Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез ксиланаз грибами Trichoderma и бактериями p. Bacillus

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез ксиланаз грибами Trichoderma и бактериями p. Bacillus"

На правах рукописи

Скворцов Евгений Владимирович

Биосинтез ксиланаз грибами ТНсИойегта и бактериями р.БасШш

03.00.07 - микробиология 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 2005

Работа выполнена

в Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина и в Татарском научно-исследовательском институте сельского хозяйства

Научный руководитель: Научный консультант: Официальные оппоненты:

Ведущая организация

- кандидат биологических наук, доцент Алимова Ф.К.

- доктор сельскохозяйственных наук, Шакиров Ш.К.

- доктор биологических наук профессор Алимов A.M.

- доктор ветеринарных наук, профессор Хазипов Н.З.

- Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН

Защита состоится « Г» о? .2005 г. в часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (Россия, Казань, Научный городок-2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан && 2005 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Установление закономерностей биосинтеза ксиланаз грибами и бактериями в настоящее время является широко исследуемой и актуальной проблемой. Все большее применение в процессах переработки сельскохозяйственного сырья находит ферментативный гидролиз. Ксиланы являются компонентами зерновых, гидролиз которыхосуществляют ксиланазы, синтезируемые грибами и бактериями.

При исследовании биосинтеза ксиланаз нами использованы культуры известного продуцента целлюлаз и геммицеллюлаз гриба Trichoderma и бактерий p.Bacillus, у которых обнаружена способность к синтезу ксиланаз (ffidenori Т., 2000, Dhillon A, Khanna S, 2000, Sa-Pereira, 2002 и др.). При исследовании синтезированных ксиланаз, нам представлялось важным провести изучение влияния рН и температуры на их каталитические свойства.

Цель и задачи исследования Целью работы было установление закономерностей биосинтеза ксиланаз грибами Trichoderma и бактериями p.Bacillus, а также определение их способности увеличивать гидролизуемость питательных веществ при добавке в кормовые рационы.

В работе решались следующие задачи:

1. Скрининг представителей рода Trichoderma на наличие способности к биосинтезу секретируемых ксиланаз.

2. Скрининг представителей рода Bacillus на наличие способности к биосинтезу секретируемых ксиланаз.

3. Изучение закономерностей биосинтеза ксиланаз Trichoderma и p.Bacillus.

4. Изучение каталитических свойств ксиланаз Trichoderma и p.Bacillus.

5. Изучение увеличения гидролизуемости питательных веществ кормовых рационов при добавлении ксиланаз Trichoderma и p.Bacillus.

Научная новизна работы Установлено принципиальное различие закономерностей биосинтеза ксиланаз у представителей родов Trichoderma и Bacillus. При этом впервые показано, что гриб Trichoderma reesei F-2433

обеспечивает максимальный синтез ксиланаз на среде, содержащей только белок. При наличии в среде культивирования ксилана, наряду с белком происходит снижение синтеза ксиланаз, таким образом, показан конститутивный механизм синтеза фермента. Культура Bacillus circulans на средах, содержащих белок и ксилан, показала индуктивный механизм синтеза ксиланаз. При исследовании В. circulans впервые установлено, что при замене белка в культуральной среде его полным гидролизатом, содержащим соответствующие аминокислоты, происходит резкое снижение синтеза протеолитических ферментов. Результаты проведенных исследований впервые показали, что ксилан является лучшим индуктором синтеза целлюлаз, чем целлюлоза, при культивировании В circulans на белоксодержащих средах. Впервые проведено исследование влияние рН и температуры, соответствующее параметрам среды желудка моногастричных, и гидротермической обработки на изменение активности ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma и Bacillus.

Практическая ценность работы Получены данные о закономерностях биосинтеза ксиланаз Trichoderma и Bacillus, позволяющие получать ксиланазы с заданным спектром сопутствующих активностей. Проведено исследование влияние рН и температуры, соответствующее параметрам среды желудка моногастричных и гидротермической обработки на изменение активности ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma и Bacillus. Разработаны методики снижения антипитательного действия пентозанов при помощи ксиланаз, что позволит специалистам сельского хозяйства правильно подбирать дозировки препаратов ксиланаз в зерновые рационы, содержащих пентозаны.

• Апробация работы Материалы диссертации доложены на 4-х международных конференциях в Москве в 2001, 2003 и 2-х в 2004 г.; на 3-х конференциях в Казани в 2002, 2004 и 2005 г.; на итоговых научных конференциях в ТатНИИСХ РАСХН 2003 и 2004 г.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, литература. Работа содержит 26 таблиц, 47 рисунков. Список литературы включает 129 источников, в том числе 102 иностранных.

1. Материалы и методы исследований

Для решения поставленных задач проведены комплексные исследования штаммов бацилл из коллекции музея лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов, лаборатории сельскохозяйственной микробиологии и кафедры микробиологии КГУ: В. cereus, В. megaterium, В. subtilis (штаммы 1,168,20-36, JH 642), В. mesentericus, В. pumilus КМ62, В. thuringiensis (var. subtoxycus), В. polimyxa, В. circulans, B.ilntermedius (штаммы 7р и 3-19) и штаммы Trichoderma (2,3,10,14,16,18,23), выделенные из почв РТ, а также промышленный штамм T.reesei F-2433 из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

При культивировании исследуемых продуцентов на агаризованной среде использовали для бактерий Bacillus L- агар, для грибов Trichoderma агаризованную среду Чапека.

При культивировании грибов Trichoderma для получения инокулята, агаризованную среду Чапека разливали в чашки Петри. Штаммы засевали «штрихом». Посевы выращивали на агаризованной среде при температуре 28°С, 7 суток. По истечении указанного срока с поверхности колоний водопроводной водой смывали споры грибов. Суспензию спор разбавляли до содержания Ix106 спор/мл-и в дальнейшем использовали в качестве инокулята для засева глубинных культур.

При культивировании бактерий Bacillus для получения инокулята, штаммы бацилл засевали «штрихом» на поверхность скошенного в пробирках L-arapa. Посевы выращивали при 37°С в течение 24-72 часов. По истечении указанного срока с поверхности колоний водой смывали бактериальные споры. Полученную суспензию спор высевали в L - бульон и культивировали при 37°С в течение ночи. Культуральную жидкость в дальнейшем разводили таким образом, чтобы ее

оптическая плотность составляла 0.25±0.05 единиц при ^=590 нм и использовали в качестве инокулята для засева глубинных культур.

Культивирование штаммов в глубинной культуре для биосинтеза ферментов проводили в колбах, содержавших 100 мл среды, которые засевали 2% инокулята. Культуры выращивали 24 - 120 часов на лабораторных качалках с интенсивностью качания 200 об./мин. Клетки отделяли центрифугированием. Пробы для определения биомассы и ферментативной активности отбирали каждые 24 часа. Прирост биомассы определяли по количеству высушенной после осаждения центрифугированием биомассы.

В работе проведено изучение особенностей биохимического состава зерна сортов ржи, районированных в Республике Татарстан. Определение моносахаридного состава нецеллюлозных полисахаридов зерна ржи проводили методом жидкостной хроматографии их кислотного гидролизата (Bartolome В.,2002). Исходя из моносахаридного состава гидролизата, определяли состав нецеллюлозных углеводов исходного материала (Maes С, 2002).

Определение ксиланазной и целлюлазной активности ферментных препаратов, полученных при культивировании продуцентов, проводили (Konig J., 2002) методом исследования увеличения редуцирующих эквивалентов в процессе гидролиза ферментным препаратом, соответственно ксилана (Sigma X0502) и карбоксиметиллцеллюлозы (Fluka, 21901, Analysis no. 365415/1 14398). Активности выражали в международных единицах. Одна единица активности энзима (IU) соответствует количеству фермента, вызывающего выход одного мкМоля восстанавливающих Сахаров в минуту при .гидролизе соответствующего субстрата. Протеолитическую активность определяли по кинетике гидролиза казеина (Каверзнева, 1971). За одну единицу протеазной активности (U) принимали количество фермента необходимого для образования 1 мМ растворимого эквивалента тирозина за 1 мин в пересчете на 1 мл исследуемого раствора.

Специфическую активность рассчитывали как отношение характеризуемой активности фермента к общему количеству биомассы.

Изучены свойства полученных препаратов ксиланаз. Влияние рН изучали используя следующие буферные растворы: ацетатный, рН 4,0-6,0; фосфатный рН 6,0-7,0; Tris-HCl рН 7,5-9,0 (Christakopoulos P., 1996).

При определении влияния температуры на активность ксиланаз (Cobos A., 2003) образцы исследуемых ферментных препаратов в пробирках помещались в водяную баню при соответствующей температуре и убирались при 37°С каждые 30 минут в течение 10 часов, при 55°С каждые 5 минут в течение 60 минут, каждую минуту в течение 10 минут при 60°С, каждые 0.5 минут в течение 2 минут при 65°С и каждые 15 секунд в течение 1.5 минут при 70°С. После охлаждения при 0°С в течение 10 минут образцы исследовались на ксиланазную активность по методике (Konig J.,2002).

В проведении анализа переваримости моногастричных in vitro (Dung N.N.X.,2002) использовалось содержимое кишечника свиньи. Процедура анализа in vitro состояла из четырех этапов. На первом этапе образец помещали в ацетатный буфер и добавляли 0.1 мл термостабильной а-амилазы, инкубировали в водяной бане при 50С в течение 1 часа. На втором этапе в колбу приливали 0.2% пепсина в 0.1Н НС1 затем инкубировали в течение 4 часов в водяной бане с температурой 40°С. На третьем этапе в колбы добавляли инокулюм, содержимого кишечника свиньи и помещали в термостат при 37°С на 36 часов. На последнем этапе образцы инкубировали в изопропаноле при 85°С в течение 8 часов.

2.РЕЗУЛЫАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Скрининг микроорганизмов на способность гидролиза ксиланов

При исследовании грибов Tnchoderma изучены 10 штаммов выделенных из местных почв и штамм промышленного продуцента ферментов T.reesei. Скринин^. Bacillus охватил 13 штаммов бацилл из коллекции музея лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии ЮГУ: В. cereus, В. megaterium, В. subtilis (штаммы /, 168, 20-36, JH642), В. mesentericus,

В. pumilus KM 62, В. thuringiensis (var. subtoxycus), B. polimyxa,, B. circulans, B.intermedius штаммы 7р и 3-19).

Для проведения скрининга нами проведено культивирование грибов Trichoderma и бактерий Bacillus на средах, содержащих пентозаны ржи. Культуральные среды получали щелочной экстракцией дробленого зерна ржи, с последующим отделением, нейтрализацией и корректировкой рН раствора до оптимальных для продуцентов значений. В ходе культивирования продуцентов проводился анализ уменьшения содержания в среде пентозанов, позволявший судить о скорости и глубине гидролиза этих полисахаридов и их использовании продуцентами в качестве источника углерода.

В ходе изучения динамики уменьшения содержания пентозанов при культивировании исследуемых штаммов грибов Trichoderma, все штаммы показали примерно одинаковую степень ассимиляции пентозанов из раствора, около 40%. Максимальную скорость ассимиляции проявил штамм Trichoderma 14. В ходе проведения скрининга бактерий штаммов Bacillus было установлено, что максимальную глубину и скорость ассимиляции пентозанов из раствора штаммы В. cereus, В. circulans, В. intermedius 3 -19 потребляющие около 90% содержащихся в растворе (рис. 1).

Полученные в ходе ферментации культуральные среды, очищенные от биомассы продуцента исследовали на способность уменьшать вязкость ржаных экстрактов. Было проведено изучение кинетики снижения вязкости растворов пентозанов ржи препаратами, полученными при культивировании штаммов Trichoderma

2,3,10,14,16,18,23, выделенных из местных почв, а также промышленного продуцента Т. reesei. Результаты показали, что лучше других снижает вязкость ржаного экстракта препарат, полученный с использованием штамма

Рис.1. Динамика уменьшения содержания пентоз в культуральной среде

Т reesei около 36% вязкости за 2 5 часа Близкие результаты, 25- 30% исходной вязкости, показали препараты грибов, выделенных из почв Tnchoderma 2,18

В ходе проведения скрининга бактерий Bacillus было установлено, что максимальную глубину и скорость ассимиляции пентозанов из раствора проявляют штаммы В cereus, В circulans,, В intermedius 3 -19 потребляющие около 90%, содержащихся в растворе пентозанов Эти же штаммы проявили наибольшую способность к деструкции пентозанов. Самую лучшую способность продемонстрировал препарат В circulans, при применении которого вязкость ржаного экстракта снижалась за 2 часа на 87% Ферменты В cereus также проявили

Высокую активность, снизив вязкость раствора пентозанов ржи в тех же условиях на величину около 82%.

По результатам проведенного обширного скрининга бактериальных и грибных продуцентов ксиланаз нами для дальнейших исследований по оптимизации культуральных сред были отобраны, проявившие лучшие показатели гидролиза и ассимиляции пентозанов штаммы Т.гееве!, ТпсИоёегта 2,14,18и Б.сегем, Б.агеыЬт, В. ШегтеМш 3-19. 2.2. Оптимизация состава культуральных сред для индукции биосинтеза ксиланаз продуцентами

При исследовании влияния содержания белка и ксилана в культуральной среде на ксиланазную активность, синтезированных препаратов Т.гееэе!, выяснилось, что максимальная активность ксиланаз 6.06 Ш/ш1, достигается при культивировании Т.гееэеI на среде, содержавшей лишь белок, в количестве 5 г/л. В целом, наблюдается тенденция снижения ксиланазной активности при увеличении содержания в среде ксилана. Такую же тенденцию сохраняет и специфическая ксиланазная активность. Максимадьные уровни специфической ксиланазной активности отмечены при отсутствии ксиланов в растворе. Это вызвано резким снижением роста культуры гриба и интенсификации синтеза ксиланаз и целлюлаз при отсутствии в среде углеводов (рис.2А).

Т.гееъеI является известным продуцентом целлюлаз, широко применяемом в промышленном синтезе коммерческих препаратов. Большинство технологий биосинтеза целлюлаз проводятся на природных средах, содержащих целлюлозу, геммицеллюлозу, белок растительного происхождения. Нами были проведены сравнительные исследования целлюлозы и ксилана, в качестве источников углерода, при синтезе целлюлаз Т.гееъеI на средах, содержавших белок, в качестве источника азота. Как показали результаты, проведенных нами исследований синтез как ксиланаз, так и целлюлаз Т. гееяе1 активнее происходит на среде, содержащей белок и ксилан, чем белок и целлюлозу. Целлюлоза вызывает заметную активизацию роста биомассы гриба T.reesei. При культивировании T.reeseiна среде,

6 5

■ 6-6 5 055-6

■ 5-5 5 04 5-5

В 4 5-5

■ 4-4 5 03 5-4

■ 3-3 5

1Шт1 5

45

43 5-

Казеин,г/л

Ксилан, г/п

Пептон, г/л

Ксилал,г/л

А

Б

Рис.2. Поверхность уровня ксиланазной активности культуральной жидкости полученной при культивировании T.reesei Аи В атеыкт Б на синтетических средах, содержавших ксилан и белок. Рядом с диаграммами приведена информация о соответствии цвета поверхностей активности ксиланаз.

содержавшей 5 г/л белка и 5 г/л ксилана, за 4 суток, накапливалось биомассы 1.88 мг/мл, а при использовании целлюлозы вместо ксилана, в тех же условиях накапливалось 4.56 мг/мл. Также при использовании целлюлозы проявляется пониженный уровень синтеза ксиланаз- 5.75 Ш/т1 на ксилане и 3.90 Ш/т1 на целлюлозе, что вызывает 4-х кратное снижение специфической активности ксиланаз. Целлюлоза является полимером глюкозы, которая при ферментации, вероятно, выделяется в культуральную среду, ингибирует синтез экзоферментов и ускоряет рост биомассы. Ксилан, являясь полимером ксилозы, не ингибирует синтез экзоферментов и поэтому является более эффективным источником углерода. Исследования влияния состава культуральных сред на активность синтеза ксиланаз В ежикт показали, что максимальное накопление ксиланаз 4.66 Ш/т1 происходит на средах содержащих белок, как источник азота и ксилан в качестве индуктора. При отсутствии в среде ксилана резко уменьшается продукция ксиланаз. В качестве оптимального источника азота для продукции ксиланаз определен белок, хотя как показали проведенные исследования, несколько лучшие показатели продемонстрировали культуры на аминокислотах.

