Характеристика грибов рода Candida как ассоциантов в микробиоценозах тела человека

Капустина, Ольга Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика грибов рода Candida как ассоциантов в микробиоценозах тела человека
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика грибов рода Candida как ассоциантов в микробиоценозах тела человека"

На правах рукописи Капустина Ольга Александровна

ХАРАКТЕРИСТИКА ГРИБОВ РОДА CANDIDA КАК АССОЦИАНТОВ В МИКРОБИОЦЕНОЗАХ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА

03.02.03 - «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 АВГ 2013 005532053

Оренбург -2013

005532053

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук»

Научный руководитель:

Доктор биологических наук ФГБУН «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН»

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России

Доктор медицинских наук, профессор ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « 26» сентября 2013 г. в /С' часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул.Советская, д.6, телефон (3532)40-35-62, факс (3532) 7724-59, e-mail: orgma_dsl@esso.ru, официальный сайт: http//orgma.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА.

Автореферат разослан 13 г., автореферат и текст

объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки РФ в сети интернет.

Карташова Ольга Львовна

Соловых Галина Николаевна

Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Немцева Наталия Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Дрожжеподобные грибы рода Candida, являясь комменсалами, обитающими в пищеварительном или/и дыхательном и урогениталь-ном трактах, на поверхности кожи, могут вызывать развитие заболеваний (Мамедова JI.P., Караев З.О., 2010; Кузьмина Д.А. с соавт., 2011). Грибы рода Candida в биотопах тела человека выживают в условиях постоянного воздействия факторов врожденного и адаптивного иммунитета, используя механизмы супрессии/нейтрализации компонентов антимикробной защиты макроорганизма. Так, у грибов, выделенных при дисбактериозе кишечника, вагинальном кандидозе и хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях придатков матки, выявлены антилизоцимная, антикомплементарная, антилакто-ферриновая активности (Валышев A.B. с соавт. 2003; Рафикова Л.М., 2009), а у грибов, колонизирующих полость рта, - антиинтерфероно-вая активность (Четвертнова Г. А., Климова Т.Н., 2008).

Вместе с тем, среди Candida spp. встречаются штаммы, устойчивые к современным антимикотикам; данная устойчивость Candida spp. может проявляться на разных уровнях: генетическом, клеточном, популяционном, видовом, что в настоящее время приобретает все большее значение.

Присутствуя в биоценозе, грибы рода Candida взаимодействуют с другими видами условно-патогенных микроорганизмов и представителями нормальной микрофлоры человека. В микробных ассоциациях между разными видами микроорганизмов возникают неоднозначные взаимоотношения, что может оказать существенное влияние, как на колонизацию слизистой, так и на течение инфекционного процесса (Долгушина В.Ф., Долгушин И.И., 2004; Karagozov I. et al., 2004). В подобных ситуациях многими исследователями (Вахитов Т.Я., 2007; Семенов A.B., 2009; Barefoot S.F. et al., 1994; Mearns-Spragg A., 1998; Yan L., 2003; Dubuis Ch., Haas D., 2007) существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности и перси-стенции и оценка характера взаимоотношений, складывающихся между сочленами микробных сообществ в том или ином биотопе.

В настоящее время накоплен большой фактический материал по взаимодействию грибов рода Candida и представителей нормальной микрофлоры тела человека Однако вопрос об изменении биологиче-

ских свойств данных микроорганизмов при инфекции остается недостаточно изученным.

В этой связи, известный интерес представляет, с одной стороны, изучение особенностей видового состава и комплекса биологических характеристик грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях, а с другой - особенностей межмикробных взаимодействий микроорганизмов-симбионтов в условиях грибково-бактериальных ассоциаций.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является сравнительное изучение видового состава и биологических свойств грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях, а также особенностей их взаимодействий с бактериями-доминантами и ассоциантами.

Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:

1. Изучить видовой состав грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе.

2. Оценить комплекс биологических свойств грибов рода Candida (факторы патогенности, персистентные характеристики, способность к образованию биопленок, антибиотикорезистентность).

3. Изучить молекулярно-генетические механизмы патогенности и резистентности грибов рода Candida к антимикотическим препаратам.

4. Изучить особенности межмикробных взаимодействий грибов рода Candida с бактериями-доминантами и ассоциантами.

Научная новизна

Проведен сравнительный анализ видового разнообразия грибов рода Candida в различных биотопах тела человека (ротовая полость, кишечник, репродуктивный тракт) в норме и при патологических состояниях (дисбиозы, острая и хроническая инфекционно-воспалительная патология). Установлено увеличение количества видов грибов при патологических состояниях по сравнению с нормой, доминирующим видом является С. albicans.

Впервые охарактеризован широкий спектр биологических свойств грибов рода Candida spp., включающий факторы патогенности, фак-

торы персистенции, способность к образованию биопленок и анти-биотикорезистентность, на фенотипическом уровне и с использованием молекулярно-генетических исследований. На основе полученных данных охарактеризованы биопрофили грибов рода Candida, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях из разных биотопов и дисбиозе кишечника. Показано, что экспрессия перси-стентных свойств у грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека, экологически детерминирована и проявляется в соответствии с уровнем факторов естественной резистентности в биотопе.

Установлена важная патогенетическая роль персистентных характеристик грибов Candida в развитии инфекционно-воспалительных заболеваний: они широко распространены среди штаммов, выделенных из всех изученных биотопов, при этом выраженность исследуемых признаков выше при хроническом течении инфекционно-воспалительных заболеваний по сравнению с острым течением.

Проведенными молекулярно-генетическими исследованиями у С. albicans установлено наличие генов секретируемых аспартат про-теиназ (SAP 1-4, SAP6-7, SAP9-10) и генов антибиотикорезистентно-сти (MDR1, FLUI, CDR1) как у штаммов, выделенных от здоровых лиц, так и при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе.

При изучении межмикробных связей индигенной и ассоциативной микрофлоры кишечника и репродуктивного тракта при дисбиозе и инфекционно-воспалительных заболеваниях с С. albicans установлено преимущественное подавление факторов персистенции С. albicans под действием индигенной микрофлоры и их повышение под действием ассоциантов.

Практическая ценность

Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника, а также характере межмикробных взаимодействий.

Полученные результаты о распространенности и выраженности факторов персистенции у грибов рода Candida, могут быть использованы при прогнозировании течения инфекционно-воспалительных заболеваний.

Выявленные особенности регулирующего воздействия индиген-ной микрофлоры (лактобактерии, энтерококки) на факторы перси-стенции грибов рода Candida могут выступать, в качестве дополнительных критериев отбора эффективных штаммов с целью создания пробиотиков для коррекции дисбиозов кишечника и влагалища. Определен спектр антимикотиков в отношении грибов рода Candida, изолированных из разных биотопов тела человека при инфекционно-воспалительных заболеваниях. Полученные данные могут способствовать оптимизации подбора препарата для эмпирической терапии больных кандидозом.

Положения, выносимые на защиту

1. Различные биотопы тела человека характеризуются особенностями видового состава грибов рода Candida в норме, при инфекци-онно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника, а выраженность биологических свойств у данных микроорганизмов является информативным критерием их экотопной принадлежности.

2. Качественный спектр биологических свойств и количественные параметры факторов персистенции у грибов рода Candida влияют на направление развития инфекционного процесса.

