Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности"

ФИЛИППОВА Лариса Вячеславовна

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ШТАММЫ CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS РАЗНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ

03.02.12 - микология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

1 9 ФЕВ ZQ15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2014

005559236

005559236

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте медицинской микологии им. П.Н. Кашкина государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И.Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Васильева Наталья Всеволодовна - доктор биологических наук, профессор Киселева Екатерина Прохоровна - доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

Липницкий Анатолий Васильевич — заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное казённое учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, главный научный сотрудник отдела спорообра-зующих микроорганизмов

Симбирцев Андрей Семёнович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического агентства России», директор.

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита диссертации состоится «13» апреля 2015 года в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.086.06 в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "СевероЗападный государственный медицинский университет имени И.И.Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке и на сайте http://szgmu.ru государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47.

Автореферат разослан «/¿7» февраля 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета л и, »

доктор медицинских наук ^М.А. Шевяков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Род Cryptococcus включает около ста видов микромицетов, из них признанными патогенами является только комплекс Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii [Fonseca et al., 2011]. Cryptococcus neoformans — базидиомицетовый гриб, является причиной тяжелого менингоэн-цефалита и диссеминированных инфекций, возникающих преимущественно у иммунокомпрометированных лиц.

В настоящее время криптококковая инфекция является актуальной медицинской проблемой. Ежегодно, из 1 миллиона заболевших криптококкозом, в мире умирают 650 тысяч больных. Летальность составляет 3-5 % в странах Европы и Америки и до 80 % в странах Африки, и зависит от уровня экономического развития страны [Brown Q.D. et al., 2012]. Наряду с этим, периодически регистрируют гипервирулентные штаммы Cryptococcus gattii, которые вызывают вспышки заболевания у лиц без признаков иммунодефицита [MacDougall L. et al., 2007; Schoffelen Т. et al., 2013].

В последние годы отмечен рост резистентности грибов рода Cryptococcus к противогрибковым препаратам [Mandras N. et al., 2011; Pfaller M.A. et al., 2011]. В России показатели снижения чувствительности к флуконазолу достигают 25 % [Vasilyeva N.V. et al., 2013]. Есть сведения о появлении штаммов С. neoformans. устойчивых к действию вориконазола [Pfaller M.A. et al., 2011]. Данный факт требует поиска новых альтернативных средств, обладающих антикриптококко-вой активностью.

Несмотря на то, что основной путь инфицирования человека криптококками -ингаляционный, криптококковая пневмония встречается крайне редко и заболевание диагностируется, как правило, на стадии криптококкового менингоэнце-фалита или диссеминации. Макрофаги являются первыми клетками иммунной системы, контактирующими с С. neoformans в легких, поэтому фагоцитоз крип-тококков макрофагами сегодня рассматривают как один из главных механизмов, контролирующих возникновение инфекции и ее исход [Netea М. et al., 2007]. Вопрос о том, какую стратегию для выживания используют С. neoformans после поглощения фагоцитами и какому из механизмов микробоцидности принадлежит доминирующая роль при взаимодействии макрофагов с криптококками разной вирулентности, до сих пор остается открытым. Известно, что развитие инфекционного процесса при криптококкозе, как и при других микотических заболевани-

ях, регулируется продукцией провоспапительных и противовоспалительных ци-токинов [Brown G.D., 2013]. Однако данные об особенностях цитокинового профиля макрофагов после взаимодействия с С. neoformans разной вирулентности малочисленны и противоречивы.

В связи с этим, мы сконцентрировали свои экспериментальные исследования на изучении взаимодействия макрофагов со штаммами С. neoformans разной вирулентности.

Степень разработанности темы исследования. Область исследования патогенных штаммов С. neoformans в Российской Федерации в основном охватывает вопросы, посвященные изучению факторов патогенности С. neoformans и их роли в патогенезе криптококкоза [Блинов Н.П., Васильева Н.В., Хмельницкий O.K., Насыров P.A., Цинзерлинг В.А., Майская М.Ю., Тилева Е.А., Константинова А.М., Босак И.А.]. Особенности взаимодействия фагоцитарных клеток с разными по вирулентности штаммами С. neoformans фрагментарно отражены только в работах зарубежных исследователей [Voelz К., Vecchiarelli А., Missall Т., Zaragoza О., Brown G.D., Netea М., Casadevall А. et al.]. В большинстве случаев проведенные исследования сосредоточены на изучении двух или нескольких изолятов криптококков, в том числе авирулентных мутантов. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для выяснения роли вирулентности С. neoformans в иммунопатогенезе криптококкоза.

Цель исследования. Изучить особенности функциональной активности макрофагов при взаимодействии со штаммами Cryptococcus neoformans разной вирулентности in vitro.

Задачи исследования. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1 Определить вирулентность клинических изолятов С. neoformans на модели экспериментального криптококкоза у мышей.

2 Изучить особенности фагоцитоза резидентными перитонеальными макрофагами интактных мышей штаммов С. neoformans разной вирулентности.

3 Исследовать способность штаммов С. neoformans разной вирулентности индуцировать продукцию макрофагами факторов микробоцидности.