Наличие больших количеств аминокислот в культуральной среде, как показали результаты эксперимента, снижает синтез протеаз.

Нами проведены исследования индукции синтеза целлюлаз B.circulans целлюлозой и ксиланом при культивировании на белоксодержащей среде. При культивировании в течение 48 часов продуцента на среде, содержавшей только белок 5 г/л, получены препараты с активностью целлюлаз 1.28 IU/ml. При добавке в исходную питательную среду целлюлозы активность препаратов снижалась до 0.90 IU/ml. При добавке ксилана целлюлазная активность увеличивалась, в сравнении со средой, содержавшей только белок, до 1.42 IU/ml. Таким образом, показано, что ксилан является более эффективным, чем целлюлоза индуктором синтеза целлюлаз B.circulans.

2.3. Характеристика ксиланаз, полученных на природных средах, содержавших пентозаны

В условиях реального промышленного производства ферментов решающее значение приобретает себестоимость производимого препарата, поэтому с целью ее снижения, индустриальные процессы синтеза ферментов ведутся на средах, приготовленных с использованием природных компонентов. Исследования, проведенные с использованием сред, содержавших чистые химические компоненты, позволили сделать вывод, что оптимальным субстратом для синтеза ксиланаз грибами Trichoderma являются белоксодержащие среды с незначительным содержанием ксиланов, а для культивирования бактерий Bacillus содержащие

5 г/л белка и 5 г/л ксиланов в качестве индуктора. Нами были получены щелочные - экстракты зерна ржи для культивирования грибов Trichoderma, содержавших 0.2% пентозанов, а также водо- и щелоче-растворимую фракцию белков 0.5% и (NH4)2SO4 0.01%, а также незначительное количество других веществ. Для получения сред, близких к оптимальным, для культивирования бактерий Bacillus использовали ржаные отруби. Среды для продукции ксиланаз при культивировании бактерий Bacillus содержали растворенные пентозаны 0.5%, белок 0.2% и (NH4)2SO4 0.01%.

При культивировании грибов на экстракте ржи штаммы Trichoderma 18 и T.reesei показали наибольшую активность синтеза

ксиланаз, 2.30 и 3.60 IU/ml соответственно. Целлюлазная активность Ш/ml препаратов Trichoderma была 1.1-1.6 IU/ml, протеолитическая активность 0.02-0.03 U/ml. Результаты проведенных исследований показали, что почвенные штаммь егта являются продуцентами

ксиланаз, сопоставимыми и даже происходящими T.reesei (табл.1). Сравнивая продуктивность исследованных штаммов видно, что B.circulans превосходит по продукции ксиланаз B.intermedius и B.cereus. Ферментный комплекс B.circulans имел ксиланазную активность 1.90 IU/ml, целлюлазная активность 1.03 IU/ml, протеазную активность 0.48 U/ml (табл.1).

Нами проведены исследования влияния рН и температуры на ксиланазную активность препаратов, полученных на ржаных экстрактах. Результаты показали, что ксиланазная активность ферментных препаратов всех исследованных нами почвенных грибов Trichoderma имеет оптимум рН в районе 5.0-6.0, ксиланазная активность резко снижается при приближении к рН 4 и еще больше снижается при сдвиге рН в щелочном направлении. Культивирование ксиланаз штамма T.reesei в течение 10 часов при рН 2 показало потерю активности всех исследованных образцов около 80%.

Таблица 1

Активность ферментов грибов Trichoderma и бактерийp.Bacillus*

Штамм Ксиланазная активность, I U/т 1 Целлюлазная активность,Ш/т1 Протеолитическая активность, U/ml

T.reesei 3.60+0.25 1.58+0.16 0.03+0.01

Trichoderma 2 1.67+0.21 1.31+0.15 0.03+0.01

Trichoderma 14 1.33+0.20 1.11+0.14 0.02+0.01

Trichoderma 18 2.30+0.22 1.37+0.13 0.02+0.01

B.circulans 1.90+0.2 1.03+0.2 0.48+0.02

B.intermedius 1.20+0.1 1.26+0.2 0.49+0.03

B.cereus 1.80+0.2 1.2110.2 0.5310.03

"(п=3) (а< 0.05)

Ксиланазная активность ферментов, исследованных нами штаммов Bacillus, имеет оптимум рН в районе 8.0, и резко снижается при повышении кислотности среды. При сдвиге рН в щелочную сторону от 8.0 до 9.0 не вызывает значительного снижения активности ксиланаз. Культивирование ксиланаз штаммов Bacillus в течение 10 часов при рН 2 показало потерю активности всех исследованных препаратов около 95%. Результаты продемонстрировали нестабильность бактериальных ксиланаз в сильнокислой среде.

При инкубировании препаратов Trichoderma при 65°С кривые зависимости ксиланазной активности препаратов имеют резкое снижение активности после минутной выдержки, а через 2 минуты препараты теряют 80% активности. А при проведении процесса при 70°С аналогичная потеря активности наблюдается уже через 1 минуту после начала инкубации. При 65 °С препараты синтезированные штаммами B.cereus, B.circulans, сохранили в течение 2 минут 85-95% активности. При проведении процесса при 70°С за 90 секунд инкубации ксиланазы, синтезированные штаммами B.cereus, В circulans сохранили 75-90% активности.

Такая повышенная термостойкость ксиланаз B.cereus, B.circulans делает перспективным их применение в процессах предварительной обработки зерновых рационов, содержащих рожь, предусматривающих тепловую обработку.

2.4. Применение ксиланаз в кормовых рационах

Исходя из исследованных свойств, полученных грибных и бактериальных -препаратов -ксиланаз,. -нами .принято .решение исследовать, добавки препаратов T.reesei, проявивших большую устойчивость при рН=2, в модельных экспериментах по переваримости in vitro зерновых рационов.

Основными зерновыми злаковыми культурами, выращиваемыми сельским хозяйством РТ являются пшеница, рожь и ячмень. Для оценки кормовых характеристик было проведено исследование 4-х районированных в Татарстане сортов ржи: «Эстафета Татарстана», «Радонь», «Татарская» и «Огонек», а также фуражных образцов ржи, пшеницы и ячменя. Нами проведены исследования,

Таблица 2

Моделирование переваримости in vitro рационов, содержащих 50% ржи с добавками ксиланаз Trichoderma, % ВСВ*

Состав рациона Содержание ксиланаз,Ш/г

0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

Рожь фуражная + Пшеница фуражная +Т. reesei 53.4 ±0.8 55.6 ±0.7 57.0 ±0.7 58.9 ±0.7 59.7 ±0.7 60.3 ±0.7 60.5 ±0.7

Рожь фуражная + Пшеница фуражная +Т. 18 53.4 +0.8 55.8 ±0.7 58.0 ±0.7 59.3 ±0.8 60.0 ±0.7 61.7 ±0.6 61.9 ±0.8

Рожь фуражная + Ячмень фуражный + Т. reesei 50.5 ±0.6 52.6 ±0.6 53.5 ±0.6 54.9 ±0.6 55.1 ±0.6 56.6 ±0.6 56.8 ±0.7

Рожь фуражная + Ячмень фуражный+Т.18 50.5 ±0.6 53.7 ±0.6 55.9 ±0.6 56.9 ±0.6 57.1 ±0.5 58.1 ±0.5 58.1 ±0.8

*(п=3) (а< 0.05)

включавшие показатели полного зоотехнического анализа и состав углеводной фракции зерна злаков. Результаты показали, что все зерновые содержат крупную фракцию крахмала, являющегося важнейшим источником глюкозы, необходимой для энергетического обмена сельскохозяйственных животных. Однако переваривание питательных веществ, содержащихся в составе зерновых, затрудняется наличием некрахмалистых углеводов, и прежде всего пентозанов. Результаты анализов показали, что в составе зерна всех злаков содержится значительное количество пентозанов. Наибольшее их количество 9.9-11.1 % содержит рожь, именно это обстоятельство не позволяет использовать ее в качестве основы кормовых рационов. Меньше пентозанов содержат пшеница до 6.8% и ячмень до 7.2%.

