Грибы рода Botrytis Micheli (Fungi, Deuteromycota)

Лихачев, Александр Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Грибы рода Botrytis Micheli (Fungi, Deuteromycota)
ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Грибы рода Botrytis Micheli (Fungi, Deuteromycota)"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи

ЛИХАЧЕВ

Александр Николаевич

Грибы рода Botrytis Micheli (Fungi, Deuteromycota). Биология, экология, микроэволюция.

Специальность - 03. 00. 24 - микология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносое

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Ю.Т. Дьяко

Официальные оппоненты - доктор биологических наук М.Ф. Григорьев

доктор биологических наук A.M. Жуков доктор биологических наук Ю.В.Синадский

Ведущая организация - Московская сельскохозяйственная академия имени К. А. Тимирязева

Защита состоится октября 2000 г. в ауд. М - 1 в 15-30 час. на заседании диссертационного совета Д. 053. 05. 65 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, корп. 12, биологический ф-т.

Факс (095) 939-39-70

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ф-та МГУ им. MB. Ломоносова.

Автореферат разослан ^ сентября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

С.Н. Лекомцева

/7 т

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Грибы рода Botrytis Micheli встречаются практически во всех регионах земного шара. Многие из них являются возбудителями серой гнили культурных растений, приносящей значительный ущерб урожаю. Виды рода Botrytis отличаются значительной изменчивостью, выраженной в многообразии культурально -морфологических, физиолого-биохимических признаков и паразитических свойств.

Изучение фитопатогенных грибов в биоценозах чаще всего проводится для облигатных биотрофных видов - паразитов сельскохозяйственных растений - мучнисто-росяных и ржавчинных (Горленко, 1974, 1995; Берлянд-Кожевников, 1976, 1979; Михайлова и др., 1982; Лекомцева, 1996; и др.). Значительно меньшее внимание уделяется сравнительному изучению биоразнообразия факультативных патогенов растений (Дьяков, 1998, 2000; Веденяпина, 2000). В целом роль патогенных для растений грибов из различных экологических групп в биоценозах изучена недостаточно.

Сведения о распространении видов Botrytis на различных видах растений в биоценозах немногочисленны. Значительные потери урожая при поражении культурных растений грибами этого рода инициируют интерес к всестороннему исследованию биологии возбудителей и разработке средств защиты. Необходимость проведения таких исследований продиктована экономической целесообразностью. Статистические данные по десяти странам Европы показывают, что только на винограде половина средств из проводимых защитных мероприятий приходится на борьбу с серой гнилью, вызываемой Botrytis cinerea Pers.: Fr. (Mathys, 1982). При этом важной и практически мало исследованной проблемой является появление в естественных ценозах устойчивых к фунгицидам форм патогенов.

Виды рода Botrytis являются удобной моделью для изучения этапов эволюции паразитизма иекротрофных грибов. Кроме того, некоторые из них являются продуцентами биологически активных веществ (Герасимова и др., 1983; Филимонова, Талиева, 1992; Куплетская, Лихачев, 1996)

Таким образом, многоплановые исследования биологии грибов рода Botrytis представляются актуальными для выявления видового разнообразия грибов в био - и агроценозах и роли иекротрофных видов патогенов растений в биоценозах, а также для решения практических проблем ограничения развития возбудителей серой гнили на культурных видах.

Цели исследований. Основной целью работы является изучение видов рода Botrytis в естественных условиях на дикорастущих видах растений и выявление особенностей их биологии по сравнению с развитием на культурных видах. Используя фитопатогенные виды Botrytis в качестве модели некротрофных паразитов, установить влияние растений-хозяев на

полиморфизм, цикл развития и формирование морфологических структур. Выявить наличие устойчивых к фунгицидам форм в биоценозах, их влияние на структуру популяции В. cinerea и резистентность морфологических структур. Изучить особенности популяций фигопатогенных видов Botrytis на культурных и дикорастущих растениях для выяснения внутривидового разнообразия и микроэволюционных процессов у факультативных паразитов. Исследовать взаимодействие видов Botrytis с микобиотой для регуляции численности патогенов и разработки теоретических основ использования антагонистических отношений грибов для создания биопрепаратов.

Задачи исследований: 1 .Выявление видового состава рода Botrytis в условиях Московской области и круга поражаемых ими видов растений 2. Изучение паразитических свойств видор Botrytis. 3. Исследование цикла развития видов рода Botrytis при естественном поражении растений - хозяев из разных семейств и полиморфизма морфологических структур in vitro и in vivo. 4. Изучение реакций вегетативной совместимости между видами и штаммами Botrytis разного происхождения. 5. Исследование ряда биохимических свойств у штаммов видов Botrytis: токсичности культуральных жидкостей, качественного и количественной: соотношения моносахаров в их полисахаридных фракциях, спектра изозимов некоторых ферментов, б. Выявление устойчивых к фунгицидам форм патогенов в естественных ценоза* и агросисгемах и их влияния на структуру популяции В. cinerea.. 7. Изучение взаимоотношения видов Botrytis с микобиотой пораженных серой гнилью растений. 8 Выявление влияния окультуренности почвы и минеральных удобрений на повышенш устойчивости растений к серой гнили.

Научная новизна. В результате многолетних наблюдений установлен круг растений-хозяев грибов рода Botrytis, включающий 199 видов из 55 семейств. Выявлены новые видь растений-хозяев В. cinerea, ранее не указанные в определителях и списках работ посвященных исследованию возбудителей серой гнили. Выявлены специализированны« виды и формы Botrytis, не установленные ранее для Московской области, - В. comediaría - h¡ ландыше майском (Convallaria majalis L.) и Botrytis sp. - на майнике двулистно» Majanthemum bifolium (L.) F.W. Schmidt) и ирисе водяном (Iris pseudacorus L.). Ежегодш поражаемые В. cinerea виды хозяев, выделенные в группу растений - реципиентов служат резерваторами различных форм патогена, определяют состав популяции гриба н; восприимчивых хозяевах в био- и агроценозах. Впервые установлена ценотическая роль В cinerea, проявляющаяся в снижении репродукции и жизнеспособности семян растений з; счет внешней и внутренней инфекции. Разработаны методы получения моноспоровьк культур и оценки патогенности видов Botrytis при искусственном заражении. Определен; вирулентность штаммов грибов, выделенных с дикорастущих и культурных растений

Впервые научено проявление патогенности по отношению разных хозяев у 35 штаммов В. cinerea и 5-и специализированных видов Botrytis. Определена структура популяций В. cinerea и специализированных видов Botrytis по признаку вирулентности и раду физиолого-биохимических свойств. Изучена динамика развития морфологических структур - мицелия, схлероциев и конидиального спороношения in vitro и in vivo. Выявлены особенности формирования этих структур на разных видах хозяев и их органах. Изучено внутривидовое разнообразие видов Botrytis по культурально - морфологическим признакам, проявлению токсичности, спектру изозимов ряда ферментов и реакциям вегетативной совместимости. Впервые установлена возможность синтеза глицериноксидазы видами Botrytis. В природной популяции видов Botrytis обнаружены формы, устойчивые к фунгицидам с разным механизмом действия. Специализированные виды Botrytis более чувствительны к фунгицидам по сравнению с многоядным видом В. cinerea.

Практическая значимость работы. Результаты исследований специализации и роли грибов рода Botrytis в качестве компонентов природных биоценозов позволяют выявить источники возбудителей серой гнили для культурных видов. Предложенная в работе оценка патогенности видов Botrytis применима для выявления вирулентности возбудителей и оценки устойчивости растений к патогенным относительно слабо специализированным видам грибов. Определение устойчивости к фунгицидам морфологических структур В. cinerea на землянике, наличие устойчивых клонов видов Botrytis в био- и агроценозах, выявленные особенности влияния химических препаратов на изменение цикла развития возбудителей позволяют предложить последовательность применения фунгицидов различного действия для ограничения развития возбудителей серой гнили. При изучении микобиоты пораженных серой гнилью растений выявлены антагонисты к возбудителям заболевания - штаммы Trichoderma viride Pers С учетом результатов изучения взаимодействия видов Botrytis с разными представителями микобиоты высказан ряд научно-методических положений по разработке теоретических основ биометода. Этот метод может бьггь применен одновременно с агротехническими мероприятиями. Виды рода Botrytis могут служить продуцентами глицериноксидазы, применяемой в медицинских целях. Материалы диссертации используются в лекциях по фитопатологии и спецкурсах кафедры микологии и альгологии биологического факультета, кафедры агрохимии факультета почвоведения МГУ.

Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации были представлены на многих конференциях: «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» М. 1970; «Московский Университет - сельскому хозяйству» М. 1972; «Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур» Вильнюс. 1978; «Споровые растения Средней

Азии и Казахстана» Душанбе. 1978; « МГУ - сельскому хозяйству», М. 1982; «Изучение грибов в биогеоценозах» Свердловск.,1988; «Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы растений и животных» Ташкент, 1989;»; «Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов». Донецк. Украина, 1997; Intern. Conf. Ecological effects of microorganisms action. Vilnius. 1997, Международная конф. посвященная 80-лепда каф. микологии и альгологии МГУ и 90 - летию со дня рождения М.В. Горленко. "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии".М.1998; II (X) съезд Русского ботанического общества. «Проблемы ботаники на рубеже XX - XXI веков.» С - Пб.1998; « Проблемы охраны и рационального использования природных экосистем и биологических ресурсов», Пенза, 1998; «Актуальные вопросы агроэкологии в интегрированных системах защиты растений», Пенза, 1999; «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов.(к 110 - летию со дня рождения проф. Е.Е. Успенского)». М. МГУ. 2000 г.; «X Московское совещание по филогении растений» М. МГУ. 2000 г.; Междунар. конф. «Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность». С-Петербург. 2000 г.; XII th International Botrytis Symposium. Reims. France. 2000.

По материалам диссертации опубликовано 47 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 322 стр. компьютерного текста (MS Windows 95, Arial 13 / 1,5), состоит из введения, 3 глав, включающих 37 разделов, обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 887 наименований (из них 350 на иностранных языках) и приложения. Работа содержит 50 таблиц и иллюстрирована 23 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы исследований, изложены цели и задачи работы, показана научная новизна и практическая значимость полученных результатов.

Глава 1. Обзор литературы.

Глава включает обзор литературы по изучению видов грибов рода Botrytis. Приведена историческая справка о систематике рода Botrytis и современные представления о его таксономии. Рассмотрены ареал и специализация видов рода Botrytis. Приведены данные о причинах и факторах определяющих устойчивость растений к возбудителям серой гнили в связи со специализацией. Особое внимание уделено роли фенолов и фитоалексинов. Представлены сведения о влиянии различных факторов, определяющих широту адаптационных возможностей грибов Botrytis. Показана роль дикорастущих хозяев в этом процессе. Рассмотрены ценотическая роль грибов, направления эволюции фитопатогенных

грибов, подразделение их на эколого-трофические группы, связанные с характером паразитизма на растениях-хозяевах. Представлены данные о роли метаболитов в патогенезе серой гнили. Изложены методы исследования структуры популяций грибов, находящихся на разных этапах эволюции паразитизма. Приведены данные по внутривидовому и видовому разнообразию Botrytis по ряду признаков и свойств, полученных с использованием разных методов исследований, включая молекулярные. Рассмотрены общие положения о взаимодействии грибов с другими организмами, взаимоотношение видов рода Botrytis с микробиотой, приведены примеры возможного использования антагонистов и фунгицидов с различным механизмом действия для ограничения развития серой гнили. Обсуждены причины появления резистентных к фунгицидам форм Botrytis и дана динамика их появления в ряде стран.

Глава 2. Материалы и методы.

Сбор материала и наблюдения за развитием возбудителей серой гнили растений проводили начиная с 1964 г. со второй половины апреля по ноябрь в разных районах Московской области, на стационарных площадках Звенигородской биологической станции и ботанического сада МГУ, оранжереях и теплицах. При учете распространения болезни, частоты встречаемости, анализе семян на наличие инфекции использовали общепринятые методы (Наумова, I960; Изучение устойчивости.,,ВИЗР. ред. Кривченко. 1972; Чумаков и др., 1974; Хохряков, 1979; Великанов и др., 1980). Выделение и культивирование грибов велось на сусло-агаре и среде Чапека при 24-26°С. Цвет колоний определяли по шкале А.С.Бондарцева (1953). Моноспоровые культуры грибов получали методом разведения конидиальной суспензии в различных модификациях (Васин, 1966, Кузнецов и др., 1968; Степанова, Сидорова, 1981; Лихачев, 1994). Для оценки уровня патогенности определяли показатель инфекционной нагрузки, рассчитываемый с учетом процента прорастания спор в суспензиях известной концентрации; с последующим заражением ими срезанных листьев тестерных растений. (Степанов, 1962). Стабильность культурально - морфологических признаков моноспоровых культур изучали путем отсева секторов из колоний, их клонирования (до 7 пассажей) на средах в 30-и кратной повторности (Гойман, 1964). Определение жизнеспособности склероциев проводили путей закладки на зимовку в почву семян клена ясенелистного (Acer negundlo) и ясеня высокого (Fraxinus excelsior), с выращенными на них штаммами. Образцы проб отбирали через каждый месяц со дня закладки опытов. Жизнеспособность устанавливали по развитию на склероциях конидяеносцев во влажных камерах и росту мицелия при посеве на питательные среды. Оценку токсичности культуральной жидкости после выращивания штаммов Botrytis исследовали на наборе тест-объектов - Paramecium caudatum, Chlorella sp, Escherichia coli,

Sàccharomyces cerevisiae, Staphylococcus aureus (Боровков, 1977; Методы ..., ред. Билай, 1982; Рубежняк, 1993, 1996). Испытание токсической активности проводили на газонах микроорганизмов, используя метод колодцев (Егоров, 1969). Фитотоксичность культуральной жидкости оценивали в баллах по развитию некрозов на срезанных листьях растений. Ингибирующее или стимулирующее действие определяли по прорастанию семян. Выделение полисахаридной фракции из культуральной жидкости и определение состава моносахаров проводили методами, описанными в ряде руководств (Зайцева, Афанасьева, 1957; «Методы химии углеводов» под ред. Кочеткова, 1967). Спектр водорастворимых белков и ферментов определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (Трувеллер, Нефёдов, 1974; Корочкин, 1977; Остерман, 1981; Micales, 1986). При оценке антибиотической активности грибов использовали методы, описанные Н С. Егоровым (1969) Микопаразитическую активность штаммов T.viride Pers. и других видов определяли по развитию культур паразитов на мицелии и склероциях разных штаммов В. cinerea (Лихачев, Васин, 1975). Выявление резистентных к фунгицидам форм Botrytis, оценку уровня устойчивости и адаптации проводили, используя методы изложенные в ряде руководств (Проблемы устойчивости..1978; Преодоление резистентности.., Метод, рекомендации,1991; Биоповреждения, Учебн. пособие, 1987). Статистическая обработка результатов производилась на персональном компьютере в программах "Microsoft Excel v.5.0" и "Statistika v.4.3."(Stat Soft, 1993).

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Виды рода Botrytis и спектр поражаемых ими растений в Московской области.

Представлен список растений-хозяев грибов рода Botrytis, включающий 199 видов из 55

семейств. Большая часть хозяев, зарегистрированных в биоценозах, ранее не указана в литературе. Наибольшее число восприимчивых видов выявлено в сем. Розоцветных, Бобовых и Сложноцветных (Rosaceae, Leguminosae, Compositae).

Показано, что в био- и агроценозах доминирует вид - В . cinerea Pers.: Fr.. Специализированные виды - В. tulipae (Lib.)Lind. - на тюльпанах и В. раеотае Oud- на пионах выявлены на садовых участках и ботаническом саду МГУ. В. allii Munn.- на вегетирующих растениях лука и при хранении, В. fabae Sard. - на кормовых бобах. На цветках клевера лугового (Trifolium pratense L.) в природе и на культивируемых сортам, встречается В. trifolii Веуша. На ландыше регулярно отмечено развитие В. convallaria (Kleb.) Ondrej. На ирисе водяном и майнике двулистном выделены две формы Botrytis sp, отличные от В. cinerea. Из почвы и растительных остатков подсолнечника выделен В. сатеа. Специализированные виды в биоценозах встречаются редко. Они чаще регистрируются на

садовых участках, ботсаду, куда заносятся с посадочным материалом. Морфометрические параметры видов приведены в табл. 1.

