Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффективное выделение микобактерий с поверхностей различных материалов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эффективное выделение микобактерий с поверхностей различных материалов"

РГБ ОД

1 3 Май №)6

На правах рукописи

ЗУЕВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА

ЭФФЕКТИВНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ МИКОБАКТЕРИЙ С ПОВЕРХНОСТЕЙ РАЗЛИЧНЫХ МАТЕРИАЛОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 1996

Работа выполнена в Уральском научно-исследователь институте "Фтизиопульмонологии", Екатеринбург.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Г.Г. Мордовской

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б.П. Бубочкин доктор медицинских наук, профессор З.Н. Кондрашова

Ведущее учреждение - Российский научно - исследовательсга

институт "Фтизиопульмонологии" Мс и МП РФ, Москва.

Защита состоится " "........ 1996 года

в . . . . часов на заседании диссертационного Совета при Челябинском государственном медицинском институте по адресу:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан " "........ 1996 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

А.В. Зурочка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туберкулез является одной из наиболее распространенных и вместе с тем наиболее опасных для человека хронических инфекций. Больной туберкулезом выделяет во внешнюю среду большое количество микобактерий туберкулеза (МБТ), часть которых, оседая на поверхностях различных предметов, может накапливаться и сохранять жизнеспособность в течение длительного времени и стать источником заражения (В.М. Ваксов, 1972; М. Иегшсоу, 1974; М. 1атато1;о, 1985).

При определении загрязненности различных поверхностей мико-бактериями наиболее распространенным является метод смыва с помощью ватного тампона (Н.В. Щербакова, 1976; Н.И. Любкина, 1989). Исследования, проведенные в 1990 году сотрудниками бактериологической лаборатории Свердловского НИИ туберкулеза показали, что применение существующих методов сбора и обработки материала приводит к потере микобактерий из-за их фиксации на вате и к, большому числу проростов при посевах (до 1820%), что значительно снижает результативность исследований (Л.И. Самусевич с соавторами, 1990). Кроме того, микобактерии во внешней среде претерпевают воздействие различных неблагоприятных факторов, поэтому большое значение приобретают методы их культивирования. Особое внимание при этом уделяется созданию новых сред обогащения, различных по составу и обладающих элективностью в отношении микобактерий туберкулеза (Е. Рог-1ае1з, 1983; В.А. Аникин., 1987; Г.Г. Мордовской, 1987 и др.).

Современный интерьер помещений представлен предметами и конструкциями, изготовленными из материалов с различной

структурой (пластмасса, кожзаменитель, полистирол, плексигла и др.) и покрытыми разными синтетическими лаками и краскам! Вид материала может оказывать влияние на особенности выявле ния микобактерий, однако этот вопрос требует дополнительног изучения (Б.Ф. Аленькин, 1977).

Особый интерес представляет изучение загрязненност] микобактериями различных материалов в учреждениях противо туберкулезной службы, где возможно выделение возбудителя ту беркулеза во внешнюю среду в силу скопления большого числ. больных - бактериовыделителей, а также проведения исследова ний заразного материала. Медицинский персонал может подвер гаться заражению туберкулезом как при прямом контакте с боль ными, так и опосредованно - через загрязненные поверхности : помещениях противотуберкулезных учреждений (A.A. Приймав JIM. Плотникова, 1992).

Исходя из изложенного, целью исследований было совер шенствование методов выделения микобактерий на объекта: внешней среды и их культивирования, применение которых по зволит более достоверно оценить загрязненность микобактериям] поверхностей различных предметов.

Цель исследования. Повысить эффективность бактериоло гических методов выделения микобактерий с поверхностей пред метов, изготовленных из различных материалов.

Задачи исследования В соответствии с поставленно] целью были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать новую конструкцию тампона для взятия смывов i модифицировать способ его обработки перед посевом.

2. Разработать высокопитательную среду для культивировани: микобактерий.

3. Определить влияние вида материала на выявляемость мико-бактерий.

4. Выявить и оценить степень загрязненности микобактериями различных поверхностей в помещениях противотуберкулезных учреждений.

5. Изучить вирулентность и другие свойства (морфологические, культуральные, биохимические, чувствительность к противотуберкулезным препаратам) микобактерий, выделенных в помещениях противотуберкулезных учреждений.

Научная новизна В результате исследования разработан более эффективный по сравнению с существующим, метод выделения микобактерий с поверхностей различных материалов, включающий сбор материала тампоном новой конструкции с минимально-оптимальных площадей и модифицированный способ обработки исследуемого материала. Изобретена новая полужидкая питательная среда обогащения для посева исследуемого материала, применение которой позволяет ускорить рост микобактерий и повысить их выявляемость. Впервые установлена зависимость массивности выделения микобактерий от вида материала. На базе этого впервые определены минимально-оптимальные площади для оценки степени загрязненности микобактериями различных материалов.

Практическое значение Разработана инструкция по методу выделения микобактерий с поверхностей различных материалов, которая утверждена Департаментом здравоохранения Свердловской области и внедрена в практическую работу лабораторий противотуберкулезных учреждений Уральского и Волго-Вятского регионов. Кроме того, на основании изучения ростовых свойств микобактерий разработана и внедрена в практику бактериологи-

ческих лабораторий противотуберкулезных диспансеров облает полужидкая питательная среда для выделения микобактерий тл беркулеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Использование для взятия смыва новой конструкции тамш на с применением поролоновой губки; смачивание тампона вмест обычно употребляемого изотонического раствора 5% рас-творо фосфорнокислого натрия трехзамещенного, одновременно являк щегося также деконтаминантом, и применение разработанно нами полужидкой питательной среды в комплексе с плотным питательными средами позволяют повысить выделение микобаь терий в 1,7 - 2,0 раза и сократить сроки их роста в 1,7-1,9 раза.

2. В помещениях противотуберкулезных учреждений загряг ненность микобактериями поверхностей оборудования и предм« тов зависит от вида материала, из которого они изготовлены.

Реализация работы Предложенный метод выделения м* кобактерий с поверхностей различных материалов внедрен применяется в бактериологических лабораториях Свердловског областного научно - практического объединения "Фтизиопульмс нология", противотуберкулезных диспансеров городов Екатерин бурга, Первоуральска, Ирбита, Серова и др.

Апробация диссертации Материалы диссертации доложен: и обсуждены на научно-практической конференции молодых уч« ных и специалистов 23. 11. 88 (Свердловск), семинаре-совещани лабораторных служб противотуберкулезных учреждений Ураль ского и Волго-Вятского регионов 19.12.95, заседаниях Ученого сс вета Свердловского НИИ "Фтизиопульмонологии" 28.01. 92 и 6. 1 95.

Публикации По теме диссертации опубликованы 3 работы, разработано 1 изобретение.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований в 3 главах, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Библиографический указатель включает 151 отечественный и 122 иностранных источника. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 2 рисунками.

Материал и методики исследования В основу работы положена разработка более эффективного метода выявления микобак-терий и его сравнение с существующим методом. Выполнено 6580 исследований в эксперименте с использованием лабораторного штамма Н?ЛИ\' и проведено 351 исследование (выполнено 4175 смывов) на загрязненность микобактериями поверхностей различных предметов и конструкций в помещениях противотуберкулезных учреждений городов Алапаевска, Асбеста, Березовского, Вол-чанска, Екатеринбурга, Каменска-Уральского, Камышлова, Кировограда, Краснотурьинска, Первоуральска, Серова, Сысерти, Та-лицы и Туринска.

При изучении свойств микобактерий (58 культур), выделенных из внешней среды исследованы их морфологические свойства, скорость размножения и образования видимых колоний, ферментативная активность, чувствительность к противотуберкулезным препаратам, вирулентность (3580 исследования). Для типирования и определения вирулентности выделенных микобактерий использовано 120 морских свинок и 8 кроликов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основной частью проведенного нами исследования явилас

разработка эффективного метода выделения микобактерий, иг

чальным этапом которого является сбор материала. Нами пре;

ложен для взятия смывов тампон новой конструкции с использс

ванием мелкопористой поролоновой губки. Для сравнения эффер

тивности нового и рутинного (ватного) тампонов на стекляннь: поверхности площадью 100 см2 наносили взвесь штамма НдуКу

параллельно проводили смывы. Определено, что при использс вании для смыва поролонового тампона вместо ватного выделен* микобактерий лабораторного штамма повысилась в 1,2-1,6 раза ( <0,001). Установлено также, что минимально-оптимальной велич! ной площади для смыва одним поролоновым тампоном следу« считать площадь не менее 100 см2.

Одной из основных причин, снижающих качество бактериол* гических исследований является присутствие в исследуемом м< териале сопутствующих микроорганизмов. Особенно актуалы это проблема в тех случаях, когда исследуется обсемененнос микобактериями объектов внешней среды, являющейся ест ственным резервуаром многих микроорганизмов. Следователь! качество обработки материала, полученного при смывах с повер: ностей различных материалов, имеет первостепенное значен* Согласно существующему способу для смачивания тампона и пользуют изотонический раствор хлорида натрия, а обработку целью удаления сопутствующей микрофлоры производят 1С раствором фосфорнокислого натрия трехзамещенного. По пре ложенному нами способу в качестве смачивающего раство применен 5% раствор фосфорнокислого натрия трехзамещенно] который одновременно служит деконтаминантом. Проведенньн

в эксперименте исследования показали, что по сравнению с общепринятым предложенный способ обработки позволил сократить число проростов в 2,2-2,8 раза, уменьшить потерю микобактерий в 1,3-1,5 раза и сэкономить рабочее время, за счет сокращения числа манипуляций по переносу материала и добавлению деконтами-нанта.

Разнообразные материалы, используемые для изготовления тех или иных предметов, могут, вероятно, оказывать влияние на уровень загрязненности микобактериями. Для изучения зависимости выделения микобактерий от вида материала на поверхность образцов из стекла, металла, керамики, кожзаменителя, линолеума, пластмассы, плексигласа, а также на поверхности, покрытые различными красителями, наносили взвесь микобактерий, а образцы из хлопчатобумажных, шерстяных и синтетических тканей в зависимости от их влагоемкости пропитывали суспензией с различной концентрацией микобактерий, таким образом, чтобы на 100 см2 каждого образца приходилось 1000 микробных клеток. Смывы с образцов производили поролоновыми тампонами. Наибольшее количество микобактерий было выделено со стекла -115,5+0,5 колоний. Эта величина условно была принята за 100% и относительно нее была вычислена массивность выделения микобактерий для других материалов в процентах. Это позволило разделить все исследованные материалы на 5 групп. К I группе материалов, кроме стекла, отнесены также металл, фаянс и эмалевое покрытие, с поверхности которых выделено 96,8% микобактерий от числа обнаруженных на стекле. С поверхностей, покрытых синтетическими лаками, масляной или водоэмульсионной красками (II группа материалов) было выделено в среднем в 2,0 раза меньше микобактерий; с поверхностей пластмассы, полистирола, плекси-

гласа, линолеума, кожзаменителя (Ш группа материалов) меньше в 3,0 раза, а с поверхностей хлопчатобумажных и шер стяных тканей (IV группа материалов) - в 4,3 раза меньше, чем поверхности стекла (Р <0,001). Следует отметить, что массивност выделения микобактерий с поверхности синтетических ткане была крайне низким и составляла 1-2 колонии.

Согласно существующему методу смывы с различных пре/: метов проводят с одинаковых площадей без учета вида материал; Это может привести к неправильной оценке степени загрязнег ности микобактериями в условиях их выделения во внешнки среду. Для повышения достоверности исследований определен: минимально-оптимальные площади исследования для различны материалов, величины которых находились в обратнс пропорциональной зависимости от показателей выделения микс бактерий: для материалов I группы - 500 см2 ; для материалов группы - 1000 см2; для материалов III группы - 1500 см2, для мг териалов IV группы - 2000 см2.

На микобактерии, находящиеся во внешней среде, разли* ные физические и химические факторы оказывают неблагоприя' ное воздействие, поэтому особое значение приобретают щадяиц-методы их культивирования. Для улучшения ростовых свой с: разработана специальная полужидкая питательная среда, в а став которой входят биологические продукты - желток куринь яиц и лошадиная сыворотка, которые повышают питательнь свойства среды, ускоряя рост микобактерий, но обладают ингиб] рующим действием на них. Поэтому для инактивации ингибит ров проводят прогревание Желтка и сыворотки при 56° С в теч ние 40 минут. Кроме того, в состав среды введен диметилсул фоксид, повышающий проникновение питательных веществ че-

рез клеточную стенку бактерий, а для углеводного питания использована натриевая соль пировиноградной кислоты. В качестве бактерицидного красителя применен малахитовый зеленый, обладающий оптимальным противомикробным действием на сопутствующие микроорганизмы и не оказывающий выраженного угнетающего действия на микобактерии. При использовании новой питательной среды для выращивания тест-штаммов и культур, выделенных от больных, а также для посева мокроты сроки роста микобактерий сократились в среднем в 1,6-1,7 раза (Р<0,001), а их выделение повысилось на 5,4-10,1% (Р<0,01) по сравнению с известной средой ЪеЬек.

Таким образом, с целью совершенствования бактериологических исследований нами был разработан комплексный метод выделения микобактерий с поверхностей различных материалов, включающий в себя сбор материала тампоном новой конструкции с минимально-оптимальных площадей, модифицированную обработку полученного материала и его посев на комплекс полужидкой и плотных питательных сред. При сравнительном изучении загрязненности поверхностей различных предметов было выявлено в 1,8 раза больше культур микобактерий и уменьшено число проростов в 2,2-2,8 раза с помощью нового метода по сравнению с существующим.

С использованием предложенного метода выделения микобактерий было проведено 351 исследование на загрязнен- ность микобактериями в 16 различных подразделениях противотуберкулезной службы Свердловской области. Была определена загрязненность микобактериями предметов и конструкций, наиболее широко встречающихся в помещениях противотуберкулезных

учреждений. Это были поверхности стен, подоконников, дверей вентили кранов; раковины; линолеум; мебель; лечебно - диагностическая аппаратура и лабораторное оборудование, изготовленные из современных материалов.

Посев материала после смывов проводили на три питательные среды: полужидкую, Левенштейна-Иенсена и "Новую". Наилучший и ранний рост микобактерий получен при посеве материала на полужидкую среду с последующим пересевом на сред} "Новая": туберкулезных - на 21-27 сутки, атипичных- на 8,300,5 сутки. Применение полужидкой среды для посева смыва позволило дополнительно выделить микобактерии в 17,2% случаев. Ми-кобактерии вырастали в 1,7 -1,9 раза быстрее при предварительном посеве материала смывов на полужидкую среду, чем пр!< прямом посеве на среду "Новая" и в 2,4-2,8 раза быстрее, чем не среде Левенштейна-Иенсена (Р<0,01).

Из 351 исследования в 58 были выделены микобактерии По результатам проведенной идентификации с использование!» бактериологических, биохимических и биологических методов (2292 исследования) 14 культур отнесены к туберкулезным мико-бактериям человеческого вида, что составило 24,1% от общего количества выделенных микобактерий. Кроме того, 7 культур отнесены к фотохромогенным микобактериям, 9 - к скотохромогеннык микобактериям, 8 - к нефотохромогенным микобактериям и 2( культур - к быстрорастущим.

Определена лекарственная чувствительность микобактерий к 5 препаратам, применяемым в терапии туберкулеза: стрептомицину, тубазиду, ПАСКу, этионамиду, этамбутолу, рифампицину, ка-намицину и тибону. Установлено, что пять культур микобактерш туберкулеза, выделенных в противотуберкулезных учреждениях,

были чувствительны ко всем 8 препаратам, остальные 9 были устойчивы к 1-5 препаратам. Нужно отметить, что все девять устойчивых культур в разной степени были устойчивы к тубазиду. Наиболее частым было проявление устойчивости к сочетанию ту-базида со стрептомицином - у 5 культур микобактерий туберкулеза.

В отличие от микобактерий туберкулеза нетуберкулезные мико-бактерии проявили более высокую устойчивость к противотуберкулезным препаратам. Большая часть культур была устойчива к 5-8 противотуберкулезным препаратам (79,2% медленнорастущих нетуберкулезных микобактерий и 80,0% - быстрорастущих). Культуры микобактерий туберкулеза, обнаруженных в помещениях противотуберкулезных учреждений, обладали различной вирулентностью для морских свинок. Исходя из общепринятых критериев оценки вирулентности микобактерий (P.O. Драбкина, 1963) три культуры микобактерий туберкулеза, выделенные в помещениях противотуберкулезных учреждений, были высоковирулентны для морских свинок, а еще четыре обладали средней степенью вирулентности. Остальные 7 культур туберкулезных микобактерий можно было отнести к микобактериям со слабой степенью вирулентности.

В помещениях противотуберкулезных учреждений более всего были загрязнены микобактериями вентили кранов, раковины, дверные ручки (микобактерии обнаружены в 30,5% случаев, Р<0,05). С поверхностей медицинской аппаратуры и оборудования микобактерии выделены в 18,7%, а с поверхностей помещений - в 9,6% случаев. Из 14 культур туберкулезных микобактерий 9 выделены в производственных помещениях бактериологических ла-

бораторий (по две - с внутренней поверхности термостата и с поверхности люминесцентного микроскопа, еще две - с вентилей кранов в боксах, используемых для идентификации микобакте-рий; по одной культуре - с баночки с мокротой больного туберкулезом, с подоконника в боксе и со стола для приема анализов). Е стационарных и диспансерных отделениях обнаружено 5 культур МБТ, из них две найдены на ингаляторной трубке и на подоконнике в ингалятории; две - на ручке двери и на стене в зоне дыхания в кабинете диспансерного приема и одна культура - на вентиле крана в туалете для больных урологического отделения.

При экспериментальных исследованиях нами установлено что выявляемость Микобактерий зависит от вида материала, ш который наносилась культура этих микроорганизмов. Поэтом} определенный интерес представляло изучение обсемененноста различных материалов в помещениях, где происходит выделение микобактерий от больных во внешнюю среду. Определено, чт< наибольшей была загрязненность микобактериями. поверхностей материалов III группы (пластмассы, полистирола, плексигласа кожзаменителя, линолеума) - в 31,6% случаев были обнаружень микобактерии. Значительно меньше были показатели загрязненности микобактериями материалов I группы (эмалевых покрытий стекла, металла, керамики) - 17,5% (Р1-ш<0,05) и материалов I группы (покрытий синтетическими лаками, масляной и водоэмульсионной краской - 10,5% (Рп-ш<0,05). На хлопчатобумажные тканях (больничных халатах, белье и др.) микобактерии не был» обнаружены.

Туберкулезные микобактерии были найдены на поверхности} материалов, принадлежавших ко всем трем группам, но нескольк< больше их также выделено с поверхностей материалов III группы

(42,9% от общего числа выделенных микобактерий), меньше (35,7%) - с поверхностей материалов I группы (Рмц>0,05) и 21,4% -с поверхностей материалов II группы (Pi_ni<0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что в помещениях противотуберкулезных учреждений, где происходит скопление больных туберкулезом и выделение возбудителя во внешнюю среду, наиболее загрязненными микобактериями являются поверхности и предметы, изготовленные из пластических материалов (пластмассы, плексигласа, линолеума и т.д.), что нужно учитывать при проектировании противотуберкулезных учреждений, а также при проведении дезинфекционных мероприятий.

- ВЫВОДЫ

1. Массивность выделения микобактерий, выделенных больным во внешнюю среду и адсорбированных на поверхностях различных материалов, повысилось в 1,8 раза с помощью разработанного нами метода.

2. Применение разработанной нами полужидкой питательной среды привело к дополнительным находкам микобактерий в 17,2% случаев и сократило сроки их роста в 1,7-1,9 раз.

3. Степень выявления микобактерий зависит от вида материала: при одинаковом загрязнении (10 микробных тел/см2) она максимальна для стекла - 115,5 колоний и минимальна для синтетических тканей - 1-2 колонии.

4. Для оценки степени загрязнения микобактериями различных материалов необходимо проводить исследования с минимально-оптимальных площадей, величина которых обратно пропорциональна выявляемости микобактерий и составляет для стекла, керамики, эмалевых покрытий - 500 см2; для поверхностей, покрытых красителями - 1000 см2; для пластмассы, кожзаменителя, линолеума - 1500 см2, для хлопчатобумажных и шерстяных тканей -2000 см2.

5. Поверхности оборудования и предметов в помещениях противотуберкулезных учреждений загрязнены микобактериями е зависимости от вида материала, из которого они изготовлены (от 9,6 до 30,5% случаев).

6. В условиях выделения микобактерий во внешнюю средз наиболее массивно (в 31,6% случаев) загрязнены микобактериями предметы, изготовленные из пластических материале)! (пластмассы, полистирола, линолеума и т.д.).

7. Туберкулезные микобактерии, обнаруженные на поверхностях различных материалов, сохраняли вирулентность (21,4% были высоковирулентны и 28,6% - средневирулентны для морекга свинок).

РЕКОМЕНДАЦИИ В ПРАКТИКУ

1. Разработанный метод выделения микобактерий с поверхно стей различных материалов может быть использован- для оценю

степени загрязненности микобактериями и контроля качеств; дезинфекции в помещениях противотуберкулезных учреждений ] в очагах туберкулеза.

2. Посев материала, полученного при смывах с различных предметов, целесообразно производить на комплекс питательных сред, в который входит полужидкая питательная среда обогащения.

3. Исследования на загрязненность микобактериями рекомендуется проводить с минимально-оптимальных площадей, величина которых зависит от вида исследуемого материала.

4. При проведении дезинфекционных мероприятий в помещениях противотуберкулезных учреждений необходимо учитывать, что загрязненность микобактериями зависит от вида материала и наиболее высока для предметов, изготовленных из пластических материалов (пластмассы, полистирола, плексигласа, линолеума и т.д.).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зуева М.Н., Самусевич Л.И., Шегежды Э.П. Усовершенствованный способ получения смывов для обнаружения микобак-терий на объектах внешней среды //Лабораторное дело. - 1990. -№1. - С. 50-52.

2. Зуева М.Н., Мордовской Г.Г., Корелина Е.А., Кравченко М.А., Костина Г.И. Эффективность применения полужидких питательных сред нового состава в бактериологической диагностике туберкулеза // XI Всероссийского Съезда фтизиатров'. Сб. резюме. - Л., 1992. - С. 245-246.

3. Зуева М.Н. Загрязненность микобактериями туберкулеза рабочих мест персонала противотуберкулезных учреждений // II (XII) Всероссийский Съезд фтизиатров: Тезисы докладов. - Саратов, 1994. - С 55-56.

ИЗОБРЕТЕНИЕ

Зуева М.Н. Питательная среда для выделения микобакте рий. - Авторское свидетельство № 1767880 от 8 июня 1992 г. , за явка № 4859748, приоритет 15 августа 1990 г. (соавторы Должан ский В.М., Мордовской Г.Г.).