4 Оценить продукцию цитокинов (IL-lß, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-23, TNF-a и TGF-ßl) резидентными перитонеальными макрофагами мышей при взаимодействии со штаммами С. neoformans разной вирулентности.

5 Определить влияние факторов патогенности на чувствительность штаммов С. neoformans к азоловым препаратам и антимикробным пептидам животного происхождения.

Научная новизна исследования. Впервые проведен сравнительный анализ влияния вирулентности клинических изолятов Cryptococcus neoformans на функциональную активность макрофагов in vitro.

Впервые было показано, что все исследованные штаммы С. neoformans не обладают способностью стимулировать продукцию супероксид анионов и нитро-ксид анионов интактными макрофагами. Также впервые показано, что в случае предварительной стимуляции макрофагов липополисахаридом, сильновирулентные штаммы подавляют продукцию нитроксид анионов, а слабовирулентные оказывают противоположное действие. Фактором микробоцидности при первичном взаимодействии макрофагов, стимулированных ЛПС, со штаммами С. neoformans разной вирулентности, является продукция метаболитов оксида азота.

Впервые установлены особенности цитокинового профиля перитонеальных макрофагов мышей при взаимодействии с С. neoformans разной вирулентности: отсутствие продукции провоспалительных цитокинов и зависимость выработки IL-10 и IL-13 от вирулентности штаммов. Впервые исследована противогрибковая активность суммарной фракции протегринов (PG-1, PG-2, PG-3) в отношении клинических изолятов С. neoformans in vitro и выявлена взаимосвязь чувствительности штаммов С. neoformans к данным антимикробным пептидам со способностью к меланинообразованию.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представленная диссертационная работа является фундаментальным научным исследованием, результаты которого вносят вклад в изучение иммунопатогенеза криптококкоза. Работа носит экспериментально-теоретический характер. Результаты исследования создают основу для поиска путей коррекции нарушенных иммунных процессов и разработки методов прогнозирования течения заболевания у больных криптококкозом. Изучение чувствительности штаммов С. neoformans к современным и новым альтернативным противогрибковым средствам вносит вклад в повышение эффективности антифунгальной терапии больных криптококкозом.

Результаты диссертационной работы могут быть использованы в научных исследованиях, связанных с изучением особенностей взаимодействия микромице-тов и фагоцитов.

Внедрение результатов исследования. Результаты настоящего исследования внедрены в учебный процесс и научную работу кафедры медицинской микробиологии и кафедры клинической микологии, аллергологии и иммунологии ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова Минздрава России, в учебный процесс кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. акад. И.П.Павлова Минздрава России, в учебный процесс кафедры инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и тропических заболеваний) ФГБОУ BMA им. С.М. Кирова Минобороны РФ.

Методология и методы исследования. Методологическая основа диссертационной работы состояла в последовательном применении методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного экспериментального исследования с использованием микробиологических, физико-химических, иммунологических и статистических методов. Положения, выносимые на защиту:

1 Фагоцитарная активность макрофагов в отношении С. neoformans зависит от степени вирулентности: активнее поглощаются слабовирулентные штаммы.

2 Сильновирулентные штаммы ингибируют продукцию метаболитов оксида азота макрофагами, активированными липополисахаридом, а слабовирулентные штаммы оказывают стимулирующее действие.

3 Установлена взаимосвязь вирулентности штаммов С. neoformans с продукцией макрофагами цитокинов IL-10 и IL-13, определяющими формирование не-протективного иммунного ответа.

4 Штаммы С. neoformans чувствительны к протегринам in vitro независимо от степени вирулентности. Более меланизированные клетки С. neoformans менее чувствительны к действию суммарной фракции протегринов.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов, полученных при проведении экспериментов, подтверждается достаточным и репрезентативным объёмом выборки выполненных наблюдений и контрольных исследований, и подтверждена адекватными методами статистической обработки данных. Методы математической обработки полученных результатов соответствуют поставленным задачам.

Материалы диссертации доложены на 17-ом и 18-ом конгрессах международного общества по медицинской и ветеринарной микологии ISHAM (Токио, Япония, 2009 г.; Берлин, Германия, 2012 г.), на 4-ом и 5-ом конгрессе «Тенденции в медицинской микологии» (Афины, Греция, 2009 г.; Валенсия, Испания, 2011 г.), на 9-ой международной конференции по криптококку и криптококкозу ICCC (Амстердам, Нидерланды, 2014), на ежегодной Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014 гг.) на заседании Санкт-Петербургского отделения Общества иммунологов РФ (Санкт-Петербург, 2013).

Личное участие автора в получении результатов. Автором были спланированы и лично выполнены все экспериментальные исследования по проблеме и проведена статистическая обработка данных. В постановке и решении конкретных задач, организации и выполнении исследований, обработке и интерпретации полученных результатов автору принадлежит ведущая роль.

Публикации по материалам исследования. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 12 работ в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов работы, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 299 источников. Текст диссертации иллюстрирован 11 таблицами, 25 рисунками и микрофотографиями.

Диссертационная работа выполнена в НИЛ иммунологии и аллергологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были 12 штаммов криптококков, полученные из Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ) НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова - Cryptococcus neoformans РКПГ №№: 1090, 1106, 1164, 1165, 1175, 1178, 1216, 1257, 1262, 1271, 1272, 1276. Все штаммы криптококков представлены клиническими изолятами.

Оценку морфо-биологических характеристик и описание культур С. neoformans проводили через 72 часа выращивания на агаре Сабуро при 37° С. Видовую идентификацию штаммов С. neoformans проводили масс-спектрометрически на приборе MALDI-TOF MS Biotyper Autoflex (Bruker, Германия). Способность С. neoformans к меланинообразованию in vitro определяли на среде с L-ДОФА при температуре 28° С и 37° С в течение 3-х суток.

Экспериментальные исследования были проведены на мышах - самцах линии Balb/c весом 18-20 г., полученных из питомника лабораторных животных «Рап-полово» РАМН. Всего в работе использовали 1080 мышей.

Модель экспериментального криптококкоза воспроизводили в опытах на мышах. Взвесь С. neoformans в стерильном 0,9 % растворе NaCl вводили внутривенно по 0,5 мл в хвостовую вену. Животным контрольной группы вводили 0,5 мл стерильного 0,9 % раствора NaCl. Доза патогена составляла 1х106кл/мл, количество погибших животных регистрировали ежедневно, в течение 70 суток. В каждую группу, включая контрольную, входили 10 мышей, каждый эксперимент повторяли дважды. В качестве характеристики вирулентности различных штаммов криптококков был принят день гибели 50% животных [E.G. da Silva et al., 2006].

Макрофаги получали путем перитонеального лаважа (5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 160 мкг/мл ген-тамицина) на мышь. Во всех экспериментах использовали резидентные перито-неальные макрофаги, которые в ряде экспериментов стимулировали липополи-сахаридом (ЛПС) в дозе 1 мкг/мл (E.coli 055:В5, Sigma) или ламинарином (Sigma) в дозе 1 мг/мл in vitro.

Для оценки поглотительной активности, макрофаги в концентрации 1x106 кл/мл, предварительно инкубировали в 4-луночных слайд-камерах в течение 18 часов при 37° С и 5% СОг для образования монослоя. Затем добавляли клетки С. neoformans и инкубировали 2 часа, окрашивали по Романовскому-Гимзе. Фагоцитарный индекс (ФИ) определяли микроскопически при подсчете 300 клеток как отношение числа поглощенных криптококков к общему числу макрофагов, выраженное в процентах. Фагоцитарное число (ФЧ) - среднее количество криптококков, захваченных одной фагоцитирующей клеткой [F.L. Jr. Wormley, J.R. Perfect, 2005].

Для оценки факторов микробоцидности макрофагов определяли продукцию нитроксид анионов и супероксид анионов. Измерение концентрации метаболитов оксида азота (NO2 ) проводили с использованием реактива Грисса и учитывали на спектрофотометре при 540 нм через 48 ч совместной инкубации макрофагов и С. neoformans [Migliorini Р. et al., 1991]. Параллельно с помощью НСТ-теста оценивали продукцию кислородных радикалов интактными макрофагами и макрофагами, стимулированными зимозаном или ЛПС. После 48 ч инкубации содержание восстановленного красителя (диформазана) оценивали спектрофо-тометрически при длине волны 620 нм [Киселева Е.П. и др., 1994].

Для определения уровня продукции цитокинов клетки макрофагов инкубировали в аналогичных условиях в течение 18 ч при 37° С и 5% СОг в 24-луночных планшетах (Orange Scientific, Бельгия) в окончательном объеме 1,5 мл, затем совместно с С. neoformans в течение 24 часов. Продукцию цитокинов IL-lß, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-23, TNF-a и TGF-ß оценивали в надосадочной жидкости методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA, R&D Systems) в соответствии с инструкциями к наборам [F.L. Jr. Wormley, J.R. Perfect, 2005].

Цитотоксическую активность макрофагов в отношении грибов С. neoformans оценивали после их инкубации с криптококками в сравнении с контрольным ростом грибов без макрофагов и выражали в процентах жизнеспособных клеток грибов. Полученный супернатант удаляли, затем добавляли раствор 0,02 % до-децил-сульфат натрия и отмывали стерильной дистиллированной Н20. Из полученного лизата готовили разведение 1:10, затем 100 мкл образца засевали на

чашки Петри с плотной средой Сабуро (37° С; 72 ч) и подсчитывали число колоний.

Чувствительность С. neoformans к флуконазолу и вориконазолу определяли диско-диффузионным методом (CLSI М44-А). Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) определяли с помощью микробиологического анализатора BIOMIC Vision (Giles Scientific, США).

Для исследования чувствительности С. neoformans к антимикробным пептидам использовали суммарную фракцию протегринов. Протегрины PG-1, PG-2, PG-3 — антимикробные пептиды лейкоцитов свиньи (близкие изоформы с молекулярной массой ~ 2000 Da) были получены методом кислотной экстракции и очищены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии сотрудниками отдела общей патологии ФБГУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН (зав. лабораторией, д.б.н., проф. Кокряков В.Н.). Чувствительность криптококков к суммарной фракции протегринов определяли путем совместной инкубации 1хЮ4 кл/мл С. neoformans с различными концентрациями суммарной фракции протегринов PG-1, PG-2, PG-3 в стерильном растворе фосфатно-солевого буфера от 0,5 мкг/мл до 7,5 мкг/мл. После экспозиции образцы засевали на чашки Петри с агаром Сабуро и инкубировали 72 ч (37° С). В контрольных образцах использовали раствор фосфатно-солевого буфера. Антифунгальную активность протегринов оценивали по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) с последующим определением минимальной фунгицидной концентрации (MFC50) для каждого штамма С. neoformans.

Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывались с помощью программной системы STATISTICA for Windows 6.0. Оценка достоверности различий полученных результатов проводилась вычислением параметрических (согласно критерию т-Стьюдента и непараметрических критериев (Манна-Уитни, у}). При использовании непараметрических критериев оценки полученных результатов указывали медианные значения показателей с интерквартильным размахом (25% - 75%) как Me (Lq-Hq). В работе также использовали подходы описательной статистики, метод линейной корреляции и анализ выживаемости. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали величину р<0,05. [Реброва О.Ю., 2006; Трухачёва Н.В., 2012].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследовали 12 клинических изолятов С. neoformans и изучили особенности их взаимодействия с перитонеальными макрофагами мышей in vitro. При микроскопическом исследовании нативных препаратов клетки всех исследуемых штаммов были округлыми, одиночными или почкующимися и образовывали по-лисахаридную капсулу, что соответствовало описанию грибов рода Cryptococcus в определителе дрожжей [С. Kurtzman., J. Fell, Т. Boekhout, 2011]. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии определили, что 9 штаммов Cryptococcus neoformans принадлежали к варианту grubii (var. grubii), 3 штамма - к варианту neoformans (var. neoformans). Средний диаметр клеток штаммов С. neoformans варьировал в пределах от 7,20 ± 0,06 мкм до 14,33 ± 0,51 мкм, средний размер капсулы — от 1,66 ± 0,07 мкм до 8,70 ± 0,54 мкм. При оценке способности штаммов С. neoformans к меланинообразованию при 37° С, образование пигмента наблюдали преимущественно ко второму дню исследования, при этом у 5 из 12 штаммов (РКПГ Y 1106, Y 1164, Y 1257, Y 1262, Y 1276) на третьи сутки инкубации пигментация на среде с L-ДОФА была слабо выражена или отсутствовала.

В результате изучения вирулентности штаммов на экспериментальной модель криптококковой инфекции у мышей, все штаммы разделили на две группы в зависимости от сроков гибели экспериментальных животных. Первая группа -сильновирулентные штаммы - сроки гибели 50% животных от 8 до 16 дней (5 штаммов), вторая группа - слабовирулентные штаммы — сроки гибели 50% мышей от 27 до 65 дней (7 штаммов С. neoformans). В контрольной группе животные были живы в течение всего срока наблюдения.

Достоверность различий по вирулентности между этими двумя группами была подтверждена двухмерным анализом по всем парным критериям и многомерному х2 (р<0,001) (рисунок 1).

Поглотительную и цитотоксическую активность макрофагов при взаимодействии с С. neoformans разной вирулентности оценивали по продукции нитроксид анионов и супероксид анионов, выработке провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

I !

л

дни после инфицирования

Рисунок 1 - Выживаемость мышей, инфицированных штаммами С. neoformans разной вирулентности. По оси ординат — кумулятивная доля выживших животных, по оси абсцисс - время от начала эксперимента, сутки. Группа 1 -сильновирулентные штаммы, группа 2 - слабовирулентные штаммы (р<0,001).

Влияние штаммов С. neoformans разной вирулентности на поглотительную активность макрофагов. При проведении серии экспериментов было показано, что интактные макрофаги мышей слабо поглощали все исследованные штаммы С. neoformans (таблица 1). Предварительная опсонизация криптококков свежей мышиной сывороткой существенно усиливала поглотительную активность макрофагов в отношении слабовирулентных штаммов С. neoformans по сравнению с сильновирулентными (таблица 1). При подсчете фагоцитарного числа было определено, что каждый макрофаг, участвующий в фагоцитозе, был способен к поглощению не более 1-2 криптококков. Показатели фагоцитарного числа не зависели от степени вирулентности штаммов и предварительной опсо-низации криптококков.

Фагоцитарную активность макрофагов в отношении С. neoformans изучали в двух вариантах: на интактных макрофагах и макрофагах, активированных липо-полисахаридом. В эксперименте мы не выявили существенного изменения фагоцитарной активности макрофагов, предварительно стимулированных ЛПС, по отношению ко всем исследованным штаммам криптококков (таблица 1).

Кроме того, для исследования роли рецептора дектина-1 в механизмах фагоцитоза криптококков, макрофаги предварительно обрабатывали ламинарином, представляющим собой полисахарид, полученный из бурых водорослей Laminaria digitata. Известно, что ламинарин взаимодействует с дектином-1 на поверхности макрофагов и может блокировать связывание этого рецептора с ß-гликанами клеточной стенки С. neoformans, что было показано в опытах с акап-сулярными криптококками [Bancroft G.J., 1995]. В проведенном нами исследовании было впервые показано, что ламинарин в два раза снижал способность макрофагов фагоцитировать клинические изоляты, обладающие полисахаридной капсулой, причем как слабовирулентных, так и сильновирулентных штаммов С. neoformans (таблица 1). Полученные результаты согласуются с новыми данными, которые подтверждают наличие ß-гликанов в составе капсулы С. neoformans [Cordero R.J. et al., 2011]. Это позволяет нам сделать предположение об участии капсулярных ß-гликанов в фагоцитозе криптококков.

Установлено, что макрофаги более эффективно фагоцитировали клетки С. neoformans слабовирулентных штаммов по сравнению с сильновирулентными (таблица 1). Была выявлена обратная корреляционная зависимость между шириной капсулы С. neoformans и фагоцитарным индексом (г = - 0,82; р<0,05).

Таблица 1 — Показатели фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов при взаимодействии со штаммами С. neoformans разной вирулентности

Варианты эксперимента Сильновирулентные штаммы (п = 5) ФИ, % (М ± ш) Слабовирулентные штаммы (п = 7) ФИ, % (М ± ш)

МФ + С. neoformans 8,88±0,29 14,32±0,44 *

МФ лпс + С. neoformans 10,85±0,40 13,76±0,48 *

МФ лам + С. neoformans 4,45±0,40 6,04±0,40 *

МФ + С. neoformans, опсонизированные 17,65±0,92 * 29,62±1,89 *

Примечание. * — достоверность различий между сильно и слабовирулентными штаммами (р <0,05).

# - достоверность различий по сравнению с ФИ интактных макрофагов в отношении С. neoformans без опсонизации (МФ + С. neoformans), (р <0,05).

Влияние штаммов С. neoformans разной вирулентности на продукцию супероксид анионов и нитроксид анионов макрофагами. Поглощение микроорганизмов макрофагами инициирует фагоцитарные клетки к продукции активных форм кислорода, токсичных для большинства грибковых патогенов [Voelz К., 2010]. Известно, что микромицеты способны к детоксикации этих радикалов, что может приводить к выживанию патогенов после фагоцитоза макрофагами [Vecchiarelli А., 2007; Missall Т., 2004; Zaragoza О., 2008]. В связи с этим, мы проводили оценку способности макрофагов к продукции факторов микробоцид-ной активности (супероксид анионов и нитроксид анионов).

В проведенном исследовании было установлено, что у макрофагов при взаимодействии с С. neoformans отсутствовала способность к продукции активных форм кислорода независимо от степени вирулентности штаммов (р>005), (рисунок 2). Аналогичные результаты были получены и после предварительной стимуляции макрофагов зимозаном - стандартным активатором «респираторного взрыва»: штаммы С. neoformans не оказывали влияния на продукцию супероксид аниона макрофагами (р>005), (рисунок 2). едОПхЮОО

Рисунок 2 - Показатели продукции супероксид анионов макрофагами в НСТ-тесте при взаимодействии со штаммами С. neoformans разной вирулентности (М ± щ; р>005).

Также было выявлено, что все штаммы криптококков были не способны индуцировать продукцию N02 интактными макрофагами. Наряду с этим, нами впервые были выявлены штаммные различия С. neoformans в отношении индукции нитроксидных анионов макрофагами, стимулированными ЛПС: сильновирулентные штаммы ингибировали продукцию метаболитов оксида азота, а слабовирулентные штаммы оказывали стимулирующее действие (таблица 2).

Таблица 2 - Показатели продукции нитроксид анионов макрофагами при взаимодействии со штаммами С. neoformans разной вирулентности (М±ш)

Варианты эксперимента Сильновирулентные штаммы (п=5), нмоль/10бкл Слабовирулентные штаммы (п=7), нмоль/10бкл Контрольные значения, нмоль/106кл

МФ + С.neoformans 67,99±2,59 72,46±2,79 74,05±1,47

МФ лпс+ С. neoformans 204,68±6,76 317,60± 10,09 276,70±7,41

*р<0,01 *р<0,01 * р<0,01

МФ + С. neoformans опсонизированные 73,56±4,09 77,80±4,49 74,05±1,47

Примечание. * - достоверность различий по сравнению с контрольными значениями; # — достоверность различий между группами штаммов.

Влияние вирулентности штаммов С. neoformans на цитотоксическую активность макрофагов. Выявленная тенденция была отмечена и при изучении цитотоксической активности макрофагов по отношению к штаммам С. neoformans разной вирулентности. Установлено, что интактные макрофаги достоверно активнее разрушали клетки слабовирулентных штаммов криптококков, по сравнению с сильновирулентными (рисунок За).

Обращает на себя внимание факт, что активация макрофагов ЛПС существенно повышала цитотоксическую активность по отношению ко всем исследованным штаммам криптококков (рисунок 36).

Выживаемость мышей, зараженных штаммами С. neoformans разной вирулентности, положительно коррелировала с цитотоксической активностью макрофагов, стимулированных ЛПС (г = 0,75; р < 0,05).

МФ+C.n.

□ сильновирулентные штаммы (п=5)

МФ+C.n. опс слабовирулентные штаммы (п=7)

%

МФлпс+С.л. опс

□ сильновирулентные штаммы (п=5)

О слабоаирулентные штаммы (п=7)

Рисунок 3 - Цитотоксическая активность макрофагов при взаимодействии с С. neoformans: а) влияние предварительной опсонизации штаммов С. neoformans разной вирулентности на киллерную активность интактных макрофагов; б) влияние опсонизации штаммов С. neoformans разной вирулентности на киллерную активность макрофагов, предварительно стимулированных ЛПС. Примечание. Указаны медианные значения с интерквартильным размахом (25%-75%) - Ме (Lq-Hq).

Влияние штаммов С. neoformans разной вирулентности на продукцию цитокинов. Важным аспектом первичного взаимодействия макрофагов с крип-тококками на раннем этапе является продукция цитокинов, которые определяют дальнейший ход инфекционного процесса, возможность выживания патогена и развитие определенного типа адаптивного иммунного ответа. Нами установлено, что инкубация макрофагов с С. neoformans разной вирулентности не стимулировала продукцию IL-12p70, IL-lß и TNF-a, TGF-ß и IL-23. Однако все штаммы С. neoformans активировали интактные макрофаги к выработке IL-10, IL-13 и IL-17 (р<0,05), и при этом установлены статистически значимые различия между сильновирулентными и слабовирулентными штаммами С. neoformans (рисунок

4).

пг/мл

500 -450 -400 350 -300 j 250 | 200 -150 -

юо;

50 •

IL-10 IL-13

□ контроль □ сильновирулентные штаммы (п=5)

IL-17

9 слабовирулентные штаммы (п=7)

Рисунок 4 - Продукция IL-10, IL-13 и IL-17 интактными макрофагами при взаимодействии со штаммами С. neoformans разной вирулентности, Ме (Lq-Hq).

С помощью корреляционного анализа Спирмена подтверждена прямая зависимость между вирулентностью штаммов С. neoformans и способностью к индукции данных цитокинов (для IL-13: г = 0,63 (р<0,05); для IL-10: г = 0,62 (р<0,05); для IL-17: г =0,82; р<0,05).

В экспериментах с предварительной стимуляцией макрофагов ЛПС, было показано усиление продукции IL-10 и IL-17 (рисунок 5, 7), а в случае добавления

17

ламинарина - отсутствие влияния на выработку 1Ь-10 (рисунок 5). На основании полученных результатов предположили участие в этом процессе толл-подобных рецепторов (ТЬЯ) и отсутствие связи с дектином-1.

При изучении продукции 1Ь-13 показано, что предварительная инкубация макрофагов как с липополисахаридом, так и с ламинарином, приводила к подавлению синтеза цитокина (рисунок 6). Можно предположить, что в данном случае стимуляция продукции 1Ь-13 криптококками происходит с участием ТЫ14 и дек-тин- 1.

лг/мл

р<0,05 р<0,05

I-1

*

□ контроль □ сильновирулентные штаммы (п=5) □ слабовирулентные штаммы (п=7)

Рисунок 5 - Влияние штаммов С. neoformans разной вирулентности на продукцию IL-10 макрофагами, культивированными с липополисахаридом или ламинарином; Ме (Lq-Hq).

* — статистически значимые различия сильно и слабовирулентных штаммов по отношению к контролю (по Манну-Уитни, р<0,05).

пг/мл

МФ+C.n. Мф ппс+С.п.

О контроль □ сильновирулентные штаммы (п=5)

МФ лам+С.п. J слабовирулентные штаммы (п=7)

Рисунок 6 - Влияние штаммов С. neoformans разной вирулентности на продукцию IL-13 макрофагами, культивированными с липополисахаридом или ламина-рином; Ме (Lq-Hq).

* — между штаммами (по Манну-Уитни, р<0,05).

** - между группами сильновирулентных штаммов (по Манну-Уитни, р<0,05). пг/мл

700,0 600,0 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0

□ контроль □ сипьновирулентные штаммы (п=5) □ слабовирулентные штаммы (п=7)

р<0,05

Рисунок 7 - Влияние С. neoformans разной вирулентности на продукцию IL-17 макрофагами, культивированными с липополисахаридом; Ме (Lq-Hq). * - по отношению к контролю, р<0,05.

Таким образом, нами впервые установлено, что штаммы С. neoformans активируют продукцию макрофагами цитокинов IL-10, IL-17 и IL-13, которые могут оказывать неблагоприятное воздействие на дальнейшее развитие инфекционного процесса и способствовать формированию непротективного иммунного ответа. Так показано, что IL-10 подавляет фагоцитоз и индуцирует образование Т-регуляторных клеток [Romani L., 2008], а IL-17 и IL-13 ингибируют действие IFN-y, который выполняет основную защитную функцию при инфекции [Zou Y. et al., 2012].