3. Межмикробные бактериально-грибковые взаимоотношения при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника характеризуются преимущественно подавлением факторов персистенции С. albicans представителями доминантной микрофлоры и непатогенных ассоциантов, а так же стимуляцией указанных факторов патогенными ассоциативными бактериями.

Апробация работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на VI и VII Всероссийской научной конференции «Персистен-ция микроорганизмов» (Оренбург, 2009; 2012); Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2009); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); научно-практической конференции «Экология. Природные ресурсы. Рациональное природопользование. Охрана окружающей среды» (Москва, 2009); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии «Микозы и микоаллергозы, нозокомиальные грибковые инфекции» (Санкт-Петербург, 2010); V научно-практической конференции с международным участием «Студенты и

аспиранты в науке - 2011» (Оренбург, 2011); межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии «Микозы и микоаллергозы. Новые технологии в микробиологической диагностике» (Санкт-Петербург, 2011); I молодежной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011); Российской научно-практической конференции «Медико-социальные аспекты формирования вторичных иммуноде-фицитных состояний у жителей Южно-Уральского региона» (Оренбург, 2011); III междисциплинарной конференции молодых ученых УрО РАН (Оренбург - Бузулук, 2012).

Фрагменты работы были представлены на областных конкурсах научно-исследовательских работ и отмечены премией Правительства Оренбургской области (2011) и премией Губернатора Оренбургской области (2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 9 публикаций в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертационной работы

Текст диссертации изложен на 154 страницах компьютерного текста, содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, 5 глав собственных исследований, заключение, выводы, библиографический список, включающий 135 отечественных и 112 иностранных источников. Текст иллюстрирован 26 рисунками и 9 таблицами.

Связь работы с научными программами. Представленные данные являются составной частью тем открытого плана НИР ИКВС УрО РАН «Формирование и функционирование микробных симбиозов в живых системах» (№ гос. регистрации 01.2010.67427) и «Эндогенные инфекции как проявление нарушения ассоциативного симбиоза» (№ гос. регистрации 01.2010.67429).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе были изучены 202 штамма грибов рода Candida, в том числе 36 - из ротовой полости здоровых лиц и больных стоматитом, острым и хроническим катаральным гингивитом; 48 штаммов из фе-

калий здоровых людей и пациентов с дисбиозом кишечника I-III степени; 64 - из репродуктивного тракта здоровых женщин и больных кольпитом, сальпингоофоритом (острое и хроническое течение); 54 : штамма от больных острым и хроническим бронхитом и пневмонией. Штаммы были получены из лаборатории дисбиозов ИКВС УрО РАН (зав. лабораторией к.м.н. Валышев A.B.), бактериологической лаборатории ЦРБ Оренбургского района Оренбургской области (врач-бактериолог Логачева JI.E.), а также выделены из вагинального биотопа при профилактическом осмотре клинически здоровых женщин в женской консультации Областной клинической больницы №2 города Оренбурга (гинеколог Аксенченко Е.С.); из фекалий клинически здоровых детей, обучающихся в учреждении муниципального образования «Нежинский лицей» (село Нежинка Оренбургского района Оренбургской области, педиатр Семенова JT.B.).

Выделение и идентификацию грибов рода Candida проводили по Р.Н. Ребровой(1989).

Гемолитическую и каталазную активности определяли по М.О. Биргер (1982), способность грибов рода Candida к продукции лизо-цимподобных ферментов по методу A.A. Ленцнера с соавт. (1975), фосфолипазную активность определяли по Т.С. Богомоловой (1990), липолитическую активность по методике А.И. Нетрусова (2005), антиоксидантную активность (АОА) - амперометрическим методом на анализаторе «ЦветЯуза-01-AA» (НПО «Химавтоматика», Москва).

Распространенность генетических детерминант секретируемых протеаз семейства SAP изучали с помощью метода ПЦР с использованием известных праймеров (Niewerth М. et al., 2003) в лаборатории кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО ОГАУ (зав. лабораторией к.б.н. Сычева М.В.).

У выделенных штаммов грибов определяли также антилизоцим-ную активность (АЛА) и sIgA-протеазную активность по методикам О.В. Бухарина с соавт. (1999; 2004) фотометрическим методом, анти-лактоферриновую активность (АЛфА) по методике И.В. Валышевой с соавт. (2005) иммуноферментным методом. Образование биоплёнок (БО) грибами оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах (OToole G. et al., 2000).

Чувствительность грибов к антимикотикам определяли методом диффузии в агар с помощью бумажных дисков, пропитанных проти-

вогрибковыми препаратами, согласно Инструкции ; научно-исследовательского центра фармакотерапии (2004).

При помощи ПЦР анализа у грибов рода Candida определяли гены, кодирующие антибиотикорезистентность: CDR1-4 - к ингибиторам стеролового синтеза, MDR1 - к циклогексимиду и флуконазолу, FLU1 - к флуконазолу. Для ПЦР-амплификации использовали известные праймеры (Niewerth М. et al., 2003), синтезированные компанией «Синтол» (г. Москва)

Чистые культуры лактобацилл и энтерококков выделяли из кишечника и репродуктивного тракта здоровых женщин, изучали их морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства. Видовую идентификацию бактерий рода Lactobacillus осуществляли на основании определения ферментации углеводов с использованием углеводов и бульона с 0,3% бромкрезолового зелёного (Определитель бактерий Берджи, 1997), бактерий рода Enterococcus -с помощью мультиплексной (мультилокусной) полимеразной цепной реакции по наличию видовых генов, кодирующих синтез супероксид-дисмутазы (Jackson C.R. et al., 2004).

Для постановки ПЦР бактериальные лизаты получали с помощью реагента «ДНК-экспресс» («Литех», Россия), для ПЦР-амплификации использовали известные праймеры (Jackson C.R. et al., 2004). Синтез праймеров осуществлен компанией «Синтол» (г. Москва).

Детерминанты вирулентности энтерококков обнаруживали с помощью известных праймеров (Semedo Т. et al., 2003, Vankerckhoven V. et al., 2004).

Взаимодействие грибов рода Candida и бактерий рода Lactobacillus spp. исследовали при совместном культивировании в жидкой питательной среде Brucella Broth Base - ВВВ («Hi Media», Индия), а с бактериями рода Enterococcus spp. в бульоне Шадлера («Hi Media», Индия) (Ермоленко Е.И. с соавт, 2007). Достоверность различий сравниваемых показателей оценивали по t-критерию Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе исследования при обследовании 135 здоровых лиц из кишечника, репродуктивного тракта и ротовой полости были получены и идентифицированы на основании морфологических и биохимических свойств 34 штамма дрожжеподобных грибов рода Candida.

Частота встречаемости дрожжеподобных грибов рода Candida в : кишечнике здоровых лиц составила 22%, в репродуктивном тракте -30,4%, в ротовой полости - 21%. Численность грибов рода Candida,^ выделенных из всех изученных биотопов, не превышала 1x10 КОЕ/мл. •

Наиболее часто из всех изученных биотопов выделялись С. albicans, которые регистрировались в ротовой полости в 100% случаев, в кишечнике - в 82% и в репродуктивном тракте - в 64,7% случаев. Другие виды дрожжеподобных грибов встречались значительно реже: С. glabrata в 23,5% случаев в репродуктивном тракте и в 9% случаев в кишечнике, С. tropicalis - в 11,8% и в 9% случаев, соответственно.