Таблица 3

Моделирование переваримости in vitro рационов, содержавших рожь, _с добавками ксиланаз B.circulans, % ВСВ*_

Состав рациона Содержание ржи в рационе, %

0 10 20- 30 40, 50 60 70

Рожь фуражная + Пшеница фуражная без обработки 85.0 ±4.2 84.1 ±4.6 84.0 ±4.2 74.9 ±4.6 62.0 ±4.0 53.4 ±4.8 52.5 ±4.8 50.0 ±4.8

Рожь фуражная + Пшеница фуражная с обработкой 85.0 ±3.2 85.1 ±4.6 85.2 ±3.2 84.0 ±3.6 82.0 ±4.0 83.0 ±3.8 82.0 ±4.8 80.2 ±3.8

Рожь фуражная + Ячмень фуражный без обработки 80.0 ±4.9 79.1 ±4.6 78.5 ±4.2 66.9 ±4.0 52.1 ±4.0 50.5 ±4.8 48.0 ±4.7 48.0 ±4.9

Рожь фуражная + Ячмень фуражный с обработкой 80.0 ±4.9 79.2 ±3.6 78.4 ±3.2 76.9 ±3.0 72.2 ±4.0 70.2 ±3.8 70.0 ±4.7 70.3 ±3.9

*(п=3) (а< 0.05)

Исследование влияния добавок ксиланаз Trichoderma на гидролизуемость зерновых .кормовых рационов, содержащих 50% ржи установлено повышение переваримости в модельных экспериментах in vitro на 4.4-5.2%, по сравнению с контролем без ксиланаз (табл.2). В исследованиях определены оптимальные нормы ввода ксиланаз. Выявлено, что для кормовых рационов из зерносмесей, содержащих 50% ржи оптимальная дозировка ксиланаз- 0.20-0.25 Ш/г. Нами проведены исследования применения термостойких препаратов ксиланаз, полученных при культивировании B.circulans при предварительной тепловой обработке зерновых рационов, содержащих рожь. Результаты проведенных исследований моделирования переваримости in vitro показали (табл.3), что внесение ксиланаз B.circulans при гидротермической обработке обеспечивает повышение, на 22-30% гидролизуемости зерносмесей.

Заключение

Представители бактерий рода Bacillus и грибы рода Trichoderma являются продуцентами ксиланаз. Нами установлена роль углеводных и азотсодержащих компонентов культуральной среды в индукции синтеза ксиланаз грибами рода Trichoderma и бактериями рода Bacillus. Исследована динамика снижения активности ксиланаз бактерий рода Bacillus и грибов рода Trichoderma в диапазоне рН 2-9 и температуры 37-70°С.

Проведены модельные эксперименты по исследованию переваримости in vitro зерновых рационов, содержащих рожь, с добавками ксиланаз. Исследованиями определены оптимальные нормы ввода ксиланаз в зерновые рационы. Исследована тепловая обработка зерновых рационов с применением ксиланаз.

ВЫВОДЫ

1. Исследования показали, что максимальная активность ксиланаз получена при культивировании гриба T.reesei на среде, содержавшей только белок.

2. При наличии в среде культивирования T.reesei ксилана, наряду с белком, происходит снижение активности ксиланаз, таким образом, показан конститутивный механизм синтеза ксиланаз грибом T.reesei.

3. Культура бактерий B.circulans на средах, содержащих белок и ксилан показала индуктивный механизм биосинтеза ксиланаз.

4. Установлено, что при замене белка в культуральной среде B.circulans его полным гидролизатом происходит резкое снижение активности протеолитических ферментов.

5. Показано, что ксилан является лучшим индуктором биосинтеза целлюлаз, чем целлюлоза, при культивировании B.circulans на белоксодержащих средах.

6. Установлена высокая стабильность ксиланаз Trichoderma в кислой среде рН 2, соответствующей среде желудка моногастричных

животных.

7. При рН 7 и температуре 60-70°С, что соответствует параметрам гидротермической обработки кормов высокую стабильность проявили ксиланазы p. Bacillus.

8. Установлена оптимальная доза ксиланаз Trichoderma 0.20-0.25 Ш/г, обеспечивающая, при добавке к зерносмесям, содержащим рожь, повышение их гидролизуемости на 4.5-5.2%.

9. Внесение 0.75 IU/г ксиланаз В. circulans при гидротермической обработке зеносмесей, содержащих рожь, обеспечивает повышение их гидролизуемости на 22-30%.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1.Ha основании результатов проведенных нами исследований считаем возможным рекомендовать при использовании грибов Trichoderma при производстве ксиланаз применять среды с низким содержанием растворенных углеводов и содержанием белка не ниже 5 г/л, что обеспечит активизацию синтеза ксиланаз и замедление роста биомассы грибов.

2.Результаты проведенных нами исследований позволяют рекомендовать организацию производства ксиланаз В-circulans.

3.Исследования показали возможность гидролиза 70% АСВ зерна ржи при применении ксиланаз бактерий В.circulans при тепловой обработке, что позволяет рекомендовать их к применению в кормовой и пищевой промышленности.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Скворцов Е.В., Соснина НА, Лапин А.А., Минзанова СТ., Миронов

B.Ф., Коновалов А.И. Новые подходы к процессу извлечения белковых фракций из фитомассы амаранта// Материалы международной научной конференции «От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии».-Москва,Тверь.-2001.-

C.67.

2.Скворцов Е.В., Соснина НА., Лапин АА., Минзанова СТ., Миронов В.Ф., Коновалов А.И., Барбю У.Е. Новые подходы к процессу извлечения белка из высушенной фитомассы амаранта// В сб."Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты", М.: РАЕН, 2001, вып.5., С.28-36.

3.Скворцов Е.В., Выштыкалюк А.Б., Миронов В.Ф. Оценка питательной ценности растительного белкового концентрата, полученного из зеленой массы амаранта// Материалы научной конференции «Химия и технология растительного сырья».-Казань.-2002.-С.22-23.

4.Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Соснина НА, Миронов В.Ф. Культивирование гриба p. Trichoderma на растительном сырье// Химия и компьютерное моделирование, №7.-2002.- С.57-60.

5.Skvortsov E.V. Extraction and isolation of rye pentosanes// Тезисы международной конференции «Актуальные проблемы иноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов».- Москва, РАЕН.-2003.-С.187

6.Скворцов Е.В. Экстракция и выделение концентратов пентозанов ржи// В сб. "Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты", М.:РАЕН,2003, вып. 9, С. 14 -18.

7.Скворцов Е.В. Исследование методов получения концентратов белка ржи. Химия и компьютерное моделирование, №1.- 2004.- С.36-38.

8.Скворцов Е.В. Абузярова Д.М.,Халилуллина А.К.,Турбатова Р.И.,Салем М., Алимова Ф.К. Использование грибов рода Trichoderma для гидролиза пентозанов зерновых культур// Тезисы докладов И международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004».-Москва,МГУ.-2004.-С4

9.Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Абузярова Д.М. Исследование изменения состава культуральной среды при биосинтезе ксиланаз грибом Trichoderma reeseill Тезисы докладов конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии».- Казань, КГУ.-2004.-С.78

10. Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Егоров С.Ю., Гарусов А.В., Абузярова Д.М., Халиллулина А.К., Тухбатова Р.И. Использование триходермина в сельском хозяйстве республики Татарстан// Тезисы докладов конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии».-Казань,КГУ.-2004.-С.94

ll.Skvortsov E.V. HPLC application for technology and feed characteristics of rye// Тезисы международной конференции «Актуальные проблемы иноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов».- Москва, РАЕН.- 2004,- С.184

12.Скворцов Е.В. Применение методов ВЭЖХ для оценки кормовых и технологических качеств ржи// В сб."Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты", М.:РАЕН, 2004, вып. 11, часть 2.-С. 52-56.

13.Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Абузярова Д.М. Исследование ферментных препаратов грибов Trichoderma, гидролизующих пентозаны ржи//Вестник Татарстанского отделения Российской Экологической Академии, 2 (20).-2004.-С.14-18

14. Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Вершинина В.И., Халилуллина А.К., Абузярова Д.М. Исследование ферментных препаратов грибов Trichoderma и бактерий Bacillus, деградирующих трудногидролизуемые компоненты растительной биомассы. Материалы научной коференции «Проблемы биотехнологии в сельском хозяйстве».- Казань, КГСХА.-2005.-С.31-32

15.Тухбатова Р.И., Абузярова Д.М., Халиллулина А.К., Скворцов Е.В., Алимова Ф.К. Изучение ферментативной активности гриба Trichoderma. Тезисы -докладов XIII .международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функция, применение».- Казань, КГУ.-2005.-С.210

Подписано к печати 30 05 05. Формат 60x90 V16 Печать на RISO. Уел печ. л 1,25. Тираж 100 Договор № 2

Лаборатория оперативной печати ТГТИ 204

420036, г. Казань, ул Побежимова, 47а, тел. 711429

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Скворцов, Евгений Владимирович

ВВЕДЕНИЕ 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биосинтез ксиланаз микроорганизмами и их свойства

1.1. Характеристика грибных ксиланаз

1.1.1 Ксиланазы грибов

1.1.2 Ксиланазы грибов Trichoderma

1.2. Характеристика бактериальных ксиланаз

1.2.1 Ксиланазы бактерий

1.2.2 Ксиланаз бактерий Bacillus

1.3. Методы анализа пентозанов и ксиланазной активности

2. Применение ферментных препаратов ксиланаз

2.1. Применение ксиланаз в кормах сельскохозяйственных животных

2.2. Анализ ксиланазной активности в кормах

2.3. Применение ксиланаз в перерабатывающей промышленности 43 Заключение

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследований

Результаты исследований

1. Скрининг микроорганизмов па способность гидролиза пентозанов

1.1. Скрининг ксиланазной активности грибов Trichoderma

1.1.1. Культивирование продуцентов на жидких средах

1.1.2. Исследование изменения вязкости растворов, содержащих пентозаны под действием ферментов

1.2. Скрининг ксиланазной активности бактерий Bacillus 68 1.2.1. Культивирование продуцентов на жидких средах

1.2.2. Исследование изменения вязкости растворов, содержащих пентозаны под действием ферментов

2. Оптимизация состава питательных сред для индукции биосинтеза ксиланаз продуцентами

2.1. Оптимизация содержания ксиланов и белка в питательной среде

2.2. Использование целлюлозы для синтеза ксиланаз микроорганизмами

2.3. Роль углеводных мономеров в качестве регуляторов биосинтеза ксиланаз

2.4. Определение оптимального источника азота 88 V* 2.5.0пределение оптимального состава синтетических сред для максимальной продукции ксиланаз

2.5.1 Состав сред для грибов Trichoderma

2.5.2 Состав сред для бактерий Bacillus

3. Характеристика ксиланаз, полученных на природных средах, содержавших пентозаны

3.1. Получение сред, содержащих пентозаны

3.2. Биосинтез ксиланаз грибами Trichoderma

3.3. Биосинтез ксиланаз бактериями Bacillus

3.4. Ксиланазы изолятов Trichoderma

3.4.1. рН оптимум ксиланаз

3.4.2. Влияние температуры на активность ксиланаз

3.5. Ксиланазы бактерий Bacillus 111 3.5.1. рН оптимум ксиланаз 111 3.5.2 Влияние температуры на активность ксиланаз

4. Применение ксиланаз в кормовых рационах

4.1. Увеличение гидролизуемости при добавках ксиланаз в зерновые рационы

4.2. Применение ксиланаз при гидротермической обработке зерновых рационов

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез ксиланаз грибами Trichoderma и бактериями p. Bacillus"

Актуальность проблемы Установление закономерностей биосинтеза ксиланаз грибами и бактериями в настоящее время является широко исследуемой и актуальной проблемой. Все большее применение в процессах переработки сельскохозяйственного сырья находит ферментативный гидролиз. Ксиланы являются компонентами зерновых, гидролиз которых осуществляют ксиланазы, синтезируемые грибами и бактериями.

При исследовании биосинтеза ксиланаз нами использованы культуры ^ известного продуцента целлюлаз и геммицеллюлаз гриба Trichoderma и бактерий p.Bacillus, у которых обнаружена способность к синтезу ксиланаз (Hidenori Т. et al., 2000, Dhillon A, Khanna S. et al. 2000, Sa-Pereira. et al. 2002). При исследовании синтезированных ксиланаз, нам представлялось важным провести изучение влияния рН и температуры на их каталитические свойства.

Цель и задачи исследования Целью работы было установление закономерностей биосинтеза ксиланаз грибами Trichoderma и бактериями p.Bacillus, а также определение их способности увеличивать гидролизуемость питательных веществ при добавке в кормовые рационы.

В работе решались следующие задачи:

1. Скрининг представителей рода Trichoderma на наличие способности к , биосинтезу секретируемых ксиланаз.

2. Скрининг представителей рода Bacillus на наличие способности к биосинтезу секретируемых ксиланаз.

3. Изучение закономерностей биосинтеза ксиланаз Trichoderma и p.Bacillus.

4. Изучение каталитических свойств ксиланаз Trichoderma и p.Bacillus.

5. Изучение увеличения гидролизуемости питательных веществ кормовых рационов при добавлении ксиланаз Trichoderma иp.Bacillus.

Научная новизна работы Установлено принципиальное различие закономерностей биосинтеза ксиланаз у представителей родов Trichoderma и Bacillus. При этом впервые показано, что гриб Trichoderma reesei F-2433 обеспечивает максимальный синтез ксиланаз на среде, содержащей только белок. При наличии в среде культивирования ксилана, наряду с белком происходит снижение синтеза ксиланаз, таким образом, показан конститутивный механизм синтеза фермента. Культура Bacillus circulans на средах, содержащих белок и ксилан, показала индуктивный механизм синтеза ксиланаз. При исследовании В. circulans впервые установлено, что при замене белка в культуральной среде его полным гидролизатом, содержащим соответствующие аминокислоты, происходит резкое снижение синтеза протеолитических ферментов. Результаты проведенных исследований впервые показали, что ксилан является более эффективным индуктором синтеза целлюлаз, чем целлюлоза, при культивировании В.circulans на белоксодержащих средах. Впервые проведено исследование влияние рН и температуры, соответствующее параметрам среды желудка моногастричных, и гидротермической обработки на изменение активности ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma и Bacillus.

Практическая ценность работы Получены данные о закономерностях биосинтеза ксиланаз Trichoderma и Bacillus, позволяющие получать ксиланазы с заданным спектром сопутствующих активностей. Проведено исследование влияние рН и температуры, соответствующее параметрам среды желудка моногастричных и гидротермической обработки на изменение активности ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma и Bacillus. Разработаны методики снижения антипитательного действия пентозанов при помощи ксиланаз, что позволит специалистам сельского хозяйства правильно подбирать дозировки препаратов ксиланаз в зерновые рационы, содержащих пентозаны.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на 4-х международных конференциях в Москве в 2001, 2003 и 2-х в 2004 г.; на 3-х конференциях в Казани в 2002, 2004, 2005 г.; на итоговых научных конференциях в ТатНИИСХ РАСХН 2003 и 2004 г.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Скворцов, Евгений Владимирович

выводы

1. Исследования показали, что максимальная активность ксиланаз получена при культивировании гриба T.reesei на среде, содержавшей только белок.

2. При наличии в среде культивирования T.reesei ксилана, наряду с белком, происходит снижение активности ксиланаз, таким образом, показан конститутивный механизм синтеза ксиланаз грибом T.reesei.

3. Культура бактерий В. circulans на средах, содержащих белок и ксилан показала индуктивный механизм биосинтеза ксиланаз.

4. Установлено, что при замене белка в культуральной среде В.circulans его полным гидролизатом происходит резкое снижение активности протеолитических ферментов.

5. Показано, что ксилан является лучшим индуктором биосинтеза целлюлаз, чем целлюлоза, при культивировании В.circulans на белоксодержащих средах.