Проблемой современной химиотерапии инвазивных микозов, в том числе и криптококкоза, является рост устойчивости криптококков к антифунгальным препаратам [Pfaller М.А., 2005, 2011]. При определении чувствительности штаммов С.neoformans к флуконазолу установлено, что из 12 изученных штаммов чувствительными были 8, умеренно чувствительными - 2 штамма (Y 1106, Y 1262) и 2 штамма С. neoformans (Y 1175, Y 1090) были устойчивыми. Все исследуемые штаммы были чувствительны к вориконазолу.

В настоящее время перспективными антимикробными агентами являются различные пептиды (дефенсины, кателицедины, протегрины, цекропины, магей-нины и др.) [Кокряков В.Н., 2006]. При определении антифунгальной активности суммарной фракции протегринов PG-1, PG-2, PG-3 было установлено, что величина минимальной фунгицидной концентрации MFC50 для штаммов С. neoformans варьировала от 0,8 мкг/мл до 3,7 мкг/мл. Достоверных различий и корреляционной зависимости между степенью вирулентности штаммов С. neoformans и MFC50 не было установлено. Согласно полученным данным, была выявлена прямая корреляционная зависимость между MFC50 и способностью штаммов С. neoformans к меланинообразованию in vitro (р = 0,92) (таблица 3). В отличие от работ других исследователей [Zaragoza О, 2008], мы не обнаружили взаимосвязи между фунгицидной активностью протегринов в отношении С. neoformans и шириной капсулы.

Таблица 3 - Показатели противогрибковой активности суммарной фракции про-тегринов в отношении штаммов С. neoformans разной вирулентности с учетом способности к меланинообразованию и капсулообразованию.

№ п/п № штамма РКПГ MFC50 (мкг/мл) Образование меланина 37°С на 3-й сутки (баллы) Медиана выживаемости (дни) Размер капсулы (мкм) (М±т)

1 Y 1164 0,8 0,5 65 1,66±0,09

2 Y 1262 0,8 0,5 15 3,23±0,14

3 Y 1276 1,1 0 51 l,660,07i

4 Y 1257 1,2 0,5 30 1,71±0,11

5 Y 1106 1,4 0,5 8 8,70±0,54

6 Y 1090 2,0 1 27 2,26±0,06

7 Y 1272 2,3 1 51 1,93±0,06

8 Y 1271 2,4 1 39 1,89±0,05

9 Y 1165 2,6 1 14 4,48±0,18

10 Y 1216 2,9 2 65 1,97±0,08

И Y 1178 3,5 2 16 2,69±0,13

12 Y 1175 3,7 2 11 2,46±0,11

Таким образом, на основании результатов проведенного исследования можно сделать заключение, что степень вирулентности штаммов С. neoformans, играет важную роль при их взаимодействии с фагоцитарными клетками на раннем этапе развития инфекционного процесса.

ВЫВОДЫ

1 Клинические изоляты С. neoformans обладают разной степенью вирулентности при экспериментальном криптококкозе (медиана выживаемости мышей Balb/c 8-65 дней), (р<0,05).

2 Способность макрофагов к фагоцитозу зависит от вирулентности штаммов С. neoformans. Макрофаги активнее поглощают слабовирулентные штаммы криптококков (р<0,05). Установлена обратно пропорциональная зависимость между фагоцитозом макрофагов и шириной капсулы C.neoformans: чем больше размер капсулы, тем ниже фагоцитарная активность (г = - 0,82; р<0,05).

3 Штаммы С. neoformans не обладают способностью стимулировать продукцию активных форм кислорода и метаболитов оксида азота в интактных макрофа-

гах. При взаимодействии с макрофагами, активированными липополисахари-дом, сильновирулентные штаммы С. neoformans, в отличие от слабовирулентных, обладают выраженной способностью подавлять продукцию нитроксид-ных анионов (р<0,05).

4 Сильновирулентные штаммы, по сравнению со слабовирулентными, активнее повышают продукцию IL-13, IL-10 и IL-17 макрофагами (р<0,05). Штаммы С. neoformans, независимо от степени вирулентности, не индуцируют макрофаги к выработке провоспалительных цитокинов IL-lß, IL-6, IL-12p70, TNF-a, а также IL-23 и TGF-ßl.

5 Протегрины обладают противогрибковой активностью in vitro по отношению к штаммам С. neoformans. Более меланизированые клетки С. neoformans менее чувствительны к действию суммарной фракции протегринов (г = - 0,92; р<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 При доклинических исследованиях новых противогрибковых средств in vitro в отношении криптококков рекомендуется использовать штаммы С. neoformans с разной способностью к меланинообразованию и чувствительностью к флукона-золу.

2 Доклинические исследования антифунгальных препаратов in vivo в экспериментальных моделях целесообразно проводить с использованием штаммов С. neoformans разной вирулентности.

ПЕРСПЕКТИВА ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

1 Разработка быстрых молекулярно-генетических методов определения вирулентности штаммов С. neoformans в качестве альтернативы использования экспериментальных животных для оценки патогенности возбудителя.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Влияние размера капсулы грибов Cryptococcus neoformans на их взаимодействие с перитонеальными макрофагами / Л.В. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П. Киселева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. — 2008. — Т.10, №2. - С.87.

2 Филиппова, Л.В. Взаимодействие макрофагов со штаммами Cryptococcus neoformans разной вирулентности / Л.В. Филиппова, Н.В.Васильева, Е.П. Киселе-

ва // В сб. науч. труд. «По материалам отчетной сессии 2009 года». - СПб., 2009. - С.14-16.

3 Особенности взаимодействия разных штаммов Cryptococcus neoformans с макрофагами / J1.B. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П. Киселева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. - 2009. - Т.11, №2. - С.120.

4 Cryptococcosis in Saint Petersburg, Russia, 1990-2008 / N.V. Vasilyeva, N.N. Klimko, T.S. Bogomolova, I.A. Bosak, L.V. Filippova // Abstracts of the 17th Congress of the International Society for Human and Animal Mycology, Tokyo, Japan, May 25-29. - 2009. - P.472.

5 The interaction of macrophages with different Cryptococcus neoformans isolates / L.V. Filippova, N.V. Vasilyeva, E.P. Kiseleva [et al.] // Mycoses. - 2009. - Vol.52.

- P.91-92.

6 Факторы микробоцидности макрофагов по отношению к штаммам Cryptococcus neoformans разной вирулентности / JI.B. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П. Киселева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. - 2010. - Т.12, №2.

- С.138-139.

7 Особенности взаимодействия макрофагов с разными по вирулентности штаммами Cryptococcus neoformans / JI.B. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П. Киселева ]и др.] II Проблемы медицинской микологии. - 2010. -Т.12, №1. - С.38-41.

8 Особенности спектра цитокинов, продуцируемых макрофагами, при взаимодействии со штаммами Cryptococcus neoformans разной вирулентности in vitro / JI.B. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П. Киселева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. — 2011. — Т.13, №2. — С.114.

9 Effect of different virulence Cryptococcus neoformans strains on phagocytosis and cytokine production by macrophages in vitro / L.V. Filippova, N.V. Vasilyeva, E.P. Kiseleva [et al.] // Mycoses. - 2011. - Vol.54. - P.115.

10 Филиппова, JI.B. Cryptococcus neoformans и врожденный иммунитет / JI.B. Филиппова, E.B. Фролова // Проблемы медицинской микологии. -2011. - Т.13, №2. - С.10-19.

11 Продукция цитокинов макрофагами при взаимодействии со штаммами Cryptococcus neoformans разной вирулентности in vitro / JI.B. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П. Киселева [и др.) // Проблемы медицинской микологии. - 2011. - Т.13, №3. - С.45-49.

12 Особенности взаимодействия Cryptococcus neoformans разной вирулентности и альвеолярных макрофагов / Н.В. Васильева, А.А. Степанова, Л.В. Филиппова [и др.] // Проблемы медицинской микологии. - 2011. -Т.13, JV®4. - С.46-50.

13 Different virulence Cryptococcus neoformans strains and cytokine production by macrophages in vitro / L.V. Filippova, N.V. Vasilyeva, E.P. Kiseleva [et al.] // Keystone Symposia on Fungal Pathogens: From Basic Biology to Drug Discovery, Santa Fe, New Mexico, USA, January, 15-20. - 2012. - P.140.

14 Fungicidal activity of antimicrobial peptides against Cryptococcus neoformans in vitro / L.V. Filippova, N.V. Vasilyeva, E.P. Kiseleva [et al.] // Mycoses. — 2012. -Vol. 55. - S.4. - P. 108.

15 Филиппова, JI.В. Чувствительность штаммов Cryptococcus neoformans к антимикробным пептидам in vitro / Л.В. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П. Киселева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. - 2012.- Т.14, №2. - С. 132.

16 Влияние вориконазола на взаимодействие макрофагов со штаммами Cryptococcus neoformans разной вирулентности / Л.В. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.В.Фролова [и др.] // Проблемы медицинской микологии. - 2014. — Т.16, №2. - С.140.

17 Interactions of murine phagocytes and Cryptococcus neoformans strains in combination with voriconazole / L.V. Filippova, N. V. Vasilyeva, E. V. Frolova [et al.] // Mycoses: Diagnosis. Therapy and prophylaxis of fungal disease. - 2014. — Vol. 57. -S.1.-P.90.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

IFN-y - интерферон гамма IL — интерлейкин

TGF - трансформирующий фактор роста

TNF - фактор некроза опухоли

ВАК — Высшая аттестационная комиссия

ДОФА - дигидроксифенилаланин

ИФА — иммуноферментный анализ

КОЕ - колониеобразующая единица

ЛПС — липополисахарид

НСТ-тест — тест с нитросиним тетразолием

РКПГ — Российская коллекция патогенных грибов

ФИ — фагоцитарный индекс

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ФЧ - фагоцитарное число

ЦСЖ — церебро-спинальная жидкость

ЭТС — эмбриональная телячья сыворотка

Филиппова, JI.В. Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности: Автореф.дисс.....канд.мед.наук: 03.02.12 - микология, 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология / Филиппова Лариса Вячеславовна. СПб., 2014. 24 с.

Подписано в печать 30.01.2015 г Формат 60x84 А6 Цифровая Печ.л.1.0 Тираж 100 Заказ №10/02 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д.54, офис 2)