Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Средства для защиты от микоповреждений на основе фунгицидов и ингибиторов пигментообразования у грибов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузикова, Ирина Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Микробиологические повреждения промышленных материалов.

1.2. Факторы биоповреждений, образуемые грибами.

1.3. Фунгициды и критерии их оценки.

1.4. Противогрибковые антибиотики, образуемые микроорганизмами.

1.5. Использование природных антибиотиков для немедицинских целей.

Глава II. Материалы и методы исследований.

2.1 Культуры микромицетов и условия их культивирования.

2.2 Фунгициды и способы их использования.

2.3 Противогрибковые антибиотики, приготовление рабочих растворов и способы их использования.

2.4 Методы изучения действия фунгицидов и антибиотиков на морфологические и физиологические признаки микромицетов.

2.4.1 Определение прироста биомассы и пигментов.

2.4.2 Определение гидролитических ферментов.

2.4.2.1. Определение амилаз.

2.4.2.2. Определение протеолитической активности.

2.4.2.3. Определение целлюлозолитической активности у грибов.

2.4.3. Определение кислотопродукции у грибов.

2.4.4. Определение действия фунгицидов и антибиотиков на морфологические признаки у грибов.

2.5. Математические методы обработки результатов.

Глава III. Влияние фунгицидов различной химической природы на биосинтез грибами факторов биодеструкции.

3.1. Влияние фунгицидов на кислотопродукцию у грибов.

3.2. Влияние фунгицидов на активность некоторых гидролитических ферментов.

3.3. Влияние фунгицидов на образование пигментов у грибов.

Глава IV. Сочетанное действие фунгицидов и ингибиторов пигментообразования на грибы.

4.1 Влияние ЭДТА на пигментообразование у грибов.

4.2 Сочетанное действие фунгицидов и ЭДТА на рост и пигментообразование у грибов.

4.3 Обсуждение результатов главы III - IV.

Глава V. Антибиотики как ингибиторы грибов, вызывающих биоповренсдения.

5.1. Определения спектра действия и биологической активности полиеновых антибиотиков.

5.2. Влияние антибиотиков на некоторые физиологические свойства микромицетов.

5.3. Сочетанное действие полиеновых антибиотиков и ЭДТА на прирост биомассы и пигментообразование у грибов.

5.4. Сочетанное действие нистатина и ЭДТА на активность амилаз, протеаз и кислотопродукцию у грибов.

5.5. Влияние имбрицина на рост и некоторые физиологические свойства грибов.

Глава VI. Влияние противогрибковых антибиотиков на грибоустойчивость целлюлозосодержащих материалов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Средства для защиты от микоповреждений на основе фунгицидов и ингибиторов пигментообразования у грибов"

Биоповреждения возникли одновременно с деятельностью человека и будут существовать пока человек производит материалы, изделия, сооружения, непрерывно насыщая ими среду, и которые с позиций окружающей среды и живых организмов попадают в категорию загрязнителей.

Потери от этого вида повреждений достигают колоссальных размеров и составляют в мировом масштабе многие десятки миллиардов долларов ежегодно [Коваль, Сидоренко, 1989]. Если в начале 50-х годов эксперты приравнивали экономический ущерб от биоповреждений к 2% стоимости промышленной продукции, то к концу 70-х годов он достигал 7-5% [Ильичев, 1989]. Не менее значительными являются потери, не поддающиеся экономическому учету и касающиеся культурных ценностей.

Основными и широко распространенными агентами биоповреждений являются микроорганизмы и, прежде всего, мицелиальные грибы [Коваль, Сидоренко, 1989]. Благодаря быстрому росту, разнообразному и лабильному ферментному аппарату, практически любые по химическому составу и свойствам материалы могут быть для них питательными субстратами [Ильичев и др. 1995].

Для защиты материалов и изделий от повреждений, вызываемых микроорганизмами, существует много способов - механические, физические, ♦ химические. Основным из них, до настоящего времени, является использование химических веществ, оказывающих биоцидное действие на микроорганизмы [Бочаров и др., 1985; Бочаров, Прокофьев, 1988; Ильичев, 1989; Бочаров, 1983]. По биологическому действию биоциды подразделяют на фунгициды и бактерициды.

Однако, из множества таких веществ в практике используют лишь незначительную часть из них (1 из 4 тысяч соединений) из-за несоответствия таким важнейшим требованиям, как экологическая чистота, безвредность для человека и животных или защищаемого материала.

В связи с этим, а также с постоянно возрастающим многообразием материалов, подвергаемых биоповреждениям, многообразием видов-возбудителей повреждений при одновременно повышающихся природоохранных требованиях, предъявляемых к биоцидам, потребность в экологически чистых и эффективных биоцидах велика и постоянно возрастает.

В настоящее время одним из актуальных направлений в области защиты и профилактики от биоповреждений, в том числе микробиологических, является разработка научно-обоснованных путей изыскания, создания таких биоцидов с заданными свойствами и, что не менее важно, совершенствование методов их оценки [Бочаров, 1988]. Последнее особенно важно в связи с тем, что действие фунгицидов изучается главным образом, в биоцидных концентрациях, без учета того, что роль химических соединений всегда временная и возникает проблема устранения их возможного последующего влияния на материалы, на активность и характер биоповреждений. В настоящее время действие фунгицидов в суббиоцидных концентрациях на физиолого-биохимическую активность грибов -биодеструкторов промышленных материалов остается неизученным, как и вопрос о причинах более сильного повреждения грибами материалов, ранее обработанных фунгицидами [Гончарова, 1990].

Учитывая жесткие требования к биоцидам с точки зрения их экологической чистоты и безвредности для человека, можно предположить целесообразность их поиска среди веществ природного происхождения, образуемых и издавна существующих в природе. К таким веществам относятся антибиотики, являющиеся продуктами метаболизма живых организмов, главным образом микроорганизмов.

Цель и задачи исследования.

Цель работы - разработка научно-методических подходов создания комплексных антифунгальных препаратов на основе фунгицидов (в том числе антибиотиков) и ингибиторов пигментообразования у грибов, разработка критерия оценки фунгицидов, учитывающего их действие на физиологическую активность грибов.

В соответствии с целью в работе поставлены следующие задачи: ■ Определить характер действия фунгицидов в суббиоцидных концентрациях на рост и образование у грибов метаболитов, вызывающих биоповреждения t органических кислот, гидролитических ферментов, пигментов (в последующем - факторы биоповреждений).

Разработать критерий аттестации фунгицидов с использованием их свойства влиять на образование грибами факторов биоповреждений.

Исследовать зависимость между интенсивностью пигментообразования у грибов и их чувствительностью к фунгицидам.

Разработать научно-методические подходы для повышения биологической активности фунгицидов и снижения продукции грибами факторов биоповреждений.

Исследовать противогрибковые антибиотики - неполиеновый (имбрицин) и полиеновые (амфотерицин В, нистатин, леворин, микогептин) как возможное средство для борьбы с микоповреждениями.

Разработать эффективный противогрибковый препарат с использованием антибиотика и ингибитора пигментообразования.

В лабораторных условиях провести испытания разработанных препаратов, как средств защиты от микоповреждений с использованием целлюлозосодержащих материалов (бумага, хлопковая ткань).

Научная новизна.

Впервые проведены систематические исследования влияния известных фунгицидов на образование грибами различных систематических групп продуктов метаболизма, под действием которых происходит биоповреждения — пигментов, органических кислот, некоторых гидролитических ферментов (амилаз, целлюлаз, протеаз). Показано, что все исследуемые фунгициды (катамин АБ, метацид, формалин, ликводек, трилан), не зависимо от их химической природы активизируют биосинтез окрашенных продуктов метаболизма. При незначительном - на 19-35% подавлении роста грибов продуктивность единицы биомассы по пигментам возрастает в 1,5-2,5 раза. Характер и степень воздействия фунгицидов на кислотопродукцию определяется, прежде всего, свойствами тест-культур - у грибов рода Penicillium она возрастает (на 20-100%) в зависимости от фунгицида, а у рода Aspergillus - несколько снижается. На активность комплексов целлюлолитических и протеолитических ферментов исследуемые фунгициды не 4 7 оказывают существенного влияния, но у всех культур грибов на 19-90% в зависимости от их свойств повышают активность амилаз.

Показано, что при снижении продуктивности биомассы по пигментам с помощью ингибитора пигментогенеза возрастает чувствительность грибов к фунгицидам. Основным местом депонирования пигментов является наружный слой клеточной поверхности. Разработан научно-методический подход создания комплексных препаратов для защиты от биоповреждений на основе фунгицида и ингибитора пигментогенеза, преимущества, которых состоят в повышении эффективности фунгицидного действия и снижении отдаленных негативных последствий от их применения. Впервые изучена фунгицидная активность полиеновых противогрибковых антибиотиков по отношению к широко распространенным возбудителям микоповреждений, фитопатогенным грибам. Выявлено ранее неизвестное свойство этих антибиотиков подавлять процессы пигментообразования, а также активность некоторых гидролитических ферментов -амилаз. Преимущество антибиотиков, как фунгицидов проявляется еще и в том, что действие их на физиолого-биохимические показатели у грибов проявляется при очень низких концентрациях в среднем от 0,3 до 10 мкг/мл в зависимости от свойств культур.

Практическая ценность работы.

Для более полной оценки фунгицидов, прогнозирования последствий от их применения, определения областей практического использования предложен такой критерий как свойство их влиять на физиолого-биохимическую активность грибов.

Разработан способ получения эффективных средств от микоповреждений, основанный на использовании фунгицидов в комплексе с ингибитором пигментогенеза - ЭДТА. При этом достигается более высокий биоцидный эффект при сокращеннии расхода фунгицида в 2-10 раз (в зависимости от фунгицида).

Показана перспективность создания и поиска эффективных, экологически чистых средств защиты от микоповреждений среди противогрибковых антибиотиков, относящихся к группе макролидных полиеновых антибиотиков.

Показано, что, как и в случае с «химическими» фунгицидами, эффективным способом снижения биоцидной концентрации антибиотиков является использование их в комплексе с ингибитором пигментогенеза.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на III Международной конференции "В новый век - с новыми технологиями" (Санкт-Петербург, 2000), на 12 Международном симпозиуме по биоповреждениям (Прага, 2002), на Московском биотехнологическом конгрессе (Москва, 2002), на научной конференции "Сохранение культурного наследия библиотек, архивов и музеев" (Санкт-Петербург, 2003).

Публикации.

По теме диссертации опубликованы 4 статьи и 4 тезисных сообщения.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 153 наименований. Работа содержит 18 таблиц, 24 рисунка и фотографии.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кузикова, Ирина Леонидовна

ВЫВОДЫ

1. Проведены сравнительные исследования характера и степени воздействия, используемых в практике фунгицидов (катамин АБ, метацид, формалин, трилан, ликводек) на биосинтез грибами веществ, под действием которых происходят биоповреждения - пигментов, органических кислот и некоторых гидролитических ферментов. Показано, что фунгициды не влияют на активность целлюлаз, протеаз, но у всех культур в зависимости от их свойств, повышают активность амилаз на 10 - 90 %. Действие их на кислотопродукцию определяется, главным образом, свойствами культур - у грибов рода Penicillium она возрастает на 20 - 100 % в зависимости от фунгицида, а у грибов рода Aspergillus несколько снижается.

2. Выявлено свойство всех исследуемых фунгицидов, не зависимо от их химической природы, активизировать биосинтез пигментов. При незначительном (19-30%) или отсутствии подавления роста грибов продуктивность биомассы по пигментам возрастает в 1,3 - 2,5 раза. Электронно-микроскопические исследования показали, что основным местом депонирования пигментов является наружный слой клеточной стенки.

3. Показано, что эффективным и экологически чистым ингибитором пигментообразования у грибов является этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). В концентрации 0,05 - 0,1% ЭДТА снижает продуктивность грибной биомассы по пигментам, в среднем, на 55 %.

4. При сочетанном действии ингибитора пигментогенеза (ЭДТА) и фунгицидов возможно повысить фунгицидный эффект при снижении концентрации фунгицида почти на порядок, что, по-видимому, обусловлено повышением в этих условиях чувствительности грибов к фунгицидам.

5. Показано, что эффективными природными фунгицидами сапрофитных грибов - возбудителей биоповреждений промышленных материалов и фитопатогенов являются макролидные противогрибковые антибиотики полиены (амфотерицин В, леворин, микогептин, нистатин) и неполиен -имбрицин.

6. Впервые выявлено свойство полиеновых противогрибковых антибиотиков подавлять продуктивность биомассы грибов по пигментам, снижать активность комплексов амилолитических ферментов, не оказывать влияния на кислотообразование и активность протеолитических ферментов. Указанные свойства свидетельствуют о перспективности поиска и изучения этой группы антибиотиков с целью создания на их основе эффективных и экологически чистых средств от биоповреждений.

7. В составе комплексного препарата, содержащего ингибитор пигментогенеза, фунгицидная концентрация антибиотиков снижается в 2,3 - 10 раз в зависимости от культуры и антибиотика.

8. На примерах химических и природных (антибиотиков) фунгицидов показано, что для их аттестации необходимо использовать критерий, определяющий характер и степень влияния на физиолого-биохимическую активность грибов и позволяющий в зависимости от химического состава и свойств защищаемых материалов определять целесообразность их применения.

9. Испытания антибиотика нистатина и комплекса нистатина с ЭДТА как средств для защиты от микоповреждений на примере целлюлозосодержащих материалов показали, что после обработки их исследуемыми фунгицидами они остаются грибоустойчивыми в течение всего срока наблюдений - 5-6 месяцев.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузикова, Ирина Леонидовна, Санкт-Петербург

1. Аверьянов А.А., Лапикова В.П., Петелина Г.Г. Защита грибными меланинами от фотодинамического повреждения // Изв. АН СССР, Сер. биол. 1986. - № 4. -С. 541-549.

2. Андреюк Е.И., Билай В.И., Коваль Э.З. Микробная коррозия и ее возбудители. Киев: Наукова думка, 1980. - 286 с.

3. Анисимов А.А., Зезина Т.В., Смирнов В.Ф. Влияние фунгицидов на содержание органических кислот в культуральной жидкости гриба A. niger II Биохимия и биофизика микроорганизмов. Горький: ГГУ, 1977. - Вып. 5. - С. 86-89.

4. Анисимов А.А., Александрова И.Ф. О биохимических механизмах действия фунгицидов // Биоповреждения в промышленности. Горький, 1983. - С. 7-17.

5. Анисимов А.А., Семичева А.С., Александрова И.Ф. и др. Биохимические аспекты проблемы защиты промышленных материалов от повреждений микроорганизмами. Обзор // Актуальные вопросы биоповреждений. М.: Наука, 1983.-С. 77-101.

6. Анисимов А.А., Фельдман М.С., Высоцкая Л.Б. Ферменты мицелиальных грибов как агрессивные метаболиты // Биоповреждения в промышленности. -Горький: ГГУ, 1985. С. 316.

7. Анисимов А.А., Фельдман М.С., Александрова И.Ф. Сравнительное исследование протеолитической активности микромицетов, вызывающих повреждение промышленных материалов // Микология и фитопатология. -1988. Т. 22, вып. 1. - С. 44-50.

8. Аравийский Р.А., Поляк М.С., Шатик Л.И. Противогрибковые антибиотики -М.: ВНИИСЭНТИ НПО "Медбиоэкономика", 1989.

9. Бабицкая В.Г., Щерба Т.В., Филимонова Е.А. Меланиновые пигменты грибов Paecilomyces variotti и Aspergilus carbonarius И Прикл. биохим. и микробиол. -2000.-Т. 36,№2.-С. 153-159.

10. Бабицкая В.Г., Щерба Т.В., Иконникова Н.В. Меланиновый комплекс гриба Inonotus obliquus II Прикл. биохим. и миробиол. 2000. - Т. 36, № 4. - С. 439444.

11. Блинов И.О., Головнина J1.M., Хохлова Ю.М. Изучение антибиотиков группы эндомицина //Антибиотики. 1967. - Т.12, № 10. - С. 867-874.

12. Борисова В.Н. Пероксидазы у грибов // Метаболиты почвенных микромицетов. Киев: Наукова думка, 1971. - С. 70-81.

13. Борисюк Л.Г., Харатьян, Жданова Н.Н. Локализация и динамика накопления меланина в клетках Cladosporium cladosporioides II Микробиол. журнал. -1991.-Т. 53, вып. 6.-С.10-16.

14. Бочаров Б.В. Защита от биоповреждений с помощью биоцидов // Актуальные вопросы биоповреждений. М.: Наука, 1983. - 239 с.

15. Бочаров Б.В. Достижения в области защиты материалов от биоповреждений с помощью биоцидов // Биоповреждения и защита материалов биоцидами. М., 1988.-С. 135-139.

16. Бочаров Б.В., Анисимов А.А., Кючков А.А. Основные средства защиты материалов от биоповреждений микроорганизмами // Экологические основы защиты от биоповреждений. М.: Наука, 1985. - С. 172-210.

17. Бочаров Б.В., Прокофьев А.К. Экотоксилогические аспекты применения биоцидов // Биоповреждения и защита материалов биоцидами. М., 1988. - С. 20-27.ч

18. Брилан Л.Е. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам. М.: Медицина, 1984. - С. 56-58.

19. Великанов Л.Л., Сидорова И.И. Некоторые биохимические аспекты в экологии грибов//Успехи микробиологии. 1983.-Т. 18.-С. 112-131.

20. Веселова А.П., Шляпникова М.А., Иудина К.А. Кислотопродукция как фактор жизнедеятельности и биодеструктивной активности микромицетов // Биохимические основы защиты промышленных материалов от биоповреждений. Горький, 1989. - С. 31-33.

21. Ветлугина А.А., Никитина Е.Н. Противогрибковые полиеновые антибиотики. -Алма-Ата: Наука, 1980. 322 с.23