Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы патогенности Cryptococcus Neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Факторы патогенности Cryptococcus Neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза"

На правах

ВАСИЛЬЕВА Наталья Всеволодовна

ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ CR YPTOCOCCUS NEOFORMANS И ИХ РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ КРИПТОКОККОЗА

03.00.24 - микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в научно-исследовательском институте медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук профессор Блинов Николай Петрович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Аркадьева Галина Евгеньевна

доктор биологических наук профессор Комов Вадим Петрович

доктор медицинских наук профессор Цинзерлинг Всеволод Александрович

Ведущая организация - Государственное учреждение научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится « АУ » (ШССМТйХ.2005 г. в /3 час. на заседании диссертационного совета у{ 208.089-67 при ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д.41.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО СПб МАЛО Росздрава по адресу: 195196, Заневский пр.,д.1/82

Автореферат разослан «.

2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

старший научный сотрудник А.В.Соболев

Ü.41&

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 3 cfV^L

Актуальность проблемы. Cryptococcus neoformans - один из наиболее важных патогенных для человека микромицетов, встречающихся в клинической практике; он вызывает тяжелый менингоэнцефалит и диссеминированные инфекции преимущественно у больных СПИД и иммунодефицитами другого генеза.

Частота криптококкоза в развитых странах мира после введения высоко активной антиретровирусной терапии составляет 0,3-0,5/100.000 населения. Однако, в развивающихся странах ситуация остается по-прежнему тревожной; по данным конференции по инвазивным микозам в 2002 г среди ВИЧ-инфицированных лиц от криптококкоза умерло 200 000 человек. Сведения о заболеваемости крипгококкозом в России в целом отсутствуют, равно как и I информация о молекулярных типах, серотипах, вариантах и вирулентности изолятов криптококков.

В настоящее время Россия по темпам прироста числа ВИЧ-инфицированных лиц занимает одно из первых мест в мире (Онищенко Г.Г., 2001 г., Лобзин Ю.В., t Жданов К.В., 2003 г., Покровский В.В., 2004 г., Рахманова А.Г. и др., 2004 г.) и ухудшение данной ситуации в ближайшие годы вполне очевидно. Поскольку криптококкоз является маркерной инфекцией при СПИД, частота его также будет возрастать.

Род Cryptococcus включает 38 видов и только два из них (С. neoformans и С. gattii) являются патогенными. Вместе с тем, биологические особенности этих двух видов изучены недостаточно, включая и факторы патогенности. Наиболее явные из них (рост патогенов при 37° С, продукция меланинов, типы спаривания, активность фосфолипазы и уреазы, капсулообразование), стали известными в последние годы, но простое их перечисление не обеспечивает возможности дифференцировать патогенные криптококки по вирулентности, что могло бы иметь прогностическое значение. Очень мало информации имеется в отношении морфологии тканевых форм возбудителя в процессе инфекции, а также реакции организма больного на различные изоляты С. neoformans, которые могут заметно варьировать по вирулентности.

Несмотря на актуальность проблемы о правомочности отнесения , капсульного полисахарида различных серотипов и вариантов С. neoformans в разряд факторов агрессии, до сих пор нет четкости в понимании разграничения роли капсулы криптококка и ее главного компонента-глюкуроноксиломаннана, в результате чего и капсульный полисахарид и капсулу обычно относят к факторам патогенности.

В последнее время усилился интерес к проблеме ассоциативных взаимодействий грибов с другими микроорганизмами. Однако данные о криптококке - ассоцианте немногочисленны и противоречивы и, как правило, эти данные получены при аутопсиях с констатацией лишь факта наличия микст-инфекций.

В этой связи давно возникла необходимость более глубокого исследования биологии криптококков, в том числе их «поведенческих» характеристик в ассоциациях.

С учетом недостаточной изученности криптококков, как возбудителей угрожающих жизни инфекций, проблема всестороннего исследования биологии названных микроорганизмов является весьма актуальной.

Цель исследования. Изучение биологических особенностей патогенных криптококков - изолятов от пациентов в России. Задачи исследования.

1. Провести генотипирование криптококков - изолятов в России.

2. Идентифицировать криптококки, выделенные от больных, по основным морфо-физиологическим характеристикам для определения их соответствия типовым культурам.

3. Изучить цитологическую вариабельность патогенных криптококков, полученных в культурах in vitro и от экспериментальных животных, зараженных тест-организмами, с использованием современной световой и электронной микроскопии.

4. Изучить вирулентность и факторы патогенности изолятов криптококков от больных и некоторых коллекционных штаммов.

5. Провести сравнительное изучение морфологии возбудителя и патоморфологических изменений в аутопсийном материале и при экспериментальном криптококкозе, обусловленном штаммами различной вирулентности.

6. Изучить влияние капсульного полисахарида на течение экспериментального криптококкоза.

7. Определить «поведенческие» реакции криптококков в ассоциациях с другими микроорганизмами.

8. Исследовать чувствительность криптококков к антимикотикам. Научная новизна исследования.

Впервые:

проведен молекулярно-генетический анализ российских изолятов криптококков, собранных и изученных в ходе исследования, получена первая информация о различных субпопуляциях С. neoformans; экспериментально обнаружены пггаммовые различия российских изолятов криптококков по морфо-физиологическим свойствам, в том числе - на ультраструктурном уровне;

установлена возможность формирования оригинальных фенотипов криптококка у одного и того же больного в процессе инфекции на фоне лечения;

обоснована опосредованная роль капсульного экзогликана как возможного фактора агрессии патогена;

оценены ассоциативные взаимоотношения криптококков с бактериями, дрожжевыми и нитчатыми грибами;

выявлена корреляция между чувствительностью криптококков к антимикотикам азолового ряда (флуконазолу, вориконазолу) и вирулентностью.

определена архитектоника типов капсул у криптококков in vitro и in vivo,

наряду с пластичностью нативного капсульного материала;

оценены и изучены тканевые формы криптококка в зависимости от

вирулентности.

Практическая значимость и внедрение в практику.

Полученные данные о внутривидовых штаммных различиях по чувствительности к антимикотикам, вирулентности, особенностям тканевых форм, ферментативной активности С. neoformans, выделяемых из патологического материала, необходимо учитывать в клинической практике постановки диагноза и выбора средств лечения соответствующих больных.

Результаты патоморфологических и электронно-микроскопических исследований являются основой для постановки диагноза криптококкоза в ходе инфекции с учетом дифференциации клеток криптококков на инкапсулированные, бескапсульные и дегенеративные формы.

Результаты изучения взаимоотношения криптококков в ассоциациях с другими микроорганизмами следует экстраполировать на оценку микст-инфекций in vivo и в природных ассоциациях, в которых участником является С. neoformans.

Установлена необходимость определения чувствительности С. neoformans к флуконазолу и вориконазолу in vitro, а также мониторирования чувствительности в ходе лечения.

Основные руководства и пособия, в которых в порядке внедрения использованы результаты исследования:

1. Руководство для врачей «Перечень основных методов и критериев диагностики микозов», 2001. Рекомендовано к использованию ученым советом НИИ медицинской микологии СПб МАПО.

2. Учебное пособие «Диагностика микозов», 2004. Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей.

3. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в клинической ординатуре по специальности «Лабораторная микология», 2004.

4. Типовая программа повышения квалификации по специальности «Лабораторная микология», 2004.

5. Типовая программа профессиональной переподготовки по специальности «Лабораторная микология», 2004.

6. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в интернатуре по специальности «Лабораторная микология», 2004.

7. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в клинической ординатуре по специальности «Клиническая микология», 2004.

8. Типовая программа повышения квалификации по специальности «Клиническая микология», 2004.

9. Типовая программа профессиональной переподготовки по специальности «Клиническая микология», 2004.

10. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в интернатуре по специальности «Клиническая микология», 2004. Материалы диссертации внедрены в работу микологической клиники,

лаборатории диагностики микозов, микологического мониторинга и биологии грибов, «Российской коллекции патогенных грибов», лаборатории патоморфологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО, НИИ детских инфекций, Городского патологоанатомического бюро, инфекционной больницы № 30 им. С.П.Боткина г.Санкт-Петербурга; Республиканской клинической инфекционной больницы (Научно-практический центр профилактики и лечения ВИЧ-инфекции у беременных женщин и детей); Центра по профилактике и борьбе со СПИД г.Санкт-Петербурга.

Материалы диссертации внедрены в педагогический процесс ряда кафедр Санкт-Петербургской Медицинской академии последипломного образования (клинической микологии, аллергологии и иммунологии, курса лабораторной микологии, педиатрии с курсом неонатологии, патологической анатомии с курсом цитологии).

Положения, выносимые на защиту.

1. Возбудители криптококкоза гетерогенны по биологическим свойствам.

2. Важнейшими в дифференциации штаммов криптококков по вирулентности являются фосфолипаза, уреаза и фенолоксидаза.

3. При криптококкозе морфология клеток С. neoformans в тканях взаимосвязана с вирулентностью.

4. Штаммы патогенных криптококков формируют разные по архитектонике капсулы.

5. Полисахариды криптококков проявляют защитное действие применительно к клеткам-продуцентам и не являются непосредственным фактором агрессии или патогенности для макроорганизма.

6. Установленные различные типы взаимоотношений криптококков в ассоциациях с бактериями, дрожжевыми и нитчатыми грибами имеют важное клиническое значение при экстраполяции результатов на микробиоту in vivo.

7. Чувствительность криптококков к флуконазолу и вориконазолу необходимо определять неоднократно в ходе лечения, учитывая возможность возникновения их новых фенотипов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на ежегодных научно-практических конференциях по медицинской микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004 и 2005), на 6-м Российском съезде врачей-инфекционистов (СПб, 2003), на расширенном заседании Российского Общества патологоанатомов с участием инфекционистов и микологов (СПб, 2003), на Втором Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2004), на 13 и 14-м Конгрессах Международного Общества медицинских и ветеринарных микологов (Италия, 1997 , Аргентина, 2000), на 6,7-м и 9-м Конгрессах Европейской Конфедерации по медицинской микологии

(Испания, 2000, Греция, 2001, Нидерланды, 2003), на 3, 4-й и 5-й Международных конференциях «Криптококк и криптококкоз» (Париж, 1996, Лондон, 1999, Аделаида, 2002, Бостон 2005).

Публикации по материалам исследования. По теме диссертации опубликовано 52 работы в научных журналах и сборниках, в том числе 20 из них в изданиях, рекомендованных ВАК.

Личный вклад автора. Автор планировал, выполнял и руководил исполнением основных экспериментальных исследований по проблеме. В выборе главного направления исследований, в постановке и решении конкретных задач, организации и выполнении экспериментальных исследований автору принадлежит ведущая роль.

Доля участия автора в сборе изолятов патогена и аутопсий - 50%; в разработке и исполнении программ разделов исследований - 90%; доля участия в обработке данных - 90%; в анализе и обобщении экспериментального материала -100%.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 9_

глав, выводов, списка цитируемой литературы ( 280 наименований) и приложений. Полный объем работы составляет 340 страниц, включая 94 рисунка и 55 таблиц.

Материалы и методы исследования.

Объектами исследования были штаммы криптококков, полученные из Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ) НИИ медицинской микологии - Cryptococcus neoformans РКПГ: 719, 852, 853, 881, 1063, 1067, 1085, 1088, 1089, 1090, 1091, 1093, 1095, 1096, 1105, 1106, 1113, 1164, 1165, 1166, 1175, 1176, 1178, 1180, 1181, 1216, 1236, 1237, 1238, 1239, 1240, С. gattii РКПГ 856 и С. albidus РКПГ1171 (Табл.1). Указанные штаммы криптококков, в основном, представлены клиническими изолятами, выделенными из патматериала сотрудниками лаборатории морфологии и биологии грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина за период с 1990 по 2004 год, за исключением штаммов РКПГ 852, 853, 856, 881, поступивших из других коллекций. Оценку морфологических характеристик и описание дрожжевых культур проводили после их выращивания на жидкой и плотной средах Сабуро при t +28 С(через 48 часов) и t° +37° С (через 72 часа).

Дифференциацию С. neoformans и С. gattii проводили на среде с канаванином и бромтимоловым синим (CGB-тест) по Квон-Чунг и Беннетгу (1992).

Гигантские колонии криптококков оценивали визуально спустя 30 дней после выращивания культуры микромицета на агаре Сабуро при t°+24°C, засеянной уколом в центр чашки Петри.

Микроморфологию клеток криптококков, выросших на жидкой и плотной средах Сабуро, изучали при микроскопии в «раздавленной капле» и в туши. Морфометрическое исследование клеток (диаметр клеток, толщина капсулы) каждого штамма криптококка проводили с помощью светового микроскопа Leica ДМ 4000, используя программное обеспечение Leica IM 1000, Adobe Photoshop 7, Excel и персональный компьютер на базе процессора Intel.

Таблица 1.

Виды и штаммы криптококков, использованные в различных экспериментах.

Название серии экспериментального исследования Штамм РКПГ Число штаммов

Изучение морфологии криптококков все исследуемые штаммы 33

Изучение патогенности на моделях экспериментально го криптококкоза а) при интрацистернальном введении 719, 881, 1067 3

б) при внутривенном введении все исследуемые штаммы 33

Изучение ультраструктуры кртттококка а) при культивировании в питательной среде (in vitro) 719, 1063, 1067, 1085, 1088, 1091,1093,1095, 1105,1113, 1165, 1166, 1175, 1176, 1178, 1180 16

б) в эксперименте на животных (in vivo) 852, 853, 881, 1067, 1085, 1088, 1089, 1090, 1093, 1095, 1096, 1105, 1106, 1113, 1164, 1165, 1176, 1178, 1180,1181 20

Изучение влияния t* на рост криптококков все исследуемые штаммы 33

Изучение ассимиляции источников углерода и азота все исследуемые штаммы 33

Изучение активности ферментов (фосфолипазы, уреазы, фенолоксидазы) все исследуемые штаммы 33

Изучение чувствительности криптококков к флуконазолу и вориконазолу все исследуемые штаммы 33

Изучение молекулярно-генетических характеристик криптококков 719, 1063, 1067, 1085, 1088, 1091, 1093,1095,1105,1113,1164,1165, 1166, 1175, 1176, 1178,1180 17

Изучение патоморфологии при экспериментально м криптококкозе у белых мьппей а) при в/в введении в дозе, равной 1Л)5о 1067, 1166 2

б) при в/в введении в дозе, равной 10® кл/мышь 719, 852, 853, 856, 881, 1063, 1067, 1085, 1088, 1089, 1090, 1091, 1093, 1095, 1096, 1105, 1106, 1113, 1164, 1165, 1166, 1171, 1175, 1176, 1178, 1180 26

Получение внеклеточных экзогликанов криптококков 719, С. humicolus ИБФМ 984 2

Изучение влияния криптококковых экзогликанов на выживаемость мышей 1067 1

Патоморфологическое и иммуногистохимическое исследование головного мозга мышей при экспериментальном криптококкозе на фоне введения криптококковых полисахаридов 1067, 1166 2

Ассоциативные взаимодействия С. neoformans in vitro с микроорганизмами а) с другими грибами (43 штамма дрожжевых и плесневых грибов различных родов и видов) 719, 852, 856, 1063, 1067, 1085, 1088, 1091, 1093, 1095, 1096, 1105, 1113, 1164, 1165, 1166, 1175, 1176, 1178, 1180, 1181 21

б) с бактериями 852, 856, 1095, 1096 4

17 штаммов С.neoformans РКПГ 1175, 1095, 1105, 1093, 1085, 1088, 1166, 1113, 1180, 1063, 1067, 1091, 1164, 1176, 1165, 1178, 719 (клинические изоляты) были исследованы в ведущей лаборатории мира по молекулярной микологии доктора У. Мейера (Австралия, Сидней, Центр инфекционных заболеваний и микробиологии) методами ПЦР-отпечатков с праймером М13 и RFLP гена URA5 с использованием рестриктаз Hhal и Sau96. В качестве стандартных штаммов в исследовании использовали 4 штамма С. neoformans var. neoformans и 4 штамма С. gattii. Штаммы Cryptococcus spp. РКПГ 1164, 1165,1166, 1171, 1175 были также типированы в лаборатории М. Вивиани (Италия, Милан, Институт гигиены и профилактической медицины) в рамках проспективного исследования криптококкоза в Европе, организованного Европейской конфедерацией медицинской микологии (ЕККМ, июль 1997 г. - декабрь 1999 г.).