Таблица 1

Морфометрические показатели видов Botrytis

Вид Конидии (мкм) Конидиеносцы (мкм) Склероции на среде (мм)

В. cinerea 6-15x6-10 300-1500 1-10

В. allii 6,5- 16x3-6,5 150-300 редко

В. carnea 5-7 150-170 нет

В. convaUariae 8-22x5-12 400-600 0,5-1

В. íabae 10,5-24x10-18 160-350 1-2,5

В. paeoniae 9-12x7-9 100-200 0,5-1

В. tulipae 10-24х 10- 18 350-400 1-1,5

В. trifolíi 5-22x4-9 150-200 2-5

Botrytis sp. с майника 6,5-14,8x5-9,5 150-300 1-5

Botrytis sp. с ириса 6-17x6-10 500-2500 редко

Из почвы полей, занятых ягодными, овощными или цветочными культурами и с растительных остатков чаще всего выделяется В. cinerea, (табл.2)

Таблица 2

Частота встречаемости грибов рода Botrytis на опаде листьев древесных пород, растительных остатках и в почве (%).

Частота встречаемости (%)

Субстрат Вид гриба

В. cinerea В. allii В. tulipae В. paeoniae В. carnea

Клен

платановидный 80 _ - - -

Береза

бородавчатая 20 - - - -

Дуб черешчатый - _ _ — -

Пион 30 _ 25 _

Тюльпан 10 10 _

Лук репчатый 15 5

Салат 60 - - -

Почва с

посадками:

земляники 5 - - - -

салата — _ _

картофеля 2 _ _ _ 1

пионов 3 _ _

тюльпанов 7 - 6 - -

Как правило, его обилие возрастает к концу вегетации. Вероятно, поступление инфекционного материала с пораженных тканей и растительных остатков увеличивает содержание гриба в почве. В почвах, занятых зерновыми культурами и картофелем, патоген выделяется крайне редко. Специализированные виды - В. аПИ, В. шИрае, В. раеотае крайне

редко выделяются из почвы и приурочены в основном к растительным остаткам, на которых способны сохраняться в течение нескольких сезонов.

Многоядносгь В .cinerea в Московской области указывает на отсутствие или слабую специализацию гриба. При развитии на культурных видах он вызывает массовое поражение растений, реже - на некоторых дикорастущих видах (Лихачев, 1978, 1979). Симптомы серой гнили проявляются чаще всего на генеративных органах растений - бутонах, цветках и плодах, реже - на листьях и стеблях. Преимущественное поражение генеративных органов многнх видов растений в биоценозах сказывается на их репродукции. Наблюдения за развитием В. cinerea в биоценозах позволило выявить ежегодно поражаемые виды, которые мы относим к растениям - реципиентам. В биоценозах к таковым относятся -земляника, малина, костяника, ландыш майский, купена лекарственная, ирис водяной и др. На данных видах частота встречаемости В. cinerea составляет от 10 до 40%. На видах-реципиентах происходит первоначальное накопление инфекции и перезимовка патогена, обеспечивающие последующее массовое развитие гриба. В связи с этим они могут служить резерваторами различных форм патогена и определять состав популяций гриба на восприимчивых растениях-хозяевах.У растений-реципиентов, как правило, доминирует вегетативное размножение, которое обеспечивает выровненный по генетической восприимчивости фон для возбудителя. Многие виды растений-реципиентов одновременно представлены как в био- , так и в агроценозах. В связи с этим природная инфекция В. cinerea на дикорастущих видах может оказывать определенное влияние на структуру популяций В.

cinerea на растениях - хозяевах при выращивании в производственных условиях.

3.2. Особенности биологии возбудителей серой гнили

Частота встречаемости видов Botrytis зависит от наличия восприимчивых видов растений,

условий микроклимата, стадии развития растений, характера сохранения инфекционного начала и других причин. Причины преимущественного развития В. cinerea на генеративных органах растений в биоценозах можно объяснить быстрым развитием и старением тканей цветка, а также разной динамикой накопления биологически активных веществ в генеративных и вегетативных органах, обуславливающих их разную устойчивость к патогену (Ваяндина, 1995, Храмова, 1997). Поражение генеративных органов может сказываться на возобновлении растений в биоценозах. На культурных видах характер поражения отличается от наблюдаемого в естественных биоценозах. Виды Botrytis в этих условиях способны в сильной степени поражать листья, стебли, а также луковицы, клубни и т. д. Особенности развития грибов на культурных видах обеспечивают массовое размножение возбудителей серой гнили, вызывающее значительные потери урожая. В. cinerea может сохраняться на семенах дикорастущих и культурных видов в виде внешней и

внутренней инфекции. Поражение серой гнилью на ранних стадиях развития генеративных органов приводит к нарушению образования семян. Всхожесть пораженных серой гнилью семян значительно снижается. Возобновление роста и спороношения грибов рода Botrytis в природе наблюдается весной, с середины - конца апреля, при наступлении положительных температур + 3 - 10°С. Частота встречаемости Botrytis нарастает при массовом цветении и плодоношении хозяев. Пик развития болезни приходится на август - сентябрь (Лихачев, 1979).

Виды Botrytis сохраняются в основном в виде мицелия и склероциев (Лихачев, Васин, 1970). Доминирование конидиалъного спороношения или склероциев в онтогенезе разных видов Botrytis определяется условиями среды и особенностями развития на различных органах растений. В оранжереях и теплицах преобладает конидиальное спороношение. На посадках различных культур у В. tulipae, В. allii В. paeoniae, В. cinerea в мае конидиальное спороношение изначально наблюдается у растений с латентной мицелиальной инфекцией. Конидиальное спороношение развивается также из сохранившихся на растительных остатках прорастающих склероциев. В период вегетации доминирует конидиальное спороношение. В. cinerea формирует покоящуюся стадию - склероцин не на всех видах растений. У разных видов Botrytis они, в зависимости от хозяина, могут развиваться на плодах, соцветиях, на стеблях под эпидермисом, листовой пластинке, отмерших цветоносах, клубнях, луковицах и т.д. Сохранение в пораженных тканях растений слабо специализированного В. cinerea и специализированных видов В. allii, В. tulipae, В. paeoniae, В. covallariae только в виде мицелия приводит к изменению цикла развития грибов - потере склероциев. Выпадение из онтогенеза склероциев и резкое снижение функционирования микроконидий приводит к потере половой стадии.

3.3. Патогенность видов рода Botrytis и штаммов & cinerea, выделенных с разных растений-хозяев.

Для патогенных видов Botrytis при искусственном заражении применена оценка степени

патогенности (вирулентности) отдельных изолятов, основой которой является «числовой порог инфекции» (или инфекционная нагрузка) с учетом процента прорастания конидий при определенной концентрации суспензии спор. При определении патогенности штаммов В. cinerea, изолированных с различных растений-хозяев, изучен процент прорастания конидий гриба через 12 ч. в суспензиях, различающихся концентрациями спор, и проведен учет некрозов. В качестве модели использованы листья фасоли. Как видно из табл. 3, концентрация суспензии спор влияет на их прорастание. Оптимальный процент прорастания наблюдается при концентрации суспензии 100 спор в 0,01 мл. При высокой концентрации суспензии, вероятно, происходит самоингибирование прорастания, что отмечалось многими

авторами не только для В. cinerea, но и у других видов грибов. Вирулентность штаммов гриба с диких видов в целом выше, чем с культурных растений (сорта земляники и малины, бобы, фасоль, цинния, кабачок, подсолнечник). Сравнение вирулентности штаммов В. cinerea с лесной и сортов культурной земляники, а также аналогичное сопоставление между штаммами с лесной и культурной малины показало, что вирулентность гриба на диких видах превышает этот показатель на культурных практически в полтора - два раза (табл. 3).

При искусственном заражении суспензией спор в концентрациях 50, 200, 1000 конидий в 0.01 мл штаммов специализированных видов Botrytis с пиона, тюльпана, ландыша майского и неспециализированного В, cinerea изолированных с листьев земляники, ландыша, майника двулистного выявлено неодинаковое проявление симптомов серой гнили (табл. 3). При минимальной инфекционной нагрузке (50 конидий) хлорозы и некрозы наблюдались только при заражении листьев соответствующих хозяев специализированными видами. Увеличение споровой нагрузки (до 200 конидий) привело к снижению разницы в поражении листьев растений-хозяев штаммами Botrytis. Это может служить показателем потенциальной патогенности некротрофных паразитов при высокой инфекционной нагрузке.

Таблица 3

Прорастание конидий штаммов Botrytis cinerea Pers. различного происхождения в зависимости от концентрации спор в суспензии и образование некрозов на

листьях фасоли

Растение - хозяин Число проросших конидий через 12 ч. (%)

Титр конвдкй в 0,01 мл и образование некрозов

10 100 1000

Земляника (сорта) 14,3 - 24,2 + 10,2 -

Земляника лесная 19,7 + 17,1 + 8,9 +

Малина (сорта) 16,4 - 27,6 + 11,2 +

Малина лесная 10,5 19,2 + 9,4 -

Бобы конские 12,1 + 25,4 + 6,4 +

Фасоль обыкновенная 11,6 - 20,7 + 7,8 +

Клен платаяовядный 8,3 - 28,6 - 19,2 -

Одуванчик лекарственный 10,5 - 21,7 - 17,4 -

Бодяк обыкновенный 9,8 19,6 - 11,9 -

Шиповник собачий 11,5 - 21,5 - 17,1 +

Цинния 9,4 - 23,4 + 14,2 +

Кабачок 7,9 17,6 + 12,5 +

Подсолнечник 15,5 + 23,4 + 11,9 +

Георгии 18,4 25,2 - 21,5 -

Пастушья сумка 10,8 - 24,7 - 18,3 -

Примечание: + наличие некроза; - отсутствие сишггомов поражения растений

При концентрации 1000 спор в 0,01 мл наблюдались некротическая реакция или хлороз под «инфекционной» каплей. В последующие 3-4 суток отмечено разрастание некрозов. Разрастание некрозов прогрессирует после появления (на 2 -3 сутки) отмерших клеток на листьях растений. Специализированный вид В. сот>а11апае вызвал максимальное заражение листьев ландыша при всех концентрациях спор. Результаты оценки влияния концентрации

1С

суспензии спор для искусственного заражения показали наибольшую степень специализации в отношении ландыша у Б. сотаПапае, меньшую степень специализации видов В. ХиНрае и В. раеотае по отношению к основным растениям-хозяевам (тюльпану и пиону соответственно) (табл. 4).

Таблица 4

Проявление симптомов серой гнили при искусственном заражении листьев разных хозяев видами Botrytis

Растение - хозяии и проявление сиюггомов

Вид гриба, Татр Convallaria Majanthemum Paeonia Tulipae

растение-хозяин суспензии majalis bifolium hybr. hybr.

В. convallariae 50 +++ i - -

(Convallaria 200 +-W- ■к -

majalis) 1000 +++ -Н- +

Botrytis sp. 50 - -t-н- - -

(Majan thcmum 200 ± - -

bifolium) 1000 * ± ± -

B. paeoniae 50 - - - -

(Paeoniahybr.) 200 ± _

1000 ± + +++ ±

B. tulipae 50 ± ± + ++

(Tulipae hybr.) 200 _ + ± +++

1000 + -н- + +++

B. cinerea 50 ± + - -

(C. majalis) 200 ++ - -

1000 +++ ++ ±

B. cinerea 50 - - - -

(F. ananassa) 200 ± - -

1000 + -Н-+ ++ +

Примечание: + развитие некроза; ± проявление хлороза; - отсутствие реакции поражения растений.

Развитие только хлорозов или отсутствие реакций поражения при искусственном заражении растений штаммами В. cinerea, выделенными из земляники и ландыша, свидетельствует о их слабой вирулентности относительно исследуемых видов. В целом штаммы специализированных видов и форм Botrytis- В. tulipae, В. раеотае, В. convallariae, Bjtrytis sp. с майника вызывали более интенсивное развитие некрозов у основных хозяев. Специализация В. convallariae по отношению к ландышу, вероятно, может быть обусловлена составом биологически активных веществ хозяина, в том числе глюкозидов, определяющих устойчивость растений. У других специализированных видов - способностью ипактивировать фитоалексины хозяев (Дмитриев и др. 19&8, 1990; Deverall et al., 1969; Schroeder, 1972; Mansfield et al., 1974).

Для определения патогенности 36 штаммов неспециализированного В. cinerea с плантации культурной земляники проведено заражение 5-и видов растений-тестеров -проростков салата, а также листьев - подсолнечника, фасоли, земляники и бобов, (рис 1).

Bcl2

Bc9

Bcl6

BclS

Bc20

Bcl9

BclS

Bei 7

Bc8

Bc7

Bc6

Bc4

Bc3

Bc2

Bell Bc5 Bc22 .Vi BclO Bei

st Br31

"1Вс25

| ВсЗЗ

I Вс2б

' Bc21

Вс14

Вс13

- Вс32

Вс23

35 ■ Вс34 'Вс24

Üj Вс36 ' Вс35

Вс29

ВсЗО

■ > . 1 Г tlt. I

Группировка штаммов Botrytis cinerea, выделенных с сортов земляники, по результатам кластерного анализа проявления патогенпости на растениях - тестерах.

Вс.28

Вс.36 Вс.35

Вс.29

Вс.ЗО

Рис. 2

Группировка штаммов Botrytis cinerea, выделенных с сортов земляники, по результатам кластерного анализа времени проявления некрозов на растениях - тестерах.

Штаммы В.cinerea, изолированные из одной плантации земляники, отличались по патогенности на растениях-тестерах. Основная группа штаммов заражала землянику, что, по-видимому, указывает на большую восприимчивость основного растения-хозяина - земляники по сравнению с дополнительными - подсолнечник, фасоль, бобы. Заражение проростков салата (практически целых растений) позволило добиться максимального проявления патогенных свойств гриба. Изоляты В. cinerea различались по времени развития инфекции на растениях-тестерах (рис. 2). Разнообразие реакций видов растений, по аналогии с " облигатными патогенами, используемых в нашем случае как растения - тестеры по отношению к каждому штамму из одной популяции гриба, позволили оценить степень различий и сходства между ними методом кластерного анализа. Результаты показали, что в популяции В. cinerea с земляники выделяются несколько групп: 1-я группа включает 14 штаммов сходной вирулентности, формирующая некрозы на всех растениях-тестерах, 2-я группа объединяет штаммы (5, 11, 21-34) не поражающие только подсолнечник или землянику (10, 1), 3-ю группу представляют единичные штаммы В. cinerea, формирующие некрозы на одном, двух, или трех разных хозяевах. Разница во времени проявления некрозов указывает на различия штаммов по продолжительности латентного периода - от заражения до формирования новой генерации конидий, что в итоге может определять доминирование клонов с определенными паразитическими свойствами в популяции во времени.

Исследование патогенности некротрофного вида В. cinerea, показало, что для него, как и для облигатных патогенов, характерна клональная мозаичность популяции.

У В- cinerea на землянике можно выделить три группы изолятов, отличающихся по патогенности и длительности латентного периода. Первая труппа, доминирующая в популяции, включает клоны, вирулентные ко всем растениям - тестерам; вторая -отличается вирулентностью к отдельным видам и третья группа, занимающая промежуточное положение, состоит из изолятов, вирулентных для 2- 3 растений - хозяев.

По-видимому, различия в патогенности, наряду с временным фактором и фазами восприимчивости хозяев, определяют доминирование определенных клонов возбудителя на потенциальных видах хозяев.

3.4. Формирование морфологических структур грибами рода Botrytis in vivo

и in vitro.

Виды рода Botrytis характеризуются значительной изменчивостью морфолого-культуральных признаков на питательных средах. Наблюдения за развитием в чистой культуре изолятов, выделенных из различных природных субстратов, позволили выделить у видов и штаммов Botrytis четыре культурально-морфологических группы- мицелиальную, спорулирующую, склероциальную и промежуточную.

