Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологический синтез никотинамидадениндинуклеотида и 2-С-метил-D-эритритол-2,4-циклодифосфата коринеподобными бактериями

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Микробиологический синтез никотинамидадениндинуклеотида и 2-С-метил-D-эритритол-2,4-циклодифосфата коринеподобными бактериями"

САНДАНОВ АЛЕКСАНДР АНДРЕЕВИЧ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДА И2-С-МЕТИЛ-ОЭРИТРИТОЛ-2,4-ЦИКЛОДИФОСФАТА КОРИНЕПОДОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 АВГ 2011

Улан-Удэ-2011

4852292

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный технологический университет» (ВСГТУ)

Научный руководитель: —Доктор биологических наук, профессор

Цыренов Владимир Жигжитович

Официальные оппоненты: — доктор биологических наук, профессор

Саловарова Валентина Петровна

Защита диссертации состоится «23» сентября 2011 г. в 12 часов 00 минут на заседании Диссертационного совета ДМ 212.039.02 при ГОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный технологический университет» по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская 40 в

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «ВосточноСибирский государственный технологический университет»; с авторефератом - на сайте www.esstu.ru.

Автореферат разослан « 23 » августа 2011 г.

Ученый секретарь д-р техн. наук, проф. Н.И. Хамнаева

— кандидат биологических наук, старший научный сотрудник. Матафонова Галина Григорьевна

Ведущая организация:

— ГОУ ВПО «Иркутский государственный технический университет»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в России модернизация промышленности и науки является актуальной проблемой, в решении которой первостепенное значение отводится биотехнологии.

Одной из важнейших задач модернизации является совершенствование технологии получения биологически активных веществ.

Никотинамидадениннуклеотид (НАД), метилэритритолциклопиро-фосфат (МЭЦ) являются ценнейшими лекарственными препаратами, субстанциями для фармакологической промышленности и реактивами для химических производств и научных исследований.

НАД является одним из основных метаболитов клетки, применяется в медицине как лекарство-иммуномодулятор, при лечении и профилактике болезней - как реактив и компонент диагностикумов. МЭЦ может быть использован в качестве предшественника при получении новых антибиотиков, лечения различных заболеваний. МЭЦ также может использоваться для оживления дормантных клеток в случае их применения в качестве продуцента в биотехнологии.

В настоящее время производство НАД и МЭЦ в России отсутствует. Применяемые за рубежом методы получения НАД и МЭЦ (методы экстракции из биомассы) имеют низкий выход целевого продукта, высокую стоимость, например стоимость МЭЦ составляет 400 $ за 1 мг. Наиболее перспективным методом их получения является микробиологический синтез. Необходимо отметить, что практическое исполнение микробиологического синтеза НАД и МЭЦ имеет очевидные трудности, связанные главным образом, с недостатком и несовершенством предложенных штаммов-продуцентов НАД и методов его получения.

Цель работы - исследование и поиск биологических объектов для микробиологического синтеза НАД и МЭЦ.

Достижение поставленной цели требовало решения следующих задач-

1. Исследовать в качестве биологических объектов для микробиологически го синтеза НАД и МЭЦ различные штаммы коринеподобных бактерий и отобрать наиболее приемлемые для биотехнологии организмы.

2. Оптимизировать для микробиологического синтеза НАД состав питательной среды.

3. Осуществить химическую очистку и выделение НАД из культуральной жидкости коринеподобных бактерий.

4. Выделить МЭЦ из клеток штамма-продуцента и исследовать способность МЭЦ к реактивации дормантных форм бактерий.

Научная новизна: Изучена биосинтетическая активность коринепо-добных бактерий, отобраны штаммы-продуценты Coiynebacterium атто-niagenes ВСТИ 404 и Coiynebacterium flavum ВСТИ 301, обладающие высокой активностью синтезировать, соответственно, никотинамидаденин-динуклеотид, 2-С-метил-0-эритритол-2,4-диклодифосфат.

Исследован химический состав НАД - содержащей культуральной жидкости С. Ammoniagenes ВСТИ 404, и разработана технологическая схема выделения и химической очистки НАД.

Исследованы закономерности «оживления» дормантных клеток, обнаружено участие МЭЦ в переходе дормантных клеток из состояния «некультивируемости» в состояние активного роста, что говорит о новой функции МЭЦ.

Практическая значимость: Разработаны технологический регламент микробиологического синтеза НАД с использованием С. ammoniagenes ВСТИ 404 и технологическая схема микробиологического синтеза МЭЦ — с использованием С. flavum ВСТИ 301 и оптимизированных ферментационных сред. Впервые предложена технологическая схема, сочетающая в себе биосинтезы НАД и МЭЦ в одном цикле производства.

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на: V и VI Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011 гг.); международных конференциях «Системная биология» (Филиал института биоорганической химии им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина., г. Пущино, май 2009 г.), "Качество как условие повышения конкурентоспособности и путь к устойчивому развитию" (ВСГТУ,'июль 2009 г.), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология в целях экономики и экологии Сибири и Дальнего Востока» (Сентябрь 2010).

Публикации: 15 наименований, в том числе 3 в реферируемых изданиях из списка рекомендованных ВАК и 2 - в зарубежных изданиях.

Работа поддержана грантами «Молодые ученые республики Бурятия "Оптимизация процесса получения НАД" (2008)», «INTAS 03-51-4077 "Inhibitors of the nonmevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis for the treatment of bacterial infections" (2004-2006)»

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

В обзоре литературы приведены сведения о никотинамидаденинди-нуклеотиде (НАД) и 2-С-метил-0-эРитритол-2,4-циклодифосфате (МЭИ)

(структуре, функциях, прикладных аспектах). Приводятся характеристики метаболических путей образования НАД и МЭЦ, описываются различные способы их получения. ин2

он он

о

II

•Р—о-о-

он он

Рисунок 1. Молекула НАД

ОН

Рисунок 2. Молекула МЭЦ 5

2. Экспериментальная часть 2.1. Материалы и методы

Объектом исследования явились музейные штаммы коринеподобных бактерий, а также штаммы-продуценты нуклеотидов, ранее выделенные на

кафедре «Биотехнология» ВСГТУ.

Для исследования НАД-синтезирующей способности бактерии использовали методы, разработанные S. Kinoshita и соавт. (Nara et al. 1969; Ли ling et al. 2005). Посевная среда: глюкоза 2%, пептон 1%, дрожжевой экстракт 1%, NaCl 0,25%. Ферментационная среда: глюкоза 10%, КН2Р04 1%, К2НР041%, MgS04-7H20 1%, мочевины 0,6%, биотин (ЗОмкг/л).

' Ферментацию НАД проводили на круговой качалке в колбах Эрлен-мейера. Процедура культивирования штамма-продуцента состояла из двух стадий: накопления биомассы и ферментации с предшественниками (аде-нин, никотинамид) и детергентом. Выделение, очистку НАД из культу-ральной жидкости осуществляли с помощью методов ультрафильтрации, ИОХ, осаждения.

Биомассу определяли турбидиметрическим методом. Осуществляли микроскопическое исследование клеточного материала, измеряли рН. Идентификацию и количественное определение НАД и нуклеотидов осуществляли методом хроматографии (бумажной, ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1100, пр-во США), спектрофотометрическим анализом, методом с с алкогольдегидрогеназой (Abbouni et al. 2005).

Способность коринеподобных бактерий продуцировать МЭЦ исследована с помощью методов, разработанных Д.Н. Островским (Щипанова и др 1992 Лысак и др., 1995). Микроорганизмы культивировали при 30° С на качалках в среде, содержащей 1% пептона, 0,3% дрожжевого экстракта и 0,5% NaCl до конца логарифмической фазы роста, вводили редокс-медиаторы - растворы бензилвиологена, параквата. Биомасса бактерий очищалась центрифугированием и подвергалась экстракции этанолом. Экстракт отделяли центрифугированием и перерастворяли в воде с содержанием D20 не менее 20%. Этот раствор использовали для регистрации 31Р-ЯМР на спектрометре фирмы Bruker (США). МЭЦ определяли в лио-филизированном препарате, полученном из этанольного экстракта биомассы бактерий регистрацией 3|Р-ЯМР (спектрометр фирмы BRUKER

АМХ-400, США).

Для выделения и химической очистки МЭЦ клетки бактерии выращивали в присутствии радиоактивного фосфата (10 Мбк на 1 мг) либо С гидролизата белка 0,2 Мбк на 1 мл. Этанольный экстракт клеток наносили

на колонку Дауэкс 1x4 ("Serva"), проводя затем элюцию в системах фор-миата аммония.

Выделения МЭЦ в препаративных количествах проводили из биомассы С. ammoniagenes АТСС 6872, и C.flavum ВСТИ 301. Клетки выращивали на среде Himedia, с последующим внесением в колбы бензилвиологена и глюкозы. Применяли хроматографию на анионите Dowex 1x4, Sephadex G-10, лиофильную сушку, как это описано (Щипанова и др., 1992)

В опытах по реактивации «некультивируемых» форм Mycobacterium smegmatis mc 155 бактерии выращивали на качалке в колбах, содержащих МПБ и твин-80. Культуру инокулировали в колбу, содержащую модифицированную среду Hartman's-de Bönt, к которой был добавлен бычий сывороточный альбумин. Оценку «некультивируемости» клеток определяли подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ). Для реактивации «некультивируемых» клеток в пластиковые планшеты ("Corning"), содержащие среду Sauton, добавляли разведения клеток. Затем планшеты инкубировали при 37 °С, при подсчете количества реактивировавшихся клеток подсчитывали количество клеток с видимым бактериальным ростом (Гончарен ко и др., 2005).

2.2. Результаты и обсуждение

Исследование способности коринеподобных бактерий к сэлвидж синтезу НАД

В качестве объектов исследования по отбору активного штамма-продуцента НАД использовано 11 культур коринеподобных бактерий Изучение роста бактерий показало, что все отобранные штаммы-продуценты накапливали биомассу в заданных условиях. Характеры кривых роста выбранных штаммов-продуцентов идентичны. Наибольший рост был показан у С. Аттотаёепез ВСТИ 404, а наименьший - у Апкго-ЪаЫег сИгеш 278.

Исследование биосинтеза показало, что накопление НАД лучше всего происходит в присутствии детергентов. Наиболее эффективным оказался цетилпиридиний хлорид в концентрациях 1 - 2 мг/мл. (табл. 1) Результаты ВЭЖХ показали, что в условиях ферментации, когда в культуру микроорганизмов вносятся предшественники - аденин и никотинамид, наблюдается биосинтез НАД (рис. 3).

При использовании в синтезе С. аттопа1аёепе5 (Вгеу&асШ-шт) АТСС 6872, многократно описанного штамма-продуцента нуклеотидов и НАД, а также продуцента нуклеотидов, С. ammoniagenes ВСТИ 404 Наблюдается значительное накопление НАД. Другие микроорганизмы

7

синтезировали небольшие количества НАД (до 0,5 мг/мл), АТФ, а также следовые количества УФ-поглощающих веществ (рис. 3).

Время, мин

Рисунок 3. Хроматография культуральной жидкости С. ammoniagenes ВСТИ 404 через 48 часов после внесения предшественников. Обозначения: 1-АТФ; 2 - АМФ; 3-НАД хроматограф Agilent 1100

Таблица 1 - Динамика накопления НАД в процессе микробиологического синтеза

Микроорганизмы

12ч

Выход НАД, мг/мл

С. ammoniagenes АТСС 6872

О

С. саптота^епез ВСТИ 404

С./ктап ВСТИ 301

С. аттота§епе8 ВСТИ 403

1,38

1,9

К

0,21

0,2

24ч

О

2,04

0,35

А. а/га« 278

С. 246

С. зГа^отз 336

С. Ипет 242

1,56

0,31

0,18

0,05

0,09

0,35

К globerгdus 226

АпИгоБшег зреаез ВСТИ 5

0,4

0,17

0,25

0,25

3,16

0,52

К

0,16

0,64

3,27

0,11

0,17

0,19

0,38

0,1

0,15

0,12

0,31

0,26

48ч

О

2,59

К

2,68

0,76

0,05

0,05

0,43

3,04

0,71

0,67

0,37

0,60

0,20

0,37

0,29

0,25

0,24

0,34

0,2

0,09

0,31

0,19

0,01

0,07

0,4

0,26

0,11

0,22

0,31

0,21

Примечание: О - опыт, ферментация в присутствии детерге^1Г^ контроль, ферментация в отсутствие детергента. Аденин, никотин'амид ЦПХ добавляли по 2 мг/мл. д

В ходе исследования динамики рН было показано, что в процессе ферментации НАД в первые 12 ч происходит увеличение рН с 6 7 до 8 4 у С. апшогшщ^ АТСС 6872 и с 7, до 8,5. у С. аттота&пез ВСТИ 403 После 12 ч культивирования наблюдали стабилизацию рН до 7 в обоих

Т ИСП0ЛЬ30ВаНИИ '^-продуцентов С. Л-

monlagenes А IСС 6872 и С. ammomagenes ВСТИ 404

Установлено, что наибольшей способностью к синтезу НАД обладают штаммы С. аттотаЖ ВСТИ 404 и С аттотаёгпе* ВСТИ 403 Их по ложительным свойством является то, что их способность синтезировать нуклеотиды не лимитируется содержанием Мп++ в среде культивирования

Оптимизация среды культивирования для биосинтеза НАД

На выход целевого продукта (НАД) влияют условия культивирования. В случае синтеза нуклеотидов, в том числе и НАД, большое значение имеет изменение проницаемости клеточных оболочек продуцентов, что достигается применением ПАВ, органических растворителей. Для увеличения проницаемости клеток мы остановились на применении ЦПХ, его оптимальное количество составляет 5-7% от количества биомассы Для того чтобы нарастить биомассу в достаточном количестве (не менее 12 мг/мл), в состав питательной среды включали такие источники биологически активных соединений, как дрожжевой, мясной, кукурузный экстракты или

гидролизаты казеина, БВК, рыбной муки.

Проведены исследования по определению зависимости НАД синтезирующей способности культуры от времени ее предварительного культивирования - выращивания штамма - до внесения предшественников и детергента.

Показано что важными условиями культивирования с целью достижения максимального выхода НАД являются содержание дрожжевого экстракта 1 2 % время культивирования до внесения предшественников 24 ч и время 'культивирования с предшественником 39 ч. Исследовали влияние различных соотношений глюкозы и мочевины при осуществлении процессов ферментации. Показано, что наибольшее накопление биомассы достигается при содержании в питательной среде: глюкозы - 7%; мочевины -О 6% и длительности ферментации 36 часов.

Исследовали влияние различных соотношений фосфатов и солеи магния Наибольшее накопление биомассы достигается при оптимальном соотношении солей в составе питательной среды: калия фосфорнокислого -О 6%- сульфата магния - 0,6%. При высоких концентрациях фосфатов происходит ингибирование роста, которое снимается при повышении концентрации сульфата магния.

Исследовали влияние витаминов, ионов кальция, железа и пептона. Установлено, что в пределах концентрации Са-пантетоната от 5 мг/л до 30 мг/л- тиамина от 0 до 5 мг/мл, биотина от 15 до 60 мкг/л, СаС12-2Н20 от 0 до 0,1%, пептона от 0,2 до 1%, Ре504-7Н20 около 0,01% выход НАД составил 3,3 мг/мл.

Наилучшие результаты дает внесение ЦПХ одновременно с предшественниками: выход НАД при этом увеличивается и достигает 3,5 мг/мл

Для учёта межфакторных взаимодействий провели многофакторную

оптимизацию состава питательной среды.

В качестве активных факторов для оптимизации были выбраны концентрации глюкозы, мочевины, фосфатов, ЦПХ. План ДФЭ 24 построен при реализации

10

процедуры Бокса-Уилсона, при этом Д^ — 1 Каждый опыт плана был поЛ

вторен трижды. Получено линейное уравнение:

у = 300 - 193С! + 1832С2 + 1238С3 + 152744С4

Экспериметальные данные адекватно с уровнем значимости 0,05 представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Параметры плана ДФЭ 24

Уровень Факторы C¡, %

с,- глюкоза С2-мочевина С3 — фосфаты С4 — ЦПХ (мг/мл)

Основной Са 10 0,6 1 .0,01

Интервал варьирования X 1 0,1 0,2 0,002

Верхний С+| 11 0,7 1,2 0,008

Нижний С_! 9 0,9 0,8 0,012

№ Опыта Факторы C¡, % Выход НАД, мкг/мл

С|- глюкоза С2- мочевина С3 —фосфаты с4- ЦПХ

1 9,2 0,55 0,81 0,013 4487

2 8,8 0,525 0,715 0,0145 5153

3 8,4 0,5 0,62 0,016 4347

При проведении третьего шага испытаний было получено снижение выхода продукта по сравнению с предыдущим значением. Поэтому оптимальными были признаны условия проведения опыта 2 и максимальный выход продукта составил 5153 мкг/мл.

Таким образом, для проведения биосинтеза НАД культурой С. атто-rtiagenes ВСТИ 404 рекомендуется среда следующего состава: глюкоза -8,8%, дрожжевой экстракт - 1,2% MgS04-7H20 - 1,4%, К2НР04 - 0,71%, КН2Р04 - 0,71%, биотин - 30 мкг/л, пептон - 0,2%, Са-пантетонат - 10 мг/л, и мочевина-0,5%. И концентрация ЦПХ, необходимая при проведении биосинтеза, составляет 14,5 мкг/мл культуральной жидкости. Накопление НАД достигает на этой среде 5150 мкг/мл к.ж. при доверительной вероятности оценок Р=0,95.

Химический состав НАД-содержащей кулыпуралъной жидкости коринеподобных бактерий и его предварительная очистка

Твердую фазу (биошрот), состоящую из биомассы продуцента и твердой взвеси среды, отделяли центрифугированием. Супернатант культу-ральной жидкости наряду с нуклеозидфосфатами, содержит балластные вещества - компоненты среды и продукты метаболизма (табл. 3.).

Таблица 3 - Характеристика исходного супернатанта культуральной жидкости С. ammoniagenes ВСТИ 404, выращенной на оптимизированной среде____

Удельный вес 1,05

рН 6,7(6,5-6,9)

Содержание сухих веществ, г/л 95,4±3,8

В том числе рибозильных производных, г/л 2,33±0,25

Белковых примесей, г/л 2,92±0,41

НАД, низкомолекулярные компоненты нуклеиновых кислот, г/л 5,9±0,5

Содержание НАД в супернатанте не превышает 0,6%. Была выбрана схема очистки и выделения НАД, состоящая из стадий ультрафильтрации и ионного обмена. На стадии ультрафильтрации были испытаны мембраны УПМ-5, УПМ-10, УПМ-15, УПМ-20. Установлено, что наилучшими показателями обладает мембрана УПМ-10, которая имеет высокую производительность и максимальную интегральную селективность по всем примесям. Провели выбор среди сильных и слабых анионитов и катеонитов. Показано, что максимальной емкостью обладают аниониты АВ17х8, ЭДЭ10П, что коррелирует с наличием фосфорных остатков в молекуле НАД. Также было показано, что максимальная эффективность сорбции достигается при объемном соотношении фильтрат-ионит 1:1.

Ввиду того что НАД не является основным компонентом сорбируемого раствора, для нас было важно установить, как сорбируются на исследуемых ионитах другие компоненты, а также в каком случае достигается максимальная степень очистки НАД.

Исследовали процесс десорбции с использованием различных элюен-

тов.

При выборе элюентов учитывали как ионообменные, так и гидрофобные свойства НАД и других компонентов фильтрата. В качестве элюента исследовали слабые растворы соляной, хлорной кислот, растворы хлористого натра и этилового спирта. Наиболее хорошие результаты по степени

12

десорбции НАД по очистке его от сопутствующих компонентов получены при применении в элюции слабых растворов хлорной и соляной кислот.

Выделение НАД осуществляли по способу, разработанному для выделения нуклеотидов из культуральных жидкостей коринеподобных бактерий (Лмагаева и др., 1978), основанному на использовании ионита АВ-17x8 в анионной форме. Фильтрат наносили на колонку АВ17х8 (200-400 меш) в анионной форме, элюировали НАД 0,05 н. НСЮ4, элюаты нейтрализовали 30% раствором КОН, упаривали на роторном испарителе, отделяли осадок КСЮ4. Осуществляли выделение НАД из водно-спиртовых растворов способом разработанным на кафедре РХТУ им. Д.И. Менделеева (Парижева, 2005). Получили препарат с содержанием НАД 86,4%

Предложена принципиальная технологическая схема микробиологического синтеза, выделения и очистки НАД, включающая следующие стадии: 1) подготовка питательных сред и посевного материала; 2) ферментация (выращивание биомассы и биосинтез); 3) выделение и очистка (ультрафильтрация, ИОХ, осаждение).

Исследование коринеподобных бактерий на способность продуцировать 2-С-метил-В-эритритол-2,4-циклодифосфат (МЭЦ)

Установлено, что у большинства исследованных нами культур при добавлении редокс-медиатора происходит накопление фосфорного соединения с химическим сдвигом в спектре ''Р-ЯМР—М^ м.д. Данное вещество в случае использования М. Шейх и С.аттота^епех АТСС 6872 Островским и сотр. было идентифицировано как МЭЦ (Щипанова и др., 1992).

Для уточнения идентификации -14,8 м.д. соединения у исследуемых нами культур применяли ИОХ с использованием в качестве реперного соединения радиоактивного препарата 32Р-МЭЦ (рис. 4)

Таблица 4 - Содержание МЭЦ в клетках у различных штаммов кори-неподобных бактерий, выращенных в присутствии редокс-медиатора бен-зилвиологена в концентрации 100 мкг/мл

Микроорганизмы Содержание МЭЦ, отнесенное к общему фосфору и к суммарному фосфору нуклеотидполифосфатов и нуклеотидов, в %

р . 1 оош р

С. ammoniagenes АТСС 6872 12,7±1,0 26,8±2,5

С. ammoniagenes ВСТИ 403 11,4±1,0 21,5±2,5

С. fieman ВСТИ 301 14,2±1,5 25,8±2,5

С. ammoniagenes ВСТИ 404 12,9±1,5 23,3±2,5

С. insidioswri 224 3,2±0,3 5,7±0,5

С. stationis 336 3,6±0,3 4,1 ±0,5

С. linenens 242 2,4±0,3 4,8±0,5

N° фракции

- -■- - оптическая плотность при 260 нм.

Рисунок 4. Хроматография экстракта клеток СогупеЬас/егшт Астап ВСТИ 301 в отсутствие бензилвиологена на колонке Эои'ех 1x4 (НСОО-, 1,6x23 см.) в градиенте 0 - 1,7 М формиата аммония, объем фракций 5 мл, скорость элюции 1 мл/мин, температура 20°С.

Хроматографические профили опыта и контроля по показателю содержания УФ-поглощающих веществ (по А260) одинаковы: в том и другом случаях обнаруживаются 3 пика. Фракции этих пиков анализировали методом бумажной хроматографии с последующим анализом УФ-спектров, содержания рибозы и фосфора. Показано, что пики этих веществ являются низкомолекулярными компонентами нуклеиновых кислот.

На основе данных исследований jlP-ilMP спектра, а также данных хроматографии фосфорных соединений и их изотопного спектра и сопоставления с данными из литературы [Островский, 1995], фосфорное соединение, индуцированное бензилвиологеном, нами идентифицировано как 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклодифосфат (МЭЦ). В таблице 4 показано накопление МЭЦ в клетках исследуемых культур. Следует отметить, что накопление МЭЦ является, по-видимому, результатом продукции радикалов 02~ (супер-оксид) между искусственным редокс-медиатором, действие которого сильно зависит от условий культивирования, в том числе от состава субстратов питательных сред. Исследовано влияние различных редокс медиаторов (бензилвиологен, паракват, менадион). Установлено, что наиболее высокая степень индукции синтеза в клетках С. flavum ВСТИ 301 наблюдается в случае использования бензилвиологена в концентрации 75 мкг/мл.

Показано, что добавка глюкозы и маннозы в питательные среды вызывает увеличение эффективности синтеза МЭЦ [Лысак и др., 1995]. В наших опытах испытали эффективность глюкозы и маннозы. Показано, что наиболее эффективной является добавка глюкозы до 1,5 %-ной концентрации.

Микробиологический синтез МЭЦ штаммом С. flavum ВСТИ 301 протекает более интенсивно и с большим выходом, чем у ранее использованного организма С. ammoniagenes 6872. Выход 30,5 мг/г биомассы достаточно высокий и имеет практическое значение.

Проводили оптимизацию состава ферментационной среды. В результате для микробиологического синтеза МЭЦ культурой С. flavum ВСТИ 301 рекомендуется среда следующего состава: 15,0 г глюкозы моногидрата, 1,2 л пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 6 г NaCl на 1 л воды.

Предложена принципиальная технологическая схема для получения МЭЦ, которая состоит из стадии биосинтеза МЭЦ в условиях окислительного стресса, выделения и очистки МЭЦ методом ИОХ. По этой схеме в лаборатории стресса микроорганизмов Института биохимии им. А.Н. Баха получали препараты МЭЦ с использованием штаммов продуцентов С. flavum ВСТИ 301 и С. ammoniagenes АТСС 6872 и использовали их для поиска новых функций этого соединения.

Поиск новых функций МЭЦ. Реактивация «некультивируемых» форм Mycobacterium smegmatis экзогенным МЭЦ

Мы предположили, что МЭЦ может участвовать в реактивации (оживлении) некультивируемых (дормантных) клеток, что имеет большое значение в биотехнологии для регуляции биологической активности про-

16

дуцентов или возбудителей инфекционных болезней. Изучена возможность реактивировать «некультивируемые» клетки М. ьте^айз добавлением экзогенного МЭЦ.

В качестве модели «некультивируемости» мы использовали культуру штамма дикого типа М. зте^паПз, потерявшую способность расти на твердых питательных средах. Добавка в среду для реактивации чистого МЭЦ приводила к зависимому от концентрации МЭЦ восстановлению способности к росту. В случае когда в опыте по реактивации использовалась культура возрастом 65 ч с числом КОЕ = 2 х 103 мл"1 (при общем количестве 109 клеток/мл), МЭЦ в концентрации 10'7 - 10"3 г/мл был способен оказывать реактивирующее действие на некультивируемые клетки М. Бте^аНз (табл. 5)

Таблица 5 - Влияние экзогенного 2-С-метил-Р-эритритол-2,4-циклодифосфата (МЭЦ) на реактивацию «некультивируемых» клеток М. Бте^айз

МЭЦ г/мл КОЕ • мл"1

1(Г 1,44-107

10"4 1,03 -106

10" 3,99-105

1041 1,70-105

ю-' 2,16 -105

108 5,58-104

Известно, что большая часть видов бактерий в природных условиях находится в покоящемся («некультивируемом») состоянии. Поэтому можно предположить, что МЭЦ является одним из регуляторов этого состояния.

На основе данных эксперимента, а также данных из литературы можно предположить, что МЭЦ препятствует переходу микобактерий в состояние некультивируемости («покоящейся клетки») и способствует выходу из него («оживление»), что представляет несомненный интерес для биотехнологии.

Разработка принципиальной технологической схемы биосинтеза НАД и МЭЦ в одном цикле производства

Так как НАД накапливается в культуральной жидкости, а МЭЦ синтезируется внутри клетки, то сделано предположение о технической возможности получения НАД и МЭЦ в одном производственном процессе.

17

Проведен модельный эксперимент в трёх повторностях с целью объединения двух синтезов по получению НАД и МЭЦ в одном цикле производства с использованием продуцента С. ammoniagenes ВСТИ 404.

Получение НАД осуществляли по принципиальной технологической схеме, с использованием оптимизированной среды. Биомассу культуры применяли в качестве посевного материала для осуществления биосинтеза МЭЦ. Из полученной биомассы выделяли и очищали препарат МЭЦ по разработанной технологии.

Выход НАД был высоким (4 мг/мл культуральной жидкости), а выход МЭЦ-удовлетворительным (0,29 мкг/г сырой биомассы), однако меньше, чем при отдельных биосинтезах. Таким образом, получение НАД и МЭЦ в одном цикле производства с применением одного штамма-продуцента является принципиально возможным.

Приготовление посевного материала

подготовка питательной среды

1 стадия ферментации выращивание биомассы

непрерывные перемешивание и аэрария

(Т = 24 ч, ( = 30°С)

аденин никотинамид | детергент

Биомасса

2 стадия ферментации с предшественниками

биосинтез НАД

__(Т = 30 ч, С =ЗСГС)

Центрифугирование (3000 об/мин, Т = 40 мин)

Супернатант

Выделение и очистка НАД

бензилвиологен

— - - -. >

глюкоза

подготовка глюкозы

3 стадия ферментации в условиях окислительного стресса - биосинтез МЭЦ __(Т = 36 ч, Г =30°С) 4

| Биомасса

Центрифугирование (3000 об/мин, Т = 40 мин)

Супернатант

Т|---.

Утилизация

¡Биомасса

Выделение и очистка МЭЦ

Препарат МЭЦ Препарат НАД

Рисунок 5. Принципиальная технологическая схема микробиологического синтеза и получения НАД и МЭЦ в одном цикле производства

Выводы

1. Для осуществления микробиологического синтеза никотинамида-дениндинуклеотида (НАД) методом ферментации отобран штамм-продуцент СогупеЬас(егшт аттота^епез ВСТИ 404, для микробиологического синтеза 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклодифосфата (МЭЦ) -штамм Со/упеЬас/еп'ит /1ауит ВСТИ 301.

2. Методом математического планирования экспериментов установлены оптимальные параметры синтеза НАД с помощью С. ammoniagenes

ч ВСТИ 404:

• ферментационная среда следующего состава: глюкоза - 8,8%, мочевина - 0,5%, К2НР04 - 0,71%, КН2Р04 - 0,71%, дрожжевой экстракт -1,2%, М§Б04-7Н20 - 1,4%, , биотин - 30 мкг/л, пептон - 0,2%, Са-пантетонат - 10 мг/л, и рН 7.0;

• время внесения предшественников и цетилпиридинийхлорида составляет 24 часа от начала ферментации, продолжительность процесса ферментации 39 ч.

3. Изучен химический состав супернатанта культуральной жидкости С. ammomagenes ВСТИ 404, разработан метод химической очистки и выделения НАД.

4. Предложены технологические схемы синтеза НАД и МЭЦ с помощью С. ammoniagenes ВСТИ 404 и С. /1ауит ВСТИ 301, а также технологическая схема синтеза этих соединений с помощью С. ammoniagenes ВСТИ 404 в одном цикле производства.

5. Установлена новая функция МЭЦ, заключающаяся в способности переводить «некультивируемые» (дормантные) клетки в состояние активного роста. Данное свойство МЭЦ может быть использовано для активизации культур микроорганизмов для решения задач биотехнологии и экологии.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Гончареяко A.B., Ершов Ю.В., Салина Е.Г., Виснер И, Вострок-яутоеа Г.Н., Санданов A.A., Капрелъянц A.C., Островский Д. Н. О роли 2-С-метилэритритол-2,4-циклопирофосфата в реактивации "некультивируе-мых" форм Mycobacterium Smcgmatis // Микробиология - М 2007 Т 76 №2. С. 172-178. " ' '

2. Санданов A.A., Цыреное В.Ж., Островский Д.Н. Биосинтез 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклодифосфата коринеподобными бактериями // Вестник ВСГТУ. Улан-Удэ. 2010. № 4,

3. Санданов A.A., Цыреное В.Ж., Островский Д.Н. Биосинтез НАД коринеподобными бактериями // Вестник ВСГТУ. Улан-Удэ. 2010. № 2

Статьи в научных изданиях

1. Tsirenov V.Z., Duiyaninova W.G., Podiepa Е.М., Sandanov A.A. Nicotinate-Phosphoribosiltransferase» properties and regulation // Industrial Application of Biotechnology. New York. Nova Science Publishers Inc - 2006 pp. 123-129.

2. Санданов АЛ., Пинуев И.О., Цыреное В..Ж. Оптимизация процесса биосинтеза НАД // Вестник ВСГТУ. Улан-Удэ. 2008. № 3. С.26-29.

_3. Мазикин КВ., Ершов Ю.В., Санданов A.A., Зимин А.И., Островский Д.Н. Некоторые свойства 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфата (МЭЦ)) - центрального метаболита МЕР-пути биосинтеза изопреноидов у бактерий // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегиональный сборник научных работ -Воронеж, 2009. Вып. U.C. 109-112.

4. Санданов A.A. Качество препарата NAD, полученного микробиологическим путем // Материалы международной научно-практической конференции Качество как условие повышения конкурентноспособности и путь к устойчивому развитию. Улан-Удэ, Изд-во ВСГТУ. 2009. С.294.

5. Санданов A.A., Гончиков Б.Г., Гончаренко A.B., Ершов Ю.В., Носов A.M., Островский Д.Н. Влияние 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклодифосфата на синтез хлорофилла в растениях в присутствии фосфо-мидомицина // Сборник I Всероссийской научно-практической конференции "Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока". Улан-Удэ. 2010. С. 33-34.

6. Санданов A.A., Мазикин К.В., Островский Д.Н. Нитроксильные соединения у бактерий // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегиональный сборник научных работ. -Воронеж, 2008. Вып. 10. С. 124-127.

7. Санданов A.A., Цыренов В.Ж. Роль гликолиза при микробиологическом синтезе нуклеозидфосфатов из предшественников у коринефрм-ных бактерий // Вестник ИГУ серия Экология. Иркутск, 2008. С.56-61.

8. Санданов A.A., Цыренов В.Ж., Островский Д.Н. Микробиологический синтез 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклодифосфата // Сборник материалов I Всероссийской научно-практической конференции "Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока".

Улан-Удэ. 2010. С.34-36.

9. Цыренов В.Ж., Санданов A.A. Технологическая схема получения препаратов нуклеозидфосфатов // Материалы V съезда Общества биотех-нологиов России им Ю.А. Овчинникова: Москва 2-4 декабря 2008 г. / Под ред. Р.Г. Василова. 2008. С.234-235.

10. Цыренов В.Ж., Тулохонова JI.B., Подлепа Е.М., Санданов A.A. О регуляции фосфориллирования в аденилатной ветви salvage синтеза НАД коринеформными бактериями // Вестник ВСГТУ. Улан-Удэ. 2004. №3. -С.54-62.

11 .Tsirenov V.Z., Pinuev I.O., Sandanov A.A. The Role of Glycolysis in Nucleosidemonophosphates Phosphorylation to Nucleosidetriphoshates by Nucleotide Producer-strains of Corynebacterium. in Biotechology in Medicine, Foodstuffs, Biocatalysis, Environment and Biogeotechnology. New York . -Nova Science Publishers, Inc (USA). 2010. p. 57-63

12.Цыренов В.Ж., Санданов A.A., Островский Д.Н., Козин В.А. Микробиологический синтез NAD // VI Московский международный конгресс 21-25 марта 2011 "Биотехнология: состояние и перспективы развития", ч. 1.-М., 2011.С. 382.

Подписано в печать 28.06.2011. Формат 60x84 1/16 Усл. п.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ № 149

Издательство ВСГТУ 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 в.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Санданов, Александр Андреевич

Актуальность темы.

Цель работы:.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Структура и физико-химические свойства и применение НАД.

1.2 Роль НАД в биохимических реакциях в клетке и его применение.

1.3 Пути биосинтеза и распада НАД у микроорганизмов.

1.3.1. De novo синтез НАД.

1.3.2. Salvage синтез НАД.

1.4 Физиологическое и прикладное значения salvage синтеза НАД.

1.5 Методы получения НАД. а) Метод получения никотинамидных коферментов выделением их из животных тканей.

1.5.1. Микробиологические методы получения НАД.

1.5.2. Условия проведения ферментационного процесса получения НАД при использовании штамма-продуцента СогупеЬаіїегіит ammoniagenes АТС С 6872.

1.5.3. Коринеподобные бактерии. Штаммы-продуценты НАД и других нуклеотидов.

1.5.4. Методы выделения и очистки НАД.

1.5.5. Достоинства Salvage синтеза.

1.6 Микробиологический синтез 2-С-метил-0-эрнтритол-2,4-циклодифосфата (МЭЦ).

1.6.1. Химическая структура и функции МЭЦ.

1.6.2. 2-С-метилэритрофосфатный путь (МЭФ-путъ) биосинтеза изопреноидов. Прикладные аспекты.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробиологический синтез никотинамидадениндинуклеотида и 2-С-метил-D-эритритол-2,4-циклодифосфата коринеподобными бактериями"

Актуальность темы. В настоящее время в России модернизация промышленности и науки является актуальной проблемой, в решении которой первостепенное значение отводится биотехнологии.

Одной из важнейших задач модернизации является совершенствование технологии получения биологически активных веществ.

Никотинамидадениннуклеотид (НАД), метилэритритолциклопирофосфат (МЭЦ), являются ценнейшими лекарственными препаратами, субстанциями-для фармакологической промышленности, и реактивами для химических производств и научных исследований.

НАД является одним из основных метаболитов клетки, применяется в медицине как лекарство-иммуномодулятор, при лечении и профилактике болезней, как реактив и компонент диагностикумов. МЭЦ может быть использован в качестве предшественника при получении новых антибиотиков, лечения различных заболеваний. МЭЦ также может использоваться для оживления дормантных клеток в случае их применения в качестве продуцента в биотехнологии.

В настоящее время производство НАД и МЭЦ в> России отсутствует. Применяемые за рубежом методы получения НАД' и МЭЦ (методы экстракции из биомассы) имеют низкий выход целевого продукта, высокую стоимость, например стоимость МЭЦ составляет 400$ за 1 мг. Наиболее перспективным методом их получения является микробиологический синтез. Небходимо отметить, что практическое исполнение микробиологического синтеза НАД и МЭЦ имеет очевидные трудности, связанные, главным образом, с недостатком и несовершенством предложенных штаммов-проуцентов НАД и> методов его получения.

Цель работы: Поиск биологических объектов для микробиологического синтеза НАД и МЭЦ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать в качестве биологических объектов для микробиологического синтеза НАД и МЭЦ различные штаммы коринеподобных бактерий и отобрать наиболее приемлемые для биотехнологии организмы.

2. Оптимизировать для микробиологического синтеза НАД состав питательной среды.

3. Осуществить химическую очистку и выделение НАД из культуральной жидкости коринеподобных бактерий.

4. Выделить МЭЦ из клеток штамма-продуцента и исследовать способность МЭЦ к реактивации дормантных форм бактерий.

Научная новизна: Нроведен поиск штаммов продуцентов из группы коринеподных бактерий, способных к синтезу НАД и МЭЦ. Установлены наиболее перспективные штаммы-продуценты С; ашшопаіа§епез ВСТИ 404, С. Пауит ВСТИ 301. Исследованы закономерности «оживления» дормантных клеток, обнаружено участие МЭЦ в переходе дормантных клеток из состояния «некультивируемости» в состояние активного роста, что говорит о новой функции МЭЦ.

Изучен химический состав супернатанта культуральной жидкости С. аттоша§епез ВСТИ 404, разработан метод химической очистки и выделения НАД.

Практическая значимость: Предложены принципиальные технологические схемы микробиологического синтеза НАД с использованием С. аттопіа§епез ВСТИ 404, МЭЦ - С. йауит ВСТИ 301, и оптимизированных ферментационных сред. Впервые предложена технологическая схема сочетающая в себе биосинтезы НАД и МЭЦ в одном цикле производства.

Результаты полученные в ходе работе над диссертацией будут использоваться при преподавании биотехнологии и микробиологии.

Методом математического планирования экспериментов установлены оптимальные параметры синтеза НАД с помощью С. агштюпіа§епез ВСТИ 404: ферментационная среда следующего состава: глюкоза - 8,8%, мочевина -0,5%, К2НР04 - 0,71%, КН2Р04 - 0,71%, дрожжевой экстракт - 1,2%, MgS04-7H20 -1,4%,, биотин - 30 мкг/л, пептон - 0,2%, Са-пантетонат - 10 мг/л, и рН 7.0; время внесения предшественников и цетилпиридинийхлорида составляет 24 часа от начала ферментации, продолжительность процесса ферментации 39 часов.

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на: пятом международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2009, 2011 г); международных конференциях «Системная биология» (Филиала института биоорганической химии им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина., г. Пугцино, май 2009 г), "Качество как условие повышения конкурентоспособности и путь к устойчивому развитию" (ВСГТУ, июль 2009 г.), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология в целях экономики и экологии Сибири и Дальнего Востока» (Сентябрь 2010).

Публикации: 13 наименований, в том числе 4 в реферируемых изданиях из списка ВАК, 2 зарубежных.

Структура и объем работы: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методик проведения экспериментов и анализов, экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы (144 наименований, в том числе 126 на иностранных языках) и приложений. Работа изложена на 127 стр. машинописного текста и содержит 16 таблиц, и 32 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Санданов, Александр Андреевич

1.9.8. Выводы.

1. Для осуществления ' микробиологического синтеза никотинамидадениндинукпеотида (НАД) методом ферментации отобран штамм продуцент Corynebacterium ammoniagenes ВСТИ 404, для микробиологического синтеза 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклодифосфата (МЭЦ) - штамм Corynebacterium flavum ВСТИ 301.

2. Методом математического планирования экспериментов установлены оптимальные параметры синтеза НАД с помощью С. ammoniagenes ВСТИ 404: ферментационная среда следующего состава: глюкоза - 8,8%, мочевина -0,5%, К2НР04 - 0,71%, КН2Р04 - 0,71%, дрожжевой экстракт - 1,2%, Мё804-7Н20 -1,4%,, биотин — 30 мкг/л, пептон - 0,2%, Са-пантетонат - 10 мг/л, и рН 7.0; время внесения предшественников и цетилпиридинийхлорида составляет 24 часа от начала ферментации, продолжительность процесса ферментации 39 часов.

3. Изучен химический состав супернатанта культуральной жидкости С. ammoniagenes ВСТИ 404, разработан метод химической очистки и выделения НАД.

4. Предложены технологические схемы синтеза НАД и МЭЦ с помощью С. ammoniagenes ВСТИ 404 и С. Ааушп ВСТИ 301, а также технологическая схема синтеза этих соединений с помощью С. ammoшagenes ВСТИ 404 в одном цикле производства.

5. Установлена новая функция МЭЦ, заключающаяся в способности переводить «некультивируемые» (дормантные) клетки в состояние активного роста. Данное свойство МЭЦ может быть использовано для активизации культур микроорганизмов для решения задач биотехнологии и экологии.

Выражаю искреннюю признательность и благодарность главному научному сотруднику Института биохимии им. А.Н. Баха доктору биологических наук, профессору Островскому Дмитрию Николаевичу за большую помощ в освоении методов современной аналитической биохимии и обсуждении результатов исследования.

Александр Санданов.

1.9.7. Заключение

Низкомолекулярные метаболиты микробной клетки являются важнейшими целевыми продуктами современной биотехнологии. К их числу относятся НАД и МЭЦ, которые имеют большие перспективы в качестве лекарств, компонентов диагностикумов и реактивов.

Для получения НАД и МЭЦ предложено несколько методов - химических, бйологических, среди которых наиболее перспективным является метод микробиологического синтеза.

В данной работе для получения НАД использовали микробиологический синтез в котором в качестве основного биологического объекта для проведения этого биосинтеза избраны коринеподобные бактерии, которые являются наиболее универсальными организмами и способны образовывать самые различные нуклеотиды, нуклеотидные коферменты (в том числе НАД), но что особенно важно - синтезируют МЭЦ, ключевой метаболит недавно обнаруженного пути синтеза изопреноидов.

В качестве биологических объектов для разрабатываемой биотехнологии мы использовали наиболее известные штаммы-продуценты нуклеотидов С. ammoniagenes АТСС 6872, и наряду с ним, ранее выделенный из природных источников штаммы — продуценты С. ammoniagenes ВСТИ 403, С. йауит ВСТИ 301, а также отдельные штаммы типовых культур из группы коринеподобных бактерий.

Осуществлены конкурсные испытания этих культур для установления перспективной культуры в качестве штамм-продуцента, обеспечивающего наиболее высокий и стабильный выход НАД и МЭЦ.

Для оптимизации питательной среды, как наиболее важного фактора для увеличения выхода целевого продукта при микробиологическом синтезе различных

БАВ, в том числе нуклеотидов и нуклеотидных коферментов, применили метод математического планирования эксперимента.

Для дальнейших работ нами были отобраны штаммы С. Аттоша§епез ВСТИ 403. Данный организм, как ранее было показано [Цыренов, 1990]. представляет собой марганец не чувствительный штамм-продуцент нуклеозидфосфатов, способный осуществлять биосинтез в водопроводной и дистиллированной воде, без дополнительной ее обработки. Этим свойством он выгодно отличается от С. аттог^^епея АТСС 6872, который осуществляет высокоэффективный биосинтез нуклеотидов и нуклеозидов (в частности инозиновой кислоты) при очень низких концентрациях ионов марганца. Другим преимуществом С. ammoniagenes ВСТИ 403 является более выраженная и стабильная биосинтетическая активность, что было установлено в работах по оптимизации питательных сред.

При оптимизации питательной среды в качестве источников основных питательных веществ и факторов роста испытаны дрожжевой экстракт, гидролизат рыбной муки, гидролизат БВК. Наиболее хорошие результаты в микробиологическом синтезе НАД получены при добавлении дрожжевого экстракта. В состав питательной среды также вносили цетилпиридиний хлорид, который изменяет проницаемость мембран клеток и способствует экскреции метаболитов, и в конечном счете усиливает эффективность биосинтеза. Методом математической оптимизации достигали выхода НАД в культуральной жидкости С. аттог^епез ВСТИ 403 4,8-5,1 мг/мл.

В настоящее время особую актуальность для фармацевтической биотехнологии имеет исследование вопросов, касающихся микробиологического синтеза МЭЦ — ключевого метаболита недавно открытого немевалонатного пути анаболизма изопреноидов и вещества, перспективного для создания антибиотиков нового поколения.

Впервые нами проведен скрининг на продуцирование МЭЦ различными штаммами коринеподобных бактерий. Установлен наиболее перспективный штаммпродуцент - С. flavum ВСТИ 301. Из клеток этого штамма удалось получить препарат МЭЦ в небольших количествах и использовать его в научных работах по поиску новых функций этого соединения. Мы предположили, что МЭЦ участвует в реактивации (оживлении) некультивируемых (дормантных) клеток, что имеет большое значение в микробиологических синтезах для регуляции биологической активности штаммов-продуцентов. В качестве модели мы использовали культуру дормантных клеток Mycobacterium smegmatis . Показано впервые, что добавка в среду для реактивации чистого МЭЦ приводила к восстановлению способности у упомянутого выше организма к росту.

Предложена приниципиальная схема микробиологического синтеза НАД и МЭЦ на основе применения в качестве биообъектов экспериментально отобранных штаммов-продуцентов из группы коринеподобных бактерий. Так же предложена схема биосинтеза НАД и МЭЦ в одном цикле производства, что призвано будет существенно улучшить экономичность процесса микробиологического синтеза, выделения и химической очистки и безотходность производства препаратов указанных метаболитов. (что будет способствовать снижению себестоимосиъ продуктов и образованию меньшего количества отходов и сточных вод в процессе производства)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Санданов, Александр Андреевич, Улан-Удэ

1. Амагаева A.A. Разработка технологических методов получения нуклеозидных и нуклеотидных коферментов: Канд. дисс. М.: 1976.

2. Ангаев С.Б., Соктоев СЛ., Дульянинова Н.Г., Цыренов В.Ж. Потребление глюкозы и синтез нуклеотидных соединений штаммом-продуцентом Corynebacterium amnonlagenes ВСГИ 404 // Известия СО РАН, Сибирский биологический журнал. 1992. - вып. 5. - с. 19-23.

3. Баздырева Н.М., Подлепа Е.М., Тулошноеа Л.В. Синтез никотинамида из экзогенных предшественников. Свойства и регуляция ферментов // Прикл. Биохим. Микробиол. 1994. - 30, 6. - 741-58.

4. Баздырева Н.М, Kyifeea JJ.C. Влияние поверхностно-активного вещества — N-цетилпиридиний-хлорида на биосинтетическую способность Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872, продуцента НАД // Прикл. Биохим. и Микробиол. 1984. - 20,3. - С. 334 - 339.

5. Барышникова И.М., Санданов Ч.М., Монахова Е.В., Головлев Е.А. Дифференциация родов коринеподобных бактерий, синтезирующих аминокислоты и нуклеотиды // Микробиология. 1982. - т. 51, Вып. I. - с. 125129:

6. Безбородое A.M. Биохимические основы микробиологического синтеза Для вузов по спец. "Технология микробиол. пр-в". М.: Лег. и пищ. пром-сть, 1984.-304 с.

7. Бекер М.Е. Введение в биотехнологию Рига: Звайгоне, 1978.

8. Бутуханов В.Д., Бобык М.А., Цыренов В.Ж., Кулаев PI. С. Изучение возможной роли высокомолекулярных полифосфатов в синтезе АТР из экзогенного аденина культурой Corynebacterium species, штамм ВСТИ 301 // Биохимия. -1979. Т. 44, вып. 7. - С. 1321 - 1328.

9. Бельков В.В. Порожденные генной инженерией // Природа. 1994. - 10, - С. 17-24.

10. Венкстерн Т.В., Баев A.A. Спекры поглощения минорных компонентов и некоторых олигонуклеотидов рибонуклеиновых кислот -М.: Наука, 1967,

11. Демина Г.Р., Плешакова О.В., Сибельдина Л.А., Харатьян Е.Ф., Щипанова И.Н., Островский Д.Н. Стабильность нового продукта окислительного стресса в клетках бактерий. // Биохимия. 1995. - 60,4. - с. 661-668.

12. Дульянинова Н.Г., Подлепа Е.М., Радина В.П., Цыренов В.Ж., Быховский В.Я. Регуляция никотинат-фосфорибозилтрансферазы из Brevibacteriumammoniagtnes АТСС 6872 // Прикл. биохимия и микробиол. 1997. - 33, 1. - С. 18-23.

13. Ершов Ю.В. 2-С-метилэритрофосфатный путь биосинтеза изопреноидов как мишень при поиске новых антибиотиков, гербицидов и иммуномодуляторов //Прикл. Биохим. и Микробиол. 2007. - том 43, № 2. - с. 133-157.

14. Зелтянухин A.A. Малый практикум по биохимии Учеб. пособие для биол. спец. вузов. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1985. - 128 с.

15. Инегиина Е.Г., Цыреиов В.Ж. Исследование физиолого-биохимических особенностей кулыуры рода Arthrobacter продуцента гуаниновых нуклеотидов // Микробиологическая промышленность. - 1979. - № 1, - С. 45.

16. Лысак Е.И., Огрель О.Д., Харатьян Е. Ф.~, Щипанова И.Н., Островский Д.И. Связь синтеза нового компонента стрессорной реакции с метаболизмом бактериальной клетки. //Микробиология. 1995. - т. 64, - с. 437 - 441.

17. Мейбаум В.В. Определение пентоз в нуклеотидах и нуклео-зидах посредством реакции Биаля. //Биохимия. 1945. - 10,4. - С. 353-359.

18. Мукалюлова Г.В., Янг М., Келл Д.Б., Капрелъянц A.C. Бактериальные феромоны и клеточное деление. // Успехи биол. химии. 1999. - Т. 39., - С. 225-254.

19. Островский Д.Н, Лысак ЕЖ, Демина Г.Р., Бинюков ВЖ. Взаимодействие бактерий с ртутными соединениями // Микробиология. 2000. - т.69, № 5. - с. 620-628.

20. Островский Д.Н. Новые участники окислительного стресса у бактерий // Усп. биол. химии. -1997. т. 37, - с. 147 - 169.

21. Островский Д.Н., Щгтанова H.H., Сибелъдина Л.А., Степанов С.Н., Харатъян Е.Ф., Шумаев КБ. II Докл. Акад. Наук СССР. 1991. - 320, - 477480.

22. Островский Д.Н., Лысак Е.И., Сибелъдина Л.А., Харатъян Е. Ф., Щипанова H.H. Новым участником теплового шока некоторых бактерий является 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфат. // Доклады РАН. 1994. - Т. 337, -С. 687-689.

23. Островский Д.Н. Окислительный стресс и органический пирофосфат у бактерий//Биохимия. 1995. - т.60, вып. 1.-е. 14-20.

24. IJapiotceea Р.А.-Х, Красноштанова A.A., Крылов PI.А. Количественные закономерности процесса экстракции никотинамидных коферментов из биомассы пекарских дрожжей. // Химическая технология. 2005. - №11. - С. 16-21.

25. Парилсева Р.А.-Х. Исследование процесса ионообменного выделения восстановленных никотинамидных коферментов из водно-щелочного экстракта пекарских дрожжей. // Успехи в химии и химической технологии. -2005. XIX, №5. - с. 67-70.

26. Насеитиченко В.А. Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов М.: ВИНТИ, 1987.

27. Санданов Ч.М., Ероишна И.В., Цыренов В Ж. Изучение метаболическогомеханизма синтеза адениновых нукпеотидов из эк-зогенного аденинау коринеморфных бактерий //Микробиология. 1981. - т. 50, вып. 6. -с. 1053-1056.

28. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии 2 - Москва: Издательство Московского университета, 1989. - 509

29. Тулохонова Л.В., Ваздырева Н.М., Подлепа ЕМ., Цыренов В.Ж. Влияние НАД и НАДФ на фосфориллирование АМФ бесклеточными экстрактами Bravibacterium ammonagenes АТСС 6872 // Прикл. Биохим. и Микробиол. -1992. т.23, №4. - с. 591-597.

30. ХоултД.Г., Заварзин Г.А., Беркли Р. Определитель бактерий Берджи В 2 т. М.:Мир, 1997. 429,1. с.

31. Цыренов В.Ж., Ракгиаина М.Ц., Алюгаева A.A. Биосинтез нуклеотидов у штамма Bac.Subtilis // Тез. Докл. Всесоюзной конференции по регуляции биохимическиих процессов у микроорганизмов. Пущино-на-Оке. 1972. - - с. 175-178.

32. Цыренов В.Ж. Микробиологический синтез нуклеозидфосфатов М.: Наука, 1990. - 199 с.

33. Щипанова H.H., Харатъян H.H., Сибелъдина Л.А., Огрелъ О.Д., Островский Д.Н. О природе нового макроэрга, возникающего у бактерий в ответ на окислительный стресс // Биохимия. 1992. - №57, вып.6. - с.862-871.

34. Abbouni В., Elhariry HM., Aiding G. Overproduction of NAD+ and 5'-inosine monophosphate in the presence of 10 microM Mn2+ by a mutant of

35. Corynebacterium ammoniagenes with thermosensitive nucleotide reduction (nrd(ts)) after temperature shift//Arch Microbiol. 2004. - 182,2-3. - 119—05.

36. AbdelRaheim S.R., Cartwright J.L., Gasmi L., McLennan A.G. Th.es NADH diphosphatase encoded by the Saccharomyces cerevisiae NPY1 nudix hydrolase gene is located in peroxisomes // Arch Biochem Biophys. 2001. - 388, 1. — 18-24.

37. Agarwal R.P., Parks R.E., Jr. Purine nucleoside phosphorylase from human erythrocytes. IV. Crystallization and some properties // J Biol Chem. 1969. - 244, 4. - 644-7.

38. Atkinson M.R., Jackson J.E, Morton R.K. Nicotinamide mono nucleotide adenylyltransferase of pig-liver nuclei. The effects of nicotinamide mononucleotide concentration and pH on dinucleotide synthesis // Biochem J. 1961. - 80, — 318-23:

39. Aiding G., Follmann H. Manganese-Dependent Ribonucleotide Reduction and Overproduction of Nucleotides in Coiyneform Bacteria New York:: Dekker, 1994.

40. Barksdale L. Corynebacterium diphtheriae and its relatives // Bacteriol'Rsiv. 1970. -34,4.-378-422.

41. Belenky P., Bogan K.L., Brenner C. NAD+ metabolism in health and disease // Trends Biochem Sci. 2007. - 32,1. - 12-9.

42. BrinkrolfK., Brune l, Tauch A. The transcriptional regulatory network of the amino acid producer Corynebacterium glutamicum // J Biotechnol. 2007. - 129, 2. - 191211.

43. Burdett A.S., Stevens M.M., Macmillan D.L. Laboratory and field studies on the effect of molinate, clomazone, and thiobencarb on nontarget aquatic invertebrates // Environ Toxicol Chem. 2001. - 20, 10. - 2229-36.51