Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антифунгальные средства и факторы патогенности оппортунистических грибов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Антифунгальные средства и факторы патогенности оппортунистических грибов"

На правах рукописи

Трошева Татьяна Дмитриевна

АНТИФУНГАЛЬНЫЕ СРЕДСТВА И ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ ГРИБОВ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 ноя zoo

Санкт-Петербург - 2013

005537070

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Санкт-Петербургский научно-исследовательский центр экологической безопасности Российской академии наук (НИЦЭБ РАН) в лаборатории биологических методов экологической безопасности.

Научные руководители: доктор технических наук

Медведева Надегкда Григорьевна

кандидат биологических наук - Кузикова Ирина Леонидовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Жариков Геннадий Алексеевич

начальник отдела экологической биотехнологии

ФГБУН Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов ФМБА России

доктор биологических наук Меденцев Александр Григорьевич

заведующий лабораторией адаптации микроорганизмов

ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская

государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «Рб » 2013 г. в ч. ООм\\н. на заседании

Диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии».

Автореферат разослан «^Г» 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

В последние годы интенсивно изучается вопрос о влиянии потенциально патогенных (оппортунистических) грибов на здоровье человека. Среди инфекционных болезней оппортунистические микозы занимают особое место, поскольку число условно патогенных микромицетов значительно больше, чем истинных патогенов [Van Burik, 2001]. Количество микозов, вызываемых оппортунистическими микромицетами, ежегодно увеличивается на 5—10 % и удваивается каждые 10 лет [Богомолова, 1999].

Потенциальная патогенность грибов определяется комплексом свойств адаптивного характера, позволяющих им противостоять защитным механизмам организма и осуществлять инвазию. К факторам патогенности относятся гидролитические ферменты (фосфолипазы, протеазы) [Сох, 2001; De Bernardis, 2001], пигменты [Butler, 2001], экзополисахариды [Charlier, 2005], способность к росту при 37°С [Богомолова, 2007] и др.

Много работ посвящено исследованиям факторов патогенности клинических патогенов человека, главным образом, дрожжей [Ramesh, 2011; Silva, 2011; Marcos-Arias, 2011], меньше исследований посвящено патогенезу мицелиальных оппортунистических грибов [Богомолова, 2007; Кузикова, 2010]. Данные о влиянии химических средств, используемых для защиты от микоповреждений, на факторы патогенности грибов крайне скудны. Показано, что некоторые фунгициды интенсифицируют образование грибами таких факторов патогенности как пигменты и полисахариды [Сухаревич, 2005]. Результатом практического использования фунгицидов может стать увеличение в антропогенном сообществе грибов, потенциально опасных для человека, что указывает на необходимость постоянного поиска новых экологически безопасных средств защиты от грибов.

Ограничить негативное воздействие синтетических фунгицидов возможно полной или частичной заменой их на природные биоциды, обладающие свойством ингибировать факторы патогенности оппортунистических грибов. Основную группу таких биоцидов составляют микробные метаболиты с антифунгальной активностью и, прежде всего, макролидные полиеновые антибиотики.

Полиеновые антифунгальные антибиотики отличаются высокой активностью и специфичностью действия, к ним длительное время не появляются устойчивые формы микроорганизмов [Егоров, 2001], они способны подавлять образование грибами пигментов [Сухаревич, 2003]. Последнее из указанных свойств полиенов приобретает особую значимость, так как пигменты выполняют одну из основных протекторных функций, снижают чувствительность грибов к воздействию любых фунгицидов и других неблагоприятных факторов. Однако в научно-практических аспектах использование антибиотиков для защиты от грибов изучено недостаточно, практически отсутствуют антибиотики, целенаправленно полученные для этих целей, а при необходимости используются антибиотики медицинского назначения.

Действию полиенов на факторы патогенности оппортунистических грибов посвящены единичные сообщения, результатов которых недостаточно для того, чтобы использовать этот критерий для оценки перспективности применения антибиотиков как средств борьбы с грибами.

Цель работы - изучение влияния фунгицидов различной химической природы на факторы потенциальной патогенности оппортунистических грибов; выделение культуры актиномицета-продуцента нового полиенового антибиотика и разработка на его основе препарата в комплексе с веществами, снижающими адаптационный потенциал микромицетов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• Определить характер действия фунгицидов различной химической природы на рост и образование у грибов метаболитов, относящихся к факторам потенциальной патогенности: пигментов, экзополисахаридов, протеаз, фосфолипаз и каталаз;

• Выделить из природной экосистемы актиномицеты, обладающие свойством образовывать антифунгальные метаболиты, и отобрать наиболее активный штамм для дальнейшего изучения;

• Определить систематическое положение выделенного продуцента;

• Провести выделение, очистку и определение компонентного состава антибиотического комплекса, образуемого отобранным продуцентом;

• Определить спектр действия и минимальные биоцидные концентрации выделенного сырца антибиотического комплекса в отношении различных групп микроорганизмов;

• Изучить влияние полиенового антибиотика на образование таких факторов патогенности оппортунистических грибов как синтез пигментов и экзополисахаридов, активности фосфолипаз и каталаз;

• Исследовать возможность повышения антифунгальной активности выделенного антибиотика и снижения уровней факторов патогенности грибов при использовании его в комплексе с ПАВ.

Научная новизна

Впервые изучено влияние азольных соединений на образование оппортунистическими грибами продуктов метаболизма, относящихся к факторам потенциальной патогенности — пигментов, экзополисахаридов, гидролитических ферментов (фосфолипаз и протеаз). Показано, что азольные соединения, также как и фунгициды, относящиеся к четвертичным аммониевым соединениям (ЧАС) и гуанидиновым основаниям, в большинстве случаев активизируют образование у грибов метаболитов, являющихся факторами патогенности. Характер и степень их воздействия определяется прежде всего свойствами тест-культур.

Впервые показано, что синтетические фунгициды, относящиеся к ЧАС, гуанидиновым основаниям и азольным соединениям, могут приводить к повышению уровня важнейшего фактора патогенности — каталазной активности оппортунистических грибов.

