Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Чувствительность грибов рода Candida к тритерпеновым гликозидам плюща крымского

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Чувствительность грибов рода Candida к тритерпеновым гликозидам плюща крымского"

На правах рукописи

Кирсанова Марина Александровна

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ГРИБОВ РОДА CANDIDA К ТРИТЕРПЕНОВЫМ ГЛИКОЗИДАМ ПЛЮЩА КРЫМСКОГО

03.02.03 - микробиология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 НО;, 2014

005554574

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор

Криворутченко Юрий Леонидович

Оболенск - 2014

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Крымского государственного медицинского университета имени С. И. Георгиевского

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Криворутченко Юрий Леонидович Официальные оппоненты:

Нугманова Татьяна Алексеевна - доктор технических наук, профессор. Открытое акционерное общество «Биохиммаш», г. Москва, заведующая лабораторией;

Меденцев Александр Григорьевич - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина» Российской академии наук, г. Пущино-на-Оке Московской области, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский центр экологической безопасности» Российской академии наук, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «12» декабря 2014 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ, кор. № 1, конференц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора

Автореферат разослан 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В структуре инфекционной патологии человека значительно возросла роль условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), к которым относятся Escherichia coli, Bacillus subtilis и грибы рода Candida (Исаков, 2001; Fridkin, 2005; Perlroth, 2007; Хмельницки, 2011). В настоящее время УПМ являются главным этиологическим фактором внутрибольничных инфекций (ВБИ). Увеличение риска возникновения ВБИ в значительной степени определяется распространением госпитальных штаммов, устойчивых к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам. Этот процесс происходит также и в лечебных учреждениях Украины (Паш'й, 2008; Марквський, 2008). Среди таких возбудителей важную роль играют дрожжеподобные грибы, приводящие к развитию микозов как у ВИЧ-инфицированных пациентов, так и у больных с другими дисфункциями иммунной системы (Волоха, 2006; Мавлянова, 2009; Таха, 2011). В основном (около 50% случаев) речь идёт о кандидомикозах, возбудителем которых является Candida albicans. Вместе с тем, отмечается возрастание встречаемости и других видов дрожжеподобных грибов рода Candida - С. tropicalis, С. parapsilosis, С. krusei, С. glabrata и др. (Чеснокова, 2003; Анкирская, 2006).

Основным средством лечения микозов, в т. ч. и кандидомикозов, остаются полиеновые антибиотики, азолы, антимикотики других групп и антисептики. Глобальный процесс распространения микроорганизмов, устойчивых к антимикробным препаратам, имеет отношение и к условно-патогенным грибам. Так, среди грибов рода Candida, выделенных от больных г. Лисичанска в 2009 г., устойчивыми к амфотерицину В, клотримазолу, флюконазолу и итракопазолу оказались 36-85% штаммов (Данилейченко, 2010). К настоящему времени предложен ряд стратегий, направленных на противодействие распространению резистентных форм возбудителей, в том числе условно-патогенных дрожжеподобных грибов. Главными элементами таких подходов являются: создание новых препаратов, комплексное использование противомикробных средств или их поочерёдное применение, адекватный выбор препаратов на основе микробиологического мониторинга устойчивости к ним госпитальных штаммов (Морозова, 2008; Марсель, 2010). Перспективной признана комбинированная терапия микозов, включающая различные вещества естественного происхождения (Manohar, 2001; Бадалян, 2003; Гусева, 2008).

Среди природных веществ-кандидатов, которые в перспективе могут быть использованы для лечения и профилактики воспалительных заболеваний бактериальной, вирусной и грибковой этиологии, важное место занимают гликозиды, в том числе сапонины. Опубликованы результаты исследований антифунгальных свойств различных сапонинов в отношении ряда грибов, патогенных как для растений, так и для человека (Sparg, 2004).

Таким образом, сравнительное изучение воздействия тритерпеновых сапонинов и применяемых сегодня антимикотиков на клинически актуальные виды условно-патогенных грибов, может позволить создать основу для конструирования

новых противогрибковых препаратов, к которым у этих возбудителей ещё не возникла устойчивость.

Связь работы с научными программами, планами, темами.

Данная работа выполнена в рамках научной тематики согласно плану научно-исследовательской работы кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГУ «Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского». Диссертационная работа является фрагментом научно-исследовательских работ «Микробиологические и иммунологические эффекты гликозидов и других биологически-активных веществ» (№ госрегистрации 0100U002031, 2000-2003 гг.), «Воздействие на микроорганизмы и антиинфекционную резистентность гликозидов, некоторых возбудителей и других биологически-активных веществ» (№ госрегистрации 0105U002161V, 20052009 гг.), «Оппортунистические микроорганизмы и взаимодействие этих микроорганизмов в составе биологических плёнок у больных с иммунодефицитами различной природы» (№ госрегистрации 0107U001261, 2007-2009 гг.) и «Воздействие биологически-активных веществ растительного и животного происхождения на условно-патогенные микроорганизмы» (№ госрегистрации 0110U002971, 2010-2011 гг.). Диссертант является непосредственным исполнителем отдельных фрагментов указанных НИР.

Цель и задачи исследования. Определить воздействие тритерпеновых сапонинов таурозидов плюща крымского (Hedera tanrica Carr.) на различные виды грибов рода Candida и обосновать возможность использования таурозидов для создания препаратов с антифунгальной активностью.

Для достижения цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить видовой состав дрожжеподобных грибов, выделенных у здоровых людей и больных с различной патологией, в 2000-2008 гг. в г. Симферополе, АР Крым;

2. Провести сравнительное исследование с помощью метода дисков чувствительности к антимикотикам грибов, выделенных в 2000-2008 гг. в г. Симферополе от здоровых и больных людей;

3. Провести сравнительное изучение воздействия на условно-патогенные дрожжеподобные грибы тритерпеновых сапонинов таурозидов Н2, и -I, выделенных из плюща крымского (Hedera taurica Carr.), а также модифицированного сапонина таурозида Sx 1;

. 4. Установить воздействие таурозидов Н,, -I, и Sxl на бактери и, являющиеся представителями патогенной и естественной микрофлоры тела человека: Escherichia coli, Alcaligenes, Shigella flexneri, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium diphtheriae, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus ;

5. Усовершенствовать методику количественной оценки антифунгальной

активности антимикотиков и сапонинов растительного происхождения в соответствии с международными стандартами;

6. Провести сравнительное изучение чувствительности грибов рода Candida, выделенных у здоровых людей и больных с различной патологией к таурозиду Sxl и к широко применяемому антимикотику амфотерицину В с помощью метода разведений;

7. Изучить действия таурозида Sxl на адгезивные свойства С. albicans и на развитие кандидоза у мышей.

Научная новизна полученных результатов. Впервые изучены антифунгальные свойства и воздействие на бактерии сапонинов таурозидов Н2, -I, и -Sxl из плюща крымского Hederá taurica Carr. и установлено, что таурозид Sxl (прежнее название «таурозид Е») подавляет рост грибов и его можно рассматривать как потенциальное противогрибковое средство (патент РФ №2241484С1 от 18.07.2003 г.)

Впервые показано, что в отличие от таурозидов Н2 и -I сапонин таурозид Sxl обладает выраженным фунгицидным действием (МПК 125-250 мг/л). Выявлено, что все изученные сапонины не подавляют жизнедеятельность бактерий. Установлено, что при экспериментальном системном кандидозе терапевтическое внутрибрюшинное введение таурозида Sxl в дозах 50-150 мкг/ мышь/сутки повышает выживаемость мышей в 4-7,7 раза.

Выявлено, что среди дрожжеподобных грибов, выделенных от больных и здоровых людей в 2000-2008 гг. в г. Симферополе, АР Крым, преобладали изоляты С. albicans. Встречаемость представителей других видов рода Candida в зависимости от типа патологии варьировала от 19,0% (стоматологические больные) до 54,5% (язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки ЯБДК).

Определено, что устойчивость грибов, выделенных от здоровых и больных людей, к нистатину составляла от 16,7% до 50%, а к таким антимикотикам, как клотримазол, флюконазол и итраконазол находилась на высоком уровне (27,395% устойчивых изолятов).

Установлено, что уровень чувствительности изученных изолятов грибов к таурозиду Sxl (95,1% — МПК 125-250 мг/л) не уступает их чувствительности к антимикотику амфотерицину В (82,7% чувствительных и 13,5% умеренно-чувствительных изолятов).

Практическая значимость полученных результатов. Создана коллекция изолятов грибов рода Candida (104 изолята), циркулирующих в АР Крым у здоровых и больных людей. В экспериментах in vitro и на модели диссеминированного кандидоза у мышей доказано антифунгалыюе действие сапонина таурозида Sxl, что создаёт перспективу разработки на его основе нового противогрибкового препарата. Разработан модифицированный метод серийных разведений на среде RPMI-1640 с добавлением 3% лошадиной сыворотки, позволяющий определять МПК антимикотиков и экспериментальных веществ в соответствии с современными международными стандартами. Модифи-

цированный метод внедрён в КРУ «Детская инфекционная клиническая больница» г. Симферополя для определения чувствительности патогенных грибов к антимикотикам(Актвнедренияот 19.10.2010г.). Результатыдиссертационнойработы внедрены в технологию создания новых химически модифицированных гликозидов с противогрибковыми свойствами на кафедре физической и аналитической химии в ГУ «Таврический национальный университет им. Вернадского» (Акт внедрения от 01.10.2012 г.).

Кроме того, результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии ГУ «Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского» и Винницкого национального медицинского университета им Н.И. Пирогова (Акт внедрения от 01.10.2010 г.)

Объекты исследования: дрожжеподобные грибы (108), выделенные от здоровых и больных людей в 2000-2008 гг. в АР Крым, штаммы бактерий (22), тритерпеновые сапонины таурозиды из плюща крымского и их антимикробные свойства.

Предмет исследования: чувствительность к таурозидам Н2, I, Sxl и антимикотикам бактерий и изолятов дрожжеподобных грибов, выделенные от здоровых и больных людей.

Методы исследования: микробиологические — выделение и идентификация дрожжеподобных грибов, определение чувствительности бактерий и грибов к сапонинам и антимикотикам с помощью методов дисков, колодцев и метода разведений, использованного в нескольких вариантах постановки; биологический - определение действия изучаемых веществ на модели оппортунистического кандидоза у мышей; статистические.

Положения, выносимые на защиту:

1. Тритерпеновый сапонин таурозид Sxl, выделенный из плюща крымского (Hederá taurica Carr.), оказывает фунгицидное действие в отношении изолятов 10 видов грибов рода Candida (МИК 125-250 мг/л), изолированных от больных людей с разной патологией, и обладает протективным антифунгальным действием при введении мышам с экспериментальным кандидозом в дозах 2,5 -7,5 мг/кг.

2. Сапонины таурозиды Sxl, Н2 и -I не проявляют антимикробной активности в отношении бактерий видов, относящихся к патогенной и естественной микрофлоре тела человека, а таурозид Н2 и таурозид I не имеют антифунгального эффекта.

3. Модифицированный микро-метод разведений в среде RPMI-1640 с добавлением 3% лошадиной сыворотки позволяет получать результаты по определению чувствительности клинических изолятов дрожжеподобных грибов к антимикотикам, находящиеся в пределах стандартных величин.

4. Таурозид Sxl снижает адгезию С. albicans к буккальным эпителиоцитам человека в концентрации 62,5 мг/л.

Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно провел информационный поиск, анализ источников литературы. Вместе с научным руководителем сформулировал цель и задачи работы, проанализировал и обобщил полученные результаты. Все лабораторные исследования, оформление первичной документации, статистическая обработка результатов проведены диссертантом самостоятельно. Исследования были проведены на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГУ «Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского». Автор непосредственно принимала участие в написании научных работ по теме диссертации. В статьях, опубликованных в соавторстве, доля участия всех авторов равнозначная.

Апробация диссертационной работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на: заседаниях Крымского филиала Украинского научного медицинского общества м икробиологов, эпидемиологов и паразитологов им Д.К. Заболотного (Симферополь, 2002, 2009); 1-ом всероссийском конгрессе по медицинской микологии «Успехи медицинской микологии» (Москва,2003), научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы педиатрии. От ребёнка к взрослому» (Севастополь, 2008); научно-практической конференции «Шпитальш ¡нфекцн: сучасний стан проблеми» (Харьков, 2008); всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Внутрибольничные инфекции и методы определения механизмов резистентности их возбудителей к антимикробным препаратам» (Киев, 2010); юбилейной конференции по медицинской микологии к 100-летию З.Г.Степанищевой (Москва, 2013), VI-ом всероссийском конгрессе по медицинской микологии «Успехи медицинской микологии» (Москва, 2014).

Апробация диссертации состоялась на межкафедральном заседании «Микробиология, инфекционные болезни и дерматовенералогия» Государственного учреждения «Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского» (Симферополь).

Публикации. По теме кандидатской диссертации опубликованы 32 работы, из них 4 статьи в рецензируемых журналах, 1 патент, 12 статей в сборниках научных работ и других изданиях и 15 тезисов конференций.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 188 страницах, включает 19 таблиц и 57 рисунков. Диссертация состоит из вступления, обзора литературы (раздел 1), описания материалов и методов исследования (раздел 2), четырех разделов собственных исследований (разделы 3-6), обсуждения результатов, выводов, рекомендаций. Список использованных источников литературы включает 228 названий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали референс-штаммы Candida albicans ССМ 885 и С. albicans АТСС 885-663, а также изоляты дрожжеподобных грибов, выделенных от 24 здоровых людей и 70 людей с различной патологией: стоматологических

больных (21), больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБДК, 11 человек), ВИЧ-инфицированных детей (24) и детей с другой патологией (14 человек). Всего было изучено 104 изолята грибов рода Candida: С. albicans - 73, С. dubliniensis - 6, С. famata - 2, С. glabrata - 1, С. guilliermondii - 1, С. kefyr -1, С. krusei - 5, С. hisitaniae — 4, С. parapsilosis — 7, С. tropicalis - 4 изолята. Также были получены: 1 изолят Saccharomyces cerevisiae от стоматологических больных, 2 изолята Saccharomyces cerevisiae и 1 изолят Geotrichum capitatum от больных ЯБДК.

Для изучения чувствительности бактерий к таурозидам использовали 22 штамма: эталонные штаммы бактерий - Bacillus subtilis АТСС 6633, Escherichia coli АТСС 25922, Escherichi a coli 3912/41, Micrococcus luteus АТСС 9341, Staphylococcus aureus АТСС 6538P, Corynebacterium xerosis NC 12078 (ГИСК им. Л. А. Тарасевича, Москва, Россия), Alcaligenes faecalis 415 (Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашевского, Киев, Украина), Corynebacterium diphtheriae 235 (городская СЭС, г. Симферополь), а так же штаммы Shigellaflexneri, Bacillus cereus, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae 87, Salmonella typhimurium 129, Proteus mirabilis — 2 штамма (Республиканская СЭС АР Крым, г. Симферополь). Кроме того, использовали 6 изолятов Staphylococcus aureus, полученных от больных.

Выделение и идентификацию грибов и бактерий проводили в соответствии со стандартными методиками (Лещенко, 1992; Тец, 1994; Каплш и др., 2006). Биохимические свойства грибов изучали с помощью тест-систем "Auxocolor 2" (BioRad, Франция), биохимические свойства стафилококков - с помощью тест-системы "Staphytest 16" (PLIVA-Lachema Diagnostika s.r.o., Чехия).

Изучили антимикробное действие тритерпеновых сапонинов таурозидов Н2 и I, выделенных из плюща крымского (Hederá taurica Carr.), а также таурозида Sxl, представляющего собой З-0-a-L рамнопиранозил (1—>2) - a-L-арабинопиранозид хедерагенина и являющегося синтетической модификацией таурозида Н2 Указанные тритерпеновые гликозиды были получены в Таврическом национальном университете, г. Симферополь, и предоставлены для исследований доктором химических наук, профессором Гришковцом В.И. Для сравнительного изучения в работе использовали следующие препараты антимикотиков: амфотерицин В (Bristol-Myers Sqibb, Франция), флюконазол (Genom, Индия), дифлюкан (Pfizer, США), кетаконазол (Janssens-Silag, Бельгия).

Для изучения антимикробного действия сапонинов применяли стандартный метод серийных разведений в жидкой среде (Навашин и др., 1982), метод дисков и метод колодцев (Метод, реком., 1982). Кроме того, для количественного определения чувствительности полученных изолятов грибов к сапонину таурозиду Sxl и антифунгальным препаратам использовали модифицированный нами микро-метод серийных разведений на среде RPMI-1640 (ООО «БилоТ», Санкт-Петербург, Россия) с добавлением 3% лошадиной сыворотки. По чувствительности к амфотерицину В изоляты разделяли на чувствительные

(МПК - 0,09-0,78 мкг/мл), умеренно-чувствительные (МПК-1.00-2,00 мкгмл) и устойчивые (МПК > 2,00 мкг/мл) согласно рекомендациям CLSI/NCCLS -Институт по клиническим и лабораторным стандартам (Саттон, 2001). Для проведения исследований влияние тритерпеновых сапонинов таурозидов на адгезию грибов C.albicans к буккальным эпителиоцитам использовали метод А.Н. Маянского с соавторами.

Сравнительное изучение противогрибковых свойств таурозида Sxl и амфотерицина В in vivo проводили на модели генерализованого кандидоза у мышей на фоне иммунодепрессии. Использовали мышей линии BALB/c массой тела 18-20 г и музейный штамм С. albicans ССМ 885. Иммунодепрессию создавали внутримышечным введением гидрокортизона в дозе 100 мкг/кг по 0,1 мл раствора на мышь по следующей схеме: за 1 сутки до заражения грибами, через 3 часа после заражения, затем через сутки и через двое суток после заражения. Заражение мышей грибами проводили внутрибрюшинным введением 1 мл взвеси клеток С. albicans 2x105 КОЕ/мл. Исследуемые вещества вводили внутрибрюшинно по 0,1 мл на мышь по следующей схеме: через 1 час, через сутки, через двое и через трое суток после заражения. Результаты учитывали по выживаемости животных на протяжении 50 дней после заражения. Для проведения патоморфологического исследования часть животных с соблюдением правил биоэтики забивали на 5-й день эксперимента, после чего забирали фрагменты тонкого кишечника, легких, печени, почек и сердца, готовили гистологические срезы, окрашивали гематоксилин-эозином и изучали микроскопически.

Статистическую обработку результатов исследования проводили путём оценки достоверности различий полученных величин с помощью t-критерия Стыодента (Pt, Р). Наличие корреляционной связи для выборок значений показателей инактивации микроорганизмов разными исследуемыми веществами определяли с помощью расчёта коэффициента корреляции Пирсона. Для этого использовали комплект программ Microsoft Excel 5,0 и программу MedStat (Миняев, 1998; Лапач, 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Раздел 3. Видовой спектр и чувствительность к известным антимикотикам дрожжеподобных грибов, выделенных в 2000-2008 годах от больных и здоровых люден в г. Симферополе.

Изучили видовой состав и чувствительность к антифунгальным препаратам и таурозиду Sxl 108 изолятов дрожжеподобных грибов (104 изолята принадлежали к грибам рода Candidà), выделенных от здоровых людей и людей с различной патологией: стоматологических больных, больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, ВИЧ- инфицированных детей и детей с другой соматической патологией.

Грибы вида С. albicans обнаруживали в приблизительно одинаковом проценте случаев как у здоровых людей, так и у больных со стоматологической патологией (около 80%). Близкие результаты получили при изучении ВИЧ-инфицированных больных (70,6%). Изоляты, выделенные в группе детей с соматической патологией, идентифицировали как С. albicans в 50% случаев. Самый низкий процент выделения грибов вида С. albicans был зарегистрировали у больных ЯБДК (35,7%), что могло быть связано как с особенностями патологии, так и с своеобразием микрофлоры желудка. Наиболее разнообразный видовой состав грибов рода Candida обнаружили в группе ВИЧ- инфицированных детей (10 выделенных штаммов С. non-albicans принадлежали к 5 разным видам). Наименьшее видовое разнообразие было присуще больным с ЯБДК. Только у здоровых людей был обнаружен вид С. glabrata. Грибы вида С. guilliermondii выделили только от детей с соматической патологией, из материалов ВИЧ-инфицированных детей изолировали C.famata и С. kefyr.

Среди 104 изолятов грибов рода Candida, выделенных от здоровых людей и больных с различной патологией, устойчивыми (определено методом дисков) оказались: к нистатину от 16,7 до 50% изолятов, к итраконазолу от 36,4% до 95,0%, к клотримазолу от 18,2% до 79,4 %, к флюконазолу от 27,3% до 82,3% изолятов.

Раздел 4. Определение воздействия тритерпеновых сапонинов таурозидов на микроорганизмы с использованием различных методов и усовершенствование методики тестирования в соответствии со стандартами CLSI/NCCLS.

Изучили антимикробное действие тритерпеновых сапонинов таурозидов Н2, I, выделенных из плюща крымского (Hederá taurica Carr.), и модифицированного сапонина таурозида Sx 1. Показали, что таурозиды Н2 и I не оказывают антимикробного действия на бактерии в максимальной используемой концентрации 2000 мг/л и на грибы рода Candida в максимальной используемой концентрации 1000 мг/л. Таурозид Sxl также не проявлял антимикробную активность по отношению к бактериям, но обладал противогрибковым действием в отношении разных штаммов грибов рода Candida.

Все исследованные нами штаммы бактерий, за исключением Bacillus cereus, не были чувствительны к таурозиду Sxl в концентрации 1000 мг/л. На В. cereus таурозид Sxl оказывал бактерицидный эффект в концентрации 1000 мг/л, но не подавлял рост бактерий в концентрации 500 мг/л. Чувствительность грибов рода Candida была существенно выше. На большинство изолятов грибов таурозид Sxl действовал при МПК 150-500 мг/л. Таким образом, было установлено, что таурозид Sxl обладает избирательным противогрибковым действием.

При попытке сравнения МПК таурозида Sxl и МПК известных антимикотиков, определенных с помощью метода серийных разведений на среде Сабуро, мы столкнулись с рядом трудностей. Установленные нами

значения МПК известных антимикотиков не совпадали с величинами, приводимыми зарубежными исследователям^ например - рекомендации CLSI/ NCCLS). В связи с этим решили модифицировать методику определения антифунгальной активности веществ для создания возможности адекватного сравнения результатов собственных исследований с данными, полученными другими исследователями. В ходе работы создали модификация микрометода определения чувствительности дрожжеподобных грибов к антимикотикам и экспериментальным веществам с использованием среды RPM1-1640 с добавлением 3% лошадиной сыворотки, которая позволила установить величины МПК антифунгальных препаратов (амфотерицин В) для клинических изолятов грибов на уровне значений, соответствующих стандартам CLSI/NCCLS.

Раздел 5. Чувствительность к таурозиду Sxl и амфотсрицину В дрожжеподобных грибов, выделенных в 2000-2008 годах от больных и здоровых людей в г. Симферополе.

С помощью модифицированного микрометода изучили воздействие таурозида Sx 1 и амфотерицина В на изоляты грибов рода Candida, полученные от здоровых людей и больных с различной патологией.

В группе здоровых людей значения МПК таурозида Sxl колебались в пределах 125 -500 мг/л, а амфотерицина В - в пределах 0,09-1,56 мг/л (рисунок 1 и 2). Большинство изолятов дрожжеподобных грибов (95,8 %), оказались чувствительны к тритерпеновому сапонину таурозиду Sxl (МПК 125-250 мг/л). К амфотерицину В были чувствительны 95,8% изолятов.

стоматологическая больные ЯБДК патология

дети с ВИЧ-

соматической инфицированные патологией дети

1МПК 125 мг/л □ МПК 250 мг/л D МПК 500 мг/л

Рисунок 1 - Чувствительность к таурозиду Sx 1 грибов рода Candida, выделенных от здоровых людей и больных с различной патологией.

здоровые стоматологическая больные ЯБДК дети с ВИЧ-

патология соматической инфицированные

патологией дети

| ■Чувствительные □ умеренно-чувствительные □ устойчивые |

Рисунок 2 - Чувствительность к амфотерицину В грибов рода Candida, выделенных от здоровых людей и больных с различной патологией.

Для изолятов, полученных от стоматологических больных, значения МПК таурозида Sx 1 колебались в пределах 125-250 мг/л, а амфотерицина В - 0,19-6,25 мг/л. Число высокочувствительных к таурозиду Sxl изолятов (МПК 125 мг/л) среди грибов, выделенных у больных со стоматологической патологией (71,4%), оказалось выше, чем в группе здоровых людей (45,8%). К амфотерицину В были чувствительны 71,4% изолятов, 28,6% оказались умеренно-чувствительными или устойчивыми.

В группе больных ЯБДК значения МПК таурозида Sxl определяли в пределах 125-250 мг/л, а амфотерицина В - 0,39-1,56 мг/л. Все выделенные изоляты грибов обладали чувствительностью к сапонину при МПК 125-250 мг/л, но не все - к амфотерицину В, 18,2% изолятов, полученных от данной группы больных, проявили умеренную чувствительность к амфотерицину В, устойчивых штаммов не обнаружили.

Для изолятов, полученных от детей с соматической патологией значения МПК составляли для таурозида Sxl - 250-500 мг/л, для амфотерицина В - 0,191,56 мг/л. В данной группе грибов не выявили изолятов, высокочувствительных к сапонину. Тем не менее, более 80 % изолятов грибов погибали при концентрации таурозида Sxl 250 мг/л. В этой группе доля малочувствительных к таурозиду Sxl изолятов (МПК 500 мг/л) была наивысшей (14,3%) по сравнению с другими исследованными группами. В данной группе грибов не обнаружили изоляты, устойчивые к амфотерицину В. Однако, около трети изолятов занимали промежуточное положение и были отнесены к умеренно-чувствительным.

В группе изолятов грибов, полученных от ВИЧ-инфицированных детей, значения МПК таурозида Sxl колебались от 125 до >500 мг/л, MIIK амфотерицина В - от 0,19 до 6,25 мг/л. Для подавляющего большинства изолятов (94,6%), МПК сапонина составляла 125-250 мкг/мл. Среди грибов, полученных от ВИЧ - инфицированных людей, устойчивых к амфотерицину В, изолятов было меньше (2,3%), по сравнению с показателями группы здоровых людей (4,2%). При этом умерено-чувствительных изолятов было вдвое больше (8,8%). Количество чувствительных изолятов, выделенных от ВИЧ -инфицированных детей, оказалось близким к количеству соответствующих изолятов, выделенных от здоровых людей. Дополнительно с помощью метода дисков определяли чувствительность изолятов грибов данной группы к ряду антимикотиков. При этом устойчивость к амфотерицину В составила 9,5%, нистатину - 47,6%, итраконазолу - 100%, клотримазолу - 80,9% и флюконазолу - 90,5%. Уровни устойчивости к антимикотикам изолятов грибов, выделенных от ВИЧ-инфицированных пациентов, были в 1,5-2 раза выше соответствующих показателей, определенных для изолятов, полученных от здоровых людей. Исключение составлял только амфотерицин В, к которому грибы, полученные от ВИЧ — инфицированных, оказались менее устойчивы (15,4% устойчивых среди изолятов, выделенных от здоровых людей).

Различия средних значений МПК таурозида Sxl для изолятов, выделенных от здоровых людей и больных с различной патологией, оказались статистически недостоверны почти для всех исследуемых групп. Исключение составляли только грибы С. albicans, выделенные в группе больных с детской соматической патологией. Чувствительность изолятов С. albicans, полученных от пациентов с детской соматической патологией, оказалась достоверно меньше (МПК=285,7±35,7 мг/л), чем чувствительность грибов этого же вида, выделенных от здоровых людей (МПК=190,8±14,7 мг/л, р=0,007).

Различия значений МПК амфотерицина В для группы здоровых людей и больных с различной патологией были также статистически недостоверны (от р=0,078 до р=0,636).

Суммарная характеристика чувствительности всех выделенных в ходе исследования изолятов грибов рода Candida к таурозиду Sxl и амфотерицину В представлена на рисунках 3 и 4.

Значения МПК таурозида Sxl (рис.3) для большинства (95,1%) изученных грибов рода Candida составляли - 125 мг/л и 250 мг/л. Низкую чувствительность (МПК - 500 мг/л) проявили около 5% изолятов.

Согласно данным литературы (Sparg, 2004), лишёнными антифунгальной активности считаются вещества, подавляющие рост грибов при МПК> 1000 мг/л. Таким образом, среди изученных нами грибов абсолютно устойчивых к таурозиду Sxl изолятов выявлено не было.

Минимальная подавляющая концентрация, мг/л

Рисунок 3 - Суммарная чувствительность к сапонину таурозиду Sxl грибов рода Candida, изолированных от здоровых людей и больных с различной патологией в 2000-2008 гг. в г. Симферополе (п=104).

Чувствительные Умеренно- Устойчивые

чувствительные

Рисунок 4 - Суммарная чувствительность к амфотерицину В грибов рода Candida, изолированных от здоровых людей и больных с различной патологией в 2000-2008 гг. в г. Симферополе (п=104).

Большинство изолятов грибов рода Candida было также чувствительно и к амфотерицину В (МПК - 0.09-0,78 мг/л). Умеренную чувствительность проявили 13.5% изолятов (МПК - 1,00-2,00 мг/л). Устойчивыми к амфотерицину В из всех изученных изолятов оказалось 3,8 % (МПК > 2,00 мг/л).

Раздел 6. Определение воздействия тритерпеновых сапонинов таурозидов из плюща крымского на адгезивные свойства Candida albicans и развитие кандидоза у мышей.

Для изучения механизма антифунгального действия исследовали влияние таурозидова Sxl на адгезивные свойства грибов рода Candida в отношении буккального эпителия. Определяли индекс адгезии (ИА), индекс прочности адгезии (ИПА) и процент прочноадгезированных грибов к эпителиоцитам.

Результаты исследования влияния таурозида Sxl на адгезивные свойства С. albicans представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Влияние различных концентраций таурозида Sxl на адгезию

С. albicans ССМ 885 к буккальным эпителиоцитам

Показатели Контроль Концентрация таурозида Sxl, мг/л

125,0 62,5 31,2 15,6

ИА 3,52±0,07 1.40±0,10 2,39±0,01 3,20±0,08 3,36±0,02

ИПА 1,74±0,04 0,75±0,07 1,37±0,04 1,65±0,05 1,66±0.06

% прочноадгезированных кандид 50,10±0,04 53,98±4,43 56,9±1,90 50,31±1,10 49,22±1,71

В концентрациях 62,5-125 мг/л таурозид Sxl эффективно снижал адгезию грибов к эпителиоцитам. В концентрации 125 мг/л происходило более чем двукратное уменьшения показателей ИА и ИПА, в концентрации 62,5 мг/л эти показатели уменьшались в 1,47 и 1,27 раза соответственно. Указанные различия были статистически достоверны (р<0,05).

Для изучения антифунгальных свойств таурозида Sxl in vivo использовали модель генерализованного кандидоза у мышей, у которых иммунодепрессию создавали внутримышечным введением гидрокортизона. Грибы вводились внутрибрюшинно. Динамика гибели заражённых мышей при терапевтическом трехдневном внутрибрюшинном введении таурозида Sxl или амфотерицина В приведена на рисунке 5.

Таким образом, при генерализованном кандидозе у мышей, терапевтическое трёхдневное введение таурозида Sxl в дозах 50 и 150 мкг/мышь/сутки дозозависимо и статистически достоверно (р=0,013 и р=0,017) повышало выживаемость заражённых животных в 4 и в 7,7 раза, соответственно. Защитный эффект от введения таурозида Sxl в дозе 150 мкг/мышь не уступал результату от введения амфотерицина В в дозе 5 мкг/мышь.

Результаты патоморфологического исследования тканей зараженных грибами мышей показали, что ежедневное введение таурозида Sxl в дозе 150 мкг/мышь к 5 дню после начала эксперимента снижало частоту возникновения гнойно-септических процессов и появления признаков повреждения тканей

U \ контроль -Ж- Sx1-50 мкг/мышь -аАг- Sx1 -150 мкг/мышь -•-АМВ-5 мкг/мышь

\ V \

\\ \

V \\v

Л Л \ ---------------А--------А.

\ ^

\ ■ " " " "

-♦--♦

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 время, дни.

Рисунок 5 - Выживаемость зараженных С. albicans ССМ 885 мышей при терапевтическом введении таурозида Sxl (Sxl) или амфотерицина В (АМВ).

в кишечнике, легких, почках и сердце при менее выраженном влиянии на процессы, происходящие в печени. У животных из опытной группы, которым вводили сапонин, не выявлялись такие признаки повреждения тканей, регистрировавшиеся у мышей контрольной группы, как эрозии и массивный некроз слизистой оболочки тонкой кишки (рисунок 6), очаги инфарктов в почечной ткани, абсцессы в миокарде и фокальный некроз гепатоцитов.

Признаки воспаления (1,2) и повреждения тканей (3,4) кишечника у мышей с кандидозом, получавших таурозид Sxl (опыт), и не получавших этот сапонин (контроль)

я 100

х я

Я 80 в о.

60 40 20 0

8

Ш

1. Отек 2.

Инф иль трация лейкоцитарная В Контроль I

3. Некроз очаговый

Опыт

4. Эррозии, массивный некроз

Рисунок 6 - Наличие признаков воспаления (1,2) и повреждения тканей (3,4) кишечника у мышей с кандидозом. получавших таурозид 8x1 (опыт), и не получавших этот сапонин (контроль).

Признаки воспаления в легких у мышей с кандидозом, получавших таурозид 8x1 (опыт), и не получавших этот сапонин (контроль)

Абсцесс SSSSSS3

Пневмония тотальная :ччч\чч1

Пневмония очаговая [чччуоо

Тромбы с лейкоцитами „чччччч!

Инфильтрация лейкоцитарная .ччччччччччччччччу^та

Геморрагии мелкие Отек

В Контроль ■ Опыт

О 20 40 60 80 Х00 Встречаемость признака, %

Рисунок 7 - Наличие признаков воспаления в легких у мышей с кандидозом, получавших таурозид 8x1 (опыт), и не получавших этот сапонин (контроль).

В отличие от мышей из контрольной группы, у животных из опытной группы, получавших таурозид 8x1, не обнаруживали такие воспалительные явления, как тотальная и очаговая фибринозно-гнойная пневмония, лейкоцитарная инфильтрация, септические тромбы и абсцессы в легочной ткани (рисунок 7), обтурирующие септические тромбы в почках, венозная гиперемия и абсцессы в миокарде.

Приведённые данные, на наш взгляд, свидетельствуют о сохранении таурозидом 8x1 антифунгальных свойств при введении сапонина в организм млекопитающих и перспективности его использования для создания на его основе нового противогрибкового средства.

1. Среди грибов рода Candida, выделенных в г. Симферополе, Крым, С. albicans является преобладающим видом у больных с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и стоматологическими заболеваниями, детей с ВИЧ и соматической патологией. Высеваемость видов С. non-albicans варьировала от 19,04% (стоматологические больные) до 54,5% (ЯБДК).

2. Выявлено, что среди 104 выделенных изолятов грибов рода Candida устойчивыми (определено методом дисков) к антимикотикам оказались: к нистатину от 16,7 до 50% изолятов, к итраконазолу от 36,4% до 95,0%, к клотримазолу от 18,2% до 79,4 %. к флюконазолу от 27,3% до 82,3% изолятов.

ВЫВОДЫ

3. Установлено, что таурозид Sxl обладает фунгнцидным действием в отношении грибов рода Candida (МПК 125-250 мг/л), а таурозиды И, и -I не оказывают антифунгального действия. Таурозиды Sxl, Н2 и -I не проявляют антибактериальной активности.

4. Модифицированный нами микро-метод разведений в среде RPMI-1640 с добавлением 3% лошадиной сыворотки позволяет получать результаты по определению чувствительности дрожжеподобных грибов к антимикотику амфотерицину В (МПК), соответствующие международным стандартам (СLSI/ NCCLS).

5. Грибы рода Candida имеют высокий уровень чувствительности к таурозиду Sxl. Среди 104 изученных изолятов грибов, выделенных от здоровых людей и больных с различной патологией, чувствительными к таурозиду Sxl оказались 95,1% изолятов (МПК125-250 мг/л). При этом к амфотерицину В были чувствительны 82,7% этих изолятов (МПК 0,09-0,78 мг/л), 13,5 % и 3,8 % изолятов оказались умеренно-чувствительными (МПК 1-2 мг/л) и устойчивыми (МПК >2 мг/л) соответственно.

6. Установлено, что таурозид Sxl в концентрациях 125 и 62,5 мг/л снижает индексы адгезии и прочности адгезии С. albicans к буккальным эпителиоцитам человека без изменения процента прочноадгезированных кандид.

7. Таурозид Sxl обладает антифунгальным действием при введении мышам с экспериментальным кандидозом. Терапевтическое введение таурозида Sxl в дозе 7,5 мг/кг повышает выживаемость зараженных животных в 7,7 раза, что не уступает результату от введения амфотерицина В в концентрации 0,25 мг/кг, соответствующей дозировке при лечении микозов у людей. Применение таурозида Sxl в течение 5 дней препятствует образованию септических тромбов, развитию очагов некроза и гнойного воспаления в слизистой оболочке кишечника, легких, печени и почках инфицированных мышей.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

а) статьи в рецензируемых журналах:

1. Лукоянова, И. С. Клинико-микробиологическая характеристика периодонтита, вызванного бактериально-грибковыми ассоциациями / И. С. Лукоянова, Е. Г. Мельниченко, М. А. Кирсанова, Л. И. Авдонина // Таврический медико-биологический вестник. - 2002. - Т. 5. - №4. - С.48-51.

2. Мельниченко, Е. Г. Изучение антимикробной активности сапонинов из плюща крымского (Hederá táurico Carr.) / Е.Г. Мельниченко, М.А.Кирсанова, В.И. Гришковец, Л.В. Тышкевич, Ю. Л. Криворутченко // Микробиологический журнал. - 2003. - Т.65. - №5. - С.8-11.

3. Кирсанова, М. А. Модификация метода определения чувствительности дрожжеподобных грибов рода Candida к антифунгальным препаратам /

М.А.Кирсанова // Таврический медико-биологический вестник. -2007. - Т.10. -№3.-0.157-159.

4. Криворутченко, Ю. JI. ВоздействиесапонинатаурозидаSxl и мирамистина на дрожжеподобные грибы, вызывающие оппортунистические микозы / Ю. JI. Криворутченко, О. Н. Постникова, М. А. Кирсанова, И. Б. Андроновская, В. И. Гришковец // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. -2011.-Т. 1. -№1(1). - С. 79-84.

б) патенты:

5. Пат. 2242484 Российской Федерации, МПК7 А 61 К 35/78, А 61 Р 31/10. Противогрибковое средство «Таурозид Е» и способ его получения / Орлова С. В., Гришковец В. И., Криворутченко Ю. Л., Мельниченко Е.Г., Кирсанова М.А. заявитель и патентообладатель Орлова С. В. - №2003122037; заяв. 18.07.03.;опубл. 10.12.04, Бюл. №34.

в) статьи в других изданиях:

6. Кирсанова, М. А. Антифунгальное действие тритерпенового гликозида Sxl относительно видов рода Candida / М. А. Кирсанова, Е. Г. Мельниченко, Ю. Л. Криворутченко, В. И. Гришковец, Н. С.Лукоянова//Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: тр. Крым. мед. ун-та им. С.И.Георгиевского. - Симферополь, 2002. - Т.138. - 4.2. - С.14-17.

7. Криворутченко, Ю. Л. Кандиды при заболеваниях, традиционно не связываемых с микозами / Ю. Л. Криворутченко, В. В. Жебровский, М.А.Кирсанова, Аль Ола Мухаммед, О. Н. Мясникова, Н. С. Лукоянова, Н. В. Павлова, Е. Б. Чемоданов, Э. М. Кулинич // Експериментальна i клппчна медицина. - 2004. - №2. - С.56-57.

8. Кирсанова, М. А. Различия в протекании экспериментальных кандидозной, гриппозной и смешанной кандидозно-гриппозной инфекции у мышей / М. А. Кирсанова, В. Ю. Малыгина // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: тр. Крым. мед. ун-та им. С.И.Георгиевского. - Симферополь,

2004. - Т. 140. - 4.3. - С.92-96.

9. Кирсанова, М. А. Чувствительность бактериальной микрофлоры к таурозиду Sxl / М.А.Кирсанова // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: тр. Крым.мед. ун-та им. С.И.Георгиевского. - Симферополь: Изд. центр КГМУ,

2005. - Т. 141. - 4.6. - С. 27-29..

10. Криворутченко, Ю. Л. Воздействие на гриппозную и ВИЧ-1 инфекции липофильных производных мурамоилдипептида и сапонина таурозида Sxl, подавляющего рост грибов / Ю. Л. Криворутченко, И. Б. Андроновская, В. Ю. Малыгина, М. А. Кирсанова, А. Е. Земляков, В. И. Гришковец, Л. В. Тышкевич // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-

биологических наук и практического здравоохранения: тр. Крым. мед. ун-та им. С.И.Георгиевского. - Симферополь, 2006. -Т. 142. - 4.5. - С. 80-86.

11. Кирсанова, М. А. Чувствительность грибов рода Candida, полученных от больных с различной патологией и здоровых людей, к сапонину Sxl и амфотерицину В / М. А. Кирсанова // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: тр. Крым. мед. ун-та им. С.И.Георгиевского. - Симферополь, 2008. - Т. 144. - 4.6. -С.41-43.

12. Кирсанова, М. А. Сравнительная характеристика грибов рода Candida, изолированных от ВИЧ-инфицировнных детей и детей с другой патологией / М. А. Кирсанова, Ю. Л. Криворутченко, Е. Ю. Павленко, Е. Г. Мельниченко // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: тр. Крым. мед. ун-та им. С.И.Георгиевского. -Симферополь, 2009. - Т.145. - 4.5. -С.82-85.

13. Лукоянова, Н. С. Грибковая микрофлора в эндодонтии / Н. С. Лукоянова, М. Н. Морозова, М. А. Кирсанова, Л. В. Тышкевич, Ю. Л. Криворутченко, Е. Ю. Шаповалова//Межотраслевое решение проблем височно-нижнечелюстного сустава (сборник статей). - Днепропетровск, 2009. - С. 20-27.

14. Кирсанова, М. О. Видовий склад гриб i в роду Candida, видшених у Криму вщ ВИЛ-нк]нкованих дней, i i'x чутливють до антимжотимв i таурозиду Sxl / М. О. Ю'рсанова, Е. Ю. Павленко, Ю. Л. Криворутченко // Гнфекцшш хвороби. -2010. - №2(60). - С.29-32.

15. Криворутченко, Ю. Л. Чувствительность к мирамистину, амфотерицину В и таурозиду Sx 1 грибов, выделенных о больных в Крыму / Ю. Л. Криворутченко, М. А. Кирсанова, О. Н. Постникова, В. И. Гришковец // Biomedical and Biosocial Anthropology. - 2010. - №15. - C.144-148.

16. Лукоянова, H. С. Микробные ассоциации периапикальных очагов / Н. С. Лукоянова, Л. И. Авдонина, М. Н. Морозова, М. А. Кирсанова, Л. В. Тышкевич, Ю. Л. Криворутченко // Эндодонтист. -2010. -№2(4). - С. 3-7.

17. Криворутченко, Ю. Л. Чувствительность патогенных дрожжеподобных грибов, выделенных в Крыму, к антисептику мирамистину, коммерческим и экспериментальным антимикотикам /Ю. Л. Криворутченко, М. А. Кирсанова, О. Н. Постникова, И. Б. Андроновская, Т. А. Сарачан, В. И. Гришковец // Труды Крымской академии наук. - Симферополь: ИТ «АРИАЛ», 2011. - С. 118-119.

г) тезисы докладов на научных конференциях:

18. Кирсанова, М.А. Тритерпеновые гликозиды из Hederá tanrica Carr. обладают антифунгальными свойствами в отношении грибов рода Candida / М.А. Кирсанова. Ю.Л. Криворутченко, В.И. Гришковец, Е.Г. Мельниченко, В.Я. Чирва // Новые технологии получения и применения биологически активных веществ: междунар. науч.-практ. конф., 20-25 мая 2002 г.: тезисы док. -Симферополь: КНЦ, 2002. - С. 148-149.

19. Криворутченко, Ю.Л. Противокандидозное действие сапонинов из крымского плюща in vitro / Ю.Л. Криворутченко, М.А. Кирсанова, Е. Г. Мельниченко, В.И. Гришковец, В .Я. Чирва, О.Н. Вислогузова // Вестник Винницкого государственного медицинского университета. - 2002. — №2. -С. 299-300.

20. Крутиков, С. Н. Патогенетическое обоснование антифунгальной терапии у больных с гастроинтестинальной патологией: материалы VIII междунар. конгр. по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть» ( Канны, Франция, 21-24 апреля 2002г.) /С. Н. Крутиков, Ю. Л. Криворутченко, В. Н. Куница, Э. М. Кулинич, Е. Г. Мельниченко, М. А. Кирсанова, О. Н. Постникова, М. С. Крутикова // International Journal on Immunorehabilitation. - 2002. - Т. 4. -№1. - C.147.

21. Криворутченко, Ю.Л. Антикандидозные свойства сапонинов из Крымского плюща / Ю.Л. Криворутченко, М.А. Кирсанова, Е.Г. Мельниченко, В.И. Гришковец, В.Я. Чирва//Успехи медицинской микологии: материалы первого всероссийского конгресса по микологии- Москва, 2003. -Т. 1- С.100-102.

22. Криворутченко, Ю.Л. Грибы родаСапсМапри заболеваниях, традиционно не связываемых с микозами / Ю. Л. Криворутченко, В.В. Жебровский, М. А. Кирсанова, Аль Ола Мухаммед, О. Н. Мясникова, Н. С. Лукоянова, Н. В. Павлова, Е. Б. Чемоданов, Э. М. Кулинич // Успехи медицинской микологии: матер. II Всероссийск. конгр. по медицинской микологии. - Москва, 2004. - Т.4. - С.64-65.

23. Малыгина, В. Ю. Внутрибрюшинное введение живых грибов рода Candida изменяет развитие экспериментальной гриппозной инфекции у мышей / В. Ю. Малыгина, М. А. Кирсанова, Ю. Л. Криворутченко // Успехи медицинской микологии: матер. II всероссийск. конгр. по медицинской микологии. -Москва, 2004. - Т.4. - С.67.

24. Кирсанова, М. А. Чувствительность грибов рода Candida, выделенных от ВИЧ- инфицированных детей, к известным антимикотикам и сапонину Sxl /М. А. Кирсанова // Госпитальные инфекции: современное состояние проблемы: матер, науч.-прак. конф., 11-12 декабря 2008 г.. -Харьков: НФУ, 2008. - С. 48-49.

25. Кирсанова, М. А. Влияние тритерпенового гликозида, полученного из крымского плюща Hederá taurica Carr., на грибы рода Candida, выделенные от ВИЧ- инфицированных пациентов / М. А. Кирсанова // Вестник морского врача. -2008. -№6. - С.105.

26. Кирсанова, М. А. Чувствительность грибов рода Candida, изолированных от людей с различной патологией, к тритерпеновому сапонину Sxl и амфотерицину В in vitro и in vivo / М. А. Кирсанова, Ю. Л. Криворутченко // Вестник морского врача. -2009. - №8. — С. 112-113.

27. Кирсанова, М. A. In vitro и in vivo чувствительность грибов рода Candida к амфотерицину В и таурозиду Sxl / М. А. Кирсанова // Внутрибольничные инфекции и методы определения механизмов резистентности их возбудителей

к антимикробным препаратам: матер, научн.-практ. конфер. с междун. участ. 2526.05. 2010 г.-Киев. 2010. - С. 86.

28. Кирсанова, М. А. Сравнительная характеристика чувствительности к таурозиду Sxl и амфотерицину В грибов рода Candida, выделенных в 2000— 2008 гг. в Симферополе от людей с различной патологией/ М. А. Кирсанова, Ю. Л. Криворутченко, Л. В. Тышкевич // Теоретичш засади опттшащ'Т системи ешдемюлопчного нагляду за шфекцшними хворобами в Укра'пй та ceiTi на сучасному еташ: матер, науч.-прак. конф., 13-10 жовтня 2011 г. - Киев: 2011. -С. 25-26.

29. Кирсанова, М. А. Чувствительность различных видов грибов рода Candida к амфотерицину В и таурозиду Sxl/M. А. Кирсанова, Ю. Л. Криворутченко //Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т.З. -№2. - С. 138

30. Кирсанова, М. А. Чувствительность к антимикотикам грибов рода Candida, выделенных в в 2000-2008 гг. в Симферополе / М. А. Кирсанова, Ю. Л. Криворутченко, О.Н. Мясникова, Л. В. Тышкевич, Н.С. Лукоянова // Успехи медицинской микологии: матер, юбел. конф. по медицинской микологии, 26 сентября 2013 г. - Москва, 2013. - Т. 11. - С.95.

31. Кирсанова, М. А. Влияние таурозидов, полученных из Плюща крымского, на адгезивные способности грибов рода Candida / М. А. Кирсанова, Ю. Л. Криворутченко, И. Б. Андроновская, Т. А. Сарачан) //XIII съезд общества микробиологов Украины им. С. Н. Виноградского: тез.докладов, 1-6 октября 2013г.-Ялта: 2013.-С.255.

32. Кирсанова, М. А. Изучение чувствительности грибов рода Candida к таурозиду Sxl на модели диссеминированного кандидоза / М. А. Кирсанова, Ю. Л. Криворутченко, В. Ю. Малыгина // Успехи медицинской микологии: матер. VI всероссийск. конгр. по медицинской микологии. - Москва, 2014. -Т. 12. -С.408.

Подписано в печать 30.09.2014 р. Формат 60x90/16. Физ. печ. л. 0.9. Усл.-печ. л. 0,9. Тираж 100 экз. Зак. № 358.

Отпечатано в издательском центре КГМУ имени С.И. Георгиевского г. Симферополь, бул. Ленина, 5/7