Патогенность криптококков определяли на беспородных белых мышах при внутривенном введении. Культуры криптококков выращивали на плотной среде Сабуро при температуре 37°С в течение 48 часов, затем готовили взвеси в стерильном 0,9 % растворе NaCl и вводили внутривенно по 0,5 мл мышам в хвостовую вену. Животным контрольной группы вводили по 0,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Дозы патогена составляли 107, 106, 10s, 104, 103 клеток С. neoformans на мышь для каждого штамма, каждую дозу испытывали на 10 мышах в 2х-кратной повторности. Всего было заражено 3 300 мышей. Количество погибших и выживших животных регистрировали ежедневно. В качестве количественной характеристики вирулентности различных штаммов криптококков была принята величина LD50, которую определяли для каждого штамма на 28 сутки эксперимента методом «пробитов».

С помощью трансмиссионного и сканирующего электронного микроскопа JSM 35 изучали клетки 16 штаммов С. neoformans различной вирулентности, выращенных in vitro в течение 72 часов в термостате при 37°С на плотной среде Сабуро (pH = 5,7), а также исследовали особенности строения клеточных стенок и полисахаридной капсулы in vivo (в легких и мозге мышей). Кислые полисахариды выявляли модифицированным методом Тайса JI. и Баррнетга JI. (1965), а также Гайер Г. (1974).

При изучении способности у С. neoformans расти при повышенных температурах культуры грибов засевали штрихами на чашки Петри с агаром Сабуро и инкубировали в термостате при 35°, 37°, 39°, 40°, 42°, 45°С. Учет результатов проводили на 3® и 7s сутки выращивания при визуальной оценке наличия или отсутствия роста культур.

Ассимиляцию и ферментацию углеводов, потребление криптококками источников азота изучали общепринятыми методами, использовали также тест-систему «Auxacolor®2» (БиоРад, Франция).

Синтез крахмалоподобных веществ оценивали в трехсуточных культурах криптококков на среде Литтмана и Циммермана с pH = 4,5; фосфолипазную активность определяли чашечным методом на питательном агаре с яичным желтком с расчетом показателя фосфолипазной активности (Pz).

Уреазную активность определяли на среде Христенсена, фенолоксидазную активности - на среде с L-ДОФА.

Изучение чувствительности криптококков к флуконазолу и вориконазолу проводили диско-диффузионным методом СХ81 М44А. Диаметр зон измеряли с помощью микробиологического анализатора - приставки «ВТОМТС» по компьютерной программе.

Таблица 2

Интерпретация зон подавления роста для флуконазола_

Категория Диаметр зоны, мм МПК, мкг/мл

Чувствительный > 19 £8

Умеренно- чувствительный 15-18 16-32

Резистентный й 14 2 64

Для более полного представления о морфогенезе криптококковой инфекции сравнивали характер изменений при экспериментальном криптококкозе и в аутопсийном материале. Были использованы материалы вскрьггия 4 мужчин и 1 женщины, умерших от криптококковой инфекции на фоне иммунодефицита без ВИЧ-инфекции, предоставленные в наше распоряжение патологоанатомами из различных прозектур г. Санкт-Петербурга. Изучены также материалы аутопсии от 3 мужчин и 1 женщины с криптококкозом при ВИЧ-инфекции в стадии СПИД. Аутопсии и первичное патоморфологическое исследование проведено Д. В. Комаровой.

В лаборатории патоморфологии НИИ медицинской микологии СПб МАЛО гистологические срезы тканей органов во всех указанных выше случаях окрашивали гематоксилином и эозином, тионином по Нисслю и применяли PAS-реакцию с докраской альциановым синим в модификации Моури. При морфологическом исследовании экспериментального и аутопсийного материалов оценивали наличие и локализацию криптококков, характер патоморфологических изменений.

Для выявления антигена криптококков (капсульный полисахарид) применяли иммуногистоцитохимический метод с использованием полюслональных антител к антигену криптококков (NCL-CN) и авидин-биотиновую систему детекции («Novocastra», Великобритания).

Криптококковые полисахариды получали на среде Голубева, которая способствует продукции внеклеточных гетерогликанов дрожжей рода Cryptococcus (Голубев В.И., 1972).

Сравнительное исследование влияния криптококковых экзогликанов (ПС № 1 - продуцент С. neoformans 719, и ПС № 2 - продуцент С. humicolus) на выживаемость мышей проводили при внутрибрюшинном введении в дозе 200 мг/кг массы тела предварительно за сутки и одновременно с внутривенным заражением штаммом С. neoformans 1067 в сублетальной дозе (LD50 1 05 кл/мышь) в течение 28 суток.

В отдельной серии экспериментов мышам вводили внутрибрюшинно только криптококковый гетерополисахарид, продуцируемый патогенным криптококком РКПГ 719, в дозе 200 мг/кг массы тела (одновременно, за 1 сутки, за 5 суток, через сутки и через 5 суток после заражения мышей С. neoformans 1067 в сублетальной дозе (LD5o = 100 000 клеток/мышь). Ежедневно регистрировали количество погибших и выживших животных. Продолжительность эксперимента составила 36 суток. Опьггы ставили дважды.

Установление типа взаимодействия (симбиотического или антагонистического) С neoformans с другими микроорганизмами in vitro определяли методом штриховых подсевов (Блинов Н.П., 1995). Оценку результатов производили визуально.

Полученные в процессе исследования данные обрабатывали с помощью компьютерной программной системы STATISTIC A for Windows (версия 5.11 Лиц. №AXXR402C29502 3FA). При этом использовали преимущественно непараметрические методы и модуль для анализа выживаемости.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В развитых странах мира ВИЧ/СПИД все еще самый важный фактор риска развития криптококкоза, роль которого несколько снизилась в связи с использованием высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ).

Мы изучили 33 штамма криптококков, в том числе 29 клинических изолятов, выделенных от больных в России за период 1990-2004 годы сотрудниками лаборатории морфологии и биологии грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина. Наше исследование проведено также в рамках решений Европейской конфедерации медицинских микологов (ЕКММ), принятых в 1997 г. Семнадцать клинических изолятов были получены от 11 ВИЧ-инфицированных пациентов, а 12 изолятов - от 10 больных без ВИЧ-инфекции. Криптококкоз был обусловлен ВИЧ-инфекцией в 52% случаев.

У больных криптококкозом в России основными факторами риска за весь период исследования (21 случай криптококкоза), наряду с ВИЧ/СПИД были хронический лимфолейкоз, трансплантация почки, идиопатическая Т-лимфоцитопения, контакт с птицами, а у двух больных не были выявлены факторы риска.

В настоящее время во многих странах мира интенсивно изучают молекулярно-генетическое разнообразие Cryptococcus neoformans - возбудителей криптококкоза, организованы согласованные международные группы по изучению популяционной генетики этого патогена [Meyer W. et al, 2005]. Более чем 1000 изолятов криптококков со всего мира, полученных из клинических, ветеринарных и природных источников, были подразделены на 8 главных молекулярных типов - по 4 типа для каждого варианта - neoformans и gattii (VNI, VNII, VNIII, VNIV, VGI, VGII, VGIII, VGIV).

В нашем исследовании впервые получены данные о внутривидовой дифференциации 17 клинических изолятов С. neoformans, выделенных в России. Эти изоляты были генотипированы методом ПЦР-отпечатков; выявлены три молекулярных типа и соответствующие им серотипы VNI (серотип A), VNTII (серотип AD) и VNTV (серотип D) с частотой 64%, 17% и 17% соответственно. Известно, что VNI (серотип А) - преобладающий генотип во всем мире, хотя в отдельных частях Европы изоляты серотипа D составляют до 30-70% всех клинических изолятов. Большинство криптококков, выделенных от ВИЧ-инфицированных больных с криптококкозом, соответствуют молекулярным типам VNI и VNIV. По нашим данным, 75% С. neoformans, выделенных от больных СПИД, принадлежали молекулярному типу VNI и 25% - к VNTV.

Распределение по генотипам штаммов С. neoformans, выделенных от больных криптококкозом без ВИЧ-инфекции, несколько отличалось: VNI - 55%, VNIII -33% и VNTV - 12%. Малоизученный генотип VNTTT обнаружен только в группе больных без ВИЧ-инфекции. Среди изолятов криптококка в России штаммы с генотипом VNII, встречающиеся в Европе, нами не обнаружены.

При анализе серийных изолятов, выделенных нами от одних и тех же больных (1088 и 1091, 1095 и 1105), выявлены одинаковые генетические спектры, которые соответствовали молекулярному типу VNI. Эти данные согласуются с наблюдениями других ученых и подтверждают тот факт, что рецидивирующие криптококковые инфекции обусловлены персистенцией первоначальных штаммов, а не новым заражением [Meyer W. et al, 2005].

В результате типирования методом ПЦР-отпечатков выявлены 2 разновидности С. neoformans: вариант grubii (серотип А) и вариант neoformans (серотип D) и гибридный вариант - grubii / neoformans (серотип AD). Как и во всем мире, в наших исследованиях вариант grubii вызвал большее число инфекций (64 %).

У штаммов 1166, 1165, 1164 и 1175, также параллельно типированных в период Европейского исследования (1997-1999гг), генетические профили были аналогичными.

В группе сильновирулентных штаммов 88% отнесены к серотипу А (генотип VNI), и только один штамм имел генотип VNIII. Штаммы, которые отличались сниженной вирулентностью, были генетически разнообразны (серотипы А, D, AD). Диплоидные изоляты серотипа AD распределились с одинаковой частотой в группах сильно-, средне- и слабовирулентных штаммов. В настоящее время вопрос о взаимосвязи вирулентности с гаплоидностью или диплоидностью остается открытым, равно как и вопрос о том, дает ли формирование диплоида какие-либо селективные преимущества над гаплоидными изолятами. Это новая интересная область для исследования С. neoformans. Важно, что штаммы можно сохранить в диплоидном состоянии лишь при 37°С, так как при комнатной температуре происходит расщепление генетических маркеров [Wiekes B.L., 2002]. В связи с этим допустимо предположение о том, что новые данные о связи серотипов с вирулентностью, возможно, будут получены при изучении диплоидов, тем более что эти изоляты часто находят именно в клинических образцах, что указывает на их роль в инфекции.

Настоящее исследование - это первая попытка проспективного исследования криптококкоза в России, в том числе в изучение эпидемиологии данного заболевания. С помощью молекулярного анализа изолятов, собранных и изученных в ходе исследования, накоплена первая информация о различных субпопуляциях С. neoformans. Полученные результаты являтся базовыми для продолжения исследований по проблеме криптококкоза, чтобы лучше определить географическую распространенность этой инфекции в России и составить карту распределения генотипов С. neoformans для сравнения с имеющимися данными в Европе и мире.

VNI

VN III

VN IV

О сильно вирулентные » средне вирулентные й слабо вирулентные

Рис. 1. Распределение по генотипам штаммов С. neoformans с различной вирулентностью.

Несмотря на различия в происхождении, общие закономерности роста, развития и размножения криптококков оказались сходными и соответствующими типовому описанию рода Cryptococcus. Криптококки образуют на агаре Сабуро через 3-е суток при 37° С колонии, как правило, блестящие, слизистые, стекающие, светлокремового или кремового, бежевого или светло-бежевого цвета (Рис. 2а). Исключения составили штаммы РКПГ: 1165,1166, 1178, 1216, 1236, 1237, 1238, 1239, 1240, образующие матовые пастообразные колонии, которые становились едва слизистыми при повторных пересевах.

При микроскопии нативных препаратов клетки всех исследуемых штаммов, за исключением РКПГ 856, были округлыми, одиночными или монополярно почкующимися (Рис. 26). При выращивании тест-культур С. neoformans (32 штамма) на CGB-arape в течение 5 суток только штамм 856 окрашивал среду в синий цвет, что свидетельствовало о его принадлежности к варианту С. neoformans var. gattii. Следует отметить, что морфология клеток штамма 856 была также характерной для варианта gattii (клетки овально вытянутые). Остальные изоляты криптококков не изменяли цвет среды CGB и, следовательно, принадлежат к варианту neoformans.

Все штаммы проявляли разную интенсивность почкования при выращивании на агаре Сабуро через 3-е суток при 37°С. Доля почкующихся клеток в популяции варьировала от 10 до 36,5 % в зависимости от штамма. Средний диаметр клеток исследуемых штаммов С. neoformans варьировал в небольших пределах (от 5,10 до 7, 81мкм). При микроскопии окрашенных клеток (суспендированных в туши) у всех штаммов отмечали наличие капсул (Рис. 2в). Клетки в популяции штамма заметно варьируют по морфометрическим показателям, что графически отражено на диаграммах (Рис. 2 г, д).

Рис. 2. Макро- и микроморфологические характеристики Cryptococcus neoformans РКПГ шт. 852 (световая микроскопия).