Впервые показана способность актиномицетов рода СИтта синтезировать гептаеновые антибиотики. Выделен и идентифицирован новый продуцент оригинального гептаенового антибиотика СИтта хр. 322 и определен спектр его биологической активности.

Выявлено свойство гептаенового антибиотика 322 подавлять процессы пигментообразования у всех исследованных культур, снижать активность каталаз и ингибировать синтез полисахаридов у большинства исследуемых микромицетов.

Теоретическая и практическая значимость

Показана перспективность создания и поиска эффективных, экологически безопасных средств защиты от микоповреждений среди противогрибковых антибиотиков, относящихся к группе макролидных полиеновых антибиотиков, не используемых в медицине.

Показано, что, как и в случае с синтетическими «химическими» фунгицидами, эффективным способом снижения биоцидной концентрации антибиотика является использование его в комплексе с ПАВ. Разработан эффективный противогрибковый препарат с использованием нового полиенового антибиотика 322 и ХГБ (хлоргексидина биглюконата). Препарат успешно испытан в Библиотеке РАН, что подтверждено соответствующим актом.

Положения, выносимые на защиту

• Результатом использования синтетических фунгицидов может стать увеличение в антропогенном сообществе грибов, потенциально опасных для человека;

• Необходимость ограничения использования синтетических фунгицидов для защиты от биоповреждений в силу их способности в большинстве случаев интенсифицировать образование грибами факторов патогенности;

• Полиеновые антибиотики немедицинского назначения являются перспективными средствами для защиты от грибов;

• Целесообразность использования комплексных препаратов на основе фунгицидов и веществ, снижающих адаптационный потенциал микромицетов.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты исследования получены с использованием современного поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных.

Результаты работы были представлены на 3-м и 4-м молодежных экологических конгрессах "Северная Пальмира" (Санкт-Петербург, ноябрь 2011, 2012), 6-й международной конференции «Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон ЭКОГИДРОМЕТ» (Санкт-Петербург, июль 2012), научно-практической конференции «Адаптационные стратегии живых систем» (Украина, Новый Свет, июнь 2012), 9-й международной научно-практической конференции «Дослщження, консерващя та реставрацЫ музейних памяток: досягнення, тенденци розвитку» (Украина, Киев, май 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 статей, в т.ч. 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 2 тезисных сообщения.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, три главы результатов исследований с их обсуждением, заключение, выводы, список сокращений и условных обозначений, список литературы, включающий 311 наименований, 2 приложения. Работа содержит 26 таблиц, 13 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность работы, сформулирована основная цель и задачи исследования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы дается характеристика грибов — возбудителей биоповреждений различных материалов и изделий, излагается состояние проблемы контаминации данными грибами - оппортунистами среды обитания человека, рассмотрены основные факторы патогенности оппортунистических грибов и представлен анализ воздействия на них фунгицидов различной химической природы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использованы тест-культуры, полученные из разных коллекций микроорганизмов :

- мицелиальиые грибы - 22 культуры родов Aspergillus, Alternaría, Pénicillium, Chaetomium, Scopulariopsis, Fusarium, Trichoderma;

- дрожжи и дрожжеподобные грибы - 5 культур родов Saccharomyces и Candida;

- бактерии - 12 культур родов Bacillus, Pseudomonas, Streptococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Escherichia, Proteus, Mycobacterium.

В работе использовали синтетические фунгициды катамин АБ (ЧАС -четвертичное аммониевое соединение), метацид (гуанидиновое основание), метатин GT (азольные соединения) и фунгицид природного происхождения - гептаеновый антибиотик 322, выделенный автором. В качестве ПАВ использовался ХГБ. Концентрацию фунгицидов и ХГБ в среде варьировали в зависимости от чувствительности к ним грибов и с таким расчетом, чтобы степень подавления роста не превышала бы 60%.

Культуры актиномицетов из почвенных образцов выделяли методом посева почвенной суспензии на плотную среду Чапека с 2% крахмала (рН = 7,0 - 7,4), содержащую нистатин (50 мкг/мл). Первичный отбор продуцентов противогрибковых антибиотиков проводили методом штрихов [Нетрусов, 2005] на среде Чапека с 2 % крахмала (рН = 6,0 - 6,4) по величине зон подавления роста тест-культур.

УФ-спектры поглощения этанольных экстрактов биомассы и нативных растворов снимали на спектрофотометре Genesys 10 UV (США) при 190 - 450 нм. Антибиотическую активность экстрактов биомассы и нативных растворов определяли методом диффузии в агар [Нетрусов, 2005].

Идентификацию штамма № 322 проводили с использованием диагностических сред и методов, рекомендованных в «Определителях актиномицетов» [Гаузе, 1983; Williams, 1989]. Морфологию мицелия, спороносцев, поверхность и форму спор, наличие склероциев изучали сканирующей электронной микроскопией, образцы готовили по методу Блэк [Black, 1974] и просматривали с использованием электронного микроскопа JSM- 35С (Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Для глубинного культивирования продуцента антибиотика 322 была использована жидкая среда № 10.

Идентификацию компонентов антибиотического комплекса, продуцируемого актиномицетом Chainia sp. 322, проводили методами УФ, ИК - спектроскопии, масс -спектрометрии, ТСХ, ВЭЖХ.

Фосфолипазную активность грибов измеряли, используя «чашечный метод», разработанный Прайс [Price, 1982]. Протеолитическую активность грибов определяли на агаризованной среде МПЖ по диаметру зоны разжижения желатины [Егоров, 1983]. Степень подавления роста на агаризованных средах с фунгицидами вычисляли по формуле Эббота [Pünthener, 1982]. Активность каталазы контролировали методом, основанным на титрометрическом определении количества разложившейся перекиси в течение определенного времени. За единицу активности фермента принимали его количество, катализирующее разложение 1 мкМ Н2Ог за 1 минуту и выражали в ед/г а.с.б. [Борисова, 1973]. Экзополисахариды нативных растворов определяли гравиметрическим методом после их осаждения этанолом [Егоров, 1983]. При культивировании грибов в жидкой среде Чапека прирост биомассы определяли весовым методом, а количество пигментов в мицелии - методом водно-щелочной экстракции [Лысенко, 1977].