При изучении факторов патогенности у грибов рода Candida, выделенных от здоровых лиц, было установлено, что все изученные штаммы продуцировали каталазу, тогда как фосфолипазной активностью обладали лишь 9% штаммов С. albicans, выделенных из репродуктивного тракта. Наличием липолитической активности характеризовались 86% штаммов С. albicans, выделенных из ротовой полости, 89% - из кишечника, 90,1% - из репродуктивного тракта, а также 25% вагинальных изолятов С. glabrata.

Изучение способности к инактивации факторов естественной резистентности у изученных грибов рода Candida показало наличие AJIA у 43% штаммов С. albicans, выделенных из ротовой полости, со средним значением признака, равным 0,27±0,015 мкг/мл, и у 33,3% фекальных изолятов со средним значением AJIA 0,14±0,01 мкг/мл. Все штаммы С. tropicalis, выделенные из репродуктивного тракта и кишечника, обладали способностью к инактивации лизоцима, средние значения признака составляли 0,1±0,001, 0,15±0,002 соответственно. Указанное свойство было выявлено только у 25% вагинальных изолятов С. glabrata (0,29 ±0,003 мкг/мл в среднем).

sIgA-протеазной активностью обладали все штаммы С. tropicalis, выделенные из кишечника и репродуктивного тракта, и С. glabrata, выделенные из кишечника, со средними значениями признака 0,1±0,01, 0,2±0,015 и 0,3±0,015 мкг/мл, соответственно. Способностью к инактивации slgA характеризовались все штаммы С. albicans, выделенные из ротовой полости, и 33% культур, выделенных из репро-- дуктивного тракта, со средним значением признака 0,3 мкг/мл, а так-• же 50% штаммов С. glabrata, выделенных из репродуктивного тракта, у которых среднее значение признака составляло 0,25±0,001 мкг/мл.

Для всех штаммов грибов рода Candida, выделенных от ¡здоровых лиц, было характерно наличие антиоксидантной активности с высокой выраженностью признака: у С. albicans, выделенных из ротовой полости, среднее значение признака составляло 9,8±3,8 ед. кв., у фекальных изолятов - 9,3±2,3 ед. кв. и у изолятов из репродуктивного тракта - 9,7±2,7 ед. кв. Выраженность АОА у С. tropicalis, выделенных из кишечника и репродуктивного тракта, составила 5,9±1,3 ед. кв., у С. glabrata - 3,8±0,4 и 2,9±0,9 ед. кв., соответственно.

Биопленкообразование было выявлено у 74% штаммов С. albicans (1,2±0,02), 80% С. glabrata (1,16±0,04) и 33% С. tropicalis (2,49±0,05), выделенных от здоровых лиц. При этом биопленки образовывали 80% фекальных изолятов (1,42±0,02), 82% вагинальных штаммов (1,16±0,015) и 43% штаммов из ротовой полости (1,11±0,01).

Далее нами был проведен анализ видового разнообразия грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе. Чаще всего из всех биотопов выделялся вид С. albicans: из кишечника - в 73,0=3,8% случаев, репродуктивного тракта - в 76,5±8,5%, респираторного тракта - в 88,9±4,6% и из ротовой полости - в 86,2±7,7% случаев. Значительно реже выделялись С. glabrata: в 17,6±3,9% случаев - из репродуктивного тракта, в 13,8±3,8% - из ротовой полости, и только в 5,5±1,3% -из респираторного тракта и в 5,3±1,1% - из кишечника. Штаммы С. tropicalis были изолированы только из кишечника и респираторного тракта, частота их встречаемости составляла 10,5±1,3% и 1,9±0,4% соответственно. Штаммы С. kefyr выделяли с частотой 7,9±2,4% из кишечника и 3,7±1,2% - из респираторного тракта, а С. krusei была выделена в 2,7±1,3% случаев из кишечника и в 5,9±1,4% случаев из репродуктивного тракта. Проведенными исследованиями выявлено увеличение видового разнообразия грибов рода Candida в ряду: ротовая полость, репродуктивный тракт, респираторный тракт, кишечник.

При изучении факторов патогенности у выделенных штаммов, было установлено, что фосфолипазной активностью обладает только С. albicans (49,0±4,5%), причем число штаммов с данным признаком значительно варьирует в зависимости от биотопа выделения: 58,8±13,6% изолятов С. albicans - из репродуктивного тракта, 51,7±11,2% штаммов из ротовой полости; 37,5±7,1% и 39,5±9,8% штаммов с признаком были выделены из респираторного тракта и

її

кишечника. Достоверно большее количество изолятов с высоким коэффициентом фосфолипазной активности отмечено при остром течении заболевания по сравнению с хроническим (р50,05).

Липолитическая активность была обнаружена практически у. всех изученных видов грибов (исключение составили штаммы С krusei). С. albicans обладали признаком в 78,9±3,9% случаев, С.. glabrata, C.kefyr и С. tropicalis - в 26±2,8%, 20±1,7% и 20±1,8%, соответственно.-При изучении распространенности данной активности у С. albicans в зависимости от биотопа выделения было обнаружено, что 86,2±7,7% изолятов с липолитической активностью выделено из ротовой полости; 74,1±6,4% - из респираторного тракта; 76,5±11,8% - из репродуктивного тракта женщин и 65,8±9,2% - из кишечника.

Среди non-albicans видов липолитическую активность проявляли 50±2,2% штаммов С. kefyr, все штаммы С. tropicalis, изолированные из респираторного тракта, и 75±1,9% штаммов С. glabrata, выделенных из ротовой полости.

Изучение продукции каталазы грибами рода Candida показало наличие у всех изученных штаммов этого фермента, необходимого грибам для предотвращения действия системы перекиси водорода, являющейся одним из наиболее активных фунгицидных факторов.

Таким образом, изучение биологических свойств у грибов рода Candida, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе, позволило установить наличие каталазной, фосфолипазной и липолитической активности у С. albicans, липолитической активности у С. glabrata, С. kefyr, С. tropicalis, каталазной активности у всех исследованных non-albicans видов. При анализе распространенности факторов патогенности у штаммов грибов рода Candida, выделенных при разных формах течения инфекционного процесса, достоверной разницы не установлено.

Для всех штаммов грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе, было характерно наличие антиоксидантной активности со средними значениями выраженности признака у С. glabrata, равными 1,6±0,23 ед. кв., С. albicans - 1,2±0,07 ед. кв., С. tropicalis - 1,1±0,2 ед.кв:, у С. kefyr и С. krusei - 0,9±0,01 и 0,96±0,1 ед. кв., соответственно.

При изучении выраженности антиоксидантной активности у грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов, отмечено, что максимальной АОА обладали изоляты из ротовой полости (2,9±0,4

ед. кв.); у штаммов, выделенных из респираторного тракта, среднее значение признака составило 1,5±0,2 ед. кв., у фекальных штаммов -1,4±0,2 ед. кв., у вагинальных изолятов - 1,0±0,8 ед. кв. >

При изучении АОА С. albicans, выделенных при разных формах течения инфекционного процесса, установлено, что значения признака в 1,5 раза выше при остром течении заболевания по сравнению с хроническим. '

Полученные нами данные подтверждают тот факт, что антиокси-данты защищают возбудителя от окислительного стресса и могут быть факторами его выживания на ранних стадиях болезни (Абрамова JI.C. с соавт., 2008).