■WfrMliMl jn/ftfrgjjm. щЯА

p8Pil|t»jii|i|ifi^^iiWi црб^г iiiiTjiiiiiiij

а>»цм■«»,

J tfi 4J SJ SS М IS И T5 U Ii M »S IM «.S

Выделенные интервалы размерности (мкм)

и м и и и и и и и м а и и Выделенные интервалы размерности (мкм)

а - макроколония при 28°С б - микроскопическая картина клеток на агаре Сабуро при 37°С (ув. х 400) в - капсулы у тест-культуры (ув. х 800) г, д - морфометрические данные по размерам клеток и капсул в мкм

Отметим появление гигантских клеток в популяции штамма 1090 С. neoformans. Их количество составляло 0,12% (Рис. 3)

Рис.3. СгурМсоссш пео/огтат РКПГ шт. 1090 (световая микроскопия в туши) (ув. х 800) (а - при 28°С, агар Сабуро; б - при 37°С, агар Сабуро)

1_д 1.050 10 12

«

I

*

1237

1239 1106 1236 1096

1240

1238

1175 1095 1105 1181

1090 1093 1089 1085 1088 1166 1113 1180

852 1063 1067

1091

1164

1176

1165 1178

853 1216

719 881 856 1171

Рис. 4. Вирулентность криптококков в зависимости от штаммовой принадлежности.

При определении патогенности криптококков при внутривенном введении возбудителя мышам было установлено, что 1Л}50 варьирует от 102 до 10п кл/мышь. Так как стандартные подходы к дифференциации криптококков по вирулентности отсутствуют, мы условно разделили их на 3 группы: сильно вируленгные (1ЛЭ50 = 10 -105 клеток/мышь), средневирулентные (1Л350 = 105-106 клеток/мышь) и слабо вирулентные (> 106 клеток/мышь). Исключение составил С. а1ЬШш, который был этиологическим агентом криптококкового остеомиелита, патогенность которого определить не удалось. Другие исследователи также

отмечают, что различные изоляты С. neoformans могут очень заметно варьировать по уровню вирулентности.

Следует отметить, что вариации по вирулентности отмечали как в группе клинических изолятов, выделенных от больных как с ВИЧ инфекцией, так и без нее. Статистически достоверных различий по вирулентности между группами штаммов, выделенных от ВИЧ-инфицированных больных (17 изолятов) и от пациентов без ВИЧ-инфекции (12 изолятов), обнаружено не было (р > 0,05). Однако существует тенденция в том, что сильновирулентные штаммы чаще встречаются в группе ВИЧ-инфицированных пациентов.

Таким образом, экспериментально было установлено, что штаммы криптококков значительно отличаются друг от друга по вирулентности. Однако мы не обнаружили взаимосвязи между выявленной гетерогенностью морфологических признаков изученных криптококков при использовании методов световой микроскопии (размер клетки, толщина капсулы и интенсивность почкования) и вирулентностью штаммов.

В нашем исследовании полисахаридная капсула криптококков in vitro различалась по толщине (от 1,47±0,28 мкм до 4,95±0,30 мкм) в зависимости от их штаммовой принадлежности и не коррелировала с вирулентностью.

В работах других исследователей попытки доказать, что вирулентность криптококка есть функция, зависящая от размера капсулы, также оказались безуспешными [Mitchell Т., Perfect J., 1995].

С учетом возможностей электронной микроскопии, мы считали целесообразным применить данный метод для характеристики особенностей штаммов, различающихся по вирулентности с акцентом на архитектонику капсулы криптококка - одного из возможных факторов патогенности.

Результаты исследования мы излагаем в диссертационной монографии, начиная с поверхностных структур клеток в следующей последовательности: капсульный материал, клеточные стенки, клеточные мембраны, цитоплазма (с мембранными структурами и включениями), ядро, ядрышко. Мы не затрагиваем те структуры, которые являются типичными для большинства эукариотических клеток, к которым относят и криптококки.

Способность С. neoformans формировать полисахаридную капсулу представляет собой генетически закрепленный признак. Под электронным микроскопом просвечивающего типа ее легко идентифицировать по значительной толщине, низкой электронной плотности и, часто, наличию хорошо развитых микрофибрилл в наружном слое капсулы (Рис. 5).

I

Рис. 5. Строение и химический состав капсулы С. neoformans.

Капсулы зрелых клеток штаммов С. neoformans, выращенных in vitro, условно можно подразделить по строению на 4 типа в зависимости от количества

слоев, их толщины и особенностей морфологии (Рис. 6). Тем не менее, и эти четыре формы не являются неизменными - возможны отклонения в структуре полисахаридных капсул и даже уменьшение числа слоев в них. В капсулах может формироваться более или менее густая сеть из полисахаридных макро- и микрофибрил, возрастать или уменьшаться их электронная плотность. Обращает на себя внимание полиморфизм и подвижность капсульного материала у криптококков при отсутствии какой-либо строгой зависимости вирулентности штаммов от формы и физической структуризации капсул.

Шт. 1067, 1113, 1165

Шт. 719,1063, 1095,1105, 1180,1091

Шт. 1088,1093, 1176

Шт. 1085,1166, 1175,1178

Рис. 6. Типы капсул зрелых клеток С. neoformans in vitro (I - клеточная стенка, II -капсула).

При выращивании клеток С. neoformans сильно (1166, 1175) и слабо вирулентных (719, 1067) штаммов на среде с L-ДОФА возрастала электронная плотность клеточных стенок за счет их импрегнации меланином, однако, нами не обнаружена прямая взаимосвязь между размерами клеток исследованных штаммов С. neoformans и толщиной их клеточной стенки.

По полученным в настоящей работе данным электронно-микроскопических исследований, можно предложить следующее схематическое изображение тонкого строения зрелой клетки трехдневных культур С. neoformans, выращенных на среде Сабуро (Рис. 7).

Условные обозначения: АЭР - агранулярный ЭПР; В -вакуоль; Г - гликоген; ГЭР -гранулярный ЭПР; К - капсула; КС -клеточная стенка; ЛВ - липидные включения; М - митохондрия; ПБ -полигональной формы белок в цистерне ЭПР; ПГ - полифосфатные гранулы; Пз - пузырьки; Пл -плазмалемма; Рб - рубец; ТГ -темное глобулярное включение в содержимом вакуоли; ФТ -фиброзиновое тельце; Я - ядро; Яд -ядрышко.

Рис. 7. Схема строения зрелой клетки С. neoformans.

С помощью электронно-микроскопических исследований нами выявлены штаммные различия по некоторым морфологическим и ультраструктурным признакам клеток штаммов С. neoformans', по типам строения капсулы, толщине клеточной стенки, степени конденсации ядерного материала. В зависимости от вирулентности штамма наиболее выраженными признаками были: число, форма, топография митохондрий, а также степень хроматизации ядра.

Однако для того, чтобы выяснить, как эти наблюдения морфологического разнообразия криптококков in vitro могут быть соотнесены с показателями in vivo и патогенностью, мы изучили морфологию тканевых форм возбудителя при исследовании в аутопсийном материале от больных криптококкозом и в тканях животных при экспериментальном криптококкозе.

По распространенности криптококкоза у умерших больных в терминальной стадии со СПИД имела место выраженная генерализация процесса с поражением многих органов, тогда как в группе больных с иммунодефицитом без ВИЧ-инфекции имело место поражение одного-двух органов. В обеих группах преимущественной локализацией криптококка были головной мозг и мозговые оболочки. На втором месте - легкие. Характерным для криптококкоза с ВИЧ-инфекцией было вовлечение лимфоидной ткани в патологический процесс.

Несмотря на то, что С. neoformans может поражать любой орган, инфекция ЦНС оказывается среди наиболее частых клинических проявлений криптококкоза. Показано, что при ВИЧ-инфекции С. neoformans обычно является причиной культурально подтвержденного менингоэнцефалита, который без лечения всегда заканчивается летально. Даже при наиболее эффективной противогрибковой терапии уровень смертности близок к 25%.

Однако, мало что-либо известно о последовательности событий, ведущих к диссеминированному менингоэнцефалиту - главной клинической форме криптококкоза и основной причине смерти больных.

В результате проведенных нами исследований аутопсийного материала установлено, что нарушение структурной целостности стенки микрососудов, ее деструкция под воздействием криптококков являются основным фактором, обусловливающим выход данного возбудителя из просвета микрососудов непосредственно в вещество головного мозга.

При ВИЧ-инфекции в стадии СПИД и без ВИЧ-инфекции, наряду с манифестирующим кригггококкозом, у умерших больных постоянно отмечали наличие другой сопутствующей микробиоты, роль которой из-за ее многообразия и различного сочетания установить не удалось. В одном случае, у умершей 45-летней женщины без ВИЧ-инфекции, при гистологическом исследовании в оболочках головного мозга было обнаружено сочетание криптококков с микобактериями туберкулеза.

На основании изучения патоморфологического материала больных СПИД и без ВИЧ-инфекции можно предположить этапность развития криптококкоза в тканях и органах, которая зависит как от срока течения инфекции, так и от характера нарушений иммунной системы. Следует отметить, что ответная тканевая реакция носила более выраженный характер при иммунодефиците без ВИЧ-инфекции и для нее были типичны очаговость процесса и наклонность к гранулематозу, тогда как при ВИЧ-инфекции воспалительный ответ практически отсутствовал или был незначительным.

Таким образом, при криптококкозе мы, так же как и другие исследователи, отличали два типа ответных тканевых реакций: минимальный или отсутствующий воспалительный ответ и грануломатозный.

Криптококки, обнаруженные при аутопсиях ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных больных, независимо от органа (головной мозг, оболочка головного мозга, легкое, лимфоузел, селезенка, печень, простата, почка, надпочечники, поджелудочная железа и другие), имели капсулированные, бескапсульные и деформированные (лимонообразные, в форме «колпачка», угловатые) формы. Процент деформированных клеток был выше во второй группе больных (без ВИЧ-инфекции), однако статистически достоверных различий между двумя группами мы не обнаружили, равно как и при сравнении размеров клеток, соотношению капсулированных и бескапсульных форм. Размеры клеток варьировали от 2 мкм до 9 мкм (70 % клеток имели диаметр 4-7 мкм). Размеры капсулы не зависели от локализации в различных органах, распространенности и степени выраженности микотического процесса. Скорее всего, это связано с вариабельностью иммунодефицитного состояния.

К сожалению, при анализе аутопсийного материала не представлялось возможным изучить динамику морфофункциональных изменений тканевых форм возбудителя в зависимости от его исходной вирулентности. Кроме того, процесс у больных криптококкозом (особенно при ВИЧ-инфекции) развивается как микст-инфекция, что затрудняет определение непосредственной роли С. neoformans в развитии патологических процессов.

Безусловно, решающая роль в развитии криптококкоза принадлежит степени иммунокомпетентности макроорганизма. В тоже время не учитывают агрессивных свойств различных штаммов этого гриба. Остается неясным, в каких

случаях в пораженных органах формируется выраженная грануломатозная реакция, а в каких процесс не сопровождается воспалением и происходит лизис тканей.

На эти вопросы мы попытались ответить в экспериментальном разделе нашего исследования, где в динамике прослеживали взаимодействие между микро- и макроорганизмом с учетом различной степени патогенности криптококков.

Основные эксперименты выполняли на мышах, заражаемых при внутривенном введении криптококка, вызывающего диссеминированный менингоэнцефалит. Для этого использовали 27 штаммов криптококков с различной вирулентностью (LD50) от 4х102 до 1x10й клеток гриба/мышь: 25 штаммов С. neoformans, 1 штамм С. gattii и 1 штамм С. albidus РКПГ 1171. Последний штамм был причиной криптококкового остеомиелита позвоночника у больной М., но оказался не патогенным для белых мышей при в/в заражении.

При сравнении патоморфологических изменений в головном мозге на Is сутки после заражения обнаруживали лишь единичные криптококки (как правило, морфологически целостные) в срезах головного мозга, за исключением штаммов 1113, 1180, 1164, 853, 719, 881, 856, 1171, которые не были обнаружены. На 7s сутки после в/в заражения мышей штаммами С. neoformans с вирулентностью LDjo 4x106 клеток/мышь и ниже клетки гриба в большом количестве обнаруживали во всех срезах головного мозга. При изучении слабо патогенных штаммов РКПГ 719 (LD50 - 107 кл/мышь), РКПГ 881 (LD50 - 108 кл/мьппь), РКПГ 856 (LD50 - Ю" кл/мышь) и С. albidus (грибы в срезах головного мозга при патоморфологическом исследовании не были выявлены.

Очаги лизиса, содержащие размножающийся гриб, возникали без определенной закономерности в различных отделах головного мозга.

Нами отмечено, что с повышением вирулентности гриба усиливаются процессы очагового лизиса в мозговой ткани (Рис. 8 а). Увеличивается «выброс» капсульного материала с образованием «звездчатых» форм и «пропитыванием» окружающих тканей капсулярным полисахаридом. Следует отметить слабую выраженность или же полное отсутствие воспалительной реакции в очагах поражения, а также значительные отечные изменения в белом веществе мозга. С другой стороны - с уменьшением вирулентности штаммы теряют способность активно вырабатывать капсулярный материал, «морфологическую» сохранность и частично дегенерируют уже к 7 суткам после заражения. Морфологически измененные (бескапсульные, лимоннообразные, угловатые) клетки и остатки (фрагменты) стенок грибов окружаются макрофагами и эпителиоидными клетками (грануломатозная форма криптококкоза).

а - штамм РКПГ 1105 (1Л>5о= 103 клеток/ мышь), очаги лизиса разных размеров, (ув. х 12,5) б - штамм РКПГ 1096 (1ЛЭ50= 10 клеток/ мышь), капсулированные криптококки в очагах лизиса (ув. х 80).

в - штамм РКПГ 719 (ЬВ50= 107 клеток/ мышь), в очагах лизиса криптококки бескапсульные или с узкой капсулой, деформированные, угловатые (ув. х 100).

Рис. 8. Экспериментальный криптококкоз головного мозга, сутки. Окраска по Моури альциановым синим, гематоксилином.

Нами показано, что при криптококкозе у человека после поражения головного мозга поражаются легкие. В связи с этим представляло интерес оценить, вовлекаются ли легкие в патологический процесс при использовании данной модели криптококкоза.

На Т сутки выявляли очаги лимфомакрофагальной пневмонии, содержащие элементы размножающегося криптококка. У одного и того же животного можно проследить в тканях легкого несколько стадий развития очагов поражения в зависимости от патогенности штамма.

При заражении высокопатогенным штаммом обнаруживали клетки криптококка, располагавшиеся периваскулярно в межальвеолярных перегородках. Затем капсулированные криптококки накапливались в просвете альвеол, будучи адгезированными к альвеолярному эпителию. В различных отделах легких встречались группы раздутых альвеол с резко истонченными межальвеолярными перегородками. Такие очаги заполнялись большим количеством почкующихся инкапсулированных клеток криптококка. Затем межальвеолярные перегородки лизировались - возникали пустоты, заполненные возбудителем, что напоминало очаги лизиса в головном мозге. Вокруг таких образований происходят с давления альвеол, окруженных лимфомакрофагальным инфильтратом, содержащим такие единичные клетки гриба. Почкующиеся элементы криптококка встречались внутри бронхиол и бронхов. Иногда были видны деформированные безкапсульные, а также мелкие клетки возбудителя. При заражении штаммом с меньшей патогенностью,

литические зоны хотя и встречаются, но реже, и они окружены более мощным слоем макрофагов.