6. Установлена высокая стабильность ксиланаз Trichoderma в кислой среде рН 2, соответствующей среде желудка моногастричных животных.

7. При рН 7 и температуре 60-70°С, что соответствует параметрам гидротермической обработки кормов высокую стабильность проявили ксиланазы p.Bacillus.

8. Установлена оптимальная доза ксиланаз Trichoderma 0.20-0.25 IU/r, обеспечивающая, при добавке к зерносмесям, содержащим рожь, повышение их гидролизуемости на 4.5-5.2%.

9. Внесение 0.75 IU/r ксиланаз В.circulans при гидротермической обработке зерносмесей, содержащих рожь, обеспечивает повышение их гидролизуемости на 22-30%.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скворцов, Евгений Владимирович, Казань

1.Алимова Ф.К., Мако Гулам А., Захарова Н.Г., Дегтярева И.А. Опыт применения триходермина в Республике Татарстан на основе, местных видов микромицетов рода Trichoderma. Нива Татарстана, 2000, №2, С.22-24

2. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. Методы исследования мяса и мясных продуктов.-М.: Колос, 2001.-С.376

3. АПК: экономика, управление, 11, 2003.-е.10, О состоянии сельского хозяйства Российской Федерации в 1998-2002 гг.

4. Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии.-М.:Химия,1976.-С.512

5. Геллер И.Т., Беркутова И.Б., Переверзева А.Л. Рост и развитие гриба Trichoderma horzianum на гранулированных питательных средах. В сб. «Биотехнология микроорганизмов в сельском хозяйстве».-М.:Издательство МСХА,1989.-С.351

6. ГОСТ9268-90 Комбикорма- концентраты для крупного рогатого скота

7. ГОСТ Р51550-2000 Комбикорма- концентраты для свиней

8. ГОСТ 18221-99 Комбикорма полнорационные для сельскохозяйственной птицы

9. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов.-М.: Агропромиздат, 1987.-С.335

10. Ю.Голенков В.Ф., Траунберберг Г.Д. Изучение набухающих и растворимых в воде углеводов озимой ржи. Прикладная биохимия и микробиология. 1966, т.2, №1, С.27-37

11. П.Ермаков А.И.,Арасимович В.В.,Смирнова-Иконникова М.И., Ярош Н.П., Луковникова Г.А. Методы биохимического исследования растений.-Л. :Колос, 1972.-С .276

12. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов.-М.: Издательство АН СССР, 1963.-С.245

13. И.Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеиназ. Прикладная биохимия и микробиология. 1971, т.7, №2, С.225-228

14. Казаков Е.Д.,Кретович В .Л. Биохимия зерна и продуктов его переработки.-М.:Колос,1980.-С.319

15. Кретович В.Л. Биохимия зерна и хлеба.-М.:Наука,1991.-С.136

16. Кретович В.Л.,Петрова И.С. Исследование слизей ржаного зерна. Биохимия. 1947, т.12, №2, С.97-101

17. Кретович В.Л., Петрова И.С. Слизи ржаного зерна и их технологическое значение. В сб. «Биохимия зерна».-М.:Издательство МСХА, 1951, №1, С.145-159

18. Маркович Н.А.,Кононова Г.Л. Литические ферменты Trichoderma и их роль при защите растений от грибных болезней (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. 2003, т.39, № 4, С.З89-400.

19. Нуртдинов М.Г. Ферментные препараты в животноводстве.-Казань: Фэн, 2002.-С.96.

20. Овчинников Ю.А. Биоорганичееская химия.-М.:Просвещние,1987.-С.815.21.0колелова Т.М., Кулаков А.В., Молоскин С.А., Грачев Д.М. Корма и ферменты.-Сергиев Посад, ВНИТИП, 2001.-С.122.

21. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.-М.:Мир, 1978.-С.331.23 .Пономарева М.Л., Пономарев С.Н. Современные тенденции производства зерна ржи и задачи селекции в Татарстане. Нива Татарстана, 2000, №1, С.7-8.

22. Чичибабин А.Е. Основные начала органической химии.-М. Государственное научно-техническое издательство химической литературы, 1954.-С.795.

23. Шакиров Ш.К., Бикташев Р.У, Нуртдинов М.Г., Гибадуллина Ф.С., Садриева P.P., Макарова Т.А., Хакимов Р.К., Мадышев И.Ш., Касимова А.Ш. Рациональное использование ферментов в животноводстве.-Казань, Издательство «Мастер Лайн», 2003.-С.52.

24. Шарков В.И., Сапотницкий С.А., Дмитриева О.А. Технология гидролизных произволств.-М.:Лесная промышленность, 1973.- С.408.

25. Aguilar G., Trejo В.А., Garcia J.M., Huitron С. Catalytic characteristics of Bacillus sp. enzymes // Can.J.Microbiol.-1991.-V. 11.- P.912-917.

26. Albersheim P., Nevins D.J., English P.D., Karr A. Alditol acetates analysis// Carbohydr. Res.-1967.- 5.- P. 340-345.

27. Annison G., Choct, M. Antinutritive activities of cereal non-starch polysaccharides in broiler diets and strategies for minimizing their effects //World's Poultry Science Journal.-1991.-47.-P. 232-242.

28. Aspinal G.O., Sturgeon R.G. Cereal gums. The constitution of an araboxylan from rye flour //J.Chemical Society.-1957.-34.-P.4469-4471.

29. Aspinal G.O., Greenwood C.T. Aspects of the chemistry of cereal polysaccharides//J.of the Inst, of Brewing-1962.-V.68, №4.-P.167-178.

30. Azuma J., Koshijima T. Enzymatic hydrolysis of wood wastes// Wood Research Technical.- 1981.- Note 16.-P.63-96.

31. Bailey M.J., Buchert J., Viikari L. Effect of pH on production of xylanase by Trichoderma reesei on xylan- and cellulose- based media// Appl.Microbiol. Biotechnol.-1993.-40.-P. 24-229.

32. Bartolome В., Santos M., Jimenez J.J. Pentoses and Hydroxycinnamic Acids in Brewer's Spent Grain// Journal of Cereal Science.-2002.-36.-P.51-58.

33. Bedford M.R. Mechanism of action and potential environmental benefits from the use of feed enzymes// Animal Feed Science and Technology.-1995.- 53.-P. 145—155.

34. Benamrouche S., Cronier D., Debeire P., Chabbert B. A Chemical and Histological Study on the Effect of (l-4)-p -endo-xylanase treatment on wheat bran// Journal of Cereal Science.- 2002.-V. 36, Issue 2.-P.-253-260.

35. Bengtsson S., Aman P. Isolation and chemical characterization of water-soluable arabinoxylans in rye grain// Carbohydr. Polym.- 1990.-12.-P.267-277.

36. Bengtsson S.; Anderson R.; Westerlund E.; Aman P. Content, structure and viscosity of soluble arabinoxylans in rye grain from several countries// Journal of the Science of Food and Agriculture.- 1992.-58.- P.331-337.

37. Bisaria V. S.; Mishra, S. Regulatory aspects of cellulase biosynthesis and secretion// Crit. Rev. Biotechnol.-1989.-9.- P.61-103.

38. BocchiniD.A., Alves-Prado H. F., Baida L.C., Roberto I.C., Gomes E.,

39. Da Silva R. Optimization of xylanase production by Bacillus circulans D1 in submerged fermentation using response surface methodology// Process Biochemistry.-2002.-10.-P.727-731.

40. Boros D. Prospects of greater utilization of rye in animal feeding and human consumption. In proceedings of Eucarpia rye Meeting, edited by Plant breeding and acclimatization Institute, Radzikow, Poland.-2002.-P.401.

41. Bruell C., Saddler J.N. Substrates influence on reducing equivalents by dinitrosalicilic reagent assay// Enzyme Microb. Technol.-l985.-7.-P.327-332.

42. Campbell G.L.; Bedford M.R. Enzyme application for monogastric feeds: a review// Canadian Journal of Animal Science.-1992,- 72.-P. 449-466.