На следующем этапе нашей работы у изолятов грибов были изучены факторы персистенции, одним из которых является способность к образованию биопленок, представляющих собой специфическим образом сформированные сообщества микроорганизмов, компартмен-ты которого выполняют различные функции и имеют единую цель -максимальную адаптацию к данной экологической нише и наиболее эффективное распространение популяции (d'Enfert С., 2006; Ramage G. et. al, 2006; Riizicka F., 2007). И поскольку самым распространенным и часто выделяемым видом в нашем исследовании являлся Candida albicans, нами изучена способность к пленкообразованию только у штаммов данного вида, выделенных из разных биотопов.

Проведенные исследования показали, что 79% штаммов С. albicans на абиотической поверхности формируют пленку, у 21% штаммов способности к образованию биопленок не установлено.

В зависимости от биотопа выделения способность БО у грибов была различной: у 100% штаммов, выделенных из кишечника и репродуктивного тракта, у 71 % изолятов из респираторного тракта и у 25% - из ротовой полости.

Среднее значение признака БО С. albicans в зависимости от биотопа выделения варьировало в пределах от 1,2±0,1 до 1,5±0,3. Наиболее высокие значения коэффициента биопленкообразования отмечены у штаммов С. albicans, выделенных из кишечника, что согласуется с полученными ранее данными А.В. Валышева с соавт. (2009).

При сравнении коэффициента биопленкообразования у штаммов С. albicans, выделенных при разных формах течения инфекционного процесса, достоверной разницы не установлено.

Инфекционные заболевания являются результатом сложного взаимодействия между патогеном и хозяином. В последние годы наблюдается изменение характера течения инфекций в сторону увеличения доли их затяжных и хронических форм, при этом нередко этиологическим фактором являются условно-патогенные микроорганизмы, включая грибы рода Candida. И если основной стратегией патогенных микроорганизмов при хронической инфекции является адаптация, направленная на длительное выживание, которое возможно только при реализации эффективных механизмов защиты и нападения, то при острой - размножение и распространение (Бухарин О.В. с соавт., 2006). Известно, что грибы рода Candida обладают многоступенчатой стратегией ускользания от иммунной защиты хозяина, во многом обеспечиваемой секрецией различного вида протеаз, способных инактивировать эффекторы врожденного (СЗЬ, C4b, С5 - компоненты комплемента) и адаптивного (IgG) иммунитета (Behnsen J. et al., 2010), что существенно снижает уровень антимикробной защиты макроорганизма. Поэтому далее мы изучили АЛфА, sIgA-протеазную активность и AJIA грибов рода Candida и установили их высокую частоту распространения у изученных штаммов.

Выраженность АЛфА у грибов рода Candida была следующей: С. kefyr - 95,5±10,0 нг/мл; С. glabrata - 171,3±20,0 нг/мл; С. albicans -189,1 ±40,7 нг/мл; С. krusei - 208,2±5,4 нг/мл; С. tropicalis - 271,6±15,3 нг/мл. Результаты исследования способности грибов рода Candida к инактивации лактоферрина показали, что наиболее выраженными значениями АЛфА характеризуются вагинальные штаммы (228,8±26,83 нг/мл), что может сказываться на снижении бактерицидных свойств вагинального секрета, одним из факторов защиты которого является лактоферрин (Valenti Р., Antonini G., 2005). Эти данные подтверждают принцип экологической детерминированности факторов персистенции микроорганизмов (Бухарин О.В., 1999). При изучении АЛфА дрожжеподобных грибов рода Candida, выделенных при разном течении инфекционно-воспалительного процесса, было установлено, что уровень выраженности признака всех исследуемых видов, выделенных при острой форме заболевания, был достоверно ниже по сравнению с АЛфА штаммов, выделенных при хроническом течении заболевания (рис.1). •■••■■•..

Хроническое

течение заболевания

С. glabrata С. albicans

I Ротовая полость а Респираторный тракт Н Репродуктивный тракт

Рис. 1. Выраженность АЛфА грибов рода Candida, выделенных при разных формах течения инфекционно-воспалительного процесса (* - р < 0,05)

Для многих представителей микрофлоры, колонизирующих слизистые открытых полостей организма человека, характерна способность секретировать протеолитические ферменты, расщепляющие sl-gA и IgA (Кострюкова H.H., Бехало В.А., 2006; Rao M.B. et al., 1998). Исследование sIgA-протеазной активности у грибов рода Candida показало наличие данного признака у всех изученных штаммов, что расширяет представления о механизмах выживания условно-патогенных микроорганизмов на слизистых оболочках, поскольку секреторный IgA является основным протективным иммуноглобулином местной иммунной защиты. Выраженность sIgA-протеазной активности составила у С. kefyr 1,0±0,4 мкг/мл, С. albicans - 0,9±0,5 мкг/мл, С. glabrata - 0,9±0,5 мкг/мл, С. tropicalis - 0,7±0,3 мкг/мл, С. krusei - 0,5±0,1 мкг/мл.

Высокий уровень sIgA-протеазной активности отмечен у грибов, выделенных из респираторного тракта (1,2±0,05 мкг/мл), что может быть связано с их выживанием в условиях высокой концентрации секреторного IgA в данном биотопе (Тотолян A.A., 1999).

Полученные нами результаты о высоком уровне sIgA-протеазной активности у штаммов, выделенных при хронической инфекции, свидетельствуют о том, что sIgA-протеазы грибов рода Candida способны поддерживать воспалительный процесс и участвовать в его хрони-зации (рис.2).

Хроническое

течение заболевания

Острое течение заболевания

Хроническое

течение заболевания

Острое течение заболевания

С. albicans

С. glabrata

■ Ротовая полость (3 Респираторный тракт 0 Репродуктивный тракт

Рис. 2. Выраженность sIgA-протеазной активности грибов рода Candida, выделенных при разных формах течения инфекционно-воспалительного процесса

(* - р < 0,05)

Уровень антилизоцимной активности грибов нарастал в ряду: С. albicans, С. tropicalis, С. glabrata, С. kefyr, С. krusei, максимальная экспрессия признака была отмечена у штаммов, выделенных из репродуктивного тракта (1,0±0,3 мкг/мл*ОП), и уменьшалась в ряду: ротовая полость (0,9±0,1 мкг/мл*ОП), кишечник (0,9±0,06 мкг/мл*ОП), респираторный тракт (0,8±0,08 мкг/мл*ОП). Значения признака при остром течении заболевания были достоверно ниже, чем при хроническом (рис. 3).

Г"

1 . aseSSS

Острое течение заболевания

С. glabrata

■ Ротовая полость Ш Респираторный тракт И Репродуктивный тракт

Рис. 3. Выраженность AJIA грибов рода Candida, выделенных при разных формах течения инфекционно-воспалительного процесса (* - р < 0,05)

Проведенными исследованиями установлено, что уровень изученных факторов персистенции (АЛА, АЛфА, sIgA-протеазная активность) С. albicans к С. glabrata, выделенных при острой форме ин-фекционно-воспалительного заболевания, был достоверно ниже, чем при хронической форме инфекционного процесса. Выявлена прямая зависимость между уровнем факторов персистенции грибов ш длительностью течения заболевания: так, sIgA-протеазная активность у различных видов грибов рода Candida, наряду с антилактоферриновой и антилизоцимной активностями, определяет персистенцию данных микроорганизмов в организме человека.

