Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференциация М. TUBERCULOSIS и W. BOVIS от атипичных видов микробактерий методами ДНК-ДНК гибридизации и полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Дифференциация М. TUBERCULOSIS и W. BOVIS от атипичных видов микробактерий методами ДНК-ДНК гибридизации и полимеразной цепной реакции"

РГ5 OD

22 ^Ь"бсер&сййския научно-исследовательский институт

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.КОВАЛЕНКО.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

МАЛЬКОВ ИГОРЬ ГЕННАДИЕВИЧ

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ М. TUBERCULOSIS И М. BOVIS ОТ АТИПИЧНЫХ ВИДОВ МИКОБАКТЕРИЙ МЕТОДАМИ ДНК-ДНК ГИБРИДИЗАЦИИ И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

03.00.2Э - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в лаборатории санитарной микробиологии Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии и лаборатории молекулярной биологии и биохимии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители - академик РАСХН, доктор ветеринарных наук,

профессор

В.С.Ярных

- академик РАСХН, доктор бипгогическик наук профессор Г.Ф.Коромыслов

- доктор ветеринарных наук А.В.Куликовский

Официальные оппоненты: - доктор ветеринарных наук, проф.

Н. П. Овдиенко - кандидат медицинских наук В.И.Хаустов

Ведущее учреждение - Всероссийский государственный научно-исслвдр-вагельский институт контроля, стандартизации \ серпийикзцш ветеринарных препаратов (ВПНКИ)

Защита состоится " !3> " O.Hf-ejS^ 1993 г. в / f часов на заседании специализированного Совета К.020.29.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко (109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан "_"_1993 г.

Учёный секретарь специализированного Совета, кандидат ветеринарных наук

Ф.Г.Терешков

- 3 -

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ыикобактерии широко распространены вс внешней среде, но особое положение среди них занимают микобакте-рии туберкулёза, вызывающие заболевание людей и животных.

Из сельскохозяйственных животных наиболее часто поражается туберкулёзом крупным рогатый скот. Размеры экономического ущерба от этого заболевания в различных хозяйствах неодинаковы и зависят от эпизоотической ситуации и формы течения болезни, степени выявления бодышх животных, величины затрат на противотуберкулёзные мероприятия. По оценке А.Г.Жилинского с соавт. (1986) и П.С.Кау-рова (1988), экономический ущерб в результате заболевания одного животного в молочно-товарном хозяйстве составлял 403,4 руб., а в племенном - 1819 руб. (по.ценам 1988 года).

Эта проблема до настоящего времени актуальна для многих регионов России, в которой ежегодная заболеваемость крупного рюга-того скота туберкулёзом составляет около 27. от имеющегося поголовья-(В.М.Авилов, В.Ф.Пылинин, 1992).

Одной из особенностей туберкулёза как типичной хронической инфекции является преобладание латент/ых форм и случаев бактерионосительства. Клинические признаки болезни у крупного рогатого скота возникают лишь.при длительном течении инфекции и особо неблагоприятных условиях его содержания и кормления.

Основной для прижизненной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота является туберкулиновая проба. Однако нередкими являются случаи возникновения парааллергической реакции на туберкулин, вызываемой некоторыми атипичными микобактериями. Это делает необходимым проведение специальных патологоанатомичес-ких, бактериологических и аллергологических исследований с учётом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни. При послеубойном осмотре реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота не всегда удаётся установить туберкулёзные изменения во внутренних органах и тканях животных (А.И.Кузин, 1987). Лабораторные исследования на туберкулёз проводятся в срок до 3 месяцев, а в Некоторых случаях могут занимать до полугода. Кроме того выявление инфекционного агента при туберкулёзе может Сыть осложнено из-за наличия у микобактерий ультрамелких и Ь-форм. Родовую и видовую идентификацию з этом случае осуществляют на -основании

сохранения у них признака кислотоустойчивости либо путём получения ревэрсий в исходную бактериальную форму при пассировании на серии специальных сред с осмотическим протектором, либо при заражении чувствительных лабораторных животных. На проведение таких исследований затрачивается до двух лет (И.В.Коваленко, 1989). В связи с этим создание высокочувствительных экспресс-методов индикации и идентификации микобактерий, независимых от формы микобак-терий и позволяющих в ряде случаев разрешать спорные вопросы, которые не могут быть решены традиционным методам исследований, до сих пор продолжает оставаться актуальной проблемой и является одним из важнейших направлений научных исследований по туберкулезу. Цель и зада1 di исследований. Целью данной работы является разработка комплексного метода дифференциации М. tuberculosis и tí. bovis от атипичных видов микобактерий на основе современных направлений молекулярной генетики - с помощью реакции ДНК-ДНК гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1) усовершенствовать метод приготовления лизатов из культур йико-бактерий для использования их в реакции ДНК-ДНК-гибридизации;

2) разработать метод приготовления лизатов из культур микобактерий для постановки реакции цепной полимеризации;

3) усовершенствовать метод дифференциации культур М. tuberculosis и М. bovis от атипичных видов микобактерий в реакции ДНК-ДНК гибридизации с помощью ДНК-зонда МБ-01, меченного нерадиоактивной меткой;

4) создать диагностическую систему для дифференциации микобактерий человеческого и бычьего видов от атипичных видов микобактерий на основе использования полимеразной цепной реакции.

Научная новизна работы. Впервые в отечественной науке проведены исследования по созданию диагностической системы для дифференциации культур М. tuberculosis и М.bovis от атипичных видов микобактерий методом полимеразной цепной реакции, позволяющим проводить исследования в течение 5-6 часов и получать высокодостоверные результаты. Доказана высокая чувствительность разработанного метода, с помощью которого можно улавливать до 100 клеток в образце методом rejib-электрофореза.

Впервые разработан метод нерадиоактивного (с помощью дигок-сигениновой ферментной метки) выявления микобактерий бычьего и

- Б -

человеческого ьидов на основе ДНК-зонда МБ-01, чувствительность которого позволяет улавливать до Ю4 клеток ь образце.

Созданы методы быстрого и эффективного разрушения плеток и получения лизатов микобактерий, пригодных для использования при постановке реакции ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР. Практическое значение работы. Показана возможность использования ДНК-зондз МБ-01, меченного ферментной (дигоксигениновой) меткой, для дифференциации культур млкобактерий туберкулёза челоьгческого и бычьего видов от атипичных видов микобактерий.

Подобрана пара олигонуклеотидов, на основе которой предложен экспресс-метод дифференциации микобактерий М. tuberculosis и tí. bovis от атипичных видов с помощью ПЦР. Отработаны условия и режимы постановки реакции амплификации.

Разработанные методы.подготовки клеток микобактерий для исследований с помощью ДНК-зондов' и ПЦР являются основой для выявления М. tuberculosis и М.bovis в патматериале.

По результатам проведённых исследований разработаны методические рекомендации по дифференциация культур И. tuberculosis и • М.bovis от атипичных микобактерий методом полиыеразной цепной реакции (ПЦР)".

Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены на научной конференции,, посвящённой 70-летию лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилакти'Ш туберкулёза и паратуберкулёза ЕИЭВ, на межлабораторном научно-производственном совещании сотрудников л^ораторий санитарной микробиологии, технологии ветсанмероприятий, ветсринарнэ-санитарной экспертизы мяса, санитарии молока и профилактики маститов, сектора санитарии очистных сооружений Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии гигиены и экологии и лаборатории молекулярной биологии и биохимии Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии РАСХН от 5 февраля 1993 года. Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 работа и 3 работы сданы в печать.

OörfMjjri^oTH. Материалы диссертации изложены на 121 странице машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, ой-зср литературы, материалы и метод.., результаты собственных исследовании, обсуждение результатов, выводы и список литературы, содержащий 133 отечественных и иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 15 рисунками.

- 6 -

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и -биохимии ВИЭВ и лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГЭ.

Коллекционные штаммы микобактерий были получены из Государственного института стандартизации и контроля им. Тарасевича (ГИСК), Всероссийского государственного научно-контрольного института ветпрепаратов (ВГНКИ) : коллекции Всероссийского института экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ) - всего 37 штаммов. Клетки выращивали на среде Левенштейна-Йенсена и Сотона.

Рекомбинантная плазмида рМБ-01, созданная на основе плазмиды pBR322 и несущая вставку МБ-01, представляющую собой видоспеци-фичный участок генома A¡.bovis -BOG была нам любезно предоставлена Я.А.Бортиком. Накопление ДНК-зонда проводили в составе рекомби-нантной плазмиды рМБ-01, трансформированной в клетки E.coli JM109 по методике, предложенной Mandel и Higa (1970). Выделение плаз-мидиой ДНК в препаративных количествах проводили модифицированным методом щелочного лизиса (Birnbolm Н.С., Doly J., 1979). Рес1рик-цио рекомбинантной плазмиды проводили с использованием рестрикта-зы Pstl.

ДНК из микобактерий выделяли по методу Ыармура (1961).

С целью облегчения процедуры приготовления препаратов микобактерий, пригодных для исследоганий методом ДНК-ДНК зондов и ПЦР, были испытаны три способа обработки клеток микобактерий: ли-зирующим раствором - 0,2 М ЫаОН, IX ДСН (додецил сульфат натрия); смесью равных объёмов лизирующего раствора и хлороформа; встряхиванием на шейкере со стеклянными бусами.

Для электрофоретического разделения молекул ДНК использовали оборудование фирмы "Pharmacia" (Швеция).

Включение радиоактивно-меченых нуклеотидтрифосфатов в ДНК проводили методом "ник-трансляции", (Rigby P.W.J.et al., 1977), а также достраиванием одноцепочечйых молекул с помощью большого фрагмента ДНК-полимеразы I (фрагмент Клёнова) и рассеянной затравки (смеси гексануклеотидов).

ДНК-ДНК гибридизацию проводили в запаянных полиэтиленовых пакетах в течение 14-16 часов при температуре 52°С. В состав гиб-рвдивационной смеси входили следующие компоненты: 50%-ный форма-мид, Б-кратный раствор Денхардта, 2-кратный раствор ССР (стан-

дартном солевом растворе) , О, IX ДСП, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 0,5-1 мкг ДНК денатурированного меченого зонда. Для предотвращения неспецифического связывания ДНК-зонда перед постановкой реакции гибридизации фильтры гибридизовали в течение 4 часов в гибрвдизациониом растворе без ДНК-зонда в тех ке условиях. По скончании гибридизации фильтры отмывали 2 раза по 15 мин. в 2-кратном ССР , 0,1% ДОН (, при комнатной температуре и 2 раза по 15 мин. ' в 0,1-кратном ССР, 0,1% ДСП, при температуре . Б2°С. После отмывки фильтры высушивали при комнатной температуре и экспонировали с рентгеновской пленкой РВ-М в кассете с усиливающим экраном при минус 70°С.

Перенос ДНК из агарозных гелей на нейлоновые и нитроцеллю-лозные фильтры проводили методом капиллярного восходящего блотин-га по Саузерну (Т.Маниатис с соавт., 1984):

Нерадиоактивное мечение ДНК проводили с помощью набора для мечения дигоксигениновой ферментной меткой фирмы Boehrlnger Mannheim (ФРГ) по инструкции изготовителя.

Праймеры для постановки ПЦР выбирали из последовательности • ДНК, кодирующей белок MbaA (J.E.R.Thole с соавт., 1987).

Компьютерный анализ проводили на персональном компьютере IEM PC AT, процессор - 80286, с использованием компьютерных программ "DNASIS" и "PR0SIStnl" (Pharmacia LKB Biotechnology, Sweden).

Объем реакционной смеси составил 50 мкл. Для амплификации использовали либо препараты ДНК (10 нг - 1 фг), либо лизаты мико-бактерий (107 - 1 кл.). Праймеры добавляли по 10 пМ каждого. Концентрация dMTP (dATP, dCTP, dGT°, dTTP) составила 50-250 мкМ каждого. Реакционный буфер содержал: 50 мМ КС1, 10 мМ Tris-HCl, рН 8,5, 4,0 мМ MgCl2 и 0,012 желатина. Полиыеразу Therms aquatlcus (Taq) (НПЦ "Виопол") вносили по 1 ед. в каждую пробирку. На реакционную смесь наслаивали по 50 мкл минерального масла. Реакцию проводили в 35-45 циклов в амплификаторе "Blotherm'91" при следующих режимах: 1 зона - 63°С, 1,0 мин.; 2 зона - 72°С, 2,0 мин.; 3 зона - 93°С, 1,5 мин.. После окончания амплификации отбивали по 10 мкл из каждой пробирки и анализировали с помощью - те^ рофореэа в 2Х-ном ага^озном геле при напряжении тока 120 воль; в течение 1 часа, а также в реакции гибридизации после переноса ДНК на нитрз-целлюлозные фильтры по методу, предложенн му Саузеряом.

Результаты гель электрофореза фотографировали на фотопленку "Микрат-йОО" и уценивали с помощью лазерного денситометра

L¡11roscan XL, Llffi (Швеция) к компьютерной обработки данных.

2.2.Результаты исследований

2.2.1. Дифференциация М. tuberculosis и М.bovis от атипичных видав микобакгерий методом ДНК-зондов с использованием лиэирующего раствора

Процедура выделения ДНК из микобактерий, особенно из небольших количеств (103-105 клето'1, является относительно длительной (1-2 дня) и трудоёмкой. Поэтому одной из задач в развитии данного подхода при идентификации микобактерий туберкулёза является отработка методов подготовки образцов патматериала и изыскание способов приготовления из них препаратов, пригодных для исследований геннопнженерными способами. Основные трудности в этом направлении связаны с особенностями структуры клеточной стенки микобактерий, ев устойчивости к воздействию химических реагентов.

Нами был испытан метод обработки культур микобактерий лизи-рующим раствором с последующим нанесением лизатов на нитроцел-ио-лозные фильтры. Результаты реакции ДНК-ДНК гибридизации с использованием в качестве ДНК-зонда фрагмента М.bovis ВОв МБ-01 показали принципиальную возмсвг'ость такого подхода. В то же время было отмечено, что кроме М.bovis и М.tuberculosis положительные сигналы с ДНК-зондом давали также некоторые атипичные ми-кобак-ерии {Ы.avium, M.kansasii M.lntracellulare Р-54). Кроме того учёт результатов реакции осложнялся отслоением тонких пленок с поверхности фильтров, что приводило к засветке рентгеновской плёнки преимущественно по периферии точек нанесения исследуемых препаратов микобактерий, затрудняя учёт результатов реакции. Наблюдаемая картина может быть объяснена прилипанием жировосковых веществ, входящих в состав клеточной стенки микобактерий, к поверхности нитроцеляшозных фильтров, что препятствовало эффективному прохождению реакции гибридизации.

Для устранения данных недостатков мы использовали дополнительное введение в лизируюшую смесь неполярного растворителя -хлороформа, растворяющего липиды и обладающего депротеинизирувдим действием. Сравнительный анализ эффективности воздействия лиэирующего раствора ,и смеси лизирущего раствора с хлороформом на клетки микобактерий показал, что во втором случае выхоп белка при 20 минутной экспозиции увеличился в 3 раза (рис. 1). Дальнейшая

к

выдержка суспензии М.В-5 с лизирувдим раствором Еьэывала деградацию белков, о чем свидетельствовали уменьшающиеся значения их количества в период времени от 20 минут до 1 часа. Следовательно, оптимальным значением экспозиции лизирующего раствора с клетками микобактерий можно считать 10-15 минут. За этот период времени лизирует основная масса клеток. При более длительной выдержке значительно увеличивается вероятность разрывов в молекулах ДНК и образования множества мелких фрагментов, которые, в свою очередь, могут быть причиной параспецифического связывания ДНК-зонда при постановке реакции гибридизации.

Вместе с тем, при использовании одного лизирующего раствора или одного хлороформа не было отмечено существенного выхода белка в раствор, что свидетельствовало о низкой эффективности разрушения клеток микобактерий. .

0.4

8 0.3^ О

к

' 0.2 М

н л

р..

1.

Ъ 2. 9 3.

'0.

ж.

" ■ ■ * ■ ■ ■ ■ I' ■ ■ ■ * * ■ ■ ■ * ■ • ■ ■ I ■ ■ ■ ■ I

0 10 20 30 40 50 60 ВРЕМЯ, МИН.

Рис.1. Динамика выхода белса при обработке клеток М.В-5 хлороформом (Ь, см? -ью лидирующего раствора с хлороформом (2) и дизирую-щим растьор^м без хлоре¡,.т'мп (3)

С учётом полученных данных метод обработки клеток смесью ли-аирующего раствора с хлороформе»! был испытан при приготовлении образцов культур микобактерий для постановки реакции ДНК-ДНК гибридизации (рис.2). При анализе результатов реакции гибридизащш с образцами микобактерий, приготовленными таким способом было отмет чено, что полученные сигналы имеют более чёткий характер, а гиб-ридизационные пятна в - местах нанесения Ы.Intracellular*. M.scrofulaceum, U.kansasll и Н.'avium были значительно слабее, чем у М. tuberculosis-и М.bovis.

Таким образом, можно едэлать вывод, что способ подготовки клеток микобактерий к постановке реакции ДНК-ДНК гибридизации с помощью смеси лизирующего раствора с хлороформом обладает опреде-

1 2

3

4

5

А Б В Г

а) ДНК-зонд - вставка из рекомбинантной ' плазмиды рМБ-01.

б) ДНК-зонд - рекомбинан-тная плазмида рМБ-01.

Рис. 2. Идентификация микобактерий туберкулёза, обработанных ли-зирующим раствором с добавлением хлороформа методом ДНК-зондов •

А: 1 - Ы. tuberculosls H37RV, 2 - М. tuberculosls; 3 - М. bovis ВСв;

4 - М.bovis Vallee; 5 - Ы.bovis Ravenel Л: 1 - Н. bovis Baite; 2 - М.bovls-622; 3 - М.bovis Виноградов-, 4 -

М. bovis Bovlnus-8; 5 - М. avium Б; 1 - M.avlum-780; 2 - M.kansasll; 3 - hl.scrofulaceum; 4 -

M.B-5; 5 - M.lntracellulare г: 1 - U. triviale-, 2 - M.fortultum; 3 - M.phlel; 4 - ДНК-гонд (200 пг); 5 - ДНК-зонд (20 нг).

ленными преимуществами. Данный метод разрушения кислотоупорных микроорганизмов прост в исполнении, даёт возможность в короткие сроки - до 30 мин. - подготавливать культуры клеток для исследований с помощью гибридизационных зондов и, вместе с тем, позволяет повысить специфичность реакции гибридизации, по-сравнению с методом обработки клеток микобактерий одним лизирующим раствором. Кроме того, он значительно менее трудоёмкий, чем способ выделения ДНК по методу предложенному Дж.Мармуром (1961) и позволяет регистрировать микроколичества клеток - до 104 (см. результаты определения чувствительности реакции ДНК-ДНК гибридизации с использованием дигоксигенииовой метки).

Другим положительным моментом, установленным нами в экспериментах, явилось то, что при учёте результатов реакций ДНК-ДНК гибридивации, в которых в качестве ДНК-зондов использовали как

А Б

и о 1

! О о]

. Г) ф 1 О. ,

0 ;

1

1

i. |

Рис.3. Результаты определения чувствительности реакции ДНК-ДНК гибридизации при использовании ДНК-зонда МБ-01, меченного дигоксигенииовой меткой

А - клетки М.bovis ВС6 в 10-кратных разведениях (107 до 1), обработанные лизирующим раствором

Б - клетки М.bovis ВОЗ, в 10-кратных разведениях (107 до 1), обработанные смесью л зиру-ющэго раствора с хлороформом.

сам фрагмент МБ-01 так и рекомбинантную плазмиду рМБ-01, полученные гибридизационные пятна оказались идентичными. Это даёт возможность использовать рекомбинантную плазмиду рМБ-01 при исследовании культур микобактерий и тем самым упростить процедуру приготовления ДНК-зонда к постановке реакции, минуя стадию рестрикции и очистки ДНК-вставки.

В то же время следует отметить, что широкое использование -метода ДНК-ДНК гибридизации на практике лимитировано из-за неудобств и ограничений, связанных с применением радиоактивных изотопов, используемых для мечения ДНК-зонда. В связи с этим одной и в задач стоящих перед нами при выполнении данной работы было разработать метод выявления микобактерий бычьего и человеческого видов с использованием ДНК-зонда МБ-01, меченного ферментной меткой. Для этого нами был использован набор для мечения ДНК дигок-сигениновой меткой фирмы Boehrlnger Mannhelm (ФРГ). ДНК-зонд МБ-01, приготовленный таким способом, гибридизовали с лизатами М. bovis ВСв. Одновременно устанавливали эффективность лизиса клеток различными методами. Сравнительный анализ методов обработки культур микобактерий лизирующим раствором с хлороформом и Cea него с использованием ДНК-зонда, меченного ферментной меткой, показал, что при дополнител!ном внесении в лизирующий раствор хлороформа эффективность результатов реакции ДНК-ДНК гибридизации повышалась в 10 раз и позволяла улавливать до 104 клеток в образце, по сравнению с 105 клетками, которые регистрировали при обработке микобактерий одним лизирующим раствором (рис.3).

По своей чувствительности ДНК-зонд, меченный ферментной меткой, не уступает радиоактивно меченному зонду, с помощью которого удавалось зарегистрировать 3,9х10"эг тотальной ДНК, что эквивалентно 5х104 микробных тел (Я.А.Бортюк, 1991). Это позволяет применять его для получения первичных данных ещё до образования видимых колоний на питательных средах и давать предварительное заключение о возможности присутствия микобактерий туберкулёза в исследуемой культуре. Количество клеток микобактерии вида Ai. tuberculosis или М. bovis, необходимое для регистрации данным методом, может быть получено уже через 1-2 недели после посева на среду Левенштейна Йенсена.

Недостатком ДНК-зонда МБ-01 является то, что при использовании лизатов микобактерий, приготовленных из больших количеств . бакмассы (20-30 мг), он может слабо гибридизоваться с некоторыми f

атипичными видами. ' В связи с этим при постановке реакции ДНК-ДНК гибридизации в TáKOM исполнении необходимо одновременное использование контрольных образцов (микобактерий бычьего и птичьего видов) , в той же концентрации, что и исследуемые культуры. Это позволяет уменьшить вероятность ошибочной интерпретации результатов.

По результатам реакции ДНК-ДНК гибридизации, полученным нами в экспериментах, можно сделать заключение, что ДНК-зонд МБ-01 позволяет проводить первичный скрининг выращенных на питательных Средах культур микобактерий. Отсутствие положительного сигнала в реакции ДНК-ДНК гибридизации с испытуемыми лизатами микобактерий свидетельствует о принадлежности исследуемых клеток к иным видам, чем М. tuberculosis- М.bovis. В случае прохождения реакции гибридизации с ЧНК-зондом, окончательное отнесение полученных культур к видам М. tuberculosis- М.bovis может быть сделано по относитель-. ной яркости гибридизационных пятен по сравнению с контролями, в качестве которых принимаются М. bovis - положительный и М.avium -отрицательный контроль.

2.2.2. Разработка метода дифференциации М. tuberculosis и М. bovis от атипичных видов микобактерий на основе полимеразной цепной реакции

В собственных исследованиях нами предпринята попытка разработать некоторые подходы для повышения вероятности определения уникального фрагмента ДНК из последовательности, кодирующей белок, и подборе на этой основе видоспецифичных праймеров для создания оригинальной диагностической системы с использованием полимеразной цепной реакции, а также создать метод подготовки клеток микобактерий, пригодный для её выполнения.

При выборе мишени для амплификации мы руководствовались тем, что, антигенные детерминанты, как правило, находятся в областях, имеющих высокую гидрофильность. Чем больше она выражена у данного участка белка, тем рельефнее антигенная детерминанта и следовательно выше вероятность его специфичности. Таким образом, мы полагали наиболее вероятным, что интересующая нас область белка, являющаяся специфичной для М. tuberculosis и М.bovis, должна располагаться именно в таком регионе.

Поскольку любая белковая последовательность закодирована в ДНК, то поиск видоспецифичного участка, перспективного в качестве

мдаени для амплификации, проводили к последовательности, кодирующей участок белка, в котором гидрофильные участки превалировали над гидрофобными.

Исследования при выборе мишени для постановки реакции амплификации проводились на базе нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, в состав которого входили как родо- так и видо-специфичные участки. В качестве объекта исследований был выбран белок МЬаА, так как, по данным T.M.Shlnnlc (1987), в нем содержатся как уникальные для Ai. tuberculosis, так и общие с другими видами микобактерий эпитопы.

Сиквенс, в состав которого входил ген, кодирующий белок МЬаА, содержал 2431 нуклеотидную пару. Наиболее протяжённый регион, включающий открытую рамку считывания и кодон терминатор, был определен с позиции 576 до позиции 2295 и насчитывал 1721 нуклеотидную пару. Такая протяженность нуклеотидной последовательности . позволила широко варьировать при подборе праймеров к выбранным участкам, кодирующим те или иные антигенные детерминанты.

Мишенью для амплификации при постановке ПЕР служил участок, кодирующий регион этого белка с наибольшим индексом гидрофильнос-ти и наименьшим гидрофобности (407-514 аминокислотный остаток). Для постановки полимеразной цепной реакции использовали олигонуклеотиды, фланкирующие данный участок'ДНК (табл. 1).

Таблица 1

Нуклеотидные последовательности и занимаемые позиции праймеров

NN nn наименование праймеров цепь ДНК нуклеотидные последовательности позиция

1. pr64i позитивная 5'-TGGGGGTGTQAC6CT3TTGC-3' 1811-

1830н.п.

2. рг64г негативная 5' -CCTCOCTr^QACTTCTCQCXJ- 3 * 2203-

12222н.П.

Исследования данной нуклеотидной последовательности на наличие гомологичных участков проводили с использованием 37 различных последовательностей ДНК. В их число входили фрагменты геномов М. tuberculosis, «.bovis, U.leprae, M.kansasll, M.fortultum, a

тагане нуклеотидные последовательности ряда генов, имеющих высокую гомологию с последовательностями ДНК, входящими в состав микобактерий.

По результатам компьютерного анализа было установлено, что известные нуклеотидные последовательности, кодирующие белки, родственные микобактериальным и вошедшие в банки данных GenBank и ЕШЬ (Hitachi Software Engineering Co., LTD), не имеют достаточно протяжённых комплементарных регионов ни с нуклеотидными последовательностями выбранных праймеров, ни с предполагаемым продуктом амплификации. Таким образом, при успешном прохождении реакции синтезируемый фрагмент ДНК мог бы выступать в качестве ДНК-зонда при постановке реакции ДНК-ДНК гибридизации.

В опытах по определению условий и режимов реакции амплификации с данной парой праймеров было установлено, что оптимальное значение концентрации ионов М? лежит в пределах 3-3,5 мЫ, рН -8,6. Выход продукта амплификации также увеличивался с повышением концентрации праймеров. Однако, так как их избыточное количество в реакции могло быть причиной неспецифической амплификации, было выбрано значение в 10 пм, что позволяло ясно видеть полосу ДНК продукта амплификаци в агарозном геле, а риск получения ложнопо-дожительных результатов был наименьшим. При определении оптимального количества циклов реакции отмечено, что увеличение количества продуктов амплификации происходило до 45 цшла и затем начинало снижаться. Это можно объяснить постепенным ослаблением активности термостабильной ДНК-полимеразы после 45 циклов амплификации.

Оценка специфичности ПЦР с использованием выбранных праймеров на препаратах ДНК 13 штаммов микобактерий показала перспективность выбранного нами подхода при поиске участков ДНК, намечаемых для амплификации. По результатам проведённых опытов было ус' тановлено, что все препараты ДНК штаммов микобактерий человеческого и бычьего видов дали положительную реакцию, а атипичных -отрицательную, о высокой специфичности праймеров свидетельствовало также отсутствие продуктов амплификации иного молекулярного веса, чем расчётного (412 н.п.).

Дальнейшую проверку специфичности выбранных праймеров проводили на более широком спектре штаммов микобактерий. Оперативное -решение поставленной задачи было затруднено длительностью наращивания бактериальной массы и трудностями, связанными с выделением

ДНК из микобактерий. В связи с этим в наиих исследованиях мы ставили перед собой задачу предельно упростить процедуру подготовки клеток микобактерий для постановки рентами амплификации в сочетании с сохранением высокой чувствительности данного метода; обеспечить безопасности в работе и использовать минимум реактивов. С этой целью нами было испытано три метода обработки колоний мико-бактегий, в том числе с использованием лизирующего раствора, лизирующего раствора с хлороформом, а также лизирующего раствора с последующим встряхиванием на пейкере в присутствии стеклянных бус. Наилучший результат был получен при использовании последнего метода. Такой подход позволил существенно упростить процедуру подготовки культур для постановки полимеразной цепной реакции и миновать стадию выделения чистого препарата ДНК традиционными методами.

Опыты по определению чувствительности разработанного нами метода дифференциации М.tuberculosis и М.bovis от атипичных видов микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции показали, что таким способом можно зарегистрировать продукт амплификации при наличии в пробирке 100 клеток (рис. 4). Результат реакции можно наблюдать визуально после проведения гель-электрофореза. ■ Этот метод превосходит по чувствительности реакцию ДНК-ДНК гибридизации с использованием ДНК-аокда líB-01 и, в то же время, имеет громадный потенциал, который связан с возможностью увеличить его чувствительность до улавливания единичных клеток в образце. Это может быть Достигнуто, в частности, с помощью постановки реакции ДНК-ДНК гибридизации по методу, предложенному Саузериом (Т.Маниа-тис с соавт., 1984). В этом случае в качестве ДНИ-зонда может выступать продукт амплификации hl. tuberculosis- М. bovis (синтезированная в полимеразной цепной реакции копия ДНК-мишени), а мишени - продукт амплификации анализируемого образца.

Так как метод разрушения клеток микобактерий с помощью стеклянных бус в присутствии лизирующего раствора оказался наиболее эффективным при подготовке препаратов микобактерий к использованию в ЩР, то в дальнейшем подтверждение специфичности праймеров проводили на лизатах микобактерий, полученных этим способом. При атом для постановки реакции брали избыточное количество бакмассы (20-30 мг), из которого может быть выделено до 10-15 мкг ДНК. Это позволило с -кокой степенью надёжности выявил, культуры атипичных микобактррий, дающие положительный сигнал в г-акции ам;;лиЛи-

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.4. Определение чувствительности реакции ашиификацин в гель-электрофорезе с использованием юзатов И. bovis ВСЕ 1 - 107IU; 2 - 10® Kl; 3 - 10® Kl; А - 10* IU; Б - 103 Kl; 6 -102 Kl; 7 - 10 КД; 8 - 1 KJ.

калии, поскольку при определении чувствительности этого метола на препаратах ДНК в агарозном геле после проведения электрофореза был виден, специфический продукт амплификации 10 пг ДНК М.bovis BCG. В результате было установлено, что 11 гтаммоэ бычьего а человеческого видов (в том числе М.bovis BCG) дали положительную реакцию, а из 14 штаммов атипичных микобактерий полоса ДНК в продукте амплификации была зафиксирована при использовании одного из двух штаммов M.fortultm и слабые полосы - с М.avium N9 и М.avium N2282 (рис. 5). Кроме того, в треках, в которых анализировали продукты амплификации м. tuberculosis и М. bovis были видны слабые дополнительные полосы синтезированной ДНК размером около 260 н.п.. Однако, поскольку полученные неспецифические сигналы были значительно слабее, чем с микобастериями человеческого и бычьего видов, то незначительное ужесточение условий и режимов реакции позволяло рассчитывать на их устранение. В связи с этим повторную серию реакций амплификации с лизатами микобактерий проводили при

1 2 3 4 Б 6 7 8 9 10 И 12 13 14

б)

Рис. Б. Результаты реакции амплификации лизатов микобактерий

а) 1 - М. tuberculosis N192; 2 - tf. tuberculosis N5281-, 3 -U. tuberculosis dt/st; 4 - М. bovis эф16; 5 - М. bovis AN5; 6 -М.bovis Ravepel; 7 - М.bovis Ban#; 8 - Af. bovis 14; 9 - M.bovis Bovlnus-8; 10 - ; 11 - M s Vallee; 12 - M. Intracellular 15769; 13 - M. lntracellulai с 14 p8R322/Hae111.

б) 1Б - M. Intracellular N12928; 16 - M.avium H9; 17 - hl.avium ФИ; 18 - «.avium 2282; 19 - M.scrofulaceum N129; 20 -It.knsasll 2409; 21 - M. for tu 1 tum Rap d; 22 - M.fortultum N342; 23 - U.phlel-, 24. M.smegmtls; 25 - Ы.В-5; 26 -M. triviale; 27 - p8f?222/HaöIII.

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

x

I

1 2" 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

а)

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

б)

щ

1 I/

I н * i

Рис. 6. Результаты реакции амплификации лизатов микобактерий в жёстких условиях

а) 1 - М.avium N9; 2 - М. Intracellular? N12928; 3 - У. kansasl 1 N2409; 4 - M.fortultm 342; 5 - Ii. Intracellulars N4937; б -Af. Intracellulars N14773; . 7 - U. Intracellulars тк; 8 -M.scrofulaceum N123; 9 - M. Intracellulars 16Э; 10

M.Intracellulars N290/52; 11 - M.avium Ф11; 12 - M. avium 14114; 13 - M.bovis ВСв (10б кл.); 14 - pfiR322/HaeIII.

б)15- M.phlel J12312; 16 - M.fortultm Rapid; 17 - M.avium N2282; 18 - M.smgmatls; 19 - hl. avium 89; 20 -U. intracellulars N12928; 21 - N. Intracellulars N13623; 22-M. Intracellulars ГЭ; 23 - Л/. Intracellulars 21Э; 24

М. avium N2282; 25 - М. triviale; 26 - М.В-5;. Z? - ДНК Ш.bovis BCG (100 пг); 28 - pBR322/HaeU I.

«

. - 20 -

более высокой температуре отжига праймеров и в условиях более низких концентраций dNTP и термоотаОильной ДНК-полиыеравы. При дополнительной проверке праймеров на специфичность в жёстких условиях было установлено, что ни один ив 24 использованных в реакции амплификации мувейных штаммов атипичных микобактерий положительных сигналов в гель-электрофорезе не дал (рис.6). При дополнительной оценке праймеров в реакции ДНК-ДНК гибридизации по методу Саузерна с использованием в качестве ДНК-зонда очищенного продукта амплификации U.bovis vi U. tuberculosis, меченного ферментной меткой, была подтверждена их высокая специфичность.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод дифференциации ливатов М.tuberculosis и М.bovis от атипичных видов микобактерий с помощью ДНК-вонда МБ-01, повволлющий улавливать до 104 клеток. Установлено, что в результате реакции ДНК-ДНК гибридизации лиэатов микобактерий о ДНК-зондом ИБ-01 возможно возникновение слабоположительных сигналов с некоторыми атипичными видами микобактерий.

2. Показано, что рекомбинантная плаамида рМБ-01 в ' качестве гибридизационного зонда не уступает по специфичности фрагменту ДНК it. bovis ВСв - МБ-01. Это даёт . возможность испольвовать её вместо ДНК-вонда МБ-01 при дифференциации культур Ы. tuberculosis и U.bovis от атипичных видов микобактерий.

з: Разработан метод постановки реакции ДНК-ДНК гибридизации с использованием ДЧК-зонда МБ-01, меченного ферментной (дигокеи-гениновой) меткой, преимуществом которого по сравнении с радиоактивно меченым вондом является безопасность в работе, а также возможность создания на этой основе диагностических наборов, подлежащих длительному хранению.

4. Разработан экспрессный и достоверный метод дифференциации культур И. tuberculosis и П.bovis от атипичных видов микобактерий с помощью амплификации фрагмента гена M.hovls BOG mbaA, основанный на полиш разной цепной реакции.

5. Разработан метод подготовки культур микобактерий к постановке реакции амплификации, повволяющий улавливать с помощью гель-э^ктрофореза синтезированную ДНК при нг^ичии в пробе до 100 микробных клеток.

6. Показана принципиальная возможность отбора перспективных

праймеров из нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующих анализируемые' белки, с учётом их индекса гидрофобности, и создания на этой основе диагностических систем с использованием поли-меразной цепной реакции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложен метод лизирования микобактерий, пригодный для использования при постановке реакции ДНК-ДНК гибридизации.

2. Предложен метод индикации микобактерий человеческого и бычьего видов с помощью ДНК-зонда МБ-01, меченного ферментной (дигоксиге-ниновой) метки.

3. Разработаны методические рекомендации "Дифференциация культур М.tuberculosls и М.bovis ст атипичных микобактерий методом поли-меразной цепной реакции (1ЩР)"

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мальков И.Г., Артюшин С.К., Фомин Б.А., Короммслов Г.Ф. Разработка метода идентифика ии микобактерий человеческого и бычьего видов с использованием реакции цепной полимеризации. //Ыол.ге-нет., ммкробиол., вирусол., в печати.

2. Malkov I.G. Identification of М.tuberculosis-M.bovis complex by using pollmerase chain reaction. //Бюл. эксп. биол и мед., в печати.

3. Мальков И.Г. Экспресс-диагностика теберкулёза методами ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции. //АгроНИИТЭИ МШ, 1992, N12, стр. 15-18.'

4. Мальков И.Г. Дифференциация культур микобактерий туберкулёза человеческого и бычьего видов с помощью ДНК-зонда. //X.Ветеринария, в печати.

Москва, 1993 г., ЕНИИВСГЭ, Звенигородское шоссе, б. Зак. 2196/11 Тир. 80