Таким образом, штаммовые различия криптококков по вирулентности от высокой до низкой определяют патоморфологическую картину в легких и в мозге, которая характеризуется снижением очагов лизиса и нарастанием грануломатозной реакции.

По нашим данным, размер капсулы не влиял на способность криптококков при внутривенном введении в дозе 106 клеток/мышь проникать через гемотоэнцефалический барьер. Очевидно, что не степень толщины капсулы, а другие факторы определяют возможность инвазии тканей С neoformans и характер течения криптококковой инфекции. Более вирулентные штаммы (LD50 от 4x10 до Зх104кл/мышь) вызывали более тяжелые поражения головного мозга. Морфология тканевых форм гриба тоже изменялась по мере снижения вирулентности штаммов криптококков от морфологически сохранных капсулированных и бескапсульных до деформированных лимонообразных, угловатых, сплющенных (Рис. 8 б, в).

Несмотря на преобладающую дрожжевую форму у С. neoformans, есть многочисленные сообщения о псевдогифальных и нитчатых структурах, их наблюдали даже в тканях в ходе инфекции. Мы наблюдали появление таких структур в очагах лизиса в головном мозге на 7-е сутки после внутривенного заражения мышей, как правило, слабовирулентными штаммами 1165 и 1178. Весьма вероятно, что клетка микромицета трансформирует свой метаболизм в пользу образования более прочных, чем капсула, структур (например, хитина), которые обеспечивали бы ей выживаемость в данных условиях.

Наряду с этим, регистрировали в срезах головного мозга мышей, инфицированных сильновирулентными штаммами, наличие множественных очагов лизиса, заполненных «желеобразными» массами, представляющими собой скопления криптококков и полисахарида. Для штаммов с вирулентностью LD50 более 105 кл/мышь количество очагов лизиса было очевидно меньше или они были единичными (шт. 1178 и шт. 853 LD50 - 1х106 кл/мышь). Клетки штаммов 881 (LD50 - lxlO8 кл/мышь), 856 (LD50 - 1x10й кл/мышь) и 1171 (патогенность которого на нашей модели не удалось определить) не были обнаружены на 7s сутки и, соответственно, не удалось обнаружить очагов лизиса.

Гистологическая картина поражения мозга криптококками различной вирулентности на этой экспериментальной модели близко напоминает таковые, обнаруженные нами и другими исследователями при патологии у больных с ВИЧ-инфекцией и без ВИЧ-инфекции. Она также напоминает поражения, наблюдаемые другими авторами, которые развились у мышей, зараженных клиническими изолятами С. neoformanss [Cretien F. et al, 2002].

Общими элементами в этих исследованиях является минимальный или полностью отсутствующий воспалительный ответ внутри ЦНС, несмотря на наличие инвазивного роста криптококка внутри паренхимы мозга и образование пустот, очагов лизиса или цист, заполненных гелеобразными массами, представляющими собой скопления криптококков и полисахарида, и отечные изменения вокруг очагов лизиса.

Как следует из наших экспериментов, более патогенные штаммы гриба в большей мере вызывают литические процессы на фоне подавленной воспалительной реакции, менее патогенные штаммы вызывают грануломатозную реакцию. Таким образом, вирулентность криптококка и связанная с этим его нейротропность во многом определяются способностью гриба задерживаться в тонкой капиллярной сети головного мозга за счет «желеобразных» масс, а затем выделять вещество, лизирующее окружающие ткани.

Широко распространено мнение о том, что взаимодействие между полисахаридной капсулой С. neoformans и клетками хозяина играет решающую роль в патогенезе криптококкового менингита, но точная роль капсулы при этом явлении не вполне ясна. Нами доказано, что клетки всех штаммов гриба на 7е сутки эксперимента в легких и мозгу формировали более толстые капсулы, чем в условиях культуры, причем в легких они всегда были толще. У зрелых клеток С. neoformans, локализующихся в легких и мозге мышей через семь дней после заражения, выявлено четыре типа тонкого строения полисахаридной капсулы (Рис. 9).

Рис. 9. Типы капсул зрелых клеток С. neoformans in vivo (Т - клеточная стенка, TT -капсула).

Тип строения капсулы зрелых клеток гриба был идентичен для особей одного штамма вне зависимости от типа поражаемого органа (легкие или мозг). Главное, обнаруженное нами при изучении ультраструктуры полисахаридной капсулы С. neoformans, это то, что инвазия ткани легких и мозга мышей криптококками сопровождалась изменением в структуре их капсулы в сравнении с клетками, полученными in vitro. Эти изменения вариабельности толщины и строения уже имеющихся слоев в капсулах, появление новых или исчезновение

некоторых из ранее присутствовавших в условиях культуры, появление в третьем слое капсулы макро- и/или микрофибрилл, служат подтверждением своеобразия тканевых форм, пластичности их ультраструктурной организации и, наконец, принципиальных отличий капсул тканевых клеток С. neoformans от капсул клеток в культуре in vitro.

Возможно, что эти динамические изменения в структуре капсулы in vivo, в сравнении с in vitro, связаны со способностью С. neoformans претерпевать активную и быструю антигенную изменчивость.

Изменения в антигенной структуре капсулы, регистрируемые с помощью моноклональных антител, связывающих различные эпитопы полисахаридной капсулы, наблюдали в мозге больных СПИД с острым и хроническим менингоэнцефалитом, а также при экспериментальном криптококкозе [Charlier С. et al, 2005].

Способность С. neoformans модифицировать свой внешний покров в ходе инвазии органов может быть важной характерной особенностью вирулентности штамма патогена, ускользающего от иммунной системы хозяина и приспосабливающегося к «враждебной» окружающей среде внутри хозяина.

По нашим данным, клетки гриба в условиях in vitro имели однообразное строение клеточных стенок вне зависимости от нггаммовой принадлежности по сравнению с клеточными стенками в условиях in vivo (семь суток от начала опыта, легкие и мозг), когда отмечали их разную морфологическую ультраструктуру. О прогрессивном возрастании толщины клеточной стенки с течением легочной инфекции во времени (от 2 часов до 28 дней) сообщили и другие исследователи [Feldmesser М. et al, 2001].

Такие изменения в клеточной стенке, обнаруженные в ходе экспериментальной инфекции, связывают, с одной стороны, с увеличением размеров клетки, а с другой - с синтезом меланина в ходе инфекции. К тому же клеточные стенки меланизированных клеток были толще, чем немеланизированных через 2 часа после инфекции. По нашим наблюдениям, возрастающие концентрации меланина в среде могут ингибировать и, даже, убивать их продуцент.

На основании вышесказанного можно заключить, что тканевая форма гриба in vivo принципиально отличается от таковой in vitro (по типам тонкого строения полисахаридной капсулы и размеру клеточной стенки). Очевидно, возникновение новых фенотипических вариантов криптококков в макроорганизме непосредственно связано с патогенезом криптококкоза, и, следовательно, необходимо изучать не только ответные защитные реакции макроорганизма, но и обязательно учитывать морфофункциональные характеристики тканевых форм криптококков, которые могут являться одним из маркеров, определяющих сопротивляемость макроорганизма.

Визуализация больших количеств ПС и бескапсульных клеток в срезах, тканей мозга и легких, особенно у сильно вирулентных штаммов, стала побуди-тельным мотивом к постановке вопроса о роли капсулы как фактора агрессии.

Показано, что отсутствие капсулы и модификация структуры капсулы изменяют вирулентность штамма [Casadevall A. et al, 1999; Chang Y.C. et al, 1998; Charlier С. et

al, 2005]. Учитывая, что основной компонент капсулы С. neoformans, которую считают важным фактором патогенности, глюкуроно-силоманнан также является компонентом капсул непатогенных дрожжей, мы оценили в сравнительном аспекте влияние двух гетерогликанов, сходных по химической структуре, на патологические изменения в мозговой ткани.

Показано, что строение глюкуроноксиломаннана из непатогенного С. humicolus полностью совпадает со строением глюкуроноксиломаннана из патогенного С. neoformans серотипа D [Самаркина Г.М., 1988]. Для выяснения роли полисахаридов как факторов агрессии проведена серия экспериментов на животных. В связи с этим представляло интерес оценить влияние гетерополисахаридов ПС1 из патогенного (С. neoformans) и ПС2 из непатогенного (С. humicolus) криптококков на выживаемость мышей при экспериментальном криптококкозе.

Сравнительное изучение выживаемости мышей проводили на фоне внутрибрюшинного введения полисахаридов ПС1 и ПС2 предварительно (за сутки) и одновременно с внутривенным введением С. neoformans 1067 (серотип D) в сублетальной дозе 105 клеток/мышь. Результаты оценивали по комплексу критериев (Вилкоксона, обобщенного Геханом, F-критерию Кокса, логарифмическому ранговому критерию Вилкоксона, обобщенного Пето) [Сергиенко В., Бондарева И., 2000; Боровиков В., 2001]. Как видно из рис. 10, разделение кривых выживаемости, характеризующих группы животных, получавших ПС1 и ПС2, не происходило как в случаях одновременного введения гетерогликанов (р > 0,05), так и в случаях предварительного (р > 0,05).

Дни исследовании

-♦-ПС 1 * С67тоедо. -в-ГС 2 - I0E7 граде, а шт 1087 -в-ГС1-1К7сдмоер -*-ПС2*'С67одн<др_-»-КЬнтрми (фиэ. р-э, ПС1, ГС2)

■V л /•

Рис. 10. Влияние криптококковых полисахаридов на выживаемость мышей при криптококкозе (кривые выживаемости по Каплану-Майеру).

На основании патоморфологического анализа срезов мозга мышей, получавших только криптококковые полисахариды, выделенные из патогенного (С. neoformans) и сапротрофного (С. humicolus) криптококков (ПС1 и ПС2) установлено, что характер патологических изменений в головном мозге мышей при введении ПС1 и ПС2 был однотипным.

Очевидно, что введение капсульного полисахарида криптококков хотя и не сопровождается развитием выраженных деструктивных изменений в головном мозге, но при этом возрастает проницаемость сосудов и развивается отек мозга (мы обращаем внимание и на антигенную гомологию экзогликанов патогена и сапроба).

Среди многочисленных проявлений биологической активности микробных полисахаридов выделяют их выраженное модулирующее влияние на устойчивость организма к инфекциям, вызванным патогенными грибами, бактериями, вирусами и простейшими. При этом важными факторами, определяющими эффективность действия микробных полисахаридов, являются диапазон доз и временной интервал введения полисахарида, а также особенности химического строения микробных полисахаридов.

Исходя из задачи данного исследования - выяснить роль криптококкового полисахарида как фактора агрессии, - мы дополнили предыдущую серию исследований по оценке влияния криптококковых полисахаридов данными о сравнительном изучении выживаемости групп мышей, которые за 5 суток до заражения и через 1 сутки и 5 суток после заражения С. neoformans (серотип D) получали гетерополисахарид из С. neoformans (серотип D).

Снижение выживаемости при введении криптококкового гетерополисаха-рида через 5 суток после заражения С. neoformans 1067 (серотип D) мы иллюстрируем с помощью кривой (по Каплану-Майеру), на которой показано раннее разделение кривых, характеризующих эти две группы (Рис. 11). Снижение выживаемости на фоне введения гетерогликана сохраняется в течение 36 дней (р < 0,05). В популяции из 20 животных через 5 суток после инфекции (группа 1067+ПС) не осталось в живых ни одной особи, в сравнении с группой 1067, где выжили 6 мышей (30%). В других группах животных, которые получали полисахарид, за 5 суток до инфекции и через 1 сутки после инфекции, статистически достоверных различий в выживаемости не отмечено (р > 0,05).

О 5 10 15 20 25 30 35 40 Дни исследования

-♦-ЛС+ 1067заЗсут -•-шт 1067

«•» ПС + 1067 через 1 сут -•-гс +1067 через 5 сут

нк- Контроли (физ. р-р, ПС)

Рис. 11. Влияние криптококкового гетерополисахарида на выживаемость мышей при криптококкозе (кривые выживаемости по Каплану-Майеру).

Сопоставляя данные предыдущих исследований о снижении выживаемости мышей при внутрибрюшинном введении криптококкового полиуронида предварительно за сутки и одновременно с заражением и полученные результаты, можно сделать вывод о том, что гетерополисахарид, продуцируемый криптококками в ходе инфекции, может опосредованно вносить негативный вклад в развитие криптококкоза, отягощая его.

Следует заметить, что во всех четырех группах при экспериментальном криптококкозе, когда животные получали полисахарид (независимо -предварительно или одновременно), выживаемость была ниже в сравнении с группой животных, не получавших полисахариды (р < 0,05), что характеризует неоднозначную реакцию организма на необычную для него полисахаридную структуру - ксенобиотик.

Таким образом, отсутствие статистически достоверных различий в выживаемости мышей при введении кршпококковых полисахаридов из гомогенных серовариантов (D) патогенного и непатогенного криптококков подтверждает сходство их действия на организм и служит доказательством отсутствия непосредственной взаимосвязи «агрессивности» полисахаридов криптококка и патогенности микроорганизма.

Поэтому рассуждения некоторых авторов о том, что патогенность С. neoformans связана с наличием капсульного полисахарида, не вполне корректны. Сравнимые патологические изменения в головном мозге мышей при внутрибрюшинном введении полисахаридов из патогенного С. neoformans 719 и непатогенного С. humicolus ИБФМ - 984, полученных нами в условиях глубинного культивирования на среде Голубева, и наблюдающиеся при этом сходные иммуногистохимические находки при оценке экспрессии обоих глюкуроноксиломаннанов в тканях мозга обосновывают нашу точку зрения о том, что капсульный полисахарид не занимает ведущего положения в определении инвазивности (агрессивности) патогена.

Известно, что сапротрофные криптококки способны сохраняться в организме животных до 3 месяцев, причем инвазии в мозговую ткань при этом не происходит. В наших исследованиях, сапротроф С. albidus, вызвавший криптококковый остеомиелит, не был обнаружен культурально ни в легких, ни в мозге, ни в почках при внутривенном введении мышам в дозе 106 клеток/мышь. Сапротрофные криптококки могут бьггь потенциальными продуцентами глюкуроноксиломаннанов in vivo, однако только их наличие в крови не обеспечивает условия для возникновения криптококкоза. Очевидно, что немаловажную роль для возникновения инфекционного процесса приобретает не только наличие патогенного криптококка, но и степень вирулентности возбудителя.

В наших исследованиях экспрессия полисахарида в мозговой ткани была выше при введении высоковирулентного штамма 1166 (LD50 1x10* кл/мышь) в сравнении с менее вирулентным 1067 (LD50 1х105 кл/мышь) на 7, 14, 21, 28 сутки после в/в заражения, несмотря на то, что в момент заражения размер капсулы штамма 1067 в 1,5 раза превышал размер капсулы штамма 1166.