Таким образом, проведенными исследованиями установлено, что для грибов рода Candida, выделенных у здоровых лиц, при инфекци-онно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника, характерно наличие каталазной, липолитической, антиоксидантной активностей, способности к биопленкообразованию, АЛА, АЛфА и slgA-протеазной активности. У всех культур, изолированных при инфекци-онно-воспалительных заболеваниях и микроэкологических нарушениях кишечника, в отличие от штаммов, выделенных от здоровых, выявлена способность к инактивации факторов естественной резистент-ностии организма с высокими значениями признаков (рис. 4), и у 50% штаммов С. albicans - фосфолипазная активность.

I АЛА [ЗАЛфА а slgA-протеазная активность

Рис. 4. Выраженность факторов персистенции грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме и при патологии.

Полученные данные о факторах персистенции и патогенности грибов позволили охарактеризовать различия биопрофилей грибов рода Candida, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника по распространенности и уровню выраженности признаков в зависимости от занимаемого биотопа. Показано, что экспрессия персистентных свойств у грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека, экологически детерминирована и проявляется в соответствии с уровнем факторов естественной резистентности в биотопе.

Анализ распространенности генетических детерминант патогенности свидетельствует о высокой частоте встречаемости генов семейства SAP у С. albicans, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника (рис. 5). Восемь из 10 генов секретируемых аспартат протеаз (SAP1-SAP4, SAP6, SAP7, SAP9, SAP 10) встречаются у изолятов из ротовой полости, кишечника и респираторного тракта, а пять генов (SAP4, SAP6, SAP7, SAP9 и SAP 10) у штаммов из репродуктивного тракта. Гены SAP5 и SAP8 не обнаруживаются у грибов ни в одном из изученных биотопов.

600 bp 500 bp

100 bp

штамм

Рис. 5. Фореграмма наличия генов SAP6 у С. albicans: дорожка 1 - маркер молекулярного веса (GeneRuler 1 kbp DNA Ladder (Fermentas, Литва)); дорожка 2 - отрицательный контроль; штаммы 1, 2, 3, 4, 7, 9, 10, 11 - специфический продукт реакции (600 bp), соответствующий гену SAP6

Затем нами была изучена чувствительность к антимикотикам грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов. Для количественной характеристики антибиотикорезистентяости изучаемых штаммов дрожжеподобных грибов мы использовали показатель «маркер анти-биотикорезистентности» - МР (Бондаренко В.И., 1990).

• Анализ антибиотикорезистентности показал, что максимальный • МР характерен для С. glabrata (0,67±0,05), минимальный для С. albicans (0,19±0,04). У С. kefyr и С. tropicalis МР был равен 0,4±0,05, у С., krusei 0,5±0,05. Выраженность МР изменялась в зависимости от биотопа выделения грибов рода Candida. Так, максимальное значение было характерно для изолятов из вагинального биотопа (0,47±0,02) и уменьшалось в ряду: респираторный тракт (0,25±0,02), кишечник • (0,19±0,007), ротовая полость (0,17±0,009). При сравнении МР у штаммов С. albicans, выделенных при разных формах течения инфекционного процесса, достоверной разницы не установлено (0,23±0,05 и 0,27±0,04 соответственно). Таким образом, грибы рода Candida, изолированные из разных экотопов тела человека, обладают вариабельной антибиотикорезистентностью, которая зависит от видовой принадлежности грибов и биотопа выделения.

Анализ генетических детерминант резистентности среди штаммов С. albicans, выделенных из всех изученных биотопов, показал широкую распространенность генов резистентности к антимикотикам FLUI, CDR1, MDR1 с максимальной частотой встречаемости у изолятов из ротовой полости и минимальной у штаммов из респираторного тракта и кишечника.

Значительное внимание исследователей в последнее время уделено изучению взаимодействия симбионтов в микросимбиоценозе при -инфекции. Изучив межбактериальные взаимодействия симбионтов в ассоциативном симбиозе при инфекции, Бухарин О.В. с соавт. (2011) выявили два существенных момента: подавление факторов перси-стенции патогенов под действием анаэробной индигенной микрофлоры и повышение персистентного потенциала патогенов и условно-патогенных микроорганизмов под действием ассоциантов-симбионтов при формировании патобиоценозов и бактерионосительства. А также установили, что при инфекции меняется персистентный. потенциал микроорганизмов, что немаловажно для развития инфекционного процесса.

При выделении грибов рода Candida из кишечника и репродуктивного тракта нами параллельно было выделено по 10 штаммов фекальных энтерококков и лактобацилл, из репродуктивного тракта - 7 штаммов бактерий рода Enterococcus spp. и 10 штаммов Lactobacillus spp. Выделенные энтерококки были идентифицированы с помощью мультиплексной (мультилокусной) полимеразной цепной реакции по наличию видовых генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы (Jackson C.R. et al., 2004), как Е. faecalis (12 штаммов) и Е. faecium (5 штаммов). Все выделенные лактобациллы были идентифицированы на основании морфологических, тинкториальных, биохимических свойств как L. acidophilus (5 штаммов), L. plantarum (4 штамма), L. casei (4 штамма) и L. fermentum (8 штаммов). Изучение факторов па-тогенности энтерококков проводили на фенотипическом уровне по способности продуцировать желатиназу и гемолизировать эритроциты и на молекулярно-генетическом с помощью ПЦР с детекцией в агарозном геле с определением генов адгезии и колонизации (ASA, ESP), токсигенности (CYLA, В, М), пенетрации и повреждения тканей (HYL, GELE). В результате было выявлено, что все фекальные изоля-ты Е. faecium не проявляли патогенности на фенотипическом и молекулярно-генетическом уровнях, все выделенные штаммы Е. faecalis обладали широким спектром детерминант вирулентности и проявляли желатиназную активность.

Таким образом, лактобациллы на основании видовой принадлежности, высокой экспрессии продукции перекиси водорода и энтерококки, не обладающие факторами патогенности на фенотипическом и молекулярно-генетическом уровнях, были отнесены нами к представителям доминантной микрофлоры и апатогенных ассоциантов кишечника и репродуктивного тракта человека соответственно, а остальные изоляты - к группе патогенных ассоциантов (Бондаренко В.М. с соавт, 2007, Бухарин О.В. с соавт., 2006; 2007; 2012).

Далее было изучено влияние этих бактерий на антилизоцимную активность грибов и их способность к биопленкообразованию.

При сокультивировании с лактобациллами, выделенными из кишечника, у всех изолятов С. albicans наблюдалось достоверное снижение способности к инактивации лизоцима в 2 раза. После сокульти-вирования с лактобациллами, выделенными из репродуктивного тракта, антилизоцимная активность снижалась у 27% штаммов, причем у 73% штаммов способность к инактивации лизоцима отсутствовала.

Бактерии рода Lactobacillus вызывали снижение способности образовывать биопленки у большинства фекальных изолятов С. albicans (60%), у 37% штаммов способность к образованию БО отсутствовала. Лактобациллы разнонаправлено влияли на данный признак С. albicans, выделенных из репродуктивного тракта: снижали его в 19% случаев, оказывали индифферентное действие в 14 % случаев, усиливали признак в 42% случаев и у 25% штаммов способность к БО отсутствовала.

На следующем этапе исследования было изучено влияние бактерий рода Enterococcus на биологические свойства грибов рода Candida. Установлено, что как Е. faecium, так и Е. faecalis изменяют выраженность антилизоцимной активности и способности к биопленкооб-разованию грибов рода Candida. Так, фекальные изоляты Е. faecium снижают способность грибов рода Candida к инактивации лизоцима в 1,4 раза, коэффициент биопленкообразования у С. albicans - в 1,4 раза. Как фекальные, так и вагинальные штаммы Е. faecalis вызывают достоверное увеличение антилизоцимной активности грибов рода Candida, повышая АЛА фекальных изолятов С. albicans в 1,2 раза, у вагинальных штаммов С. albicans - в 2,2 раза. После сокультивирова-ния с Е. faecalis как вагинальные, так и фекальные изоляты С. albicans увеличивали способность к биопленкообразованию в 1,2 раза (рис.6,

7).

Мкг/мл 0,9

уО-О-1

WN XNCy

Контроль

Lactobacillus | E.faecium Фекальные изоляты

Контроль | Lactobacillus | E.faecalis Вагинальные изоляты

Рис. 6. Влияние бактерий рода Lactobacillus и Enterococcus на антилизоцим-ную активность С. albicans

у.е.

Контроль

Lactobacillus j E.faecium Фекальные изоляты

Контроль [ Lactobacillus | E.faecalis Вагинальные изоляты

Рис. 7. Влияние бактерий рода Lactobacillus и Enterococcus на способность к биопленкообразованию С. albicans

Таким образом, при изучении межмикробных связей индигенной и ассоциативной микрофлоры кишечника и репродуктивного тракта при дисбиозе и инфекционно-воспалительных заболеваниях установлено преимущественное подавление факторов персистенции С. albicans под действием бактерий рода Lactobacillus и Е. faecium; и повышение персистентного потенциала С. albicans под действием Е. faecalis.

Подводя итог проделанной работе, следует заключить, что различные биотопы тела человека характеризуются особенностями видового состава грибов рода Candida в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника, а выраженность биологических свойств у данных микроорганизмов является информативным критерием их экотопной принадлежности. Качественный спектр биологических свойств и количественные параметры факторов персистенции у грибов рода Candida влияют на направление развития инфекционного процесса, а межмикробные бактериально-грибковые взаимодействия при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника характеризуются преимущественным подавлением факторов персистенции С. albicans представителями доминантной микрофлоры и непатогенных ассоциантов, а также стимуляцией указанных факторов патогенными ассоциативными бактериями.

Выводы. -i

1. Установлена низкая частота обнаружения грибов рода Саяс//-da, выделенных у здоровых людей из кишечника, репродуктивного тракта и ротовой полости. В условиях нормоценоза доминирующим видом являлся С: albicans, наряду с которым из кишечника и репродуктивного тракта выделяли С. glabrata и С. tropicalis. '

2. Установлено видовое разнообразие грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника: доминирующим явился вид С. albicans, значительно реже выделялись С. kefyr, С. glabrata, С. tropicalis, С. krusei. Выявлено увеличение видового разнообразия грибов рода Candida в ряду: ротовая полость, репродуктивный тракт, респираторный тракт, кишечник.

3. Проведена комплексная оценка фенотипических характеристик грибов рода Candida — способности к инактивации факторов естественной резистентности (лизоцима, лактоферрина, секреторного иммуноглобулина А), выделенных из разных биотопов у здоровых лиц, больных инфекционно-воспалительными заболеваниями и при дис-бактериозе кишечника человека, что позволило определить информативность изученных свойств при разных формах течения заболеваний. Наличие AJIA и sIgA-протеазной активности у грибов рода Candida, выделенных от здоровых лиц, свидетельствует об участии данных факторов в процессах колонизации слизистых.

4. Охарактеризованы различия биопрофйлей грибов рода Candida в зависимости от занимаемого биотопа, что позволяет их дифференцировать по распространенности и уровню выраженности признаков. Показано, что экспрессия персистентных свойств у грибов рода Candida, вьщеленных из разных биотопов тела человека, экологически детерминирована и проявляется в соответствии с уровнем факторов естественной резистентности в биотопе.

5. Установлено, что грибы рода Candida, изолированные из разных биотопов тела человека при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника, обладают вариабельной антибиоти-корезистентностью, которая зависит от видовой принадлежности грибов и биотопа выделения.

6. Выявлено, что для грибов рода Candida, выделенных у, здоровых лиц, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника, характерно наличие каталазной, липолитической, антиок-

сидантной активностей и способности к биопленкообразованию. Культуры, изолированные при инфекционно-воспалительных заболеваниях и микроэкологических нарушениях кишечника, наряду с данными свойствами, характеризовались также наличием фосфолипаз-ной активности и низкими значениями АОА по сравнению с культурами, выделенными от здоровых лиц.

7. При проведении молекулярно-генетических исследований установлено наличие генов секретируемых аспартат протеиназ (SAP 1-4, SAP6-7, SAP9-10) и генов антибиотикорезистентности (MDR1, FLU1, CDR1) как у грибов, выделенных у здоровых лиц, так и при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбактериозе.

8. При изучении межмикробных связей индигенной и ассоциативной микрофлоры кишечника и репродуктивного тракта при дисбиозе и инфекционно-воспалительных заболеваниях установлено преимущественное подавление факторов персистенции С. albicans под действием бактерий рода Lactobacillus и Е. faecium и повышение перси-стентного потенциала С. albicans под действием Е. faecalis.

Список работ, опубликованных в научных журналах, рекомендованных ВАК:

1. Капустина O.A. Видовой состав и биологические свойства грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека / O.A. Капустина, JI.E. Логачева, О.Л. Карташова // Известия Оренбургского государственного аграрного университета, 2009. №4. С. 179-181.

2. Капустина O.A. Биологические свойства грибов рода Candida / O.A. Капустина, О.В. Михайличенко, О.Л. Карташова // Бюллетень Московского общества испытателей природы, отдел биологический, 2009. Т. 114. Вып. 2. С. 54-55.

3. Капустина O.A. Таксономический состав и физиологические свойства грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов / О.А.Капустина, О.Л. Карташова, Н.С. Пашинин // Бюллетень Московского общества испытателей природы, отдел биологический, 2009. Т. 114. Вып. 3. С. 418-420.

4. Факторы персистенции грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов / O.A. Капустина, О.Л. Карташова, И.Н. Чайникова,

Н.С. Пашинин// Проблемы медицинской микологии, 2010. Т.12. №2. С. 92.

5. Капустина О.А. Влияние экзометаболитов бактерий рода Lactobacillus на антилизоцимную активность грибов рода Candida / О.А; Капустина, Я.Е. Диянова // Вестник Оренбургского государственного университета, 2011. №4. С. 38-40.

6. Биопленкообразование грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека / О.А. Капустина, O.JI. Карташова, Л.П. Потехина, Т.М. Уткина // Проблемы медицинской микологии, 2011. Т.13. №2. С. 81-82.

7. Капустина О.А. Устойчивость грибов рода Candida к факторам естественного иммунитета человека в условиях микроэкологических нарушений / О.А. Капустина, И.Н. Чайникова, О.Л. Карташова // Гигиена и санитария, 2012. №3. С. 27-29.

8. Капустина О.А. Видовая характеристика и факторы перси-стенции грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника / О.А. Капустина, И.Н. Чайникова, О.Л. Карташова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2012. №4. С. 37-41.