Обработку экспериментальных данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0 [Халафян, 2007].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние синтетических фунгицидов на факторы патогенности оппортунистических грибов

Основным критерием патогенности микроорганизмов и оппортунистических грибов в частности является активность так называемых факторов патогенности [Latge, 2001]. Известно, что некоторые биоциды, используемые для защиты различных материалов от оппортунистических грибов, усиливают образование грибами факторов деструкции, одновременно являющихся и факторами патогенности. Так, под влиянием ЧАС (катамин АБ), гуанидиновых оснований (метацид), медьсодержащих препаратов (оксихинолят меди) и некоторых других у грибов повышается синтез полисахаридов и пигментов [Сухаревич, 2005], а также

возрастают активности гидролитических ферментов [Кузикова, 2010]. В последние годы широкое применение не только в медицинской практике, но и для защиты различных материалов от биоповреждений получили азолсодержащие фунгициды [De Bernardis, 1996; Barelle, 2008]. Однако в литературе практически отсутствуют данные о влиянии азолсодержащих соединений на факторы патогенности оппортунистических грибов.

В настоящей работе изучено влияние широко используемого для защиты от биоповреждений препарата метатина GT на наиболее значимые с медицинской точки зрения факторы патогенности оппортунистических грибов родов Aspergillus и Pénicillium. Исследования проводили как с микромицетами, полученными из ВКМ, так и с микромицетами - контаминантами фондов Библиотеки РАН.

Влияние фунгицидов на фосфолипазную и желатиназную активности грибов. Многие патогенные микроорганизмы для проникновения в организм хозяина образуют конститутивные и индуцибельные гидролитические ферменты, которые повреждают клеточные мембраны, нарушают их функции, деструктируют клетки и молекулы иммунной системы макроорганизма. Так как основными компонентами клеточных оболочек макроорганизма являются фосфолипиды и белки, то ферменты, гидролизующие эти соединения — фосфолипазы и протеазы - относятся к факторам патогенности. Известно, что более низкая экспрессия фосфолипаз и протеаз коррелирует с более низкой вирулентностью и наоборот, что подтверждает их роль как важнейших факторов патогенности [Monod, 2002; Fotedar, 2005].

На рисунке 1 представлены данные по влиянию синтетических фунгицидов на уровень желатиназной и фосфолипазной активностей микромицетов, выделенных из фондов БАН.

Как показали результаты экспериментов, под действием метатина GT у двух из пяти исследованных штаммов грибов - P. fimiculosum шт. 37 и A. terreus шт. 35 -желатиназная активность увеличивается более чем в 2 раза. У других штаммов она остается на уровне контроля или уменьшается на 17 — 25 %. Аналогичное влияние на желатиназную активность оказал и катамин АБ. Действие метацида, за исключением A. terreus шт. 35, приводит к стимуляции желатиназной активности у всех исследованных тест-культур на 50 - 120 % в зависимости от культуры микромицетов.

Наибольшее повышение фосфолипазной активности наблюдается в случае использования метацида. У всех штаммов грибов она увеличивается на 25 — 110 % в зависимости от культуры микромицетов. Стимулирующим действием на активность фосфолипаз обладает и катамин АБ. Характер действия метатина GT отличается от действия метацида и катамина АБ: фосфолипазная активность в присутствии метатина GT остается у трех изученных штаммов на уровне контроля, а у штаммов Р. funiculosum шт. 37 и A. terreus шт. 35 - снижается на 32 %.

300 ! 250

S 200

g 150

a

100 50

v© o4-

0

1

rb

I

[Ь

rbi

метатин GT

Pénicillium fimiculosum37

метатин GT

Pénicillium funiculosum 26

1

метатин GT

Pénicillium crysogenum38

rb

метатин GT

Pénicillium simplieissimum24

i

1

i

метатин GT

Aspergillus terreus 35

□ Фосфолипазная активность ЕЗ Желатиназная активность

Рисунок 1 - Влияние фунгицидов на желатиназную и фосфолипазную активности грибов, выделенных из библиотечных фондов БАН;

контроль принят за 100 %

Следует отметить, что исследуемые фунгициды - катамин АБ и метацид -оказывают менее выраженное влияние на фосфолипазную и желатиназную активности микромицетов, полученных из коллекции ВКМ [Кузикова, 2010]. Действие метатина ОТ практически не приводит к стимуляции данных факторов патогенности у коллекционных грибов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что синтетические фунгициды -метацид, катамин АБ и метатин ОТ - могут способствовать активации фосфолипазной и желатиназной активностей у оппортунистических грибов.

Влияние метатина СТ на образование пигментов и экзополисахаридов грибов. Другими хорошо известными факторами патогенности микроорганизмов являются внеклеточные полисахариды (ПС) и пигменты. Основным механизмом действия пигментов и ПС, как факторов патогенности, является защита патогена от иммунной системы макроорганизма [Клуогщ-Онл^, 1986; Langfelder, 2003].

Из результатов, представленных в таблице 1 следует, что под действием метатина ОТ происходит увеличение образования пигментов у исследованных тест-культур на 29 - 120 %, за исключением А. ¡еггеия, у которой синтез пигментов снижается на 57 %.

Действие метатина ОТ на синтез экзополисахаридов у грибов аналогично его действию на образование пигментов. У трех из четырех исследуемых тест-культур выход экзополисахаридов увеличивается на 35 - 294 % (таблица 1).

Таким образом, азолсодержащие соединения (метатин ОТ), также как и фунгициды другой химической природы, относящиеся к ЧАС, гуанидиновым основаниям [Сухаревич, 2005], приводят к стимуляции синтеза пигментов и экзополисахаридов у оппортунистических грибов.