Сопоставление частот появления указанных групп, наблюдаемое в природе на растениях и в чистых культурах, выделенных с соответствующих хозяев, показало, что характер доминирования морфологических структур грибов в природных условиях на растениях отличается от наблюдаемого при выращивании на среде (табл.5). В целом на питательных средах штаммы неспециализированного вида В. cinerea и специализированных - В. paeoniae, В. iulipae, В. convallariae, В trifolii и Botrytis sp. (с ириса и майника) формируют все типы морфологических структур, за исключением апотециев, с разной степенью развития воздушного мицелия, спороношения и склероциев. На растениях грибы формируют только конидиальное спороношение и склероции. Склероции, особенно у В. cinerea, образуются не на всех пораженных растениях. Специализированные виды в чистой культуре отличаются слабым развитием мицелия и доминированием склероциев. Воздушный мицелий у штаммов из популяции В. cinerea превалирует в культуре.

Анализ культуральных признаков моноспоровых штаммов специализированных видов и форм В. cinerea, развивающихся на растениях- реципиентах, показал, что их вариабельность, определяемая по образованию в колониях аспорогенных участков мицелия и секторов с обильным спороношением или склероциями, составляет 2-5 %. Этот показатель у штаммов В. cinerea, выделенных с других растений, варьирует от 8 до 32%. Это может указывать на то, что полиморфность признаков у клонов грибов, существующих и развивающихся долгое время в условиях одной и той же трофической ниши, снижается.

Соотношение репродуктивных (спороношение), покоящихся структур (склероциев) и развитие воздушного мицелия может служить показателем тенденции жизненной стратегии видов Botrytis (табл.5). У штаммов B.cinerea тип стратегии на средах не совпадает с выявленным на растениях. На средах большая часть из них имеет свойства промежуточного типа стратегии, для которого характерно наличие развитого воздушного мицелия, конидиального спороношения и склероциев.

На растениях-хозяевах чаще наблюдается проявление стратегии г-типа - формирование только конидиального спороношения. На большинстве видов растений, поражаемых B.cinerea, преобладают формы, занимающие промежуточное положение между К и г-стратегами. Четко выраженные признаки К - стратегов в чистой культуре выявлены только у штаммов B.cinerea с некоторых растений и у специализированных видов. У специализированных видов проявление типа стратегии на среде и растениях, как правило, совпадает.

Поэтому тип жизненной стратегии, видимо, следует устанавливать с учетом сходства морфологических структур гриба на растениях и в чистой культуре.

Таблица 5

Распределение видов Botrytis по соотношению морфологических структур, образующихся в чистой культуре в сравнении с их формированием при естественном поражении растений

Растение хозяин Питательная среда 1 Растительный 1 Жизненная 1 субстрат 1 стратегия

Botrytis cinerea

Liliivm tigrinum Gawl. Возд.м; сп, ск сп R

Saponaria officinalis L. Возд.м; си, ск сп R

Aquilegia vulgaris L. Возд.и; сп, ск сп R

Acer platanoides L. ск, сп сп ПР

Ficaria venia Hands. Возд.м; сп, ск сп R

Escholtzia californita Возд м; сп, ск сп ПР

Capsella bursapastoris Mnch. Воздм; сп, ск сп ПР

Brassica oleracea L, Воздм; сп, ск сп, ск ПР

Matthiola tragrans Bung. Возд.м; сп, ск сп ПР

Ribes nignun L. Воздм; сп, ск сп ПР

Rubus idaeusL, Возд.м; сп, ск сп ПР

Fragaria vescaL. Возд.м; сп, ск сп ПР

Rosa majalis Heem. Возд м; сп сп R

Rcaiuna L. Возд.м; сп, ск сп ПР

Phascolus vulgaris L. Возд.м; сп, ск сп, ск К

Asamm europeum L. ck, сп сп ПР

Daucus sativus (Hofim.)Rochl. Возд.и; сп, ск сп, ск К

Pyrola media Sw. Возд.м; сп, ск ск К

Physalis hybnda Во1Д.и; сп, ск ск К

Cucumis sativus L. Возд.м; сп, ск ск, сп К

Cucurbita pepo L. Воздм; сп, ск ск, сп К

Allium cepa L. Botrytis allii сп сп R

Paeoniae L. Botrytis paeoniae Возд.м, сп, ck сп ск К

Tulipa hybr. Botrytis tulipae ck, сп ск, сп К

Convallaria majalis L. Botrytis convallariae ck сп ск, сп к

Trifolium salivum(Schrcb.) Crome Botrytis tnfolii Возд-м; ch, ck си R

Maianthemum bifolium (L) Schmidt Botrytis sp. ck, сп сп ПР

Iris pseudacorus L. Botiytis sp. Возд m, сп, ck сп, ск ПР

Примечание: И или К жизненная стратегия', ПР - промежуточное положение стратегии; жирный шрифт - преобладание развития морфологической структуры (возд м - воздушный мицелий; сп - конидиальное спороношсние; ск - склерошш).

3.5. Типы реакций вегетативной совместимости у грибов рода Botrytis. Для оценки видовой и внутривидовой дифференциации грибов рода Botrytis изучено проявление реакций вегетативной совместимости и несовместимости между изолятами разного происхождения (табл. б).

Проявление типов реакций вегетативной совместимости при сращивании культур видов рода Botrytis._

Вариан -ты сращивания Число пар ТИПЫ РЕАКЦИЙ (%)

Барраж Бордюр Ограничение роста Смешанный Валик Споро- ноше- вие Проникновение

А. Б

15. cinerea

1 600 17,3 24,6 15,6 9,5 3,5 11,1 6,3 12,3

2 373 6,9 13,9 13,9 15,2 5,6 17,9 6,4 19,8

3 278 1,0 11,5 16,5 12,5 7,1 15,1 13,6 22,3

В. tulipae

1 19 - 15,7 - - 21,0 52,6 -

2 56 - - 30,3 - - 21,0 52,6 16,0

3 36 - - 36,1 - - 11,1 27,7 25,0

В. allii

1 15 - - 2,0 - - 8,0 25,0 75,0

2 36 - - 7,0 - - 12,2 11,8 69,0

3 30 - 2,0 5,7 - - - 2,0 82,3

В.carnea

1 27 - - 11,1 - - 7,4 - 81,4

2 39 - 7,6 15,3 5,1 2,5 66,6 - 20,5

3 49 - 2,0 12,2 8,1 4,0 26,5 - 24,4

Примечание: Варяакгм сращивания культур одного вида: 1 - изодяг + изоллт другого происхождения; 2 - шелтг + моноспоровый птгамм, полученный из и'.олята другого происхождения; 3 - моноспоровыс штаммы разных юолягов.

При сращивании изолятов разных видов Botrytis и моноспоровых штаммов одного вида выявилось несколько типов реакций вегетативной совместимости:!) на месте контакта колоний формируется валик из воздушного мицелия, на котором иногда образуются конидии, 2) при контакте гиф колоний образуется полоса с обильным спороношением, при этом конидиеносцы выходят из среды; 3) мицелий свободно входит из одной колонии гриба в другую без заметных внешних изменений. Реакции совместимости характерны для штаммов с хорошо развитым воздушным мицелием.

Реакция вегетативной несовместимости была представлена в виде нескольких типов: 1) между колониями образуется разной ширины (до 1 мм) светлая зона - бордюр или отталкивание; 2) в толще среды по линии контакта субстратного мицелия двух колоний формируется пигментированная полоса, цвет которой варьирует от светло- до темно-коричневого - барраж; 3) рост одной, медленно растущей колонии, ограничен мицелием быстрорастущего штамма Вегетативная несовместимость четко проявляется у контрастных по культуральным признакам штаммов.

Наряду с указанными типами вегетативной несовместимости отмечены две формы их смешанного проявления. А) на протяжении зоны контакта колоний из воздушного мицелия образуется валик, а под ним, по линии субстратного мицелия - барраж; Б) в зоне

соприкосновения колоний наблюдается чередование участков с валиком из воздушного мицелия (чаще у внешнего края) с линиями в виде барража или бордюра.

У неспециализированного B.cinerea выявлен более широкий спектр проявления реакций вегетативной несовместимости по сравнению со специализированными видами. В вариантах сращивания моноспоровых культур B.cinerea наблюдается тенденция снижения частот реакций несовместимости и возрастание реакций совместимости. По-видимому, использование моноспоровых культур приводит к снижению разнообразия выявленных реакций взаимодействия клонов в популяциях B.cinerea по сравнению с наблюдаемым у многоспоровых клонов.

У специализированных видов В. allii, В. íulipae и сапротрофного В. carnea четких реакций несовместимости не наблюдалось, чгго отражает однородность состава этих видов по изучаемому признаку в сравнении с популяциями B.cinerea.

При изучении совместимости изолятов и моноспоровых культур в природной популяции специализированного вида В. convallariae на ландыше и штаммов В. cinerea с ландыша, а также В. cinerea с майника выявлены все указанные типы реакций. Штаммы В. convallariae с ландыша оказались несовместимыми с Botrytis sp. с майника и В. cinerea ландыша. В то же время они образовали три внутривидовых группы, различающиеся по совместимости. Эти результаты подтверждают изоляцию В. convallariae от близких по хозяевам изолятов В. cinerea.

В целом на культивируемых видах растений реакция несовместимости отмечается относительно с большей частотой по сравнению с дикорастущими видами. Полученные результаты свидетельствуют о различной степени изоляции клонов популяций специализированных и неспециализированных видов Botrytis по признакам вегетативной совместимости.

3.6. Биохимические особенности видов рода Botrytis Полиморфизм видов рода Botrytis по морфологии, культуральным особенностям, патогенное™ и другим признакам связан с метаболизмом изучаемой группы грибов. В связи с этим было проведено изучение некоторых физиолого-биохимических показателей у представителей Botrytis.

j.6.1. Изучение токсического действия видов и штаммов fíotrytis У видов рода Botrytis, как и у других некротрофных патогенов выявлен разнообразный набор ферментов и низкомолекулярных фитотоксинов. Однако роль этих метаболитов в патогенезе оценивается неоднозначно. Причиной проявления некротической реакции часто считают действие ферментов и токсинов (Gentile, 1954; Красильников, Кублицкая, 1956;

Аксенова, 1962; Ладыгина, 1962; Талиева, 1960; Талиева, Плотникова, 1962; Кожонова и др., 1970; Антонова, Бехтер, 1983, Leone, 1990). Полисахаридная фракция токсинов многих грибов определяет проявление некротической реакции у растений (Савельева, Рубин, 1963: Аксенова, 1964; Kamoen, Jamart, 1973; Бородин, 1979; Ахмеджанов и др.,1992).

В связи со сказанным определена токсическая активность культуральной жидкости видов Botrytis. Для этой цели были использованы фильтраты культуральной жидкости (ФКЖ) различных видов и штаммов Botrytis, токсическая активность которых определялась по отношению к ряду тест-объектов (см. раздел Материалы и методы).

ФКЖ большинства штаммов B.cinerea проявлял токсическое действие, изменяя характер движения или вызывая гибель парамеций (табл. 7). Токсичность ФКЖ возрастала с увеличением времени культивирования грибов. При этом наблюдалось увеличение числа токсичных штаммов. К 20-м суткам ФКЖ всех штаммов В. cinerea (за исключением штамма с Caltha palustris L.) приводил к гибели парамеций. Штаммы B.cinerea, различного происхождения различались по времени начального проявления токсичности, выраженного в изменении движения и гибели клеток парамеций.

Культуральная жидкость специализированных видов и сапротрофного - В.сатеа обладала более «мягким» действием на парамеции, изменяя только характер их движения и не вызывая гибели клеток.

Для оценки стабильности токсинообразования у штаммов B.cinerea представляло интерес выяснить, как сохраняется это свойство после перезимовки гриба в виде склероциев в почве естественного биоценоза Звенигородской биостанции и окультуренной почве ботанического сада МГУ. С этой целью склероции помещали в почву на зимний период (см. Материалы и методы), а затем проводилась реизоляция культур и изучалось действие ФКЖ на парамеции.

Лучше сохраняются склероции штаммов, обладающих высокой токсической активностью. При этом токсичность ЮК у реизолятов B.cinerea с земляники, полученных из склероциев, которые зимовали в разных почвах, значительно варьирует относительно исходных штаммов.

Результаты изучения токсичности штаммов В. cinerea различного происхождения показали, что токсинообразование не является стабильным свойством и в большой степени зависит не только от происхождения штамма и условий культивирования, но и типа почвы и, по-видимому, от присутствия в ней сопутствующей микробиоты. Роль токсичности разных изолятов гриба может заключаться в обеспечении его выживаемости в условиях сапротрофного существования, а различные свойства почв в разной степени могут способствовать поддержанию уровня токсичности штаммов гриба.

Влияние фильтратов культуральной жидкости видов рода Botrytis на Paramecium eaudatum в зависимости от времени инкубации грибов.

Субстрат. Вид гриба Экспозиция с ФКЖ

Происхождение. 5 сут. 10 сут. 20 сут.

Д 1 Ж Д- Ж д ж

В. cinerea Московская обл.

Melyanthes trifoliata L - - 2 - 1 60

Caltha palustris L. - - 90 - 50 _

Ranunculus acer L. 30 - 10 120 5 60

Fragaria ananassa E. _ _ 5 60 2 60

Daucus carota L. 60 - 5 20 5 40

Solanum lycoperäcum L. - - 50 - 40 120

Solanum tuberosum L. - - 10 - 10 140

Petunia hybrida - - 60 - 120

Senecio vulgaris L. 40 - 15 80 5 70

Sonchus arvensis L. 40 - 15 80 8 60

Rubus idacus L. _ - 5 90 2 70

Tagetes patulaL. _ - 1 40 2 40

Rosa hybrida 50 - 20 - 5 60

B. tulipae Московская обл.

Tulipa L. - 60 -

В. paeoniae Московская обл.

Paeonia hybrida - 1 - 120 - 10 -

В. allii Московская обл.

Allium сера L. - - ISO 1 - 1 60 -

В. carnea Московская обл.

Почва - - 50 - 50 -

В. cinerea Телсцкое озеро

Rubus idaeus L. - - ¡ 120 1 - 1 60 140

В. cinerea Молдавия

Vitis vinifera L. - - 1 120 - 1 60 140

В. cinerea Камчатка

Почва - - 1 30 1 120 1 10 60

Примечание: - - отсутствие действия ФКЖ; Д-изменение движения парамеций; Ж-гибель клеток в секундах.

Для определения токсических свойств видов и штаммов Botrytis по отношению к

растениям изучено влияние ФКЖ на изменение длины корня и стебля прорастающих семян

вики, а также действие ФКЖ B.citierea на листья сныти, земляники и проростки кресс-салата

Замачивание семян вики в ФКЖ штаммов и видов Botrytis вызвало задержку их прорастания

на 1- 2 суток. В зависимости от штамма В. cinerea наблюдается разная степень

ингибирования длины стеблей и корней по сравнению с контролем. ФКЖ

специализированных видов (B.paeoniae, B.tulipae, В. convaliariae и Botrytis sp. с майника) не

обладает ингибирующим действием, а иногда вызывал стимулирование роста стеблей. В

целом штаммы неспециализированного B.cinerea отличались большей токсичностью и различиями в действии КЖ по сравнению со специализированными видами (за исключением B.allii и сапротрофа В.сатеа). Разное проявление токсичности наблюдалось у штаммов B.cinerea, что говорит о неоднородности гриба по изученным показателям метаболизма

Можно предположить, чгго токсины этих грибов могут играть определенную роль в патогенезе. Источники азота и углерода в среде влияли на токсичность разных видов, что, по-видимому, связано с разными путями метаболизма у грибов изучаемой группы. Вопрос о связи между специализацией видов этого рода и токсичностью в отношении растений-хозяев остается открытым.

Анализ хроматограмм полисахаридной фракции культуральной жидкости разных видов Botrytis показал, что фракция B.cinerea, B.allii, B.tulipae содержит галактозу, глюкозу и маннозу. У B.paeoniae в составе полисахарида выявлено - 6, у B.comallariae -5, у Botrytis sp - 4, В. carnea - 3 вида моносахаров. Только у B.paeoniae и В. carnea в ее составе выявлена рамноза. Водные растворы полисахарида и элюаты некоторых моносахаров вызывали задержку прорастания семян вики и гибель парамеций, а также ингибировали развитие корней растений.