9. Капустина О.А. Влияние Lactobacillus на способность к био-пленкообразованию Candida, выделенных из разных биотопов тела человека / О.А. Капустина, О.Л. Карташова, Т.М. Уткина // Проблемы медицинской микологии, 2012. Т. 14. №2. С 91.

Публикации в других изданиях:

Ю.Капустина О.А. Антилизоцимная активность грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов. Тематический сборник научных работ / О.А. Капустина, О.В. Михайличенко, Е.А. Назарова // Современный мир, природа и человек [Электронный журнал]. -Томск, 2009. URL: http:// www.tele-conf.ru.

П.Капустина О.А. Антиоксидантная активность грибов рода Candida / О.А. Капустина, О.В. Михайличенко, Е.А. Назарова // Тематический сборник научных работ. Современный мир, природа и человек [Электронный журнал]. - Томск, 2009. URL: http:// www.tele-conf.ru.

12. Капустина О.А. Антилактоферриновая активность грибов рода Candida / О.А. Капустина, О.В. Михайличенко, О.Л. Карташова // Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской

конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки». - Ярославль, 2009. С. 77.

13.Чувствительность к противогрибковым препаратам грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека / O.A. Капустина, O.JI. Карташова, Н.С. Пашинин, P.M. Нургалиева // Современные наукоемкие технологии, 2010. №2. С. 94.

14. Капустина O.A. Особенности биопленкообразования грибов рода Candida / O.A. Капустина // Материалы V научно-практической конференции «Студенты и аспиранты в науке». - Оренбург, 2011. С. 15-17.

15. Капустина O.A. Факторы патогенности грибов рода Candida и возможность их регуляции эфирными маслами / O.A. Капустина, O.J1. Карташова // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН [Электронный журнал], 2013. №1. URL: http://www.elmag.uran.ru.

КАПУСТИНА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА ХАРАКТЕРИСТИКА ГРИБОВ РОДА CANDIDA КАК АССОЦІІАНТОВ В МИКРОБИОЦЕНОЗАХ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2010 Подписано в печать 25. 06. 2013 г. Формат 60*84/16. Усл.-печ. Л. 1,0. Печать оперативная. Гарнитура Times. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Капустина, Ольга Александровна, Оренбург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ КЛЕТОЧНОГО И ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СИМБИОЗА

04201361710 На правах рукописи

Капустина Ольга Александровна

ХАРАКТЕРИСТИКА ГРИБОВ РОДА CANDIDA КАК АССОЦИАНТОВ В МИКРОБИОЦЕНОЗАХ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА

03.02.03 - «Микробиология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук О.Л.Карташова

Оренбург -2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГРИБОВ РОДА

CANDIDA И ОСОБЕННОСТИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С 10 МИКРООРГАНИЗМАМИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Факторы патогенности грибов рода Candida 10

1.2. Факторы персистенции грибов рода Candida 18

1.3. Антибиотикорезистентность грибов рода Candida 21

1.4. Взаимодействие бактерий и грибов рода Candida 26

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34

2.1. Выделение и идентификация грибов рода Candida 34

2.2. Методы определения факторов патогенности грибов рода Candida 35

2.3. Методы определения факторов персистенции грибов рода Candida 39

2.4. Методика определения способности грибов рода Candida к биопленкообразованию 42

2.5. Метод определения чувствительности грибов рода Candida к антимикотикам 43

2.6. Методика обнаружения генов, кодирующих резистентность к антимикотикам грибов рода Candida 44

2.7. Выделение и идентификация бактерий рода Lactobacillus spp.

и Enterococcus spp. 46

2.8. Методика обнаружения генов, кодирующих факторы вирулентности бактерий рода Enterococcus spp. 48

2.9. Методика совместного культивирования грибов рода Candida и бактерий родов Lactobacillus spp. и Enterococcus spp. 50

2.10. Методы статистической обработки результатов 50

ГЛАВА 3. ВИДОВОЙ СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГРИБОВ РОДА CANDIDA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗНЫХ

БИОТОПОВ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ 51

3.1. Видовой состав грибов рода Candida, выделенных в норме 51

3.2. Биологические свойства грибов рода Candida, выделенных

в норме 51

ГЛАВА 4. ВИДОВОЙ СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГРИБОВ РОДА CANDIDA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗНЫХ БИОТОПОВ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРИ ИНФЕКЦИОННО-

ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И ДИСБИОЗЕ 59

4.1. Видовой состав грибов рода Candida 59

4.2. Биологические свойства грибов рода Candida 61

4.3. Факторы персистенции грибов рода Candida 72

ГЛАВА 5. АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ГРИБОВ РОДА 83 CANDIDA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗНЫХ БИОТОПОВ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРИ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И ДИСБИОЗЕ

ГЛАВА 6. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИ- 98 ЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГРИБОВ РОДА CANDIDA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗНЫХ БИОТОПОВ

ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ МЕЖМИКРОБНЫХ 108 ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ГРИБОВ РОДА CANDIDA И БАКТЕРИЙ РОДОВ LACTOBACILLUS И ENTEROCOCCUS

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 114

ВЫВОДЫ 128

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ 130

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Дрожжеподобные грибы рода Candida, являясь комменсалами, обитающими в пищеварительном или/и дыхательном и урогенитальном трактах, на поверхности кожи, могут вызывать развитие заболеваний (Мамедова JI.P., Караев З.О., 2010; Кузьмина Д.А. с соавт., 2011). Грибы рода Candida в биотопах тела человека выживают в условиях постоянного воздействия факторов врожденного и адаптивного иммунитета, используя механизмы супрессии/нейтрализации компонентов антимикробной защиты макроорганизма. Так, у грибов, выделенных при дисбиозе кишечника, вагинальном кандидозе и хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях придатков матки, выявлены антилизоцимная, антикомплементарная, антилактоферриновая активности (Валышев A.B. с соавт., 2003; Рафикова Л.М., 2009), а у грибов, колонизирующих полость рта, - антиинтерфероновая активность (Четвертнова Г.А., Климова Т.Н., 2008).

Вместе с тем, среди Candida spp. встречаются штаммы, устойчивые к современным антимикотикам; данная устойчивость Candida spp. может проявляться на разных уровнях: генетическом, клеточном, популяционном, видовом и в настоящее время приобретает все большую значимость.

Присутствуя в биоценозе, грибы рода Candida взаимодействуют с другими видами условно-патогенных микроорганизмов и представителями нормальной микрофлоры тела человека. В микробных ассоциациях между разными видами микроорганизмов возникают неоднозначные взаимоотношения, что может оказать существенное влияние, как на колонизацию слизистой, так и на течение инфекционного процесса (Долгушина В.Ф., Долгушин И.И., 2004; Karagozov I. et al., 2004). В подобных ситуациях многими исследователями (Вахитов Т.Я., 2007; Семенов A.B., 2009; Barefoot S.F. et al., 1994; Mearns-Spragg A., 1998; Yan L., 2003; Dubuis Ch., Haas D., 2007) существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности и

персистенции и оценка характера взаимоотношений, складывающихся между сочленами микробных сообществ в том или ином биотопе.

В настоящее время накоплен большой фактический материал по взаимодействию грибов рода Candida и представителей нормальной микрофлоры тела человека. Однако вопрос об изменении биологических свойств данных микроорганизмов при инфекции остается недостаточно изученным.

Цель и задачи исследования

Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:

1. Изучить видовой состав грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника.