Таблица 1 - Влияние метатина GT на образование пигментов и экзополисахаридов грибами

Тест-культура Конц. метатина GT, % (массовые) Продуктивность биомассы по пигментам Продуктивность биомассы по экзополисахаридам

мг/г а.с.б. % от контроля** мг/г а.с.б. % от контроля

A. terreus 4-10"2 34,2 ± 1,2 43 512,0 ±42,2 394

A. niger 4-10"2 335,0 ±28,1 129 120,1 ±11,4 135

P. funiculosum 5-Ю"3 64,1 ±4,2 161 288,0 ± 16,2 81

A. flavus 2-10"2 119,2 ±9,7 220 н/о* н/о

P. ochrochloron 2-10"2 н/о н/о 115,3 ± 10,9 164

н/о* — не определяли; ** - контроль принят за 100 %

Влияние синтетических фунгицидов на каталазную активность у оппортунистических грибов. Каталаза относится к важнейшим оксидоредуктазам клетки, высокая активность которой обеспечивает возможность быстрого разрушения токсичного продукта её метаболизма - перекиси водорода. Каталаза относится микробиологами к одному из главных факторов патогенности [Chromy, 2005]. Наличие высокой активности каталазы у микроорганизмов, вызывающих инвазивные инфекции, позволяет им защищаться от активных форм кислорода, образуемых макрофагами и нейтрофилами [Steven, 2006].

Из результатов, представленных на рисунке 2, следует, что характер и степень влияния фунгицидов на каталазную активность зависит как от свойств тест-культур, так и от химической природы фунгицида, однако в большинстве случаев наблюдается повышение активности фермента. Так, под действием всех исследуемых фунгицидов увеличивается активность фермента у A. niger на 36 - 147 % в зависимости от фунгицида. У тест-культуры P. funiculosum увеличение каталазной активности наблюдается под действием метацида и катамина АБ на 53 % и 21 % соответственно, в то время как метатин GT ингибирует каталазную активность в 2 раза. У Р. ochrochloron повышение данного фактора патогенности на 34 % происходит только под действием метатина GT.

Таким образом, в ходе проведенных исследований показано, что азолсодержащие соединения, также как и фунгициды другой химической природы, относящиеся к ЧАС и гуанидиновым основаниям, в большинстве случаев приводят к стимуляции факторов патогенности оппортунистических грибов. Очевидно, что при этом в воздухе помещений могут возникнуть специфические антропогенные сообщества грибов с повышенной вирулентностью, более опасные для человека, чем не подвергаемые действию фунгицидов.

Полученные результаты исследования, а также анализ научной литературы о негативном влиянии синтетических фунгицидов на состояние окружающей среды и факторы патогенности оппортунистических грибов, подтверждают известное положение о необходимости разработки новых и оптимизации уже существующих антифунгальных средств, обладающих и свойством ингибировать факторы патогенности грибов.

300

250

200

.50

«

5 и к ^

I 100

м

о

метит ОТ

ШРет'а'Н^шносЬгосЫогоп

метацпд кашмпн АБ

ОАврег&Низткег ШРппсШппнАппаЛохти

Рисунок 2 - Влияние синтетических фунгицидов на каталазную активность грибов; контроль принят за 100 %

2. Выделение и идентификация продуцента полиенового антибиотика

В последние десятилетия осуществляются попытки применения антибиотиков в качестве средств защиты от биоповреждений различных материалов и изделий [Медведева, 1996; Мелентьев, 2006]. Несмотря на то, что многие вопросы в проблеме немедицинского использования антибиотиков остаются дискуссионными по таким критериям как высокая биологическая активность, специфичность действия, экологическая безопасность, они, несомненно, могут быть отнесены к перспективным биоцидам в различных областях человеческой деятельности. В первую очередь это касается полиеновых антибиотиков, не используемых в медицине, к которым очень медленно возникают резистентные формы микроорганизмов.

В настоящей работе представлены результаты целенаправленного поиска полиеновых антибиотиков немедицинского назначения с новым типом химического строения.

Из образцов различных типов почв было выделено 27 культур актиномицетов. Из 7 штаммов, характеризующихся высокой антифунгальной активностью, для последующих исследований был отобран штамм, обозначенный № 322, отличающийся наибольшей биологической активностью. Анализ УФ—спектров спиртового экстракта штамма № 322 показал, что максимумы поглощения в УФ-спектре соответствуют 210, 253, 343, 358, 378, 400 нм. Это позволило предположить, что штамм образует антибиотический комплекс, один из компонентов которого -полиен [Ветлугина, 1980].

Сканирующая электронная микроскопия изолята № 322, выращенного на среде Чапека с 2 % крахмала, показала, что штамм имеет септированный мицелий диаметром 0,3 — 0,4 мкм, образующий густую разветвленную ячеистую сеть. Спороносцы спиральные, имеют 2-3 витка диаметром 2-2,5 мкм. Завитки плотно сжаты. Споры, расположенные в спороносцах цепочками, имеют шаровидную форму диаметром 0,4 мкм. Изолят хорошо растет на всех использованных диагностических средах. В зависимости от состава среды окраска воздушного мицелия варьирует от светло-серой до темно-серой, субстратного - от желто-серой до оливковой и коричневой. На глицерин-аспарагиновой и глюкозо-пептонной средах образует растворимый коричневый пигмент. Обладает желатинолитической активностью, гидролизует крахмал, не восстанавливает нитраты. Штамм № 322 лучше всего растёт на среде Придхэма-Готтлиба с мальтозой, хорошо растет на среде с сахарозой, глюкозой, рамнозой, фруктозой, раффинозой; слабо растёт на средах с сорбозой, ксилозой, маннозой, галактозой, не использует рибозу и арабинозу.

На основании исследованных морфолого-культуральных и физиолого-биохимических характеристик штамм № 322 предварительно отнесен к роду СИаМа и обозначен как СИмта хр. 322 (рисунок 3), а образуемый им антибиотик обозначен как антибиотик 322.

Как следует из УФ-спектра спиртового экстракта биомассы и нативного раствора СЪаШа яр. 322, продуцент образует антибиотический комплекс, состоящий, из 2-х компонентов - полиенового с максимумами поглощения при 343, 358, 378, 400 нм, соответствующими гептаеновым антибиотикам, и неполиенового с максимумами поглощения при 210 и 253 нм (рисунок 4). При этом полиеновый компонент содержится только в биомассе, а неполиеновый - в биомассе и в нативном растворе.

Антибиотик 322 проявляет антимикробное действие в отношении всех исследуемых оппортунистических грибов (зоны подавления роста тест-культур этанольного экстракта биомассы достигают 31 мм), дрожжей, грамположительных бактерий и оказывает слабое влияние на рост грамотрицательных бактерий. Это позволяет считать спектр его противомикробного действия достаточно широким, а ингибиторную эффективность в отношении оппортунистических грибов - высокой.

250 300 350 Длина волны, им

т—1—I-1—г

400 450

I Г I I I I I

Рисунок 3 - Мицелий и спиральные Рисунок 4 - УФ - спектр поглощения спороносны штамма № 322 (х 4000) этанольного экстракта биомассы штамма

№322

Выделение, очистка и идентификация антибиотика 322. Исследования были начаты с выбора экстрагента антибиотика 322 из биомассы. Как видно из таблицы 2, наибольшей биологической активностью обладают этанольный и метанольный экстракты биомассы, к тому же, этанол и метанол, в отличие от бутанола, изопропанола и диметилформамида, не оказывают ингибирующего действия на тест-культуры. Учитывая сходство эффективности экстракции, проводимой этанолом и метанолом, в дальнейшей работе в качестве экстрагента использовался этанол как менее токсичный. При изучении кислотности этанола на эффективность экстракции установлено, что рН в интервале 4,0 - 9,0 не оказывает заметного влияния на биологическую активность полученных экстрактов. В последующих исследованиях для экстракции антибиотического комплекса из биомассы продуцента СИаМа яр. 322 использовали этанол с натуральным рН = 7,2.

Для получения сырца антибиотика 322 была разработана принципиальная схема, включающая в себя следующие стадии: культивирование продуцента в течение 5 суток на жидкой среде № 10, двухкратная экстракция антибиотического комплекса из биомассы продуцента этанолом, охлаждение полученного экстракта при 1=5°С, фильтрование экстракта, выпаривание этанола, трехкратная очистка сухого вещества н-гексаном, выпаривание и сушка с получением сырца I, растворение сырца I в этаноле, охлаждение раствора сырца I при 1=5°С, фильтрование раствора сырца I, выпаривание этанола из фильтрата с получением конечного продукта - сырца II (антибиотический комплекс 322). Продуктивность биомассы по сырцу антибиотика (сырцу II) составляла 0,22 ± 0,03 г сырца/г а.с.б..

В УФ-спектре этанольного раствора полученного сырца обнаружены максимумы поглощения при длинах волн 210, 253, 343, 358, 378 и 400 нм.

Таблица 2 - Биологическая активность экстрактов биомассы Chainia sp. 322

Тест-культура Диаметры зон подавления роста тест-культур, мм

Бутанол Диметилформамид Изопропанол Этанол Метанол

С. utilis 34,0 ±2,2 24,0 ±0,6 33,5 ±2,6 35,0 ±1,6 32,5 ±1,0

В. subtilis 36,0 ±2,3 40,5 ±1,5 42,5 ±2,5 45,0 ±2,0 42,5 ±1,8

P. fimiculosum 14,0± 1,0 15,8 ±0,7 25,0 ±2,3 26,0 ±2,8 27,0 ±1,4

A. niger 13,5 ± 1,1 14,5 ±0,6 19,0 ±1,5 18,5 ±0,8 22,0 ±1,6

При определении минимальной биоцидной концентрации (МБК) сырца антибиотика 322 выявлено, что наиболее чувствительны к исследуемому сырцу грамположительные бактерии и микромицеты родов Alternaria, Chaetomium и Fusarium (МБК составляют от 20 до 70 мкг/мл). МБК для грибов родов Aspergillus, Pénicillium, Trichoderma составляют от 100 до 200 мкг/мл. Наименее чувствительными (МБК > 250 мкг/мл) по отношению к сырцу антибиотика 322 являются грамотрицательные бактерии и дрожжи.

При сопоставлении антимикробной активности выделенного сырца антибиотика 322 с активностью высокоочищенных антибиотиков медицинского назначения установлено, что антибиотик 322 проявляет противогрибковую активность сходную или даже превосходящую активность полиеновых медицинских антибиотиков — нистатина и амфотерицина Б - в отношении всех исследуемых тест-культур за исключением A. niger и P. ochrochloron. Биологическая активность антибиотика 322 превосходит активность медицинских азольных антибиотиков (итраконазола, клотримазола, кетоконазола, флуконазола) в отношении тест-культур Fusarium oxysporum и A. niger, но уступает по отношению к тест-культуре A. flavus за исключением флуконазола. Антибиотик 322 не активен по отношению к грамотрицательным бактериям, а по отношению к грамположительным спорообразующим бактериям рода Bacillus его активность превышает активность оксацилина, цефазолина, цефатоксима и азтреонама. Очевидно, что при более высокой степени очистки исследуемого антибиотика (содержание гептаена в сырце 2,2 ± 0,3 %) от биологически неактивных примесей, его противомикробная активность будет значительно выше.

С целью определения новизны изучаемого антибиотика были проведены исследования по химической идентификации его компонентов. Гептаен выделяли из этанольного экстракта биомассы, экстракт упаривали в вакуумном испарителе при t=40°C и выдерживали при t=4°C 12 часов, в результате чего получали коричневый осадок и надосадочную водную жидкость. Осадок промывали трижды гексаном, затем эфиром, высушивали и получали осадок темно-желтого цвета, гексановый и эфирный растворы. Надосадочную водную жидкость дважды экстрагировали н-бутанолом. Бутанольный экстракт промывали дистиллированной водой и упаривали досуха под вакуумом. Осадок объединяли с темно-желтым осадком, промывали гексаном и эфиром. Получили вещество с Е1% ,см = 250 при X = 371 нм, метанольный

раствор которого пропускали через колонку с сефадексом G-5Ö. После удаления растворителей получен светло-коричневый порошок - гептаен, имеющий максимумы поглощения в УФ-спектре при 397нм (E,CM10/l 850), при 371 нм (Е,см1% 990), при 358 (Е1см1%742), при 336 нм (Е1см1%420) (рисунок 5).

Полученный гептаен хорошо растворим в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, пиридине, умеренно растворим в этаноле и других спиртах, не растворим в воде и гексане. В отличие от гептаенов, описанных в литературе, очень хорошо растворим в метаноле. Не имеет четкой температуры плавления, разлагается при 160 °С. Оптически деятелен - [a]JD21 = +165° (С=1,0 в метаноле).

В ИК - спектре (КВг) имеются полосы поглощения при 3421 см"1, 2964, 2934, 2895,2859,1711, 1646,1605, 1460,1383, 1261,1187, 1118, 1072, 1016, 980, 920, 849 см" Полосы поглощения при 1605, 1187, 849 см"1 могут соответствовать п-аминобензоилену; при 1711 см"1 - карбонил лактону; при 1646, 1016, 980 см"1 - за счет колебаний двойной связи, а при 980 см"1 свидетельствуют о наличии группы транс -СН = СН -. В соответствии с данными ИК и УФ - спектров полиен 322 может быть отнесен к группе ароматических гептаеновых антибиотиков.

Длина волны, нм Время, мин

Рисунок 5 - УФ-спектр поглощения 1- Рисунок 6 - ВЭЖХ гептаена 322 % этанолыюго раствора гептаена 322

Хроматографическая подвижность гептаена 322 (метод ТСХ) изучена в 10 различных системах растворителей. В качестве образцов сравнения использовались гептаены: леворин, трихомицин и партрицин. Как следует из полученных результатов, антибиотик 322 является трехкомпонентным комплексом (системы растворителей метанол - уксусная кислота - вода (8:1:1) и метанол - >Щ3 - вода (20:1:4)) и в ряде систем по хроматографической подвижности отличается от известных гептаенов. Наличие трех компонентов в составе гептаена 322 подтверждено и методом ВЭЖХ (рисунок 6). Компоненты со временем выхода 12,17; 14,13; 14,67 минут имеют характерные для гептаенов полосы поглощения в УФ-спектрах - 336, 358, 371 и 397 нм.

Полученный нами сырец антибиотика 322 содержит 2,2 ± 0,3 % гептаена.

Выделение неполиеновых антибиотиков проводили из гексанового раствора и эфирного раствора, полученных при процедуре выделения гептаена. После удаления

гексана под вакуумом получали ярко-желтый осадок. Осадок растворяли в гексане, пропускали через колонку с сефадексом G-50 и элюировали гексаном. После удаления растворителя получали слегка желтоватое вещество (компонент 2), не имеющее максимумов поглощения в УФ - спектре. Аналогичным способом получали бесцветное вещество из эфирного раствора (компонент 3), имеющее слабое поглощение в УФ-спектре при Х=250 нм.

Оба компонента (2 и 3) хорошо растворимы в гексане, эфире и других органических растворителях, нерастворимы в воде. Оба компонента имеют очень близкие ИК - спектры. Так ИК - спектр компонента 3 (КВг): 3438, 2962, 2928, 2874, 2855, 1737, 1640, 1572, 1460, 1403, 1379, 1310, 1284, 1269, 1244, 1224, 1206, 1185, 1157, 1118, 1081, 1062, 1014, 991, 976, 987, 9292, 901, 878, 842, 812, 748, 718 см"1. В ИК - спектре компонента 2 отсутствует полоса поглощения при 1640 см"1, что можно трактовать как отсутствие колебания двойной связи. Поглощение при 1737 и 1572 см"1 свидетельствует о наличии в молекуле компонентов сложноэфирных связей; поглощение при 1310, 1224 и 1081 см"1 - о наличии гидроксильных групп или эфиров С — О. В обоих компонентах отсутствуют полосы поглощения, характерные для ароматического кольца (1600 и 1500 см"1). Компоненты 2 и 3 имеют очень близкие масс-спектры. В обоих вариантах базовым пиком является пик с а.е.м. 365.

По данным спектральных анализов можно предположить, что обе неполиеновые фракции антибиотического комплекса 322 относятся к антибиотикам - макролидам. Данные хроматографического анализа (метод ТСХ) показали, что компоненты 2 и 3 имеют отличия по величине Rf в трёх из пяти исследованных системах растворителей.

Неполиеновые компоненты 2 и 3 обладают одинаковой биологической активностью в отношении бактериальных культур родов Bacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Proteus и практически не активны в отношении дрожжей и мицелиальных грибов.

Таким образом, выделенная из почвы культура актиномицета Chainia sp. 322, образует комплекс антибиотиков с высокой противомикробной активностью и широким спектром действия. Антибиотик включает три основных компонента -ароматический гептаен с антифунгальной активностью и два неполиеновых компонента, в основном, с противобактериальной активностью. Следует отметить, что до настоящего времени о синтезе гептаенов актиномицетами рода Chainia не сообщалось.

3. Влияние полиенового антибиотика 322 на факторы патогенности оппортунистических грибов

Характер и степень влияния антибиотика 322 на каталазную активность и синтез полисахаридов микромицетами зависит от индивидуальных свойств тест-культур (таблица 3). Так, действие антибиотика 322 приводит к ингибированию каталазной активности в среднем на 44 % у двух из четырех исследуемых штаммов грибов. У двух других штаммов каталазная активность возрастает в 1,5 - 2,5 раза. Действие антибиотика 322 на экзополисахариды зависит от родовой принадлежности грибов. У

грибов рода Aspergillus выход экзополисахаридов возрастает в 1,4 - 3,2 раза, а у грибов рода Pénicillium снижается в среднем на 25 %.

Таблица 3 - Влияние антибиотика 322 на каталазную активность и образование

грибами экзополисахаридов

Микромицеты Концентрация антибиотика, мкг/мл Прирост биомассы, %к контролю Активность каталазы, %к контролю Продуктивность биомассы по экзополисахаридам, % к контролю

A. terreus 80 48 61 320

A. niger 80 48 243 140

P. funiculosum 40 63 155 82

P. ochrochloron 10 54 51 68

- контроль принят за 100 %

На пигментообразование антибиотик 322 оказывает ингибирующее действие у всех исследуемых культур. При степени подавления роста мицелия (на 23 — 87 %) антибиотик 322 снижает продуктивность биомассы по пигментам на 11 - 90 % в зависимости от тест-культуры. Данное свойство нового полиенового антибиотика 322 принципиально отличает его от синтетических фунгицидов, стимулирующих образование окрашенных метаболитов, и полностью согласуется с характером действия известных полиенов — амфотерицина Б и нистатина [Сухаревич, 2003] и нового гексаенового антибиотика 30 [Кузикова, 2010]. Эти результаты позволяют предположить наличие у полиенов, независимо от их строения, единого механизма подавления пигментогенеза у оппортунистических грибов.

Под действием антибиотика 322 так же, как и при действии других полиеновых антибиотиков и синтетических фунгицидов, происходит увеличение фосфолипазной активности на 17-65% в зависимости от культуры микромицетов.

Таким образом, синтетические средства - фунгициды и антибиотик природного происхождения влияют на образование факторов патогенности оппортунистическими грибами. Характер (ингибирование или стимулирование) и степень воздействия варьируют в зависимости от свойств антифунгальных веществ и грибов. Учитывая тот факт, что факторы патогенности выполняют и адаптационную функцию, очевидно, что любой биоцид, независимо от его происхождения, будет активизировать их образование.

Сопоставительный анализ фунгицидов и полученного антибиотика показал, что полиеновые антифунгальные антибиотики имеют определенную перспективу быть использованными в качестве средств защиты от грибов. Они характеризуются повышенной биологической активностью, специфичностью действия, к ним сравнительно редко возникает резистентность. Положительным свойством полиенов как антифунгальных средств является способность в значительной степени подавлять у грибов пигментогенез. Это свойство заслуживает особого внимания в связи с полифункциональностью пигментов, осуществляющих основную протекторную функцию. Стимуляция пигментообразования сопровождается повышением

устойчивости грибов к действию различного рода фунгицидов и других неблагоприятных воздействий.

Антибиотики не относятся к числу ксенобиотиков и в отличие от синтетических фунгицидов не накапливаются в среде. Следует отметить, что использование антибиотиков для защиты от оппортунистических грибов предполагает применение только антибиотиков, целенаправленно получаемых для этой цели и не относящихся к числу медицинских препаратов.

4. Комплексное действие полиенового антибиотика 322 и ПАВ на факторы

патогенности грибов

Известно, что использование в качестве антифунгальных средств комплексных препаратов фунгицид/антибиотик с ПАВ имеет ряд преимуществ по сравнению с действием только одного фунгицида/антибиотика или только ПАВ [Кузикова, 2005; Кузикова, 2010]. Под действием ПАВ увеличивается клеточная проницаемость микромицетов, повышается их чувствительность к фунгициду, что позволяет снизить концентрацию фунгицидов/антибиотиков в среде и в ряде случаев уменьшить образование микромицетами пигментов, полисахаридов, фосфолипаз [Кузикова, 2010]. Этот подход был апробирован нами как с целью повышения чувствительности грибов к антибиотику 322, так и возможного снижения указанных выше факторов патогенности. В качестве ПАВ нами был выбран экологически безопасный препарат -хлоргексидина биглюконат (ХГБ).

Для определения эффекта от сочетанного действия антибиотка 322 и ХГБ использовали индекс РБС (как показатель фунгицидного эффекта) [БгЬауакЫуа, 2012; Поляк, 2012].

Результаты расчета индекса РБС показали, что при использовании антибиотика 322 в комплексе с ХГБ наблюдаются аддитивные и синергидный эффекты их взаимодействия. Индекс ББС составляет от 0,43 до 0,85 в зависимости от тест-культуры, что свидетельствует о достаточно высокой эффективности применения такого сочетания. В комплексном препарате фунгицидная концентрация антибиотика 322 по сравнению с его индивидуальным использованием снижается от 1,2 до 3 раз в зависимости от тест-культур.

При исследовании влияния антибиотика 322 в комплексе с ХГБ на факторы патогенности грибов выявлено (рисунок 7), что комплексный препарат снижает образование пигментов, экзополисахаридов и активность каталаз у всех исследуемых грибов до уровня более низкого, чем под воздействием одного антибиотика, за исключением А. 1егге№ (пигменты и каталаза).

Однако изучение сочетанного действия антибиотика 322 и ХГБ на фосфолипазную активность показало, что у всех культур микромицетов происходит увеличение активности фермента по сравнению с действием только антибиотика 322, даже несмотря на то, что сам ХГБ практически не оказывает стимулирующего действия на фосфолипазную активность грибов.

Таким образом, по итогам изучения действия комплексного препарата -антибиотик 322 + ХГБ - на некоторые факторы патогенное™ оппортунистических грибов выявлены и экспериментально подтверждены его преимущества как антифунгального средства по сравнению с действием только антибиотика на эти же свойства грибов. Основными преимуществами использования комплекса являются значительное снижение минимальной фунгицидной концентрации антибиотика 322 в сочетании с ПАВ, а также снижение продуктивности грибного мицелия по пигментам и экзополисахаридам, уменьшение активности некоторых ферментов, относящихся к факторам патогенности оппортунистических грибов.

Антифунгальные средства - антибиотик 322 и его сочетание с ХГБ - были успешно испытаны в Библиотеке РАН при дезинфекционной обработке книг, что подтверждено соответствующим актом.

350

зоо

250 200 150 100 50 0

гЬ

гЬ

пигменты эпех каталача

Азрегд^Шм 1й§ег

и

пигменты эпох каталача

АзрехдгШиз (епеиз

гЬ

лпгмешы эпох каталача РешсЛШип Йиисгйогтап

□ антпбттоттпг 322

И антибиотик 322 + ХТТ>

Рисунок 7 - Комплексное действие антибиотика 322 и ХГБ на факторы патогенности грибов; контроль принят за 100 %

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что под действием синтетических фунгицидов (метатина ОТ, катамина АБ, метацида) происходит увеличение образования таких факторов патогенности оппортунистических грибов как экзополисахариды, пигменты, фосфолипазы, протеазы и каталазы.

2. Из почвы выделена культура актиномицета, образующая высокоактивный антифунгальный антибиотик. На основании морфолого-культуральных и физиолого-биохимических характеристик культура отнесена к роду СЬаииа и обозначена как СИаМа Ар. 322. Показано, что антибиотик обладает широким спектром антимикробного действия в отношении мицелиальных грибов, дрожжей и грамположительных бактерий.

3. Разработан способ выделения из биомассы актиномицета Ска'т'ш яр. сырца антибиотического комплекса 322.

4. Антибиотический комплекс 322 состоит из 2-х компонентов - гептаенового и неполиенового, при этом в мицелии актиномицета содержатся оба компонента, а в среду выделяется только неполиеновый антибиотик.

5. Показано, что гептаеновый компонент антибиотического комплекса 322 обладает противогрибковой активностью, а неполиеновый — противобактериальной. Широкий спектр действия антибиотического комплекса 322 делает возможным создание на его основе бактерицидных и фунгицидных препаратов разного назначения.

6. Установлено, что биологическая активность сырца антибиотического комплекса 322 в отношении оппортунистических грибов и грамположительных бактерий сравнима с активностью известных медицинских препаратов высокой степени очистки.

7. Выявлено свойство полиенового антибиотика 322 подавлять процессы пигментообразования у всех исследованных микромицетов, а также у большинства культур ингибировать синтез полисахаридов и снижать активность каталаз.

8. Показано, что комплексное использование антибиотика 322 и ХГБ позволяет без снижения эффекта воздействия сократить расход антибиотика 322 в 1,2 — 3 раза, снизить уровни некоторых факторов патогенности оппортунистических грибов -пигментов, экзополисахаридов, каталаз.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Зайцева, Т.Б. Физико-химические свойства и противомикробная активность антибиотического комплекса, образуемого актиномицетом Chainia sp. 322 / Т.Б. Зайцева, Т.Д. Трошева, В.И. Сухаревич, Н.Г. Медведева // Биотехнология. - 2012.-№ 5. - С. 86-95.

2. Кузикова, И.Л. Потенциальная патогенность микромицетов-контаминантов библиотечных фондов / И. Л. Кузикова, Е. А. Тилева, Т. Д. Трошева, Н. Г. Медведева // Микология и фитопатология. - 2012.- Том 46, вып. 5.- С. 329-333.

б) статьи и тезисы научных конференций

3. Kuzikova, I. L. Effect of polyene antibiotics on the potential pathogenicity factors in saprophytic micromycetes / I.L. Kuzikova, N.G Medvedeva, V.l. Sukharevich, T.D. Trosheva // Fungi: Types, Environmental Impact and Role in Disease. - New York: Nova Science Publishers, Inc., 2012. - Chapter 5. - P. 67-86.

4. Трошева, Т. Д. Поиск и выделение из экологических систем микроорганизмов, обладающих антифунгальной активностью / Т. Д. Трошева, Т. Б. Зайцева, И. Л. Кузикова // Сборник научных трудов молодых специалистов, преподавателей и аспирантов: 3-й молодежный экологический конгресс «Северная Пальмира» (21 - 22 ноября 2011, Санкт-Петербург). - СПб.: НИЦЭБ РАН, 2011. - С. 56-60.

5. Трошева Т. Д. Влияние нового полиенового антифунгального антибиотика на факторы патогенности оппортунистических грибов / Т. Д. Трошева, Т. Б. Зайцева, И. Л. Кузикова // Сборник научных трудов молодых специалистов, преподавателей и аспирантов: 4-й молодежный экологический конгресс «Северная Пальмира» (27 - 28 ноября 2012, Санкт-Петербург). -СПб.: НИЦЭБ РАН, 2012. - С. 251-256.

6. Кузикова, И. Л. Фунгициды и уровень потенциальной патогенности изолятов грибов-контаминантов воздушной среды и микоповрежденных материалов / И. Л. Кузикова, Н. Г. Медведева, Т.Д. Трошева // Материалы 6-ой международной конференции «Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон ЭКОГИДРОМЕТ» (2 - 4 июля 2012, Санкт-Петербург).- СПб.: РГГМУ, 2012.-С. 25-27.

7. Кузикова, И. Л. Способы повышения чувствительности мицелиальных грибов к фунгицидам / И. Л. Кузикова, Н. Г. Медведева, Т.Д. Трошева // Тезисы докладов научно-практической конференции «Адаптационные стратегии живых систем» (11 -16 июня 2012, Киев).- Киев: издатель B.C. Мартынюк, 2012. - С. 281-282.

8. Медведева, Н.Г. Фунгициды и потенциальная патогенность микромицетов-деструкторов библиотечных фондов / Н. Г. Медведева, И. Л. Кузикова, Т. Д. Трошева // HayKoei доповда IX М1жнародно1 практично!- конференцн «Дослщження, консерващя та реставрашя музейних памяток: досягнення, тенденци розвитку». 36ipnnK до 75-р1ччя Нацюнапьного науково- дослщного реставрацшного центру Украшы (27-31 мая 2013, Киев). - Киев.: ННДРЦУ, 2013. - с. 189-194.

Подписано в печать 21.10.2013. Формат 60x84 1/16 Гарнитура Times New Roman. Печать цифровая. Бумага офсетная 80г/м2. Печ. л. 1,38. Тираж 100 экз. Заказ № 125 Отпечатано в ООО «Политехника-сервис», 191023, Санкт-Петербург, Измайловский пр., 18 Д