Сравнительная характеристика природных и клинических изолятов Cruptococcus neoformans

Босак, Илья Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительная характеристика природных и клинических изолятов Cruptococcus neoformans
ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика природных и клинических изолятов Cruptococcus neoformans"

003488760

БОСАК Илья Алексеевич

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

03.00.24- микология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 О ДЕК 2009

БОСАК Илья Алексеевич

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

03.00.24- микология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор биологических наук Васильева Наталья Всеволодовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Романюк Фёдор Петрович доктор медицинских наук, профессор Афиногенов Геннадий Евгеньевич Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится « У У» /2 200 / в_часов на заседании диссертационного совета Д.208.089.04 при Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»'(195196, Санкт-Петербург, Заневский пр, д. 1/82)

Автореферат разослан « » К_200 у.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Г? М.А. Шевяков

ОШАу?

Актуальность темы. Базидиомицетовые капсулированные дрожжи Cryptococcus neoformans и С. gattii вызывают поражение центральной нервной системы у иммунокомпрометированных и реже у иммунокомпетентных лиц. Частота заболевания криптококкозом составляет 0,2-0,9 на 100 ООО населения (Murphy W.J., 2009 г.). По данным Центра по контролю за заболеваниями (CDC, США), в мире ежегодно регистрируют 1 млн. случаев криптококкоза у ВИЧ-инфицированных больных, из них 680 000 погибают (Perfect J., 2008). Данные о частоте криптококкоза в России отсутствуют. В последние годы отмечен рост числа зарегистрированных случаев криптококкоза в Санкт-Петербурге (Н.В. Васильева, 2005; Н.В. Васильева и др. 2009).

С. neoformans включает две разновидности и три серотипа: С. neoformans var. grubii (серотип А), С. neoformans var. neoformans (серотип D) и гибрид (серотип AD). С. gattii включает два серотипа - В и С. Не для всех серотипов С. gattii известны экологические ниши, так как природные местообитания С. gattii серотипа С не выявлены.

С. neoformans наиболее часто выявляют в разных странах мира в субстратах, обильно загрязненных пометом птиц, в основном - голубей, но природными биосубстратами, из которых может быть выделен С. neoformans, в различных условиях могут выступать: почва, гниющая древесина, фрукты, деревья, домашняя пыль, слизистые оболочки рта и полости носа домашних животных (кошек, собак, коров и др.) (Viviani М.А., 2009). Экология С. neoformans относительно хорошо изучена применительно к странам и территориям с умеренным, суб-, и тропическим климатом, чего нельзя сказать о регионах с прохладным (холодным) климатом - сведения о таких исследованиях весьма ограничены.

нее вопрос об истинных природных источниках криптококковой инфекции остается открытым. Поэтому новые экологические ниши С. neoformans и С. gattii в настоящее время являются объектом исследования многих авторов за рубежом, а сведения о природных резервуарах криптококковой инфекции в России по-прежнему отсутствуют, равно как и сведения о популя-ционной структуре природных изолятов в России. Наряду с этим, несмотря на существенный прогресс в изучении патогенных криптококков молеку-лярно-генетическими методами в последние пять лет, следует признать, что существует значительный дисбаланс между количеством исследований клинических и природных изолятов С. neoformans со значительным их превалированием в сторону клинических (Kwon-Chung K.J., 2000; Meyer W„ 2003; Litvintseva A.P., 2009).

В доступной нам литературе данные о морфогенезе клеток С. neoformans, выделенных из окружающей среды и выращенных in vitro, также отсутствуют.

В специальной литературе сведения о вирулентности природных изолятов С. neoformans противоречивые - от полного отрицания вирулентности до выявления высокого потенциала патогенное™ (Fräser J.A., 2005; Pal М„ 2005; Litvintseva А.Р., 2009).

Учитывая вышеизложенное актуальным является исследование возможных природных резервуаров возбудителя криптококкоза с оценкой морфо-биологических особенностей изолятов С. neoformans, выделенных из окружающей среды в г. Санкт-Петербурге.

Цель исследования. Выявить и изучить биологические особенности изолятов С. neoformans, выделенных из окружающей среды и от больных криптококкозом людей.

Задачи исследования.

1. Выявить возможные природные резервуары С. neoformans в г. Санкт-Петербурге.

2. Изучить морфологические особенности изолятов С. neoformans, выделенных из окружающей среды и от больных криптококкозом лиц.

3. Исследовать особенности морфогенеза клеток культур - природных изолятов.

4. Оценить вирулентность природных и клинических изолятов С. neoformans на экспериментальной модели криптококкоза у мышей.

5. Исследовать факторы патогенности (лакказу, фосфолипазу, уреазу,

способность к росту при 37°С и капсулообразованию) у природных и клинических изолятов С. neoformans, а так же определить их чувствительность к флуконазолу и вориконазолу.

Научная новизна исследования.

Впервые:

- выявлен природный резервуар С. neoformans в г. Санкт-Петербурге;

- изучены морфологические свойства природных изолятов С. neoformans, в том числе, ультраструктурные аспекты их морфогенеза, в сравнении с клиническими изолятами, выделенными в Санкт-Петербурге в 2005-2008 гг.;

- проведено сравнение активности внеклеточных ферментов (уреаза, фосфолипаза, фенолоксидаза) изолятов, выделенных из окружающей среды и от пациентов с криптококкозом в г. Санкт-Петербурге;

- исследованы ассоциативные взаимодействия криптококков, выделенных из помета голубей, с другими микроорганизмами, выделенными из этой экологической ниши в Санкт-Петербурге;

- определены профили вирулентности природных штаммов С. neoformans, выделенных из экониш г. Санкт-Петербурга;

- проведен сравнительный молекулярно-генетический анализ природных и клинических изолятов С. neoformans.

Практическая значимость.

- Наличие патогенного криптококка в отложениях помета голубей на чердаках жилых зданий диктует необходимость проведения санитарно-эпидемиологических мероприятий в местах гнездования птиц.

- Данные о резервуарах С. neoformans в г. Санкт-Петербурге следует учитывать в профилактических рекомендациях для лиц, относимых к группе риска развития криптококкоза, которым целесообразно избегать контакта с пометом птиц и местами гнездования голубей.

- Данные об избирательном росте С. neoformans на дифференциально-диагностических питательных средах необходимо учитывать при выборе сред для выделения криптококков из объектов окружающей среды.

Положения, выносимые на защиту.

1. Основным природным резервуаром С. neoformans в Санкт-

Петербурге является помет голубей. Частота выделения культур крипто-кокков из отложений помета голубей на чердаках жилых зданий составляет 3,2%.

2. Характер ассоциативных взаимоотношений криптококков с другими микроорганизмами, выделенными из помета голубей -' определяющий фактор при оценке природной экониши возбудителей криптококковой инфекции.

3. Морфогенез клеток природных изолятов С. neoformans протекает однотипно. В тоже время изоляты различаются между собой по ультраструктурной организации полисахаридных капсул.

4. Природные изоляты С. neoformans являются слабовирулентными по сравнению с клиническими штаммами криптококков при воспроизведении на модели экспериментального криптококкоза у белых беспородных мышей, но обладают всеми известными факторами патогенности.

Апробация диссертационного материала. Материалы диссертации доложены на 4-ом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2006), на 9-ом съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), на 3-ем конгрессе «Тенденции в медицинской микологии» (Италия, 2007), на 7-ой международной конференции по криптококку и криптококкозу (Япония, 2008), на 17-ом конгрессе международного общества по медицинской и ветеринарной микологии (Япония, 2009), на ежегодной научно-практической конференции по медицинской микологии «XII Кашкинские чтения» (г. Санкт-Петербург, Россия, 2009), на 4-ом конгрессе «Тенденции в медицинской микологии» (Греция, 2009).

Внедрение результатов исследования. Результаты настоящего исследования внедрены в учебный процесс кафедры лабораторной микологии и патоморфологии микозов и работу «Российской коллекции патогенных грибов» ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава.

Публикации по материалам исследования. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

тических исследований природных и клинических изолятов С. neoformans. В постановке и решении конкретных задач, организации и выполнении экспериментальных исследований автору принадлежит ведущая роль. Доля участия автора в сборе проб из окружающей среды и выделении штаммов криптококков - 100%; в разработке и исполнении программ разделов исследований - 90%; доля участия в обработке данных - 100%; в анализе и обобщении экспериментального материала - 100%.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 186 источников, и приложений. Текст диссертации иллюстрирован 19 таблицами, 3 схемами, 35 рисунками и микрофотографиями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Объекты исследования: 10 клинических штаммов, хранящихся в Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ) НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО (РКПГ Y № 1251,1257,1262, 1263, 1264,1272,1271, 1276, 1283, 1291) и 5 природных изолятов С. neoformans. Изоляты от пациентов были выделены сотрудниками НИЛ микологического мониторинга и биологии грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина за период с 2005 по 2008 год. Клинические штаммы 1257, 1262, 1263, 1264, 1272, 1271, 1276, 1283, 1291 были выделены из ликвора больных СПИДом, тогда как шт. 1251 был выделен из крови пациента с онкогематологическим заболеванием. Среди природных изолятов С. neoformans - 4 выделены нами из проб помета голубей, собранных на чердаках жилых зданий г. Санкт-Петербурга в течение 20052008 гг. (ГП 1, ГП 2, ГП 3, ГП 4) и 1 штамм С. neoformans (РКПГ № 861), поступивший из коллекции США в 1967 г. и выделенный из помета голубей.

Для выделения патогенных видов криптококков из объектов окружающей среды были использованы элективные и селективные питательные среды: агар Сабуро с хлорамфениколом, агаризованная среда с Л-ДОФА, инозит агар, и агар Сабуро с хлорамфениколом и гентамицином.

Тип взаимодействия (симбиоз или антагонизм) природных изолятов С. neoformans с другими микроорганизмами in vitro определяли методом штриховых подсевов (Блинов Н.П., 1995). Для определения типов взаи-

модействия были выбраны микроорганизмы, выделенные из проб помета голубей: дрожжевые грибы С. albicans, Rhodotorula spp., и бактерии Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris.

Описание дрожжевых культур проводили через 72 часа после их выращивания на агаре Сабуро (рН 5,7) в термостате при +28°С и +37°С. Морфологию зрелых клеток (диаметр, толщина капсулы) изучали в нативных и тушевых препаратах в ходе 80-100 измерений в световом микроскопе Leica DM LB при увеличении хЮОО (программное обеспечение Leica IM 1000).

В лаборатории патоморфологии и цитологии микозов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина (при содействии д.б.н. Степановой А.А. и к.м.н. Синицкой И.А.), с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ), изучали клетки культур 4-х природных изолятов (ГП 1, ГП 2, ГП 3, ГП 4) С. neoformans через 3, 7 и 10 суток выращивания на агаре Сабуро при 37°С. Ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе Jem-100SX. Промеры клеточных компонентов проводили на 20-25 медианных срезах интактных зрелых клеток С. neoformans с помощью специальной измерительной шкалы. Кислые полисахариды выявляли по методу Тайса Л. и Барнетта Р. (1965), а также Гайер Г. (1974) с некоторыми модификациями.

Патоморфологические исследования кожи и подкожной клетчаки мышей, зараженных штаммом РКПГ Y 861, проводили на материале, фиксированном в 10% нейтральном формалине и залитом в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином-эозином и альциановым синим по Моури (Mowry R, 1958).

Изучение способности криптококка расти при повышенных температурах инкубации проводили в чашках Петри на агаре Сабуро при 28°, 37°, 39°, 40°, 41°, 42°, 43°С. Результаты учитывали на 3-й и 7-е сутки после посева.

Ассимиляцию углеводов природными и клиническими изолята-ми С. neoformans изучали с помощью коммерческой тест-системы «Auxacolor®2» (Bio-Rad, Франция).

Уреазную активность природных изолятов и клинических штаммов С. neoformans исследовали полуколичественным методом на среде Христенсе-на с мочевиной при температуре инкубации 28°С и 37°С в течение 3-х суток.

Фенолоксидазную активность природных изолятов и клинических штаммов С. neoformans изучали на среде с А-ДОФА при температуре инкубации 28°С и 37°С в течение 3-х суток.

Фосфолипазную активность криптококков определяли чашечным методом на плотной питательной среде с яичным желтком (Ottolenghi А., 1963). При учете результатов проводили измерение диаметра выросших колоний и диаметра зоны помутнения среды вокруг колонии гриба. Показатель фосфо-липазной активности (Pz), рассчитывали по отношению диаметра колонии гриба к диаметру зоны помутнения среды. Минимальные значения Pz соответствуют наибольшей фосфолипазной активности исследуемых культур.

Определение патогенности криптококков проводили на модели экспериментального криптококкоза при внутривенном введении беспородным белым мышам, самцам весом 18-20 г. Животным вводили по 0,5 мл взвеси патогена с концентрацией 107,106,10\ 104,103 клеток С. neoformans на мышь для штамма, каждую дозу испытывали на 10 мышах. Всего в эксперименте было использовано 1400 мышей. Количество погибших и выживших животных регистрировали ежедневно. Ретрокультуру С. neoformans, для изучения влияния пассирования через организм беспородных мышей, получали после высева из органов животных (почка, печень, легкое, головной мозг) на 7-е сутки после внутривенного введения дозы патогена 107 КОЕ/мл. После выделения и накопления чистой культуры проводили внутривенное заражение групп животных дозами 107, 106, 105, 104, 103 кл/мышь. В качестве количественной характеристики вирулентности различных штаммов криптококков была принята величина LD50. которую определяли для каждого штамма на 28 сутки эксперимента методом «пробитов».

Исследование чувствительности криптококков к флуконазолу и вори-коназолу проводили диско-диффузионным методом по протоколу CLSI М44А. Диаметр зон задержки роста грибов измеряли при помощи специализированной компьютерной программы посредством микробиологического анализатора «BIOMIC Vision». Интерпретацию категории чувствительности проводили согласно диаметру зоны задержки роста гриба по протоколу CLSI М44А.

Полученные в процессе исследования результаты обрабатывали на ЭВМ с помощью программной системы STATISTICA for Windows (версия 5.11 Лиц. №AXXR402C29502 3FA). При этом использовали преимущественно непараметрические методы и анализ выживаемости. Критерием статистической достоверности получаемых данных мы считали общепринятую в медицине величину р<0,05.

Результаты собственных исследований. Среди экологических ниш, свойственных для С. neoformans, известных к настоящему времени, основными являются помет голубей, почва, деревья.

Нами было исследовано 253 образца биоматериалов из возможных природных резервуаров С. neoformans в г. Санкт-Петербурге. В результате исследования было выделено в чистой культуре 4 изолята этого вида гриба из 124 проб помета голубей, отобранных на чердаках жилых зданий в Санкт-Петербурге (табл. 1).

Таблица 1

Распределение количества проб из возможных природных резервуаров С. neoformans и результаты микологического исследования

Объекты исследования Материал Количество проб Результаты микологического исследования

Птицы Содержимое кишечника мертвых птиц 63 Candida spp., Rhodotomla spp.

Помет голубей 124 Candida spp., Rhodotoruia spp., C. neoformans 4 изолята

Домашние животные (кошки, собаки) Мазки из зева и носа 47 Candida spp., Rhodotoruia spp., Malassezio SPP-

Почва Почва Листовойопад 18 Candida spp.

Итого: 253

В результате нашего исследования культуры криптококков удалось получить в 3,2% (доверительные границы 0,8% - 7,0%) от количества исследованных проб помета голубей, а обсемененность составила 200 - 300 КОЕ/г. Пробы помета голубей, полученные с крыш зданий (Казанский собор) были отрицательными в отношении С. neoformans. Эти данные соответствуют современным представлениям о наиболее вероятных положительных находках С. neoformans в закрытых локализациях в сравнении с открытыми из-за высокой чувствительности этого микромицета к воздействию ультра-фиолетового излучения (Hubalek Z., 1975; Idnurm А., 2005; Casadevall А., 2007). При исследовании проб почвы, не загрязненной пометом голубей в Санкт-Петербурге, грибы С. neoformans выделены не были. По данным других исследователей, пробы почвы, положительные на криптококк, составляют около 1 % (Kwon-Chung К., 1992). Домашние животные (кошки, собаки) могут выступать носителями патогенных криптококков на слизистых носовой и ротовой полости, равно как и описаны случаи криптококкоза у этих животных (Castella G., 2008). В нашем исследовании 47 мазков из зева и носа

домашних животных (кошки, собаки) патогенные виды криптококков выделены не были. Полученные при посевах виды дрожжевых грибов были идентифицированы как С. laurentii, Candida spp., Rhodotorula spp., Malassezia spp. В связи с этим, по-видимому, вероятность заражения криптококкозом людей от домашних животных в Санкт-Петербурге невелика.

Согласно последним исследованиям, места обитания С. neoformans, равно как С. gattii, могут быть связаны с деревьями. Оба вида имеют фермент лакказу, которая позволяет этим грибам расщеплять лигнин, таким образом давая им возможность использовать древесину деревьев как еще одну экологическую нишу (Williamson P.R., 1997). В нашем исследовании при анализе проб разлагающейся листвы деревьев (береза) криптококки обнаружены не были. Это соответствует данным исследований, проведенных в Турции. Так при мониторировании 61 эвкалиптового дерева (признанный источник криптококков в мире), в течение двух лет не было выделено ни одного изолята С. neoformans (Ates А., 2008). В то время как, например, в Индии при исследовании 311 деревьев 64 из них (20,5%) были положительны на С. neoformans или С. gattii (Randhawa Н., 2008).

Выделение патогенных видов криптококков из сильно контаминиро-ванных сопутствующей биотой объектов окружающей среды значительно облегчается при использовании селективных и элективных питательных сред. Так Staib F., было предложено использование питательной среды, содержащей экстракт семян масличного нута (Guizotia abyssinica), а другие авторы показали возможность успешного использования для выделения криптококков из природных источников синтетической среды, содержащей Л-ДОФА, и ампициллин (Paliwal D.K., 1978). В нашем исследовании попытки выделить С. neoformans на аналогичных средах (среда с Л-ДОФА, инозит агар, Сабуро агар с хлорамфениколом) были неудачны.

Чистые культуры С. neoformans были выделены на среде Сабуро агар с хлорамфениколом и гентамицином. При этом удалось получить полное подавление роста бактерий - контаминантов, в обилии содержащихся в помете голубей. Выявленная нами низкая частота (3,2%) выявления крипто-кокка в помете голубей в регионе Санкт-Петербурга (Северо-Запад России) и низкий уровень обсемененности жизнеспособными клетками в сравнении с данными зарубежных исследователей, частота выделения С. neoformans в исследованиях которых достигает более 30% (Castanon-Olivares L., 1994),

возможно, связаны с холодным климатом, с одной стороны, и ингибирую-щим действием микроорганизмов ассоциантов помета голубей, с другой. Мы изучили ассоциативные взаимодействия выделенных в результате исследования изолятов С. neoformans с основными микроорганизмами кон-таминантами помета голубей (С. albicans, Rhodotorula spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris), в результате чего был выявлен выраженный односторонний антагонизм в отношении природных изолятов С. neoformans при совместном культивировании их с Р. aeruginosa (табл. 2).

Таблица 2

Типы ассоциативных взаимодействий между природными изолятами С. neoformans и микроорганизмами контаминантами помета голубей

Вид гриба Росткриптококков Ростассоцианта Тип ассоциативного

ГП1 ГП ГП ГП4 взаимодействия

С. albicans + + + + + Нейтрализм

Rhodotorula spp. + + + + + Нейтрализм

Rhodotorula spp. , + + + + + Нейтрализм

S. aureus + + + + + нейтрализм

£ faecalis + + + + + нейтрализм

f. coli + + + + + нейтрализм

P. aeruginosa - - — - + односторонний антагонизм

/(.pneumoniae + + + + + нейтрализм

P. vulgaris + + + + + нейтрализм

Другие исследованные образцы биоматериалов (содержимое кишечника погибших птиц, мазки из зева и носа кошек и собак, почва, растительные остатки), оказались отрицательными на наличие патогенных видов крипто-кокков. Учитывая интенсивность заселения голубями крупных промышленных и культурных центров по всему миру, актуален вопрос о биологических особенностях природных изолятов данного патогена.

После 3-х суток выращивания, при 37°С на агаре Сабуро, колонии клинических штаммов были от 1 до 3-х мм в диаметре, в большинстве своем, слизистые, блестящие, возвышающиеся над поверхностью питательной среды, край колонии ровный, цвет варьировал от кремового до светло-корич-

невого. Колонии природных изолятов были блестящие, слабо слизистые, с ровным краем, светло-кремового цвета, за исключением белых колоний у изолята ГП 2.

В ходе микроскопического изучения нативных препаратов визуализировали округлые, почкующиеся, одиночные и в группах клетки криптокок-ков, с чётко очерченной клеточной стенкой и зернистым содержимым. Размеры клеток природных изолятов варьировали в пределах от 5,26±0,09 до 5,71±0,26 мкм, тогда как клинических штаммов - от 4,86±0,12 до 7,17±0Д6 мкм. Получены достоверные различия (р=0.027), характеризующие клетки природных изолятов как более мелкие, по сравнению с таковыми клинических штаммов (рис. 1).

7,0

6,6

е- 5,6

5,4

5.0

Природные изояяты Клинические штаммы Группы C.neoformans

1С iSld. Dev О tStl Егг. о Меап

Рис. 1. Сравнение диаметров клеток природных и клинических изолятов

С. neoformans

При микроскопии в тушевом препарате у всех изучаемых культур была выявлена капсула. При сравнении толщины капсулы природных и клинических изолятов С. neoformans выявлены достоверные различия (р=0,035). Как видно из рисунка 2, толщина капсулы у клеток природных изолятов была меньше (от 0,62±0,02 до 0,80±0,03 мкм), чем аналогичная у клинических штаммов (от 0,79±0,03 до 3,06±0,11 мкм).

Таким образом, клетки природных изолятов значительно меньше в размерах, чем клинических штаммов, что, возможно, способствует их более эффективному распространению и проникновению в трахео-альвеолярное пространство у человека и животных.

2,2

_ V6

¥ "

2 V2

Q. 1,0 й

0.8 0.6 0,4

Природные изоляты Клинические штаммы Группы (¡.neoformans

X iSId.Dw. □ »SID. Err. О Мэзп

Рис. 2. Сравнение природных и клинических изолятов С. neoformans по ширине капсулы

При электронно-микроскопическом исследовании морфогенеза клеток 4-х природных изолятов (ГП 1, ГП 2, ГП 3, ГП 4) С. neoformans, выращенных in vitro, отмечено сходство его у всех изученных культур. В растущих клетках изученных природных изолятов С. neoformans мы не обнаружили варьирования в числе, топографии, форме и ультраструктуре митохондрий, по сравнению с ранее изученными клиническими штаммами (Васильева Н. В., 2005; 2007), для которых были выявлены существенные штаммные различия по этим признакам.

Структура митохондрий в пределах как отдельно взятой растущей клетки, так и между клетками культур разных природных изолятов, была всегда постоянной, что резко отличало их от ранее изученных клинических штаммов (Васильева Н. В., 2005; 2007). Интересно отметить, что у последних отмечено варьирование в топографии, числе и ультраструктуре митохондрий, как между клетками культуры одного штамма, так и разных.

Толщина капсулы у зрелых клеток природных изолятов криптококка, выращенных in vitro, всегда была больше таковой клеточной стенки (в 2 раза у изолятов ГП 1, ГП 3, ГП 4, в 3 раза - ГП 2). У зрелых клеток преобладающего числа (62%) клинических штаммов капсулы более чем в 10 раз превышали толщину их клеточных стенок (Васильева Н.В., 2005). Эти данные согласуются с гипотезой об общебиологической защитной роли капсулы (Блинов Н. П., 1989).

При изучении морфогенеза клеток природных изолятов С. neoformans с помощью традиционных методов трансмиссионной электронной микроскопии (фиксация глутаральдегидом-осмием) установлено три типа строения полисахаридных капсул (1 тип - ГП 1, 2 тип - ГП 2, 3 тип - ГП 3, ГП 4, рис. 3). Зрелые клетки культур у 3-х (ГП 1, ГП 3, ГП 4) из 4-х изученных изолятов гриба имели сходный план ультратонкого строения капсул (наличие трех слоев: нижнего с микрофибриллами (слой 1 на схеме), среднего плотного (слой 2 на схеме) и наружного аморфного (слой 3 на схеме), между которыми имели место различия по толщине описанных слоев.

Рис. 3. Схема морфогенеза капсулы зрелых клеток С. neoformans после применения традиционных методов фиксации (а-в) и после гистохимического выявления кислых полисахаридов (г). Арабскими цифрами показаны слои капсулы, римскими обозначены изоляты (I - ГП 1, II - ГП 2, III - ГП 3, IV - ГП 4). а - дочерняя почка, б - растущая, в, г - зрелые клетки гриба. Мф - микрофибриллы; ПК - полисахаридная капсула

При применении метода гистохимического окрашивания кислых полисахаридов, входящих в состав капсулы клеток природных изолятов крипто-кокка, мы выявили четыре типа строения полисахаридной капсулы у зрелых клеток природных изолятов гриба (рис. Зг). Наши исследования показывают, что при ультраструктурной характеристике капсулы криптококков целесообразно одновременное использование этих двух методов просвечивающей электронной микроскопии.

При исследовании вирулентности все природные изоляты проявили свойства слабопатогенных: LD 50 на 28-е сутки после заражения составила 1х106-1х107 КОЕ/мл. Пассирование через организм беспородных мышей не изменило патогенности природного изолята ГП 3. Эти сведения согласуются с данными зарубежных исследователей, в работе которых даже трехкратное пассирование через организм мышей не увеличивало патогенности изначально слабо вирулентных природных изолятов С. neoformans (Litvintseva А. 2009).

Среди исследованных клинических изолятов четыре штамма были сильнопатогенными для белых беспородных мышей (LD 50 1х102-1х103 КОЕ/ мл), четыре штамма со средней вирулентностью (LD 50 1х104-1х105 КОЕ/ мл) и два штамма вошли в группу слабопатогенных (LD 50 1х10б КОЕ/мл). Распределение клинических штаммов С. neoformans по группам вирулентности представлено на рисунке 4.

0,9

ор

0,7

ь 05

S 0S

О)

S ОД

1 03

CQ 02

0.1

-0,1

......

.............Н...........г-

:=üii

V-

....."Ч-

15 20

Время

— Груша I

— Груш 2 ..... Группа 3

Рис. 4. Распределение выживаемости мышей в зависимости от групп патогенности клинических штаммов С. neoformans

При сравнении выживаемости мышей, зараженных природными и клиническими изолятами С. neoformans получены достоверные различия (р = 0.0002) между этими двумя группами криптококков. Выживаемость мышей, зараженных С. neoformans, изолятами от больных, была значительно ниже, чем выживаемость мышей, зараженных изолятами из помета голубей (рис. 5).

1.0

0.9

l 0,3

Л 0.7

0 0.8

г~> ПК

1 0,4

« 0.3

0.2

0.1

0 5 10 15 20 25 30 35 ..... ПРИР

Time

Рис. 5. Выживаемость мышей, зараженных природными изолятами и клиническими

штаммами С. neoformans

■При исследовании вирулентности штамма С. neoformans РКПГ Y 861, на сроках позднее 60 суток после внутривенного введения, отмечена троп-ность к коже и подкожной клетчатке у беспородных мышей, с явлениями некроза тканей и накоплением возбудителя в подкожной клетчатке. К концу эксперимента (58 суток после заражения) гибель мышей отмечена в группах 106 (60%) и 107 (80%). В течение эксперимента с 40-х суток после заражения у животных на высоких дозах (106,107) наблюдали поражения кожи в области носа в виде экзофитных разрастаний с явлениями некроза, прикрытых корками. На более поздних сроках подобные поражения проявлялись у животных, зараженных более низкими концентрациями клеток крипотококка (105). У животных были взяты ткани из очагов поражения для гистологического исследования. При патоморфологическом исследовании пораженных участков было выявлено массовое поражение кожи и подкожной клетчатки, проявляющееся в образовании крупных очагов лизиса в подкожной клетчатке, заполненных возбудителем. Характерным был полиморфизм гриба -от мелких бескапсульных форм (2-3 мкм) до крупных капсулообразующих клеток, интенсивно воспринимающих окраску альциановым синим. Неожиданным оказалось внедрение и размножение С. neoformans внутри пласта эпидермиса (рис. 6).

Рис. б. Гистологическая картина поражения кожи и подкожной клетчатки у мыши, зараженной штаммом С. neoformans РКПГ Y 861, окр. по Моури, х 1000.

Стрелками показаны клетки гриба

Известно, что наряду со способностью к капсулообразованию важнейшими факторами патогенности криптококков является способность расти и размножаться при 37°С (в отличие от сапротрофов, выживающих при более низких температурных показателях) и энзиматическая активность фосфолипазы, фенолоксидазы и уреазы (Сох G., 2001; Eisenman Н., 2007; Sanchez А., 2008).

Способность криптококков сохранять жизнеспособность при температурах выше 37°С является важной частью жизненного цикла С. neoformans. Это свойство позволяет им выживать в кишечнике птиц, температура которых, в частности голубей, составляет 39-43°С. При исследовании устойчивости к повышенным температурам криптококков серотипов А и D выявили, что С. neoformans var. grubii (серотип А) более устойчив к воздействию высокой температуры, а природные изоляты криптококков менее, чем клинические, устойчивы к действию высоких температур (Martinez L.,2001; Perfect ]., 2006). В нашем исследовании криптококки подвергали культивированию при температурах 37°, 40°, 41°, 42° и 43°С. Все изоляты из помета голубей проявили способность к росту на третьи сутки инкубации на агаре Сабуро при 40°С, а изолят ГП 2 на третьи сутки проявлял рост при 41°С. Исследованные культуры криптококков от пациентов отличались большей устойчивостью к действию высоких температур инкубации, штаммы РКПГ Y 1257 и РКПГ Y1272 проявили способность к росту при температуре

инкубации +42°С. При температуре +43°С к пятым суткам инкубации рост изучаемых культур получить не удалось (табл. 3).

Таблица 3

Влияние температуры на рост природных и клинических изолятов С. neoformans

№ п/п № штамма РКПГ 37°С 40°С 4ГС 42°С 43 °С

1 PKnTY 1251 +++ +++ - - -

2 РКПГY1257 +++ ++ ++ + -

3 РКПГY1262 +++ +++ ++ - -

4 РКПГY1263 +++ +++ - - -

5 РКПГY1264 +++ +++ - - -

6 РКПГ Y1271 +++ +++ - - -

7 РКПГ Y1272 +++ +++ ++ ++ -

8 РКПГV1276 +++ +++ - - -

9 РКПГУ1283 +++ +++ - - -

10 РКПГУ1291 +++ +++ + - -

11 ГП1 +++ +++ - - -

12 ГП2 +++ +++ + - -

13 ГПЗ +++ +++ - - -

14 ГП4 +++ +++ - - - ■

15 РКПГУ861 ++ - - - -

При изучении ферментативной активности природных изолятов С. neoformans выявлена способность этих культур к разложению мочевины на среде Христенсена при 28°С и 37°С, причем при температуре инкубации 37°С уреазная активность в обеих группах изолятов была выше, чем при 28°С (рис. 8). При сравнении уреазной активности природных и клинических изолятов выявлены достоверные различия (р<0.05) в первые и вторые сутки инкубации при 28°С. Клинические штаммы С. neoformans более активно разлагали мочевину при 28°С.

юо% ■

90% ■ 80% • 707. ■ 60% • 60% ■ 40% -30% ■ 20% -10% ■ 0%

J1-

teüi I,. ■

Пр. Кл.

1-е w-ylKH

Пр. Кл.

2-е сугки

Пр. Кл.

3-й сути!

□ + И -fr-t

Рис. 8. Уреазная активность природных изолятов и клинических штаммов С. neoformans при 28°С

Фенолоксидазную активность природных и клинических изолятов С. neoformans изучали на синтетической среде с Л-ДОФА. Способность к меланинообразованию проявили все изученные культуры криптококков, а синтез меланина при 28°С протекал более активно, в сравнении с таковым при температуре инкубации 37°С (рис. 9). При сравнении фенолоксидазной активности природных и клинических изолятов С. neoformans достоверных различий в продукции фермента выявлено не было.

100 80 60 40 20 0

28С 37С 28С 37С 28С 37С 1 -е сутки 2-е сугки 3-й еужг

G+ + Щ + + +

Рис. 9. Фенолоксидазная активность природных изолятов С. neoformans при 28°С и 37°С, в течение 3-х суток

Изучение фосфолипазной активности природных изолятов С. neoformans

на среде с яичным желтком выявило способность всех природных изолятов

С. neoformans образовывать зону помутнения среды вокруг колонии гриба.

Показатель Pz для этой группы был в пределах 0,51±0,03 - 0,60±0,03. При сравнении с активностью этого фермента у клинических изолятов (Pz от 0,48±0,09 до 0,66+0,10) достоверных различий не выявлено. Несмотря на то, что установлена взаимосвязь между патогенностью криптококков и активностью фосфолипазы (Сох G., 2001), мы не выявили корреляции между уровнем продукции фосфолипазы и уровнем вирулентности как у природных, так и у клинических изолятов С. neoformans. Ряд авторов подтверждает этот факт (Murphy J., 1998).

Эти факты и полученные нами данные об активности уреазы и фенолок-сидазы усиливают предположение о том, что наличие этих факторов, а не их количественные показатели, определяют уровень вирулентности для С. neoformans, равно как и еще неизвестные факторы вирулентности.

Исследование нами молекулярно-генетического профиля культур природных и клинических изолятов С. neoformans методом RAPD анализа с праймером JWFF (S'-GGTCCGTGTTTCAAGACG-S') позволило выявить наличие у природных изолятов С. neoformans нуклеотидных последовательностей (600-700 п.н.), отсутствующих у культур, выделенных от пациентов с криптококкозом в Санкт-Петербурге. Профили же клинических изолятов оказались генетически не идентичны, а выявленный полиморфизм их генов указывает на наличие как минимум трех внутривидовых генотипов.

При изучении чувствительности к флуконазолу и вориконазолу диско-диффузионным методом по протоколу CLSI М 44-А, все природные изо-ляты С. neoformans оказались чувствительны к флуконазолу и вориконазолу, тогда как 30% изученных клинических штаммов имели промежуточную чувствительность к флуконазолу, а один штамм (10%) был резистентен к флуконазолу и промежуточно чувствителен к вориконазолу. При сравнении диаметров зон задержки роста грибов получены достоверные различия между природными и клиническими изолятами С. neoformans (р = 0,001). Природные изоляты С. neoformans были более чувствительны к флуконазолу и вориконазолу (рис. 10).

Природные изоляты Клинические штаммы

Группы С.neoformans

П FLU с. VOR

Рис. 10. Чувствительность природных и клинических изолятов С. neoformans к флуконазолу и вориконазолу

ВЫВОДЫ

1. Основным природным резервуаром С. neoformans в г. Санкт-Петербурге являются отложения помета голубей, частота выделения составила 3,2%.

2. Низкая частота выделения С. neoformans на среде с хлорамфенико-лом обусловлена ассоциативным взаимодействием микроорганизмов по типу одностороннего антагонизма между С. neoformans и Pseudomonas aeruginosa.

3. Морфогенез клеток природных изолятов С. neoformans происходит однотипно, но существуют различия в ультраструктурной организации капсулы.

4. Природные изоляты С. neoformans, выделенные в Санкт-Петербурге, являются слабовирулентными, но обладают основными факторами патогенности: способностью к росту при 37°С и капсулообразова-нию, синтезу меланина, уреазной и фосфолипазной активностью.

5. Природные изоляты С. neoformans отличаются от исследованных клинических штаммов молекулярно-генетическим профилем. Полиморфизм генов клинических штаммов указывает на наличие у них, как минимум, трех внутривидовых генотипов.

6. Природные изоляты С. neoformans чувствительны к флуконазолу и вориконазолу; среди клинических штаммов 60% чувствительны к флуконазолу, а 10% имели промежуточную чувствительность к вориконазолу.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Органам санитарно-эпидемиологического надзора рекомендуется проведение противоэпидемических мероприятий в местах отложения помета голубей.

2. Персоналу, проводящему работы в местах накопления помета голубей, рекомендуется использование средств индивидуальной защиты: респираторы, защитная одежда и головные уборы.

3. Лицам с нарушениями в системе иммунитета следует избегать контакта с птицами и продуктами их жизнедеятельности.

4. В качестве питательной среды для выделения криптококков из объектов окружающей среды, следует использовать агар Сабуро с хло-рамфениколом и гентамицином.

5. При изучении ультраструктуры капсулы криптококков целесообразно сочетать два метода электронной микроскопии: традиционный (глютаральдегид-осмий), и гистохимический (докрашивание альциа-новым синим).

СПИСОК РАБОТ/ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Босак И.А. Взаимосвязь чувствительности к флуконазолу и биологических особенностей клинических изолятов Cryptococcus neoformans / H.B. Васильева, И.В. Выборнова, Т.С. Богомолова, Г.А. Чилина, М.А. Михайлова, И.А. Босак // В сб. «Успехи медицинской микологии». (Материалы четвертого Всероссийского конгресса по медицинской микологии).- T.VII, гл. 2. - С.163-164. - М.: Национальная Академия микологии. - 2006.

2. Босак И.А. Прошлое и настоящее Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Vuillemin (1901) как объекта изучения и потенциально грозного патогена для человека / Н.П. Блинов, И.А. Босак // Проблемы медицинской микологии. 2006. - Т.8, №4. - С. 47-53.

3. Bosak I.A. Cryptococcosis in HIV-infected patients in Saint-Petersburg / N.V. Vasilyeva, T.S. Bogomolova, I.V. Vybornova, I.A. Bosak // J. of Chemotherapy.-2007.- Vol. 19, Suppl. 3.- P. 82.

4. Босак И.А. Экспериментальный криптококкоз с вовлечением кожи и подкожной клетчатки / Н.В. Васильева, P.A. Аравийский, И.А. Босак // Проблемы медицинской микологии,- 2007.- Т.9, №2.- С. 47.

5. Босак И.А. Факторы патогенности Cryptococcus neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза / Н.В. Васильева, Т.С. Богомолова, И.В. Выборнова, И.А. Босак Ц В сб. «Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». -2007.- Т.2.- С. 221.

6. Bosak I.A. Cryptococcosis in Saint Petersburg, Russia, 1990-2008 / N.V. Vasilyeva, N.N. Klimko, T.S. Bogomolova, I.A. Bosak, L.V. Filipova // Abstracts of the 17th Congress of the International Society for Human and Animal Mycology, Tokyo, Japan, May 25-29,2009, P. 472.

7. Bosak I.A. Virulence for mice and susceptibility to fluconasole of Cryptococcus neoformans clinical isolates / T.S. Bogomolova, N.V. Vasilyeva, I.A. Bosak, I.V. Vybornova // 7th International Conference on Cryptococcus and Cryptococcosis. Nagasaki, Japan, Sept. 11-14, 2009, P. 105.

8. Босак И.А Характеристика изолятов Cryptococcus neoformans из окружающей среды г. Санкт-Петербурга / И.А. Босак // Проблемы медицинской микологии. - 2009. - Т.П.- №2 - С. 59.

9. Босак И.А. Особенности морфогенеза штаммов Cryptococcus neoformans, выделенных из окружающей среды / A.A. Степанова, И.А. Босак, И.А. Синицкая // Проблемы медицинской микологии. - 2009. -Т.П.-№2,- С. 113.

10. Босак И.А. Выделение и характеристика изолятов Cryptococcus neoformans из окружающей среды г. Санкт-Петербурга / И.А. Босак // Проблемы медицинской микологии. - 2009. - Т.П. - №3. - С. 43-46.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Босак, Илья Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Возбудители криптококкоза. Естественные экониши криптококков.

1.1 История открытия и таксономия возбудителей криптококкоза

1.2. Серотипы и молекулярные типы С. neoformans и С. gattii

1.3. Основные клинические варианты криптококкоза и факторы риска

1.4. Экологические ниши С. neoformans и С. gattii

1.5. Методы выделения С. neoformans и С. gattii из окружающей среды

Глава И. Морфо-биологические особенности клинических и природных изолятов С. neoformans

2.1. Морфология и ультраструктура

2.2. Факторы патогенности С. neoformans

2.3. Вирулентность изолятов С. neoformans на экспериментальных моделях

2.4. Чувствительность к антимикотическим препаратам

2.5. Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими микроорганизмами

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава III. Объекты и методы исследования

3.1 Объекты исследования

3.2 Методы исследования

3.2.1 Среды для выделения криптококков из окружающей среды

3.2.2 Морфология культур С. neoformans

3.2.3 Исследование ультраструктуры

3.2.4 Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими микромицетами и бактериями in vitro

3.2.4.1 Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими грибами in vitro

3.2.4.2 Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с бактериями in vitro

3.2.5 Ассимиляция источников углерода и азота культурами криптококков

3.2.6 Изучение патогенности криптококков в опытах на лабораторных животных

3.2.7 Способность клеток С. neoformans расти при повышенных температурах

3.2.8 Определение уреазной активности

3.2.9 Определение фенолоксидазной активности.

3.2.10 Определение внеклеточной фосфолипазной активности

3.2.11 Изучение молекулярно-генетического профиля природных и клинических изолятов С. neoformans методом RAPD-анализа

3.2.12 Исследование чувствительности криптококков к флуконазолу и вориконазолу

3.3 Статистическая обработка результатов

Глава IV МОРФОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРИПТОКОККОВ

4.1 Результаты микологического исследования биопроб из объектов окружающей среды

4.2 Изучение ассоциативных взаимодействий природных изолятов С. neoformans другими микроорганизмами

4.2.1 Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с другими микромицетами in vitro

4.2.2 Ассоциативные взаимодействия С. neoformans с бактериями in.vitro

4.3 Происхождение клинических штаммов криптококков

4.4 Морфологическая характеристика культур природных и клинических изолятов С. neoformans, выращенных на агаре Сабуро

4.5 Ультраструктура клеток природных изолятов и штамма С. neoformans, выращенных in vitro

4.5.1 Размеры и форма клеток

4.5.2 Ультраструктура дифференцирующихся клеток

4.5.3 Ультраструктура стенки и капсулы зрелых клеток изолятов

С. neoformans

4.6 Ассимиляция различных источников углерода и азота

4.7 Определение патогенности криптококков при внутривенном введении мышам

Глава V. ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ С. NEOFORMANS

5.1 Исследование способности к росту при повышенных температурах

5.2 Уреазная активность природных и клинических изолятов

С. neoformans

5.3 Образование меланина природными и клиническими изолятами

С. neoformans

5.4 Фосфолипазная активность природных и клинических изолятов

С. neoformans

5.5 Исследование молекулярно-генетического профиля культур природных и клинических изолятов С. neoformans методом RAPD анализа

5.6 Чувствительность изолятов криптококков к флуконазолу и вориконазолу

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика природных и клинических изолятов Cruptococcus neoformans"

Актуальность темы: Базидиомицетовые капсулированные дрожжи Cryptococcus neoformans и С. gattii вызывают поражение центральной нервной системы у иммунокомпрометированных и реже у иммунокомпетентных лиц. Частота заболевания криптококкозом составляет 0,2-0,9 случаев на 100 ООО населения (Murphy W.J., 2009г). По данным Центра по контролю за заболеваниями (CDC, США), в мире ежегодно регистрируют 1 млн. случаев криптококкоза у ВИЧ-инфицированных больных, из них 680 000 погибают (Perfect J., 2008). Данные о частоте криптококкоза в России отсутствуют. В последние годы отмечен рост числа зарегистрированных случаев криптококкоза в Санкт-Петербурге (Н.В. Васильева, 2005; Н.В. Васильева и др. 2009).

С. neoformans наиболее часто выявляют в разных странах мира в субстратах, обильно загрязненных пометом птиц, в основном - голубей, но природными биосубстратами, из которых может быть выделен С. neoformans, в различных условиях могут выступать: почва, гниющая древесина, фрукты, деревья, домашняя пыль, слизистые оболочки рта и полости носа домашних животных (кошек, собак, коров и др.) (Viviani М.А., 2009). Экология С. neoformans относительно хорошо изучена применительно к странам и территориям с умеренным, субтропическим и тропическим климатом. Чего нельзя сказать о регионах с прохладным (холодным) климатом - сведения о таких исследованиях весьма ограничены.

В отличие от С. neoformans, С. gattii не был найден в широком спектре субстратов из окружающей среды. Недавно полагали, что С. gattii распространен только в тропических и субтропических климатических зонах и его экологическая ниша связана с двумя видами эвкалиптов (Eucaliptus camaldulensis и Е. tereticornis). Однако представления об экологии патогенных криптококков изменились после вспышки криптококкоза на о. Ванкувер (Канада), обусловленного С. gattii, обнаруженного в больших количествах на различных видах деревьев и в воздухе (Bartlet К., 2005). Позднее С. gattii выделяли от пациентов с криптококкозом и от животных в штатах Вашингтон и Орегон (США), а так же в Европе (Hagen F., 2009). Тем не менее вопрос об истинных природных источниках криптококковой инфекции остается открытым. Поэтому, новые экологические ниши С. neoformans и С. gattii в настоящее время являются объектом исследования многих авторов за рубежом, а сведения о природных резервуарах криптококковой инфекции в России по-прежнему отсутствуют, равно как и сведения о популяционной структуре природных изолятов в России. Наряду с этим, несмотря на существенный прогресс в изучении патогенных криптококков молекулярно-генетическими» методами в последние пять лет, следует признать,' что существует значительный дисбаланс между количеством исследованием клинических и природных изолятов С. neoformans со значительным их превалированием в сторону клинических (Kwon-Chung К J., 2000; Meyer W., 2003; Litvintseva A.P., 2009).

В доступной нам литературе данные о морфогенезе клеток С. neoformans, выделенных из окружающей среды и выращенных in vitro, также отсутствовали.

В специальной литературе сведения о вирулентности природных изолятов С. neoformans противоречивые - от полного отрицания вирулентности до выявления высокого потенциала патогенности (Fraser J.A., 2005; Pal М., 2005; Litvintseva А.Р., 2009).

Цель исследования. Выявить и изучить биологические особенности изолятов С. neoformans, выделенных из окружающей среды и от больных криптококкозом людей. Задачи исследования.

1. Выявить возможные природные резервуары С. neoformans в г. Санкт-Петербурге.

3. Исследовать особенности морфогенеза клеток культур -природных изолятов.

5. Исследовать факторы патогенности (лакказу, фосфолипазу, уреазу, способность к росту при 37°С и капсулообразование) у природных и клинических изолятов С. neoformans, а так же определить их чувствительность к флуконазолу и вориконазолу.

Научная новизна исследования.

Впервые: выявлен природный резервуар С. neoformans в г. Санкт-Петербурге; изучены морфологические свойства природных изолятов С. neoformans Санкт-Петербурга, в том числе, ультраструктурные аспекты их морфогенеза, в сравнении с клиническими изолятами, выделенными в Санкт-Петербурге в 2005-2008 г.г.; проведено сравнение активности внеклеточных ферментов (уреаза, фосфолипаза, фенолоксидаза) изолятов, выделенных из окружающей среды и от пациентов с криптококкозом в г. Санкт-Петербурге; исследованы ассоциативные взаимодействия криптококков, выделенных из помета голубей, с другими микроорганизмами, выделенными из этой экологической ниши в Санкт-Петербурге; определены профили вирулентности природных штаммов С. neoformans, выделенных из экониш г. Санкт-Петербурга; проведен сравнительный молекулярно-генетический анализ природных и клинических изолятов С. neoformans.

Практическая значимость.

Наличие патогенного криптококка в отложениях помета голубей на чердаках жилых зданий диктует необходимость проведения санитарно-эпидемиологических мероприятий в местах гнездования птиц.

Данные о резервуарах С. neoformans в г. Санкт-Петербурге следует учитывать в профилактических рекомендациях для лиц, относимых к группе риска развития криптококкоза, которым целесообразно избегать контакта с пометом птиц и местами гнездования голубей.

Данные об избирательном росте С. neoformans на дифференциально-диагностических питательных средах необходимо учитывать при выборе сред для выделения криптококков из объектов окружающей среды.

Положения выносимые на защиту.

1. Основным природным резервуаром С. neoformans в Санкт-Петербурге является помет голубей. Частота выделения культур криптококков из отложений помета голубей на чердаках жилых зданий составляет 3,2%.

2. Характер ассоциативных взаимоотношений криптококков с другими микроорганизмами, выделенными из помета голубей определяющий фактор при оценке природной экониши возбудителей криптококковой инфекции.

3. Морфогенез клеток природных изолятов С. neoformans протекает однотипно. В тоже время они различаются между собой по ультраструктурной организации полисахаридных капсул.

Апробация диссертационного материала. Материалы диссертации доложены на 4-ом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2006), на 9-ом съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), на 3-ем конгрессе «Тенденции в медицинской микологии» (Италия, 2007), на 7-ой международной конференции по криптококку и криптококкозу (Япония, 2008), на 17-ом конгрессе международного общества по медицинской и ветеринарной микологии (Япония, 2009), на ежегодной научно—практической конференции по медицинской микологии «XXII Кашкинские чтения» (г. Санкт-Петербург, Россия, 2009), на 4-ом конгрессе «Тенденции в медицинской микологии» (Греция, 2009).

Публикации по материалам исследования. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах рецензируемых ВАК.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Автор планировал и выполнял основные экспериментальные исследования по проблеме, участвовал в проведении электронно-микроскопических и молекулярно-генетических исследований природных и клинических изолятов С. neoformans. В постановке и решении конкретных задач, организации и выполнении экспериментальных исследований автору принадлежит ведущая роль. Доля участия автора в сборе проб из окружающей среды и выделении штаммов криптококков - 100%; в разработке и исполнении программ разделов исследований - 90%; доля участия в обработке данных - 100%; в анализе и обобщении экспериментального материала - 100%. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 186 источников, и приложений. Текст диссертации иллюстрирован 19 таблицами, 3 схемами, 35 рисунками и микрофотографиями.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Босак, Илья Алексеевич

ВЫВОДЫ

1. Основным природным резервуаром С. neoformans в г. Санкт-Петербурге являются отложения помета голубей, частота выделения составила (3,2%).

2. Низкая частота выделения С. neoformans на среде с хлорамфениколом обусловлена ассоциативным взаимодействием микроорганизмов по типу одностороннего антагонизма между С. neoformans и Pseudomonas aeruginosa.

4. Природные изоляты С. neoformans, выделенные в Санкт-Петербурге, являются слабовирулентными, но обладают основными факторами патогенности: способностью к росту при 37°С и капсулообразованию, синтезу меланина, уреазной и фосфолипазной активностью.

6. Природные изоляты С. neoformans чувствительны к флуконазолу и вориконазолу; среди клинических штаммов 60% чувствительны к флуконазолу, 30% промежуточно чувствительны к флуконазолу, а 10% резистентны к флуконазолу и промежуточно чувствительны к вориконазолу.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

2. Персоналу, при проведении работ в местах накопления помета голубей, рекомендуется использование средств индивидуальной защиты: респираторы, защитная одежда и головные уборы.

3. Лицам с нарушениями в системе иммунитета избегать контакта с птицами и продуктами их жизнедеятельности.

4. В качестве питательной среды, для выделения криптококков из объектов окружающей среды, следует использовать агар Сабуро с хлорамфениколом и гентамицином.

5. При изучении ультраструктуры криптококков целесообразно использовать два метода электронной микроскопии, как традиционный (глютаральдегид, осмий), так и после гистохимического окрашивания полисахаридной капсулы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Босак, Илья Алексеевич, Санкт-Петербург

1. Боровиков В.П., Боровиков И.П. STATISTICA — Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. /— М.: «Филин»- 1997.

2. Боровиков В. П., STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере. Для профессионалов / — СПб., "Питер" — 2001. — 656 с.

3. Васильева Н. В. Факторы патогенности Cryptococcus neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза: Автореф. докт. дисс 2005.— 42 с.

4. Васильева Н. В., Степанова А. А., Синицкая И. А., Семенов В. В. Сравнительное изучение ультраструктуры штаммов Cryptococcus neoformans разной вирулентности // Тез. докл. 8-х Кашкинских чтений. — 2005. с. 99.

5. Васильева Н. В., Степанова А. А., Синицкая И. А. Ультраструктура капсул зрелых клеток штаммов Cryptococcus neoformans in vitro in vivo // Журн. Пробл. мед. микологии. — 2006. Т. 8, N2. - с. 25.

6. Васильева Н. В., Степанова А. А., Синицкая И. А. Особенности морфогенеза клеток Cryptococcus neoformans в зависимости от вирулентности штаммов // Журн. Пробл. мед. микологии. 2007. - Т. 9, №2. - с. 23-30.

7. Васильева Н. В., Степанова А. А., Синицкая И. А. Электронно-микроскопическое изучение биологии развития клеток слабо и сильно вирулентного штаммов Cryptococcus neoformans // Журн. Проблемы мед. микологии. 2007. - Т. 9, №2. - 47-48.

8. Гайер Г. Электронная гистохимия. / Изд. «Мир»: Москва. 1974. - 488 с.

9. Блинов Н.П. Основы биотехнологии./ Изд «Наука» . - 1995. - 600 с.

10. Блинов Н.П. Патогенные дрожжеподобные организмы./ Л.: Медицина, 1964. - 383 с.

11. Камалетдинова Ф. И., Васильев А. Б. Цитология дискомицетов./ -Алма-Ата: Наука. 1982. - 176 с.

12. Реброва О.В. Статистический анализ медицинских данных с помощью пакета программ «Статистика»./ Москва, Медиа Сфера, 2002 - С.380.

13. Тилева Е.А. Ферментативные и патогенные свойства криптококков — изолятов от больных и сапробионтов: Автореф. канд. дисс- 2003 14 с.

14. Acosta В., Alvarez .- P., Deniz S., et al. Cryptococcal lymphadenitis in a dog. // Rev Iberoam Micol.- 1999.- V. 16 № 3 .- P. 155-157.

15. Al-Doory Y. The ultrastructure of Cryptococcus neoformans // Sabouraudia. 1971.-V. 9.-P. 113-6.

16. Anaissie E. J., Clinical Mycology// Elsevier Science 2009: 700.

17. Baharaeen S., Vishniac H. S. A fixation methods for visualization of yeast ultrastructure in the electron microscope // Mycopathologia. 1982. - V. 77, №1. -P. 19-22.

18. Baltazar Lde M., Ribeiro M.A. First isolation of Cryptococcus gattii from the environment in the State of Espirito Santo.// Rev Soc Bras Med Tro.- P.— 2008 V. 41 № 5.- P. 449-453.

19. Bemis D.A., Krahwinkel D.J., Kwon-Chung K.J., et al. Temperature-sensitive strain of Cryptococcus neoformans producing hyphal elements in a feline nasal granuloma.// J Clin Microbiol. -2000- V. 38 № 2 .- P. 926-928.

20. Bose I., Reese A. J., Ory J. J., Janbon G. A yeast under cover: the capsule of Cryptococcus neoformans // Eukaryotic Cell. 2003. - V. 2, N 4. - P. 655-663.

21. Brandt ME, Pfaller MA, Hajjeh RA, et al. Trends in antifungal drug susceptibility of Cryptococcus neoformans isolates in the United States: 1992 to 1994 and 1996 to 1998. // Antimicrob Agents Chemother 2001- V. 45 № 11 .P. 3065-3069.

22. Buchanan K.L., Murphy J.W. What makes Cryptococcus neoformans a pathogen? //Emerg Infect Dis.- 1998.- V. 4 № 1 .- P. 71-83.

23. Bui Т., Lin X., Malik R., et al. Isolates of Cryptococcus neoformans from infected animals reveal genetic exchange in unisexual, alpha mating type populations.//Eukaryot Cell.-2008.-V. 7 № 10 .-P. 1771-1780.

24. Bulmer G. S. Twenty-five years with Cryptococcus neoformans // Mycopathology. 1990. - V. 109. - P. 111-122.25: Bulmer G.S., Sans M.D., Gunn C.M. Cryptococcus neoformans. I. Nonencapsulated mutants.// J Bacteriol. 1967. V. 94 № 5. - P. 1475-1479.

25. Cabanes FJ. Mycoses and zoonoses: Cryptococcus sp. — P.// Rev Iberoam Micol.-2008 V. 25 № 1 :Sl-3.

26. Cabral Passoni L.F. Wood, animals and human beings as reservoirs for human Cryptococcus neoformans infection.// Rev Iberoam Micol. — 1999. — V. 16 №2.-P. 77-81.

27. Caicedo L.D., Alvarez M.I., Delgado M., et al. Cryptococcus neoformans in bird excreta in the city zoo of Cali, Colombia.// Mycopathologia 1999 — V. 147 №3 .-P. 121-124

28. Calista D., Grosso C. Cutaneous cryptococcosis of the penis. // Dermatol Online J.-2008.-V. 15; 14 №7.-P. 9.

29. Campbell L.T., Fraser J.A., Nichols C.B., et al. Clinical and environmental isolates of Cryptococcus gattii from Australia that retain sexual fecundity.// Eukaryot Cell.-2005.-V. 4'№ 8 .-P. 1410-1419.

30. Casadevall A., Perfect J. Cryptococcus neoformans // ASM Press, Washington. DC 1998.

31. Castella G., Abarca M.L., Cabanes F.J. Cryptococcosis and pets. // Rev Iberoam Micol. -2008. V. 25 № 1. - P. 19-24.

32. Chakrabarti A., Jatana M., Kumar .— P., et al. Isolation of Cryptococcus neoformans var. gattii from Eucalyptus camaldulensis in India. // J Clin Microbiol. 1997. -V. 35 № 12. - P. 3340-3342.

33. Chang Y.C., Kwon-Chung K.J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence.// Mol Cell Biol — 1994.- V. 14 № 7 .- P. 4912-4919.

34. Chee H.Y., Lee K.B. Isolation of Cryptococcus neoformans var. grubii № serotype A from pigeon droppings in Seoul, Korea. // J Microbiol. 2005. — V. 43 №5.-P. 469-472.

35. Chen L.C., Blank E.S., Casadevall A. Extracellular proteinase activity of Cryptococcus neoformans.// Clin Diagn Lab Immunol 1996,- V. 3 № 5 .— P. 570-574.

36. Chen S.C., Wright L.C., Muller M., et al. Identification of extracellular phospholipase B, lysophospholipase, and acyltransferase produced by Cryptococcus neoformans.// Infect Immun. -1997. V. 65 № 2. - P. 405-411.

37. Cherniak R., Sundstrom J.B. Polysaccharide antigens of the capsule of Cryptococcus neoformans. //Infect Immun. -1994. V. 62 № 5. - P. 1507-1512.

38. Cox G.M., Casadevall A., Perfect J.R. et al. Urease as a virulence factor in experimental cryptococcosis. //Infect Immun. -2000. V. 68 № 2. - P. 443-448.

39. Datta K., Bartlett K.H., Baer R., et al. Cryptococcus gattii Working Group of the Pacific Northwest. Spread of Cryptococcus gattii into Pacific Northwest region of the United States.// Emerg Infect Dis.- 2009.- V. 15 № 8 .- P. 1185— 1191.

40. Davel G, Abrantes R, Brudny M, et al. 1st environmental isolation of Cryptococcus neoformans var. gattii in Argentina.// Rev Argent Microbiol-2003 .-V. 35 №2.-P. 110-112.

41. De Hoog G. Atlas of clinical fungi 2-nd edition.// Centraalbureau voor Schimmelcultures.-2000.-P. 139

42. Dinato S.L., Dinato M.M., Nakanishi C.P., et al. Disseminated cutaneous cryptococcosis in a patient with AIDS.// Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2006-V. 48 №6.-P. 353-358.

43. Dromer F, Mathoulin S, Dupont B, Laporte A. Epidemiology of cryptococcosis in France: a 9-year survey № 1985-1993. French Cryptococcosis Study Grou. P. //Clin Infect Dis. - 1996. - V. 23 № 1. - P. 82-90.

44. Duncan C., Stephen C., Campbell J., et al. Cryptococcus gattii in wildlife of Vancouver Island, British Columbia, Canada.// J Wildl Dis. -2006,- V. 42 № 1 .-P. 175-8.

45. Duncan С., Stephen С., Campbell J. Clinical characteristics and predictors of mortality for Cryptococcus gattii infection in dogs and cats of southwestern British Columbia.// Can Vet J.- 2006.- V. 47 № 10 .- P. 993-998.

46. Edberg S.C., Chaskes S.J., Alture-Werber E., et al. Esculin-based medium for isolation and identification of Cryptococcus neoformans. //J Clin Microbiol. — 1980.-V. 12 №3.-P. 332-335.

47. Edwards M. R., Gordon M. A., Lapa E. W., et al. Micromorphology of Cryptococcus neoformans // J. Bacteriol. 1967. - V. 94. -. - P. 766-777.

48. Eisenman H.C., Mues M., Weber S.E., et al. Cryptococcus neoformans laccase catalyses melanin synthesis from both D- and L-DOPA.// Microbiology.-2007.-V. 153 № Pt 12 .-P. 3954-3962.

49. Ellis D.H., Pfeiffer T.J. Natural habitat of Cryptococcus neoformans var. gattii.// J Clin Microbiol. -1990. V. 28 № 7. - P. 1642-1644.

50. Emmons C.W. Isolation of Cryptococcus neoformans from soil. // J Bacteriol. 1951. -V. 62 № 6. - P. 685-690.

51. Emmons C.W. Prevalence of Cryptococcus neoformans in pigeon habitats.// Public Health Re. P. -1960. - V. 75. - P. 362-364.

52. Evans E.E., Theriault R.J. The antigenic compostion of Cryptococcus neoformans. IV. The use of paper chromatography for following purification of the capsular polysaccharide.// J Bacteriol. -1953. V. 65 № 5. - P. 571-577.

53. Filiu W.F., Wanke В., Agiiena S.M., et al. Avian habitats as sources of Cryptococcus neoformans in the city of Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil.// Rev Soc Bras Med Tro. P. -2002. - V. 35 № 6. - P. 591-595.

54. Fisher A.M. Inhibition of growth of Cryptococcus neoformans by cultures of Pseudomonas aeruginosa.// Bull Johns Hopkins Hos. — P. —1954. V. 95 № 4. — P. 157-161.

55. Fiskin A. M., Zalles M. C., Garrison R. G. Electron cytochemical studies of Cryptococcus neoformans grown on uric acid and related sources of nitrogen // J. Med. Vet. Mycol. 1990. - V. 28, N 3. - P. 197-207.

56. Franzot S. P., Mukherjee J., Cherniak R., et al. Microevolution of a standard strain of Cryptococcus neoformans resulting in differences in virulence and other phenotypes.// Infect Immun. -1998 - V. 66 № 1 .- P. 89-97.

57. Frases S., Ferrer C., Sanchez M., et al. Molecular epidemiology of isolates of the Cryptococcus neoformans species complex from Spain. // Rev Iberoam Micol. -2009. V. 26 № 2. - P. 112-117.

58. Fujita N.K., Hukkanen J., Edwards J.E. Jr. Experimental hematogenous endophthalmitis due to Cryptococcus neoformans. //Invest Ophthalmol Vis Sci. — 1983. V. 24 № 3. - P. 368-375.

59. Garcia-Hermoso D., Dromer F., Janbon G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection.// Infect Immun— 2004.- V. 72 № 6 .- P. 3359-3365.

60. Garcia-Rivera J., Tucker S.C., Feldmesser M., et al. Laccase expression in murine pulmonary Cryptococcus neoformans infection.// Infect Immun. —2005 — V. 73 №5 .p. 3124-3127.

61. Ghannoum M.A. Potential role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis.//Clin Microbiol Rev.-2000.-V. 13 № 1 .-P. 122-143,

62. Giles S.S., Batinic-Haberle I., Perfect J.R., et al. Cryptococcus neoformans mitochondrial superoxide dismutase: an essential link between antioxidant function and high-temperature growth.// Eukaryot Cell. -2005. V. 4 № 1. - P. 46-54.

63. Gugnani H.C., Mitchell T.G., Litvintseva A.- P., et al. Isolation of Cryptococcus gattii and Cryptococcus neoformans var. grubii from the flowers and bark of Eucalyptus trees in India.// Med Mycol. -2005 V. 43 № 6 .- P. 565-569.

64. Hamasha A.M., Yildiran S.T., Gonlum A., et al. Cryptococcus neoformans varieties from material under the canopies of eucalyptus trees and pigeon dropping samples from four major cities in Jordan.// Mycopathologia. -2004. -V. 158 №2.-P. 195-199.

65. Hamilton A.J., Gomez B.L. Melanins in fungal pathogens.// J Med Microbiol. -2002. V. 51 № 3. - P. 189-191.

66. Hanley C.S., MacWilliams .— P., Giles S., et al. Diagnosis and successful treatment of Cryptococcus neoformans variety grubii in a domestic ferret.// Can Vet J.-2006.-V. 47 № 10 .-P. 1015-1017.

67. Healy ME, Dillavou CL, Taylor GE. Diagnostic medium containing inositol, urea, and caffeic acid for selective growth of Cryptococcus neoformans.// J Clin Microbiol. -1977. -V. 6 № 4 .-P. 387-391.

68. Hernandez Idel C., Machin G.M., Andreu C.M., et al. Pigmentation of Cryptococcus neoformans strains on sunflower seed agar. // Rev Cubana Med Tro P. -2003.- V. 55 № 2 .- P. 119-120.

69. Hogan L.H., Klein B.S., Levitz S.M. Virulence factors of medically important fungi. // Clin Microbiol Rev. -1996.- V. 9 № 4 .- P. 469-488.

70. Idnurm A., Heitman J. Light controls growth and development via a conserved pathway in the fungal kingdom. //PLoS Biol. -2005. — V. 3 № 4. P. 95.

71. Irokanulo E.A., Akueshi C.O. Virulence of Cryptococcus neoformans serotypes А, В, С and D for four mouse strains.// J Med Microbiol. -1995 V. 43 № 4 .- P. 289-293.

72. Ishinkin N., Zasshi G. Three-dimensional reconstruction of mitotic cells of Cryptococcus neoformans based on septal section electron microscopy // Review Japensis. 1998. - V. 39, №3. - P. 123-127.

73. Iyo S. Fine structure of Cryptococcus neoformans — an electron microscopy study // Japanese J. Dermatol. 1966. - V. 76. - P. 65-85.

74. Jenney A., Pandithage K., Fisher D.A., et al. Cryptococcus infection in tropical Australia.// J Clin Microbiol. -2004. V. 42 № 8. - P. 3865-3868.

75. Jong SC, Bulmer GS, Ruiz A. Serologic grouping and sexual compatibility of airborne Cryptococcus neoformans.// Mycopathologia. -1982. Sep 17;79 № 3 .-P. 185-188.

76. Kajihiro E.S. Occurrence of dermatophytes in fresh guano. //Appl Microbiol. 1965,- V. 13 №5. -P. 720-724.

77. Kaufmann C.S., Merz W.G. Two rapid pigmentation tests for identification of Cryptococcus neoformans.// J Clin Microbiol. -1982. V. 15 № 2 .- P. 339341.

78. Kiertiburanakul S., Sungkanuparph S., Buabut В., et al. Cryptococcuria as a manifestation of disseminated cryptococcosis and isolated urinary tract infection.// Jpn J Infect Dis. -2004.- V. 57 № 5,- P. 203-205.

79. Kobayashi C.C., Souza L.K., Fernandes Ode F., et al. Characterization of Cryptococcus neoformans isolated from urban environmental sources in Goiania, Goias State, Brazil. //Rev Inst Med Trop Sao Paulo. -2005. V. 47 № 4. - P. 203-207.

80. Kopecka M., Gabriel M., Takeo K., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts // European Journal of Cell Biology. 2001. — V. 80

81. Kraus P.R., Nichols C.B., Heitman J. Calcium- and calcineurin-independent roles for calmodulin in Cryptococcus neoformans morphogenesis and high-temperature growth.// Eukaryot Cell. -2005. V. 4 № 6. - P. 1079-1087.

82. Kwon-Chung K.J., Polacheck I., Popkin T.J. Melanin-lacking mutants of Cryptococcus neoformans and their virulence for mice. // J Bacteriol. —1982. — V. 150 №3,-P. 1414-21.

83. Kwon-Chung K.J., Wickes B.L., Stockman L., et al. Virulence, serotype, and molecular characteristics of environmental strains of Cryptococcus neoformans var. gattii.// Infect Immun. -1992.- V. 60 № 5 .- P. 1869-1874.

84. Lewis JL, Rabinovich S. The wide spectrum of cryptococcal infections.// Am J Med.-1972.-V. 53 № 3.-P. 315-322.

85. Littman M, Schneierson S. Cryptococcus neoformans in pigeon excreta in New York City. // Am J Hyg. -1959. V. 69 № 1. - P. 49-59.

86. Litvintseva A.P., Kestenbaum L., Vilgalys R., Mitchell T.G. Comparative analysis of environmental and clinical populations of Cryptococcus neoformans. /Я Clin Microbiol. 2005.- V. 43 № 2 .- P. 556-564.

87. Litvintseva A.P., Lin X., Templeton I., Heitman J., Mitchell T.G. Many globally isolated AD hybrid strains of Cryptococcus neoformans originated in Africa. //PLoS Pathog. -2007. V. 17;3 № 8 .- P. 114.

88. Litvintseva AP, Mitchell TG. Most environmental isolates of Cryptococcus neoformans var. grubii № serotype A are not lethal for mice. // Infect Immun. -2009. V. 77 № 8. - P. 3188-3195.

89. Loftus B.J., Fung E., Roncaglia .- P., et al. The genome of the basidiomycetous yeast and human pathogen Cryptococcus neoformans.// Science. -2005. -V. 25;307 № 5713 .-P. 1321-1324.

90. Mancianti F., Nardoni S., Ceccherelli R. Occurrence of yeasts in psittacines droppings from captive birds in Italy. // Mycopathologia. -2002. V. 153 № 3. -P. 121-124.

91. Martinez L.R., Casadevall A. Cryptococcus neoformans biofilm formation depends on surface support and carbon source and reduces fungal cell susceptibility to heat, cold, and UV light. //Appl Environ Microbiol. -2007. V. 73 № 14.-P. 4592-4601.

92. Martinez L.R., Garcia-Rivera J., Casadevall A. Cryptococcus neoformans var. neoformans № serotype D strains are more susceptible to heat than C. neoformans var. grubii № serotype A strains.// J Clin Microbiol. —2001. — V. 39 №9.-P. 3365-3367.

93. Mason D. L., Wilson C. L. Cytochemical and biochemical identification of lysosomes in Cryptococcus neoformans // Mycopathologia. 1979. — V. 28, N 3. -P. 183-190.

94. McClelland E.E., Perrine W.T., Potts W.K., Casadevall A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines.// Infect Immun. -2005 V. 73 № 10 :7047-7050.

95. Meyer C.E., Reusser F. A polypeptide antibacterial agent. isolated from Trichoderma viride.// Experientia. -1967. V. 15;23 № 2 .- P. 85-86.

96. Miller W.G., Padhye A.A., van Bonn W., et al. Cryptococcosis in a bottlenose dolphin № Tursiops truncatus caused by Cryptococcus neoformans var. gattii.// J Clin Microbiol. -2002. V. 40 № 2. - P. 721-724.

97. Mishra S.K., Staib F., Folkens U., Fromtling R.A. Serotypes of Cryptococcus neoformans strains isolated in Germany.// J Clin Microbiol. —1981. -V. 14№ l.-P. 106-107.

98. Mitchell A.P. Cryptococcal virulence: beyond the usual suspects.// J Clin Invest. -2006. -V. 116 № 6. -P.1481-1483.

99. Mitchell A.P. Updated view of Cryptococcus neoformans mating type and virulence. //Infect Immun. -2003. V. 71 № 9. - P. 4829^1830.

100. Mochizuki Т., Tanaka S. Ultrastructure of the mitotic apparatus in Cryptococcus neofor-mans // J. Med. Vet. Mycol. 1987. - V. 25. - P. 223-233.

101. Mochizuki Т., Tanaka S., Saito Y., Watanabe S. Three-dimensional reconstruction of mitotic cells of Cryptococcus neoformans based on serial section electron microscopy // JaP. J. Med. Mycol. 1998. - V. 39. - P. 123— 127.

102. Mondon P., Petter R., Amalfitano G., et al. Heteroresistance to fluconazole and voriconazole in Cryptococcus neoformans.// Antimicrob Agents Chemother.- 1999.-V. 43 № 8 .-P. 1856-1861.

103. Muiphy J.W. Cryptococcosis // Infect Immun. -2009. -V.57 № 7 :1946-52.

104. Nagl W. Nuclear ultrastructure: condensed chromatin in plants is species specific № karyo-typical , but not tissue-specific № functional // Protoplasma. -1979.-V. 57, N1.-P. 53-71.

105. Nakamura Y., Kano R., Sato H., et al. Isolates of Cryptococcus neoformans serotype A and D developed on canavanine-glycine-bromthymol blue medium.// Mycoses. -1998. V. 41 № 1-2. - P. 35^10.

106. Nandhakumar В., Kumar C.P., Prabu D., Menon T. Mustard seed agar, a new medium for differentiation of Cryptococcus neoformans. //J Clin Microbiol. 2006.- V. 44 № 2 .- P. 674.

107. Neilson J. В., Bulmer G. S. Cryptococcus neoformans: size range of infectious particles from aerosolized soil // Infect. Immun. 1977. - V. 17. - P. 634—638.

108. Nielsen K., De Obaldia A.L., Heitman J. Cryptococcus neoformans mates on pigeon guano: implications for the realized ecological niche and globalization.// Eukaryot Cell. -2007,- V. 6 № 6 .- P. 949-959.

109. Nosanchuk J.D., Rudolph J., Rosas A.L., Casadevall A. Evidence that Cryptococcus neoformans is melanized in pigeon excreta: implications for pathogenesis.// Infect Immun. -1999.- V. 67 № 10 .- P. 5477-5479.

110. Nosanchuk J.D., Shoham S., Fries B.C., et al. Evidence of zoonotic transmission of Cryptococcus neoformans from a pet cockatoo to an immunocompromised patient.// Ann Intern Med. -2000.- V. 1; 132 № 3 .- P. 205-208.

111. Odom A., Muir S., Lim E., et al. Calcineurin is required for virulence of Cryptococcus neoformans.// EMBO J. -1997. V. 16 № 10. - P. 2576-2589.

112. Osuna A., Carragoso A., Lemos A., et al. Cryptococcosis. //Acta Med Port. -2008.-V. 21 №3 :307-13. .-P. 303-311.

113. Pal M. First report of isolation of Cryptococcus neoformans var. neoformans from avian excreta in Kathmandu, Nepal. // Rev Iberoam Micol. -1997. V. 14 №4.-P. 181-183.

114. Pal M. Pathogenicity of environmental strains of Ciyptococcus neoformans var neoformans in murine model.// Rev Iberoam Micol. -2005 V. 22 № 2 .- P. 129.

115. Paliwal D.K., Randhawa H.S. A rapid pigmentation test for identification of Cryptococcus neoformans.// Antonie Van Leeuwenhoek. -1978. V. 44 № 2 .— P. 243-246.

116. Perfect J. R. Cryptococcosis // Infect. Dis. Clin. N. Am. 2008. - V. 3. - P. 77-102.

117. Plaman M. Nuclear division, nuclear distribution and cytokinesis in filamentous fungi // J. Genet. 1996. - V.75. - 351-360.

118. Polacheck I., Kwon-Chung K.J. Melanogenesis in Cryptococcus neoformans.// J Gen Microbiol. -1988. -V. 134 № 4. P. 1037-1041.

119. Polacheck I., Piatt Y., Aronovitch J. Catecholamines and virulence of Cryptococcus neoformans. //Infect Immun. -1990. V. 58 № 9. - P. 2919-2922.

120. Racicot T.A., Bulmer G.S. Comparison of Media for the Isolation of Cryptococcus neoformans.// Appl Environ Microbiol. —1985. V. 50 № 2. — P. 548-549.

121. Reimao J.Q., Drummond E.D., Terceti Mde S., et al. Isolation of Cryptococcus neoformans from hollows of living trees in the city of Alfenas, MG, Brazil.// Mycoses. -2007. V. 50 № 4. - P. 261-264.

122. Reynolds E. S. The use of lead citrate as high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol. 1963. - V. 17, N3. - P. 208 - 212.

123. Rhodes J.C., Polacheck I., Kwon-Chung K.J. Phenoloxidase activity and virulence in isogenic strains of Cryptococcus neoformans.// Infect Immun. — 1982-V. 36 №3 .-P. 1175-1184.

124. Ribeiro M.A., Ngamskulrungroj P. Molecular characterization of environmental Cryptococcus neoformans isolated in Vitoria, ES, Brazil. //Rev Inst Med Trop Sao Paulo. -2008. V. 50 № 6. - P. 315-320.

125. Rivas F., De Martin M.C., Rojas V. Cryptococcus neoformans isolation from the soil in Panama.// Rev Med Panama. -1999. V. 24 № 1. - P. 4-6.

126. Rivera J., Feldmesser M., Cammer M., Casadevall A. Organ-dependent variation of capsule thickness in Cryptococcus neoformans during experimental murine infection // Infect. Immun. 1998. - V. 66. - P. 5027 - 5030.

127. Rodrigues M.L., Nakayasu E.S., Oliveira D.L., et al. Extracellular vesicles produced by Cryptococcus neoformans contain protein components associated with virulence.// Eukaryot Cell. -2008. V. 7 № 1. - P. 58-67.

128. Rosario I., Acosta В., Colom M.F. Pigeons and other birds as a reservoir for Cryptococcus spP.// Rev Iberoam Micol. -2008. V. 25 № 1. - P. 13-18.

129. Rosenthal SA, Furnari D. Efficacy of "dermatophyte test medium". Comparison of two commercial preparations with laboratory-prepared Sabouraud-antibiotic medium.// Arch Dermatol. -1971. V. 104 № 5. - P. 486489.

130. Ruane P.J., Walker L.J., George W.L. Disseminated infection caused by urease-negative Cryptococcus neoformans.// J Clin Microbiol. -1988. — V. 26 № 10.-P. 2224-2225.

131. Ruiz A., Bulmer G.S. Particle size of airborn Cryptococcus neoformans in a tower. //Appl Environ Microbiol. -1981. V. 41 № 5. - P. 1225-1229.

132. Ruiz A., Fromtling R.A., Bulmer G.S. Distribution of Cryptococcus neoformans in a natural site. //Infect Immun. -1981. V. 31 № 2. - P. 560-563.

133. Sakaguchi N., Baba Т., Fukuzawa M., Ohno S. Ultrastructural study of Cryptococcus neoformans by quick-freezing and deep-etching method // Mycopathologia. 1993. - V. 121, N3.-P. 133-141.

134. Salkowski C.A., Balish E. Cutaneous cryptococcosis in athymic and beige— athymic mice. // Infect Immun. -1991. -V. 59 № 5 .- P. 1785-1789.

135. Schiave L.A., Pedroso R.S., Candido R.C., et al. Variability in UVB tolerances of melanized and nomnelanized cells of Cryptococcus neoformans and C. laurentii.// Photochem Photobiol. -2009. V. 85 № l.-P. 205-213.

136. Secko D. Light as a defence against fungal infection. //CMAJ. -2005. V. 26; 172 №9 P. 1174.

137. Segal E, Ajello L. Evaluation of a new system for the rapid identification of clinically important yeasts.// J Clin Microbiol. -1976. V. 4 № 2 .- P. 157-159.

138. Seixas F., Martins Mda L., de Lurdes Pinto M., et al. A case of pulmonary cryptococcosis in a free-living.toad № Bufo bufo. // J Wildl Dis. -2008. V. 44 №2.-P. 460-463.

139. Severo L.C., Berta-E—Zardo I., Londero A.T. Cutaneous cryptococcosis due to Cryptococcus neoformans var. gattii.// Rev Iberoam Micol. -2001. V. 18 № 4.-P. 200-201.

140. Shany M. A mixed fungal infection in a dog: sporotrichosis and cryptococcosis. //Can Vet J. -2000. V. 41 № 10. - P. 799-800.

141. Shields A.B., Ajello L. Medium for selective isolation of Ciyptococcus neoformans. //Science. -1966. V. 14; 151 № 707. - P. 208-209.

142. Siafakas A.R., Wright L.C., Sorrell T.C., Djordjevic J.T. Lipid rafts in Cryptococcus neoformans concentrate the virulence determinants phospholipase B1 and Cu/Zn superoxide dismutase. //Eukaryot Cell. -2006. V. 5 № 3. - P. 488-498.

143. Silva E.G., Baroni Fde A., Viani F.C et al. Virulence profile of strains of Cryptococcus neoformans var. grubii evaluated by experimental infection in

144. BALB/c mice and correlation with exoenzyme activity.// J Med Microbiol. -2006.-V. 55 №2.-P. 139-142.

145. Shaw CE, Kapica L. Production of diagnostic pigment by phenoloxidase activity of cryptococcus neoformans.// Appl Microbiol. -1972. V. 24 № 5. - P. 824-830.

146. Shields AB, Ajello L. Medium for selective isolation of Cryptococcus neoformans.// Science. -1966. V. 14; 151 № 707. - P. 208-209.

147. Soares M.C., Paula C.R., Dias A.L., et al. Environmental strains of Cryptococcus neoformans variety grubii in the city of Santos, SP, Brazil.// Rev Inst Med Trop Sao Paulo. -2005. V. 47 № 1. - P. 31-36.

148. Sorrell T.C., Brownlee A.G., Ruma P., et al. Natural environmental sources of Cryptococcus neoformans var. gattii.// J Clin Microbiol. -1996. — V. 34 № 5. -P.1261-1263.

149. Sorrell T.C., Ellis D.H. Ecology of Cryptococcus neoformans.// Rev Iberoam Micol. -1997. V. 14 № 2. - P. 42-43.

150. Souza LK, Fernandes Ode F, Kobayashi CC, et al. Antifungal susceptibilities of clinical and environmental isolates of Cryptococcus neoformans in Goiania city, Goias, Brazil.// Rev Inst Med Trop Sao Paulo. -2005. V. 47 № 5. - P. 253-256.

151. Spanamberg A., Wunder E.A. Jr., Brayer Pereira D.I., et al. Diversity of yeasts from bovine mastitis in Southern Brazil. //Rev Iberoam Micol. -2008. V. 30; 25 №3.-P. 154-156.

152. Staib F., Seeliger H.P. A new selective medium for the isolation of C. neoformans from fecal material and from soil. //Ann Inst Pasteur Paris. -1966. -V. 110№ 5.-P. 792-793.

153. Steenbergen J.N., Casadevall A. Prevalence of Cryptococcus neoformans var. neoformans № Serotype D and Cryptococcus neoformans var. grubii № Serotype A isolates in New York City.// J Clin Microbiol. -2000. V. 38 № 5. -P. 1974-1976.

154. Tendolkar U., Tainwala S., Jog S., Mathur M. Use of a new medium -Tobacco agar, for pigment production of cryptococcus neoformans.// Indian J Med Microbiol. -2003. V. 21 № 4. - P. 277-279.

155. Teoh-Chan H, Chau PY, Ng MH, Wong PC. Inhibition of Cryptococcus neoformans by Pseudomonas aeruginosa.// J Med Microbiol. -1975 V. 8 № 1 .— P. 77-81.

156. Thomson P., Miranda G., Silva V. Canine lymphadenitis caused by Cryptococcus neoformans. First case in Chile. // Rev Iberoam Micol. —2006. — V. 23 №4.-P. 238-240.

157. Tice L. W., Barmett R. J. Diazophthalocyanins as reagents for fine structural cytochemistry // J. Cell Biol. 1965. - V. 25, N1. - P. 23-41.

158. Torres-Rodriguez J.M., Alvarado-Ramirez E., Gutierrez-Gallego R. Urease activity in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. //Rev Iberoam Micol. -2008. V. 25 № 1. - p. 27-31.

159. Torres-Rodriguez J.M., Baro Т., Hermoso de Mendoza M., Morera Y., Alia C. First isolates of Cryptococcus neoformans var gattii in Spain. //Rev Iberoam Micol.-1997.-V. 14 № l.-P. 36.

160. Torres-Rodriguez J.M., Baro Т., Morera Y., et al. Molecular characterization of Cryptococcus neoformans var. gattii causing epidemic outbreaks of cryptococcosis in goats.// Rev Iberoam Micol. -1999. V. 16 № 3. -P. 164-165.

161. Tsukahara T. Cytological structure of Cryptococcus neoformans // Japan. J. Microbiol. 1963. - V. 7. - P. 53-67.

162. Utz J., Butler W. Ciyptococcal meningitis. Recent observations on diagnosis and treatment. //Dtsch Med Wochenschr. -1965. V. 21; 90. - P. 941-943.

163. Van Uden N. The temperature profile of Cryptococcus neoformans. //Sabouraudia. -1982. V. 20 № 4. - P. 331-334.

164. Van Uden N., Do Sousa L.C. Yeasts from the bovine caecum.// J Gen Microbiol. -1957.- V. 16 № 2 .- P. 385-395.

165. Vartivarian S.E., Reyes G.H., Jacobson E.S., et al. Localization of mannoprotein in Cryptococcus neoformans.// J Bacteriol. -1989. V. 171 № 12. -P. 6850-6852.

166. Vidotto V., Koga-Ito C.Y., Canella D., et al. Extracellular activity in Cryptococcus neoformans strains isolated from AIDS patients and from environmental sources.// Rev Iberoam Micol. -2000. V. 17 № 1. - P. 14-19.

167. Voros-Felkai G. Incidence of Cryptococcus species in urban air. // Acta Microbiol Acad Sci Hung. -1967. V. 14 № 3. - P. 305-308.

168. Wang Y., Aisen P., Casadevall A. Cryptococcus neoformans melanin and virulence: mechanism of action.// Infect Immun. -1995.- V. 63 № 8 .- P. 3131— 3136.

169. Wang Y., Casadevall A. Decreased susceptibility of melanized Cryptococcus neoformans to UV light. // Appl Environ Microbiol. -1994. V. 60№ 10.-P. 3864-3866.

170. Wang Y, Casadevall A. Growth of Cryptococcus neoformans in presence of L-dopa decreases its susceptibility to amphotericin В.// Antimicrob Agents Chemother. -1994. V. 38 № 11. - P. 2648-2650.

171. Williamson P.R. Biochemical and molecular characterization of the diphenol oxidase of Cryptococcus neoformans: identification as a laccase.// J Bacteriol.— 1994.-V. 176 №3 .-P. 656-664.

172. Williamson P.R., Wakamatsu K., Ito S. Melanin biosynthesis in Cryptococcus neoformans.// J Bacteriol. -1998. V. 180 № 6. - P. 1570-1572.

173. Woyke Т., Robertson R. W., Pettit G. R., et al. Effect of auristatin PHE on microtubule integrity and nuclear localization in Cryptococcus neoformans // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2002. - V. 46, N 12. - P. 38023808.

174. Yamaguchi M., Ohkusu M., Biswas S. K., Kawamoto S. Cytological study of cell cycle of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans // Ja— P. J. Mycol.-2007. V. 48.-P. 147-152.

175. Yamaguchi M., Ohkusu M., Sameshima M., Kawamoto S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation // JaP. J. Med. Mycol. 2005. - V. 46. - P. 187192.

176. Yamamoto Y., Kohno S., Koga H., et al. Random amplified polymorphic DNA analysis of clinically and environmentally isolated Cryptococcus neoformans in Nagasaki.// J Clin Microbiol. -1995. V. 33 № 12. - P. 33283332.

177. Yamaquchi M., Biswas S. K., Kita S., Aikawa E., Takeo K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing // J. Electron Microsc. 2002. - V. 51, №1.-P. 21-27.

178. Zaragoza O., Fries B.C., Casadevall A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and C02.// Infect Immun-2003.-V. 71 № 11 .-P. 6155-6164.

179. Zhu X., Gibbons J., Casadevall A., et al. Laccase of Cryptococcus neoformans is a cell wall-associated virulence factor. //Infect Immun. -2001. — V. 69 №9.-P. 5589-5596.

Информация о работе

Босак, Илья Алексеевич
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.24

Диссертация

Сравнительная характеристика природных и клинических изолятов Cruptococcus neoformans - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Сравнительная характеристика природных и клинических изолятов Cruptococcus neoformans ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика природных и клинических изолятов Cruptococcus neoformans"

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Босак, Илья Алексеевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика природных и клинических изолятов Cruptococcus neoformans"

Заключение Диссертация по теме "Микология", Босак, Илья Алексеевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Босак, Илья Алексеевич, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительная характеристика природных и клинических изолятов Cruptococcus neoformans
ВАК РФ 03.00.24, Микология