Обращали на себя внимание такие факты, как не тождественность размера капсулы и способности продуцировать основную структурную часть капсулы криптококка - высокомолекулярный полисахарид (глюкуроноксиломаннан), несмотря на то, что некоторые исследователи высказывали предположения о наличии такой взаимосвязи.

Таким образом, капсулообразование - необходимый признак патогенного криптококка вне зависимости от степени его вирулентности.

Известно, что способность микроорганизмов развиваться при 37°С является одним из признаков их патогенности. Согласно нашим данным, все исследуемые штаммы криптококков, кроме С. albidus РКПГ 1171, хорошо росли на агаре Сабуро при t° 37°С. С возрастанием t° до 39°С способность к росту была умеренной у большинства штаммов, за исключением пяти штаммов (РКПГ 1085, 1164, 881, 852 и 1216), у которых эта способность была слабой.

При повышении t° до 42 С все штаммы слабо росли при такой температуре, а 4 штамма (РКПГ 1166, 856, 1237 и 1216) совсем утратили эту способность к росту. При t° 43°С 15 штаммов (45%) обладали слабой способностью к росту через 3 суток, 2 штамма - сниженной, 12 штаммов утратили способность к росту. Примечательно, что и при t° 45°С 10 штаммов росли, хотя и скудно. Температурный максимум для С. albidus РКПГ 1171, который был причиной заболевания криптококковым остеомиелитом у больной М., составлял 35 С, и для штаммов РКПГ 1166 и 856 (var. gattii) - 39°С.

Клинические изоляты криптококков обладали терморезистентностью в диапазоне 37-42°С, а некоторые и при 43-45°С. Эти выявленные свойства криптококков являются важными в эпидемиологическом аспекте, так как природным резервуаром С. neoformans служит голубиный помет. Учитывая, что температура в кишке голубя 44-45°С, можно предположить, что эти клинические изоляты итог вторичного отбора, в результате которого штаммы менее конкурентно способные выживать при высоких температурах были устранены.

Еще более 25 лет назад было показано, что способность хорошо расти при 37°С генетически контролируется и специфически связана с вирулентностью у С. neoformans. Сейчас обнаружено около 40 генов у С. neoformans, которые прямо связаны с ростом при высокой температуре. Более того, было показано, что гены, которые должны быть интактными для роста при высоких температурах (39-40°С), не обязательны и для эффективного роста при 37°С [Perfect J., 2005]. По-видимому, этим можно объяснить отсутствие штаммных различий по способности расти при 37°С и возможность их наличия в среде при 39°, 42°, 43° и 45°С, причем без взаимосвязи с вирулентностью. Однако есть микроорганизмы, растущие при температурах выше 37°С и не вызывающие заболевания. Видимо, в этом случае убедительны предположения о том, что у С. neoformans фенотип роста при высокой температуре интегрально сцеплен с другими факторами, которые делают его патогеном.

Поскольку многие исследователи признают тот факт, что ферменты фосфолипаза, фенолоксидаза и уреаза обеспечивают патогенность С. neoformans, мы изучили активность этих ферментов у исследуемых штаммов различной вирулентности.

t

Уреаза признана важным фактором вирулентности С. neoformans. Этот фермент играет решающую роль при диссеминации криптококковой инфекции из легких в мозг, способствуя изоляции криптококка в микрокапиллярах мозга [Сох G. et al, 2000; Olzewski М. et al, 2004).

Все штаммы, независимо от их вирулентности, проявили высокую уреазную активность при 28°С к 4-м суткам наблюдения, за исключением штамма 1178, который продуцировал уреазу менее активно. Однако на 1-е сутки не обладали активностью 5 штаммов (из них четыре - 719, 853, 856 и 1171 - были слабо вирулентными, и один - 1090 - сильно вирулентным), причем три из них - слабо вирулентные 856, 881 и 1171 - не обладали способностью инвазировать головной мозг мышей, что коррелирует с данными Ольшевского и др. (2004 г) о неспособности уреазоотрицательных мутантов проникать в головной мозг. Однако, взаимосвязи между вирулентностью штаммов (LD50 при внутривенном введении) и продукцией уреазы in vitro при 28°С не обнаружено.

При выращивании на агаре Христенсена при 37°С штаммы криптококков продуцировали уреазу быстрее, чем при 28°С. Уреазоотрицательными через 1 сутки выращивания были только три штамма (9%): 852, 881 и 1171, причем последний штамм, относящийся к виду С. albidus, тестировали при максимальной температуре роста 35°С. Высокую активность уреазы на сроке 1 сутки проявили 7 штаммов (21,2%), причем все из группы сильновирулентных. Мы получили статистически достоверные различия (Р < 0,05) при сравнении группы сильновирулентных штаммов с менее вирулентными.

На сроке 3 суток все исследуемые изоляты криптококков, независимо от их вирулентности, активно продуцировали уреазу, за исключением С. albidus 1171, который оставался уреазоотрицательным и проявил активность этого фермента только через 4 суток выращивания при 35°С.

К основным факторам вирулентности С. neoformans, наряду с капсулообразованием, относят фенолоксидазу (лакказу) микромицета. К настоящему времени показано, что лакказа - фермент, катализирующий продукцию меланина, имеет решающее значение для выживания С. neoformans в мозге [ZhuX. et al, 2001].

Штаммы С. neoformans, как правило, образуют пигмент на средах с фенольными соединениями и этот признак используют при видовой идентификации криптококков. Все изученные нами изоляты С. neoformans продуцировали меланин на среде с L-ДОФА при 28°С, причем 30 штаммов были меланинообразующими уже через двое суток, а наименее вирулентные штаммы № 856 (LD50 1х10" кл/мышь) и № 881 (LD50 1x1011 кл/мышь) - только через 7 суток. Мы не обнаружили меланин в этих условиях у С. albidus, не относящегося к признанным патогенам, хотя в литературе есть сведения о наличии слабой лакказной активности у С. albidus, С. laurentii и С. curvatus, являющихся крайне редкими возбудителями криптококкоза у человека [Averbuch D. et al, 2001; Ikeda

при а С только 9 штаммов из 28 обладали способностью образовывать меланин через 1 сутки. На вторые сутки количество меланинообразующих штаммов возросло до 17, а к третьим суткам - до 19. Причем, максимальную

интенсивность образования меланина регистрировали только для сильно вирулентного штамма 1238 (LD50 5,6x10 кл/мышь), все остальные меланинообразующие штаммы на 2е и 3е сутки обладали средней или слабой активностью.

Взаимосвязь продукции меланина с вирулентностью наиболее четко проявилась на вторые сутки при 37°С в условиях, когда мы объединили группу средневирулентных штаммов со слабовирулентными; достоверных различий мы не установили, хотя тенденция была выражена достаточно четко (р = 0,07).

Лакказа обладает разнообразной сетью индуцирующих и репрессирующих сигналов из окружающей среды, они моделируют экспрессию данного фермента, включая репрессию глюкозой и азотом, а также повышенной температурой, и индукцию металлами - медь и кальций [Williamson Р., 2005]. Возможно, что репрессией лакказной активности С. neoformans при повышении t° можно объяснить снижение или полное отсутствие активности фенолоксидазы при повышении t° до 37°С у некоторых штаммов.

Фосфолипазу у С. neoformans также признают одной из главных детерминант патогенности этого гриба. Показано, что она способствует инвазии легочной ткани криптококком и необходима для диссеминации возбудителя из легкого в кровь и лимфу (Sorell F., 2005). Сравнивая активность фосфолипазы при 37°С у 33 штаммов криптококков с различной вирулентностью, мы обнаружили значительные межштаммовые различия по ее активности. Все клинические изоляты криптококков образовывали зоны преципитации на среде с желтковым агаром через трое суток выращивания при 37°С. Ширина зоны преципитации и, соответственно, Pz варьировали от 0,54 (максимальная продукция фосфолипазы) до 0,91 (слабая продукция фосфолипазы). Примечательно, что штаммы с LD50 > 108 кл/мышь не образовывали зоны преципитации на желтковом агаре.

При изучении фосфолипазной активности серийных изолятов с одинаковым генотипом, полученных от одного и того же пациента в процессе лечения, отмечено, что десятикратное снижение вирулентности штамма 1091 из ликвора сопровождалось уменьшением фосфолипазной активности (Pz возрастал от 0,75 до 0,84).

Методом построения классификационных древ установлена ведущая роль фосфолипазы в дифференциации криптококков по вирулентности и пороговое значение Pz (0,75). Если Pz < 0,75, то криптококк следует относить к сильновирулентному даже при слабой активности уреазы или фенолоксидазы. Если Pz > 0,75 - то штамм криптококка можно считать сильно вирулентным, если совокупная активность уреазы вместе с меланином составляют «+++» и более. Эти различия статистически значимы (Р < 0,01) (Рис. 12).

7

If'

1,1

1,0

0,9

□

N 0,8 Q.

0,7

О

□

0,6

0,5

1

2

3

T iStd. Oev. I—I ±Std. Err. □ Mean

Уровень вирулентности штаммов (1 - сильно вирулентные, 2 - умеренно вирулентные, 3 - слабо вирулентные)

Рис.12. Характеристика фосфолипазной активности криптококков с различной вирулентностью.

На основании вышеизложенного можно заключить, что патогенность штамма криптококка зависит от сочетания следующих факторов: способности к росту при температуре 37°С, капсулообразованию, меланинообразованию, фосфолипазной и уреазной активности; выраженность последних трех свойств кореллирует с их различиям и по вирулентности.

При анализе аутопсий у ВИЧ-инфицированных больных в стадии СПИД и у пациентов без ВИЧ-инфекции, наряду с криптококками, постоянно отмечали наличие сопутствующей бактериальной, вирусной и грибковой микробиоты. Так как при анализе аутопсий у ВИЧ-инфицированных больных в стадии СПИД и пациентов без ВИЧ-инфекции, наряду с криптококками, постоянно отмечали наличие сопутствующей бактериальной, вирусной и грибковой микробиоты, мы изучили ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими грибами и бактериями in vitro. Нами было установлено, что в ассоциациях с бактериями и микромицетами криптококки проявляют различные взаимоотношения: нейтральные, стимулирующие, ингибирующие и антагонистические (Табл. 3, Рис.

В научной литературе почти отсутствуют какие-либо суждения по этой важной проблеме, особенно при микст-инфекциях, в которых криптококк оказывается явным патогенном с неустановленными поведенческими характеристиками [Ikeda R., 2005]. В наших экспериментах по ассоциативным взаимодействиям С. neoformans с названными выше микроорганизмами конечный результат таких взаимодействий определялся видовыми и штаммными различиями. Это четко видно и в ассоциациях с некоторыми представителями микобиоты, например, Candida albicdns, С. krusei, С. parapsilosis, С. zeylanoides,

13).

некоторыми аспергшшами, способными ингибировать криптококки в ассоциациях. В подобных случаях могут сложиться ситуации, затрудняющие диагностику и лечение пациентов, страдающих от микст-инфекций.

Таблица 3.

Ассоциативные взаимодействия криптококков с другими микромицетами.

........... '«" . - -— Лссоциганты «в* лц^вдмкгер - хукцщщйиейцуиии. Л-.... •Ж^ЭМоЛ01И (ОГ -.„;•,;,- ,:•:•,..;,

1. Др^жжтге

ОопроФы Условные патогены

С. Ьлтсока 1147,674,675 С. /тМОгчшт 1095,1090, 862, в56 инжОириванив (Нри1~ 28° и 30®С)

19 видов и вариантов СгурХкоссм С. жаЬгтам 1005,1086, 852,856 нейтралкам (При 1=28° И 30°С)

Ус поены« патогены Условные патогены

СагхЗИа аЫсапс 1058, 1186 С. пеоЮгтапз 719,1063, 1087,1086,1088,1091, 1093.1095.1113,1184. 1166,1176.1181 ингибирование

С. пвоКягпапб 1088,1105, 1165,1175,1178,1180 нейтрализм

$ й н1|) 1 1 ш И? '(¡1 8

"-"Л« ш гршвшяз®"* 1

(ртицу-ляиия

Рис. 13. Ассоциативные взаимодействия криптококков и грам-отрицательных

бактерий. __[

Первичная резистентность С. Ифф^пдодо(8 (иипажЫ препаратам для лечения

флук«ши»Я^ТИ^акон®олу) встречается редко СПтКШГ {

криптококкоза (амфотерицину В,

[Birley H. et al, 1995; Brandt M. et al, 2001]. Однако, есть сведения о появлении резистентности к амфотерицину В, флуконазолу, флуцитозину и итраконазолу у С. neoformans в процессе лечения [Davey К. et al, 1998; Kantarcioglu А., Yncel А., 2002]. По нашим данным частота резистентности к флуконазолу среди клинических изолятов составила 10,3 %, умеренно-чувствительные штаммы обнаружены с такой же частотой и 79,4 % штаммов были чувствительны к флуконазолу. Причем, среди резистентных штаммов - два (1236, 1237) были выделены из крови и ЦСЖ одного и того же больного.

Из 29 клинических изолятов резистентными к флуконазолу оказались три сильно вирулентных штамма: 1237 (LD50 1,4х102 кл/мышь), 1239 (LD50 2х102 кл/мышь), 1236 (LD5o 4,5х102 кл/мышь); умеренно резистентными также были три штамма из группы сильно вирулентных 1096 (LD50 5х102 кл/мышь), 1238 (LD50 5,6х102 кл/мышь), 1090 (LD50 2х103 кл/мышь). Следует отметить, что 2 изолята 1096 и 1090 выделены от ВИЧ-инфицированных больных, а остальные 4 изолята (1237, 1239, 1236 и 1238) от не ВИЧ-инфицированных пациентов (2 изолята при пересадке почки, 2 изолята - при хроническом лимфолейкозе).

Нами получены статистически значимые различия (р<0,05) при сравнении чувствительности к флуконазолу и вориконазолу между группами сильновирулентных и слабовирулентных штаммов по комплексу непараметрических критериев (Манна-Уитни, медианный и х-квадрат, Крускала-Уоллеса, модуль ANOVA).

4 «

~Т" 1SM 0« □ iSld En-

Группы

Рис. 14. Чувствительность штаммов криптококков разной вирулентности к флуконазолу.

Мы провели сопоставление чувствительности клинических изолятов к антимикотикам и их способности к меланинообразованию при 37°С. Выявлена взаимосвязь между уровнем продукции меланина и чувствительности изолятов к флуконазолу (р < 0,05).

Заметим, что два штамма с умеренной чувствительностью к флуконазолу от ВИЧ-инфицированных пациентов входили в группы серийных изолятов (1088,

1089, 1090, 1091 и 1095, 1096,1105, 1106), которые были выделены от одних и тех же пациентов в разные периоды времени до и после их лечения флуконазолом.

Так, изолят 1090, выделенный из крови больного через 6 месяцев после лечения флуконазолом, отличался от первично выделенного из крови изолята 1089 несколько повышенной вирулентностью (LD50 2х103 кл/мышь против З,5х103 кл/мышь), сниженной чувствительностью к флуконазолу (МПК 16 мкг/мл против 6 мкг/мл) и слегка повышенной способностью к капсулообразованию in vitro. При этом, в случае штамма 1090, регистрировали диссоциацию популяции клеток на два основных фенотипа: мелкие клетки (размер клетки 6,93 ± 0,11, толщина капсулы 2,21 ± 0,13) и крупные (гигантские) клетки (размер клетки 20,51± 3,1, толщина капсулы 12,3 ± 1,4).

Несмотря на то, что подобные сообщения немногочисленны, гигантские формы криптококков, несомненно, имеют отношение к патогенезу криптококкоза. Генерация новых вариантов клеток патогена может вносить вклад в персистенцию инфекции. Механизм, отвечающий за такое разнообразие клеток, остается пока непонятным.

Таким образом, ориентируясь на вышеизложенное, есть основания предполагать, что необходимо проводить мониторирование как чувствительности изолята криптококка in vitro к флуконазолу и вориконазолу, так и морфологии возбудителя, поскольку появление вариантов в результате фенотипического переключения может осложнять хронический криптококкоз и его лечение у людей.

ВЫВОДЫ

1. Возбудители, выделенные от пациентов в России, относятся к молекулярным типам VNI, VNIII и VNTV, серотипам А, Д, АД и вариантам С. neoformans var. grubii, wax.neoformas и var. grubii / var. neoformans.

2. Штаммы различаются внутри вида С. neoformans и между видами С. gattii и С. albidus по способности к капсулообразованию, меланинообразованию, росту при температуре выше 37°С, фосфолипазной и уреазной активностям, ультраструктуре, интенсивности почкования, чувствительности к антимикотикам - флуконазолу и вориконазолу, тканевым формам.

3. Возбудители криптококкоза различаются по вирулентности (LD50 от 102 до 10" клеток/мышь). Патогенность штаммов криптококков зависит от комбинации следующих факторов: способности к росту при температуре

капсулообразованию, меланинообразованию, фосфолипазной и уреазной активностям; выраженность последних трех свойств соответствует различиям их по вирулентности.

4. На основании электронно-микроскопических исследований клеток установлено, что штаммы С. neoformans отличаются по строению и толщине капсулы и клеточной стенки, степени конденсации ядерного материала; в зависимости от вирулентности штамма наиболее выраженными признаками были только число, форма и топография митохондрий. Толщина капсулы и клеточной стенки не связана с вирулентностью штамма.

5. Капсулообразование - видовой признак криптококков, необходимый фактор для проявления патогенности

5.1.При этом отсутствует зависимость архитектоники капсул (толщина, уровень сложности, качество и количество микрофибрилл в ней) от вирулентности штаммов. 5.2.Обнаруженные динамические изменения в ультраструктуре капсул in vivo непосредственно связаны с трансформацией капсульного

полисахарида, определяющего антигенную специфичность криптококка.

6. Капсульный полисахарид не занимает ведущего положения в определении патогенности (агрессивности) криптококка; экзогликаны капсул из патогенного С. neoformans (серотип D) и непатогенного С. humicolus (серотип D), обладающие сходной химической структурой, вызывают однотипные изменения в головном мозге при экспериментальном криптококкозе.

7. Возможность инвазии тканей С. neoformans и характер течения криптококковой инфекции определяются не только степенью иммунодефицита, но и вирулентностью штамма.

8. Морфология тканевых форм гриба изменяется по мере снижения вирулентности, более вирулентные штаммы криптококка вызывают более тяжелые поражения головного мозга и легких, при этом формируется большее число очагов лизиса («цист») на фоне подавления воспалительной реакции; менее вирулентные штаммы индуцируют гранулематозную реакцию при меньшем числе очагов лизиса.

9. Установлено, что в ассоциациях с бактериями и микромицетами проявляются различные взаимоотношения криптококков:

9.1. Штаммы криптококков 1095, 1096, 852 и 856 стимулировали рост всех взятых в опыты грамотрицательных бактерий и избирательно -грамположительных бактерий; грамположительные и грамотрицательные бактерии не стимулировали роста криптококков, но часть из них выступала ингибиторами роста микромицетов, а Proteus vulgaris проявил себя выраженным антагонистом С. neoformans.

9.2. Дрожжевые организмы - Candida albicans, С. krusei и С. zeylanoides заметно тормозили рост криптококков (С. rugosa проявляла нейтрализм); ингибирующее действие нивелировалось при снижении температуры с 37°С до 26°С. Сапротрофные штаммы С. humicolus ингибировали тест-культуры С. neoformans при 37°С.

9.3. Нитчатые микромицеты Aspergillus niger 1117 и А. flavus 954 ингибирующе действовали в отношении штаммов криптококков РКПГ 852, 856, а сапробы Penicillium nigricans 184, Р. expansum 185 и Р. patulum 190 - подавляли штаммы С. neoformans РКПГ 1095 и 1096. Применительно к другим изученным видам нитчатых микромицетов (сапробов) в ассоциациях отмечен нейтрализм.

10. 10 % возбудителей криптококкоза резистентны к флуконазолу и вориконазолу; установлена взаимосвязь вирулентности криптококков и их чувствительности к названным препаратам. Показана возможность

формирования новых фенотипов криптококка на фоне лечения этими антимикотиками.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для изучения эпидемиологии криптокоюсоза в России необходимо продолжать исследования для составления карты распределения генотипов Cryptococcus neoformans в сравнении с имеющимися данными в Европе и мире.

2. Целесообразно определять вирулентность изолятов криптококков по показателям их ферментативной активности при 37° С (фосфолипазной, уреазной, фенолоксидазной); это может иметь прогностическое значение при криптококкозе.

3. При оценке тканевых форм криптококка необходимо использовать модифицированную окраску альциановым синим по Моури (целесообразно сочетание альцианового синего, PAS-реакции и гематоксилина), что приобретает особое значение для постановки диагноза криптококкоза при выявлении капсулосодержащих, бескапсульных и дегенеративных форм гриба, а также продуктов их распада.

4. В случаях обнаружения многочисленных очагов лизиса («цист») в гистологических препаратах при отсутствии воспалительной реакции можно предполагать наличие высоковирулентного возбудителя криптококкоза (слабо вирулентный штамм индуцирует «грануломатозную реакцию»).

5. При выделении криптококков из биосубстратов необходимо определять чувствительность всех штаммов к антимикотикам и контролировать ее в случаях рецидивов криптококкоза.

6. При обнаружении в патологическом материале микроорганизмов -ассоциантов криптококка при криптококкозе необходимо определять тип их взаимоотношений (симбиоз, антибиоз).

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Васильева Н.В. Иммуносупрессивные свойства Cryptococcus neoformans / H.B. Васильева, P.A. Аравийский, М.Б. Зайцев // В сб. «Тезисы II Межд. миколог, симпозиума «Микозы и иммунодефицит». - Л., 1991. - С. 23.

2. Блинов Н.П. Вклад антигенной информации в понимание механизмов развития иммунитета при некоторых микозах / Н.П. Блинов, Н.В. Васильева, H.H. Блинова, М.А. Кашкина, Г.А. Витовская // В сб. «Тезисы TI Межд. миколог, симпозиума «Микозы и иммунодефициты». - Л., 1991. - С. 31.

3. Vasilyeva N.V. Role of macrophages in pathogenesis of cryptococcosis / N.V. Vasilyeva, R.A. Aravyjskyj, L.A. Semenova, M.A. Mikhaylova, I.V. Vybornova // Intern. J. of Immun. - 1994. -№ 1. - Suppl. - P. 368.

4. Васильева Н.В. Сравнительная патогенность различных штаммов Cryptococcus neoformans / Н.В. Васильева, P.A. Аравийский, M.A. Михайлова, И.В. Выборнова, Т.С. Богомолова, Е.П. Киселева // В сб. «Тезисы

III Межд. миколог, симпозиума «Патогенез, диагностика и терапия микозов и микогенной аллергии». - СПб., 1995. - С. 33.

5. Elinov N.P. The chemical peculiarities of some cryptococcal polysaccharides in their relation to aggressive factors in cryptococcosis / N.P. Elinov, N.V. Vasilyeva // Abstr. 3- Intern. Conference on Cryptococcus and Cryptococcosis. - Paris, 1996.-P.172.

6. Vasilyeva N.V. Virulence of large and small encapsulated strains of Cryptococcus neoformans / N.V. Vasilyeva, T.S. Bogomolova, V.B. Antonov, R.A. Aravyjskyj // Abstr. 3- Intern. Conference on Cryptococcus and Cryptococcosis. - Paris, 1996. -P. 173.

7. Васильева H.B. Капсула Cryptococcus neoformans: ее вариабельность и значение в определении вирулентности гриба / Н.В. Васильева, Т.С. Богомолова, О.Х. Гяургиева, Р.А. Аравийский // Вестник дерматологии и венерологии. - 1997. - № 4. - С. 5-7.

8. Богомолова Т.С. Размер капсулы криптококков, выделенных от больных СПИДом / Т.С. Богомолова, О.Х. Гяургиева, Н.В. Васильева // В сб. статей "Актуальные вопросы медицины и биологии": вып. 9. - Украина: Днепропетровск, 1997.- С. 192.

9. Рахманова А.Г. Клинико-лабораторные особенности криптококкоза в зависимости от толщины капсулы возбудителя / А.Г. Рахманова, О.Х. Гяургиева, Т.С. Богомолова, Н.В. Васильева, В.Я. Ильина, И.В. Выборнова, А.С. Литвинов // Intern. J. on Immunorehabilitation. - 1997. - № 4. - С. 49.

10. Богомолова Т.С. Особенности лабораторной диагностики криптококкоза при ВИЧ-инфекции / Т.С. Богомолова, Г.И. Горшкова, Н.В. Васильева // В сб. научных трудов «Актуальные вопросы ВИЧ-инфекции». - СПб., 1997. - С. 34-35.

11. Гяургиева О.Х. Антифунгальная терапия при ВИЧ-инфекции в России / О.Х. Гяургиева, Н.В. Васильева, А.Г. Рахманова, Т.С. Богомолова, М.А. Михайлова // Сб. «Тезисы 4 Конгресса Европейской конфедерации медицинской микологии». - Глазго, 1998. - Р. 109.

12. Васильева Н.В. Антифунгальная терапия при ВИЧ-инфекции в России / Н.В. Васильева, Т.С. Богомолова, О.Х. Гяургиева, А.Г. Рахманова // Сб. тезисов конференции «Инфекционные болезни: новое в диагностике и терапии». -СПб, 1998. -Р.77-78.

13. Васильева Н.В. О факторах агрессии Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Vufflemin, 1901 / Н.В. Васильева, Е.А. Тилева // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 1999. - Т.1, № 1. - С. 24-27.

14. Васильева Н.В. Случай успешного лечения вертебрального (Thxn-Li) остеомиелита, обусловленного Cryptococcus albidus (Saito) Skinner / Н.В. Васильева, Н.Н. Климко, Р.А. Аравийский, Е.А. Загорская, Т.С. Богомолова // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 1999. - Т.1, № 1. - С. 27-32.

15. Vasilyeva N.V. Pathomorphology of cryptococcosis: 14 cases from St-Petersburg (Russia) / N.V. Vasilyeva, O.K. Khmelnitskyi, M.S. Tretiakova, D.V. Komarova // Abstracts 4Ш International Conference on «Cryptococcus and Cryptococcosis». London, UK, 1999.-P. 23.

16. Vasilyeva N.V. Plants containing phenolic compounds and possibility of their " application in mycology / N.V. Vasilyeva, N.P. Yelinov, E.A. Thileva, T.S. 1 Bogomolova // Abstracts of 4th International Conference on «Cryptococcus and

Cryptococcosis». - London, UK, 1999. - P.85.

17. Васильева H.B. Чувствительность Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Vuillemin и Cryptococcus albidus (Saito) Skinner к различным антимикотическим препаратам / H.B. Васильева, Т.С. Богомолова, М.А. Михайлова // Сб. «Тезисы докладов VI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 1999.-Р. 120.

18. Хмельницкий O.K. Особенности поражения головного мозга при

* криптококковой инфекции / O.K. Хмельницкий, Р.А. Насыров, Н.В. Васильева // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2000. - Т.2, № 2. - С. 35-36.

■■ 19. Васильева Н.В. Микоцины и микоциногенная активность анаморфных

представителей рода Cryptococcus / Н.В. Васильева, Е.А. Тилева // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2000. - Т.2, № 2. - С. 41-42.

20. Блинов Н.П. Род Cryptococcus в четвертом издании «The Yeasts" (А taxonomic study) / Н.П. Блинов, Н.В. Васильева // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2000. - Т.2, № 3. - С. 6-12.

21. Васильева Н.В. Морфология клеток Cryptococcus neoformans на средах с фенольными соединениями / Н.В. Васильева, И.А. Синицкая, Е.А. Тилева // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2000. - Т.2, № 4. - С. 34-41.

22. Vasilyeva N.V. Cryptococcus albidus (Saito) Skinner as a causative agent of osteomyelitis / N.V. Vasilyeva, N.N. Klimko, R.A. Aravyjskyj, E.A. Zagorskaya, T.S. Bogomolova // Abstr. of the 14th ISHAM Congress, Argentina. - 2000. -P. 105.

23. Vasilyeva N.V. Characterization of some morphological and biological features of strains of cryptococci, isolated from patients in Russia / N.V. Vasilyeva, T.S. Bogomolova, E.A. Thileva // Iberoamericana Micologia. - 2000. - Vol. 17, № 3. -

, P.137-138.

f 24. Vasilyeva N.V. Survey of cryptococcosis in Europe, the ECMM working group

report / N.V. Vasilyeva, M.A. Viviani et al. // Iberoamericana Micologia. - 2000. -vol. 17, № 3. -P.115.

* 25. Khmelnitskyi O.K. Comparative pathomorphology of cryptococcosis in patients " with AIDS and other immunodeficiencies / O.K.Khmelnitskyi, M.S. Tretyakova,

N.V. Vasilyeva // Abstr.I Intercontinental congress of pathology. Portugal, 2000. -P.203.

26. Хмельницкий O.K. О патологической анатомии криптококкоза / O.K. Хмельницкий, Р.А. Насыров, Н.В. Васильева // В сб. труд: «Актуальные вопросы клинической патоморфологии». - СПб, 2000. - С. 7-8. ' 27. Семенов В.В. Формирование митохондрий de novo и их возможное

происхождение у Eukaryota /В.В. Семенов, Н.В. Васильева // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2001. - Т.З, № 1. - С. 33-66.

... j

28. Гяургиева О.Х. Клиническое течение криптококкоза у больных СПИД / О.Х. Гяургиева, К.А. Гяургиева, Н.В. Васильева, А.Г. Рахманова // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2001. - Т.З, № 2. - С. 15-19.

29. Васильева Н.В. Моделирование экспериментального криптококкоза / Н.В. Васильева, O.K. Хмельницкий, Р.А. Насыров, Е.А. Тилева, Н.А. Елисеева // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2001. - Т.З, № 2. - С. 42-43.

30. Chmelnicki O.K. The pathology changes pattern in brain induced by cryptococcosis / O.K. Chmelnicki, R.A. Nasirov, N.V. Vasilyeva // 8th European Congress of Pathology. - Berlin, 2001. - P.143.

31. Васильева Н.В. Перечень основных методов и критериев диагностики микозов / Н.В. Васильева, Н.Н. Климко, Р.А. Аравийский и др. - СПб., 2001. -24 с.

32. Vasilyeva N.V. New cases of cryptococcosis in Saint-Petersburg: / N.V. Vasilyeva, T.S. Bogomolova, N.N. Klimko, E.A. Thileva // Mycoses . - 2001. - № 44. (Suppl.l). - P. 37.

33. Васильева Н.В. Криптококки и криптоккокоз на современном этапе // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2002. - Т.4, № 2. - С. 45-46.

34. Хмельницкий O.K. Патоморфогенез криптококкоза центральной нервной системы / O.K. Хмельницкий, Н.В. Васильева, Р.А. Насыров // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2002. - Т.4, № 2. - С. 46-47.

35. Блинов Н.П. Пятая международная конференция «Криптококк и криптококкоз» 3-7 марта 2002 г., г. Аделаида, Австралия / Н.П. Блинов, Н.В. Васильева, А.Н. Коваль // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2002. -Т.4,№2.-С. 99-105.

36. Васильева Н.В. Влияние гидрокортизона, дофамина и резорцина на морфологию и ультраструктуру криптококков in vitro / Н.В. Васильева, Е.А. Тилева, И.А. Синицкая // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2002. -Т.4, ife 4.-С. 28-35.

37. Vasilyeva N.V. Chloroquine activity against Ciyptococcus neoformans in vivo / N.V. Vasilyeva, E.A. Thilyeva, M.A. Michaylova, I.V. Vybornova, D.D. Chyrkst // Abstr. of the 5® International conference «Cryptococcus and Cryptococcosis», 3-7 March 2002, Adelaida, Australia. - P.75.

38. Vasilyeva N.V. The mating of Cryptococcus neoformans strains isolated from patients in Russia / N.V. Vasilyeva, N.P. Yelinov, E.A. Thilyeva, T.S. Bogomolova, V.V. Semenov // Abstr. of the International conference «Cryptococcus and Cryptococcosis», 3-7 March 2002, Adelaida, Australia. - P.72.

39. Vasilyeva N. Morphobiological and pathogenic properties of a strain Cryptococcus neoformans MATa, isolated from the patient in Russia / N. Vasilyeva, E. Thilyeva, N. Yelinov, T. Bogomolova // Сб. "Proceedings of the Trends in Medical Mycology". - Monduzzi Editore. - Italy, 2003. - P.33-36.

40. Насыров Р.А. Патоморфологические изменения в головном мозге мышей, обусловленные воздействием различных штаммов криптококков / Р.А. Насыров, Н.В. Васильева, O.K. Хмельницкий, М.Ю. Майская, Е.А. Тилева // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2003. - Т.5, № 2. - С. 30.

41. Мейер У. Анализ ДНК в геноме Cryptococcus neoformans изолятов от больных методами ПЦР-отпечатков и PFLP / У. Мейер, Н.В. Васильева, Н.П. Блинов, Е.А. Тилева, Т.С. Богомолова // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2003. - Т.5, № 3. - С. 3-11.

42. Vasilyeva N. Morphobiological and pathogenic properties of a strain Cryptococcus neoformans MATa, isolated from the patient in Russia / N. Vasilyeva, E. Thilyeva, N. Yelinov, T. Bogomolova // Сб. "Abstracts of the 9й Congress of ECMM and 7~ Trends in Invasive Fungal Infections". - Amsterdam, 2003. - P. 220.

43. Васильева H.B. Влияние капсульных полисахаридов криптококков на характер патоморфологических изменений в головном мозге мышей, инфицированных С. neoformans / H.B. Васильева, O.K. Хмельницкий, М.Ю. Майская, И.В. Выборнова, P.A. Насыров // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2004. - Т.6, № 2. - С. 66-67.

44. Майская М.Ю. Сравнительная характеристика морфологических изменений в головном мозге мышей, инфицированных различными штаммами С. neoformans / М.Ю. Майская, Н.В. Васильева, O.K. Хмельницкий, P.A. Насыров // Труды Санкт-Петербургской ассоциации патологоанатомов. -СПб., 2004. - Вып. 45, № 2. - С. 41-42.

45. Аравийский P.A. Диагностика микозов / Аравийский P.A., H.H. Климко, Н.В. Васильева - СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2004. - 186 с.

46. Васильева Н.В. Патоморфология экспериментального криптококкоза, вызванного различными по патогенности штаммами Cryptococcus spp. / H.B. Васильева, Н.П. Блинов, P.A. Аравийский, И.В. Выборнова, М.А. Михайлова // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2005. - Т.7, № 2. - С. 98.

47. Васильева Н.В. Сравнительное изучение ультраструктуры штаммов Cryptococcus neoformans разной вирулентности / Н.В. Васильева, A.A. Степанова, И.А. Синицкая, В В. Семенов // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2005. - Т.7, № 1. - С. 99.

48. Хмельницкий O.K. Патоморфология криптококкоза головного мозга при иммунодефицитных состояниях различного генеза / O.K. Хмельницкий, P.A. Насыров, Н.В. Васильева, М.Ю. Майская // Архив патологии. - 2005. - Т.67. -С. 10-12.

49. Васильева Н.В. Активность внеклеточных ферментов клинических изолятов Cryptococcus neoformans / Н.В. Васильева, Т.С. Богомолова, Г.А. Чилина, М.А. Михайлова, И.В. Выборнова // В сб. «Успехи медицинской микологии»: Т.5 Мат. Третьего Всероссийского конгресса по медицинской микологии. -М.: Национальная академия микологии, 2005. - С. 30-31.

50. Васильева Н.В. Вариабельность чувствительности микромицетов к некоторым азоловым препаратам / Н.В. Васильева, И.В. Выборнова, Н.П. Блинов, М.А. Михайлова // В сб. «Успехи медицинской микологии»: Т.5 Мат. Третьего Всероссийского конгресса по медицинской микологии. - М.: Национальная академия микологии, 2005. - С. 295-296.

51. Васильева Н.В. Лабораторная диагностика микозов кожи / Н.В. Васильева, Т.С. Богомолова // В сб. «Тезисы научных работ IX Всероссийского съезда дерматовенерологов»: Т.1. - М., 2005- С.64.

52. Vasilyeva N.V. Characterization of virulence and extracellular enzymatic activities of clinical isolates of Cryptococcus neoformans / N.V. Vasilyeva, T.S. Bogomolova, G.A. Chilina, I.V. Vybornova, M.A. Mikhaylova // Abstr. 6-Intemational Conference on Cryptococcus and Cryptococcosis, June 24-28, 2005-Boston, USA. - P.216-217.

Типография «МГК», Заказ № 457. Тираж 100 экз. Подписано в печать 01.11.05 г.

»2314»

РНБ Русский фонд

2006-4 24790

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Васильева, Наталья Всеволодовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Морфолого-биологические особенности рода Cryptococcus.

1.1. Род Cryptococcus

1.2. Ультраструктура клеток С. neoformans.

1.3. Молекулярно-генетическая характеристика

Cryptococcus neoformans.

Глава II. Патогенность криптококков.

2.1. Базовые характеристики патогенных свойств криптококков.

2.2. Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими микроорганизмами.

2.3. Современные представления о патогенезе криптококкоза.

2.4. Факторы патогенности криптококков.

2.4.1. Капсула.

2.4.2. Уреаза.

2.4.3. Лакказа и меланиногенез.

2.4.4. Фосфолипаза.

2.4.5. Типы спаривания.

2.4.6. Рост при повышенных температурах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 111. Объекты и методы исследования.

3.1. Объекты исследования. ф 3.2. Методы исследования

3.2.1. Морфологические характеристики изолятов

С. neoformans.

3.2.2. Изучение патогенности криптококков в опытах на лабораторных животных.

3.2.3. Сравнительная ультраструктура клеток криптококков.

3.2.4. Способность клеток С. neoformans расти при повышенных температурах.

3.2.5. Ассимиляция источников углерода и азота тест-культурами криптококков.

3.2.6. Ферментативная активность криптококков (фосфолипазная, уреазная, фенолоксидазная).

3.2.7. Исследование чувствительности криптококков к флуконазолу и вориконазолу.

3.2.8. Молекулярно-генетическая характеристика

С. neoformans.

3.2.9. Особенности патоморфогенеза криптококкоза.

3.2.9.1. Патоморфогенез криптококкоза у человека.

3.2.9.2. Патоморфогенез экспериментального криптококкоза головного мозга и легких у белых мышей, вызванного различными по патогенности штаммами криптококков.

3.2.10. Иммуногистохимическое изучение локализации капсульного гетерогликана в тканях головного мозга мышей при криптококкозе.

3.2.11. Получение экзогликанов, образуемых Cryptococcus neoformans С. РКПГ 719 и humicolus ИБФМ 984.

3.2.12. Изучение влияния криптококковых экзогликанов на выживаемость зараженных мышей.

3.2.13. Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими микромицетами и бактериями in vitro.

3.2.13.1. Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими грибами in vitro.

3.2.13.2. Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с бактериями in vitro.

3.3. Статистические методы.

Глава IV. Морфолого-биологические свойства клинических изолятов криптококков.

4.1. Происхождение изучаемых штаммов криптококков.

4.2. Морфология штаммов С. neoformans, выращенных на питательных средах in vitro.

4.3. Определение.патогенности криптококков при внутривенном введении мышам.

4.4. Ассимиляция различных источников углерода и азота.

4.5. Ультраструктура клеток штаммов С. neoformans, выращенных in vitro.

4.6. Генетическая характеристика 17 штаммов С. neoformans, выделенных от больных в России.

Глава V. Морфо-биологические особенности С. neoformans in vivo.

5.1. Патоморфология криптококкоза у человека.

5.2. Экспериментальный криптококкоз.

5.2.1. Экспериментальный криптококкоз, вызванный различными по патогенности штаммами Cryptococcus spp.

5.2.2. Экспериментальный криптококкоз головного мозга при внутривенном заражении мышей высоко патогенным штаммом С. neoformans 1166.

5.2.3. Экспериментальный криптококкоз головного мозга при внутривенном заражении мышей менее патогенным штаммом С. neoformans 1067.

5.3. Экспериментальный криптококкоз. Ультраструктура клеток С. neoformans.

5.3.1. Ультраструктура клеточных стенок и капсул штаммов С. neoformans в легких и мозге белых мышей через 7 дней после внутривенного заражения.

5.3.2. Ультраструктура клеточной стенки и капсулы зрелых клеток С. neoformans штаммов 1166 и 1067 в мозге белых мышей через 14 дней после их заражения.

5.4. Выявление антигена криптококка в головном мозге мышей, внутривенно зараженных различными штаммами.

Глава VI. Сравнительное изучение гомологичных экзогликанов в экспериментах in vivo.

6.1. Влияние криптококковых экзогликанов из патогенных и непатогенных криптококков на выживаемость мышей при экспериментальном криптококкозе.

6.2. Патоморфологическое и иммуногистохимическое исследование головного мозга мышей после введения полисахаридов из патогенного и непатогенного криптококков.

6.3. Влияние криптококкового экзогликана, продуцируемого патогенным криптококком, на выживаемость мышей при экспериментальном криптококкозе.

Глава VII. Факторы патогенности С. neoformans.

7.1. Рост и развитие С. neoformans при повышенных температурах.

7.2. Определение меланинообразующей способности

Ф криптококков.

7.3. Определение уреазной активности.

7.4. Определение фосфолипазной активности криптококков.

Глава \/111.Ассоциативные взаимодействия Cryptococcus neoformans с другими грибами и бактериями in vitro.

8.1. Ассоциативные взаимодействия Cryptococcus neoformans с другими грибами in vitro.

8.2. Ассоциативные взаимодействия Cryptococcus neoformans с некоторыми бактериями in vitro.

Глава IX. Чувствительность изолятов криптококков к флуконазолу и вориконазолу.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Факторы патогенности Cryptococcus Neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза"

Актуальность проблемы

Cryptococcus neoformans - один из наиболее важных патогенных для человека микромицетов, встречающихся в клинической практике; он вызывает тяжелый менингоэнцефалит и диссеминированные инфекции преимущественно у больных СПИД и иммунодефицитами другого генеза.

Частота криптококкоза в развитых странах мира после введения высоко эффективной антиретровирусной терапии составляет 0,3-0,5/100.000 населения. Однако, в развивающихся странах ситуация остается по-прежнему тревожной; по данным конференции по инвазивным микозам в 2002 г среди ВИЧ-инфицированных лиц от криптококкоза умерло 200 000 человек. Сведения о заболеваемости криптококкозом в России в целом отсутствуют, равно как и информация о молекулярных типах, серотипах, вариантах и вирулентности изолятов криптококков.

В настоящее время Россия по темпам прироста числа ВИЧ-инфицированных лиц занимает одно из первых мест в мире и ухудшение данной ситуации в ближайшие годы вполне очевидно [22, 24, 26, 27]. Поскольку криптококкоз является маркерной инфекцией при СПИД, частота его также будет возрастать.

Род Cryptococcus включает 38 видов и только два из них (С. neoformans и С. gattii) являются патогенными. Вместе с тем, биологические особенности этих двух видов изучены недостаточно, включая и факторы патогенности. Наиболее явные из них (рост патогенов при 37° С, продукция меланинов, типы спаривания, активность фосфолипазы и уреазы, капсулообразование), стали известными в последние годы, но простое их перечисление не обеспечивает возможности дифференцировать патогенные криптококки по вирулентности, что могло бы иметь прогностическое значение. Очень мало информации имеется в отношении морфологии тканевых форм возбудителя в процессе инфекции, а также реакции организма больного на различные изоляты С. neoformans, которые могут заметно варьировать по вирулентности.

Несмотря на актуальность проблемы о правомочности отнесения кап-сульного полисахарида различных серотипов и вариантов С. neoformans в разряд факторов агрессии, до сих пор нет четкости в понимании разграничения роли капсулы криптококка и ее главного компонента-глюкуроноксиломаннана, в результате чего и капсульный полисахарид и капсулу обычно относят к факторам патогенности.

В последнее время усилился интерес к проблеме ассоциативных взаимодействий грибов с другими микроорганизмами. Однако данные о криптокок-ке - ассоцианте немногочисленны и противоречивы и, как правило, эти данные получены при аутопсиях с констатацией лишь факта наличия микст-инфекций.

В этой связи давно возникла необходимость более глубокого исследования биологии криптококков, в том числе их «поведенческих» характеристик в ассоциациях.

С учетом недостаточной изученности криптококков, как возбудителей угрожающих жизни инфекций, проблема всестороннего исследования биологии названных микроорганизмов является весьма актуальной. Цель исследования

Изучение биологических особенностей патогенных криптококков - изоля-тов от пациентов в России. Задачи исследования

1. Провести генотипирование криптококков - изолятов в России.

2. Идентифицировать криптококки, выделенные от больных, по основным морфо-физиологическим характеристикам для определения их соответствия типовым культурам.

3. Изучить цитологическую вариабельность патогенных криптококков, полученных в культурах in vitro и от экспериментальных животных, зараженных тест-организмами, с использованием современной световой и электронной микроскопии.

4. Изучить вирулентность и факторы патогенности изолятов криптококков от больных и некоторых коллекционных штаммов.

5. Провести сравнительное изучение морфологии возбудителя и патоморфо-логических изменений в аутопсийном материале и при экспериментальном криптококкозе, обусловленном штаммами различной вирулентности.

6. Изучить влияние капсульного полисахарида на течение экспериментального криптококкоза.

7. Определить «поведенческие» . реакции криптококков в ассоциациях с другими микроорганизмами.

8. Исследовать чувствительность криптококков к антимикотикам. Научная новизна исследования

Впервые:

- проведен молекулярный анализ российских изолятов криптококков, собранных и изученных в ходе исследования, получена первая информация о различных субпопуляциях С. neoformans;

- экспериментально обнаружены штаммовые различия российских изолятов криптококков по морфо-физиологическим свойствам, в том числе - на ультраструктурном уровне;

- установлена возможность формирования оригинальных фенотипов крип-тококка у одного и того же больного в процессе инфекции на фоне лечения;

- обоснована опосредованная роль капсульного экзогликана как возможного фактора агрессии патогена;

- оценены ассоциативные взаимоотношения криптококков с бактериями, дрожжевыми и нитчатыми грибами;

- выявлена корреляция между чувствительностью криптококков к антимикотикам азолового ряда (флуконазолу, вориконазолу) и вирулентностью.

- выявлена и определена архитектоника типов капсул у криптококков in vitro и in vivo, наряду с пластичностью нативного капсульного материала;

- оценены и изучены тканевые формы криптококка в зависимости от вирулентности.

Практическая значимость и внедрение в практику

Полученные данные о внутривидовых штаммных различиях по чувствительности к антимикотикам, вирулентности, особенностям тканевых форм, ферментативной активности С. neoformans, выделяемых из патологического материала, необходимо учитывать в клинической практике постановки диагноза и выбора средств лечения соответствующих больных.

Результаты патоморфологических и электронно-микроскопических исследований являются основой для постановки диагноза криптококкоза в ходе инфекции с учетом дифференциации клеток криптококков на инкапсулированные, бескапсульные и дегенеративные формы.

Результаты изучения взаимоотношения криптококков в ассоциациях с другими микроорганизмами следует экстраполировать на оценку микст-инфекций in vivo и в природных ассоциациях, в которых участником является С. neoformans.

Установлена необходимость определения чувствительности С. neoformans к флуконазолу и вориконазолу in vitro, а также мониторирования чувствительности в ходе лечения.

Основные руководства и пособия, в которых в порядке внедрения использованы результаты исследования:

1. Руководство для врачей «Перечень основных методов и критериев диагностики микозов», 2001. Рекомендовано к использованию ученым советом НИИ медицинской микологии СПб МАПО.

2. Учебное пособие «Диагностика микозов», 2004. Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей.

3. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в клинической ординатуре по специальности «Лабораторная микология», 2004.

4. Типовая программа повышения квалификации по специальности «Лабораторная микология», 2004.

5. Типовая программа профессиональной переподготовки по специальности «Лабораторная микология», 2004.

6. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в интернатуре по специальности «Лабораторная микология», 2004.

7. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в клинической ординатуре по специальности «Клиническая микология», 2004.

8. Типовая программа повышения квалификации по специальности «Клиническая микология», 2004.

9. Типовая программа профессиональной переподготовки по специальности

Клиническая микология», 2004.

10. Типовая программа и учебные планы послевузовской подготовки в интернатуре по специальности «Клиническая микология», 2004.

Материалы диссертации внедрены в работу микологической клиники, лаборатории диагностики микозов, микологического мониторинга и биологии грибов, «Российской коллекции патогенных грибов», лаборатории патомор-фологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО, НИИ детских инфекций, Городского патологоанатомического бюро, инфекционной больницы № 30 им. С.П.Боткина г. Санкт-Петербурга; Республиканской клинической инфекционной больницы (Научно-практический центр профилактики и лечения ВИЧ-инфекции у беременных женщин и детей); Центра по профилактике и борьбе со СПИД г.Санкт-Петербурга.

Материалы диссертации внедрены в педагогический процесс ряда кафедр Санкт-Петербургской Медицинской академии последипломного образования (клинической микологии, аллергологии и иммунологии, курса лабораторной микологии, педиатрии с курсом неонатологии, патологической анатомии с курсом цитологии). Положения, выносимые на защиту

1. Возбудители криптококкоза гетерогенны по биологическим свойствам.

2. Важнейшими в дифференциации штаммов криптококков по вирулентности являются фосфолипаза, уреаза и фенолоксидаза.

3. При криптококкозе морфология клеток С. neoformans в тканях взаимосвязана с вирулентностью.

4. Штаммы патогенных криптококков формируют разные по архитектонике капсулы.

5. Полисахариды криптококков проявляют защитное действие применительно к клеткам-продуцентам и не являются непосредственным фактором агрессии или патогенности для макроорганизма.

6. Установленные различные типы взаимоотношений криптококков в ассоциациях с бактериями, дрожжевыми и нитчатыми грибами имеют важное клиническое значение при экстраполяции результатов на микробиоту in vivo.

7. Чувствительность криптококков к флуконазолу и вориконазолу необходимо определять неоднократно в ходе лечения, учитывая возможность возникновения их новых фенотипов. Апробация работы

Материалы диссертации доложены на ежегодных научно-практических конференциях по медицинской микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004 и 2005), на 6-м Российском съезде врачей-инфекционистов (СПб, 2003), на расширенном заседании Российского Общества патологоанатомов с участием инфекционистов и микологов (СПб, 2003), на Втором Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2004), на 13 и 14-м Конгрессах Международного Общества медицинских и ветеринарных микологов (Италия, 1997 , Аргентина, 2000), на 6,7-м и 9-м Конгрессах Европейской Конфедерации по медицинской микологии (Испания, 2000, Греция, 2001, Нидерланды, 2003), на 3, 4-й и 5-й Международных конференциях «Криптококк и криптококкоз» (Париж, 1996, Лондон, 1999, Аделаида, 2000, Бостон, 2005). Публикации по материалам исследования

По теме диссертации опубликовано 52 работы в научных журналах и сборниках, в том числе 20 из них в изданиях, рекомендованных ВАК. Личный вклад автора

Автор планировал, выполнял и руководил исполнением основных экспериментальных исследований по проблеме. В выборе главного направления исследований, в постановке и решении конкретных задач, организации и выполнении экспериментальных исследований автору принадлежит ведущая роль.

Доля участия автора в сборе изолятов патогена и аутопсий - 50%; в разработке и исполнении программ разделов исследований - 90%; доля участия в обработке данных - 90%; в анализе и обобщении экспериментального материала-100%.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, 9 глав, выводов, списка цитируемой литературы (280 наименований) и приложения. Полный объем работы составляет 340 страниц, включая 94 рисунка и 45 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Васильева, Наталья Всеволодовна

выводы

Возбудители, выделенные от пациентов в России, относятся к молекулярным типам VNI, VNIII и VNIV, серотипам А, Д, АД и вариантам С. neoformans var. grubii, var. neoformas и var. grubii / var. neoformans. Штаммы различаются внутри вида С. neoformans и между видами С. gattii и С. albidus по способности к капсулообразованию, меланинообразо-ванию, росту при температуре выше 37°С, фосфолипазной и уреазной активностям, ультраструктуре, интенсивности почкования, чувствительности к антимикотикам - флуконазолу и вориконазолу, тканевым формам.

Возбудители криптококкоза различаются по вирулентности (LD50ot 102 до 1011 клеток/мышь). Патогенность штаммов криптококков зависит от комбинации следующих факторов: способности к росту при температуре 37°С, капсулообразованию, меланинообразованию, фосфолипазной и уреазной активностям; выраженность последних трех свойств соответствует различиям их по вирулентности.

На основании электронно-микроскопических исследований клеток установлено, что штаммы С. neoformans отличаются по строению и толщине капсулы и клеточной стенки, степени конденсации ядерного материала; в зависимости от вирулентности штамма наиболее выраженными признаками были только число, форма и топография митохондрий. Толщина капсулы и клеточной стенки не связана с вирулентностью штамма. Капсулообразование - видовой признак криптококков, необходимый фактор патогенности

5.1.При этом отсутствует зависимость архитектоники капсул (толщина, уровень сложности, качество и количество микрофибрилл в ней) от вирулентности штаммов. 5.2.Обнаруженные динамические изменения в ультраструктуре капсул in vivo непосредственно связаны с трансформацией капсульного полисахарида, определяющего антигенную специфичность криптококка. Капсульный полисахарид не занимает ведущего положения в определении патогенности (агрессивности) криптококка; экзогликаны капсул из патогенного С. neoformans (серотип Д) и непатогенного С. humicolus (серотип Д), обладающие сходной химической структурой, вызывают однотипные изменения в головном мозге при экспериментальном криптококкозе. Возможность инвазии тканей С. neoformans и характер течения крипто-кокковой инфекции определяются не только степенью иммунодефицита, но и вирулентностью штамма.

Морфология тканевых форм гриба изменяется по мере снижения вирулентности, более вирулентные штаммы криптококка вызывают более тяжелые поражения головного мозга и легких, при этом формируется большее число очагов лизиса («цист») на фоне подавления воспалительной реакции; менее вирулентные штаммы индуцируют гранулема-тозную реакцию при меньшем числе очагов лизиса. Установлено, что в ассоциациях с бактериями и микромицетами проявляются различные взаимоотношения криптококков:

9.1. Штаммы криптококков 1095, 1096, 852 и 856 стимулировали рост всех взятых в опыты грамотрицательных бактерий и избирательно -грамположительных бактерий; грамположительные и грамотрица-тельные бактерии не стимулировали роста криптококков, но часть из них выступала ингибиторами роста микромицетов, a Proteus vulgaris проявил себя выраженным антагонистом С. neoformans.

9.2. Дрожжевые организмы - Candida albicans, С. krusei и С. zeylanoides заметно тормозили рост криптококков (С. rugosa проявляла нейтрализм); ингибирующее действие нивелировалось при снижении температуры с 37°С до 26°С. Сапротрофные штаммы С. humicolus ингибировали тест-культуры С. neoformans при 30°С.

9.3. Нитчатые микромицеты Aspergillus niger 1117 и A. flavus 954 ингибирующе действовали в отношении штаммов криптококков РКПГ 852, 856, а сапробы Penicillium nigricans 184, P. expansum 185 и P. patulum 190 - подавляли штаммы С. neoformans РКПГ 1095 и 1096. Применительно к другим изученным видам нитчатых микромицетов (сапробов) в ассоциациях отмечен нейтрализм.

-28510. 10 % возбудителей криптококкоза резистентны к флуконазолу и ворико-назолу; установлена взаимосвязь вирулентности криптококков и их чувствительности к названным препаратам. Показана возможность формирования новых фенотипов криптококка на фоне лечения этими антимикоти-ками.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для изучения эпидемиологии криптококкоза в России необходимо продолжать исследования для составления карты распределения генотипов Cryptococcus neoformans в сравнении с имеющимися данными в Европе и мире.

2. Целесообразно определять вирулентность изолятов криптококков по показателям их ферментативной активности при 37° С (фосфолипазной, уреазной, фенолоксидазной); это может иметь прогностическое значение при криптококкозе.

3. При оценке тканевых форм криптококка необходимо использовать модифицированную окраску альциановым синим по Моури (целесообразно сочетание альцианового синего, PAS-реакции и гематоксилина), что приобретает особое значение для постановки диагноза криптококкоза при выявлении капсулосодержащих, бескапсульных и дегенеративных форм гриба, а также продуктов их распада.

4. В случаях обнаружения многочисленных очагов лизиса («цист») в гистологических препаратах при отсутствии воспалительной реакции можно предполагать наличие высоковирулентного возбудителя криптококкоза (слабо вирулентный штамм индуцирует «грануломатозную реакцию»).

5. При выделении криптококков из биосубстратов необходимо определять чувствительность всех штаммов к антимикотикам и контролировать ее в случаях рецидивов криптококкоза.

6. При обнаружении в патологическом материале микроорганизмов - ассо-циантов криптококка при криптококкозе необходимо определять тип их взаимоотношений (симбиоз, антибиоз).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Васильева, Наталья Всеволодовна, Санкт-Петербург

1. Авцын А.П., Струков А.И., Фукс Б.Б. Принципы и методы гистоцитохими-ческого анализа в патологии. Л.: Медицина, 1971. - 367 с.

2. Аркадьева Г. Е. Биологическая активность некоторых микробных полисахаридов: дисс. .д-ра биол. наук. Л., 1974. -275 с.

3. Бабьева И. П., Чернова И. Ю. Биология дрожжей. М.: Товарищество научн. изд. КМ К, 2004. - 212 с.

4. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии (в 2 частях). -М.: Мир, 1989.-400 с.

5. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. 2 изд., перераб. и доп. - Л.: Гос. изд-во мед. литерат., 1963. -152 с.

6. Боровиков В.П., Боровиков И.П. STATISTICA Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. - М.: Филин, 1997.

7. Боровиков В.П. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере. Для профессионалов. СПб.: Питер, 2001. - 656 с.

8. Васильев А.Е., Камалетдинова Ф.И. О фиброзиновых тельцах грибных клеток // Докл. АН СССР. 1988. - Т. 301. - № 4. - С. 982-984.

9. Васильева Н.В. Влияние криптококкового полиуронида на макрофаги: Дисс. канд. биол. наук. Л., 1989. - 179 с.

10. Гайер Г. Электронная гистохимия. Изд. «Мир»: Москва. - 1974.-488 с.

11. Голубев В.И. Грибы рода Cryptococcus. М.,1980. - 80 с.

12. Голубев В.И., Икеда Р., Шинода Т. Активность сапротрофных тремел-лоидных дрожжей против Cryptococcus neoformans И Проблемы медицинской микологии. 2000. - Т. 2, № 3. - С. 39-43.

13. Елинов Н.П. Криптококковые полисахариды и криптококкоз // Тезисы I Межд. микол. симпозиума, 1987, Л. С. 11-12.

14. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. Изд-во «Наука» . - 1995. - 600 с.

15. Елинов Н.П. Патогенные дрожжеподобные организмы. Л.: Медицина, 1964.-383 с.16