43. Cardoso J.P, Emery A.N. A new model to describe enzyme inactivation// Biotechnol Bioeng.-1978.-20:1471.-P.7-13.

44. Chinshuh C, Chen J., Lin T. Purification and characterization of a xylanase from Trichoderma longibrachiatum for xylooligosaccharide production// Enzyme and Microbial Technology.- 1997.-V.21, Issue 2.-P. 91-96.

45. Cleemput G., Roels S.P., Van Oort M., Grobet P.J., Delcour J.A. Heterogeneity in structure of water-soluable arabinoxylans in European wheat flours of variable bread-making quality//Cereal Chem.-1993.-70.-P.324-329.

46. Cobos A., Estrada P. Effect of polyhydroxylic cosolvents on the thermostability and activity of xylanase from Trichoderma reesei QM 9414П Enzyme and Microbial Technology.-2003.-33.-P.810-818.

47. Colina A., Sulbaran-De-Ferrer В., Aiello C., Ferrer A. Xylanase production by Trichoderma reesei Rut C-30 on rice straw //Applied Biochemistry and Biotechnology.-2003.-V.l08,Issue 1-3.-P.715- 724.

48. Cosson Т., Perez Vendrell A.M., Teresac B.G., Renfe D., Taillade P. Enzymatic assays for xylanase and b-glucanase feed enzymes// Animal Feed Science and Technology.-1999.- 77.-P.345-353.

49. Csizar E., Urbanszki K., Szakacs G. Biotreatment of desired cotton fabric by cellulase and xylanase enzymes// J.Mol.Catal.-2001.-l 1, №4.-P. 1065-1072.

50. Cyran M., Cygankiewicz A. Content and composition of non-starch polysaccharides of rye in relation to its baking quality. In proceedings of Eucarpia rye Meeting, edited by Plant breeding and acclimatization Institute, Radzikow, Poland.-2002.-P.401.

51. Dhillon A., Khanna S. Production of a thermostable alkali-tolerant xylanase from Bacillus circulans AB 16 grown on wheat straw// World Journal of Microbiology and Biotechnology.- 2000.-27(3).-P.325-327.

52. Dische Z. Reducing equivalents assay// J.Biol.Chem.-1949.-147.-P.181-182.

53. Doppelbauer R., Esterbauer H., Steiner W., Lafferty R.M., Steinmuller H. The use of lignocellulosic wastes for production of cellulases by Trichjderma reeseiH Appl. Microbiol. Biotechnol.-1987.-26.-P.485-494.

54. Drews E. Die Einflub des Pentasanfaktors auf das Amylogramm von Roggen und Roggenmahlprodukten// Getreide und Mehl.-1966.-8.-P.83-89.

55. Drews E. Der Einflub der Roggenmehlpentosane auf die Teigausbeute und die Beschaftenheit des Roggenmehlteiges// Dtsch.-Muller-Ztg.-1966.-64, №5.-P. 102-106.

56. Drews E. Die Bedeutung der Schleimstoffe fur die Bewertung der Roggenqualitat// Getreide und Mehl.-1966.-h.3.-P.21-26.

57. Dung N.N.X., Ude P. Estimation of neutral detergent fibre degradation in pigs by an in vitro method// Animal feed science and technology.-2002.- 95.-P.205-214.

58. Elliott G.O., McLauchlan W.R., Williamson G. P. Kroon A. Wheat xylanase inhibitor protein (XIP-I) accumulates in the grain and has homologues in other cereals//Journal of Cereal Science.-2003.-V.37, Issue 2.-P.187-194.

59. Farani de Souza D, Giatti Marques de Souza C., Peralta R. Effect of easily metabolizable sugars in the production of xylanase by Aspergillus tamarii in solid-state fermentation// Process Biochemistry.-2001.-V.36,Issues 8-9.- P.835-838.

60. Fincher, G.B.; Stone, B.A. Cell walls and their components in cereal grain technology// Advances in cereal science and technology.- 1986.-V.8.-P.207-295.

61. Forouni E., Gunn D.J. Variability of DNSA method's results// Biotechnol Bioeng.-1983.-25.-P.1905-1911.

62. Fu-hong X. Изучение необработанной ксиланазы продуцируемой Trichoderma sp.№183ll J.Yunnan Univ. Natur.Sci.-2003.-25, №l.-P.81-84.

63. Fujimoto, Z. Isolation of Streptomyces olivaceoviridis xylanase // J. Mol. Biol.- 2000,- 300.-P. 575-585.

64. Girhammar U.; Nair B.M. Certain physical properties of water-soluble non-starch polysaccharides from wheat, rye, triticale, barley and oats// Food Hydrocolloids.-1992.-6.-P.329-343.

65. Haapala R.,Parkkinen E.,Suominen P.,Linko S. Production of endo-l,4-{3-glucanase and xylanase with nylon-web immobilized and free Trichoderma reesei!I Enzyme and Microbial Technology.-1996.-18.-P.495-501.

66. Hakomori S.O-methylated derivatives carbohydrates// Biochemistry J.-1964.-55.-P.205-208.

67. Haseborg E. Polymeric components in cereal// Flimenta.-1988.-V.8.1.-P.9-10.

68. Haseborg E., Himmeelstein A. Microbiologic infections in cerial grain// Cereal Food World.-1988.-V.3.№5.-P.419-422.

69. Henry, R.J. Genetic and environmental variation in the pentosan and 13-glucan contents of barley and their relationship to malting quality// Journal of Cereal Science.-1986.- 4.-P.269-277.

70. Hew L.I., Ravindran V., Mollah Y., Bryden W.L. Influence of exogenous xylanase supplementation on apparent metabolisable energy and amino acid digestibility in wheat for broiler chickens// Animal Feed Science and Technology.-1998.-75.-P.83-92.

71. Hidenori Т., Ryuichiro N., Satoshi N. Purification and partial characterization of a basic xylanase produced by thermoalkaliphilic Bacillus sp. Strain TAR-1И Biotechnol. and biochem.-2000.- №4.-P.887-890.

72. Honda H. Chromatography enzymatic hydrolyzed polysaccharides// Agric. Biol. Chem.-l985.-49.-P.3165-3169.

73. Jagruti G.P., Koteswara R.K., Prafulla D.J. Characterization of extracellular thermostable xylanase from Chaetomium Globosum //J. Chem. Technol. and Biotechnol.- 1994.- 60, №1.- P.55-60.

74. Jamroz D., Jakobsen K., Knudsen K., Wiliczkiewicz A., Orda J. Digestibility and energy value of non-starch polysaccharides in young chickens, ducks and geese, fed diets containing high amounts of barley// Comparative

75. Biochemistry and Phisiology-Part A. Molecular and Integrative Physiology.-2002.-V.131, Issue 3.-P.657-668.

76. Jeffries T. W., Yang V. W., Davis M. W. Comparative study of xylanase kinetics using dinitrosalicylic, arsenomolybdate and ion chromatographic assays// Applied Biochemistry and Biotechnology.-1998.-V.70-72 .-P.257-265.

77. Jeroch, H.; Danicke, S.; Brufau, J. The influence of enzyme preparations on the nutritional value of cereals for poultry: a review// Journal of Animal Feed and Science.-1995.- 4.-P.263-285.

78. JorgensenH., Eriksson Т., Borjesson J., Tjerneld F. Olsson L. Purification and characterization of five cellulases and one xylanase from Penicillium brasilianum IBT 20888// Enzyme and Microbial Technology.-2003.-V.32.-P.851-861.

79. Jung-han, Suh, Yong-Jin C. Synergism among Endo-xylanase, (3-Xylosidase and Acetyl Xylan Esterase from Bacillus stearothermophilus!/ Journal of Microbiology and Biotechnology,-1996.- 6 (3)-P. 173-178.

80. Khalil B.O., Bharat В., Muresh K., Hoondal G.S. Enhanced production of thermostable xylanase from Streptomyces sp.QG-11-3 and its application in biobleching of eucalyptus kraft pulp// Enzyme and Microb. Technol.-2000.-27,№7- P.459-466.

81. Kosmina T. Viride cellulases additions in bread// Biochemistry of bread.-1975.-16.-P.324-330.

82. Kolasinska I., Boros D.,Madej L., Cygankiewicz A., Qualitative characteristics of rye inbred lines. In Proceeding of the Eukarpia Rye Meeting, Edited by Plant Breeding and Acclimatization Institute, Radzikow, Poland.- 2002.-P.401.

83. Konig J., Grasser R., Pikor H.,Vogel K. Determination of xylanase, glucanase, and cellulase activity// Anal Bioanal Chem.-2002.~ 374.-P.80-87.

84. Kubicek C. P., Messner R., Gruber F., Mach, R. L., Kubicek Pranz E. M. The Trichoderma cellulase regulatory puzzle: from the interior life of a secretory fungus//Enzyme Microb. Technol.-1993.- 15.-P.90-99.

85. Kusakabe I., Kawaguchi M., Yasui Т., Kobayashi T. Characteristics of Streptomyces olivaceoviridis xylanase// Nippon Nogeikagaku Kaishi 1977.-51.-P.429-437.

86. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Dissolved protein assay// J.Biol.Chem.-1951.- 193.-P.265-266.

87. Lu W., Li D., Wu Y. Influence of water activity and temperature on xylanase biosynthesis in pilot-scale solid-state fermentation by Aspergillus sulphureus//Enzyme and Microbial Technology.- 2003.-V.32, Issue 2.-P. 305-311.

88. Mach R.L., Zeilinger S., Kristufek D., Kubicek C.P. Ca 2 -calmodulin antagonists interfere with xylanase formation and secretion in Trichoderma reesei // Molecular Cell Research.- 1998.-V.1403 (3).P. 281-289.

89. Maes C., Delcour J. A. Structural Characterisation of Water-extractable and Water-unextractable Arabinoxylans in Wheat Bran// Journal of Cereal Science.-2002.-35.-P. 315-326.

90. Marquardt R.R., Boros D., Guenter W., Crow G. The nutritive value of barley, rye, wheat and corn for young chicks as affected by use of a Trichoderma reesei enzyme preparation// Animal Feed Science and Technology.-1994.- 45.1. P.363-378.

91. Marquardt R.R., Brenes A., Zhiqun Z., Boros D. Use of enzymes to improve nutrient availability in poultry feedstuffs// Animal Feed Science and Technology.- 1996.- 60.-P. 321-330.

92. Marquardt R.R., Han Z. Xylanases in wheat feeds// Enzymes in Poultry and Swine Nutrition.-1997.-16.-P. 154-162.

93. Miller G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal Chem.-1959.- 31.-P.426^128.

94. Nilsson M., Andersson R., Aman P. Arabinoxylan fractionation on DEAE-cellulose chromatography influenced by protease pre-treatment// Carbohydrate Polymers.- 1999.-V.39, Issue 4.-P.321-326.

95. NilssonM., Andersson R., Autio K., Aman P. Heterogeneity in a water-extractable rye arabinoxylan with a low degree of disubstitution// Carbohydrate Polymers.- 2000.-V.41, Issue 4.-P.397-405.

96. Nilsson M., Saulnier L., Andersson R., Aman P. Water unextractable polysaccharides from three milling fractions of rye grain// Carbohydrate Polymers.- 1996.-V.30, Issue 4.-P.229-237.

97. Nishimoto M., Honda Y., Kitaoka M., Hayashi K. A kinetic study on pH-activity relationship of XynA from alkaliphilic Bacillus halodurans C-125 using aryl-xylobiosides// Journal of Bioscience and Bioengineering.-2002.-V.93, Issue 4.- P.428-430.

98. Nishimura Т., Ishihara M., Ishii Т., Kato A. Structure of neutral branched xylooligosaccharides produced by xylanase from in situ reduced hardwood xylan// Carbohydrate Research.-1998.-308.-P.l 17-122.

99. Paice B.Subtilis xylanases// Archiv. Microbiology.-1986.-144.-P.201-205.

100. Reed G. Enzymes in food processing// Academic press.-1966.-91.-P.253-256.

101. Robyt J.F., Whelan J.W. Ions influence on results DNSA methods of reducing sugars determination// Anal. Biochem.-1972.-45.-P.510-516.

102. Rotsch A. Assumed action of pentosanases and emulgators in bread processing// Bread and pastry.-1966.-35.-P.91-96.

103. Roubroeks J. P., Andersson R., Aman P. Structural features of (1-3),(1-4)-B-glucan and arabinoxylan fractions isolated from rye bran// Carbohydrate Polymers.-2000.-V.42, Issue 1.-P.3-11.

104. Royer J.C., Nakas J.P. Substrate inhibition in enzymatic assay// Enzyme Microb. Technol.-1989.-11.-P.405-410.

105. Rozs M., Manczinger L.,Cs. Vagvolgyil, Keveil F., Hochkoeppler A., Vara A.G. Fermentation characteristics and secretion of proteases of a new keratinolytic strain of Bacillus licheniformis//^>\oiQc\\r\o\ogy Letters.-2001.-23.-P.1925-1929.

106. Ryu D.D.Y.,Mandels M. Cellulases. Biosinthesis and application// Enzyme Microb.Technol.-1980.-2.P.91-102.

107. Sandford P.A., Conrad H.E. Process O- methylated carbohydrates// Biochemistry.-1966.- 5.-P.1508-1516.

108. Saastamoinen, M.; Plaami, S.; Kumpulainen, J. Pentosan and B-glucan of Finnish winter rye varieties as compared with rye of six other countries// Journal of Cereal Science.-1989.-10.-P. 199-207.

109. Saha B.C. Production, purification and properties of xylanase from a newly isolated Fusarium proliferatumll Process Biochemistry.- 2002.-V.37, Issue 11.-P. 1279-1284.

110. Sa-Pereira P., Costa-Ferreira M., Aires-Barros M.R. Enzymatic properties of a neutral endo-l,3(4)-xylanase Xyl II from Bacillus subtilisll Journal ofBiotechnology.-2002.-V.94, Issue 3.-P. 265-275.

111. Scoles G.J.,Campbell G.L.,McLeod J.G. Variability for grain extract viscosity in inbreed lines and an F2 population of rye// Can.J.Plant Sci.-1993.-73.-P.l-6.

112. Somogyi M. Method of reducing equivalents determination with dinitro-salicilic acid//J. Biol. Chem.-1952.-195.-P.19-23.

113. Tomme P., Warren R., Gilkes N.R. Binding domens in xylanases structure//Adv. Microbiol. Physiol. -1995.- 37,l.-P.81-84.

114. Turker M., Mavituna F. Production of cellulase by freely suspended and immobilized cell of Trichoderma reeseill Enzyme Microb. Technol.-l987.-9.-P.739-743.

115. Vega-Estrada J., Flores-Cotera L., Santiago A., Magana-Plasa I., Montes-Horcasitas C. Draw-fill batch culture mode for production of xylanases by Cellulomonas flavigena on sugar cane bagasse.// Appl.Microbiol and Biotechnol.-2002.-58,№4-P.43 5-438

116. Waeghe T.J., Darvill A.G., McNeil M., Albersheim P. Process O-methylated alditol acetates isolation// Carbohydr. Res.-1983.-123.-P.281-304.

117. Wakarchuk W. W., Campbell R.L., Sung W.L., Davoodi J., Yaguchi M. Mutational and crystallografic analyses of the active site residues of the Bacillus circulans xylanase// Protein Science.- 1994.- V.3, Issue 3.-P.218-224.

118. Wubah, D.A.; Akin, D.E.; Borneman, W.S. Biology, fiber degradation and enzymology of anaerobic zoosporic fungi// Critical Reviews in Microbiology.-1993.- 19.-P. 99-115.

119. York W.S., Darvill A.G., McNeil M., Stevenson T.T., Albersheim P. Analysis of ferment hydrolysis carbohydrate products// Methods Enzymol.-1985.-118.-P.3-40.

120. Yoshida S., Ono Т., Matsuo N., Kusakabe I. Process of carbohydrate hydrolysis by enzymatic complex Streptomyces olivaceoviridislJ Biosci. Biotech. Biochem.-1994.- 58-P.2068-2070.

121. Zhao J., Li X., Qu Y., Gao P. Xylanase pretreatment leads to enhanced soda pulping of wheat straw// Enzyme and Microbial Technology.-2002.-V.30, Issue 6.-P. 734-740.129. Pat U.S. 5306633,2002