Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Средства для защиты от микроповреждений на основе фунгицидов и ингибиторов пигментообразования у грибов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Средства для защиты от микроповреждений на основе фунгицидов и ингибиторов пигментообразования у грибов"

На прав ахрукописи

Кузикова Ирина Леонидовна

СРЕДСТВА ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОТ МИКОПОВРЕЖДЕНИЙ НА ОСНОВЕ ФУНГИЦИДОВ И ИНГИБИТОРОВ ПИГМЕНТООБРАЗОВАНИЯ У ГРИБОВ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2004

Работа выполнена в лаборатории микологии и микробиологии Санкт-Петербургского Научно-исследовательского центра экологической безопасности РАН.

Научный руководитель: доктор технических наук Н.Г. Медведева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.П. Денисова канд. биологических наук O.K. Струнникова

Ведущая организация:

Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия

Зашита состоится 16 июня 2004 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета К.006.028.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии.

Автореферат разослан "/3 '¿-¿¿4&12004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат биологических наук

Алисова

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Биоповреждения возникли одновременно с деятельностью человека и будут существовать, пока человек производит материалы, изделия, сооружения, непрерывно насыщая ими среду, и которые с позиций окружающей среды и живых организмов попадают в категорию загрязнителей.

Потерн от этого вида повреждений достигают колоссальных размеров и составляют в мировом масштабе многие десятки миллиардов долларов ежегодно [Коваль, Сидоренко, 1989]. Если в начале 50-х годов эксперты приравнивали экономический ущерб от биоповреждений к 2% стоимости промышленной продукции, то к концу 70-х годов он достигал 7-5% [Ильичев, 1989]. Не менее значительными являются потери, не поддающиеся экономическому учету и касающиеся культурных ценностей.

Основными и широко распространенными агентами биоповреждений являются микроорганизмы и, прежде всего, мицелиальные грибы [Коваль, Сидоренко, 1989]. Благодаря быстрому росту, разнообразному и лабильному ферментному аппарату, практически любые по химическому составу и свойствам материалы могут быть для них питательными субстратами [Ильичев и др. 1995].

Для защиты материалов и изделий от повреждений, вызываемых микроорганизмами, существует много способов - механические, физические, химические. Основным из них, до настоящего времени, является использование химических веществ, оказывающих биоцидное действие на микроорганизмы [Бочаров и др., 1985; Бочаров, Прокофьев, 1988; Ильичев, 1989; Бочаров, 1983]. По биологическому действию биоциды подразделяют на фунгициды и бактерициды.

Однако, из множества таких веществ в практике используют лишь незначительную часть из них из-за несоответствия таким важнейшим требованиям, как экологическая Чистота, безвредность для человека и животных или защищаемого материала.

В связи с этим, а также с постоянно возрастающим многообразием материалов, подвергаемых биоповреждениям, многообразием видов - возбудителей повреждений при одновременно повышающихся природоохранных требованиях, предъявляемых к биоцидам, потребность в экологически чистых и эффективных биоцидах велика и постоянно возрастает.

В настоящее время одним из актуальных направлений в области защиты и профилактики от биоповреждений, в том числе микробиологических, является разработка научно-обоснованных путей изыскания, создания таких биоцидов с заданными свойствами и, что не менее важно, совершенствование методов их оценки [Бочаров, 1988]. Последнее особенно важно в связи с тем, что действие фунгицидов изучается главным образом, в биоцидных концентрациях, без учета того, что роль химических соединений всегда временная и возникает проблема устранения и возможного погладундщего влшп я н а материалы, на активность и характер время

С-Пстсввург 1 /н I

СПстсрвург ОЭ ЯНУ/»

действие фунгицидов в суббиоцидных концентрациях на физиолого-биохимическую активность грибов - биодеструкторов промышленных материалов остается неизученным, как и вопрос о причинах более сильного повреждения грибами материалов, ранее обработанных фунгицидами [Горгчаро-ва, 1990].

Учитывая жесткие требования к биоцидам с точки зрения их экологической чистоты и безвредности для человека, можно предположить целесообразность их поиска среди веществ природного происхождения, образуемых и издавна существующих в природе. К таким веществам относятся антибиотики, являющиеся продуктами метаболизма живых организмов, главным образом микроорганизмов.

Цель работы - разработка научно-методических подходов создания комплексных антифунгальных препаратов на основе фунгицидов (в том числе антибиотиков) и ингибиторов пигментообразования у грибов, разработка критерия оценки фунгицидов, учитывающего их действие на физиологическую активность грибов.

Основные задачи, поставленные в работе:

• Определить характер действия фунгицидов в суббиоцидных концентрациях на рост и образование у грибов метаболитов, вызывающих биоповреждения - органических кислот, гидролитических ферментов, пигментов (в последующем факторы биоповреждений).

• Разработать критерий аттестации фунгицидов с использованием их свойства влиять на образование грибами факторов биоповреждений.

• Исследовать зависимость между интенсивностью пигментообразова-ния у грибов и их чувствительностью к фунгицидам.

• Разработать научно-методические подходы для повышения биологической активности фунгицидов и снижения продукции грибами факторов биоповреждений.

• Исследовать противогрибковые антибиотики - неполиеновый (им-брицин) и полиеновые (амфотерицин В, нистатин, леворин, микогептин) как возможное средство для борьбы с микоповреждениями.

• Разработать эффективный противогрибковый препарат с использованием антибиотика и ингибитора пигментообразования.

• В лабораторных условиях провести испытания разработанных препаратов, как средств защиты от микоповреждений с использованием целлюло-зосодержащих материалов (бумага, хлопковая ткань).

Научная новизна. Впервые проведены систематические исследования влияния известных фунгицидов на образование грибами различных систематических групп продуктов метаболизма, под действием которых происходит биоповреждения - пигментов, органических кислот, некоторых гидролитических ферментов (амилаз, целлюлаз, протеаз). Показано, что все исследуемые фунгициды (катамин АБ, метацид, формалин, ликводек, трилан), не зависимо от их химической природы-активизируют биосинтез окрашенных продуктов метаболизма. При незначительном (на 19-35%) подавлении роста грибов про-

дуктивность единицы биомассы по пигментам возрастает в 1,5-2,5 раза. Характер и степень воздействия фунгицидов на кислотопродукцию определяется, прежде всего, свойствами тест - культур - у грибов рода Penicilliwn она возрастает (на 20-100%) в зависимости от фунгицида, а у рода Aspergillus -несколько снижается. На активность комплексов целлюлолитических и про-теолитических ферментов исследуемые фунгициды не оказывают существенного влияния, но у всех культур грибов на 10-90% в зависимости от их свойств повышают активность амилаз.

Показано, что при снижении продуктивности биомассы по пигментам с помощью ингибитора пигментогенеза возрастает чувствительность грибов к фунгицидам. Основным местом депонирования пигментов является наружный слой клеточной поверхности. Разработан научно-методический подход создания комплексных препаратов для защиты от биоповреждений на основе фунгицида и ингибитора пигментогенеза, преимущества, которых состоят в повышении эффективности фунгицидного действия и снижении отдаленных негативных последствий от их применения. Впервые изучена фунгицидная активность полиеновых противогрибковых антибиотиков по отношению к широко распространенным возбудителям микоповреждений и фитопатоген-ным грибам. Выявлено ранее неизвестное свойство этих антибиотиков подавлять процессы пигментообразования, а также активность некоторых гидролитических ферментов - амилаз. Преимущество антибиотиков, как фунгицидов проявляется еще и в том, что действие их на физиолого-биохимические показатели у грибов проявляется при очень низких концентрациях в среднем от 0,3 до 10 мкг/мл в зависимости от свойств культур.

Практическая ценность работы. Для более полной оценки фунгицидов, прогнозирования последствий от их применения, определения областей практического использования предложен такой критерий как свойство их влиять на физиолого-биохимическую активность грибов.

Разработан способ получения эффективных средств от микоповрежде-ний, основанный на использовании фунгицидов в комплексе с ингибитором пигментогенеза - ЭДТА. При этом достигается более высокий биоцидный эффект при сокращеннии расхода фунгицида в 2-10 раз (в зависимости от фунгицида).

Показана перспективность создания и поиска эффективных, экологически чистых средств защиты от микоповреждений среди противогрибковых антибиотиков, относящихся к группе макролидных полиеновых антибиотиков.

Показано, что, как и в случае с «химическими» фунгицидами, эффективным способом снижения биоцидной концентрации антибиотиков является использование их в комплексе с ингибиторами пигментогенеза.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на III Международной конференции "В новый век - с новыми технологиями" (Санкт-Петербург, 2000), на 12 Международном симпозиуме по биоповреждениям (Прага, 2002), на Московском биотехнологическом конгрессе (Москва, 2002),

на научной конференции "Сохранение культурного наследия библиотек, архивов и музеев" (Санкт-Петербург, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи и 4 тезисных сообщения.

Рбъем и структура диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 153 наименований. Работа содержит 16 таблиц, 24 рисунка и фотографии.

Материалы и методы исследований

Работа выполнена с Использованием мицелиальных грибов - Aspergillus niger van Tieghem, A.terreus Thorn, A.fumigatus Fresenius, Aureobasidiumpullu-lans (de Bary) Arnuud, .Penicillium funiculosum Thorn, P. ochrochloron Biourge, P. diversion, Paecilomyces variotti Bainier, Chaetomium globosum Kunze, Cepha-losporium'acremonium, Stachybottys'atra, Verticilliumfungiocola, Trichoderma viride Persoon:Fries, Scopulariopsis brevicaulis (Saccardo) Bainier, относящихся к широко распространенным возбудителям биоповреждений различных промышленных материалов; полученных из ВКМ, и фитопатогенных культур -Fusarium oxysporum, Alternaria consortiale, Alternaria radicina, Helmintospo-rium inaeguale, Botritis cinerea, Helmintosporium sativum, полученных из коллекции - микроорганизмов Санкт-Петербургского Ботанического института Академии Наук и из Всесоюзного научно-исследовательского института технологии антибиотиков и ферментов медицинского назначения (ВНИТИАФ).

В работе использовали фунгициды, широко применяемые в практике защиты материалов от микоповреждений, - катамин АБ, метацид, форма-лин,оксихинолят меди, салициланилид, трилан, а также полиеновые противогрибковые антибиотики: амфотерицин В производства АКО "Синтез" (г. Курган) с активностью 850 Ед/мг, нистатин с активностью 3500 Ед/мг, леворин с активностью — 450 мкг/мг, микогептин с активностью - 530 мкг/мг и неполи-еновый антибиотик имбрицин с активностью - 750 мкг/мг производства ОАО "Биосинтез" (г. Пенза). Степень подавления роста на агаризованных средах с фунгицидами, в том числе и с противогрибковыми антибиотиками, вычисляли по формуле Эбботта. Интенсивность -образования пигментов и спор оценивали визуально.

При культивировании грибов в жидкой среде Чапека с 3% крахмала прирост биомассы определяли весовым методом, а количество пигментов в мицелии - методом водно-щелочной экстракции [Лысенко, Лях, 1977; Рубан и др., 1969]. Спектры поглощения водно-щелочных экстрактов в видимой части света (400-600 нм) снимали на СФ-46. Относительное содержание внеклеточных пигментов в нативном растворе определяли по их спектрам поглощения при 400-600 нм (СФ-46).

Амилолитическую активность грибов при культивировании на агари-зованной среде Чапека с крахмалом определяли общепринятым методом (по

диаметру зон гидролиза крахмала) [Егоров, 1983]; при культивировании в жидкой среде методом, основанным на гидролизе крахмала ферментами ами-лолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы [Грачева и др., 1982]. Протеолэтическую (желатиназную) активность грибов определяли на агаризованной среде МПЖ (мясо-пептонная желатина) по диаметру зон разжижения желатины [Егоров, 1983]. Активность комплекса целлюлозолитических ферментов, выделяемых в культуральную жидкость, определяли методом Мандельс-Вебера [Mandels, Weber, 1969]. Процесс ки-слотообразования контролировали двумя методами: потенциометрически по изменению рН [Веселова и др., 1989; Шевченко и др., 1989] и методом титрования [Ермаков, 1981].

Изучение морфологии грибов проводили просвечивающим [Hayat, 1914] и сканирующим [Black, 1914] методами электронной микроскопии. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-8800, окраску срезов проводили по методу Рейнольдса [Spurr, 1969] уранилацетатом и цитратом свинца. Препараты исследовали в электронном микроскопе GEM-100C (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Сканирующую электронную микроскопию проводили с использованием микроскопа GSM-35C (Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ. Математическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с методиками, изложенными в [Максимов, 1980].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

/. Влияние фунгицидовразличнойхимической природы на биосинтез грибами факторов биодеструкции.

В подавляющем большинстве исследований, посвященных разработке или оценке фунгицидов, внимание уделяется, прежде всего, их биоцидной активности, и не изучается вопрос о влиянии на физиологическую активность грибов, на образование ими факторов биодеструкции - органических кислот, ферментов, пигментов, спиртов и др. В то же время известно, что все фунгициды со временем постепенно теряют свою активность, и создаются условия для развития и размножения биодеструкторов на материале, ранее обработанном фунгицидом. Естественно предположить, что фунгициды в суббио-цидных концентрациях будут оказывать влияние на физиологические признаки грибов, а следовательно, и на характер, степень биоповреждения, то есть будет проявляться «вторичный» эффект или эффект «последствия». В настоящей работе представлены результаты изучения влияния фунгицидов различной химической природы на образование микромицетами различных систематических групп "агрессивных" продуктов метаболизма.

1.1. Влияние фунгицидов на кислотопродукциюу грибов

Как показали результаты, представленные на рисунке 1, характер и степень влияния исследуемых фунгицидов на этот процесс определяется, прежде всего, свойствами культур грибов.

A. niger A. flavus P. funiculosum P. ochrochloron

□ катаминАБ Иметацид □формалин

Рис. 1. Образование органических кислот грибами A. niger, A.flavus, P.funiculosum, P. ochrochloron на среде с фунгицидами. Контроль принят за 100%.

Так, все 3 фунгицида стимулируют кислотообразование у грибов рода Penicillium и, прежде всего, у P. funiculosum. Действие на этот процесс у грибов рода Aspergillus выражено слабо - у A. niger под действием всех фунгицидов наблюдается некоторое снижение количества образуемых кислот - на 16-26%, а у A.flavus снижение их количества на 20% происходит только под действием катамина АБ, в присутствии метацида увеличивается на 20%.

Учитывая, что микоповреждения осуществляются ассоциациями культур микромицетов, очевидно, что под действием того или иного фунгицида количество кислот, выделяемых в среду (а, следовательно, и биоповреждаю-щий эффект) будет зависеть от состава этой ассоциации.

1.2. Влияние фунгицидовна активность некоторых гидролитическихферментов

Активность гидролитических ферментов также изменяется под действием фунгицидов. Значительность этих изменений определяется, как и в случае с кислотообразованием, в зависимости от свойств и фунгицида и культуры. Так, активность комплекса целлюлолитических ферментов на среде с ме-тацидом или формалином у некоторых культур незначительно снижается - на 20-30%, а у других - на столько же повышается. Катамин АБ практически не влияет на активность этих ферментов.

Активность протеолитических ферментов у одних культур в присутствии фунгицидов остается на уровне контроля, а у других (составляющих 50% от общего числа культур) существенно возрастет - на 50-90%. Практически все фунгициды у всех используемых культур повышают суммарную активность амилаз, выделяемых в среду.

Так как ферменты являются одним из основных факторов биохимических повреждений, очевидно, что при выборе фунгицида необходимо учиты-

вать характер его действия (стимуляция/ингибирование) на активность тех грибных ферментов, для которых компоненты повреждаемого материала являются субстратами.

1.3. Влияние фунгицидов на образование пигментов у грибов

Наиболее значительный эффект от действия всех фунгицидов и у всех культур проявляется на процессе пигментообразования (табл. I).

Таблица 1

Влияние фунгицидов (катамина АБ, метацида) на прирост биомассы

__щибов_и ее продуктивность по пигментам_

Катамин АБ 5 • 10-4 % (масс.) Метацид 1 • 10-3 % (масс.)

Тест- Биомасса_Пигменты_Биомасса_Пигменты

культуры г/л % к мг/г % к г/л % к- мг/г % к

_а.с.б. контр. а.с.б. контр, а.с.б. контр, а.с.б. контр.

A. niger 3,3* 390 4,4 369

_-Ц^Г 75 272 143 -665 272 136

A. terreas 3,5 4,2 130

_4j8_65_6j4_90_

A. ílavus —- 78 148 68 132

_5i0_54_7j2_1^6_

P. funículo- 458__50 lc_ „

sum 5,9 81 31 161_Не определяли

Scopulariopsis 4,4 __ 130 ,„„ brevicaulis 5,7 77 75 173 He °пРеДеляли

♦Числитель — опыт, ««Знаменатель - контроль.

Так, катамин АБ, метацид даже при сравнительно невысокой степени подавления роста мицелия (на 19-35%) повышают продуктивность биомассы по пигментам в 1,3-1,9 раза в зависимости от свойств тест - культур и фунгицидов. Так как одной из основных функций пигментов является протекторная, очевидно, что значительная часть известных фунгицидов будет проявлять это свойство. Этот факт приобретает особую значимость в связи с тем, что с увеличением интенсивности пигментообразования будет снижаться и чувствительность грибов к фунгицидам.

Полученные в работе результаты позволили предположить, что использование фунгицидов в комплексе с ингибитором пигментогенеза позволит повысить чувствительность грибов к фунгицидам и, таким образом, сократить их расход и попадание в окружающую среду.

1.4. Сочетанное действие фунгицидов и ЭДТА нарост и пигмептообразованиеу грибов

Из большого числа известных ингибиторов пигментогенеза у грибов как наиболее эффективный был выбран ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), который в концентрации 0,05-0,1% снижает в среднем на 50% продуктивность биомассы по пигментам. С увеличением его концентрации эффект воз-

растает, однако полное подавление процесса образования пигментов не достигается.

При одновременном (сочетанном) использовании ЭДТЛ (0,05-0,1%) и фунгицида в низких концентрациях (1 • 10-4%) происходит снижение продуктивности биомассы по пигментам до уровня, более низкого, чем в контрольных условиях (без ЭДТА и фунгицида). Кроме того, при сочетанном действии фунгицида и ЭДТА минимальная фунгицидная концентрация фунгицида на 1 порядок ниже, чем в варианте без ЭДТА. Этот эффект - 100% подавление роста не является результатом сложения эффектов ("суммарным эффектом"), получаемый от каждого фактора в отдельности, поскольку он значительно выше. Так, например у A. niger под действием катамина АБ выход биомассы снижается на 30%, а под действием ЭДТА - на 14%, то есть "суммарный" эффект составляет всего 44%. Из этих результатов следует, что при сочетан-ном действии фунгицида и ингибитора пигментогенеза повышается чувствительность грибов к фунгицидам. Этот вывод подтверждается известным положениями о протекторной функции пигментов у грибов, и о том, что процессы вторичного метаболизма, каким является и пигментообразование, также важны для клетки, как и другие синтетические процессы, происходящие в процессе роста. Следовательно, клетки с нарушенной функцией по вторичному метаболизму являются менее жизнеспособными [Рубан, 1986]. Из этого следует, что нарушение синтеза пигментов и есть проявление снижения жизнеспособности грибов, повышение их чувствительности к неблагоприятному фактору - фунгициду.

1. Антибиотики как ингибиторы грибов, вызывающихбиоповреждения Вторым направлением работы является оценка перспективности использования для защиты промышленных материалов от микоповреждений природных антибиотических веществ.

2.1. Определение спектра действия и биологической активности полиеновыхантибиотиков Исследование проводили с 15 культурами грибов, относящихся к 10 родам. Грибы культивировали как на поверхности агаризованной среды так и в жидкой среде. Результаты исследований, полученных при культивировании грибов на агаризованной среде показали, что все антибиотики - амфотери-цин В, нистатин, леворин, микогептин проявляют высокую ингибиторную активность по отношению ко всем грибам. Однако наибольшая чувствительность ко всем антибиотикам проявляется у Л. niger, Paecilomyces variotii, T. viride, Scopulariopsis ЬгеукаыШ; к более устойчивым относятся - Л. terreus, Л. /1ауш, P.funiculosum, StachyЬotrys а^а и Chaetomium gloЬosum.

Аналогичные зависимости получены в экспериментах, проведенных на жидкой среде с использованием двух антибиотиков - амфотерицина В и нистатина. Фунгицидная концентрация отдельных антибиотиков зависит как от свойств культуры, так и антибиотика (таблица 2).

Таблица 2

Минимальная фунгицидная концентрация амфотерицина В _ и нистатина для некоторых грибов_

Культуры грибов ---МФК мкг/мл-

_амфотерицин В_нистатин_

Aspergillus niger 0,5-0,8 0,8 - 1,2

A.flavus 30-37 8,0- 12,0

A.terreus 33-48 8,0- 12,0

Pénicillium funiculosum 46-58 20,0-30,0

P. ochrochloron 17-20 16,0-20,0

Scopulariopsis brevicaulis 10-15 4,8-7,2

Trichoderma viride_ 13-17 _ 4,8-8,8_

2.2. Влияние антибиотиков па некоторые физиологические свойства

микромицетов

Кнслотопродукция. Как показали результаты экспериментов (рис. 2), антибиотики не оказывают существенного влияния на изучаемый процесс у всех культур. В зависимости от культуры и антибиотика кислотопродукция остается на уровне контроля или несколько снижается (на 10-25%) или на 810% повышается (только у А. 1вггвш). Учитывая высокую вариабельность такого признака у грибов этими изменениями можно пренебречь.

Рис. 2. Влияние амфотерицина В, нистатина и леворина в суббиостатических концентрациях на образование кислот у грибов, (контроль) - 100%.

Концентрации амфотерицина В (мкг/мл): А. niger - 0,2; А. /¡ауш - 15; А. 1еггет — 15; P.funicu¡osum - 20; Р. оскгосМогоп - 10.

Концентрации нистатина (мкг/мл): 0,08; 2,0; 3,2; 10; 10; соответственно.

Концентрация леворина (мкг/мл): А. Аауш - 10; А. 1еггеш - 10; Р. А-тси1озит- 10.

Гидролитические ферменты. При определении характера и степени воздействия противогрибковых антибиотиков на гидролитические ферменты ограничились только амилолитическими ферментами, на которые химические фунгициды оказывают значительное стимулирующее действие. Как следует из данных таблицы 3, у исследуемых антибиотиков наблюдается однотипный

характер действия на активность грибных амилаз. Это выражается в том, что каждый из антибиотиков у некоторых культур (в зависимости от антибиотика) несколько (не более 36%) снижает активность ферментов, а на активность других не оказывает влияния. Таким образом, получаемый результат зависит, прежде всего, от индивидуальных свойств культуры.

Таблица 3

Влияние антибиотиков на активность (общую) амилаз у грибов

Культу- Концентрация антибиотиков, мкг/мл Прирост Удельная актив-

ры грибов амфоте- нистатин рицин В леворин биомассы, % к контролю ность амилаз, % к контролю

А. йауиБ 10,0 2,0 10,0 84 65 69 64 63 100

А. п^ег 0,2 0,04 0,3 57 70 72 100 120 110

А ¡еггеиз 2,0 10,0 62 70 70 64

Р./итси- 20,0 Шит - 10,0

10,0

60 58 87

100 100 80

Окрашенные продукты метаболизма. Впервые выявлено свойство противогрибковых полиеновых антибиотиков в значительной степени подавлять процесс образования пигментов у грибов (табл. 4).

Таблица 4

Влияние нистатина на прирост биомассы и пигментообразование

Концентра- Прирост биомассы Содержание пигментов

Культуры микромицетов ция нистатина, мкг/мл г/л, а.с.б. % к контролю мг/г а.с.б. к контролю

А. п^ег 0 0,3 0,4 6,0 ± 0,2 3,4 ± 0,1 1,2 ± 0,1 100 57 20 190 ± 13 34 ± 2 9 ± 1 100 18 5

А 0 2 4 7,0 ±0,4 5,8 ±0,4 3,0 ±0,1 100 83 43 66 ±4 40 ±2 30±1 100 60 45

А. /еггеиз 0 4 5,4 ±0,3 2,8 ±0,1 100 52 255 ± 15 130 ± 7 100 51

Р. /итЫозит 0 4 14 7,7 ±0,5 8,9 ±0,5 2,3 ±0,1 100 115 31 75 ±5 38 ±2 0 100 50 0

Р оскгосМогоп 0 4 6 8,2 ±0,5 3,8 ±0,2 1,7 ±0,1 100 46 20 106 ±6 48 ±2 36±2 100 45 35

На примере наиболее эффективного полиенового антибиотика - нистатина показано, что на среде с нистатином в концентрациях, при которых при-

рост биомассы составляет 57-74% от контрольного, продуктивность её по пигментам снижается в среднем в 2-2,2 раза (табл. 4). Аналогичным свойством обладают и другие полиеновые антибиотики. Так, на среде с амфотери-цином В, продуктивность биомассы по пигментам снижается в 1,4-1,9 раз. Это свойство полиеновых антибиотиков, выявленное впервые, определяет одно из их преимуществ перед "химическими" фунгицидами, исследуемыми в работе, в присутствии которых содержание пигментов в биомассе этих же грибов, напротив, увеличивается в 1,5-2,0 раза.

2.3. Сочетанное действие полиеновых антибиотиков и ЭДТА на прирост биомассы и пигментообразование у грибов

Так как под действием антибиотиков подавление пигментообразования происходит не полностью, для усиления ингибирующего эффекта использовали способ, предложенный нами при работе с другими фунгицидами, а именно: антибиотики использовали в комплексе с ингибитором пигментогенеза (ЭДТА).

В таблице 5 на примере нистатина показано, что и при сочетанном воздействии нистатина и ЭДТА на грибы, не происходит полное подавление процесса образования пигментов у грибов. Аналогичные результаты получены с другим антибиотиком - амфотерицином В.

Таблица 5

Сочетанное действие нистатина и ЭДТА на прирост и продуктивность

биомассы по пигментам v пзибов

Культуры грибов Концентрация ЭДТА, % (масс.) Концентрация ■ нистатина, мкг/мл Прирост биомассы Пигменты биомассы

г/л а.с.б. %к контролю мг/г а.с.б. %к контролю

А. т2ег 0 0,05 0 0,08 8,5 ± 0,3 4,4 ±0,2 100 52 125,6 ±7,5 84,0 ± 4,2 100 67

А. ¡еггем 0 0 4,2 ± 0,2 100 178,7 ±10,7 100

0,05 0,4 1,8 ±0,1 43 110,8 ±6.6 62

А. /1а\-ш 0 0 7,5 ± 0,3 100 78,1 ±3,9 100

0,05 2,0 5,6 ±0,2 75 57,4 ± 2,9 74

Р./ип1си!о$ит 0 0,025 0 2,0 7,0 ± 0,4 7,4 ±0,4 100 110 99,0 ± 5,9 15,2 ±0.8 100 15

При одновременном использовании ЭДТА в концентрации 0,05-0,10%, а антибиотики в концентрациях, при которых рост грибов подавляется на 4560%, наблюдается полный фунгицидный эффект. В этом варианте фунгицид-ные концентрации антибиотиков снижаются в 2,3-9 раз в зависимости от культуры и антибиотика (таблица 6). Этот эффект, по-видимому, является результатом сложения ингибирующих эффектов (как в случае с грибами рода Penicillium), получаемых от действия антибиотика и ЭДТА на рост грибов. Возможно, что на усиление ингибиторного эффекта оказывает повышение под влиянием ЭДТА проницаемости

клетки для макролидных полиеновых антибиотиков.

Таблица 6

_Сочетанное действие антибиотиков и ЭДТА на рост грибов_

Культуры Концентрация антибиотиков, Кокцентрация Прирост био* " 4 »»л^т* /*«• тт _ 1 моолиг СЕ» «л

грибов

мкг/мл

амфотерицин В нистатин

ЭДТА, % масс.

массы, % к контролю

А. ш§ег

0,7 0,3 0,3

0,8 0,12 0,12

0,1 0,1

0 53 0 0

89 0

А. ¡еггеиз 47 — _ 0

5 _ _ 90

5 _ 0,1 0

- 12 _ 0

- 4 _ 52

- 4 0,05 0

Р. /итси1о$ит 48 _ — 0

20 _ 63

20 _ 0,05 0

- 24 0

- 10 68

- 10 0.05 0

2.4. Сочетанное действие нистатина и ЭДТА на активность амилаз, протеаз и кислотопродущию у грибов Действие препарата (нистатин + ЭДТА) на кислотопродукцию отражает характер и степень воздействия отдельно и ЭДТА и нистатина на этот процесс и, в целом является не существенным. Аналогичные зависимости выявлены и при изучении активности ферментов. Действие каждого из компонентов препарата на активность амилаз и протеиназ у отдельных культур несколько различаются, в результате чего при сочетанном их действии наблюдается усредненный эффект. Исключение составляет вариант с культурой Р. funiculosum, у которой под действием ЭДТА, а, следовательно, и препарата активность амилаз увеличилась в 2,5-2,7 раза. В целом, под действием препарата, активность изучаемых гидролитических ферментов не превышает контрольную активность.

Таким образом, полиеновые противогрибковые антибиотики обладают широким спектром действия, высокой фунгицидной активностью, а также свойством значительно подавлять пигментообразование у грибов и, практически, не влиять у них на активность изучаемых гидролитических ферментов и образование органических кислот. Использование антибиотиков в комплексе с ЭДТА позволяет достичь полного подавления жизнедеятельности грибов при более низких их концентрациях и предположить, что такой комплексный препарат будет обладать более пролонгированным действием, чем один антибиотик.

Фунгицидная активность нистатина в комплексе с ЭДТА была испытана с использованием ассоциации культур грибов наиболее распространенных возбудителей повреждений разнообразных промышленных материалов - А niger, А 1еггет, А. Даут/Р. ^тси^ит, Р. осНгосМогоп, ТпсНоёегта хтёе. Как показали результаты, концентрация нистатина, при которой наблюдается полное подавление роста всех культур ассоциации, составляет 20 мкг/мл, то есть в 3,7 раза ниже концентрации, необходимой для подавления роста самой устойчивой культуры - Р.^тсиЫит.

С целью определения широты спектра действия и возможных областей применения такого комплексного препарата были проведены исследования с использованием 6 культур фитопатогенных грибов, относящихся к 4 родам. Результаты экспериментов показали высокую чувствительность фитопато-генных грибов к исследуемому антибиотику и его комплексу с ЭДТА, однако степень такой чувствительности варьирует в зависимости от родовой принадлежности грибов. Повышенную чувствительность проявляют грибы рода Во-ЬуНз и He¡mitosponum, минимальная подавляющая концентрация нистатина для которых составляет в среднем 0,5 мкг/мл, а препарата - 0,12-0,2 мкг/мл. Использование нистатина одновременно с ЭДТА для подавления роста фи-топатогенов позволяет снизить его фунгицидную концентрацию (в среднем) в 3 раза, а концентрацию ЭДТА до 0,05%.

Основная часть исследований выполнена нами с полиеновыми противогрибковыми антибиотиками, ранее не изучавшимися для этой цели, но очевидно, что и другие противогрибковые антибиотики будут эффективны против возбудителей микоповреждений.

Исследованиями, выполненными нами ранее, показано, что неполиено-вый антибиотик имбрицин является высокоэффективным средством для длительной защиты бумаги от микоповреждений [Медведева и др, 1996а, б, в]. Однако, несмотря на то, что он известен давно и используется в практике, механизмы его действия на физиологическую активность грибов не изучались.

2.5. Влияние имбрицшш на некоторые физиологические свойства грибов

Имбрицин в отличие от полиеновых антибиотиков стимулирует пиг-ментообразование у грибов (табл. 7). При ограничении прироста биомассы в среднем на 24% ее продуктивность по пигментам увеличивается в 1,5-2,0 раза. Исключение составляет А. niger, у которого этот показатель снижается, что, по-видимому, обусловлено значительным подавлением и процесса образования конидий, в которых у А niger содержится основная часть пигментов - меланинов. Местом депонирования пигментов у основной части грибов является поверхностный слой клеточной стенки.

С целью снижения негативного эффекта от действия имбрицина на пигментообразования и выявления возможности повышения чувствительности к нему грибов были проведены исследования сочетанного действия на грибы имбрицина и ингибитора пигментогенеза - ЭДТА. Результаты экспериментов показали, что при сочетанном действии имбрицина и ЭДТА коли-

чество внутриклеточных пигментов (в расчете на 1 г а.с.б.) снижается значительно: у A. nigerв 4 раза, у A.flavus, P. funiculosum и A. terreus в 2-2,5 раза. Одновременное использование имбрицина и ЭДТА позволяет снизить его фунгицидную концентрацию на порядок - с 8,9 мкг/мл до 0,8 мкг/мл для грибов рода Aspergillus.

Таблица 7

_Влияние имбрицина на рост и образование пигментов у грибов_

Концентрация_Биомасса_Пигменты

грибов имбрицина, мкг/мл г/л а.с.б. % к контролю мг/г а.с.б. % к контролю

A. niger 0,8 5,1* 76 220 81

6,7 272

A. terreus 2,4 4,6 67 134 206

6,8 65

A.flavus 2,4 5,4 77 110 157

7,0 70

P. funiculosum 2,4 6,5 85 80 167

7,7 48

• В числителе - опыт, в знаменателе • контроль.

Положительным свойством имбрицина является значительное подавление процесса кислотообразования у грибов, свойство не оказывать влияния на комплекс целлюлолитических ферментов.

Таким образом, все исследуемые полиены в значительной степени подавляют пигментообразование в отличие от химических фунгицидов и непо-лиенового антибиотика имбрицина, под действием которых этот процесс стимулируется.

По этому признаку, выявленному впервые, полиеновые антибиотики как возможные ингибиторы возбудителей биоповреждений имеют несомненное преимущество, так как пигменты являются не только одним из основных факторов биоповреждений, но и универсальным протектором, способствующим повышению устойчивости грибов к ингибиторам, а, следовательно, и снижению их фунгицидной активности.

3. Влияние противогрибковыхантибиотиков на грибоустойчивость целлюлозосодержащихматериалов

В настоящей работе представлены данные исследований микоустойчи-вости материалов, обработанных растворами антибиотиков и хранящихся при комнатной температуре. Определение и оценку микоустойчивости проводили до ГОСТ 9.048-89. В качестве объекта исследования на первом этапе выбрана сульфитная бумага - легко повреждаемый целлюлозосодержащий материал. Грибостойкость бумаги определяли непосредственно после еб пропитки растворами антибиотиков и через каждый месяц хранения.

Из результатов, представленных в таблице 8 следует, что бумага, обработанная растворами амфотерицина В (6,7 мг/мл) или нистатина (4,0 мг/мл),

остается устойчивой к 5 культурам грибов из 6 используемых в течение всего срока хранения - 4 месяца. Некоторое исключение составляет культура Р./и-nicu¡osum, рост которой на бумаге не подавляется полностью. К леворину, как к менее эффективному антибиотику, менее чувствительны две культуры - А. terreus и Р. ^тсиЫит. Однако проявление роста этих культур не является результатом снижения фунгицидной активности антибиотиков в процессе хранения, так как аналогичные результаты были получены при оценке грибо-стойкости бумаги сразу после её обработки растворами антибиотиков.

С целью повышения фунгицидной активности антибиотиков без увеличения их концентрации были проведены эксперименты по приданию гри-боустойчивости бумаге и хлопчатобумажной ткани с использованием антибиотиков (на примере с нистатином) в комплексе с ЭДТА. Концентрация нистатина в пропитывающем растворе была 2 мг/мл и 4 мг/мл, а концентрация ЭДТА во всех случаях - 0,5%. Следует отметить, что ЭДТА в этой концентрации (без антибиотика) не придает грибоустойчивости бумаге и ткани.

Как показали результаты, при одновременной обработке выше указанных материалов растворами нистатина и ЭДТА достигается их грибостойкость ко всем тест-культурам, которая сохраняется в течение всего срока наблюдений - 5 месяцев, а с учетом продолжительности испытаний (21 сутки) - 6 месяцев.

Таблица 8

Грибостойкость сульфитной бумаги, обработанной антибиотиками методом пропитки^с2ок_хранения_бумагипри_комн^ *

Тест- Продолжи- Рост грибов на бумаге, пропитанной растворами

культуры тельность антибиотиков

культиви- контроль амфотерицин В нистатин леворин

рования 6,7 мг/мл 4 мг/мл 4,7 мг/мл

А. П1£ег 7 + — _ -

14 ++ __ _ _

21 +++ — —

А. /еггеиз 7 + _ _ +

14 ++ _ _ ++

21 +++ — — +++

А.Аатэ 7 + — — -

14 ++ _ _ _

21 +++ — — _

ТпсЬоАегта 7 +

\iride 14- 4+ _ _ _

21 +++ — -

Р. /ишсиШит 7 + — — +

14 ++ + + ++

21 +-Н- ++ ++ +++

- отсутствие роста, + слабый рост, ++ активный рост, +++ обильный рост,

спороношение

Таким образом, полиеновые противогрибковые антибиотики при очень низких концентрациях повышают устойчивость целлюлозосодержащих мате-

риалов к грибам различных систематических групп и отнесенных к наиболее распространенным и активным возбудителям повреждений.

Результаты, полученные при совместном использовании антибиотиков и ЭДТА, позволяют предположить, что для повышения фунгицидной активности (без увеличения их расхода) и степени грибоустойчивости материалов целесообразно использовать их в комплексе с другими веществами, влияющими на морфолого-физиологические свойства грибов. К таким веществам могут относиться мембранотропные вещества, облегчающие проникновение антибиотиков в клетку, ингибиторы пигментогенеза у грибов и другие.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что фунгициды (катамин АБ, метацид, формалин, три-лан, ликводек, оксихинолят меди, салициланилид) не оказывают влияния на активность целлюлаз и протеаз у микромицетов - деструкторов целлюлозы и повышают активность амилаз на 10-90% в зависимости от культуры. Действие их на кислотопродукцию различается - у грибов рода Penicillium она возрастает на 20-100% в зависимости от фунгицида, а у грибов рода Aspergillus несколько снижается.

2. Выявлено свойство всех исследуемых фунгицидов активизировать биосинтез пигментов в 1,3-2,5 раза. Показано, что основным местом депонирования пигментов у микромицетов - деструкторов целлюлозы является наружный слой клеточной стенки.

3. Показано, что эффективным и экологически чистым ингибитором пигментообразования у грибов является этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). В концентрации 0,05-0,10% ЭДТА снижает продуктивность грибной биомассы по пигментам, в среднем, на 55%.

4. При сочетанием действии ингибитора пигментогенеза (ЭДТА) и фунгицидов возможно повысить фунгицидный эффект при снижении концентрации фунгицида почти на порядок, что, по-видимому, обусловлено повышением в этих условиях чувствительности грибов к фунгицидам.

5. Показано, что эффективными природными фунгицидами сапрофитных грибов - возбудителей биоповреждений являются макролидные противогрибковые антибиотики - полиены (амфотерицин В, леворин, микогеп-тин, нистатин) и неполиен - имбрицин.

6. Впервые выявлено свойство полиеновых противогрибковых антибиотиков подавлять продуктивность биомассы грибов по пигментам, снижать активность комплексов амилолитических ферментов, не оказывать влияние на кислотообразование и активность протеолитических ферментов.

7. В составе комплексного препарата, содержащего ингибитор пиг-ментогенеза, фунгицидная концентрация антибиотиков снижается в 2,3-9 раз в зависимости от вида культуры и антибиотика.

8. Показано, что для аттестации химических и природных (антибиотиков) фунгицидов необходимо использовать критерий, определяющий характер и степень влияния на физиолого-биохимическую активность грибов и

позволяющий в зависимости от химического состава и свойств защищаемых материалов определять целесообразность их применения.

9. Показано, что при обработке целлюлозосодержащих материалов нистатином и комплексом нистатина с ЭДТА сохраняется высокая грибо-стойкость этих материалов в течение всего срока наблюдений - 5-6 месяцев.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Медведева Н.Г., Блинов Н.П., Никитина И.П., Кузикова И.Л. Действие ликводека на микромицеты - контаминанты библиотечных фондов // Микология и фитопатология. - 2000. - Т. 34, № 2. - С. 53-58.

2. Сухаревич В.И., Зайцева Т.Б., Медведева Н.Г., Сухаревич М.Э., Кузикова И.Л. Влияние биоцидов различной химической природы на синтез пигментов у целлюлозоразрушаюших грибов // Микология и фитопатология. -2000. - Т. 34, № 3. - С. 39-42.

3. Сухаревич В.И., Кузикова И.Л., Медведева Н.Г., Гриднева Ю.А. Рост микромицетов и синтез пигментов на средах, содержащих фунгициды и ингибиторы пигментообразования // Микология и фитопатология. - 2000. - Т. 34, № 3. - С. 43-47.

4. Медведева Н.Г., Кузикова И.Л. Гриднева Ю.А., Никитина И.П. Влияние фунгицидов на пигментогенез у целлюлозоразрушающих грибов // Тез. докл. III Межд. конф. "В новый век - с новыми технологиями", Санкт-Петербург, 17-20 октября 2000 г. - СПб, 2000. - С. 51-52.

5. Sukharevich V., Martyniyk Ju., Kuzikova I. Some fungicides influence on formation of the fungal methabolites causing biological deterioration // 12th International Biodeterioration Symposium, 14-18 July 2002, Praque, Chech Republic. -P.153.

6. Сухаревич В.И. Медведева Н.Г., Мартынюк Ю.В., Кузикова ИЛ. Сочетанное действие фунгицидов и ингибиторов пигментообразования на микромицеты // Материалы 1-го Международного конгресса "Биотехнология - состояние и перспективы развития", Москва, 14-18 октября 2002. - М., 2003.-С. 317-318.

7. Сухаревич В.И., Кузикова И.Л., Медведева Н.Г. Влияние полиено-вых антибиотиков на рост и некоторые метаболические процессы у низших грибов // Биотехнология. -2003. - № 1. - С. 27-32.

8. Кузикова И.Л., Медведева Н.Г. Использование антибиотиков для борьбы с биоповреждениями // Тез. докл. научной конференции «Сохранение культурного наследия библиотек, архивов и музеев», Санкт- Петербург, 14-15 февраля2003.-СПб,2003.-С.156-159.

Научное издание. RIZO-печать ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

Лицензия ПЛД№ 69-253. Подписано к печати 30 апреля 2004 г. Тираж 100 экз

Р-9 О 8 1