993.-12о.

34: Юзбеков А.К. Возделывание аиаранта на листоотебельнуп массу и семена(Научно-обоонованные рекомендации).-Новгород, 1993.-16с.