Различное проявление токсической активности видами рода Botrytis, выраженное в способности культуральной жидкости вызывать некрозы на листьях растений, разное накопление и состав моносахаров во фракции полисахаридов у разных видов свидетельствуют о неоднозначной роли токсичности в проявлении паразитических свойств у Botrytis. Одинаковый состав моносахаров у некоторых видов и разное проявление некротической реакции при действии моносахаров позволяет предположить, что изучаемые грибы синтезируют более сложный комплекс веществ, определяющих токсическое действие культуральных жидкостей. Результаты дальнейших исследований механизмов токсичности видов и штаммов Botrytis, по-видимому, могут быть полезными для выявления процессов паразитической специализации у группы широко специализированных некротрофных грибов.

3.б.2.Глицериноксидазная активность грибов рода Botrytis

Фермент глицериноксидаза используется для определения содержания триглицеридов. Повышенное содержание триглицеридов в крови приводит к возникновению атеросклероза и инфаркта миокарда. Для своевременного предупредительного лечения требуется эффективный метод определения данных веществ. Проведенные исследования совместно с сотрудником каф. микробиологии М.Б. Куплетской, впервые выявили наличие глицериноксидазы у фитопатогенных видов рода Botrytis.

Глнцериноксидазная активность грибов рода Botrytis Micheli.

Вяд1риба Происхождение Субстрат Число игтаммов Глнцериноксидазная

всего актив- активность, ев/ мг

ные белка

Подмосковье лук 19 19 0,070 -0,136

В. allii Крым 5 5 0,022 - 0,056

Узбекистан 3 3 0,0004-0,0007

В. tulipae Подмосковье тюльпан 6 6 0.017-0,299

Подмосковье малина

В. cinerea Камчатка земляника 23 23 0,001-0,005

Молдавия виноград

В. сагпеа Подмосковье почьа 2 0 Не обнаружена

Обнаружено, что глицериноксиазная активность видов В. allii и В. tulipae из Подмосковья значительно превышала активность фермента у В. allii из Крыма и Узбекистана. Штаммы неспециализированного вида В. cinerea разного происхождения показали низкую активность глицериноксидазы. У сапротрофного В. сатеа глицериноксидаза не обнаружена. Сравнение субстратной специфичности глицериноксидазы с этим же ферментом представителей рода Aspergillus (Uwajima, Terada, 1980) показало, что она идентична выделяемой у стандартного штамма Л. japonicus - ATOOS

3.6.3 Изучение комплекса фенолоксидазы и неспецифической эстеразы у грибов

рода Botrytis

Ответные реакции растений на заражение грибами рода Botrytis в связи с различным химическим составом тканей растений-хозяев могут обуславливаться проявлением активности различных ферментных систем. Элетрофорез полифенолоксидазы (ПФО) и неспецифической эстеразы в мицелии видов Botrytis показал различный состав фракций, отличающихся по электрофоретической подвижности.

У В. convallariae с ландыша выявлено от 2 до 5, Botrytis sp. с майника - 14, В. tulipae - 4, B.paeoniae- 2 фракции ПФО. Фракции ПФО с Rf 20; 28; 30 % свойственны всем изолятам видов Botrytis. В мицелии штаммов В. cinerea, выделенных с земляники, обнаружено от 2 до 12 фракций ПФО. У B.cimrea с цикламена, донника, фасоли выявлены две фракции ПФО - с Rf 14 и 20%.

Значительно большее разнообразие у видов Botrytis обнаружено в качественном и количественном составе фракций эстеразы. В составе эстераз В. convallariae с ландыша обнаружено от 2 до 6 фракций, при этом 5 фракций были характерны только для этого вида.. Наибольшим числом фракций - от 5 до 9 характеризовались штаммы В. tulipae и В. paeoniae, у штаммов Botrytis.sp. с майника обнаружено 3 фракции, у штаммов B.cinerea -от 1 до 14 фракций. Элекгрофоретическая подвижность изоферментов эстераз штаммов B.cinerea с

земляники частично не совпадала с обнаруженной у штаммов этого вида, выделенных с других растений. Были выявлены фракции эстеразы присущие только штаммам с земляники с Rf - 4% (15% штаммов), 27% (45%), 66% (33%), 73% (27%), 90% (76%) и 94% (48%). Наличие у Botrytis ряда общих фракций ферментов может указывать на определенное сходство видов по изучаемым параметрам.

Для выявления вероятной адаптивной роли ферментов изучен состав изоферментов ПФО и неспецифической эстеразы у резистентных к фунгицидам штаммов В. cinerea и В. allii. Резистентные кэупарену, ровралю, ронплану, беномилу клоны В.cinerea характеризовались наличием ряда полос ПФО, не обнаруженных у изолятов из популяций гриба не обработанных фунгицидами. У резистентных к эупарену клонов В. allii наблюдалось снижение вариабельности спектра ПФО по сравнению с исходными штаммами. Клоны B.cinerea, устойчивые к беномилу не изменяли спектра фенолоксидаз по сравнению с исходными культурами.

Сравнение состава нзозимов фенолоксидазы и эстеразы у устойчивых к разным фунгицидам клонов Botrytis с чувствительными изолятами соответствующих видов позволяют предположить, что под влиянием субстратов, содержащих разные классы химических соединений, могут происходить изменения в составе популяций грибов. Эти изменения могут иметь адаптивный характер и, вероятно, приводить к появлению новых г енетически измененных особей.

3.6.3. Анализ сходства и различий видов Botrytis по спектрам фенолоксидазы и неспецифической эстеразы

Метод изоферментного анализа широко применяется в изучении структуры популяций фитопатогенных грибов, поскольку позволяет использовать в качестве параметра структур генетически относительно нейтральные маркеры - изоферменты. Последние удобны для анализа, поскольку часто не связаны с признаками, зависящими от параметров среды (Дьяков, 1998). Поэтому применение этого метода позволяет выявлять процессы, протекающие в популяциях, т.е. оценивать микроэволюционный процесс.

Выявление изозимов фенолоксидазы и неспецифической эстеразы видов и штаммов рода Botrytis позволило провести сравнение внутривидового и межвидового разнообразия популяций указанной группы грибов методом кластерного анализа. Для построения филогенетического дерева использовали ГО метод (Saitou, Nei, 1987; Studier, Keppler, 1988).

Для анализа достоверности топологии деревьев применяли bootstrap анализ ( Efron, Gong, 1983; Felsenstein, 1985; Swofford, Olsen, 1990).

1_Л

83.

-В. cinerea Л B.c.4(C. majalis)

- В. cinerea JI B.c.l(C. majalis)

- В. cinerea Л В.с.2(С. majalis) -В. convallariae L7

- В. convallariae L2

- М2 Botrytis sp.l(M.bifolium)

- MlBotrytis sp.l(M. bifolium)

- B. cinerea Л B.c.3(C.majalis) -B. convallariae L3

- B, convallariae LI

- B. convallariae L8

Botrytis sp.2 (I.pseudacorus) Irl Botrytis sp.2 (I.pseudacorus)

— B. convallariae L6

- B. convallariae L5 -B. convallariae L4

B.carnea

Рис.3

Группировка штаммов видов рода Botrytis Micheli, выделенных с дикорастущих растений, по результатам кластерного анализа показателей

фракций эсгеразы

■ B.convalIariae8

В.сагоеаЗ Botrytis sp.-Iris2 Botrytis sp.-Irisl B.carnea2 B.cameal

■ B.convaHariae3

-B.convallariael

-B.cinerea -Convallarial

• B.convaIlariae6

Botrytis sp.-Maianthemura2

— B.paeoniael

-Botrytis sp.-Maianthemuml

--B.tulipae2

B.cinerea -Convallaria3 B.coriva]lariae2

— B.tulipael

---B.convaiIariae5

B.cinerea -ConvaIIaria4 -B.paeoniae2

B.cinerea -Convallaria2

• B.convalIariae7

B.convalIariae4

Рис. 4

Группировка штаммов видов рода Войгуйз, выделенных с дикорастущих растений, по результатам кластерного анализа показателей фракций полифеиолоксидазы

Результаты применения кластерного анализа показали разную степень дифференциации популяций на диких и культурных видах растений, (рис. 3, 4) В популяции видов и штаммов Botrytis на диких видах (ландыш майский, майник двулистный, ирис водяной) по спектрам изозимов фенолоксидазы они образовали обособленные между собой группы с показателем bootstrap от 36 до 80 - 136. Штаммы с ириса Botrytis sp. и В. сашеа составляют единую группу, обособленную от других видов.(рис. 4)

По спектрам эстеразы В. convallariac образовал отдельную четко ограниченную группу. В разных кластерах находятся Botrytis sp. 2 (с ириса), Botrytis sp. 1 (с майника) и В. cornea. Вьивлено расхождение штаммов В. cinerea (с ландыша) и В. convallariac, основного возбудителя серой гнили ландыша. При этом внутри штаммов В. cortvallariae отмечается наличие групп, с незначительным расхождением между ними по bootstrap показателям (рис.3).

Таким образом, в популяциях видов Botrytis на дикорастущих растениях выявлены четко расходящиеся группы. Значительные различия по изучаемым показателям В. cortvallariae от других форм и штаммов Botrytis подтверждают, наряду с другими признаками (морфология, культуральные особенности, патогенность, вегетативная совместимость, физиолого-биохимические признаки), обособленность вида от других видов Botrytis.

Изучение разнообразия изозимов штаммов В. cinerea с культурных сортов земляники показало, что по спектрам эстеразы и фенолоксидазы они образуют многочисленные пестрые группы с разной степенью расхождения. Некоторые группы штаммов образуют четкие кластеры, включающие 1-2 штамма с разным показателем bootstrap. Однако в целом популяция В. cinerea на культурной землянике отличается значительной вариабельностью состава и меньшей степенью дифференциации по сравнению с популяциями на диких видах растений.

3.7. Обоснование способов ограничения возбудителей серой гнили в агроценозах.

3.7.1. Взаимодействие видов рода Botrytis с микобиотой.

Состав микобиоты синузий с участием Botrytis до настоящего времени практически не

исследован. Не определено влияние состава микобиоты на цикл развития, формирование морфологических структур и выживаемость видов Botrytis.

Характер развития грибов рода Botrytis на растениях определяется их взаимодействием с микобиотой филлопланы. При этом в зависимости от биологических особенностей представителей микобиоты между возбудителями серой гнили и ее компонентами могут складываться различные типы взаимоотношений. Для обоснования применения

антагонистов возбудителей серой гнили в биологическом методе борьбы необходимо выявление всех типов взаимодействий микобиоты с патогеном.

При наблюдении совместного развития В. cincrea с другими возбудителями болезней на растениях обнаружено, что на многих культурных и диких видах возбудители серой гнили являетюся вторичным компонентом микобиоты. В этом случае в естественных условиях В. cinerea не оказывает существенного влияния на проявление основного заболевания. Однако возбудители мучнистой росы могут зарастать мицелием В. cinerea и вытеснять его с субстрата. На плодах многих видов растений при доминирующем развитии грибов из родов Alternaría, Pénicillium, Cladosporium, В. cinerea представлен в виде отдельных пучков конидиеносцев. При соответствующей влажности и температуре указанные виды грибов могут вытеснять возбудителя серой гнили с субстрата. Выявлено частое совместное поражение тюльпанов В. tulipae и Fusarmm oxysporum, реже Typhuta. Представители родов Mucor, Pénicillium, Trichoderma, Trichothecium, Verticillium могут паразитировать на мицелии, конидиеносцах и конидиях Я cinerea.

Совместный посев на питательную среду штаммов В. cinerea, В. allii, В. tulipae, В. paeoniae и культур грибов, выделенных из пораженных серой гнилью растений, показал, что A.tenuis, С. herbarum, M. racemosus, могут проникать в колонии Botrytis и постепенно вытеснять их с субстрата. Виды микопаразитов -Trichoderma viride, Trichoderma harzianum, Verticillium lateritium и Trichothecium roseum образуют колонии и спороношение на культурах Botrytis. Отмечено поражение репродуктивных структур В. cinerea видами Trichoderma, V. lateritium и Mucor sp. Установлен разный уровень антибиотической активности культуральной жидкости штаммов микопаразитов по отношению к В. cinerea.

Таким образом, при одновременном развитии на одном и том же растении возбудителей серой гнили и других видов грибов между видами Botrytis и представителями филлопланы могут складываться различные отношения - микопаразитизм; подавление развития Botrytis под действием антибиотиков и нейтральное взаимодействие. На пораженных R. cinérea органах растений-хозяев формируются три типа микосинузий: первый - с участием фитопатогенных видов, второй - сапротрофов и третий - с участием микофилов. Формирование таких микосинузий обусловлено трофическими связями их компонентов, что в итоге определяет смену и динамику видового состава филлопланы во времени. Поиск перспективных, адаптированных к местным экологическим условиям, антагонистов следует вести среди доминантных видов, определяющих ядро комплекса биоты. Для подавления почвенной инфекции B.cinerea сохраняющейся на растительных остатках эффективно внесение Т. viride, размноженной на зерне пшеницы или лузге подсолнечника при первом рыхлении почвы (Лихачев, 1998).

3.7.2 Действие фунгицидов на возбудителей серой гнили в природных популяциях и агросистемах

На дикорастущих и культурных видах растений-хозяев обнаружены изоляты грибов рода

Botrytis, устойчивые к беномилу, ровралю, ронилану, эупарену, дакоиилу. Частота появления устойчивых форм колеблется в значительных пределах. У ряда культур выявлено проявление полирезистенгности. Они обладали устойчивостью к 2 - 3 фунгицидам и значительно реже ко всем взятым препаратам. Выявление частоты резистентных форм в природной популяции видов Botrytis показало, что наибольшее число резистентных форм обнаруживается у В. cinerea. Специализированные виды оказались более чувствительными к препаратам по сравнению с В. cinerea. Наибольшее число штаммов проявляло устойчивость к беномилу (фундазолу). Среди специализированных видов преобладают формы, чувствительные ко всем фунгицидам. Наличие устойчивых форм в естественных ценозах, не подвергавшихся действию фунгицидов, говорит о высокой вариабельности видов Botrytis, выражающейся в значительных адаптационных возможностях указанной группы по отношению к ограничивающим их развитие факторам - фунгицидам.

По возрастанию ингибирующего действия на конидии фунгициды расположились в следующем порядке: беномил - даконил - ронилан - ровраль - эупарен, а на мицелий -эупарен - ровраль - ронилан - даколнил - беномил. Резистентные варианты штаммов в этом случае формировались из мицелия при действии эупарена, ровраля и роиилана, из конидий -беномила. Разная устойчивость мицелия и конидий к препаратам обнаружена и у специализированных видов.

Культуральиые группы Botrytis по разному реагируют на действие фунгицидов на разных стадиях онтогенеза. На среде с концентрацией беномила 50 мкг/мл у разных штаммов остается 10,5 - 53% жизнеспособных конидий, при 100 мкг/мл - 5 - 26%, при 750 мкг/мл - 0 -0,5%. После первого пассажа процент прорастания у новой генерации конидий возрастает до 100% при концентрациях 50 и 100 мкг/мл, а при 200-750 мкг/мл выявлено от 20 до 60% жизнеспособных конидий. Максимальная концентрация фунгицидов для ингибирования роста мицелия на среде у большинства изолятов составляла 200 - 250 мкм/мл (по действующему веществу). Однако некоторые штаммы были способны развиваться в мицелиалъной форме при концентрациях 500 и даже 750 мкм/мл фунгицида. Прорастанис спор задерживалось на 4-6 часов по сравнению с контролем. Большинство яйцевидных и эллипсоидальных конидий лизировались или прорастали структурами, напоминающими хламидоспоры. Диаметр конидий увеличивался более чем в 2 раза. В присутствии беномши конидии формировали 2-3, реже одну ростковые трубки. Мицелий начинал ветвиться чере;

52 часа, образуя анастомозы. Концентрация беномила, способная ингибировать рост мицелия чувствительных штаммов на 50% составляла 0,2 -0,6 мкм/мл. В присутствии эупарена конидии быстро лизировались, а - ровраля и ронилана лизис был выражен слабо. Резистентные формы под влиянием этой группы фунгицидов возникали только из мицелия. Их действие проявляется в стимулировании образования склероциев, микроконидий и усилении пигментации мицелия.