4. Изучить особенности межмикробных взаимодействий грибов рода

Candida с бактериями-доминантами и ассоциантами.

Научная новизна

Впервые охарактеризован широкий спектр биологических свойств грибов рода Candida spp., включающий факторы патогенности, факторы перси-стенции, способность к образованию биопленок и антибиотикорезистент-ность, на фенотипическом уровне и с использованием молекулярно-генетических исследований. На основе полученных данных охарактеризованы биопрофили грибов рода Candida, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях из разных биотопов и дисбиозе кишечника. Показано, что экспрессия персистентных свойств у грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека, экологически детерминирована и проявляется в соответствии с уровнем факторов естественной резистентности в биотопе.

Проведенными молекулярно-генетическими исследованиями у С. albicans установлено наличие генов секретируемых аспартат протеиназ (SAP 1-4, SAP6-7, SAP9-10) и генов антибиотикорезистентности (MDR1, FLUI, CDR1) как у грибов, выделенных у здоровых лиц, так и при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе.

Практическая ценность Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника, а также характере межмикробных взаимодействий.

Выявленные особенности регулирующего воздействия индигенной микрофлоры (лактобактерии, энтерококки) на факторы персистенции грибов рода Candida могут выступать в качестве дополнительных критериев отбора эффективных пробиотиков с целью коррекции дисбиозов кишечника и влагалища. Определен спектр антимикотиков в отношении грибов рода Candida, изолированных из разных биотопов тела человека при инфекционно-воспалительных заболеваниях. Полученные данные будут способствовать выбору препаратов для эмпирической терапии больных кандидозом.

Положения, выносимые на защиту 1. Различные биотопы тела человека характеризуются особенностями видового состава грибов рода Candida в норме, при инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника, а выраженность биологических свойств у данных микроорганизмов является информативным критерием их экотопной принадлежности.

3. Межмикробные бактериально-грибковые взаимодействия при инфек-ционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника характеризуются преимущественным подавлением факторов персистенции С. albicans представителями доминантной микрофлоры и непатогенных ассоциантов, а также стимуляцией указанных факторов патогенными ассоциативными бактериями.

Апробация работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на VI и VII Всероссийской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009; 2012); Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2009); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); научно-практической конференции «Экология. Природные ресурсы. Рациональное природопользование. Охрана окружающей среды» (Москва, 2009); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии «Микозы и микоаллергозы, нозокомиальные грибковые инфекции» (Санкт-Петербург, 2010); V научно-практической конференции с международным участием «Студенты и аспиранты в науке — 2011» (Оренбург, 2011); межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии «Микозы и микоаллергозы. Новые технологии в микробиологической диагностике» (Санкт-Петербург, 2011); I молодежной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011); Российской научно-практической конференции «Медико-социальные аспекты формирования вторичных иммунодефицитных состояний у жителей Южно-Уральского региона» (Оренбург, 2011); III междисцип-

линарной конференции молодых ученых УрО РАН (Оренбург - Бузулук, 2012).

Объем и структура диссертационной работы. Текст диссертации изложен на 154 страницах компьютерного текста, содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, 5 глав собственных исследований, заключение, выводы, библиографический список, включающий 135 отечественных и 112 иностранных источников. Текст иллюстрирован 26 рисунками и 9 таблицами.

ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГРИБОВ РОДА CANDIDA И ОСОБЕННОСТИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МИКРООРГАНИЗМАМИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1 .Факторы патогенности грибов рода Candida

Ввиду того, что грибы рода Candida широко представлены в нормальной микрофлоре тела человека и относятся к условно-патогенным возбудителям, для возникновения заболевания необходимо создание таких условий и обстоятельств, которые привели бы к срыву регуляторных процессов, обеспечивающих нормальные формы симбиоза макро- и микроорганизма (Elmer G.W., Surawicz С.М., 1996; Haynes К., 2001; Khosravi A.R. et al., 2008; Taheri J.B. etal., 2011).

Различают следующие этапы развития кандидозной инфекции: прикрепление грибов к поверхности слизистой оболочки (адгезия), увеличение численности возбудителя (колонизация), внедрение в эпителий (инвазия), преодоление эпителиального барьера слизистой оболочки, попадание в соединительную ткань, преодоление тканевых клеточных механизмов защиты, проникновение в сосудистое русло с последующей диссеминацией и поражением различных органов (Рахматуллина М.Р., 2007).

Факторы патогенности Candida spp. можно представить в следующем виде (Шевяков М.А., 2000): способность к адгезии на тканях хозяина и образованию «биопленок» на полимерном покрытии медицинского оборудования; способность к трансформации в псевдомицелий, инвазирующий ткани хозяина; микогенная сенсибилизация за счет алкогольдегидрогеназы и кислого Рг-протеина; синтез гидролитических энзимов, таких как секретируемые аспартат-протеиназы и фосфолипазы, вызывающих повреждение тканей хозяина; фенотипическая изменчивость, которая может играть роль в процессах адаптации грибов к различным анатомическим нишам хозяина и приобретения резистентности к антифунгальным препаратам; иммуномодуляторные эффекты, повреждающие эффективность систем антимикробной резистентности хозяина; токсигенность за счет гемолизина и эндотоксинов; подавле-

"Л

ние облигатной бактериобиоты слизистых оболочек хозяина и формирование микстинфекции.

Начальным этапом колонизации является адгезия.

Адгезины (рецепторы адгезии) - участки поверхности грибов, участвующие в прикреплении последних к эпителиоцитам, микроорганизмам, а также обеспечивающие способность фиксироваться на различных лигандах не только тканей организма, но и на пластмассах, используемых в катетерах, трансфузионных системах и эндопротезах (Волосевич Л.И., Шеремет З.А.,1989).

По данным A.C. Анкирской с соавт. (1998) некоторые агдезины по своей структуре напоминают рецепторные белки самого организма, что не только увеличивает степень адгезии, но и снижает вероятность иммунного ответа. Более того, описаны регуляторные механизмы адгезии как при изменении внешних условий, так и в зависимости от формы существования гриба (дрожжевые клетки, псевдогифы и истинные гифы) в конкретный момент, реализующиеся изменением количества адгезинов одного типа и/или сменой одной группы адгезинов на другую, отличную по аффинности к лиганду в макроорганизме (Кашкин П.Н., Лисин В.В., 1983).

Кроме того, для грибов рода Candida характерно наличие набора адгезинов, участвующих в распознавании отдельного лиганда или клетки хозяина (табл. 1).

Способность к адгезии у представителей различных видов Candida значительно различается. Так, среди Candida spp. обнаружены высоко и низко адгезивные виды: наиболее высока эта способность у С. albicans, С. tropicalis, С. dubliniensis, наименее - у С. glabrata, С. krusei (Шабашова Н.В., 1999). Согласно данным Н.Р. Redmond (1997) С. albicans в модельных экспериментах адгезировались в большем количестве, чем С. tropicalis, в то время как С. krusei показывали незначительную или нулевую адгезию.

Существует мнение, что степень адгезии коррелирует с патогенностью

Candida для человека и животных и проявлением диморфизма.

Таблица 1

Механизмы адгезии грибов рода Candida _(по R.D. Cannon et al., 1995)_

Механизм адгезии Адгезины �

Информация о работе

Капустина, Ольга Александровна
кандидата биологических наук
Оренбург, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Характеристика грибов рода Candida как ассоциантов в микробиоценозах тела человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы