Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение и исследование нового фосфорного соединения 2-С-метил-D-эритритол-2.4-циклопирофосфата у микобактерий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение и исследование нового фосфорного соединения 2-С-метил-D-эритритол-2.4-циклопирофосфата у микобактерий"

„ „ ^ Я

£ 5 Ь

^ т; ?'л? РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИИ. Л.Н.БАХА

На правах рукописи

ОГРЕЛЬ ОЛЬГА ДМИТРИЕВНА

ОБНАРУЖЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ НОВОГО ФОСФОРНОГО СОЕДИНЕНИЯ 2-С-МЕТШ1-0-ЭРИТРИТ0Л-2.4-ЦИКЛОПИРОФОСФАТА У МИКОБАКТЕРИЙ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН

и в Гематологическом Научном Центре РАМН Научные руководители: - доктор биол: наук A.C.Капрельянц кандидат биол. наук К. В.Фегединг

Официальные оппоненты: доктор биол.наук , профессор

0. Л.Озерецковская доктор биол.наук , профессор Е.П.Феофилова

Ведущая организация: Московский государственный университет им.

М. В.Ломоносова

Зашита диссертации-состоится " 9 " СИПрЛА) 1995 г. на заседании диссертационного совета (К.002.96.01) в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН (Москва, Ленинский проспект,33,корпус 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 1).

-Т •• axoj)TQi

Автореферат разослан "_£ - " кмщли'! 1996 г.

Ученый секретарь 4

диссертационного совета

доктор биологических наук ' М.И.Молчанов

Актуальность проблемы В основе развития многих патологических процессов в.живом организме лежит окислительный стресс - особое напряженное состояние клетки, обусловленное воздействием повышенных концентраций активных форм кислорода. Особый интерес это явление представляет как один из важнейших факторов иммунитета [Маянский А.Н., Маянский Д. Н., 1983]. Механизм взаимодействия возбудителей инфекционных заболеваний с организмом человека неизменно находится в центре внимания' биологической науки в последнее столетие. В последние годы, несмотря на все достижения цивилизации, все болыиую опасность представляет туберкулез, особенно его устойчивые к большинству применяемых препаратов формы, уносящий ежегодно миллионы человеческих жизней Причем, среди людей, страдающих иммунными дефицитами различной этиологии туберкулез является причиной смерти в 70 % случаев [Bloom B.R., 1992]-, Претендентами ка-роль важнейших факторов вирулентности' • в случае возбудителя туберкулеза является целый ряд белков [Beketov S., 1994]. Существенная роль приписывается также низкомолекулярным небелковым компонентам бактерий, которые вызывает in vitro активацию у, 8 -Т-лимфоцитов человека, важных участников иммунной реакции. Усилиями специалистов ряда крупных зарубежных лабораторий удалось выяснить, что активаторами у, 5 -Т-клеток являются фосфаты с молекулярным весом менее 1*Да [Schoel В., et al., 1994], среди которых имеются производные нуклеотидов [Constant Р., et al., 1994] и, возможно, изопентенилпирофосфат [Tanaka Y., etal., 1995]. Главный же действующий компонент этих факторов ввиду трудности выделения из патогенных микобактерий все еще не идентифицирован

окончательно, но спектр ЯМР был опубликован. Незадс.-.го до проведения работ, упомянутых выше, в Институте биохимии имени А. Н. Баха было . обнаружено необичное соединение 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфат, детектируемое в ряде видов бактерий при выращивании в условиях окислительного стресса. Сходство спектров протонного ЯМР фактора из Н. tuberculosis и нового циклопирофосфата, а также структуры нашего вещества и изопентенилпирофосфата побудили нас к поиску способности к синтезу 2-С-метил-0-эритритол-2,4-цикпопирофосфата в сапрофитных и патогенных микобактериях и корреляции между этой способностью и резистентностью бактерий к воздействию защитных механизмов иммунитета.

Цели данной работы:

1. Поиск у сапрофитных и патогенных микобактерий способности к синтезу и накоплению 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфата

• (НФС) в условиях окислительного стресса. ' ~

2. В случае невозможности прямого обнаружения этой способности разработка методов поиска в бактериальном геноме нуклеотидных последовательностей, кодирующих предполагаемую НФС-синтазу, с помощью специальных зондов.

3. Изучение роли НФС в противостоянии микробов-продуцентов окислительному стрессу, создаваемому иммунными клетками, на различных моделях:

а) химическая индукция активных форм кислорода;

б) взаимодействие бактерий с клетками

- фагоцитирующего простейшего Acanthsmoeba castellar!//'.; ' :

в)_ взаимодействие с макрофагами мыши.

к

Научная новизна работы. ^

В микобактериях впервые обнаружено, изолировано и идентифицировано как 2-С-метил-0-зритритол-2,4-циклолирофосфат (НФС) новое фосфорное соединение, накапливающееся в клетках в ответ на окислительный стресс. Прямим методом НФС обнаружен у сапрофитов Mycobacterium smegmatis и H.phlei, но не выявлен у патогенных видов Н. tuberculosis и Н. bovis. С помощью метода гибридизации по Саузерну и полимеразной цепной реакции в ДНК некоторых патогенных микобактерий обнаружены участки гомологии с зондами из • коринебактерий, имеющими общую последовательность с фрагментами ДНК, кодирующими накопление 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфата в рекомбинантных клонах £. со//'. Удалось также установить, что рекомбинантный штамм E.coli 2-31 с клонированной из Corynebacterium amoniagenes способностью к накоплению нового циклопирофосфата в больших количествах обладает повышенной устойчивостью к пребыванию внутри_ мышиных перитонеальных макрофагов по сравнению с изогенным клоном Е. col i, несущим вектор без вставки.

Практическое значение работы. Полученные результаты существенно дополняют современные данные о процессах, протекающих в бактериальной клетке в условиях окислительного стресса, а также о характере взаимодействия бактерии с иммунными клетками животного-хозяина. Обнаружение.у сапрофитных микобактерий способности к Синтезу 2-С -метил-О-эритритол-2,4-циклопирофосфата (НФС), а также нуклеотидных последовательностей, гомологичных гену предполагаемой НФС-синтазы у целого ряда патогенных видов, ^раскрывает широкие перспективы понимания сущности патологического процесса при микобактериальных инфекциях. Возможны

принципиально новые подходы к диагностике и лечен;п микобактериозов. В частности, создание живых протективных вакцин на основе штаммов, аттенюированных по генам синтеза нового циклопирофосфата. Тот факт,-что Е.соИ, получившая искусственным путем способность к синтезу НФС, приобретает преимущества в борьбе с иммунной клеткой, может пролить свет на саму суть туберкулеза и родственных заболеваний и. исходя из этого, разработать новые подходы к-лечению и лекарственные препараты.

Апробация работы: Основные положения диссертации доложены на XI11 th International conference on phosphorus chemistry - ICPC, Jerusalem, Israel, 16-21 июля 1995. И на International workshop "Membrane Bioenergetics", 15-20 декабря 1995.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 статей.

1.Натериалы и методы исследования Бактериальные штаммы.Mycobacterium smegmatis ВКМ АС 1171, ■Mycobacterium ptilei ВКМ AC 1291, М. bovis В CG , Н. Tuberculosis, Micrococcus luteus (/ysodeikticus штамм Флемминга 2665), Corynebacterium amoniagenes АТСС 6872, Escherichia col i , штамм XL-1 blue и производные от него рекомбинантные клоны: EVC, несущий плазмидный вектор pßluescript SKIl+("Stratagene", США) без вставки, 1-17 и 2-31, с тем же вектором, но несущие фрагменты геномной ДНК из Corynebacterium ammonlagenes длиной 1.2 и 8 тыс. пар оснований соответственно [Степанов С. И. и др., 1995].

Культивирование бактерий осуществлялось на богатой среде, содержащей 1% пептона, 0.3 % дрожжевого экстракта и 0.5 % Nací или среде LB. Никобаетерии культивировали также на жидкой среде Сотона ,' а М. tuberculosis - на среде Левенштейна и Йенсена в стационарных условиях [Драбкина P.O., 1963]. При выращивании рекомбинантных клонов в среду добавлялись антибиотики'тетрациклин и ампициллина

натриевая соль. Автор признателен к. б.н. А. Н. Калек к д. вет.н. А.Н.Шарову за помощь в работе с патогенными микобастериями.

Для индукции окислительного стресса к бактериальной культуре в логарифмической "фазе роста добавляли раствор глюкозы до конечной концентрации 1 % и редоксциклирующие агенты: бензилвиологен до 50 мкг/мл или Н, И-биС-(2-карбамоилзтил)-4,4-дипиридилкя гидрохлерид (А\0 и продолжали культивировать еще 17-20 часов. В качестве индукторов применяли также фурацилин, фурадонин, снесь глюкозы и глюкозооксидазы (10 мкг на 1 мл, 0.2 е.а. на 1 мл), нитропруссид натрия (1мг/мл) перекись водорода , хлорамин Б, промышленные антисептики дезоксон-1 и #1-2.

Спектроскопия ЯНР на ядрах 31Р осуществлялась на приборе "Вгикег АМ-400" ( Германия) , внешним стандартом'служила натриевая соль этилендиаминтетрафосфоновой кислоты в 020 (хин. сдвиг 7,8.м.д. относительно ортофосфорной кислоты). Подготовка образца осуществлялась по схеме, ранее описанной в работе [Папанова И.Н., Огрель О.Д. и др., Биохимия, 1992].

Масс-спектрометрические исследования проводились, на приборе МСБХ (Сумы, Украина) с плазменной десорбцией ускоренными ядрами 2S2Cf в'виде водных растворов [Оэггоуэку 0. ег'.'ак В!оРас1:ог8, 1992].

Газо-жидкостная хроматография ацетатов альдитов, полученных по методике, описанной в [Баиагйекег и.Б. е1:.а1 , 1965], осуществлялась в форме бензольных растворов на аппарате ЛХМ на колонке ОУ-17, нагреваемой со скоростью 5 градусов в минуту с 80 до 250°С и затем стабильно на 250 градусах до выхода всех компонентов, газ-носитель - азот.

Выделение бактериальной ДНК осуществлялось двумя методами. Метод № 1 описан в [Ма^а-Ыв Т. ег а1., 1982]. Новый нетод, коротко, состоял в следующем. Бактерии обрабатывали последовательно лизоцимом и проназой Е с саркозилом (аналогично методу 1). По окончании ферментативной реакции ДНК из смеси сорбировали на силикагель в С1Т-буфере (5М тиоцианата гуанвдина , 0.053 М Трис*НС1,

рН 7.5, 12мМ ЭДТА, рН 8.0, 0.2 И (Ш 2.12% саркозила. 0.15Н 2?

меркаптоэтанола). После промывки носителя 40% водным этанолом, ДНК • десорбировали с силикагеля водой и лереосаждали из водного этанола. Качество ДНК проверяли электрофорезом, а также гибридизацией по Саузерну с радиоактивным зондом гена 16S РНК.

Блоттинг по Саузеону осуществлялся согласно методике [ Man i at is T. et al., 1982] с использованием рестриктазы EcoRI. Матрицей для получения радиоактивного зонда служил фрагмент ДНК„ полученный методом ПЦР (см далее) на основе плазмиды-вектора, выделенной из рекомбинантного клона 1-17 с участием праймеров StGG и StCC. Олигонуклеотидные праймеры StGG и StCC были синтезированы на основании данных по нухлеотидной последовательности вставки из клона 1-17. Включение радиоактивной метки проводилось с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы-l s стандартных условиях. Мембрану с фрагментами исследуемых ДНК гибридизовали с радиоактивным зондом, Отмывали и закладывали в кассету с пленкой KODAK Х-ОМАТ AR с усиливающим экраном. Результат получали после проявления радиоавтографа.

Лолимеоазную цепную реакцию (ПЦР) TChien A. et.al., 1976] проводили в программируемом термостате Perkin Elmer . В состав реакционной смеси входили: матрица*ДНК 0.5-1 мкг на образец, праймеры, по 10 пМ на образец, смесь дезоксирибонуклеотидов в концентрации 0.2 мМ,' буфер, деионизованная вода и фермент Taq-полимераза, по 1.25ед./образец. Реакционную смесь прогревали при 94° С 3-5 мин для полной денатурации ДНК, затем 30 циклов ПЦР проводили

о

по следующей схеме: 94 С - 30 сек. (плавление двухцепочечной ДНК),

о а

49 С - 30 сек. (отжиг праймеров),72 С - 30 сек, с увеличзнием продолжительности стадии с каждым последующим циклом на 5 сек. (полимеразная реакция). По окончании полимеразной цепной реакции реакционную смесь выдерживали 7 мин при 72°С для полной достройки амплифицируемого фрагмента ДНК. Продукты реакции анализировались методом электрофореза в 1-1.5 % агарозе.

Эксперименты с простейшими Acanthamoeba caste I lani i штамм Neff. Амебы культивировались на среде PYG' (0.75 % пептона, 0.75 %' дрожжевого экстракта и 1.5% глюкозы) с добавкой 50 мкг/мл

о

ампициллина, при 28 С на качалке при 160 об/мин. Число клеток подсчитывали в камере Горяева. Для исследования взаимодействия с бактериями использовали активно растущую культуру амеб, которую наносили на чашку Петри с минеральным агаром, покрытым бактериальным газоном. Перемещение амеб по агару регистрировали по наблюдению в микроскопе и визуально по появлению прозрачной зоны вокруг точки аппликации амеб [Тупйа11 Оош'шдие Е.1., 1982].

Эксперименты с перитрнеальными макрофагами мыши [НипоэЬ \ Ьа Т. ег. аI., 1993].Схема приведена на рис1. В экспериментах использовались мыши в возрасте 8-13 недель, самки, линейный гибрид '.Р-|(СВА*С57/6.0. У мышей, от которых планировалось получить • макрофаги, вызывали стерильное воспаление инекцией пептона в брюшную полость. Через 3 дня, когда в очаге воспаления собирались макрофаги, их вымывали из брюшной полости физиологическим раствором, забуференным фосфатами и содержавшим около 1ед/мл гепарина. Полученные при этом клетки сортировали по способности к адгезии. Культивирование макрофагов осуществлялось в среде ЯРМ1 1640, с добавкой 5% сыворотки плода коровы в инкубаторе при 37 С и 5% С02 в атмосфере. На 1 лунку плашки приходилось 1.2-1.5*106 клеток. Живые макрофаги прилипали ко дну лунки иммунологической плаикй; а загрязнения было легко удалить, слив среду. Параллельно шла подготовка бактерий. Ночную культуру отмывали от среды, смешивали с 10% нормальной мышиной сывороткой, полученной по методике [Кэтти Д.. ред., 1991] и выдерживали при 37°С в течении 0.5 часа. В результате этого процесса опсонизации к поверхности бактерий прикреплялись антитела и некоторые компоненты комплемента. Это в дальнейшем обеспечивало узнавание и поглощение бактерий макрофагами. Подготовленных таким образом бактерий добавляли к культуре макрофагов, из расчета 10 микробов на 1 макрофаг. Плашки подвергали центрифугированию для осаждения бактерий и усиления фагоцитоза и выдержизали еще 40 мин в инкубаторе. Затем среду с бактериями удаляли и заменяли на свежую, содержавшую антибиотик', гентамицин (200 мкг/мл) для уничтожения внеклеточных бактерий. Кокультивированиэ макрофагов и поглощенных ими бактерий продолжали

Стерильное воспаление

1 Схена эксперимента по выживанию бактерий внутри нышимих макрофагов. ■10

еще 10 часов. Через каждые 2 часа часть макрофагов лизировали дезоксихолатом натрия и лизаты в нескольких разведениях высевали на чашки с LB-агаром. Долю выживших внутри макрофагов бактерий определяли по числу колоний на чашках. Расчитанные как среднее арифметическое данные по каждой экспериментальной точке наносились на график.

2. Результаты и их обсуждение 2.1 Обнаружение и установление структуры нового фосфорного соединения.

В условиях окислительного стресса в клетках Corynebacterium amoniagenes накапливается новое фосфорное . соединение с необычным сигналом в 31р-ЯМР-спектре. В выделении и идентификации этого вещества из С. аттоп i agenes ■ я принимала участие на отдельных этапах работы. В частности, с помощью нового масс-спектрометрического метода был уточнен молекулярный вес нового вещества -278.3'Да. Газожидкостная хроматография показала, что органическая часть молекулы представляет собой необычный углевод. Окончательно структура нового фосфорного соединения (НФС) была установлена А.Шашковым и И.Щипановой на основании вышеупомянутых данных и новейших методов ЯМР: 2-С-м"етил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфат:

Н Н СН3

II!

Н—С—С—С—CH2OH

III

0 он о

1 I 0 о=р—о—р=о

.. I I

он он

4J

Помимо коринебактерий накопление в культуре необычного циклопирофосфата в условиях окислительного стресса отмечалось у целого ряда бактерий [Островский Д.Н. и др., 1991], [Santos Н. etal.], [Kjelstadt В. etal., 1989]. Но особый интерес, безусловно, представляло обнаружение характерного сигнала с химическим сдвигом -14.8 м.д. в спектрах ЯМР Н. smegmatis и H.phlei (рис 2). Сходство сигналов 31Р-ЯНР несомненно указывало на наличие похожих фосфорсодержащих группировок, но не означало идентичности новых фосфатов из разных бактерий. Поэтому была проведена большая работа по установлению структуры НФС из Н. smegmatis. Культивирование микобактерий в перемешиваемой жидкой среде в течении 48-72 часов от момента пересева с твердой среды сопровождалось образованием в цитоплазме обычного набора фосфорсодержащих соединений. На рис 2а показан спектр 31р. ЯМР суспензии контрольных Клеток. Однако, добавка в среду за 20 часов до окончания опыта редоксциклирующего агента бензилвиологена (БВ) (до 10-4 М) приводило к накоплению НФС с характерным сигналом (-14.8 м.д.). На рис 26 четко видно появление характерных пиков: -10.7, -14.8 м.д. Вопрос об идентичности пирофосфата, выделенного из микобактерий 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфату из коринебактерий был решен практически однозначно. Для этого циклопирофосфат был выделен из культуры микобактерий и подвергнут очистке по той же схеме, как вещество из коринебактерий. Следует однако отметить, что уровень накопления нового циклопирофосфатэ у микобактерий значительно, в среднем на полпорядка, ниже, чем

а

(а)

(6)

i i_' '

mi-' '

0 -5 -10-15 -25 5 0 -5 -10 -15 -25 Химический сдвиг, м.д.

Рис 2. Спектры 31Р-ЯМР экстрактов из клеток Н.зтедтаИв, выращенных на обычной' среде (а) и на среде с добавкой бензилеиологена (б).

1234 5 6789 10-11 12 13 14 15

Рис 4'.Электрофорез в 1.5% агарозе продуктов ПЦР праймеров 1-17 и бактериальных геномных ДНК, слева направо: 1-наркер;2- Micrococcus luteus;3- нетзнобактерия; A- Н. ha I obi us; 5-2-31; 6- E.coiiX L-1; 7-9- Pseudomonasr, 10,11-H.tuberculosis;1Z- H.aviuzr, 13,14-/i.bovis (2 итакиз);15-<7.aimoniagenes.

у коринебактерий. В связи с недостаточным количеством вещества, мы ограничились сопоставлением масс-, 13с -ЯМР и протонных спектров циклопирофосфатов из микобактерий и из коринебактерий. Методом многоступенчатой ионообменной хроматографии с дополнительной очисткой материала и добавкой ЭДТА для удаления мешающих дивалентных катионов из клеток Н. smegmatis, ыращенных в присутствии БВ был получен препарат, согласно данным 1Н-ЯМР состоящий на 95% из НФС и демонстрирующий характерные сигналы ■ 13С -ЯМР и протонного магнитного резонанса, хим.сдвиги в D2O: Ci=68,3; С2=85,36; Сз=67,14; С4=69,83; С5=17,69 (СНз) м.д. Н1а, 6=3,6 и 3,75; Нз+Н4а,б=мультиплет 4,1-4,2 м.д.; H5 (в СНЗ)=1,42 м.д.

Совпадение этих данных с таковыми для коринебактерий, доказывает, что микобактерии также синтезируют в стрессорных условиях 2-С-метил-0-эритритол-2,4-цикло.пирофосфат. , . . .

2.2 Поиск способности к синтезу нового циклопироФосФата v патогенных микобактерий.

Обнаружив новое вещество у сапрофитных микобактерий, мы решили попытаться напрямую обнаружить его и у патогенных. Работа с патогенными культурами очень опасна и требует применения сильных антисептиков. Поэтому необходимо было проверить влияние жесткой обработки на преднакопленный в клетках циклопирофосфат. Вещество оказалось весьма стабильно в клетке и выдерживало действие не только антисептиков и детергентов, но даже автоклавирование. Добавление в ростовую среду Н.bovis BCG редоксциклирующего агента не приводило к индукций синтеза искомого вещества (рис 3). Клетки реагировали на

•Й"

экстактов из них (б) и экстрактов из меток, выращенных в присутствии бензилвиологена (в).

это воздействие снижением запасов полифосфатов, накапливавшихся в норме. Необходимо, однако, отметить, что условия культивирования патогенных микобактерий in vitro существенно отличаются от природных. И так как в опытах с бензилвиологеном их1 жизнедеятельность существенно не угнеталась, существовала вероятность того, что потенциальная способность к синтезу нашего вещества была закодирована в их геноме. В,поисках этого гена мы воспользовались находками наших коллег С.Степанова, Е.Лысак и К.Фегединга [Степанов С. и др., 1995]. Они с помощью специальных ферментов разрезали всю геномную ДНК коринебактерии на фрагменты и используя специальные вектора ввели в клетки E.coti. Среди полученных таким способом рекомбинантных клонов были отобраны устойчивые к действию бензилвиологена и способные к накопления нашего веществг. Мы воспользовались плазмидами этих клонов для получения 17-членных олигонуклеотидных зондов. Эти олигонуклеотиды, так называемые праймеры,- были использованы в поисках гена • предполагаемой НФС-синтазы в геномах различных бактерий. Поиск этот осуществлялся по двум направлениям. Блоттингом по Саузерну с использованием радиоактивного зонда и полимеразной цепной реакцией. В обоих случаях праймеры использовались как затравка для ферментативного достраивания фрагментов ДНК, гомологичных искомому гену. На рис 4 показана схема электрофореза продуктов полимеразной цепной реакции с участием геномных ДНК'ряда бактерий. Наиболее сильный положительный сигнал, свидетельствующий о наличии нуклеотидной последовательности, гомологичной гену предполагаемой НФС-синтазы наблюдается у С. amnion i agenes, И. lúteas, и-рекомбинантного штамма Е. col i 2-31, для которых способность к

синтезу установлена по 31Р ЯНР и у И. tuberculosis, Н. avium, Н. bovis. Из этого можно сделать вывод о присутствии в геномах этих бактерий закодированной потенциальной способности к синтезу нашего вещества. Неясным однако оставался вопрос, реализуется ли эта возможность в условиях патогенеза и как это сказывается на выживании бактерии.

2.3 Изучение окислительного стресса на различных моделях.

Для изучения роли нового циклопирофосфата в противостоянии бактерии и иммунной клетки мы изучали этот процесс на моделях. Было испытано действие различных веществ-генераторов активных форм кислорода и азота. Перекись водорода и ее источник смесь глюкозы и глюкозооксидазы, генератор N0 нитропруссид, различные красители. Синтез нашего вещества обнаруживался только в случае смеси глюкозы и глюкозооксидазы у рекомбинантного клона 2-31, обладателя вставки из генома коринебактерии. Этот клон оказался и весьма устойчив к действию виологенов. На рис 5 показаны кривые роста клона 2-31 и исходного штамма E.coli XL-1.XL-1 практически перестает расти даже при присутствии в среде минимальных количеств виологена, в то время как на жизнедеятельности 2-31 не сказываются и значительно большие количества.

Более совершенной моделью были фагоцитирующие простейшие Acanthamoeba castelI an i i. Их наносили на бактериальный газон на твердой среде и наблюдали рост зоны выедания по прозрачному пятну. Простейшие не показали никакой избирательности в поглощении бактерий, не сказывалось на их аппетите и преднакопление нового фосфата. Хотя отдаленные последствия такой диеты (10-30дней) возможны и может быть позволят найти подход к роли .нового вещества в природе.

Á7

£ со //'Xl-1

Время инкубации в часах £. col / XL-1,рекомбинангный клон 2-31

Рис 5. Кривые роста на богатой среде в присутствии виологена AV Е.соН XL-1. рекомбинантный клоя2-31 (а) и реципиектного штакка XL-1 (б).

—*--контроль --100 нкг/нл AV

—I--30 мкг/мл AV -о- - 300 мкг/мл AV

и

Наилучшей моделью из доступных нам были, безусловно, макрофаги мыши. Схема этого сложного эксперимента приведена на рис. 1. График, построенный по результатам одного из нескольких однотипных экспериментов приведен на рис.6. Каждая точка - среднее арифметическое данных по нескольким чашкам. На рисунке четко видно, что клон 2-31, получивший от коринебактерии способность к синтезу нового циклопирофосфата имеет явные преимущества по выживанию внутри макрофага по сравнению с клоном, несущим вектор без вставки. Мы имеем все. основания заключить, что это преимущество связано с наличием у бактерии нуклеотидной последовательности, ответственной за синтез 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфата.

Итак, с помощь» нового, ранее не применявшегося, метода масс-спектрометрии с участием ускоренных ядер калифорния, установлено точное значение молекулярного веса нового фосфорного соединения 2-С-метил-0-зритритол-2,4-циклопирофосфата (НФС). Разработан удобный метод получения ДНК из патогенных микобактерий. Обнаружен новый -аспект ответа сапрофитных микобактерий на окислительный стресс -синтез нового циклопирофосфата. Используя зонд, удалось обнаружить предполагаемый ген способности к синтезу НФС в целом ряде микробов, в которых не удавалось зарегистрировать это вещество напрямую по спектру Р-ЯМР из-за сложности или опасности культивирования, а также из-за трудности подбора подходящих стрессорных условий. Новым подходом к отбору синтезирующих нсзый циклопирофосфат микроорганизмов, особенно среди трансформированных £ со//, стоит считать тест по выживанию длительное время внутри мышиных макрофагов. Нами был спробирован целый ряд моделей взаимодейстзня патогенного микроорганизма с иммунной системой жертвы. Помимо

выживаемость в %

враия инкубации в часах

Рис '6. Выживание бактерий внутри мышиных макрофаго-.

- Рекомбинанткый клон с вектором без вставки (ЕУС) —ь— -) Рекокбинантный клон 2-31. Каждая точка является средним арифметически« дублирующихся данных в пределах одного эксперимента. Отклонения величин между независимыми экспериментами находятся в пределах 5-10%.

традиционных химических подходов, мы предлагаем использовать с этой целью легко культивируемых простейших - амеб и адсорбированные на твердой подложке мышиные перитонеальные макрофаги. Амебы не . оказывали предпочтения ни одному из испытанных видов и штаммов в ходе краткосрочных экспериментов.Не сказывался на их аппетите и факт преднакопления в бактериальных клетках НФС. Но на макрофагах был продемонстрирован поразительный результат. Рекомбинантный клон E.coli , получивший от коринебактерии способность к синтезу нового циклопирофосфата вместе с участком генома, обладал повышенной способностью к выживаний внутри фагосом макрофагов по сравнений с изогенным клоном, не имевшим вставки чужеродного генома. Этот факт открывает перед нами новые захватывающие перспектива понимания сущности влияния окислительного стресса на бактерии,а также места 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфата в патогенезе и других процессах , сопряженных с повышением концентрации активных форм кислорода. • • • ... .

! Основные выводы диссертации:

1.В сапрофитных микобактериях Hycobacterium smegmatis и H.phlei обнаружено, изолировано и идентифицировано как 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфат (НФС) новое фосфорное соединение, накапливающееся в клетках в ответ на окислительный стресс.

2. С помощью метода гибридизации по Саузерну и полимеразной цепной реакции в ДНК некоторых патогенных микобактерий обнаружены участки гомологии с зондами из коринебактерий, имеющими общую последовательность с фрагментами ДНК, кодирующими накопление 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфата в рекомбинантшх клонах ' ■ E.coli .

3. Показано, что рекомбинантный штаммЕсоИ 2-31 с клонированной из Corynebacterium ammoniagenes способностью к накоплению нового циклопирофосфата в больших количествах обладает повышенной, устойчивостью к пребыванию внутри мышиных перитонеальных макрофагов по сравнению с изогенным клоном E.coli несущим вектор без вставки.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. И.Н.Щипанова, Е.Ф.Харатьян, Л.А.Сибельдина, О.Д.Огрель, Д.Н.Островский, 0 природе нового макроэрга, возникающего у бактерий в ответ на окислительный стресс. Биохимия, 1992, 57(6), 862-872.

2. D.Ostrovsky, E.Kharatian, T.Dubrovsky, O.Ogrel, l.Shipanova, L.Sibeldina. The abi I ity of bacteria to synthesize a new cyclopyrophosphate correlates with their tolerance to redox-cycl ing drugs: on a crossroad of chemotherapy, environmental toxicology and immunobiochemical problems. BioFactors, 1992, 4, 63-68.

3.Д.Н.Островский, О.Д.Огрель, В.И.Бинюков, С.Д.Таптыкова, Е.Ф.Харатьян, А.С.Шашков, К.Б.Шумаев, И.Н.Щипанова. Взаимосвязь устойчивости микобактерий с биосинтезом новых метаболитов:

' циклопирофосфата й ради кал образу еще го соединения. ДАН, 1992, 325(5), 1071-1076. '

4.Д.Н.Островский, М.А.Мартынова, В.К.Матус, О.Д.Огрель, Е.И.Лысак, Е.Ф.Харатьян, Л.А.Сибельдина, И.Н.Щипанова. Озон: "нйвый аспект действия на микроорганизмы. ДАН, 1993, 331, 104-108.

5. И.Н.Щипанова, Г.Р.Демина, О.Д.Огрель, Д.Н.Островский, А.Ф.Свиридов, Л.А.Сибельдина, А.С.Шашков. Спонтанное превращение и встречный синтез углеродного скелета нового бактериального макроэрга. ДАН, 1993, 333(5), 666-670. -

6.D.Ostrovsky, R.Amirov, E.Kharatian, O.Ogrel, S.Stepanov, L.Sibeldina, I. Shipanova, S.Taptykova. Bacteria and pesticides: a new aspect of interaction. BioFactors, 1994, 4(3/4), 151-154.

7.Д.H.Островский, К^Ш.Досанов, A'.H.Калюк, О.Д.Огрель, • Л.А.Сибельдина! Е.Ф.Харатьян, И.Н.Щипанова, А.Н.Шаров. Действие

антисептических средств и редоксциклирующих агентов на

Согупsbacteriu.il amoniagenes и родственные микроорганизмы в связи

с синтезом нового макроэрга. Микробиология, 1994, 63 (3), 431-438.

8.Е.И.Лысак, О.Д.Огрель, Е.Ф.Харатьян, И.Н.Щипанова, Д.Н.Островский. Связь синтеза нового компонента стрессорной реакции с метаболизмом бактериальной клетки. Микробиология, 1995, 64(4), 437-441.

9. O.D.Ogrel, K.V.Fegeding, Е.F.Kharatian, A.B.Sudarikov, D.H.Ostrovsky. The abi I ity of recombinant Escherichia coli strain to synthesize 2-C-methyl-D-erithrytol-2,4-cyclopyrophosphate correlates with its.tolerance to in.vitro induced oxidative stress and bactericidal action of murine peritoneal macrophages. Curr. Microbiology,' 1996, 32.

10. О.Д.Огрель, К.В.Фегединг, А.С.Капрельянц, Е.И.Лысак, М.Ш.Нго, А.б.Судариков, Е.Ф.Харатьян, Д.Н.Островский. Участие 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфата (МЭЦ) в реакции бактерий на окислительный стресс и в их персистенции в макрофагах теплокровных. Биохимия, 1996(сдано в печать).

2 Ъ