Результаты выращивания изолятов Botrytis на средах с возрастающей концентрацией фунгицидов показали, что возникновение резистентных форм идет двумя путями: в зоне концентраций от 50 до 100 мкм/мл д,в. путем постепенной адаптации, а при более высоких концентрациях 200 - 750 мкм/мл — путем отбора жизнеспособных форм.

Таким образом, процесс появления устойчивых штаммов В. cinerea может быть связан как со ступенчатой, постепенной адаптацией, так и с быстрым появлением максимальной устойчивости. В связи с этим, по-видимому, популяция патогена после применения фунгицидов разделяется на чувствительную, резко сокращающую численность составляющую, и резистентную часть, содержащую формы с разным порогом устойчивости к фунгицидам.

Сравнение патогенности чувствительных и резистентных форм Botrytis показало отсутствие различий в проявлении паразитических свойств. Предварительная обработка бобов беномилом, ровралем, рониланом и эупаренм снижала интенсивность развития болезни при заражении В.cinerea. Однако резистентные штаммы были способны преодолевать защитное действие препаратов. Аналогичные результаты получены и с В. tulipae при обработке тюльпанов (Булукова, Лихачев, 1977).

При пересевах культур, реизолированных из некрозов, на среды с данными фунгицидами показано, что у большинства исходных и резистентных штаммов определенное, число конидий сохраняется жизнеспособными. Наибольший процент таких конидий приходится на штаммы, устойчивые к беномилу. В целом конидии патогена более чувствительны к эупарену, ровралю, ронилану по сравнению с мицелием. Пассажи клонов, устойчивых к определенной концентрации фунгицидов во втором и третьем поколениях, повышают их представленность в новых репродукциях конидий до 100%. Поэтому в полевых условиях высокая патогенность и давление последующих обработок могут увеличить пропорцию уешйчнвых форм в популяциях.

Сравнение соотношения чувствительных и резистентных штаммов на промышленной плантации земляники, обработанной эупареном, и опытном участке ЗБС показало, что на указанных участках присутствуют разные по устойчивости формы. На промышленной плантации обнаружены формы, резистентные ко всем исследуемым фунгицидам. При

постоянных обработках промышленной плантации земляники эупарен способствовал отбору резистентных форм В. cinerea. При этом увеличивалось число темно-окрашенных, склонных к образованию склероциев клонов. Изоляты с опытных участков отличались обильным спороношением, начинающимся на 5-8 день роста.

В условиях агроценоза резистентные клоны выживали преимущественно за счет заселения цветков, переходя затем на вегетативные органы, интенсивно развиваясь внутри субстрата. Пониженная вирулентность и спорообразование компенсировались способностью переносить действие фунгицидов и лучшей приспособленностью к сапрофитному существованию в почве и на растительных остатках.

На опытном участке ЗБС, необработанном препаратами, преобладали светлые штаммы, резистентные только к даконилу. К другим фунгицидам штаммы с опытного участка ЗБС были чувствительны. Таким образом, популяции Botrytis содержат формы с разным порогом устойчивости к фунгицидам.

Резистентность штаммов Botrytis определяется комплексом факторов, включающих возможность ферментативного превращения фунгицидов в нетоксичные формы, а также связанной с проницаемостью клеточных стенок. Выяснение возможного различия е проницаемости клеточных стенок мицелия и конидий проверено нами в модельных опытах с покраской их родомином. Проведенные эксперименты показали, что краситель проникает только в конидии. При этом они отличались светлым фоном окраски npi микроскопировании на люминесцентном микроскопе. Мицелий же оставался без измененго окраски, что говорит о невозможности проникновения красителя через его стенки. Вероятно разная проницаемость клеточных стенок тех или иных структур определяет проникновение фунгицидов и эффективность их действия на различных стадиях онтогенеза грибов.

Таким образом, обработка промышленных плантаций фунгицидами приводит i изменению состава популяций возбудителей серой гнили и появлению резистентных форм На промышленной плантации земляники выявляется больший процент устойчивы? штаммов, по сравнению с опытным участком ЗБС. Выровненный по генетическо! устойчивости фон растений в агросистеме создает основу для отбора определенных форл патогена, что отражается в меньшем полиморфизме культуральных признаков изолятов i соотношении в выборках чувствительных и резистентных к фунгицидам клонов. При 3ton выявляются и различия в проявлении устойчивости к определенным фунгицидам и т концентрациям. Преобладание штаммов мицелиально-спорулирующего типа, как cpe,ai изолятов при первоначальном выделении патогена с расгений-хозяев, так и npi моноспоровом рассеве, указывает на его доминирующее положение в популяциях. Высока!

вариабельность позволяет В. cinerea легко адаптироваться в условиях меняющейся среды обитания, в том числе и под действием фунгицидов.

3.7.3. Влияние окультуренности почвы и минеральных удобрений на развитие грибов рода Botrytis на примере возбудителя шоколадной пятнистости кормовых

бобов B.fabae

На примере возбудителя шоколадной пятнистости кормовых бобов В. fäbae изучено влияние минеральных удобрений и агротехнических мероприятий на развитие грибов рода Botrytis на растениях в производственных посевах. Полевые и лабораторные опыты показали, что как одностороннее внесение фосфора, так и сочетание его с азотом приводят к увеличению поражаемости бобов шоколадной пятнистостью. Так, при внесении только фосфорных удобрений степень развития болезни возрастала от цветения до фазы сизых бобов с 33 до 86%. Улучшение окультуренности почвы за счет известкования и внесения калийных удобрений повышает толерантность растений к возбудителю и в 2-3 раза снижает поражаемость растений.

Заключение

Результаты сравнительного изучения биологии, специализации, патогенности, морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков, совместимости и устойчивости к стрессовым факторам (фунгицидам) видов Botrytis в природных и сельскохозяйственных ценозах позволили выявить особенности развития и микроэволюции важной в хозяйственном отношении группы грибов.

Растения - реципиенты, ежегодно поражающиеся В. cinerea, В. convallaria и формами Botrytis sp. с ириса водяного и майника двулистного, образуют в биоценозах гомеостатические фитоценопопуляции (Работнов, 1992), обеспечивающие для патогенов относительно выровненный по устойчивости фон, способствующий проявлению стабильного полиморфизма и обеспечивающий закрепление отдельных клонов в трофических нишах -растениях-хозяевах, на которых формируются популяции со своей эволюционной судьбой. Клоны В. cinerea на различных хозяевах в биоценозах, образуют временные группировки с разной вирулентностью, исчезающие в отдельные сезоны и служащие источниками инфекции для растений при благоприятных условиях среды.

Эволюция грибов рода Botrytis проявляется в модификациях жизненного цикла. Редукция склероциальной стадии, переход к зимовке и сохранению в виде мицелия, снижение функций микроконидий или их отсутствие приводят к доминированию бесполой стадии. Коиидиальное спороношение, которое является основной паразитической стадией в цикле развития Botrytis, за счет нескольких генераций в течение сезона определяет представленность видов в биоценозах.

Под влиянием растений - хозяев клоны грибов с измененным циклом развития могут образовать новую популяцию или группу популяций. Смена растений-хозяев при этом сопровождается изменением функции морфологических структур. Выпадение склероциев из цикла развития снижает вероятность формирования половой стадии.

Проявление типа жизненной стратегии видов Botrytis следует устанавливать с учетом сходства морфологических структур гриба на растениях и в чистой культуре. На большинстве видов растений, поражаемых B.cinerea, преобладают формы, занимающие промежуточное положение между К и г-стратегами.

Популяционная структура некротрофного патогена В. cinerea отличается клональной мозаичностью. Доминирующее положение в популяциях, даже на одном растении-хозяине, занимают клоны, с широкой специализацией, поражающие обширный спектр растений-хозяев. Другие - занимают промежуточное положение и третья группа, потенциально опасна только для 1-2 видов. Вероятно, различия в патогенности, наряду с временным фактором и фазами восприимчивости хозяев, определяют проявление и доминирование клонов серой гнили на видах хозяев. В меняющихся условиях среды потенциал генетической «программы», контролирующей процессы развития, обеспечивает видам грибов рода Botrytis высокую онтогенетическую и эволюционную пластичность.

Результаты исследования вегетативной совместимости свидетельствуют о различной степени разнообразия популяций специализированных и неспециализированных видов Botrytis. Разное проявление заболевания по времени и вегетативная несовместимосп разделяет популяцию на отдельные самостоятельно эволюционирующие группы штаммов.

При симпатрическом существовании для закрепления специализации и дальнейшей развития вида необходимым условием является наличие собственных очагов возобновлена форм в экологической нише, полная или частичная генетическая изоляция от других клоно! популяции. В случае последней - у гибридов наблюдается снижение продуктивности i патогенности (Дьяков, Лекомцева,1984). Эти условия выдерживаются у представителей родг Botrytis при поражении растений - реципиентов.

По комплексу признаков В. convallariae можно считать специализированным пс отношению к ландышу видом. Штаммы В. cinerea, развивающиеся на ландыше, еще н< достигли данного уровня специализации, хотя по ряду свойств выделяются из общей состава популяций возбудителя серой гнили.

Популяция В. cinerea в агроценозе (плантация земляники) отличается от популяций н; диких видах в биоценозах. Массовое проявление В. cinerea на больших площадях приводит i реализации генетического потенциала вида, выражающегося в разделении популяции н; одном хозяине на множество относительно мелких мозаичных субпопуляций, отличающихс:

комплексом признаков. Отражением процесса специализации в агроценозах является появление групп клонов, специализированных к определенной группе видов растений. Такое усиление паразитических свойств гриба наблюдается в ботанических садах, па садовых участках при поражении серой гнилью интродуцированных растений, в природных биоценозах обычно не подверженных заболеванию.

Действие стрессовых факторов - фунгицидов усиливает процесс дифференциации популяции. При обработке расгений-реципиентов фунгицидами - создается дополнительное направленное действие на популяцию патогена. Оно способствует отбору клонов с признаками, существенно отличающимися от признаков, характерных для изолятов с необрабатываемых фунгицидами растений. В условиях агроценоза популяция В.cinerea распадается на 2 различающиеся тенденцией проявления жизненной стратегии группы: быстро разрастающиеся по поверхности субстрата и обильно спорулирующие, с коротким циклом развития - "r-стратеги", успешно развивающиеся внутри субстрата и способные к длительному сохранению в неблагоприятных условиях вследствии сильной пигментации мицелия - "K-стратеги". Указанные группы изолятов различаются по интенсивности освоения живых и мертвых растительных субстратов, стабильности культуральных признаков на питательных средах и способности выживания на погребенных в почве растительных остатках. Вероятно, эти различия существенно сказываются на жизнеспособности клонов В.cinerea в агроценозах.

Жизнеспособность и конкурентность видов Botrytis определяются множеством факторов. Среди них существенное влияние оказывает микобисгга, развивающаяся в филлоплане одновременно с серой гнилью. Сохранение покоящихся стадий грибов и последующее их развитие во многом зависят от сопутствующих антагонистических микроорганизмов. Для ограничения развития возбудителей серой гнили наибольший интерес представляют виды Trichoderma, которые могут быть использованы в качестве агентов биологического метода борьбы с проявлением серой гнили на культурных растениях. В природной популяции видов Botrytis присутствуют формы с разным порогом устойчивости к фунгицидам. Процесс появления устойчивых штаммов В. cinerea может быть связан как со ступенчатой, постепенной адаптацией, так и с быстрым появлением максимальной устойчивости. В связи с этим, по-видимому, популяция патогена после применения фунгицидов разделяется на чувствительную, резко сокращающую численность, и резистентную часть, содержащую формы с разным порогом устойчивости к фунгицидам. Наряду с фунгицидами, значительное влияние в этом процессе оказывают агротехнические приемы. Комплекс мероприятий по борьбе с серой гнилью растений должен учитывать биологические особенности, как растения-хозяина, так и развивающегося на нем возбудителя.

Выводы

1.В Московской области род Botrytis представлен комплексным полиморфным видом Botrytis cinerea, специализированными видами- B.allii, В. fabae, В. tulipae, В. paeoniae, В. trifolii и сапротрофным видом В.сагпеа На ландыше майском выявлен ранее неизвестный для Московской области вид А comallariae. и формы Botrytis sp. на ирисе водяном и майнике двулистном.

2.Среди поражаемых Botrytis представителей 55 семейств растений, выделена группа растений-реципиентов, на которых наблюдается ежегодное развитие возбудителей серой гнили. Растения-реципиенты, образуют в биоценозах гомеостатические фитоценопопуляции с выровненным по генетической устойчивости фоном для возбудителей. На них отмечено снижение вариабельности культуралыю - морфологических признаков патогена.

3.В. cinerea представлен в популяциях культурально- морфологическими формами, отличающимися типом жизненных стратегий. На ряде поражаемых растений-хозяев в естественных условиях он утрачивает способность образования склероциев и сохраняется в пораженных тканях в виде мицелия. Исключение в онтогенезе склероциев как обязательной стадии развития и снижение функций или образования микроконидий приводит к редукции полового процесса у Botrytis.

4.В агросистемах характер развития болезни отличается от наблюдаемого в естественных биоценозах усилением поражения вегетирующих органов. При этом вирулентность гриба на диких видах превышает этот показатель на культурных в полтора-два раза. Штаммы B.cinerea с плантаций культурной земляники отличаются по патогенносги к различным растениям-хозяевам, выбранных в качестве дифференциаторов, и образуют на них несколько разных по числу штаммов групп.

5.Результаты искусственного заражения показали высокую степень специализации в отношении основного растения-хозяина у В. convallariae и меньшую видов В. tulipae и В. paeoniae.

6.Проявление типа жизненной стратегии видов и штаммов Botrytis установлено с учетом сходства морфологических" структур гриба на растениях и в чистой культуре. На большинстве видов растений преобладают формы B.cinerea, занимающие промежуточное положение между К и г-стратегами.

7. Анализ культуральных признаков изолятов с сортов земляники, показал наличие группировок штаммов с четко очерченными культуральными характеристиками, доминирующими на определенных органах. Специализированные виды отличаются большей стабильностью культуральных признаков по сравнению с B.cinerea.

8.При совместном сращивании изолятов разных видов Botrytis и полученных из них «оноспоровых штаммов проявилось несколько типов реакций вегетативной совместимости. V специализированных видов В. aliii, В. tulipas и сапротрофного В. сатеа проявления четких реакций несовместимости не наблюдалось, что отражает однородность состава этих видов по изучаемому признаку в сравнении с популяциями B.cinerea

9.Результаты изучения вегетативной совместимости изолятов из природной популяции специализированного вида В. convallariae на ландыше и штаммов В. cinerea, выделенных с данного растения, а также изолятов Botrytis sp. с майника показали, что штаммы специализированного вида с основного растения-хозяина при попарном сращивании образуют 3 группы совместимости.

Ю.Анализ спектров изозймов фенолоксидазы и неспецифической эстеразы у Botrytis, поражающих дикие виды растений (ландыш, майник, ирис) по сравнению с сапротрофным В. сатеа показал, что штаммы В. convallariae по спектрам изозимов указанных ферментов образуют четко обособленные группы.

11. Впервые установлено наличие и проявление активности фермента глицериноксидазы у видов Botrytis.

12. При регулярном применении фунгицидов на землянике происходит перестройка состава популяции В. cinerea и доминирование резистентных форм с разным порогом устойчивости. Фунгициды влияют на изменение культуральных признаков, появление хламидоспор, не свойственных при обычных условиях развития грибов и увеличение интенсивности образования микроконидий. Конидии и мицелий патогена проявляют разную устойчивость к препаратам. Резистентные штаммы сохраняют патогенные свойства близкие к исходным культурам.

13. Исследование комплекса биологических признаков и физиолого- биохимических свойств Botrytis выявило мозаичность состава их популяций, клоны которых имеют разную направленность эволюции паразитизма и генетической изоляции.

Н.На поражаемых органах растений виды Botrytis образуют сукцессии с }жто патогенными и сапротрофными видами из разных таксономических групп, взаимоотношения с которыми имеют разный характер - от нейтрального до проявления штагонизма и микопаразитизма.

15.Интродукцию отобранных штаммов Т. viride и соотношение минеральных удобрений можно использовать для ограничения численности возбудителя и развития серой гнили.

Ряд разделов работы выполнен при поддержке Российского фонда фундаментальных ^следований и программы «Университеты России».

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1.Лихачёв А.Н., Васин В.Б. Изыскание антагонистов к Botrytis cinerea Pers и возможность их применения в борьбе с серой гнилью земляники// Тез. докл. П межвуз. конф. М.1968. с.17

2.Лихачёв А.Н. К вопросу о биологической борьбе с серой гнилью земляники // Тр. конф. Микроорганизмы в сельском хозяйстве» М. 1970. С. 386 - 391

3.Лихачёв А.Н., Васин В.Б.-О сохранении в почве возбудителя серой гнили земляники Botrytis cinerea Pers //Микол. и фитопатол. 1970, Т. 5, вып. 5. С.472 - 473

4.Лихачёв А.Н. Культуральные и биологические особенности штаммов Trichoderma lignomm (Tode)Harz.//Вестн. Моск. Унта, 1970, № 3, с.ЮЗ - 104

5.Лихачёв АН. К вопросу об использовании триходермина в борьбе с серой гнилью земляники // Тез. докл. конф. « Московский университет - сельскому хозяйству» М. 1972

6.Лихачёв А.Н., Васин В.Б. Использование Trichodemia lignorum (Tode) Harz, в борьбе с серой гнилью земляники //1| Микол. и фитопатол., 1974, Т.8, вып. 1, с. 37-42

7.Лихачев А.Н., Васин В.Б. Определение микопаразитической активности штаммов Trichoderma lignorum (Tode) Harz. || Микол. и фитопатол., 1975, Т.9, вып.З, с. 248 - 250

8.Булукова В.И., Лихачёв А.Н. Эффективность новых фунгицидов в борьбе с грибными болезнями тюльпанов // Вестн.Московск. ун-та 1977, № 1. С.84 - 86

9.Лихачёв А.Н. Отбор штаммов Trichoderma lignorum (Tode) Harz, для ограничения развития почвенной инфекции возбудителя серой гнили земляники // Тр. конф. "Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур" Вильнюс. 1978 Ю.Лихачёв А Н., Сидорова И.И., Прохоров В.П., Великанов Л.Л. Биометод - частный случай изменения структурно - " функциональной организации биоценоза / /Тр. конф. "Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур" Вильнюс. 1978

П.Лихачёв А.Н. Значение внутривидового разнообразия Botrytis cinerea Pers. в распространении серой гнили // Матер. VI конф. по споровым растениям Средн. Азии и Казахстана. Душанбе, 1978

12.Лихачёв А.Н., Популяция Botrytis cinerea Pers. в Московской области // Микол. и фитопатол., 1979, т. 13, вып.2, с.136- 139.

13.Дурынина Е.П., Чернецова Л.Д, Лихачев А.Н. Влияние окультуренности почвы, известкования и минерального удобрения на устойчивость кормовых бобов к шоколадной пятнистости. //Агрохимия. 1982, №8, с. 101 - 108

14.Лихачёв А.Н. Типы микосинузий с участием Botrytis cinerea Pers.// Микол. и фитопатол.,1984,Т. 18, вып.З, с. 185 -189

15.Лихачёв А.Н. Влияние состава биоценоза на популяцию Botrytis cinerea Pers // Матер. Ill Всесоюзн. конф. « Изучение грибов в биогеоценозах» Ташкент.1985 с.77

16.Сале М., Лихачёв À.H. Устойчивость природных штаммов возбудителей серой гнили к фунгицидам // Микол. и фитопатол.,1989, т.23.,вып.З., с.288 - 293.

17.Лихачёв А.Н. Использование фитотоксичных антагонистов в биометоде // Тез. докл Всесоюзн. конф. « Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы растен. и животных); Ташкент, 1989, с 120

18.Лихачёв А.Н., Сале М. Патогенность исходных и резистентных к фунгицидам штаммоЕ Botrytis cinerea Pers .// Микол. и фитопатол.,1991,Т. 25, вып. 3, с. 240243

19.Сале М., Лихачёв А_Н. Действие фунгицидов на жизненные формы возбудителей cepoí гнили растений Botrytis cinerea Pers. и Botrytis alli Munn.// Вестн. Московск. унта, сер Биология,16,1991,№ 4, с.52 - 56

20.Лихачёв А.Н. Мониторинг основа рационального применения фунгицидов // Защит; растений, 1991, №11, с. 13 - 14.

21.Лихачев А.Н. Использование жидких питательных сред для получения моноспоровы? культур грибов И Микол. и фитопатол. 1994, Т. 28, вып.5, с. 14 - 16

22.Лихачев А.Н. Признаки дивергенции природной популяции Botrytis cinerea Pers / / Вестн Московск. Ун-та, сер. 16, Биология, 1994, №2, с.35 - 38

23. Куплетская М.Б., Лихачев А.Н. Глицериноксидазная активность грибов рода Botrytis Micheli // Микол. и фитопатол. 1996. Т.ЗО.Вып.56, с. 55 - 57

24.Лихачев А.Н., Пальмова Н.П. Биологически активные вещества видов рода Botrytis Micheli // Матер. 1 Международн. Конф. Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов. Донецк. Украина,1997.с.19 - 21 '

25.Чикин Ю.А., Лихачев А.Н. Влияние фунгицидов на структуру популяций Botrytis cinérea в условиях Московской области // Матер. 1 Международн. Копф. Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологичёски активных соединений и пищевых продуктов. Донецк. Украина, 1997.с.90 - 92

2б.Чикин Ю.А., Лихачев А.Н. Морфологические типы изолятов Botrytis cinerea Pers.: Fr. и гифальное взаимодействие между ними // Микол. и фитопатол., 1997, Т.31, Вып.4, с. 54 - 61

27.Likhachev A.N., Chikín Yü.A. The role of trophic niche in intraspecific diversity of Botrytis genus II Materials of International Conf "Ecological Effects of Microorganism Action". Vilnius. 1997 .pp.260-263

28.Лихачев A.H., Пальмова Н.П. Влияние видового состава естественных ценозов, агросистем на дифференциацию популяций и формообразовательные процессы у грибов рода Botrytis Micheli. ]| Матер. Всероссийской научн. - пракгич. конф. посвященной 125 летию И.И. Сапрыгина. Пенза.1998. с.270 - 272

29.Лихачев А,Н. Трофические ниши, растения - хозяева - основа дивергенции популяций грибов рода Botrytis Micheli // Сб. трудов Международной конф. Посвященной 80летию каф. микологии и альгологии МГУ и 90 - летию со дня рождения М.В. Горленко. Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии. М.1998. с.72 - 74

30.Лихачев А.Н. Формирование морфологических структур у видов рода Botrytis Micheli в условиях in vivo in и vitro // Тез. докл. представленных II (X) съезду Русского ботанического общества. Проблемы ботаники на рубеже XX - XXI вековЛ998, Т.2, с.56 - 57

31.Лихачев А.Н., Пальмова Н.П., Гоголева И.А. Токсинообразование как признак внутривидового разнообразия и специализации видов у возбудителей серой гнили// Микол. и фитопатол.,1998, Т.32,Вып.б, C.52-57

32. Пальмова Н.П. Лихачев А.Н., Фенолоксидазная активность грибов рода Botrytis Micheli У Сб. трудов Международной конф. Посвященной 80летию каф. микологии и альгологии МГУ и 90 - летию со дня рождения М.В. Горленко. Современные проблемы микологии, шьгологии и фитопатологии. М.1998. с.93 - 94

?З.Чикин Ю.А., Лихачев А.Н. Стратегия выживания клонов Botrytis cinerea Pers.. Fr. в условиях агроценоза // Сб. трудов Международной конф. Посвященной 80летик> каф. яикологии и альгологии МГУ и 90 - летию со дня рождения М.В. Горленко. Современные троблемы микологии, альгологии и фитопатологии. М.1998. с. 128 -129 Н.Лихачев А.Н. Морфологические особенности вегетативной стадии грибов рода Botrytis víicheli с разной специализацией в отношении растений - хозяев // Сб. Матер, междунар. гаучн. конф. " Изучение и охрана биологического разнообразия ландшафтов Руссой >авнины". Пенза 1999. С.312 -315

!5.Лихачев А.Н., Буров Б.В. Биологический метод - составная часть интегрированной :истемы возделывания сельскохозяйственных культур.// Матер. Междунар. Научно -фактической конф.» Актуальные вопросы агроэкологии в интегрированных системах ащиты растений». Пенза.1999. с. 55 - 57

6.Лихачев А.Н. Формирование морфологических структур грибов рода Botrytis Micheli.// Латер. Междунар. Научно - практической конф.» Актуальные вопросы агроэкологии в [нтегрированных системах защиты растений». Пенза.1999. с. 1518

7.Лихачев АН., Пальмова Н.П. Типы реакций вегетативной совместимости у грибов рода lotrytis и их роль в формообразовательном процессе // Вестн. МГУ, сер. 16, Биология, 1999, fe 2, с.45 - 49

38.Шарикадзе О.Г., Лихачев А.Н. Фитопатогенные грибы на Convallaria majalis L.// Сб. Матер. Междунар. конф.» Изучение и охрана биологического разнообразия ландшафтов Русской равнины». Пенза 1999. С.343 - 346

39.Лихачев АН.Оценка жизненной стратегии фитопатогенных видов рода Botrytis Micheli // Материалы Всероссийской научной конференции. Саранск. 1999.С.136 - 139

40.Лихачев А.Н., Изменение спектра изозимов фенолоксидазы и неспецифической эстеразы у грибов рода Botrytis под влиянием фунгицидов // Сб. трудов научн. конференции "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов" (к 110 -летию со дня рождения проф. Е.Е. Успенского). М.2000. с.69

41.Шарикадзе О.Г., Лихачев А Н. Влияние специализации у видов рода Botrytis на спектр изозимов полифенолоксидазы и неспецифической эстеразы. // Сб. трудов научн. конференции. "Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов" (к 110 -летаю со дня рождения проф. Е.Е. Успенского). М.2000 . с. 106

42. Лихачев А.Н. Эволюция зимующих стадий грибов II X Московское совещание по филогении растений. М. 2000, с. 103 - 106

43.Лихачев А.Н. Микроэволюция фитопатогенных видов рода Botrytis Micheli // Междунар. Конф. « Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность». С. Петербург.2000г.с. 181 - 184

44.Vlasova Т., Likhachev A.," Blintsov A. Accumulation of abscisic acid in culture filtrates of selected species of genus Botrytis II XII th International Botrytis Symposium. Reims. France. 2000. P 23

45. Лихачев A.H., Инсарова И.И., Шарикадзе О.И. Изозимы полифенолоксидазы и эстеразы Botrytis convallariae (Kleb.) Ondrej в сравнении с другими видами рода Botrytis Micheli. (Веста. Моск. Ун-та, в печати)

46. Шарикадзе О.Г., Лихачев А.Н. Культурально - морфологические признаки и физиолога - биохимические свойства возбудителя серой гнили Convallaria majalis L. в Московской области // Микол. и фитопатол. в печати)

47.Лихачев А. Н., Шарикадзе О. Г., Чикин Ю. А., Лекомцева С. Н. Патогенность видов и штаммов грибов рода BOTRYTIS MICHELI (DEUTEROMYCOTA, HYPHOMYCETALES), выделенных с различных растений - хозяев // Микол. и фитопатол. в печати).

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лихачев, Александр Николаевич

Введение

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Таксономия и разнообразие видов и внутривидовых форм рода Botrtyis Micheli.

1.2 Ареал и специализация видов рода Botrytis.

1.3 Факторы устойчивости растений к возбудителям серой гнили.

1.4 Изменчивость популяций фитопатогенных грибов и видов рода Botrytis.

1.5 Эколого-трофические группы грибов. Особенности паразитизма видов рода Botrytis.

1.6 Биохимические особенности видов рода Botrytis.

1.7 Общие подходы к изучению популяций фитопатогенных грибов.

1.8 Характеристика популяций видов рода Botrytis.

1.9 Взаимодействие видов рода Botrytis с микробиотой.

1.10 Использование фунгицидов против серой гнили и резистентность возбудителей.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Сбор материала. Учет частоты встречаемости возбудителей серой гнили и развития заболевания растений. Выделение чистых культур.

2.2 Получение моноспоровых культур

2.3 Оценка нестабильности штаммов Botrytis

2.4 Оценка титра конидиальной суспензии и расчет инфекционной нагрузки для заражения растений штаммами Botrytis.

2.5 Получение склероциев и определение их жизнеспособности

2.6 Оценка токсичности культуральной жидкости на наборе тест-объектов при выращивании штаммов Botrytis на жидких средах.

2.7 Оценка фитотоксичности культуральной жидкости штаммов Botrytis

2.8 Выделение полисахаридной фракции из культуральной жидкости штаммов Botrytis и определение качественного и количественного состава моносахаров.

2.9 Определение спектра водорастворимых белков и некоторых ферментов мицелия штаммов Botrytis методом электрофореза в полиакриламидном геле

2.10 Определение глицериноксидазной активности у видов Botritys.

2.11 Исследование парамагнитных свойств препаратов В. cinerea.

2.12 Определение микопаразитической активности штаммов грибов.

2.13 Определение взаимоотношения представителей микобиоты с видами Botritys и проявления ими антибиотической активности.

2.14 Методики выявления резистентности, определения степени устойчивости и адаптации Botritys к фунгицидам.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Виды рода Botrytis и спектр поражаемых ими растений в Московской области.

3.2 Особенности биологии возбудителей серой гнили

3.3 Патогенность видов рода Botrytis и штаммов В. cinerea, выделенных с разных хозяев.

3.4 Формирование морфологических структур грибами рода Botrytis Micheli in vivo и in vitro.

3.5 Типы реакций вегетативной совместимости у грибов рода Botrytis Mich.

3.6. 3.6.1 Биохимические особенности видов рода Botrytis Изучение токсического действия видов и штаммов Botrytis

3.6.2 Глицериноксидазная активность грибов рода Botrytis.

3.6.3 Изучение комплекса фенолоксидазы и неспецифической эстеразы у грибов рода Botrytis.

3.6.4 Анализ сходства и различия видов рода Botrytis по спектрам фенолоксидазы и неспецифической эстеразы.

3.7 3.7.1 Обоснование способов ограничения возбудителей серой гнили в агроценозах. Взаимодействие видов рода Botrytis с микобиотой

3.7.2 Действие фунгицидов на возбудителей серой гнили в природных популяциях и агросистемах.

3.8 Влияние окультуренности почвы и минеральных удобрений на развитие грибов рода Botrytis на примере возбудителя шоколадной пятнистости кормовых бобов В. fabae.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Грибы рода Botrytis Micheli (Fungi, Deuteromycota)"

Грибы, как составная часть практически всех наземных и водных экосистем, являются одним из постоянных компонентов гетеротрофного блока организмов, характеризующиеся разнообразными функциями. Влияние гетеротрофного блока, включающего грибы, на биоценотические процессы, структуру и функции сообществ подтверждено целым рядом работ, хотя их роль менее исследована по сравнению с ролью растений (Красильников, 1958; Аристовская, 1980; Одум, 1986; Сидорова, 1987; Великанов, 1997; Переведенцева, 1999). Роль фитопатогенных грибов и представленность видов в биоценозах чаще всего исследуется для высоко патогенных видов с целью сокращения экономического ущерба, наносимого возделываемым культурам и диким видам. Значительно меньшее внимание уделяется сравнительному изучению биоразнообразия фитопатогенных грибов в естественных ценозах и агросистемах (Веденяпина, 2000; Дьяков, 1998, 1999). Исключением являются облигатные паразиты - мучнисторосяные и ржавчинные грибы, цикл развития которых непосредственно связан с паразитированием и сохранением на дикорастущих растениях (Горленко, 1950; Михайлова и др., 1982; Берлянд-Кожевников, 1979; Лекомцева, и др., 1996;). Смена растений - хозяев приводит к изменению цикла развития и доминированию бесполой или половой стадий видов (Горленко, 1950; Александров, 1968; Томилин, 1980).

Биохимический полиморфизм растений в природных условиях определяет устойчивость к паразитическим грибам и служит одним из факторов, определяющих формообразовательные процессы патогенов (Дьяков, 1999; Clarke, 1979; Dinoor, Eshed, 1984). Участвуя в регуляции численности хозяев, фитопатогены создают предпосылки для формирования экологически устойчивого многовидового фитоценоза.

Познание процессов протекающих в популяциях паразитов и их хозяев в естественных ценозах и агросистемах создает теоретическую основу для возможного создания гомеостатических экологических систем. Конечной целью этих исследований являются использование генов диких видов растений в качестве доноров устойчивости культурных сородичей; регуляция численности паразитических видов и снижение затрат на защитные мероприятия.

Факультативные паразиты, к которым относятся фитопатогенные виды рода Botrytis Micheli, менее исследованы с этой точки зрения. Виды рода Botrytis являются удобной моделью для выявления этапов эволюции паразитизма некротрофных видов грибов. Кроме того, они могут быть продуцентами биологически активных веществ (Трофименко и др., 1971, 1974, 1980; Герасимова и др., 1983; Талиева, Филимонова 1992; Филимонова, 1989; Филимонова и др., 1986, 1991; Куплетская, Лихачев, 1996)

Сведения о распространении видов Botrytis на различных видах растений в регионе Нечерноземной полосы и в частности на территории Московской области немногочисленны (Проценко, 1954; Селочник,1978; Васин, 1966; Пантелеймонова, 1986). Наиболее распространен вид В. cinerea Pers., отличающийся крайне широким спектром поражаемых растений - хозяев. Конидиальная стадия типа Botrytis может принадлежать разным видам, имеющих телиоморфу p. Botryotinia, в том числе и дискомицетам (Hennebert, Korf, 1975; Hennebert, Groves, 1963). Поэтому данный вид считают сборным, полиморфным в роде Botrytis. Телиоморфа в естественных условиях образуется редко, а эксперименты по ее получению не всегда заканчиваются успешно (Сидорова, 1971). В. cinerea отличается многообразием культурально - морфологических форм на питательных средах и, по-видимому, сложной внутривидовой структурой. Все это отражается на проявлении характера паразитизма на представителях растений из разных таксономических групп. На ряде сельскохозяйственных культур он вызывает эпифитотии, принося значительный экономический ущерб, как в период вегетации, так и при хранении сельскохозяйственной продукции. Значительные потери урожая, наносимые видами этого рода, инициируют интерес к всестороннему исследованию биологии грибов этой группы и разработке средств защиты растений.

Важной практически мало исследованной проблемой является наличие устойчивых форм патогенов, развивающихся в естественных ценозах к фунгицидам. Необходимость проведения таких специальных исследований проистекает из экономической целесообразности. Статистические данные по десяти странам Европы показывают, что только на винограде половина средств из проводимых защитных мероприятий приходится на борьбу с серой гнилью, вызываемой В. cinerea Pers.: Fr. (Mathys, 1982).

Слабо исследованной областью остается изучение места и функций факультативных паразитов, в том числе и видов Botrytis, в сукцессионных процессах биоценозов (Мирчинк, 1979; Симонян, 1981). Исследования взаимодействия Botrytis с микробиотой почвы и растений открывают возможности теоретического обоснования и практического использования регуляторной роли сопутствующих организмов по ограничению вредного воздействия фитопатогенов. Выяснение видового состава и исследование динамики синузий может способствовать выявлению грибов антагонистов, микопаразитов, симбионтов и др. и на их основе созданию многокомпонентых биопрепаратов (Филлипов, Кузнецова, 1994; Великанов, 1997).

Основной целью работы является изучение представленности видов рода Botrytis в естественных условиях на диких видах растений и сравнительное исследование особенностей их биологии на диких и культурных видах, установление влияния растений-хозяев на полиморфизм, цикл развития и формирование морфологических структур видов Botrytis, выявление действия фунгицидов на изменение структуры популяций В. cinerea.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Лихачев, Александр Николаевич

Выводы

1.В Московской области род Botrytis представлен комплексным полиморфным видом Botrytis cinerea, специализированными видами-В.allii, В. fabae, В. tulipae, В. paeoniae, В. trifolii и сапротрофным видом В.сагпеа. На ландыше майском выявлен ранее неизвестный для Московской области вид B.convallariae. и формы Botrytis sp. на ирисе водяном и майнике двулистном.

2.Среди поражаемых Botrytis представителей 54 семейств растений, выделена группа растений-реципиентов, на которых наблюдается ежегодное развитие возбудителей серой гнили. Растения-реципиенты, образуют в биоценозах гомеостатические фитоценопопуляции с выровненным по генетической устойчивости фоном для возбудителей. На них отмечено снижение вариабельности культурально морфологических признаков патогена.

3.В. cinerea представлен в популяциях культурально-морфологическими формами, отличающимися типом жизненных стратегий. На ряде поражаемых растений-хозяев в естественных условиях он утрачивает способность образования склероциев и сохраняется в пораженных тканях в виде мицелия. Исключение в онтогенезе склероциев как обязательной стадии развития и снижение функций или образования микроконидий приводит к редукции полового процесса у Botrytis.

4.В агросистемах характер развития болезни отличается от наблюдаемого в биоценозах, усилением поражения вегетирующих органов. При этом вирулентность гриба на диких видах превышает этот показатель на культурных в полтора-два раза. Штаммы B.cinerea с плантаций культурной земляники отличаются по патогенности к различным растениям-хозяевам, выбранных в качестве дифференциаторов, и образуют на них несколько разных по числу штаммов групп.

6.Проявление типа жизненной стратегии видов и штаммов Botrytis установлено с учетом сходства морфологических структур гриба на растениях и в чистой культуре. На большинстве видов растений преобладают формы B.cinerea, занимающие промежуточное положение между К и г-стратегами.

8.При совместном сращивании изолятов разных видов Botrytis и полученных из них моноспоровых штаммов проявилось несколько типов реакций вегетативной совместимости. У специализированных видов В. allii, В. tulipae и сапротрофного В. сагпеа проявления четких реакций несовместимости не наблюдалось, что отражает однородность состава этих видов по изучаемому признаку в сравнении с популяциями B.cinerea

10.Анализ спектров изозимов фенолоксидазы и неспецифической эстеразы у Botrytis, поражающих дикие виды растений (ландыш, майник, ирис) по сравнению с сапротрофным В. сагпеа показал, что штаммы В. convallariae по спектрам изозимов указанных ферментов образуют четко обособленные группы.

11 Впервые установлено наличие и проявление активности фермента глицериноксидазы у видов Botrytis.

13. Исследование комплекса биологических признаков и физиолого-биохимических свойств Botrytis выявило мозаичность состава их популяций, клоны которых имеют разную направленность эволюции паразитизма и генетической изоляции.

14.На поражаемых органах растений виды Botrytis образуют сукцессии с фитопатогенными и сапротрофными видами из разных таксономических групп, взаимоотношения с которыми имеют разный характер - от нейтрального до проявления антагонизма и микопаразитизма.

15.Интродукцию отобранных штаммов Т. viride и соотношение минеральных удобрений можно использовать для ограничения численности возбудителей и развития серой гнили.

Автор выражает признательность за участие в выполнении ряда разделов работы аспирантов Сале Махамат, Чикину Ю.А., Шарикадзе О.Г., сотрудникам кафед :ры микробиологии Куплетской М.Б. и Пальмовой Н.П., доценту кафедры биофизики Тимофееву К.Н. биологического факультета МГУ, в также коллегам из других научно- исследовательских инстутов -Васину В.Б., Столбовой К.А., Гоголевой И.А. за научно творческое сотружество.

Особую благодарность автор выражает проф. Дьякову Ю.Т., доктору биологических наук Лекомцевой С.Н. за консультации и рекомендации при написании работы.

Ряд разделов работы выполнен при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и программы «Университеты России».

Заключение

Эволюция грибов из разных таксонов и трофических групп связана с эволюцией растительного мира, что подтверждается не только при анализе экосистем прошлых геологических периодов, но и при исследовании современных растительных сообществ. На протяжении всей жизни растений, от момента возобновления развития до отмирания и деструкции растительных остатков, их сопровождают комплексы организмов, в том числе и различные по трофике группы грибов. (Каратыгин, 1993). В процессе эволюции любой вид испытывает определенное давление со стороны окружающих его организмов. Грибы при этом образуют согласованные пространственно - временные, эколого-трофические системы, в которых также складываются различные взаимоотношения как между отдельными видами, так и их комплексами.

Виды рода Botrytis (Mitotic fungi) представляют собой группу грибов с разным уровнем специализации в отношении растений-хозяев. Среди них встречаются специализированные виды, виды, находящиеся в процессе специализации, и сапротрофные виды. Наиболее широко представлен в разных экосистемах многоядный вид В. cinerea, паразитирующий на широком спектре видов хозяев в природных ценозах и агросистемах.

Результаты сравнительного исследования биологии, специализации, патогенности, морфологических, культуральных, физиолого-биохимических признаков, а также выявление совместимости и устойчивости к стрессовым факторам (фунгицидам) видов Botrytis в природных и сельскохозяйственных ценозах позволили выявить особенности развития и микроэволюции важной в хозяйственном отношении группы грибов.

Многоядный вид В. cinerea поражает широкий спектр видов растений. В популяциях природных ценозов и агросистемах гриб представлен многообразными культурально- морфологическими формами, отличающимися по физиолого- биохимическим показателям, патогенности, чувствительности к фунгицидам и вегетативной совместимости.

По результатам многолетнего изучения развития видов Botrytis в био- и агроценозах на представителях 54 семейств растений выделена группа растений-реципиентов, на которых наблюдается ежегодное развитие возбудителей серой гнили. Растения-реципиенты, ежегодно поражающиеся В. cinerea, В. convallaria (Kleb.) Ondrej, выделенные формы Botrytis sp. с ириса водного и майника двулистного, образуют в биоценозах гомеостатические фитоценопопуляции (Работнов, 1992), которые обеспечивают для патогенов относительно выровненный по устойчивости фон. Последний способствует проявлению стабильного полиморфизма у гриба, обеспечивающего закрепление отдельных клонов в трофических нишах - растениях-хозяевах, на которых формируются популяции со своей эволюционной судьбой.

Примером таких популяций может служить популяция В. cinerea на ландыше, в составе которой в одной экологической нише дифференцируются клоны, близкие по патогенности, совместимости и физиолого-биохимическим показателям к специализированному виду В. convallariae и одновременно к другим изолятам гриба, развивающихся на майнике двулистном и ирисе водном. Другие клоны В. cinerea, выявленные на большом наборе видов хозяев, существуют как временные группировки с разной вирулентностью, исчезающие в отдельные сезоны и служащие источниками инфекции для широкого или более узкого круга растений.

Превалирование бесполого размножения и развитие только за счет последнего, отражается на характере формирования структуры популяций грибов рода Botrytis. Смена растения-хозяина или изменение спектра поражаемых видов сопровождается изменением функции морфологических структур грибов. Это выражается в перезимовке грибов Botrytis мицелием, конидиальным спороношением и хламидоспорами вместо обычной зимующей стадии - склероциев. Выпадение склероциев из цикла развития возбудителей серой гнили на многих видах растений и отсутствие функциональной активности микроконидий (спермациев) резко снижает вероятность формирования половой стадии.

Как указывал М.В. Горленко (1995) эволюция фитопатогенных грибов проявляется в модификации жизненных циклов, которая выражается в изменении круга питающих растений. Под влиянием растений - хозяев клоны грибов с измененным циклом развития образуют новую популяцию или группу популяций. Редукция склероциальной стадии, переход к зимовке и сохранению фитопатогенных видов Botrytis в виде мицелия, а также снижение функций микроконидий или их отсутствие у ряда форм также приводит к доминированию бесполой стадии в популяции. Бесполая стадия в виде конидиального спороношения является основной паразитической стадией в цикле развития гриба, определяющая за счет нескольких генераций в течение вегетационного сезона представленность вида в биоценозах.

Проявление типа жизненной стратегии видов и штаммов Botrytis следует устанавливать с учетом сходства морфологических структур гриба на растениях и в чистой культуре. На большинстве видов растений, поражаемых B.cinerea, преобладают формы B.cinerea, занимающие промежуточное положение между К и г-стратегами.

Результаты исследований популяционной структуры некротрофного патогена В. cinerea, показывают, что для данного вида, как и для патогенов облигатного типа, характерна клональная мозаичность популяций по вирулентности. Доминирующее положение в популяциях, даже на одном растении-хозяине, занимают клоны, с широкой специализацией, поражающие относительно обширный спектр растений-хозяев. Другие занимают промежуточное положение и третья группа, потенциально опасна только для определенных видов. Вероятно, различия в патогенности, наряду с временным фактором и фазами восприимчивости хозяев, определяют проявление и доминирование определенных клонов серой гнили на потенциальных видах хозяев. В меняющихся условиях среды потенциал генетической «программы», контролирующей процессы развития, обеспечивает видам грибов рода Botrytis высокую онтогенетическую и эволюционную пластичность.

Проявление вегетативной совместимости между отдельными клонами одного вида грибов показало наличие нескольких типов совместимых и несовместимых реакций. Смешанный тип реакций совместимости свойственен культурам с хорошо развитым воздушным мицелием и которые являются, вероятно, нестабильными гетерокарионами. Такие культуры, как правило, выщепляют участки, или сектора, с обильным спороношением, образованием склероциев, а также аспорогенным прижатым мицелием. Полученные результаты свидетельствуют о различной степени разнообразия популяций специализированных и неспециализированных видов Botrytis по признакам вегетативной совместимости. При этом вегетативная несовместимость разделяет популяцию на отдельные самостоятельно эволюционирующие группы штаммов.

При симпатрическом существовании для закрепления специализации и дальнейшего развития вида необходимым условием является наличие собственных очагов возобновления этих форм в данной экологической нише, полная или частичная генетическая изоляция от других клонов популяции. В случае последней - у гибридов наблюдается снижение продуктивности и патогенности (Дьяков, Лекомцева, 1984). Эти условия выдерживаются у представителей рода Botrytis при поражении растений - реципиентов.

Применение методов молекулярной биологии, позволяющих использовать частоты молекулярных маркеров (в качестве нейтральных генетических параметров), дало возможность выявить внутривидовое разнообразие Botrytis и дивергенцию их популяций.

Анализ спектров изозимов фенолоксидазы и неспецифической эстеразы у Botrytis, поражающих дикие виды растений (ландыш, майник, ирис) по сравнению с сапротрофным В. сагпеа показал, что штаммы В. convallariae по спектрам фенолоксидазы образуют четко обособленые группы. Культуры В. cinerea, паразитирующего на ландыше, и Botrytis sp.

1 с майника по спектру фенолоксидазы занимают промежуточное положение Возможно, изменение спектров ферментов происходит в результате адаптации к особенностям биохимического состава хозяев. Закрепление этих изменений в геноме может сопровождаться появлением более узкой специализации и появлению видов - двойников без существенных изменений морфологии. В естественных ценозах этому отбору способствуют растения-реципиенты, размножающиеся вегетативным путем.

По ряду культурально-морфологических признаков, характеру паразитизма, проявлению реакций вегетативной совместимости и спектру изоферментов В. convallariae можно считать специализированным по отношению к ландышу видом. Штаммы В. cinerea, развивающиеся на ландыше, еще не достигли данного уровня специализации, хотя по ряду свойств выделяются из общего состава популяций возбудителя серой гнили.

Изучение популяции В. cinerea в агроценозах (плантация земляники) по патогенности, морфолого-культуральным и физиолого-биохимическим признакам, совместимости, составу изоферментов, проявлению устойчивости к фунгицидам и.т.д. показало отличие популяции гриба в агроценозах от популяций на диких видах в биоценозах. Массовое развитие относительно неспециализированного вида В. cinerea на больших площадях приводит к реализации генетического потенциала вида, выражающейся в разделении популяции на одном хозяине на множество относительно мелких мозаичных субпопуляций, отличающихся по вирулентности, изозимному составу ферментов и совместимости. Отражением процесса специализации в агроценозах является появление в составе популяций групп клонов, преимущественно поражающих определенную группу видов растений, что было показано нами при изучении патогенности штаммов гриба на землянике. Такое усиление паразитических свойств гриба наблюдается в ботанических садах при поражении интродуцированных растений серой гнилью, которые в природных биоценозах обычно не подвержены этому заболеванию (Горленко С.В., 1972, 1984).

Действие фунгицидов, как стрессового фактора, усиливает процесс дифференциации популяции. В условиях агроценозов при обработке растений-реципиентов фунгицидами - создается дополнительное направленное действие на популяцию патогена. Оно способствует отбору клонов с признаками, существенно отличающимися от признаков, характерных для изолятов с необрабатываемых фунгицидами растений. В условиях агроценоза популяция гриба распадается на 2 различающиеся жизненной стратегией группы: 1) быстро разрастающиеся по поверхности субстрата и обильно спорулирующие, с коротким циклом развития - "г-стратеги"; 2) успешно развивающиеся внутри субстрата и способные к длительному сохранению в неблагоприятных условиях вследствие сильной пигментации мицелия - "К-стратеги". Указанные группы изолятов различаются по интенсивности освоения живых и мертвых растительных субстратов, стабильности культуральных признаков при выращивании на различных питательных средах и способности выживания на погребенных в почве растительных остатках. Вероятно, эти различия существенно сказываются на жизнеспособности клонов В. cinerea в агроценозах.

Исследование жизнеспособности и конкурентности видов Botrytis показало, что эти свойства определяются проявлением токсичности, накоплением меланина, комплексом ферментов и других биологически активных метаболитов, а также множеством других факторов.

Среди последних существенное влияние на выживаемость и проявление паразитизма видов Botrytis оказывает микобиота, развиваюшаяся в филлоплане одновременно с серой гнилью. Сохранение покоящихся стадий грибов и последующее их развитие во многом зависит от влияния сопутствующих антагонистических микроорганизмов. Как показали наши исследования при одновременном развитии на одном и том же растении возбудителей серой гнили и других видов грибов между видами Botrytis и представителями филлопланы могут складываться различные отношения - микопаразитизм; подавление развития Botrytis вследствие проявления антибиотического действия грибов филлопланы, а также нейтральное взаимодействие между указанными группами грибов. При этом в указанных типах взаимоидействия с Botrytis участвуют различные виды микромицетов. Для ограничения развития возбудителей серой гнили наибольший интерес представляют виды Trichoderma, которые могут быть использованы в качестве агентов биологического метода борьбы для ограничения проявления серой гнили на культурных растениях.

Изучение процессов ограничения развития возбудителей серой гнили на растениях с помощью фунгицидов показало, что в природной популяции видов Botrytis присутствуют формы с разным порогом устойчивости к препаратам. В ряде случаев штаммы различались по устойчивости как к разным концентрациям одного фунгицида, так и резистентностью к их набору.

Выявлена общая тенденция влияния фунгицидов на культуральные группы штаммов: более сильное подавление роста мицелиальных форм беномилом, а спорулирующих - ровралем, рониланом, эупареном. Исследуемые фунгициды, воздействуя на разные морфологические структуры гриба, способствуют появлению новых структур и изменению морфологических признаков. По возрастанию ингибирующего действия на конидии фунгициды располагаются в следующем порядке: беномил -даконил - ронилан - ровраль - эупарен, а на мицелий — беномил. -эупарен - ровраль - ронилан Резистентные варианты штаммов в этом случае образуются из мицелия при воздействии эупарена, ровраля и ронилана, у беномила - из конидий. Процесс появления устойчивых штаммов В. cinerea может быть связан как со ступенчатой, постепенной адаптацией, так и с быстрым появлением максимальной устойчивости. В связи с этим, по-видимому, популяция патогена после применения фунгицидов разделяется на чувствительную, резко сокращающую численность, и резистентную часть, содержащую формы с разным порогом устойчивости к фунгицидам. Наличие культуральных групп в структуре популяции В. cinerea с разным соотношением морфологических структур, обладающих разным порогом устойчивости и чувствительности к фунгицидам, может проявляться после обработок в доминировании одного из указанных типов. Вероятно, с этим связана неодинаковая эффективность используемых фунгицидов в разных регионах.

Наряду с фунгицидами, значительное влияние в этом процессе оказывают агротехнические приемы. Комплекс мероприятий по борьбе с серой гнилью растений должен учитывать биологические особенности как растения-хозяина, так и развивающегося на нем возбудителя.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лихачев, Александр Николаевич, Москва

1. Абеленцев В.И. Резистентность возбудителей серой и белой гнилей к производным бензимидазола//Химия в с/хюб 1980. 18. 5. С. 36-39

2. Абеленцев В.И., Голышин Н. М. Адаптация некоторых фитопатогенных грибов к беномилу // Химия в с-х. 1973. 6. С. 32-36

3. Абиев С.А., Есенгулова Б.Ж. Перезимовка желтой ржавчины пшеницы на юго-востоке Казахстана. // Микол. и фитопатол. 1982. Т.16.вып. 1. С. 48-51

4. Авазходжаев М.Х.Мусаев Х.А., Зельцер С.Ш., Нуритдинова Х.В. Некоторые свойства сорняка щирицы в системе хлопчатника патоген вертициллезного вилта//Тез.докл. 1 съезда физиол. Раст. Узбекистана. Ташкент. 1991.с 93

5. Авакян Б.П., Багдасарян Г.М. Заболевание плодов яблони при холодном хранении //Матер. VII Закавказск. Конф. по споровым астениям.Ереван.1986.с.7

6. Авиром С.М., Берлянд С.С., Вилько Н.С., Гитман Л.С., Ирхен А.К.,Мишин Н.Н., Русанов Ф.Н. Кендырь. М. Из-во с/х лит.1950. 393 С.

7. Агарков В.А. Паразитирование грибка ботритис на гречихе и эспарете // Селекция и семеноводство, 1950, №10, с. 67.

8. Азбукина З.М., Мартынюк Т.Д. Новая форма Pyricularia oryzae Cav/ f. zizaniae Azb.:Martynyukf,nov. с Дальнего востока . // Микол. ифитопатол. 1986,Т.20,Вып,4,с.249-251

9. Айзенберг В.Л.,Билай В.И. О методах первичного отбора пектинолитически активных микроскописеских грибов // Сб. Биологически активные вещества микроорганизмов. Кишинев. 1970,вып. 1,с.65-74

10. Ю.Аксенова В.А, Савченко Р.В. Влияние заражения Botrytis cinerea на растительную клетку // Тез.докл. 4 Всесоюзн. Совещания по иммунитету с/х растений. Общие вопросы теории иммунитета с/х растений Кишинев. 1965,с.98-99

11. Аксенова В.А. О токсичности полисахаридной фракции токсина Botrytis cinerea || ДАН СССР, 1962, Т. 147 № 3, с.496-498

12. Аксенова В.А., Савченко Р.В. Окислительное фосфорилирование в тканях капусты при заражении Botrytis cinerea// Докл. ВАСХНИЛ, 1965,34,с.21-23

13. Аксенова В.А.,Рубин В.А. О механизме действия токсина Botrytis cinerea на ткани капусты // Сб. Биохимия плодов и овощей. М. Наука. 1964,с.96-110

14. Александров И.Н . Способы зимовки форм Erysiphe graminis Dc. || Микол. и фитопатол., 1968,Т.2,Вып.6,с.475-480

15. Алексеева С.П.,Таов А.Ж. Серая гниль подсолнечника// Защита растений.1971,№8,с.30-31

16. Аптон Л.В. Влияние нитратов на жизнедеятельность микромицетов в морской и речной воде и в почве // Микол. и фитопатол., 1994,Т.28,Вып. 1 ,с.З-7

17. Алтон Jl.В. Жизнеспособность микроскопических грибов в морской и речной воде загрязненной фосфором // Микол. и фитопатол., 1995,Т.29,Вып. 1,с. 11

18. Алтон Л.В. Жизнеспособность некоторых видов почвенных грибов при разных температурах морской и речной воды // Микробиол., 1985, Т.47,№ ,с.56-61

19. Э.Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М.Наука. 1983. 277 С.

20. Андреева В.А. Фермент пероксидаза.М.Наука.1988, 128 С.

21. Андреева Е.И. Перспективные фунгициды для защиты растений // Микол. и фитопатол., 1979,Т. 13,вып,2, с.89-94

22. Андреева Е.И., Ахматова Н.И. Механизм действия фунгицидов // Микол. и фитопатол., 1985,Т. 19,вып.3, с.268-276

23. Андреева Е.И., Ахматова Н.И. Механизм действия фунгицидов, применяемых в сельском хозяйстве. М.: МИИТЭХ. 1988 - 34 е.- (Хим. ср-ва защиты растений).

24. Аникина М.И. Исследование вегетативной несовместимости Phytophthora infestans // Автореф.дисс.канд.наук.М.1994. 24 С.

25. Антифунгальные свойства высших растений. // Сб. Новосибирск. 1969. 252 с.

26. Антонова Т.С., Бехтер А.Г. Об участии щавелевой кислоты в мацереции тканей цветоложа подсолнечника при заболевнии белой и серой гнилями // Сельскохозяйственная биология, 1983, № 2., с. 78-80

27. Аристовская Т.В. Микробиология процессов почвообразования. Л. Изд-во Наука, 1980.185 С.

28. Артеменко Ю.П. Изменчивость вирулентности у вегетативных штаммов возбудителей белой и серой гнилей подсолнечника // Микол. и фитопатол., 1988,Т.22,Вып.4,с.343-346

29. Артемчук Н.Я. Грибы Черного моря. 1. Новые для морских водоемов и впервые выделенные из Черного моря виды. // Микол. и фитопатол. 1979. т. 13. Вып.5. с. 361-363

30. Арциховская Е.В. К вопросу о биохимических признаках устойчивости хранящейся капусты к Botrytis cinerea //Автореф. дисс. канд.биол.наук.1941

31. Арциховская Е.В. К физиологии взаимоотношений Botrytis cinerea и капусты (Brassica oleraceae) // Микробиология,1946.т.25,Вып.1,с.47-56

32. Афанасенко О.С.б Левитин М.М., Михайлова Л.А. Методы изучения вирулентности и агрессивности возбудителя сетчатого гельминтоспориоза ячменя // Микол. и фитопатол.1976. Т.10, вып.5. с. 433-436

33. Афанасьева М.М. Фунгистатическое действие почвы и выживаемость конидий Helminthosporium sativum || Микол. и фитопатол. 1875. Т. 9. Вып. 5. С. 428-431

34. Бабушинская О.А., Дударева Т.П. Влияние газообразного формальдегида на рост грибов- возбудителей гнили яблок // Микол. и фитопатол., 1977,Т.11,Вып.6,с. 176479

35. Бабушкина И.Н. Некоторые физиологические особенности Verticillium dahliae Kleb., V. tricorpus Isaac, и их вариантов, образовавшихся под действием грибов-антагонистов//Микол. и фитопатол., 1979,Т.13,Вып,6, с.203

36. Бабушкина И.Н. Почвенный микроскопические грибы хлопкосеющих районов Узбекской ССР и их антагонистическая активность к возбудителю вертициллезного вилта растений // Автореф. Канд. Дисс. Л. 1977. 26 С.

37. Багирова С.Ф., Дьяков Ю.Т. Взаимовлияние систем половой и вегетативной несовместимости у грибов // Генетика, 1993,№ 29, с. 1589-1596

38. Байбакова О.В. О специализации Erysiphe communis Fr.// Микол. и фитопатол. 1971, Т.5, вып.4, с.381-384

39. Байтматова Б.К Грибы каштановой почвы Алма- Атинской области / / XII конф. по споровым растениям Средней Азии и Казахстана.Ташкент.1989, с.96

40. Бакстон Е.У. Механизм изменчивости у Fusarium oxysporum, связанные с взаимодействием хозяина и паразита. В кн.: Проблемы и достижения фитопатологии. М.: И.Л., 1962, с. 212-214.

41. Барсукова О.Н. Парша яблони в Европейской части СССР// Микол. и фитопатол., 1983,Т.17,Вып,5,с.395-403

42. Басова С.В., Менина М.М. Фунгистатическая активность фитоалексинов коры тополей при некрозо-раковых заболеваниях // Микол. и фитопатол. 1990, Т.24,Вып.1,с.65-70

43. Батикаян А.Г.,Осипян Л.Л. Грибы, контаминирующие томатную пасту процессе производства, их термостойкость, токсичность, патулинообразование //Микол. и фитопатол. 1994.Т.28,вып. 1 ,с.8-17

44. Батикян А.Г.,Тарасова Е.О., Папян С.С. Изменение основных химических показателей плодов томатов и томатной пасты под влиянием плеснеобразующих грибов//Матер. VII Закавказск. Конф. по споровым растениям .Ереван. 1986,с.28

45. Бедианашвили Ц.В., Дьяков Ю.Т. Мутанты возбудителя парши яблони Venturia ineaqualis (Cooke) Wint., устойчивые к фунгицидам // Изв. АН СССР. Сер. Биологическая. 1987. 6. С.912-919

46. Белосельская З.Г., Сильвестров А.Д. Вредители и болезни цветочных культур. М-Л.Сельхозгиз. 1953.207 С.

47. Беккер З.Э. Физиология и биохимия грибов М.МГУ. 1988,228 С.

48. Белова Л.Б., Никитина С.М. Фитоалексинная активность лука как показатель устойчивости к серой гнили и пероноспорозу // Интегрир. Защита с/х культур от вредитю и болезней. Новосибирск. 1986,с. 4-13

49. Белозерский Ф.Н., Проскурякова Н И. Практическое руководство по биохимии растений. М.1951

50. Бенкен А.А. Типы грибных эпифитотий//Микол. и итопатол.,1980,Т.14,Вып,2, • с. 141-151

51. Бенкен А.А., Корхов Я.Г., Степанова МЮ., Пантелеева Е.К. Фитопатологическое исследование клубней картофеля // Микол. и фитопатол., 1968,Т.2,Вып.6, с.484-491

52. Бенкен А.А., Хацевич Л.К. Параморфогенные вещества в практике фитопатологических исследований//Микол. и фитопатол., 1972,Т.6,Вып.2,с. 174177

53. Бенкен А.А., Хацевич Л.К. Формирование инфекционных зачатков возбудителей корневой гнили зерновых культур // Микол. и фитопатол. 1976. Т. 10. Вып.2. с. 11117

54. Билай В.И. Фузарии. Наукова думка. Киев.1977. 440 С.

55. Биоповреждения. Учебное пособие для вузов. Ред В.Д. Ильичев. М. Высш. школа. 1987. 352 с.

56. Бравина И. В. Микофлора комаров мелководных зон Рыбинского водохранилища и дельты Волги//Микол. и фитопатол. 1987.Т.21 .вып.1 .с.8-13

57. Брежнев И.Е, Грерасимов Г Г., Потлайчук В.И. Определитель грибов на плодах и семенах древесных и кустарниковых пород. Сельхозгиз.М.1962

58. Бережнова Г.И., Якубова Е.В., Мостовой В.А., Турапин В.П. Оценка сходства популяций возбудителя бурой ржавчины на пшенице в Западном и Северном Казахстане // Вестн. С/х науки Казахстана, 1990, №9, с.32-33

59. Берестецкий О.А., Кравченко Л.В., Макарова Н.М. Влияние летучих продуктов распада растительных остатков на развитие спор грибов// Мткол. И фитопатол. 1982,Т. 16,вып.2.с. 126-129

60. Берлянд-Кожевников В.М., Дмитриев А.П., Будашкина Е.Б., Шитова П., Рейтер Б. Г. Устойчивость пшеницы к бурой ржавчине. Новосибирск. Наука. 1976. 306 .

61. Берлянд-Кожевников В.М. Эволюция и динамика популяции хозяина и паразита в связи с устойчивостью пшеницы к бурой ржавчине. Автореф. дисс. Докт. наук. Л. 1979.42 С.63.

Информация о работе

Лихачев, Александр Николаевич
доктора биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.24

Диссертация

Грибы рода Botrytis Micheli (Fungi, Deuteromycota) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно