Разработка и применение перспективных методов микробиологического катализа для получения физиологически активных соединений

Абелян, Варужан Амаякович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и применение перспективных методов микробиологического катализа для получения физиологически активных соединений
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение перспективных методов микробиологического катализа для получения физиологически активных соединений"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

АБЕЛЯН Варужан Амаякович

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ МЕТОДОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КАТАЛИЗА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

специальность - 00.14 - биотехнология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук а сорм.е научного доклада

Абовян-1995

Работа выполнена в Институте Микробиологии HAH Армении

Официальные опоненты: академик HAH Армении,

доктор биологических наук К.Г. Карагезян

доктор химических наук A.A. Шагинян

доктор химических наук Р.Г. Мелик-Оганджанян

Ведущая организация: НИИ Биотехнологии

Министерства промышленности РА

Защита диссертации состоится " " А e^.Ct А 1996г. в (■S*"" часов на заседании Специализированного Совета 018 в Институте микробиологии HAH Армении по адресу: Ереван. Республика Армения, ул. Маршала Баграмяна 24, Национальная Академия Наук РА. отделение биологических наук.

Автореферат разослан " /Э " У^' b^'i/j Я 199бг.

Ученый секретарь

Специализированного Совета. ¿Ы

кандидат биологических наук ^ ) Л.А. Пивазян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Проблемы, бискатализа и биотрансэормации органических зоедннений приобретает ведущее значение для современной биотехнологии и :межных отраслей науки (Березки, 1978; Березин и яр., 1867; Егоров и до.. 1357; члессв. 1383). Успехи з этой сбласти определили создание и развитие н-? только юаых направлений науки, но также разработку и широкое практическое 1рименение высокоэффективных способов для получения антибистикса, ¡имтаминов, аминокислот; гормонов, сахаристых и многйх-других продуктсз Васильев, 1988: В'/даорд, 1988: Уатаяпот. 1933:; ОисПепе. 193С).

Анализ технико-экономических показателей -использования биокатализа и ;иотранарсрмации, осуществляемых в оснсеном с использованием 1ммсбилизованных клеток (ИК) и ферментов' (ИФ) микроорганизмов, показьзает 1Х нерспаримыет преимущества как перед химическим катализом, так и чикрсбиологическим синезоМ.

Эффективное применение биокатализа лзжит а осноае новых прогрессивных тправлений биотехнологии, разработки непрерывных и безотходных произзсдстз : наименьшими затратами сырьеаых и энергетических ресурссз.

В этом отношении важнее значение приобретает использование белее ярсректизных и технологичных зкетремошильных биокатапизаторез, особенно их ¡ммобилизованных форм, открытие и применение которых составили нозуо эсу ас ■многих отраслях науки и промышленности. Перспективы их научно-практического пользования определяются более экономичными показателями, для создания и Гнтенсификации непрерывных процессов и фактически безотходных технологий. Зместе с тем, существующие методы иммобилизации клеток микробов не юзосляот получать биокаталйзаторы с высокой активностью и стабильностью. 1То в значительней мере связано с тем, что они в большинстве случаев сснсзаны |а применении так называемых банальных микроорганизмов, а иммобилизация летск и среркентсз. как празило, ссуаэстэляется с испспьзозанием неприродных уб стратой.

Настоящее исследование песаящено изучению, получению и использованию 1.К и НО ркстремофильных форм микроорганнзмЬа и изучению этих прсцессоз длл ыработки различных физиологически активных соединений - и 0-ютарагиновей кислот. Ьаланина, Ьяблочной кислоты. Ьтеанина и разл^ных 1инейных и циклических олигосгкариасв. В этих исследованиях глазной целевой стансзкой явилась разработка на сснояе природных субстратов нозых методических подходов по проблеме ."Иммобилизованные клетки и ферменты микроорганизмов" и изыскание путей стабилизации их специфической ахти а- :стч частности, в экстремальных условия;; среды. Разработаниыа методы открывают нозие перспективы для получения многих физиологически актизных ездинений и продуктов с использованием иммобилизованных бюкатализатсрсз.

Ряд разделов данной работы выполнялся в рамках целевых комплексных программ по получение белковых и сахаристых продуктов, б частности программе 'Топинамбур".

Состояние яопрпга. Становление научно-практической области применения иммобилизованных биокатализаторов обычно относят к 60-ым годам нашего столетия. Однако, в бродильной промышленности эмпирически давно практиковались приемы иммобилизации клеток дрожжей и уксуснокислых бактерий при выработке вин. уксуса и спирта. С 196S-70 гг., после известных работ по использовании микробных аминоацилаз для получения оптически активных аминокислот (Chibata et а!.. 1976). достигнуты большие успехи как по разработке новых методов, так и в области практического использования ИК и ИФ микроорганизмов. Крупные успехи достигнуты в производстве аминокислот, антибиотиков, органических кислот, витаминов, гормонов и многих других биологически активных веществ (Клесов, 193S; Вудворд, 1983; Klein, Kressdorf, 1S85: Berset, 19SS: Hartmeier. 1986; Apolinar/, Rapak, 1938, Yamamoto. 198£; 1995; D'Souza, 1989; Korpela et ai„ 1989).

Клетки ¿ñ с»/?'включенные в каррагинан, с успехом использованы для непрерывного синтеза L-аспарагиновой кислоты (Sato et al..1979; Tosa et a!.,1979; Takamaisu et al.,! 984; Chibata et a!.,1956). Процесс полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Промышленным способом получают также L-аланин из L-аспарагиновой кислоты с помощью иммобилизованных в каррагинан клеток Pseudomonas dacunhas^emamoKo etal.,1980; Takamatsu et a!.,1SS1). С помощью ИК Brevibactcrium fiavi/m и Brevibacterium ammoniagensc Фирма 'Танабэ Сейяку" получала ежегодно до 100 т L-яблочной кислоты (Yamamoto et al., 1976; Chibata et al., 1934). Получение L-аспарагиновой и L-H5no4Hoí кислот разрабатывалось также советскими исследователями (Березин и др.,1979 Зуева и др!,1984; 1935; Веревкин и др..1988-1990).

Однако, предложенные методы - наряду с положительными качествами -имеют и свои недостатки. Так, после иммобилизации клетки сохраняют в лучшем случае лишь 52% активности от исходной и требуют дополнительной активации до или после иммобилизации, что намного удлиняет и усложняет процесс. Кроме того, в конечном продукте обнаруживается побочные вещества, что понижает степень трансформации и требует дополнительных усилий для очистки целевого продукта. В ряде случаев стабильность биокатализаторов очень низкая, что делает неэкономичным их использование.

Следует также отметить, что определенные трудности создания высокозфэктивных биокатализаторав с инулиназной и цикломалотодекстрин глюканотранареразной активностями препятствуют промышленному освоению методов получения глокозо-фруктозного сиропа из инулина и циклодекстриноз и: крахмала в проточных услоаиях. Развитие работ в указанном направлении безусловно связано с наличием высокоэффективных штаммов-продуцентов ферментов, особенно экстремофилов, а также с разработкой новых методов

чмобилизации. позволяющих создавать биокатапизаторы с высокой сгивностью и стабильностью. В этой связи в наших исследованиях использован чд активных продуцентов ферментов из групп неспороносных и спорообразующих актрий, а также дрожжей, что позволяет рекомендовать разработанные методы пя широкого круга микроорганизмов.

На основании анализа опубликованных работ по рассматриваемой проблеме учетом практических задач сформулированы и основные цели и задачи ^следования.

Цель и г.апачи работы. Основной целью настоящей работы была разработка ысскоактивных и стабильно функционирующих систем биокатализатсров для ыработки некоторых физиологически активных соединений методом 'Ютрансформаиии на основе экстремофильных форм микроорганизмов. Для остижения поставленной цели необходимо было разрешить ряд задач, тавными из которых являются следующие:

- изыскание новых носителей из природных соединений, обеспечивающих =)сокую активность и стабильность иммобилизованных клеток и ферментов икроорганизмов:

- разработка безносительных способов иммобилизации клеток, позволяющих задавать мультиферментные системы, пригодные к использованию в проточных, частйочти экстремальных условиях:

- выделение, очистка и исследование некоторых физико-химических и .нохимических свойств фумарат-гидратазы. Ьаспартат-аммиак-лиазы. гпартат-В-декарбоксилазы. инулиназы, цикломальтодекстрин юканотрансшеразы, гпутаминазы и (3-фруктофуранозидазы:

- изучение кинетики пооцессов получения Ь и О-аспарагиновой кислот. Ь панина. 1_-яблочной кислоты. Ьтеанина. различных фрукта- и ' тахтоолигосахаридов, а также циклодекстринов с помощью иммобилизованных юкатализаторов:

- разработка одностадийного получения Ьаланина из фумаровой кислоты ^ферментным биокатализатором:

- разработка основ технологии получения вышеуказанных соединений с эмощью интактных и иммобилизованных ферментов и клеток микроорганизмов

Научная новизна ппботы Впервые показана возможность иммобилизации четок и Ферментов на полисахариде микробного происхождения - аубазидане. а экже инулине. Выделены и изучены внеклеточные полисахарида Оургоссссиз /¡псу/) и Сг./аигепШ Показано, что они могут служить матрицами для -^мобилизации ферментов.

Выявлено, что добавление циклодекстринов к носителям природного зоисхождения намного увеличивает их связывающую способность и содействуе

- 6-

(г-олее высокому проценту сохранения активности при иммобилизации ферментов метс-дом ковалентного связывания.

Разработаны новые способы модифицирования силикагеля- методом хемоссрбции акоияокитрипа и получения безмосительных биокатализато^ов на основе клеток микроорганизмов с высокой активностью и стабильностью. Показано что данный биокатализатор может с успехом применяться для получения мультисрерментных биокатализаторов, которые зполне пригодны для .использования в проточных условиях, включая процессы, где субстратом служит высокомолекулярное соединение.

Выявлены особенности и оптимизированы процессы термечтативно-микрсбиологического получения и О-аспарагиновой кислот. ¡--апанина. 1.-яолочной кислоты. Ьтеанина. р-цикяодекстрина и глюкозо-фруктазного сиропа с .'помощью поедварительно стабилизированных и иммобилизованных клеток и ферментов оригинальных культур микроорганизмов.

Впервые выявлены продуценты цикломапьтодекстрин глюканатрансфераз сзеди галотиланых бацилл и термоактиномицетоо.

Выявлены характерные особенности цикломальтодекстрин глюканэтвансферзз различных групп микроорганизмов и предложена модель механизмэ деистви? цикломальтодекстрин глюкамотрансфераз. обнаружены и охарактеризованы изофевменты цикломальтодекстрин глсконотрансфераз.

Впервые выявлены особенности получения а-цикподекстрина в условиях ультоаоильтваиионных мембран и.обнаружены специфические комплексообразователи для у-циклодекстрина.

Разработаны научно-методические подходы ферментативной перзрабстки молочной сыворотки с иелыо получения галактоалигосахаридного подсластител! и фрухтозо-концевых глоканов и срруктсолигссахаридов с использованием цикломальтодекстрин глюканотрзнороразы и ^-фруктозофуранозидазы. соответственно. '

• Изучен процесс синтеза лактосахарозы с помощью Р-фруктофуранозидазы и инзертазы.Впервые получены некоторые производные циклодекстринов и их полимерных Форм и испсльзозаны в условиях 7СХ, ГЖХ и БЭЖХ в качестве энантисселекторов.

Ррак'~1""еская ; ■ечнчтг'? работы:. На основе природных носителей оазоэботаны новые методы иммобилизации ¡слеток и ферментов микооорганизмоз. которые обеспечивают высокую активность и стабильность биокатализатороз.

С помощью оригинального метода иммобилизации клеток микроорганизме в присутствии периодата натрия и Ш^'-т-фенилендиаспаримида получен

■^ферментный биокатализатор, на основе которого разработан процесс цноэтапного получения L-аланина из <румарата аммония. Указанный метод гкрывает широкие перспективы полунения и применения ИК микроорганизмов в сстремальных условиях среды со стабилизацией ферментативной активности.

Разработаны технологические регламенты на производство L-аспарагиновой зелоты. L-аланина. L-яблочной кислоты, глюкозо-фруктозного сиропа, а также 1ытно-промышленные регламенты на производство ß-циклодекстоина и жтозного подсластителя. Разработанная документация передана организациям эсагропрома Армении, Минхимпрома и Минмедпрома бывшего СССР для зактической реализации.

Получено разоешениа Фармкомитета на использование ß-циклодекстрина пя стабилизации лекарственных форм. На его основе выпущена опытно-гамышленная партия пектусина.

Апробация. Результаты работы докладывались на V Международном ¡неральном симпозиуме по дрожжам (Канада. 7-10 сентября.1930). I ззтислазсксм симпозиуме по сахаридам (Чехословакия. 18-23 мая,19Э1). VII вждународном специализированном симпозиуме по дрожжам (Испания. 11-15 ,тября.1981). Всесоюзной научной конференции "Исследования по изысканию :крственных средств природного происхождения" (Ленинград. 17-18 сентября. 81), Международном совещании "Биотехнология утилизации вторичных ;сурсов" (Абовян. 6-11 сентября.19S8). ill Респ. конф. "Достижения физико-мической биологии и биотехнологии и пути их внедрения" (Ереван. 16-17. тября, 1989). Всес. н/п конф. "Состояние и перспективы создания новых карственных средств и фитохимических препаратов" (Харьков, 3-5 октября. 90). II Бсес. н/п конф. "Топинамбур и топинсолнечник - проблемы возделывания и пользования" (Иркутск. 6-10 августа. 1990), III Всес. н/п конф. "Топинамбур и' тмнеслночник - проблемы возделыаания и использования" (Одесса. 7-11 тября,1991). н/п конф. "Перспективы создания и производства лекарственных едстз в Украине" (Одесса, 4-8 октября, 1993), ежегодном собрании льскохозяй'ствснного и биохимического общества Японии (Кобе. Япония. 5 !кабря, 1992) и в Бсро отделении биологических наук HAH Армении и ¡езидиуме HAH Армении (10 мая, 1969).

Материалы работ по расшифровке структур полисахаридов Cryptococcus едены в учебные пособия для высших учебных заведений по микробиологии пиноз Н.П. "Химия микробных полисахаридов, 1S84.-256c.; Блинов Н.П. ямическая микробиология, 1989,-44бс.).

Результаты научных исследований опубликованы в 95 работах, в м числа одной монографии и15 авторских свидетельствах.

Месха'хдазаагния работы, Оснозная часть работы выполнялась в Институте 'кробиологии HAH Армении и была частью плановой тематики Института, следования микробных полисахаридов проводились в Ленинградском (С,-

Петербург) Хнмико-фармацевткчеехам института, а.иаучение механизма Д-^.-Гс,/ ЦГТаз и процессов получения^ L-теанина - на ба^а Центральной исследовательской лаборатории фирмы Taiyo Kagaku Co., Ltd (Япония). Ряд разделов работ выполнен совместно с сотрудниками Института микробиологии HAH Армении и других организаций, которым автор выражает глубокую признательность.

ОСНОВНЫЕ ЗАЩИЩАЕМЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ

1. Для Эффективной иммобилизации клеток микроорганизмов мзтоясм вклинения, при выборе геля-носителя необходима учитывать особенности строения клеточной стенки, которая содержит в своем составе полисахариды различного сложного строения. Каждый вкешный полисахарид, обладающий только ему'присущей структурой, оказывает сугубо специфическое действие на Функциональную деятельность микробных клеток. При зтом. чем ближе эта структура к строению собственных полисахаридов микроорганизмов, тем мягче его действие и меньше нарушение жизненных функции включаемых клеток, что .приводит к поаышгнио выхода активности после иммобилизации.

2. Обработка микробных клеток периодатсм иатрчя призодит к образование на поверхности клеточной стенки альдегидных групп, сшивкой которых жесткими диаминами могут быть получены стабилизированные мультиоерментные иммобилизованные клетки, без применения каких-либо носителей.

3. Различие между адсорбционными способностями носителой на сскозс полисахаридов связано с различием их строения и молекулярными массами. Более разветвленные полисахариды дагзт болоз стабильные результаты, поскольку на них можно создавать большее колмчзстве- активных групп, из-за большей поаерхности получанной, матрицы.

4. Признака мономера при модификации сияикзгеяя хечоезрбцигй гкрилонитрила протечет за счет напряженных SK^Si групп по конному или радикальному моханизму б зависимости от текстуры поверхности носителя. При этом, на поверхности сохраняется гидрохсмльиий покров. приларшяа ноаггелэ большую гидрсфипьность и создает благоприятна успозия для иимоб^-П^алч;-. фзрментоз методом козалантксго связывания.

5. Аспартазная рзакцил, г.атализируемол иммз&«шоза1 шыяи KSW-C^.H. протековт аналогично реакции един субггрзт - одни продукт. Процрсо RSJ^JSLii1Si иаспарагиноЕОй ich слоты из фумарозой необходимо ссушоствить а биорзапторо с периодической переменой каст егг.ци'л, т£'? как ст&бияьилгть биокаталязатсра в пгрвых секциях су^гстЕон.чэ гыие, чзм в поелгд;«::-:, %{5ОД иммобилизацией клзток вшзчзнигм. необходимой* прздпарителько стабилизировать поперечно;! адйзкей.

G. Синтез L-алгнина можно осуществить едкрзтапио из фумграта аимок>-:л с помощь» совместно сшитых и кмме&шадезаннух клеток и ферментов с аспартпзной и Ьгоплртст-р-дэчЕрбохси^знрй активностями.

7. Иммобилизацию клеток с L-аспартат-р-декарбсхсилгзной гктизностью для одновременного получения L- аланина и D-аспарагиновой кислоты из D.L-аспарагинсвой кислоты можно осуществить в 5%-ксм геле агара.

S. Синтез L-теанина можно осуществить из глутимина и этиламина под действием интактной или иммобилизованной глутаминазы.

9. Успех получения L-яблочнсй кислоты из фумэрозой с помощью иммобилизованных клеток с фумаразной активностью в значительной степени зазисит от способа иммобилизации, а биокатапизатор может актизизиросатся в течение процесса.

10. Иммобилизацию клеток с инулиназной активностью для получения глюкозо-фруктознсго сиропа из инулинсодержаошго сырья можно осуществить безносительным способом, при котором не существуют диффузионных ограничений. При этом, целзсообразно использовать инулиназы сзкзо-типом действия, которые имеют подцантровую структуру активного центра, а каталитическое расщепление субстратов протекает между подцэнтрамм 1 и 2.

11. Активный центр циклсмальтодекстрин гпюканотрансозраз состоит из двух отдльных частей - донорнсй и акцепторной. Первая из них строго слециаичена к а-1,4-сзязгнным мэльтсопигосахаридам, а вторая - может взаимодействовать с другими моно- и олигосахаридами. Циклизация требует сзязызаниз субстрата с обоими центрами одновременно, в поотивном случае в начальный период deакции протекает только межмолекулярное тргнсгликозилирозание. Наиболеа низксмолекугярным и специфическим субстратом для циклизации является мальтсоктаоза. Специфическая часть активного центра состоит из семи подцентроч, а акцепторный участох имеет только прадварительно-связызпащуо функцию, приводящую к изменениям кенформации везго активного цзнтра и опи.ентируяшуя связывание денера s положении, необходимом для трансгликозипносвания.

12. Полимеры.циклодекстриноз и их производные могут связывать цнкломальтодекстрин глоканотрансфэразу не только с еысокой аффинностью, не и с тонкой специфичностью, что позволяет обнаружить присутствие изоферментое.

13. Процесс получения а-цихлодекстрина можно осуществить а условиях ультрафильтрационных мембран,' р-циклодекстрина - иммобилизованным фзрментом, а -у-фермы - о прмсутстзии специфических макроциклических комплексссбразозатвлей.

' 4. Из высоких концентрация субстратов р-оруктсфургнозидаза Р. pafíans i-р-галсктозидаза способны образовывать фру кто- и галактсолигссахариды ссответсгаенно.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследований использованы штаммы микроорганизмов следующих групп и видов : из группы аэробных спорообразующих бактрий - Baaïïut suhtíiis, BJichen/formis, B.stearathsmwphjlus, B.atkaJophiíus, B.haíophüus и ряд новых разновидностей; из неспороносных бактрий - AlcaJigenes faecaüs, Erwinia aro/dea, Brevibacterium, Pseudomonas nitroreduœns, из дрожжей - Khiyservmyces mandanus (fragi/is), CrypTococcus е/inoW/, CrJaurentii из грибов - P. pafíter.s.

Большинство изученных штаммов являлись оригинальными культурами, в основном экстремосрильными формами микроорганизмов, выделенными и хорошо идентифицированными в Институте микробиологии HAH Армении (ИНМИА).

Культивирование микроорганизмов осуществляли методами глубинной ферментации в колбах и ферментерах. Аспартазную активность определяли по списанному методу [15]; Ьаспартат-р-декарбоксилазную активность - по [16]; фумаразную - по Goodman, 1957; инулиназную - по Guiraud et al.,1981; цикломальтодекстрин глюканотрансферазную (ЦГТазная) - по [21]; теанинсинтетаэную - по [26]; ß-галактозидазную - по Honda et ai., 1931; ß-фруктофуранозидазную - по Зинченко и др., 1995.

Иммобилизацию клеток и ферментов проводили различными методами: включение в полиакриламидный гель (ПААГ ) - по Yamamoto et al.,1976, в собственной модификации; включение в мембраны из поливинилового спирта (ПВС) - по Fukui etal., 1980, в Са-альгинат - по Ohisonetal., 1979; вкаррагинан-по Tosa et al., 1979; в триацетатцеллюлозу (TAU) - по Marconi. 1978; в агаровый гель - по Cannon, 1986; ковалентное связывание на силохроме - по Ананичеву и др., 1978; методом адсорбции - по Guiraud. 1981, в собственной модификации.

Исследование полисахаридов криптококков проводили по описанным методам [3,4].

Белок определяли по Лоури (Lowry et al., 1951); редуцируощие вещества - по Шомоди-Нельсону (Somogyi, 1952; Nelson, 1S44); азот - методом Кьельдаля (Bradstreet. 1965).

Фруктозу и глюкозу определяли по Bergmeyer, 1974, а также методом тонкослойной хроматаграфии (ТСХ) в система растворителей н.пропанря-этилацетат-вода = 7-1-2. '

Гомогенность очищенных ферментов определяли Na-DS-гель-электрофорезом в 7.5% ПААГ па Девису (Davis. 1S64).

ИК-спектры снимали на приборе UR-20.

Величины оптического вращения определяли на автоматическом поляриметре Perkin-Elmer-24!.

Аминокислотный состав очищенных ферментов определяли на аминокислотном анализаторе ААА-333 фирмы Microtekhna (Чехословакия) после

гидролиза препаратов 6н. HC¡ в течение 24 часов при 105°.

Циклодекстрины и олигосахариды определяли методом ВЭЖХ на-приборе НРР 4001 (Чехословакия) в качестве детектора, используя дифференциальный

егррахтометр на колонке SEFARQN SGX-NH2 (t50 х 3,3 мм), а системе цетснитрил-вода = 70/30.

Кофеинсодержашив растворы акалиаирозапи методом ВЭЖХ на приборе litachi 655А-11 (Япония) на колонке DeveJosil ODS (Ncmora Chemical Co.. Япония) 150 x 3,3 мм), в качества подвижной фазы используя смесь уксусной кислоты, цетонитрила, диметипгрормамида и воды в соотношении 3:1:15:81 (скорость 0.5 т/мин ) и детектор UV=280 нМ.

Теанин определяли на колонке Shiseido Capeeil Pak CjsAG (4.6 x 250 мм) при

эмпаратуре 25° и 214 нМ со скоростью воды (pH 3,5) 0,5 мл/мин в качестве одеижнсй фазы. ' -

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. РАЗРАБОТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ СИСТЕМ КЛЕТОК

. И ФЕРМЕНТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

1.1. Иммобилизация краток включением а аубззидгн

Полиглюкины типа аубазидана входят в состав углезодной части клеточной генки микроорганизмсз. что, вероятно, и обуславливает более мягкий контакт и эйствие внешнего полисахарида (аубазидана) с клеточной стенкой икроорганизмоз. мало нарушая их жизненные функции,

. Метод был применен к трем культурам E.arcx!t?a, A. faecslis и Pseudomonas so. 1[.

Выявлены оптимальные параметры проведения процесса. Самый высокий :оцечт сохранения активности у испытанных культур наблюдается при ¿пользовании 0,3 г аубазидана на 1.0 г сырых клеток, В качестве армирующих ентов необходимо использовать 0,01 М гексаметилендиамина (ГМДА) и :утароесго альдегида (ГА). Лучшие результаты в процесса гелеобразозания базидама дает использование ионов Са^+, в то время как в присутствии элсчных металлов гелеобразозания вообще не происходит.

Из различных диаминсз и дигидразидсз наиболее благоприятное действие i гелесбраэоаанисоказывают П>1ДА и М М'-т-фчнипендиаспаримид (©ПАИ).

Выявлено, что для успешной иммобилизации клеток в аубазидаие: обходимо использовать следующее соотношение компонентов - аубази дан : смасса клеток: ГМДА : ГА = 1: (1,67-6.67): (2.7-5.03): (0.83-S.S7). Как

леобразующие агенты используются ионы Ca2 \ а вместо ГМДА можно пользовать ФДАИ.

При этом получается гель, нерастворимый при 37°. физически устойчивый храняющиЯ высокий процент активности у испытанных культур. Аспартазная тивность клеток E.aroidea сохраняется на 91.2%, a L-acnapTaT-ß-

декарбоксилазная активность 73,1% и 84,4% для клеток A.fasza//sn Pseudomonas sp. соответственно.

Способ может решить задачу замены каррагинана или полиакриламида.

■—■ Иммобилизация клатпк р ппигутг-гвии п<?г,иппята чятпкя и Ф_ПАИ

Известные методы иммобилизации, как правило, не позволяют получить биокатализатор с более высокой активностью, чам интактмые клетки, а это привадит к тому, что в проточных условиях невозможно использовать большие удельные скорости. Разработанный нами способ безносительной иммобилизации клзток микроорганизмов является особенно ценным для тех процессов, которьи протекают в экстремальных условиях pH и температур, а также, если в качестве субстратов используют высокомолекулярные соодинения. При этом активность иммобилизованных этим методом клеток в несколько раз выше . чем у интактиы; (в соеднам. 7-10 раз) [33.40,52].

При иммобилизации этим способом клетки сначала обрабатывали растворог-периодата натрия, затем сшивали ФДАИ. Предполагаемый механизм способа трактуется следующим образом:

Так как клеточная стенка микроорганизмов содержит в своем составе углеводные полимеры, то, действуя пориодатом натрия, мы селективно действуем на них. вследствие чего раскрываются кольца углеводов и образуйте! альдегидные группы на поверхности клеточной стенки. Кроме того, такая обработка намного увеличивает проницаемость клеток, что вызывает повышение активности. Затем, обработкой ФДАИ добываемся сшивки полученных альдегидных групп, тем самым, еще больше увеличивая проницаемость клеток и приводя их в стационарное состояние, что в свою очередь намного повышает стабильность клеток в иммобилизованном состоянии.

Исключительно важным является тот факт, что метод позволяет сшивать клетки разных микроорганизмов с цельс создания мультиферментных биокателизаторао.

Полученные сухиз частицы продукта обладают исключительно большой физической стабильностью и структурной прочностью. Катализатор можно использовать не только в проточных, но также и в периодических условиях. При этом, он практически не вымывается из колонки и не имеется диффузионных ограничений. /

.1.3. Ра?р?.6отка ит-ите"»»* г* пи ня основе

Грр^улги'поя

В качестве исходных материалов для приготовления носителей были использованы крахмал, инулин, аубазидан и внеклеточные полисахариды, продуцируемые микроорганизмами Cr.etinow и Q-.iaureni/t.

- :з -

Процесс получения носителей на основе полисахаридов и иммобилизации зментов проводили по следующей схеме {20.23]:

ПОЛИСАХАРИД

4 сшивание НЕРАСТВОРИМЫЙ ГЕЛЬ

| зпихлоргидрин АВИЗИРОВАННЫЙ ГЕЛЬ

I ГМЯА АМИНИРОВАННЫЙ ГЕЛЬ эпихлоогидрин О ГА

АКТИВИРОВАННЫЙ НОСИТЕЛЬ

1 растеоа фермента ИММОБИЛИЗОВАННЫЙ ФЕРМЕНТ

Наилучшей зсчовой для саязызания аспастазы и срумаразы сказался юелан. для 1_-аспартат-Р-декарссксилазы - полисахарид Сг.1аигвпШ. а для 'линаз, как и следовала ожидать, инулин. 8 этом случае, по-видимому, помимо 1алентного связывания, инулиназа сорбируется на носителе также аффинным ем, что намного увеличивает саязывающую способность геля (табл. 1). Это :дположение подтверждается также в случае с носителем, активированном (хлсргидриным.

Таблица 1

Связывающая способность носителей, активированных глутароеым

альдегидом (мг/мл)

;оза Аспартаза Асп.-р-дек. Инулиназа Фумараза

1хмал 2.1 6.2 4.9 7.1

¡азидан 13.3 11.5 3.3 7.0

/лин 1.0 4.7 29.6. 3.6

«озлан 19.8 10.0 4.7 8.8 лисахаоид

Y.íaursnm 12.1 17.2 6.1 6.2

Результаты па остаточной активности ферментов после их иммобилизации носителях, активированных ГА, показывает, что инулйназа меньше всего раняет сзоп активность именно при использовании инулина. Остальные ¡менты сохраняет, э среднем, 50-80% исходной активности (табл. Z).

Таблица 2

Остаточная активность ферментов, иммобилизованных на различных носителях (исходная активность-100%)

Основа Аспартаза Асп.-|3-дек. Инулиназа ©умараза

Крахмал 55 40 54 42

Аубазидан 64 73 50 42

Инулин 12 23 26 . 31

Коиаелан 83 70 53 69

Полисахарид

Сг./аип?п& 78 85 65 40

Различие между связывающими способностями носителей, вероятно, связанс со структурными особенностями полисахаридов и их молекулярными массами. Более разветвленные полисахариды дают более стабильные результаты. По-видимому, на них можно создавать большее количество активных групп из-за значительной поверхности полученной матрицы.

1 Л. Получение носителей ня основа сипикагеля С целыо устранения известных недостатков метода иммобилизации Ферментов на силикагеле, нами разработан новый способ активации данного носителя, который делает возможным применение биокатализатора в экстремальных условиях и. не подвержен микробному загрязнение в течение длительного времени {1.43], Суть способа заключается в том, что на поверхности специально обработанного силикагега адсорбируют акрилонитрил таким образом, чтобы циановые группы, через которые фермент связывается с носителем, оставались свободными.

Принципиальным отличием предложенного способа от известных является то, что прививка мономера к поверхности происходит на за счет ЗЮН. а напряженных Б?"04» групп силикагеля, которые под воздействием модификатора разрываатся с образованием привитьве (хемссорбированных) молекул по ионному или радикальному механизму:

-о ОН

Т. А * СН " ' £1 »1

; ' А . 1

а) Скема ионного механизма

а** & * ^н -^-с^-сн-^-. ах-С-с^н-^ -

б) СхЕма радикального механизма

Описанный способ модифицирования приведет или к образованию привитых к поверхности молекул модификатора йли его полимера, или же то и Другое вместе а зависимости оттекстурыловерхности носителя.

Способ позволяет прививать большееколи1 геС\ во мономера, так как активные центры образуются непосредственно на поверхности и не образуются-; подвижные радикалы. <

Предполагается, что связыааниефермента С модифицированным акрилонитрипом силикагелелпрсисходитсогласно следующему механизму:

' Ч1" ' р-КН-Е >

' •

Данный носитель был использован для иммобилизации аслаотазы. I-аслзртат-С-декарбоксилазы. фумаразыи ииулиназы. Результаты по связывающей способности иостаточнсй активности показывают. что метод.позволяет сохранять достаточно болишой:прйцент актив :

связано с страняющимся гидроксильным покровом на поверхности, придающим-носителю больигуюгидрофильнсстьи благоприятные условия для иммобилизации

(табл.3)".

.■ Таблица 3

Сравнительная характеристикаразличных иммобилизованных <реоментсв

Ферменты Связывающая способность носителя, мгЛ^л Остаточная активность, . %

Аспартаза - 11.1 79.9

Аспартат-р-

декарбоксилаза 8.7 65.0'

Инулиназа 8.1 73.0 '

Фумараза <3.5 84.0

2. - ИЗУЧЕНИЕ -ПРОЦЕССОВ ПОЛУЧЕНИЯ,- АМИНОКИСЛОТ 2 Л,, Получений 1-асптгвагиндвай кистотн-

Для получения и-аспарагинаной кислоты применяли купьтуры-лродуцечты аспартазы ЕвюНеа шт.ЦМПМ В-2970 и 9.виЬИИз шт.ЦМПМ 6-2537. Выявлены оптимальные условия хранения, реактивации и высащизания культур [1.45].

Разработан легкий способ выделения аспартазы экстракцией а смеси трис-НО буфера и фумарата аммония, который позволяет сравнительно быстро и проста получить эпектрсфоретически гомогенный фермент {47].

T f

- lo —

Как для интактныж клеток, так и гомогенного фермента оптимальными являются температуры в пределах 50-55° и pH 9.0-tÖ,0, но они более стабильны при температурах 37-40° и pH 8,5. Все испытанные ионы, кроме Со2"*" и 2п2+ . оказывают защитное влияние на интактные клетки и на чистый фермент. Лучшие результаты дает использование ионов Mg2"1" в количестве 1 мМ [7,8.12.13.15].

Фермент из E.amidea иммобилизовали методом включения и ковалентного связывания. Наилучшие результаты дают агар и криоелан (табл.4). Последний их них использовали для дальнейших работ по получению L-аспарагиновой кислоты в проточных условиях [t5J.

Таблица4

Остаточная активность ИФ при различных методах иммобилизации

Метод иммобилизации Остаточная активность, %

Включение в ПААГ 50

Аубазидан 74

Каррагинан 54

Агар 79

Са-альгинат 70

ПВО • 14

TAU 11

Ковадектнга-свааьшние 55

Крахмал

Аубазидан 64

Инулин 12

Криоелан 83

Полисахарид 79

Q-.JaufBntff

Силикагель .80

Температурный и рН-опггимумы для иммобилизованного биокатализатора шире, чем свободного фермента. ИФ Эффективно может работать в интервале температур 45-55° и рН 6-10. но в прегточиых условиях целесообразно использовать температуру 37°. Время полужизни данного биокатализатора 20-25 дней. Метод имеет несомненные преимущества в короткий период работы: Это и высокая удельная скорость (0,5-0.7чгег»), и высокий выход конечного продукта (96-97%). а также отсутствие побочных продуктов. Но трудоемкость выделения и очистки аспартазы делают невыгодным использование данного способа, поэтому

был разработан процесс на основе ИК,

Иммобилизацию клеток осуществляли методом включения. Показано, что наилучшие результаты получаются при использовании аубазидана [41](табл.5).

однако при высоких значениях температур и рН гель постепенно размягчается, что затрудняет его использование в больших масштабах.

... Таблица 5 Сравнительная характеристика аспартазной активности клеток при различных методах иммобилизации (активность интактных клеток -100%)

Метод иммобилизации , Остаточная активность. %

Eamidea 8.suóú'üs

ПААГ 43 54

ПВС 25 30

Агар 90 92

Каррагикан ' 55 52

Коллаген ' 28 41

Са-альгинат ■ 84 80

Аубазидан 91 93

Разработанный способ иммобилизации клеток микроорганизмов а присутствии периодата натрия и ФДАИ позволяет повысить активность биокатализатора rio сравнению с интактными клетками в 7,1-3,3 раза. Но полученный: гзль недостаточно компактен и неудобен для применения в проточных услазмях. Для устранения этого недостаткайх включали в ПААГ. Посла этого получали биокатализатср с высокой активностью и стабильностью. Показано, что сшитые таким образом клетки работают намного эффективнее, чем необработанные. Так, за единицу времени первые образуют примерно а 2 раза больше продукта, чем клетки, которые предварительно нё сшивали (рис.1).

т--г-—г—яг

B[«Nfl, ш

Рис.1, Кинетика накопления L-аспарггиновсй кислоты

Стабильность биокатализаторов определяли в колонках (2 х 20 см) в течение ; 90 (уток (рМ 8,5: 5У» 0Лнвс"Ч37°)/Пшааано. что предва^жтепьная сшивка намного гшвьишетстебильность ИК. За ЭОднейнепрерывной работы они теряют ; всего 5-7%свовй иоаэднойакгивности(рис£).

Риь2. Стабильность биоетгтализвторов

С целью опитимизации и стабилизации биокатвлитичеасого процесса на основе ИК нами былийггпвдгучжынекоторые кинетические параметры.

Аспартазная реакция. катаяизируемаяИК,лротекаегг аналогично реакции один субстрат - один продукт. Такое мшточениедопустимо,та* как ао время реакции потребленное количества аммонийного иона незначительно по сравнению с непотреблвнным. Приреаличных температурах проведения процесса значение Кш (каж.) не меняется; в то время как с повышением температуры увеличивается скорость реакции й,«ответственно повышается выход целевого продукта за единицу времени. С другойстороны, с увеличением температуры падает жнзнеаюс^ность бдакаталкзатора и. как следствие, эффективность всего процесса. Это указывает,' что д анный процесс нуждается в четком • температурном контроле; особенно.- при режиме* выше 37°.

Длявыяснеиия причин, вяиясадих на процесс инактивации. исследовали ее Динамику вбиореакторес пятью ивкциями. Пс.лу«лнные результаты показывают, что в верхних секциях инактивация биокатвлизатора протекает намного быстрее, чем в нижних (рис.3). ■

Рис.3, Стабильность ИК в различны* секциях.

Такса различие, вероятно, связано с различней стабильностью ИК в растворах Ьаспарагинсзсй хисг.оты и фумарата аммония - после <£ массе обработки ИК а раствсрз Ьоспарагинозай кислоты сохраняют 37%. исоодной активности, а в оумарате аммония - 50%.

Влияние дачного ьэжелатгльнсго Эффекта можно уменьшить, если снизить температуру реакции е верхних секциях, т.е. процесс заканчивать при возможно •и-.зких температурах. При зтем процент трансформации будет несколько ниже, не это будет компенсироваться более высокой стабильностью биокатадизатора. <роме того, а «саку я рффзэтизнссть мокло сохранить также, замедлением :ксрссти потока в верхних секциях. Показано таюке, что с увеличением ееодимсй г.снцентрации фумарата повышается.зогректианссть всего процесса.

Суммируя полученные данные можно заключить, что для успешного зсушестеления процесса в кенцэ реакции необходимо снизить температуру я жороеггь протока. Кроме тего. необходимо по возможности максимизировать шчальнуа концентрацию субстрата.

Искздя из получение.« данных разработан способ получения L-аспарагинозой :ислоты. где з качестве предшественника ислсльзсзали 1,5М р^стсор сумарата 1ммсния. получаемого из маяеиноаого ангидрида.

Предложенный нрзыЯ сгоссб получения йеспарзтинсвой кислоты выгодно ггличазтея от существуя тих мзтедев, так ках полученный бискатализатср гс зоей активности превышает интг?кткыэ в 7-3 раз. Кроме тего, разработанный, ■лособ иммобилизации пегзелязт получить цеягзсЯ продукт баз примесей блочной кислоты. Намного удеи:ззг.зн процесс. благодаря использованию з а-ества предшественника о технологическом цикла aMecfo Фумаровой кислоты чалгинового ангидриде, а вместо серной - мапеинезей кислоты.

2.2. ГЪпучяние L-апяминя

Разработан метод одностадийного получения L-аланина из фумаровой кислоты с использованием культур-продуцентов L-аспартат-бета-декарбоксилаэы Pseudomonas sp шт.ИНМИА-1455 и Afaecafis шт.ЦМПМ В-3197 [1.9.10,11.40.41,45,46.46].

Интактньш клетки обеих культур эффективно могут работать в интервале температур 37-60° и pH 4,0-7,0 с одинаковым оптимумом - 55° и pH 5,5.

Выделены, очищены и охарактеризованы внутриклеточные ферменты [9]. Их оптимальные интервалы проявления активности не отличаются от таковых для интактных клеток. По аминокислотному составу ферменты отличаются высоким содержанием аспарагиновой и глутаминовой кислот, аланина. валина и изолейцина (табл. 6).

Аминокислотный состав 1_-аепартат-Р-декярбоксираз

Аминокислоты

Количество остатков. нМ на мг белка

Pseudomonas so.

A-faecafis

Аспарагиновая кислота 37 25

Треонин 27 21

Серии 21 18

Глутаминоаая кислота 32 21

Пролин 16 11

Глицин 36 30

Алании 49 24

Цистин 1/2 не определяли не

Валин 22 6

Метионин 4 2

Изолейцин 14 7.

Пейцин' 22 15

Тирозин 5 5

Фенилаланин / 5 4

Гистидин / Триптофан ' 15 13

не определяли и

Лизин .' 16 6

Аргинин 12 5

' Иммобилизацию полученных ферментов проводили методами включения и ковалентного связывания по разработанной нами методике на полисахаридных носителях и силикагеле [1С]. Наилучшие результаты получены при использовании

агара (включение) и полисахарида 0.1аипеп& (ковалентное связывание), для ;отсрых опоеделены оптимальные параметры проведения процесса трансформации (табл.7).

Таблица 7

Сравнительная хаиактеристика Ь-аслартаТг0-декар-боксилазной активности ИШ

Летод иммобилизации Остаточная активность, %

Pseudomonas sp. AtascaJis

Зкпюч«нив в ПААГ 52 .57

Аубазида-ч 73 30

Касоагинан 44 51

Aran 31 36

Са-альгинат 66 38

пвс 10 . 5

TAU • а о

'оралянтное связывание

Крахмал 42 • 39

Аубазидан 75 70

Инулин 24 23

Хоиоелан 71 56

Полисахарид

Сг./аигвпт 9t 82

Силикагель 64 67

Но жизнеспособность полученных биокатализаторов не превышает 1б суток и е может удоэлеггвосять потребностям промышленности; Кроме того, не вся спарагиновая кислота превращается в Ь-аланин (63%) и возникает еобхсдимость их разделения, что дополнительно усложняет процесс.

Для устранения этих недостатков был разработан новый способ получения ланина с помощью биферментнсго биохатализатора. который дает возможность дностадийного получения продукта из фумаровой кислоты [1,40].

Поскольку предлагается одновременное использование двух разных ерментов - аслартазы и Ьаспартат-(3-декар6оксилазьц проведена оптимизация < соотношения и сшивающего агента (глутарового альдегида). Лучшим, дахзшим очти 100% трансформацию фумарата аммония а Ьаланин, является соотношении 7 (количество аслартазы принято за единицу). Сшитые ферменты ополнительно иммобилизовали методом включения. Выявлено, что за одно и то .е время предварительно сшитые ферменты образуют примерно в 1,7 раза

больше продукта, чем несшитые. Данный эффект можно объяснить следующим образом:

Предварительно сшитые ферменты находятся в тесной близости с пределах одной микрочастицы, т.е. каждая мигчрочастица биокатализаторз является носителем двух ферментов - двух активностей , и микрсокружение аспгртазы является также микроокружением 1_-гслгртат-Р-дек£р5оксилазы. Когда начинает работать аспартаза, в микроокружении происходит понижение р.Н, что приводит к тому, что для Ьаспартат-В-дгкарбоксилгзы создаются услозня, близкие к оптимальным. В результате этой реакция рН снова позышагтег. вследствие выделения СОчто, в свою очередь, может активизировать работу гслартазы, т.е. предварительно сшитые ферменты работают как бы в езоих индивидуальных оптимальных усяоБиях. В случаз с несшитыми ферментами не мс;;-;ат наблюдаться. такого слияния кикрззкружэния одного фермента на второе.

Но данный биокатапизатор хотя и позволяет упростить и интенсифицировать процесс получения Ьаланина, но не обзепзчизавт жизнеспособность. За 21 день непрерывной работы ИФ теряли 77% езоей изначальной активности.

Для псвышзния операционной стабильности бизиатзлизатор был получен на основе совместно иммобйлизезанных клеток [40}.

В качестве микроорганизмов-продуцентов ферментов были испольгаэаны культуры Е.ггоЫга и Рвгизотопаз ер, а иммобилизацию проводили в присутствии пзриодата натрия и ОДАМ. Как и в случаз с И©, предварительно сшитые клетки работают намного эффективнее, чем необработанные, образуя за единицу времени примерно о 2 раза больше целезого продукта (риз.4).

¿4 08 10

Рис.<-. Влияний предварительной сиизкч на образование '_-гланг:на из фумгрзеой-кислоты х-х - предварительно сшитые; о-о - баз оикгки

Пслу^енныг ИК облз_~адт высокой стабильностью при 37°. За 90 суток непрерывной работы бизкатализатор, '¡а есиззе предзгрител^но сшитых клзток.

практически сохранял сзою исходную активность, в то время как несшитые клетки эффективно работали всего з течение!0-12 суток (рис.5).

100

5С

х-х- прагазгнаано актив о-о- <5аз 02ШХ2

3 50 30 Зргия, сутхя

Рис.5. Стабильность биокатализатосов

Таким образом, разработанный способ получения 1.-аланина выгодно отличается от существующих, так как полученный биокатализатср одноэтапно может превращать фумарат аммония в ¡.-аланин с высоким выходом. После трехмесячной непрерывной работы он практически сохранял своя исходную активность.

2 З^тс-з^г^ча?получек? Г^сп^гкисеей»кедата

В качестве культуры-продуцента использовали Рзеис/отогав вр шт.ИНМИА-1455. а" субстрата - О^-зсларлгинсвую кислоту [1].

Клетки ^осияизсвали включением в 5% гель агара, при котсоом' сохранится 69% исходной активности. Наиболее высокая степень трансформации наблюдается при концентрации субстрата 1.СМ, содержащем 1м№ пироеиноградкей кислоты, температуре 50-60° и рН 5,0-6,0.

Полуденный биокатализатср обладает достаточней стабильность*! (табл.61 Из полученного на выходе реакционней келенки раствора , О-аспарагиновую кислоту ссгждзли г.одкислением раствора до рН 2.3, а надссадочную жидкость упасизали и Ьапанин осаждали зтанслсм.

ТябпимяВ

Стабильность ИК. в зависимости от температуры

Бремя, Активность. % от максимальной

сутки 37° 45° 50° 550

1 100 100 100 100

2 100 31 84 64

3 100 87 78 77

4 100 85 63 59

5 100 81 57 53

? 4) По^уиоьч^е (..-тезччна ЬТеанин (у-глутамилзтиломид) является одним из ссноаньж компонентов, повышающих вкусовыа качестоа настоя зеленого чая и впервые обнаружен в верхних побегах чайного куста.

Используя иммобилизованные клетки Рзгиазтопзз п/йътз'исБлз 1РО 12534 в качестве биокатализатора с глутаминазкей активностью нами осуществлен синтез ¡.-теанина из глутамина и этиламина па следующей схема [26,31.33]:

СОКЕ2 С0ИН0Н2СН3

СН2 СН2

СН2 + СЕ5СН2ЕН2 — СН2 + КН5

ЕСЫН2 . - КНШ2

■ с ООН СООН

глутгшан зтдлаьшн теанан

Клетки были иммобилизованы методами включения, адсорбция и ионного связывания. Наилучшиг ргзувьтаты получены при юс включении с каррагняан (табл. 9).

Бяо^ташзатор его» максимальную активность проявлял при 30° и рН 9,5.

Условия непрерывного получения теаника были иоолздозшчы б чат ырежекционном биоэеакторе. Выявлено, что реакция протекает в кинетической области, однако с повышением температуры падает зфоектяокоегть всего процесса из-за нестабильности биокатализатора при температурах выше 35° что указывает на необходимость более строгого ее контроля.

ИК Р. п.Ъопя1иг?лз "активизировались" ео боох секциях в течение 10-12 сути;, а на 51 день их активность есэ еще была вышз первоначальной в 1.37. 1,30. 1.48 и 1.59 раза для первой. второй, третьей и чзтвертей секция соответственно

(табл.10).

Тяприпя9

Остаточная активность клеток Ps.nrtrvrsducsns после их иммобилизации различными методами

Способ иммобилизации

Активность. Выход активности, мкмоль/г.час " %

ДЭАЭ-целлосайн А-200 1105 ДЭАЗ-целлюлоза 529

КМ-целлссрайн , 40

Diaion FPDAB 460

Dawex 50W-X4' (Na*) 367

Duolite S326 54

Физичв^ФЯ я.нсппбния

Галлеонит No 236 78

Цеолит 54

Еентонит 235 .

Каолин 1156

Активная белая почва 155

Активированный уголь 35

Уголь костный 63

Песок (Nippon Kckan Co.,. LTD) 0 Песок Shirasu (Kagashima, Япония) 0 Древесные опилки бамбука 108 Мембрана из яичной скорлупы +

ПААГ

Каррггинан Агар (5%)

Триацетат целлюлозы

1410 1530 1200 235

47,0 22.5 1.7

19.5

15.6 2.3

3.3 2.3 10.0 49.2 6.6 1.5 2.7 0 0

4.5 +

60.0 65.0 51.0

10.0

Данная "активация" может быть результатом роста клеток или их акклиматизации к применяемым условиям, а различия между эфсрективностями начальных и конечных секции бисрегктсра - с различно, стабильностью ИК о растворах глутамина и теанина. Они более стабильны в растзоре продукта, чем субстрата.

Кроме того, при зыдерживании раствора субстрата из него выпадал ссадск Данный процесс апслне может протекать и внутри колонок, таким образом загрязняя ИК в начальных секциях биореактора. Эти данные подтверждаются тем. что при низких значениях удельной скорости стабильность биск.атали.затоо

■абпяча 10

Изменение активности ИК во времени в каждой секции (раствор 0 ЗМ глvтaминa и 0.7М этиламина с рН 9.5 пропускали через биореактор паи ЗСР и БУ = 0,3 час'1)

Активность, % от максимальной Соотношение активностей

d!^ ____

исходная (а; -icpes 12 (а1) 51 суток (а2) а1/а а2/а

49 S3 67 1.59 1,37

2 85 75 1 1.39

3 55 SS 83 1.54 1.48

63 100 ЮО 1.59 1 59

намнете выше Так. после 10 суток непрерывной работы при удельной зк.оэссти ! и час"" (40%) активности ИК пада!:а на 48%, а то время как при 0,3 -(ос " она была на 1,52 раза больше исходной (табл.11).

Изменение активности ИК во времени при различные значениях удельной скорости

S v. Активность. % от максимальной Ссзтношзние активностей час'1 _____ _

Негодная (А) 'чеиез5 (А1) 1 0 CVTOK '(А2) А1/А А2/А

U ^ 63 100 95 1.59 1.52

0 £ 35 55 33 • 1.30 1.10

! 0 26 31 . 14 1,:в 0.52

С другой стороны, применение слишком низких скоростей раствора предшественника невозможно из-за гидзолпза продукта глутаминазой в последних секциях биспеаптсрв. В данных условиях эксперимента наиболее оптимальной сксзсстьс яаляетси 0.3 чпс"1.

Исходя из выявленных результатов, для непрерывного получения L-теанина раствор 0.3М глутамина и 0.7М этиламина (рН S.5) пропускали через биореактор с ИК. со скоростью 0.3 час"1 при 30°. В данных условиях активность биокатализатора после 51 суток непрерывной работы была в 1,5 раза выше исканной, а время полужизнн составлял около ISO суток. Выход L-теанима был

окало 95% от использованного глутамина. Идентичность продукта устанавливали с пРмЬщьяо 1И-ЯМР спектра (рис.6).

Спомошыо И© и ИК культуры Вгеуг'ЬаЫепит ер шт.ИНМИА-783 сфумаразно^ активностью удалось осуществить синтез Ь-яблочной кислоты из фумарсвой 14,29,51[.

Внутриклеточная фумаразаочищена до гомогенного состояния и охарактеризована [29]. Сравнительный анализ иммобилизации ее на различных носителях показал, что самый большой процент остаточной активности наблюдается при использовании силикагеля, позтому для дальнейших работ трименяли именно этот носитель. Однако, в непрерывных рабочих условиях (рН 7.0; ЗУ = 0.4 час"1, 37°) биокатализатор стабилен всего 17 с/тск. поэтому процесс 5ыл осуществлен с помощью ИК [29,51]. Клетки иммобилизовали в присутствии 1ериодата натрия и ФДАИ, что повышало активность примерно в б оаз. Креме "ого. после такой обработки клетки не проявляют сункцинатдегидрогеназнсй ¡ктивности, по-видимому, вследствие увеличения мембранного транспорта, летку покидает кофактор, необходимый для образования янтарной кислоты.

Показано, что получение ^-яблочной кислоты необходимо проводить при 37-•0°, так как при этих температурах биокатализатор отличается высокой табильн.остыо. За 43 суток непрерывной работы ИК теряют всего 10-12% своей ¡сходной активности (рис. 7).

Рис.3,1Н-ЯМР спектр 1_-теанина

3. ПОЛУЧЕНИЕ '.-Я5ПОЧНОЙ КИСПОТЫ

хоо

I 80

. 60

Й 40

за. 50

Брздз, 07222

Рис.7. Стабильность ИК во времени при различных температурах

За происходящими изменениями ИК следили в секционной колонке. Показано, что во всех секциях в процесса работы происходит активация биокатализатора с максимумом на 25 дань, что вероятно связано с лизисом ИК (рис. 8).

1с гс го 40 го

Рис.8..Стабильность ИК в различных секциях

При этом они Почти во всех секциях ахтиаизируотся одинаково - в 2-3 раза, с увеличекием-В сторону последних секции (табл.12).

Габлни

Изменение активности ИК во времени

Сек- Активность, % от максимальной Соотношение активностей

ЦИИ___ _

Исходная Через 25 43 суток

(Ао) (AI) (А2) At/Ao A2/Ao

1 25 85 32 2.6 1.28

2 3Q 38 40 2.9 1.33

3 33 97 46 2.9 1,40

4 43 100 75 2.3 1.74

5 49 100 SS 2,0 1,96

Полученные эффекты не сгязаиы с диффузионными ограничениями. Различие между зссектиенсстями нижних и весхних секций, т.е. между их стабильности -ч. могут быть связаны или с загрязнением биокатализатора ядовитыми веществами из раствора субстрата, утечкой кофакторов или же зькмыванием фермента из гранул ИК. так как все остальные успозия одинаковы. Э ги факторы связаны со скоростью подачи раствора предшественника через слой бкокап ализатора. Было вырзлено. что хаоактер кривых стабильности не меняется при различных значениях удельной скорости, но по мере ее понижения кривые, после максимума, постепенно пеоеходят о плато, т.е. пои низкой скорости потока стабильность ИК намного еыщз. С уменьшением удельной скорости /ееличинается также степень "активации" ИК.

4 ПОЛУЧЕНИЕ САХАРИСТЫХ ПРОДУКТОВ Д 1 Полудни" гр«окгу;о-тауктоэного сиропа Одним из паоспективных кетсдсз получения ГФС является ферментативный "идролиз инулина клубней тепкмамйура. Для этой цели использовали культуры Кmandsiujs шт.ИНМИА-2864 и Л/сЛе/7/>»Л77/5111Т.ИНМИА-1911 - продуцентов -чнулиназы [19.49 501. Внутриклеточные инулиназы получили в гомогенном :сстсянии с помощью аффинной хроматографии на поперечносшитом инулине.

максимальную активность они проявляли при pH 4.5-5.5 и в интерзале температур 45-50°. Молекулярные массы, идентифицированные методом электрофореза, составляли 72 и 64 кДа соответственно для ферментов К,marianus и З./icfeniform/s

Выделенные инулиназы гидролизуют не только инулин, но также сахарозу и различные инуло- и фруктсолигссахариды. При этом, в начальной стадии реакции наблюдалось образование моносахаридов, т.е. изучаемые ферменты относятся ^ <нулиназам с зкзо-типом действия.

Выявлено, что активность ферментов к инулоэлигосахаридам (Fn) зависит от размера цепи субстратов, а сродство к субстрату увеличиаалось пропорционально степени полимеризации (п). Кроме того, значение Ко мало зависело от размера Fn, а соотношение Ko/Km для Fn имело четкую зависимость от п. Данный факт указывает, что активный центр изучаемых зкзс-инулингз имеют подцентровуо структуру. При этом, подцентры V, 2 и 3 имели положительное значение аффинности, в то время как 4 и 5 hç имели большого влияния на взаимодействие субстрата с ферментом. Во всех случаях наибольшую аффинность проявлял подцентр 2.

Полученные результаты определенно указывает на то, что для Fn (гт=3-5) продуктивные связывания преобладают над не продуктивными. F2 может связываться с ферментом как в продуктивной, так и не продуктивной форме, поэтому значения Ко и Ko/Km для данного субстрата меньше, чем у других Фруктозанов.

Из полученных данных очевидно, что место каталитического расщепления субстратов для изучаемых инулиназ находится к езду подцентрами 1 и 2 (рис. S).

Рис.Э. Гистогр^^а аффинности подцентроз инулиназ.

(Т). 'К.т&^злдя (2), В.Яспвпгюгттз шт.И,в?^ЙА-.1911; (3). В.&фёгзДЬткз шт.ИНМИА-303'». " ' ■ Стрелка указывает на место'каталитического расщепления субстратоз (Рп). ......-

Ферриты иммобилизовали методом ковалзктного связывания на крахмале,

ииулинг. а так^е смеси их с р-ЦЦ.

Выявлено, что добавление Р-ЦД существенно увеличивает езязывагащую способность геля и поззолягт сохранить более высокий процент активности. Гели на основе инулина способны сзяЗызать большее количество фермента, чем

Нокбра ECŒSBKTpOS

сшитый крахмал или крахмап-р-ЦЦ, но активность полученных биокатализаторов ниже. Данный зрфект, вероятно, связан с тем, что инулин, являясь субстратом для инулиназы, может закрывать ее активный центр, образуя устойчивый Фермент-субстратный комплекс, так как поперзчнссшитый инулин не поддается действию инулиназы. Сказанное подтверждается тем. что при использовании в качестве носителя сополимера инулина и Р-ЦД, количество связанного белка практически такое жэ, как при чистом инулине, а активность ИФ почти в 1.5 раза зыше.

Сравнительные эксперименты о носителями на основе чистого инулина и полностью метилированного инулина, кэ являющегося субстратом для инулиназы, показали, что метилированный инулин за три часа связывает меньшее количество белка. но выход активности намного выше.

Следовательно, использование инулика в качестве носителя при иммобилизации инулиназы не целесообразно из-за низкой активности получаемого биокатализатора. Наиболее подходящим является гель на основе крахмала и Р-ЦД.

Интересна отметить, что при использовании частично очищенного фермента после иммобилизации инулиназная активность намного повышается. Из Ферментного раствора с активностью в 45 ед/мин получали биэкатализатср с активностью 140 ед/мин. При зтсм связывалось 50% общего белка (840 мг), а остаточная активность в растворе составляла 12.3 ед/мин, т.е. около 28% от исходной. Эффект, по-видимому, связан с тем, что носитель каким-то образом специфически сзязывает инулиназу, или жо ска связывается в выгодной информации.

При совпадении оптимальных точек свободного фермента и ИФ отклонение зт оптимального в случае И© не приводит к такому большому падению активности, как з случае сю свободным ферментом. И© с успехом может забота ! ь а интервале температур 37-55° и рН 4.0-5,5.

Биокзтализатор был разработан также на основе ИК, которые получали зключенмем клеток в ПААГ, 5% гель егара и Са-альгинзта. Данные ■ Зиокатализаторы дают достаточно хорошмэ результаты, ко имеют ряд' тушестпеннь-х недостатков. Это, в первую очередь, диффузионные ограничения, (то делает невозможным применение высоких удельных скоростей раствора 1редшестеенника. использование высоких концентраций инулина; кромз того :летки в гелэ размножаются и усваивают фруктозу.

Поэтому клетки были иммобилизованы в присутствии периодата натрия, ОДАИ и ГА. т.з. безносительным способом. После обработки перисдатом и тиски ©ДАИ актизность клзтск увеличивается з 18.5 раза, а после ГА и ¡беззожиэания активность полученного биокатализатора в 8,8 раза превышает исгивность интактных клеток. Его с успехом можно использовать в протечных ■истемах. При непрерывных рабочих услсгитас (10% инулин; рН 4,5; 37-40°) И,К тличаютсл высокой стабильностью - за 25 суток сни теряют везго 12-15% -начальной активности (рис. 101.

Ерзал, cyrsa

Рис. 10. Стабильность ИК при различных температурах

Разработанный биокатализатор по сразнзкис с иззестными имезт ряд преимуществ. Та;-;, реакция нз ограничена диффузией; можно применять большие концентрации инулина: в конечном продукте практически отсутствуют слигосахаридные компоненты: ИК лишены способности размножаться и. следовательно, не усзаизгат.фруктозу; им"-т высокую жизнеспособность. Раствор инулина через биоргактор можно t.po;, гхггь с высокой удельной скоростью (0,5-0.5 час*'), л выход фруктозы составляет 75-76% от использованного инулина.

ó. о П.о гумен"" |.1ик,лдлекстричсп

Значительный практический и теоретический интерес у исследователей иызываат циклические олигосзхзриды - циклодекстрины (ЦД). Tas как успех эффективного их получений в большей степени зазисит от свойства применяемого фермента, нахи прозедено сравнительное изучение циклсмальтодекстрин глюканотранорераз (ЦГТаза). продуцируемых различными группами микроорганизмов - термофильными {B.siczrotfisrmcphHus шт.ВКПМ В-4905 и Bacillus so шт.ИНМИА-Тб и Т17), алхалорильными (Bacillus sp шт.ИНМИА А2. А4. AS и A7/Í) [21.22.23.27.23]. галофильным {B.hs!ophi/us шт.ИНЫИА-334Э)[34.35] и мезофкпьным ( Baailusср шт.ИИМИА-1919) [21,22] бациллами, а также гермеачтинсмицетами-( Thsrmoaavncmycsssp шт.ИНМИА А-561 и А-554) [37]. .

бнеклеточные ЦГТазы были счищены и охарактеризованы. Их некоторые физико-химические свойства приведены в табл. 13.

" м - . Таблииа 13

Ссойства различных ЦГТаз

Культура-продуцент Мол. Оптимум р.Н-сга- Термэ- Основной масса, рН бкль- ста- продукт,

кДа и ость биль- 1Щ

ность, ос

В. svsarcthcnnapliilus

шт.ВКПМ В-4505 £9 6.5 8.0- S.0 70 (х/р

Bacillus ср шт. Т17 70 - 3.0 5.5- 9.0 60 а/р

Bacillus ср. шт.Тб 68 7.0 5.5- Э.О 60 В/а

Bsa/luscp шт. А2 82 8.5 С.О-Ю.О 35 Р

Bacillus set шт. А4 07 3.5 ■ 5.0-10.0 75 Р

Bacillus sp шт. А8 90 9.0 6.0-11.0 63 Р "

Bacillus ар. шт. А7/1 93 ■ 6.5 5.0- 8.0 65 Р

Bacillus sp шт. 1S19 42 4.0 5.0- 8.0 50 а/р

B.hatc3.hilus шт. 3-349 71 7.0 6.5- 8.0 50 Р

7hsi7r.caci:nc.Tiycss ср.

шт. A-5S1 54 6.5 5.5- 8.5 70 а/р

Thcrmcactincmycss sp

шт. А-554 G3 3.5 5.5- 8.5 so а/р

Среди галорильчых баиилл и термсл'стккомицзтоз ЦГТазз идентифицирована впервые. Особенно заднее значение имеет обнаружение ЦГТаз среди термофильных актикзмиизтез, тг.ч как р^д ведущих микребиологев рассмзтр'иаззт их как филогенетически рздегге-зинуя гзробным спарообразуюшим бактериям. Это мнение ссксзгно на игепгдезакккх сравнительной характеристики укгзгмчых групп микрторгенизмов и данных нумеричесхсй классификации. Обнаружение ЦГТаз у тезмогкткном^цетов может явиться дополнительным подтзер^деннем ^ипогензтичссчсго ргдетеа этих организмов с родом БасШуз и открыэяет широкие псрспзктазы з покосе этех ферментов с нозыми, быть может более уникальными сэсастзами.

Анализ аминокислотного сзстаяа срормзнтоэ показан, что тгрмссрильнь'е и ал'салог.ильныэ ЦГТазы отличается повышенным содержанием глутаминовой кислоты, глицина, ергииина, аланина И тирозина, которые способны образовывать сс-спизаль из заряженных и непелярных остаться. Их способность кооперироваться друг с другом имеет большой стабили;!--руощий эффект. Интересно отметить, что алкалз?клы;ыа ЦГТазы обладает наибольшим количеством этих остатков. чем. видимо, может объясняться кх высокая

термостабильность - выше, чем у ферментов, полученных из термофильных штаммов. У ЦГТаз, полученных из алкалофильного штамма А8 и термофильных бактерий, наблюдается пониженное содержание серима, что также благоприятна влияет на термостабильность, так как она имеет дестабилизирующее влияние в силу того, что не входит в состав тех аминокислот, которые образуют а-епираль

Более детальное изучение ферментов показало, что каждая ЦГТаза обладает только ей присущими свойствами, которые могут быть похожими с рамках видовой принадлежности штаммов-продуцентов.

Используя полимер р-ЦД как аффинный сорбент и хроматографию на ДЭАЭ-полимере Р-ЦД и ДЭДЭ-производном сополимера р-ЦД и целлюлозы. ЦГТазы из термофильных штаммов ВКПМ В-4905 и ИНМИА-Т6, а также алкалофильного штамма ИНМИА А7/1 были разделены на несколько активных фракции, или изозерментоа, которые по своим физико-химическим и функциональным характеристикам отличались от ферментов, очищенных общепринятыми методами.

Вероятно, ДЭАЭ-Р-ЦД полимер и сополимер ДЭАЭ-Р-ЦД-целлюлозы связывают ЦГТазу не только с еысокой аффинностью, но и с тонкой специфичность». При этом, ионные взаимодействия нз играют особой роли, так как ЦГТазы, очищенные без применения этих носителей, были электроооретически гомогенными и их молекулярные массы были почти равны сумме молекулярных масс полученных изоферментоз. Тот факт, что при очистке ■ЦГТаз гель-фильтрацией и хроматографией на ДЭАЭ-тойоперле не удалось идентифицировать различные активные фракции, позволяет предполагать, что последние, по-видимому, находятся в связанном друг с другом виде (зероятно. ■. помошь» водородных связей).

Следует отметить, что ЦГТаза из мезофильного штамма была получена только б одном видз и ее характеристика была та же, что и у фермента, очищенном известными методами.

Некоторые свойства выделенных кзоферментов ЦГТаз приеедень; о табл. К При зтсм. если считать, что ЦГТаза из шт.ВКПМ 3-4905 находится в двух димерных формах (Ф. 1 + 0.4 и 0.2 + О.З). которые не удалось разделить по известным методам из-за близких молекулярных масс, то отмечегинуо выше корреляцию по молекулярным массам можно распространить -и на них. Среди различных изоферментос только ©.1 и Ф.2 алкалофильного шт.А7Л продуцировали р-ЦД как основной продукт. -В Остальных случаях а^ЦД продуцировался в сравнимом или большем-количестве по сравнению с р-ЦД. С другой стороны, ЦГТаза из от .'ВКПМ В-4905, выделенная без применения полимера ЦД. прадуцирезала преимущественно р-ЦД. Данный факт мо»-.но объяснять тем. что 70% общего беляа и 50% общей активности исходного сермента этого штамма приходится на Ф.1, для которого основным продуктом

Таблица 14

Несколько характеристик изоферментоп ЦГТаз

Источник Мол. Оптимум рН-ста- Термо-Соотношение Выход масса, рН биль- -га- а/р/у-ЦД, ЦД. кДа ность биль- % %

ность, °С

Фракция 1 35 6.5 6.0-10.0 75' 2.9/3.5/1.0 62

Фракция 2 31 7.5 6.0- 8.0 70 5.2/3.1/1.0 55

Фракция 3 23 7.0 5.5- 8.5 60 4.8/3.5/1.0 60

Фракция 4 25 6.5 5.0- 8.0 50 5.2/3.4/1:0 46

Р* 69 3.5 6.0- 9.0 70 1.4/3.1/1.0 55

ИНМИА-Т6

Фракция 1 38 6.5 5.0- 9.5 еп 4.6/3.8/1.0 55

Фракция 2 30 7.0 6.0- 8.0 60 5.4/3.7/1.0 61

Р* 68 7.0 5.5- 9.0 60 4.4/3.7/1.0 53

ИЧМИА-А7И

Фракция 1 50 7.0 5.0- 8.0 65 1.0/27.0/4.0 6-1

Фракция 2 44 3.0 5.5-10.0 55 1.0/58.-/7.4 70

?' 93 6.5 5.0- 8.0 65 1.0/3.7/1.2 56

Р' - исходный фермент.

являетгя Р-1±Ц. Полученные данный выявляют наличие определенной видовой слят-фичнести в образовании отдельных изсхрерментов, ответственных за гродуцирозание ЦД у споресбразующих бактерий.

Так как каждая ЦГТаза способна катализировать по крайней мере три превращений' внутримолекулярное трансгликос-мписсзание; ме,*мо пекулярное трансгликозилироаание: гид^ллн- крахмала, мальтоолигссахаридсз и ЦД - то механизм ее действия должен рассмативаться с учетом протекания всех этих реакций. При этом, важное значение имеет исследование взаимодействия различных гликсзидов, способных связываться с активным центром ИГТаз и ингнбировать реакцио циклизации или/и инициировать межмопокулярное траисгликозилирсвание. Заявлено, что дяп ^реактивного связывания акцепторов с ЦГТазами необходимым условием является интактность гидроксильных групп концевого глокоп^оонозильного цикла во второй, третьей и шестой позициях, поскольку зце гиг.глокозамин, 3-0-метил-глпксза и глюкоза-6-фосфат по сравнение с

глюкозе?» проявляли меньшую или не проявляли ингибирующей активности вообще по отношение к циклизации. Изомеризация в положении 2 (манноза) и 4 (галактоза) приводила к аналогичному эффекту.

С другой стороны, ингибироаание становится более выраженным при блокировании полуацетальных гидпроксильных групп (метил-а- и -¡З-глюкозиды), указывающим, что в случае низкомолекулярных акцепторов природа аномерной езязи и неуглеводная часть не имеет большого влияния на реактивность ЦГТаз.

Таким образом, для эффективного взаимодействия гликозидов с ЦГТазой важнее значение имеет гидроксильные группы в положениях С2. СЗ и С6 концезого глокопираиозильного цикла. Причем, экваториальная гидроксильная группа акцептора при С4 должна быть свободной. Сахара, которые имеют другую конфигурацию одной из вышеперечисленных гидроксильных групп, являются неэффективными акцепторами или не являются ими вообще.

Следует отметить, что основные продукты реакции межмолекулярного трансгликозилирования заканчиваются молекулами акцептора. С другой стороны, в присутствии любого акцептора в начальный период реакции ЦД образовывались до определенного количества и соотношения, характерного для данного ергрмента. Затем их количества снижались из-за децикпизгции и межмолекулярного трансгликозилироаак-. ■.•■ з трс:™ер:

в линейные олигосахариды.

Исследован также механизм образования ЦД из различных мальтсолигосехаридов. Выявлено, что выход ЦД существенно зависит от размера субстрата. Чем выше степень полимеризации (СП) мальтоолигосахаридов. тем выше еыход ЦД (рис.11).

¡ЕКЙ

Рис. 11. Образование ЦД из различных мальтоолигосахаридов

Соотношение а-, р- и -у-ЦД зависит от типа субстрата и значительно аасеирузт во времени.

5 самый начальный период реакции (30 сак. 40°) ЦГТаза термофильного штамма 5.КЛМ В-43С5 не прод/цироааг.а ЦД из мальтогексаозы и

мальтогептаозы, а мэльтстрисза была идентифицирована как основной продукт гидролиза. Однако ужй после 1.0 ми» инкубации наблюдалось образование маг.ьтсолигссзхарл.сз со СП, разной вссьми и выше, и вслед за этим - появление ЦД. Вполне вероятно, что мальтсолигссахариды со СП ниже восьми прежде всего подвергается межмолекулярному трансгликозилированию с образованием нсеых мальтоог.игссахаридоз с более высокой СП, которые мсгут быть прямыми субстратами для циклизации. Так, ЦГТаза из шт.ВКПМ В-4905 способна сгязызать мальтсгексаозу и мальтогексаозу, но образующиеся комплексы были непродуктивными для образования ЦД. Только мальтоог.игссахариды со СП выше семи могли быть прямыми субстратами з реакции внутримолекулярного тргксгликсзилиросзния. При этом мальтооктаоза была самой маленькой из них.

ЦГТаза из апкалсфильнего шт.ИНМИА-А4 из мальтогексаозы и мальтогептаозы продуцировала ЦД. глюкозу и различные мальтоолигосахгриды со СП до 10 (2 мин, 37°). Однако при реакции с мгльтооктаозой, мапьтононаогсй и мапьтодекаогой были идентифицированы глюкоза, мальтоза и мальтотриоза совместно с С-ЦД (рис. 12). Полученные результаты покззызаот, что циклизация и отщепление бск.сзой цепочки мальтослигсгг^сидоз со СП выше восьми протекает одновременно.

Сс-разсопн-хз ЦД из '"пгьтссктгсзы (а), мачьтонснаэзы (5) и млгьтодекзоза (з) под действием иГТазы щт.ИНМИА-А4 ¡373, 2 мин): 1 - глюксеа. с - мальтоза, 3 - мальтотриозз 4-Э-ЦД.

,, п Дгя еь«»*»* действия ЦГТаз на различные субстраты » путей обезэования

"ень кнеермацию можно получить, исследуя продукты реакции

! аз замещенное мзльтсслигсса^риды. Б реакциях иГТаз из термефилы-ых злтинзмицетеэ и галсоильнсго штамма -.а^-н-тгссз^нл-с-ма.-ьтголигос=Х2рнды ча очень короткий период, чтобы ■слех-гта циклизации и дисг.рсг.сзиионирсгания, выпалено. что сенсзным -сзд.>лсм гидролиза 4-читрооанил-мальтсзы (р^РС2), мальтотриэзы (р(\РОЗ) V -.^ьтотетраезе [рНРОЛ) явля-зтея читрссенчлггюхоза ДОР01). а то время как

из более высокомолекулярных субстратов образуется преимущественно р При этом, в случае всех трех ферментов сродство к субстрату увеличивалось от

до несколько уменьшалось для /?МР(з5 и достигало максимуму с

рМРОв (табл. 15).

Таблица 15

Кинетические параметры действия ЦГТаз на различные

Суосгргт . Km, mM Vroax, мкмоль/»»™ Ко, сек-1 Ko/Km, М.сег1

А в С А В С А Е i с А Б с

/¡NPG2 1020 560 620 0.670 1,000 о.аоо 5.5Ü0 8,40 6,70 5.50 15.0 10.6

>sNPG3 310 740 330 0270 0.420 о.зоо 2.250 3,50 2.50 2.77 8.0 6.6

/TNPG4 es 42 35 0.055 0.055 о.мз 0.540 0,4В 0.33 8.33 160 10,2

pHPGS 22 23 27 0.037 0.063 0.044 0.553 0.53 0.37 24,70 23.6 13.6

pNPGS 34 24 33 О.СЕЗ 0.063 0,047 0.530 '0,54 0.33 16.81 23,0 13.0

pHPG7 26 23 30 0,072 0.067 0.048 о.еоо 0.56 0,40 , 23.50 23.9 13.5

рЫРОЬ 8 8 о 0,034 0.03S 0,01 S 0.2S3 0,30 0.1 Б 34.10 35,6 18.4

А. ßbitophäut цл\ИНы^А-3343: В, sp.'ит.ИЙМИА -А-С61;

С. Thermoacpnamycas sp ил".ИНМИА-А-554.

Это показывает, что активный центр ЦГТаз состоит из дзух отдельных частей - предположительна даноркой и акцепторной. Максимальная скорость реакции слабо сазискт от размера замещенных мальтсслигосгхаридов от pNHG4 до рНРО.1, одналз она существенно уменьшается для /?NHG£>, которая, видимо, способна взаимодействовать с обоими центрами одновременно, что является необходимым условием образования ЦД. В случао других использованных субстратоз со СП мзнге восьми прэтокает только реакция мгжмолекулярного трансгликозилирования, т.е. данная саязи язлястся нзпродуктиеией для циклизации, поскольку очи способны оккупировать только один из педцентрзв.

Для всех трех ферментов максимальное сродство к субстрату наблюдалось для подцантра 2. Аффинности подцечтроз !, 4 и 5 тахх-е были положительными, с то время как 6 и 7 имели значения, бяюгфе к нул:з, а для третьего она была отрицательной. Полученные данные уъаздеают, что ейзето расцепления субстратоз находится между лодцентрами 2 и 3 (рис. 13).'

Выявлено также. что различный Ц.Д способны занять активные центр ЦГТаз. что однако недостаточна для высокой скорости реакции. Для этого трзбуется присутствие различных акцрлторзз. С другой сторзуы. при избыточном количастве ферментов гидролиз и взаимрпреврзшюакз УД наблодагмсь также при отсутствии акцепторов. При этом, с? всех исследоааннух случаях, в начальный период реакции из ß-ЦД образовался <*-ЦД. и.нэзберот. Синтезу-ЦД

наблюдало: в белее лозпньге сроки превращения. Причем, конечное соотношение различных ЦД было приблизительно таким, как а спуч~е с крахмалом з качестве субстрата. При большей проасл;китсльн,згги реакции.ЦД

]

■ - Л

-яЛ.

Рис, {3. Гистограмма аффинности пздщ-.чгоз

А, 7Ъг-ггт:сгс£:~о,цжзср. щт.ИНММА-521; 3, Гпеплаасапотусгзср шт.ИНМИА-554; С. В-Ье/орШис шт.ИНМИА-г543. Стрелка указызеет место каталитического расщепления.

полностью превращались в линейные мальтозл'-госахариды, т.». ЦД сами могут яыступать а качестве икгибиторез циклизации.

Еолсо детальный анализ продуктез ргакцки на ЦД показал, что взаимопревращение а- и р-ЦД под всздайствией термофильных и кгзофильного реркентоз протекает по одинзкезой ехгмз, однако они действуют нау-ЦД по несколько иному механизму..

Отдельные эксперименты с иетсльзсганием термофильного фермента шт.БКПМ 3-4505 покозаяи, что в сзкыЗ начальный пзэисд реакции (30 сек. 50°) ЦГТаза продуцирузт мальтотрнозу и.мальтсггксасзу из а-ЦД (сис.14п). С другой стороны, фермент продуцирезал глюкс-зу, мальтотриозу и мгпьтегептаозу

Рис.К. Взаимопревращениее.-(а). р- (5) иу-ЦД (з)т-^д.де?,стэигм термофильной ЦГТезы шт.ЗКПМ 3-^305 (30 сек. 50=). 1- глюкоз?.. 2- мальтоза. 3- мгльтотркоса,-'--мзльтог2ксгоза. 5-мзльтсгслтасза. 3- кальтсоктаоза. 7 - к-ЦД, 3- р-ЦД. 5- у -ЦД.

с.

(рис. 146) и мальтозу, мальтотриозу. мальтооктаозу, а-ЦД и малое количество глюкозы (рис. 14а) из р- и -/-ЦД соответственно.

Очевидно реакция с ЦД начинается с образования линейных мальтоолигссахаридоз. которые затем подвергаются мвжмолекулярному трансгликозилированию. При этом накопление глюкозы и мальтозы наблюдается толоко после образования ЦД. Из а-ЦД вначале образовывался (5-ЦД и наоборот, а образование у-ЦД наблюдалось только посте накоштения-в реакционной смеси достаточного количества мальтоолигосахаридов со СП равной девяти и выше.

В начальный период реакции скорость взаимопревращения была низкой, но затем ускорялась с накоплением низкомолекулярных Сахаров, з особенности. , мальтозы.

Из полученных результатов можно предположить, что активный центр ЦГТаз состоит из двух отдельных частей, одна из которых строго специфична к а-1,4-связанным мальтоолигосахаридам. в вторая - менее специфична и может . взаимодействовать с неаосстанааливаощим концом концевого 0-глокозного остатка и с некоторыми другими сахар«--« (сахароза, сорбоза. ксилоза и т.д.) (рис.15).

^ Гц......и» |, ........и,

Рис. 15. Гипотетическая структура активного центра ЦГТазы

Однако, для циклизации необходимо, что субстрат связывался с двумя частями активного центра одновременно и гидроксильная группа в положении С4 концевого невосстаназливавщегося глюкозного остатка была свободной. Вероятно также, что в специфической.части фермента существует только семь каталитических участков, каждый из которых способен связывать лишь одну глокозную единицу. Поэтому, когда субстрат короче, чем восемь глокозных единиц, протекает только их гидролиз и диспропосционироаание, так как. они способны занимать специфическую часть,ЦГТазы, но не взаимодействуют с неспецифической частьи, или же занимают оба участка, но существую связи между ними. При этом протекает реакция межмолекуляного трансгликозилирс^'ания с образованием высокомолекулярных маг.ьтосл^госахаридоз. так как низкомолекулярные продукты гидролиза или низ».омоле»упярныа акцепторы сами могут отдельно взааимодействовать как

специфической, так и неспецифичесхой частями. Например, при применении сахарозы в качестве акцептора образовываются невосстанавливающие фруктозо-концевые олигосахариды, а из мальтозы,- более высокомолекулярные мальтоолигосахариды (рис. 16. 17).

СЮООр® 'М--' ООООФ® . О0

О® 0 ........III,.. , In. п

Рис. 16. Образование не редуцирующего фруктозо-концевого опигосахгрида из мальтогексаозы и сахарозы

■ м

ЯГ .

Рис.17. Образование некоторых мальтоолигосахаридов из мальтозы: 1- глюкозный остаток, 2- редуцирующий конец.

Можно предположить также, что акцепторный центр имеет только предварительно-связывающую функцию, приводящую к изменениям конформации всего активного центра и ориентирующую связывание донора в положении, необходимом для трансгликозилирования.

Из данного предположения может быть обьяснен факт гидролиза и взаимопреврацения ЦД- Если ЦГТаза действовала бы только как трансгликозилаза, то в отсутствии акцепторов она не смогла бы раскрыть цикл ЦД. Однако, если последний связывается с акцепторным центром без каких-либо возможностей переноса, кроме как к воде, то гидролиз может протекать в донорном (специфическом) подцентре.

Исходя из описанного механизма, предлагаем осему дециклизации (рис. 18) и взаимопревращения ЦД на примерв7-ЦД (рис.19).

в-©'®'®« ® (№■'............. " """

е-©«*®*®-»-®

вЮОФ®

»»в •■в

«-в

Рис.18. Схема дециклизации Р-ЦД в начальный период реакции

Рис. 13. Схема взаимопревращения ЦД на примере у-ЦД

Кроме того, необходимо отметить, что каждая ЦГТаза продуцирует смесь ЦД 8 строго определением соотношении. На основании результатов кинетического анализа и применения различных резгентез для нарушения этого равновгеия, можно добиться получения того или иного ЦД с достаточно высоким выходом. Данное предположение может объяснить Зффект некоторые органических растворителей на выход разл. 1!Д. При зтом происходит обргзееализ специфических комплексов, котс^-«. выводятся из реакционной среды, так как на являются субстратами для .¿ДГТаз'. Вследствие этого продукция д-^нногс ЦД под действием фермента увеличивается.

Таким образом, в зависимости от применяемого фермента и услоаий реакции можно получить определенный тип ЦД непосредственно из прямого субстрата или реакцией взаимопревращения,

Используя имеющиеся данные па свойствам и механизму действия ЦГТаз нами разработан метод получения ЦД с применением ИФ и ИК термофильного шт. ЕКПМ В-4505 [23].

Частично очищенный фермент,-а также- клетки были иммобилизованы различными методами (табл. 16).

При использовании носителей на основе |ф5хмала зффектианость процесса понижаете;! из-за низкой активности полученных биокатализаторов. Еероятно, при этом Ц| I аза сеязы^аэтсг! не только ксвелентным, но и аффинным путем, что приводит к блскирсеанию активного центра. Интересно отметить, что добавлений ЦД намного улучшает биокатглмтйчесхие сцэЯства использованных ' подложек. При методах иммобилизации вклинением главную роле играят диффузионные ограничения, возникающие при использовании высокомолекулярных субстратов.

"ТйблинЯ 16

Эффективностьразличных могтодЬвмобилизации. ЦГТазы ' Bxtcawähemxphäus. игъВКПМ:В-4905

. Метод иммобилизации ; ВышД1Ш, %-от крахмала

• Интактные клетки , £37,4 t^nrrnfiirnr'Trinillirr пгтнти

Са-апыч4нат - Т% • :Т54.7

-Л -2% Г 54.5 :

-5% • СО

Поперечная сшивака Г52.0

ПГТта ичпг^Нтаттнтя

Крахмал + ЦД • "44.0

Крахмал '0 .

Инулин . . ?50.0 -

Инулин+ ЦД 52.2

.Силдаром "53.8

Са-альгинат- 2% 55.3

-5% . ' ■ '.0

Наилучшие результаты как по активности, так и по выходу:ЦД получены при использовании еилахрома и инулина с ß-ЦД. Ситюхромовый биокатализатир. который проявлял выажу» активность и стабильность в интервале pH 5.0-8.0 и . температур - 30-60°, был применен для- получения. ЦЦ в проточных условиях.

Исследование некоторых кинетических закономерностей ИФ показало, что с увеличением температуры процесс сильно интенсифицируется. Йнактивацию ИФ исследовали в пятиоекционнойколонкесудельдай скоростью 0,5 час'З и 55°ГВ первой секции инактивация проиоаэдитнамного быстрее, чем в верхних, (рис.20).

Причиной этого явления можеТбыть вымывание -фермента из биореактора, лгм влияние токсичных длябиокатализатораеещесте. которые могут 7рисутствоэать в крахмале: Однако вымывание фермента не наблюдалось.' а i торой фактор полностью связан, с удельной скоростью рзстрора тредшественйика. с увеличением которой Стабильность ИФ сильно падает. Однако невозможно использовать слишком нИзкие скррости, так как при этом в жореакторе, после циклизацмапротекаетреакция межмолехулярного -рансгликозипирсаания с получением линейных мальтоолигосакаридов. Данный крфект полностью снимается также при использовании высокоочишенкого рахкала.

- ц -

При оптимальных условиях проведения процесса выход ЦД Достигает до 50% с содержанием а-, (3- й у~<рормв молярном соотношении 2,2:3,6:1.0. .

С применением ЦГТазы В.5&аго#1егтпсрЬИиз шт.ВКПМ В-4305 нами разработана также оригинальная технология целенаправленного получения а-ЦД [53]. При этом . исходили из того, что во время реакции а-ЦД образуется намного быстрее, чем р-ЦД, но его количество со временем падает. К такому же эффекту приводят высокие концентрации субстрат- тах как сильно увеличивается продолжительность реакции. Наиболее -эффективным путем повышения выхода а-ЦД и предотвращения взаимопревращения является выведения его из реакционной среды. Для этого можно использоваТь 'или различные комллексосбразователи. от которых в последующем весьма трудно освобождаться, или применять ультрафильтрационные мембраны, которые селективно пропускает ЦД с низкомопекулярными мапьтоолигосахаридами. Для этой цели нами использовались ультрафипьтрационные мембраны на полых волокнах. В выявленных оптимальных'условиях выход а-ЦД из 5®/<>-ного ■ растворимого крахмала достигал до 60%. -

Суммируя полученные данные, можно.заключить, что алкалсхрильныв и галофильная ЦГТазы являются наиболее эффективными для получении р-ЦД. а термофильные ферменты перспективны для получения а-ЦД. но в зависимости от технологических решений их можно использовать и для получения других ЦД.

На основе термофильной ЦГТазы шт.ВКПМ 8-4905 разработана технология получения р-ЦД и алрабирована в условиях Ладыжинского ЛБО 'Энзим" (Украина), где получены его опытно-промышленные партии.

Глаензя проблема эффективного получения-у-ЦД является термодинамическая невыгодность этого процесса, которую можно улучшить только с использованием специфических комплексробразователей. как это показано в случае метилэтилкет'она, бромбензола и пентациклических терпеноидоа. Однако эти соединения, помимо у-ЦД образуют устойчивые комплексы также с а- и р-формами. Необходим был поиск таких веществ, которые образовывали нерастворимые ииклюзионные комплексы только с у-ЦД.

Для этой цели нами были исследованы различные макроциклйческие соединения. Выявлено, что вещества с 10-12 атомами углерода в цикле способствуют образование р-ЦД, а более высокомолекулярные комплексуются почти исключительно с -¡г-ЦД. Наилучшие результаты получены с использованием циклотридеканона. а также циклотетрадек-7-эн-1-она, циклогексадек-8-зн-1-она. циклогексадека-1,Э-диона. 2.8-диокса-1-оксо:-цикл6гептадекана и 2,5-диокса-1.6-диоксо-циклогексадекана в количестве 1% в конверсинной среде. При этом. ЦГТазы шт.ВКПМ В-4905 ншт.ИНМИА А7/1 продуцировали смесь р- иу-ЦД с

вьжодом 40-46% и с содержанием у-формы 98-99%.

Нами разрабегган метод получения а- и р-ЦД из рисовых отрубей, которые являются отходами производство японского напитка сакэ и содержат около 70е/, крахмала [25,36].

Сорбция различных кзтехинов и кофеина ЦД и их производними Носитель ■ Количество сорбированных компонентов;%

С; ЕС - ЕвСд СО ЕСд ЕвС ССд Кофеин

а-ЦД ( 0 0 0 0 0 ' 0 0 0

Р-ЦД 0 0 0 0 0 0 0 . 0

7-ЦД 0 0 0 0 0 0 0 0

сб-ЦД-полимер , . 30 33 41 21 12 44 46 90

Р-ЦД-полимер 100 100 100 100 100 100 100 2

7-ЦД-лалимер 21 12 33 . 35 25 42 40 21

Амиио-Р-ЦД-полимер 60 БЗ 54 50 43 ' 81 67 6

Гексаметиламино-

р-ЦД-полимер 75 60 57 51 38 84 88 3

Эпокси-Р-ЦД-полимер76 6В • 50' 77 62 71 74 133

Альдегид-Р-ЦД-

полимер 63 60 55 70 62 .74 13 ■ 3

Диальдегид-Р-ЦД- .

полимер . ' 55 52,. 67 69 66 70 73 5

ДЭАЭ-Р-ЦД-полимер 42 40 38 52 61 72 78 8

ЙгОУ-Р-ЦД-полимер 70 71 74 78 • .83 88 36 4

Целлвлоза-Р-Ш-

сополимер 47 . 50 , 52 55 56 87 82 8

ДЭАЭ-целлюлсза-р- 68 76 11

ЦД-сополимер 46 45 49 53 59

¿/¡Зр-Р-ЦД-полимер 10 12 9 20 16 28 26 7

При зтом:1ЦГТазашх.В1ШМ В;А805йл 1 кг.отруб«лродуцирйеапа 130 r ji- и 120 г а-ЦД^а.тахже:.140г рисовой мук* с аысаки«тдвр»ииив*г протеина (около-40%) ;.и 27% 'глюкозы Поспаднна *тажв^тцмрб№.жоот>аювдпяя -

питании при пригсгговтгениису>^.маго^ т.шблагодаря

. своим высоким гттательнымсаойлвам. Остаточный маточный раствор а по лне : пригоден для молочнокислого* СПИртГОВСГОбрОЖвНИ».

Наоснове лолученногонамм е твпллгуиасусяоаыях {ЫДДАалажан опытноу

промышданиыажыпусм»^^ ' ■' ''•'*'•-,'.

Полимер ртЦХи^нтезцюванныйками дказалсшзревпгхщцмм -матаризломддя -декофеинизацин различных растворов (чай, кофе, коканшла и .т. д.) (табл.. 17) [30];

' При этом, он не тольшне образовывал хомплексас кафчмном, -но и выводил из растворов все*атехииы;такиек2вс (+)^техин (^, ^)-эпи1(атвхин (ЕС); (-)-

эпигаллокатвхин (-)-•

эпигаллокатехингаллат (EGCg) и -(-)-галлакатехингаялат (GCg),

Оптимальнойтемг^атуроадемхреинизгциибьша выбрана 306 при удельной ■■ скорости кофеинсодержащего раствора 1.0-1,5 час?.. Элюцию Адсорбированных компонентов осуществляли простил ромыаание»носитеяя30%-ным этанолом или 0,2%-ным раствором ЫаОН (рис.21), '

e-.^-e.-w «..»/■•«.*' j I i ¡J'Ll! \

Рис.21-. ВЭЖХ-грамма декофеинизации зеленого ная: А-исходный раствор чая; В -злюат после обработки полимером р-ЦД;. СГэлюат после обработки 30%-ным этанолом; 1 - кофеин; 2 - С; 3 - ЕС; 4 - ЕССд; 5 - вСд; 6 - ЕСд

Полимеры ЦД и их некоторые производные, впервые синтезированные нами.. были использованы также для энантиомерного разделения различных соединений в условиях ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ.

¿.3. Папундуха-стуктсао-^сц^выу спинзозхэриппя

Промышленное использование ЦГТаз определяется не только их способностью катализировать внутримолекулярной, но также м межмолекулярное трансгликозилированиз {22].

Как отмечено выше, в присутствии некоторых низкомолекулярных Сахаров -акцепторов под действием ЦГТаз происходит расщепление крахмала или ЦД с образованием мальтоолигосахаридсв, оканчивапщимися на ред'уцирусщем конце молекулами акцептора. Данное свойство послужило основой для получения фруктозо-концевых олигосахаридов из крахмала и сахарозы.

Сравнительное изучение термофильных, алкалофильных и мезскрильных ЦГТаз показало, что в случае с термошильными ферментами преобладающими являются мапьтозилфруктоза и мальтотриозйлфруктоза. а количество низкомолекулярных сруктозо-концеаыхслигосахаридов составляет около 50% в смеси. Данная тенденция прослеживалась также в случае с алкалофильными и мезофильными ферментами, однако в отличие от термофильной, зти ЦГТаз ы продуцировали большее количество мальтозы. :

Типичный состав получаемого сиропа приведен в табл.18.

Таблица 1А

Состав сиропа сруктозо-кониевых олигосахаридов

Фруктоза 0.5-1.5%

Глюкоза 5.0-7.0%

Сахароза 11.0-15.0%

Глюкозилсахароза 11.0- 15.0%

Мальтоза Ю.0-12.0%

Мальтотриоза 7.0-3.0%

Мальтстрисзилсзхароза 7.0-11.0%

Мальтотетраозилфруктоза •' 8.0-9.0%'

Мальтопентаозилфруктоза 5.0-7.0%

Более высокомолекулярные

олигосахариды 28.0-30.0%

Тоже результаты получены при использовании вместо крахмала различных ЦД или вместо сахарозы - гидрояизат инулина. Однако, при этом резко .снижается количество высокомолекулярных олигосахаридоа (около 8,0%), что очень важно.

Полученный подсластитель обладает низкой калорийность» и не сгрззует кариеса благодаря тому, что из него не образуется нерастворимый глюкан м, кроме того он подазляет рост З&Е/Яхассив ппЛалв вызываошего кислстсобразование. Подсластитель не кристаллизуется, обладает отменными вкусовыми качествами и может употребляться больными диабетом.

- 4<i

4 4, fon^n р-тпуктозу/аачозидазо*

Подсластитель на осноае фруктоолигосахаридсв, обладающий всеми преимуществами, что и фруктоао-концевые олигосахариды, получен с помощью ß-фруктофуранозидазы P.paiitans шт.ИНМИА-Т1. Данный заменитель сахара улучшает липидный уровень и подавляет гнилостные процессы и селективно усваивается бифидобактериями кишечного тракта. ■

Для этого на 55%-ный раствор сахарозы (pH 5,0) добавляли 2-3 ед фермента на 1 г субстрата и реакцию осуществляли при 55-60° в течение 22-24 часов. После инактивации фермента обработкой реакционной смеси при 80° в течение 30 мин. раствор обрабатывали активированным углем, фильтровали и концентрировали до содержания сухих веществ 75-76%. Разделение отдельных продуктов реакции проводили на колонке с модифицированным активированным углем и их строения идентифицировали методом полного кислотного гидролиза, метилирования и метанолиза.

Установлено, что изучаемая ß-фруктофуранозидаза продуцирует преимущественно 1-кестозу, нистозу и фруктозилнистсзу и по процентному их содержанию превосходит известный промышленный подсластитель подобного типа "Neosugar G" (Япония). Полученный нш .„-■ лодукт состоит из смеси глюкозы и Фруктозы (до 29%). сахарозы (до 19%), 1-кестозы (до 25%), нистозы (до 24%) и

ФРУКТОЗ/1ЛНИСГОЗЫ (до 10%).

Используя тот же феомзнт. а также инзертазу К.marianus шт,ИНМИА-388Д разработан такжз метод получения лактосахарозы:

Данный олигосахарид отличается низкой калорийностью, отсутствием кариессгеннссти, не усваивается в желудке, язляется фактором роста для би.фидобоктерии кишечника, улучшает уровень липидов. а также оказывает положительное влияние при запорах.

В качестьг субстрата использовали смесь лактозы и сахарозы. Образование лактосахарозы достигала максимума при рН 5.5-6,0 и температур 50-60°. Наилучшее количество фермента при использовании 40%-ной смеси Сахаров ронялось 7.5 ед для фруктофуранозидазы и 15 ед/г сахарозы для инеертазы. В качгстее оптимального выбрано соотношение лактозы и сахарозы 1:1. В указанных условиях реакция практически зазершаатся за 15-13 часов.

Конечный сиропообразный продукт после очистки наряду с лактосахарозой =спес.-.«.лп с,*.ог,о 0.5% глюкозы и фруктозы. 0.6% лактозы, 0,2% сахарозы, 0.5% 1-м-ттсзы ,< 0.1% других слигосзхасидез.

е'^ои

с%оч

4 5, Иггун*" галгктгслигосяуаднпмого сипгттд

Р-Галактозидаза производства Ладыжинского ПБО "Энзим" (Украина) была использована для получения различных галактослигссахаридов. которые обладают 40-50% сладости сахарозы и кэляотся фактором роста для битидобактерий.

В качестве субстрата в процессе использозапи творожную и подсырную молочную сыворотку. содержащую около 4.0% лактозы [63].

Сыворотку подвергали термообработке при 92-95° в течение 30 мин при рН 4.45-4.6 и выпавший осадок денатурированных белкоз отделяли центрифугированием. Остаточные белки отделяли на ультрафильтрационных мембранах. После деминерилизации, полученный рзстеср концентрировали до содержания лактозы 50-55%. добавляли 20 ед р-галактозидазы на 1 г лактсзы и реакцию осуществляли при 50° з течение 4-5 часов при постоянном перемешивании.

Выявлено, что с увеличением концентрации лактозы' выход слигосахаридсв существенно увеличивается, в то время как с увеличением количества вносимого фермента происходит лишь ускорение реакции, а содержание и соотношение различных ди-. три- и моносахаридов остается неизменными.

Выделение и очистку продуктов реакции осуществляли на колонке с активированным углем и с последующей накопительной бумажной хроматографией.

Из реакционной смеси были выделены три дисахарида, один три- и один тетраегхарид.

Методами полного кислотного гидролиза, исчерпывающего метилирования и метанолиза идентифицировано, что дисахариды имеют следующие строения: 1 -Са]р('»Э)Оа!: ¡1 - Са!р{1-5)С1с (аллолактоза) "и Ш - Сг!Р(1-3)а1с.

Трисахарид и тетраегхарид состояли из одного остатка глюкозы, а также 2-х и 3-х единиц галактозы ¿»ответственно, соединенных между собой следующим образом:

р-0-0з]-(1-5)-р-0-Са]-(1-4)-0-С!с; р-0-Са1-(1*5)-р-0-Сз1-(1*6)-р-0-Оа!-(1'4)-0-С!с. .

Содержание трансферных продуктов достигает до 30-40% в зависимости ст концентрации лзктезы.

Разработанный метод переработки мелочней сызоротки с получением различных гапэчсслигеезхгридоэ отличается своей оригинальностью и эффективность». Процесс межко легко автоматизировать и осуществлять в проточных условиях с использованием иммобилизованного фермента.

ОСКОЕШВ ВЫВОД*

1. В результате исследования процессов иммобилизации клеток и ферментов микроорганизмов на основе природных соединений - аубазидана. инулина, внеклеточных полисахаридов Сг.ейпаш и Qr.kiu.snia. а также ЦД разработаны новые методы получения иммобилизованных систем, позволяющие интенсифицировать процессы получения 1_-аспарагиноеой кислоты. Ьапанина, яблочной кислоты, глокозочрруктозного сиропа и циклодекстринов. Установлено, что добавление Р-циклодекстрина к носителям полисахаридной природы обеспечивает более высокую связывающую способность и остаточную активность.

2. Исходя из результатов исследований особенностей текстуры и химической реактивности силикагеля предложен способ его активации, хемосорбцией , акрилонитрила. После модификации на поверхности сохраняется гидроксильный покрав, придающий носителе большую гидрофильность, что создает благоприятные условия для иммобилизации. При этом прививка мономеоа к поверхности происходитзаснет напряженных й'О'Э групп силикагеля.

3. На основе изучения состава углеводной части клеточных стенок используемых культур и возможности создания на них реакционоспссобных альдегидных групп разработан новый, оригинальный способ иммобилизации клеток микроорганизмов в присутствии периодата натрия и N,N'-^1-фенилендиаспаримида. который псзво'" получить безносительный биокатализатор с высокой актиЕностыо и стг;.\;г»нсстыо1 Метод особенно ценен при иммобилизации экстремофильных микроорганизмов и для получения мультиферментных биокатализаторов.

4. На основе сравнительного изучения гомогенных внутриклеточных !.-аспартат-оммиак-лиаз, продуцируемых оригинальными культурами Е агсшЗеа шт ЦМПМ В-2370 и В. эиШ/з шт.ЦМПМ В-2537 выявлены их характерные особенности. Исследовано их поведение в иммобилизованном состоянии и . осуществлен синтез 1_-аспарагинсзой кислоты. Наибольшую эффективность процесс приобретает при применении а иммобилизованных клеток в качестве биокатализатора. Показано, что предварительная обработка клеток периодатом натрия и №Ы'-т-фенилендиасларимидсм намного увеличивает стабильность биокатализатора. За 90 сутск непрерывней работы иммобилизованные клетки теряет всего 5-7% изначальной активности. Чтобы обеспечить, высокую эффективность процесса в конце реакции, нзобходимо снизить температуру и скорость протока и. по возможности, повысить начальную концентрацию субстрата. ЬАсларагинсзЕЯ кислота получается без примесей побочных продуктов с выходом 95-97% от потребленного румарата.

5. На сснсае изучения и применения основных принципов получения мупьтиферментных биекатализатороз разработан одностадийный метод и изуче! процесс получения ¡.-аланина из фумарата аммония с помощь» иммобилизованных клеток и хорошо изученных внутриклеточных Ферментов культур бактерий с. агв/сЪа шт.ЦМПМ В-2370 и Рзеис^отапаз зр шт.ИНМИА-1455 - прод>центсв Ьаслартат-аммиак-лиазы и Ьаспартат-р-декарбоксилазы, соответственно. При этом, установлена интенсификация процесса по сравнению с

нативнымии и раздельно иммобилизованными клетками или ферментами. Показано, что на эффективность процесса влияют рН субстрата, температура реакции, удельная скорость фумарата и соотношение клеток иммобилизованных культур бактрий. Иммобилизованные клетки не обладают апанинрацемазной и фумаразной активностями и после трехмесячной непрерывной работы практически не теряют своей исходной активности.

6. Исходя из основных характеристик очищеной и охарактеризованной внутриклеточная фумарат-гидратаза, продуцируемая ВгепЬасХегшт Бр шт.ИНМИА-783 выявлены особенности получения !_-яблочной кислоты с помощью высокоэффективных биокатализаторов на основе клеток и ферментов Выход продукта составляет 80-85% от использованного фумарата. В период до 25 суток происходит "активация" иммобилизованных клеток, а через 43 суток они обладают в 2-3 раза выше исходной активности испытанных клеток.

7. Специфические свойства иммобилизованных клеток с 1_-аспартат-Р-декарбоксилазной активностью, изученные нами, были использованы для одновременного получения р-аспарагиновой кислоты и !--аланина из рацемата аспарагиновой кислоты, 1

8. Выявлены характерные особенности внутриклеточных инулиназ, продуцируемых К. таоаагшв (ЬздШз) шт.ИНМИА-3684, В. ЛсЬеЫ/огтё шт.ИНМИА-1911 и шт.ИНМИА-3004. Установлено, что они относятся к ферментам с экзо-типом действия, а место каталитического расщепления субстратов расположено между подцентрами 1 и 2. Выявлены особенности и оптимальные условия ферментативно-микробиологичеркого гидролиза инулинсодержащего сырья с помощью иммобилизованных ферментов и клеток. При этом, реакция не ограничена диффузией и можно применять большие концентрации инулина и высокие скорости прохождения субстрата через биореактор.

9. Проведено сравнительное изучение цикломальтодекстрин глюканотрансфераз различных групп микроорганизмов. Дачный фермент впервы( идентифицирован среди галофильных бацилл и'термоактикомицетов, что очень важно в филогенетическом плане, так как является дополнительным подтверждением родства термофильных эктиномицетов с родом ВааНиа

Выявлен механизм действия цикломальтодекстрин глоканотранссераз. Установлено, что их активный центр состоит из дЕух отдельных участков, один и: которых строго специфичен к а-1.4-сзязанным мальтоолигосахаридам (донорный центр), а второй - менее специфичен и может взаимодействовать с чевосстаназливиошим концом концевого тикозного остатка и некоторыми другими сахаоами (акцепторный центр). Однако для циклизации необходимо, чтобы субстрат связывался с двумя участками одновременно, в противном случае может протекать лишь реакция межмолакулярного

грансгликозилирования. Самым маленьким прямым субстратом для образования ¿иклодекстриноз является мальтооктаоза. так как в специфической части 1КТИВНОГО центра существуют только семь каталитических участков, каждый из .отсдых способен связывать лишь одну глюкозную единицу. Исходя из

выявленного механизма предложен механизм взаимопревращения различных циклоденкстринов под действием циклсмапьтодекстрин гляканотрансфераз.

10. Исследованы и разработаны эффективные процессы получения а-, р- и -/-циклсдекстриноз из крахмала и рисовых отрубей с помощью иммобилизованных и интактных цикломапьтодекстрин гляканотрансфераз в проточных и периодических условиях, а также с применением ультрафильграционных мембран. При этом, выявлены некоторые макроциклические соединения, образующие специфические комплексы с у-цихлодекстринсм.

11. Изучены свойства межмолекулярного трансгликозилирования различных цикломальтодексрии глоканотрансфераз и установлено, что из смеси сахарозы с крахмалом или циклодекстрином под действием изученных ферментов образуются различные фруктозо-концгаые олигссахариды - глокозилсахароза. мапьтстриозил-, мапьтотетраозил- и мальтспентаозилфруктоза.

12. Выявлены кинетические закономерности получения L-теанина с использованием иммобилизованной теанинсинтетазы и клеток Р. nitroreducens Ir О 12694 с глутамияазной активиостьо.

13. Изучены трансгликозилируюи. .. Л:-гва р-фруктсфуранозидазы РепЫ/ит pafítasis шт. ИН.МИА-Т1. Данный фермент из сахарозы продуцировал 1-к.естозу, нисгозу и фруктозилнистозу в качестве основных продуктов. Выявлены особенности получения лактосзхарозы из смеси лактозы и сахарозы.

14. 'Исследовано трансфзрэзное действие р-галактоэидазы, которая из высококонцентрированных растворов лактозы продуцировала различные

глюкозоконцевые галарчтоолигосахариды, структуры которых полностью расшифрованы.

15. Сравнительное изучение и применение ферментов из различных групп микроорганизмов показало несомненное преимущество использования зкстремсфияьчых. в честности термофильных форм. Выявлены определенные спшифичсгслиз отличия активности одних и тех же ферментов из экстеремофипьных и других форм бяцилл. •

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 На основании полученных результатов разработаны технолог ические регламенты и норматианс-техническая документация на производство L-аслзраги.-сасй кюлоты, L-аланима, L-яблочной кислоты, «рруктозо-глюкозногс сиропа. а также опытно-промышленные регламенты на посизводство р-циклоаглстрина и лзктознсго подсластителя, которые переданы организация!"-Гссагрспрсма Армении, Мннхимг.рома и Минмедпрома севшего СССР для прг^-ичесхой реализации.

2. Опытно-промышленные партии р-циклодекстрина получены на базе Ладыл^.гсхсго П50 "Энзим" и ©армкомитетом Украины разрешено его

использование в качестве вспомогательного вещьттза для производства стабилизированных лекарственных форм. Разработанная технология звкомендуется для реализации на база предприятий биотехнологической и рзриацевтической промышленности.

3. Для выделения и очистки в лабораторных и промышленных условиях юэпаратоз миксобных еерм?нтоз (аспартаза. аспартат-Р-декарбоксилаза, <нупиназа. ¡румараза и ЦГТаза) рекомендуется сравнительно простые методы с ¡спользрванием биоспецифичгских сорбентоз.

4. Разработанные методы иммобилизации клгток и ферментов микроорганизмов рекомендуется использовать при получении биокатализатороз : высокой активностью и жизнеспособностью. ^

5. Разработанные методы получения фруктозо-концввых олигосахаридоз и алактоолигосахаоидов рекомендуатся использовать для получения'диетических одсластителей - заменителей сахара, в то числе при переработке молочной ыворотки.

6. Для производственной реализации разработанных технологий и методов редлагаются оригинальные штаммы экстремофильных форм микроорганизмов з коллекции культур Республиканского' Центра депонирования микро15оп рмении.

Qc-чпвняе раду/пьтаты работы изпожеиы в следующих

■публикациях Монографии

1. Абелян В.А. Получение и применение иммобилизованных ферментов и клеток микроорганизмов. Ереван, Изд-во АН Армении. 1989. 39tc.

2. Абелян В.А. Циклодекстрины : получение и применение. 1995. 700с. машинопись.

Научные статьи

3. Блинов Н.П., Абелян В.А., Кусгтова Н.В. Внеклеточные полисахариды, образуемые некоторыми видами криптококков// Микология и фитопатология. 1931 Т.15. N 5. С.394-398.

4. Блинов Н.П., Витовская Г.А., Ананьева Е.П., Абелян В.А., Киселева С.М. Биосинтез гетерополисахаридов некоторыми видами криптококков// .Прикл.биохим. и микробиол. 1932. Т.13, В.5. С.636-640.

5. Абелян В.А. Исследование полигс"*аоидоа некоторых видов Oypto'ooccu'dl Аот.канд.дис.. П., 1982. 24с. .

6. Балаян A.M., Абелян В.А., Маркосян Л.С. Ферментативный гидролиз крахмала с использованием термрофильной бациллы//Биолог.ж.Армении. 1988. Т.41. N 2. C.10S-113.

7. Абелян В.А.. Меликсетян B.C. Ферментатизно-микробиологическое получение L-аспарагиновой кислоты. 1. Аспартазная активность интактных клаток бактерий// Биолог.ж.Армении. 1988. Т.41. N 2. С. 163.

8. Абелян В.А., Меликсетян B.C. Ферментативно-микробислогическое получение L-аспарагиноеой кислоты. 2. Выделение и характеристика внутриклеточной аспартазы Erw'nia arcidsäl Биолог.ж.Армении. 1988. Т.41. N 2. С. 164.

9. Абе лян З.А., Мхитарян A.B., Антонян А.П. Характеристика внутриклеточной L-аспзртат-бета декарбоксилазы//5ислог.ж.Армении. 1988. Т.41. N 12. С.1015. Деп. во ВИНИТИ 8292-BS8 от 24.iX.1988.

10. Абелян В.А., Мхитарян A.B. Иммобилизация и характеристика L-аспартат-бета-декарбоксилазы//Биолог.ж.Армении. 1988. Т.41. N 12. С.1016 Деп во ВИНИТИ 8295-В68 от 24.iX.1988.

11. Абелян В.А.. Меликсетян B.C., Багдасарян С.Н., Мхитарян A.B. Характеристика интактных клеток бактерий-продуцентов L-аспартат-бета-декарбоксилазы//Биолог.ж.Армении. 1988. Т.41. N 12. С.1016-1017. Деп во ВИНИТИ 8294-В88 от 24. ¡Х.1983.

12. Абелян В.А.. Меликсетян B.C. Ферментативно-микробиологическое получение L-аспарагиновой кислоты. 3. Иммобилизация аспартазы и

арактеристика полученного биокатализатора// Биолог.ж.Армении. 1S89 Т42 N2 :.75. Деп. во ВИНИТИ 8292-BS8 от 24. II. 1933.

13. Абелян В.А., Мсликсятя.ч B.C. Ферментативно-микробисгхгическое ■ □пучение L-аспарагиновой кислоты. 4. Характеристика иммобилизованных клеток икроорганиэмов'- продуцентов аспгртааы// Биолог.ж.Армении. 1983. Т 42 N 2 .76. Деп. во ВИНИТИ 3293-В88 от 24.11.1983.

14. Абелян В.А., Андргасян H.A.. Антонин А.Г1. Получение L-яблочной кислоты помощью иммобилизованных клеток Brvx-ibactcrium sp //Биотехнология 199 Г N С.47-50.

15. Абелян В.А., Антонян А.П. Исследование процесса получения L-:парагинозой кислоты с помощьи иммобилизованных клеток £n\inia aroidcäi ^технология. 1S91. N 5. С.69-71.

16. Абелян S.A., Багдасарян С.Н., Асрикян Э.Г. Внутриклеточная L-аспартат-та-де-карбоксилеза Pseudomonas sp и -A'caJigsnes spM ее иммобилизация// юхимия. 1991. T.5S. N 7. C.1288-12S5. Ibidem Biochemistry-USSR. 1931. V56. N7 S99-905.

17. Абелян В.А.. Гаспарян A.B.. Авакян З.Г., Африкян Э.Г. Внеклеточная клодекстрин гликозилтрансфераэа из термофильной бактерий Sacüfus ?//Биохимия. 1S91. T.5S. N9. С.1578-1532. /üJdsm Biochemictry-USSR. 1S91. V 56.

1. Р.11С8-1112.

18. Абелян В.А., Дихтяерез С.И., Африкян Э.Г. О некоторых нозых свойствах рмсфильной циклодекстрин гликоэилтрансэерогы ВзЫ/usspU Биохимия. 1391 56. N5. С.1583-1590. !b:dcm Biochemistry-USSR. 1991. V.56. Ы9. Р.1112-1117.

19. Манукян Л.С.. Абелян В.А.. Выделение, очистка и характеристика /триклетечных инупиназ//Биолог.ж.Армении. 1992. Т.45. N2. С. 172.

20. Абелян В.А., Манукян П.С. Иммобилизация микробной инулиназы на 5личкых носителях// Прикл. биохим. и микробиол. 19S2. Т.28. N 3. C.35G-361.

21. Абелян В.А., Авакян З.Г., Мелкумян А.Г., Балаян A.M.. Узунян Л.В.. гтасян A.B. Сравнительная характеристика циклодекстрин гликозилтрансферлэ ¡личных групп микроорганизмов// Биохимия. 1992. Т.57. N 3. С.430-437. fbrdenn chemistry-USSR. 1992. V.57. N3. р.2. Р.285-292.

22. Абелян З.А., Балаян A.M.. Аоакян З.Г., Манукян Л.С., Узунян Л.В. ■«молекулярное трансгликозилировакие различных циклодекстрин козилтранофераз// Биохимия. 1592.Т.57. N 3. С.438-443. ib-dem Biochemistry-3R. 1SS2. V.57. N3. р.2. P.292-2S7.

23. Абелян В. А.. Азрикин Э.Г. Иммобилизация циклодекстрин козилтрансоеразы и характеристика полученного биокатализатора// Прикл. хим. и микробиол. 1932. Т.23'. N2. С.205-210.

24. Гаспарян A.B.. Абелян В.А.. Аорикян Э.Г. Характеристика бета-амилазы из y//ysро/)'ОТ/аз//Бисхимия. 13S2.T.57. N S. С.855-661. ibidem Biochemistry-USSR.

2. V.57.'N6. р.2. Р.5е0-5&4.

25. Abelian V.H., Shamtsian M.M., Chu D.-J., Kim M;, Yamamoto T. Production of cydodextrins along with rice protein concentrate and sugar syrup from white rice bran// Chemistry Express (Tokyo). 1993.V.8. N6. P.365-368.

26. Abeiian V.H., Okubo Т.. Shamtsian M.M., Mutoh K.. Chu D.-J., Kim M., Yamamoto T. A novel mrthod of production of theanine by immobilized Pseudomonas nitroreducsnscsWsll Biosd.Biotech.Biochem. 1993. V.57. N3. P.481-483.

27. Абелян B.A.. Ямамото Т., Африкян Э.Г. Выделение и характеристика цикломальтодекстрин глоканотрзнсфераз с использованием-полимеров циклодекстринов и их производных// Биохимия. 1994. Т.59. N 6. С.778-787. Ibidem Biochemistry (Moscow). 1994. V.59. N6. Р.573-579.

28. Абелян В.А., Ямамото Т.. Африкян Э.Г. О механизме действия цикломальтодекстрин глоканотрансфераз алкалофильных. термофильных и мезофильных микроорганизмов//Биохимия. 1994. Т.59. N8. С.1122-1129. Ibidem Biochemistry (Moscow). 1994. V.59. N8. P.839-844.

29. Абелян В.А., Андреасян H.A. Выделение и иммобилизация е,-;утпимуз точной фумаразы из Brevibacienum spll Прикл. биохим. и микробирол. 1332. Т.23, N4. С.525-530.

30. Абелян В.А., Яамамото Т., Атрикян Э.Г. Использование циклодекстринов и их полимерных производных для декофеинизации растворов.// Биотехнология. 1S94. N2. С.29-32.

31. Арслян В.А., Ямамото Т.. Окубо Т., Африкян Э.Г. Получение L-теанина с использованием иммобилизованных клеток Pseudomonas nitroreducend! Прикл. биохим. и микробиол. 1955. Т.31. N 3. С.323-329.

32. Дихтярев С.И., Абелян В.А. Застосувания ферментив для перетворения г.олисахаридив// Фармацевтичный журнал (Украина). 1992. N4. С.25-30.

33. Шамцян М.М., Абелян В.А., Яковлев В.И. Кинетика аспартазной ■ аг,тиености иммобилизованных клеток культуры термофильного

б 1илла'/5иолог.ж.Армении. 1991. Т.44. N3. С.245.

34. Абелян В.А., Адамян М.О., Абелян Л.А., Балаян A.M., Африкян Э.Г. Новая u-'.лломгльтодекстрин глоканотрансфераза из галофильного бацилла// Биохимия 13S5. Т.60. N6. С.891-897.

35. Абелян S.A.. Адамян М.О., Абелян П.А. Модель действия цикломальтодекстрин глюканотрансферазы галофильного бацилла// Биохимия 5595 Т.50. N6. С.898-904.

36 Абелян В.А., Чу Д.-С., Ямамото Т. Получение циклодекстринов из рисовых отрубей// Прикл. биохим. и микробиол. 1995. Т.31. N4. С.453-457

37. Аб елян В.А., Афян К.Б., Авакян З.Г.. Мелкумян А.Г., Африкян Э.Г. Ц^.-чломальтодекстрин глсканотранарераза из термофильных a.NT инсмицетсв//Биохимия. 1995. Т.60. N10. С.1600-1608.

33 Abelian V.H., Okubo Т.. Mutoh К.. Chu D.-J.. Kim M.. Yamamoto Т. A continuous production method of theanine by immobilized Pseudomonas n.'troreducensceiIs// J.Ferment. Techncl (Japan). 1935. in press.

АРТОГТКИИ Г°мпятрпнгтдя

39. A.c. СССР N1324294. Способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов, обладающих аслартазной и аспартат-бета-декарбоксилазной активностыо//Абелян В.А., Меликсетян B.C., Африкян Э.Г., 10с., 1985 (н/п).

40. A.c. СССР N 1378391. Способ получения L-аланина//Абелян В.А.. Меликсетян B.C.. Айрапетян P.C., Кочикян Т.В., Африкян Э.Г., 12с. 1935 (н/п).

41. A.c. СССР N 1391032. Способ получения иммобилизованных клеток бактерий, обладающих аслартазной и аспартат-бета-декарбоксилазной активностью//Абелян В.А.. Блинов Н.П.. Меликсетян B.C., 6с. 1936 (н/п).

42. A.c. СССР N 1441785. Способ получения L-аспарагиновой кислоты//А6елян В.А.. Антонян А.П., Багдасарян С.Н., Хачатурян A.A., Африкян Э.Г., 6с. 1S35 [н/п)

43. A.c. СССР N.1510363. Способ получения L-аспарагиновой кислоты/.'Абелян

B.А., Мхитарян A.B., Камалян O.A.. 6с. 1937 (н/п).

44. A.c. СССР N 1510359.'Способ иммобилизации клеток микроорганизмов// Абелян В.А., Мхитарян A.B., Абелян Л.А., Мхитарян И.А., 8с. 1987 (н/п).

45. A.c. СССР N 1515694. Питательная среда для культивирования бактерий-продуцентов аслартат-аммиак-лиазы и аслартат-бета-декарбоксилазы// Багдасарян С.Н.. Абелян В.А., Юс. 19S7 (н/п).

46. A.c. СССР N 152274S. Способ получения L-аспаотат-бетг-декарбоксилазы//Абелян В.А., Антонян А.П.. Исраелян Н.С.. 4с. 1987 (н/п).

47. A.c. СССР N 1522747. Способ получения L-аспартат-аммиак-лиазы." Абелян В.А.. Антонян А.П.. Исраелян Н.С., 4с. 1937 (н/п).

48. A.c. СССР 1529727. Способ получения L-аланина// Абелян В.А., Багдасаоен

C.Н.. 6с. 1987 (н/п).

49. A.c. СССР N 1607390. Способ получения микробной инулиназы// Абелян В.А.. Манукян Л.С., Андреасян H.A., 4с. 1938 (н/п). 5.И. N11. 1990. С.70.

50. A.c. СССР N 1607391. Способ получения иммобилизованной микробной инулиназы// Абелян В.А., Манукян Л.С., Айвазян H.A.. Африкян Э.Г., 6с. 1985 (н/п). 5.Й. N11. 1S90. С.70.

51. A.c. СССР N 1609152. Способ получения иммобилизованного бискатализатсра для получения L-яблочной кислоты// Абелян В.А.. Мхитарян A.B., Андреасян H.A.. Африкян Э.Г., 8с.'1988 (н/п). Б.И. N11. 1990. С.71.

52. A.c. СССР N 1683324. Способ получения глюкозо-фруктозного сиропа из экстракта клубней топинамбура// Абелян З.А., Манукян Л.С., Мхитарян А.2.. Ассрикян Э.Г.. 8с. 1991 (н/п).

53. A.c. СССР N 1814313. Штамм бактрий Bac.'/us stsarvthermcphiius-продуцент циклсмальтодекстрин глюкачотрансферазы и способ получения апьза-циклодекстрина//Абелян В.А., Мхитарян A.B., Хачатурян A.A.. Сейранян И.Б.. Аеакян З.Г.. Африкян Э.Г.. 14с. 1992 (н/п).

Котаатизяо^егаологтееская лрггА'дчтлг:!?.

54. Африкян Э.Г.. Абалрн В.А., Антонян А.П., Айрапетян P.C., Мапиксетян B.C.. Багдасарян С.Н.. Хачатурян A.A., Мнацаканян Ф.А. Производство L-аспарагиноасй кислоты методом ферментативно-микрсбиологической трансформации// Технологический регламент.' Абовян. 1936, 67с.

55. Техническое задание. Технические условия и Карта технического уровня на L-аспарагинсвую кислоту./Африкян Э.Г., Абелян В.А./. 1931. 30с.

55. Африкян Э.Г„ Абелян B.Ä., Антонян А.П., Меликсетян B.C., Айрапетян P.C. Производство L-аланина одностадийным биокаталитическим методом// Технологичгский регламент. Абовян. 1936. 64с. .

57. Техническое задание. Технические условия и Карта технического уровня на L-аланин/Африкян Э.Г., Абеляк В.А./. 1991. 37с. .

56. Африкян Э.Г.. Абзлян З.А.// Комплекс н/т документации по программе-"Топинамбур":

- техническое задание на опытное производство фруктозо-глюкезного ospona из инулинсодержащего сырья;

- технические условия на ciipori фруктезо-глюкозный;

- техни.чо-экономичес.чое обоснсаание на создание в Армении опытно-промышленного производства сахаристых продуктов, этанола и других биологически активных аещеста из тшил - -б',.с

- технологические рекомендации дл>: организации производства фруктозо-глюкозного сиропа;

- технологичео.из и эксплуатационные документации генерации культуры-продуцента инулиназы;

- опытно-промышленный регламент на производство фруктозо-глокозного сиропа из топинамбура.

59. Африкян Э.Г., Абелян В.А., Мхитарян A.B.. АаакянЗ.Г., Антонян А.П., 'Андреасян H.A., Мелкумян А.Г., Мхитарян И.А. Производство L-яблочной кислоть. методом фсрментатизио-микробиалргическсй трансформации/' Технологический регламент. Абовян. 1823. 108с.

60. Техническое задание. Технические.условия и Технологические.инструкции на L-яблочную кислоту/Африхян Э.Г., Абелян B.AJ: 1931. 85с.

61. Африкян Э.Г.. Абелян З.А., Айрапетян P.C.. Авакян З.Г. Получение бста-циклодекстрина//Технологический регламент. Ереван-Харьков. 1930. 59с (н/п).

52. Техническое задание, Технические условия и Технологические инструкции на р-цикледекстрим/ АфрикЯн Э.Г.,-Абзлян В.А./. 1991. 75с.

63. Африкян Э.Г., Абелян В.А. Производство подсластителя лактосного из мелочной сыноротки// Технологический регламент. Абозян. 1195. 87с.

64. Техническое задание и Технические условия на опытное производство подсластителя лактозногс/ Африкян Э.Г., Абелян В.А./. 1934. 16с.

65 Африкян Э.Г.. Абелян В.А., Балаян A.M., Дихтяреа С .И. и др. Производстве бетз-циллодалстрина// Опытно-промышленный регламент. Харьков-Падымин-Абсаян, 1993. 103а

65. Абелкн В.А.. Аорикян Э.Г.И Опытно-промышленный регламент на получение этилового спирта пищевого назначения из мелассы и крахмалистого сырья. Абсвян. 1995. 51с.

67. Аррикян З.Г.. Абелян В.А. Техническое задание и Техничнские условия на этиловый спирт пищевого назначения из крахмалистого сырья и мелассы Абовян. 1995. 33с.

ЦЦ-ФЛФЦ<№Р

iJLuijinuhuß <iuuijujl{ji UpbjjuiG

UuiGptuipuiGujlpijG LjLumiuijiqJi hbmu(iUiupuij}iG Gbpnqfibpfi fimiljrmlp i, oquuiiqnp&niGp 4>pqjinmql-.ujiqhu mljmjiij üpiupnipjniGGbpti шлшайшй hunüiiji

PuiGiu[ji piucbp' jiGnpJnjiqmcj ;»ii -I - Ii D-iumquipuiqliGujppm - L-uj[ii)G}iG -1,-»huiGfiG-

L-)uGännuippni - д^пцЬришррОЬр - o|}iqn2ujpujpGbp - piun(jpiugnig}i<Gbji

"bbpljiiijnulu opquiGuiljiuG ü{iiuanipjmGGhp[i l)bGuiui}in}uiupl|rm1p ишиюшшшр i?iiiGiutniipjmn t ¿bnp pbpnuS IjliüuuimtjJiirmjnqjinjjfi b qJimmpjiiiG huipiuljjiq Giiiquji|iimGbp}i Ьшйшр:

Ujq uibtmiljtimjKj uiimnjbj ni^iuqnuiij bG GiuGpLGbpJi pyfwGbpji b M,p.i5b(imht.p|i i5npji[]iqiugijiuö dbbpp, npnüp hGiupuiifiipiupjniG tiG pCiboGmü yiqfminqfiumjbu iu!pn{ii[ ниррЬр iShiuyiiipiniGfibph lUpmmqpmpjniGp ipiiqiSiuljiipiqb| hnupiujjiü иjiujиiиi;иS.;111u.'i I. uuhntiuiqbjid: PGrj прпш' iqpngbuGbph ш p qj ni f: ш 11 b in nt p j ui G uiGhiuGbGumi ui(i 1. Ipumiimii l puu]]iuiin.]>{i[ liuHiptGtipf; cqmuiqnpdiSiijG rjbu^pniil.

U^iuiuinujfipli uu|n:mujljö L hqbi ршрйр uilpnfidmpjmüp L bptjiuptulibgnipiuji'ip dmijuiö Ubiiuiiiljuimuiijiqujmnpf!lip]i hmöiuljuipqbph iSiuiijmtfp, niun!ÖGuju[ipimip b Jipmunii'ip 4>liqfni|nqtiuJU|Uu mlimfiij uuuppbp lijuugnipjmGGbpji ишшдйшП hmtiuip

Uji] pGpiugpnn) mnuieJiG ujGqunS gnijg I: трЦшд p«fis>Gi/pji b фЬрйЬГллйЬр}) i5npfi|jiquigi5iuG hGuipuiqnpmpiniGp lUjGiqiiiifi diuöpLuifijiü рии|1$илшршрйЬр]| ijpui, !i<u[|iu{ip bG uüiipuiiil'.qiuQp, ¿фпЬ^шйр, Cr. huren tu, JiG^ujbu Guib hönijJiGp

äiüjg I. ui]ii]uiö,np gJitüüqbpumpJiGGbpJi Gbjtlnujnipjuiiip LuiljiuGnpliü tih^uUiniri L [mrjfibpfi ¡[uiujuibgnq mGujljnipjniGp:

fj^uitiqu-ici L uhifiluuqtqh üгщЬ.^.hi!gpшjJ'. Gnp ühpaq ш1цф|пй>1тр'ир jünuiippgtiuijii ¡Sfcgngnq, JiG^iqbu Gmb GujGptCbpii poiiyGhph' шпшОд IjjtnqGbpli :)inuiqnpdüiuöp }iGnp]i[Jiquig^mG bquiGml}. npp hGuipuujnpnipjniG f. pü«'bnünn5 шпшииц штрЬйпЭДц ¿bhpji piuqi5u!3>bpi5bGmu]jliG !;bGuiu!juimiuifiquJirmiiGtip:

Puigtuliiupnilbl bG L- b D-uiiiupumtiqtiüujpp»Jji, b-U)|i:it;p(i}i, I.-}iifiünpiijppi[ji, 1 -jiijiijiG}:, р-()]|1лШ)Ьртпр1Шр bquniljnq-^pniljinnqmjliG oiuiniuf;>; }>bpi5bGm!m:i}iij

- 6G -

mr.uvjáuiü mamü<!iQuihuimliiupj[H(iübpp' jnipuihiumruli tfmCipUibp{i pyjwíibpfi b .^jpiHiiimOtiph jii5npJntiqujgi|iuft(ibbp)i oquiuiqnpdiíiutfp:

^mj<¡ L трЦшд, np Jifi¿ujbu шцшиЬр tfuiQpiXibpp, lujfitqbu Li ]>hpiiiiiul{in{iGm1|i9buiGbpp Ipupnrj hQ ЬшО^ишйш^д^цпйицрпцЬршл^фб <)1.|Г||1{шГшшршПифЬршц фЬрйийш!) lupiniuqpfyûbp: Spijuid I ищ 4>bpúbliuili Imiübi'miiniijlpiili píimpmqfipp muippbp tpuuipbiín^Jn iStuüpUibpfi hunluip, umiuyjiíi uiCjqiuiî puiymhuijinijuiù bli üpui liqn4>bpiSb(imQbpp b uimupuipljijujö t. uiqqütuíi ü!i|uuiíi{iqi5fi iSnrjbip:

I UimiiSiiuiuJipiJiuiJ U gnijcj L трфий a- ti y- qjilnni]bpiimp|iüübp|i (¡ujiumujljujjtiíi umuiijiíuiíi hljmpunJnpnipjmfiQ пцшршЭДрлршд^мП iíbi5ppuiíiúbpt> l> тшррЬр rîujljpng|il||iiJj[i(j puójijübpji oqmtuqnpdiîuiiSp:

и^шЦфид bQ l[nip(uu?ií(ifuti]i 3>bpi5bf]inujm¡nj фршп^шЦйшй (j}miuJ-i5bpriqujlp.uü rfmnbgniri(¡Lp[i<)ii)iuiL{inno|]iqn¿ui¡>ujpiuj|iú ¡>uiqgpuJ(jruy|i¿Ji uuiiuyiiuiCi tiiquiumiipul, fi1;ii|bu (hub muiutfûiuujipijuiô t тшррЬр 4>[uultuinqnij ijbpguiçjiiii дцгпЦшййЬр}) Ь ■¡«iiiiljmnoitiqniiDpuipíibpJi ujifipbqp' gfilj|iirtujipni(bpumpJiíi qijnilpiiímuipuií¡u.'t>bpu¡q b (i-^¡uulpiin5>mpiuGiiqiuj>uq ^púbúmübpfi oqûnipiuiûp:

ПпшиНшифрфнд bíi finp ртгщршутд!^}!' puliinn2uipu)p{i ишшдйшП гшфилрр uiu¡)iii¡iiiq|i b iiuljuiiiqfi luuu>fiiiipn]iy' JiGijUpuiuiq 4>bpübüm}] oqfinipjmúp:

l!';:ii!jijuiíi bû iufihpiuclb?in mti}i¡(minqtiuil[iuti фшшлшр^рЬрр фрпЬ{щш[ u¡m>i¡tiiihlip¡i hunluip Ь трфид bü hmüunijuimiuujuuiG ^qúujlibpu]mpjniüübpJiCi újnuíirj qnpiiGiuliiufi JipiugiSuiG huiúuip:

l!miiigijiuíí bG p-g[iliiniibj>uwp{iûli qnpdujpuifiuijjhü (iúni2Übp b ""UjniiiqnpíHulpiili 'liitîjiinbjî pruj|ini}mpiniGp йрш oqmiuqnpÔiSmû hiudtup цЬгриО^трЦф Ipnqtimppuli i5by:

Псггксено к печати ?.IL95r. Jopt/зг 3yw. 50x64 1/Г5 3,8 v..т..

?s-A.z:-2 ~7.zsx ?"_

Гггггрг-^зд Apw.CXA ря.Тврзнз 74

Информация о работе

Абелян, Варужан Амаякович
доктора биологических наук
Абовян, 1995
ВАК 03.00.23

Автореферат

Разработка и применение перспективных методов микробиологического катализа для получения физиологически активных соединений - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы