Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение полимеразной цепной реакции для диагностики и оценки эффективности химиотерапии туберкулеза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Александров, Андрей Александрович

Страница

Перечень условных обозначений

Введение

Глава 1. Обзор литературы ' '

1.1. Микробиологическая диагностика туберкулеза

1.2. Применение молекулярно - генетических методов в лабораторной диагностике туберкулеза

1.3. Методы видовой идентификации микобактерий

1.4. Применение молекулярно-гентических методов в оценке эффективности проводимой химиотерапии

Глава 2. Материалы и методы

2.1 .Структура работы и характеристика больных

2.2.Реагенты и основное лабораторное оборудование

2.3.Штаммы микобактерий 40 2.4.Описание методов и статистический анализ результатов

Глава 3.Диагностическая эффективность ПЦР-анализа у больных туберкулезом легких

Глава 4. Применение ПЦР-анализа для оценки эффективности химиотерапии туберкулеза легких

Глава 5. Применение ПЦР - анализа для видовой идентификации микобактерий

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение полимеразной цепной реакции для диагностики и оценки эффективности химиотерапии туберкулеза"

Актуальность темы. В решении проблемы своевременного выявления туберкулеза значительное место отводится методам лабораторной диагностики. Использование рентгенологических методов является достаточно информативным, но требует применения иных дополнительных методов исследования для проведения дифференциальной диагностики туберкулеза.

Микробиологические методы играют очень большую роль в специфической диагностике туберкулеза. Однако традиционные микробиологические исследования не всегда способны быстро и с высокой надежностью выявить возбудитель заболевания - микобактерии туберкулеза (МБТ) в клинических материалах.

Клиническая фтизиатрия нуждается в разработке и освоении новых высокотехнологичных и эффективных методов диагностики.

Начиная с 90-х годов прошлого столетия в клинической лабораторной практике для диагностики туберкулеза и других инфекционных заболеваний стали широко применяться методы молекулярной биологии, зарекомендовавшие себя как быстрый, надежный, специфичный и высокочувствительный способ обнаружения и идентификации ряда патогенных для человека и животных микроорганизмов [114].

Методы амплификации нуклеиновых кислот, в частности, разработанная в 1985 г. Кэрри Мюллисом полимеразная цепная реакция (ПЦР) получили большое развитие в лабораторной диагностике большинства инфекций [50].

Применению метода ПЦР в лабораторной диагностике туберкулеза посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных исследователей. Авторы отмечают высокую чувствительность и специфичность ПЦР - анализа в выявлении различных форм туберкулеза как легочной, так и внелегочной локализации [42, 62, 63]. Вместе с тем, до сих пор не разработана стандартная для всех клинических лабораторий общепринятая методика обнаружения возбудителя туберкулеза в клинических образцах методом ПЦР. Способы пробоподготовки и выделения микобактериальной ДНК остаются трудоемкими и относительно длительными в исполнении. Некоторые ПЦР-лаборатории нередко «грешат» большим количеством ложноположительных результатов анализа. Не до конца решена проблема ингибиторов ПЦР, особенно при исследовании биопсийных материалов.

Недостаточно изучен вопрос о возможности применения молекулярно -генетических методов наряду с традиционными - бактериоскопией и посевом в качестве средства лабораторного контроля эффективности проводимой 4 химиотерапии. Поскольку каждый из вышеперечисленных методов имеет свои достоинства и недостатки, интересной, с нашей точки зрения, явилась возможность показать диагностические возможности применения каждого из них в процессе специфического лечения туберкулеза легких.

Проблема быстрой и точной видовой идентификации микобактерий в эпоху распространения ВИЧ - инфекции и успехов трансплантологии является весьма актуальной. Во всем мире отмечается рост числа заболеваний, причиной которых являются нетуберкулезные (атипичные) виды микобактерий [101]. Традиционные микробиологические методы видовой идентификации являются длительными в исполнении, трудоемкими, требуют наличия специализированного дорогостоящего оборудования. Нередко результаты такой идентификации базируются на субъективных оценках. Широко используемые за рубежом, современные высокоспецифичные и надежные молекулярно -генетические методы видовой идентификации микобактерий, к сожалению, еще не заняли своего достойного места в отечественных практических лабораториях.

На протяжении последних нескольких лет в зарубежной печати появились сообщения об успешном применении молекулярно - генетических методов для видовой идентификации микобактерий, входящих в комплекс М. tuberculosis

129]. Кроме решения ряда практических вопросов (лечение, эпидемиология), дальнейшее изучение межвидовых различий среди представителей комплекса МБТ сможет пролить свет на эволюционное развитие возбудителя туберкулеза [121].

Цель настоящего исследования: Повышение эффективности микробиологической диагностики туберкулеза на основе молекулярно-генетических методов анализа.

Задачи работы:

1 .Установить диагностическую значимость (чувствительность и специфичность) применения модифицированного метода пробоподготовки для проведения ПЦР4 анализа в диагностике впервые выявленного туберкулеза легких.

2.Изучить эффективность ПЦР-анализа в качестве метода оценки результативности проводимого лечения у больных туберкулезом.

3.Изучить возможности применения ПЦР-анализа для видовой идентификации микобактерий.

Научная новизна:

Продемонстрирована эффективность применения нового, основанного на иммуномагнитной сепарации, метода пробоподготовки диагностических материалов (мокроты) для определения МБТ с помощью ПЦР.

При использовании ПЦР-анализа в процессе динамического наблюдения за эффективностью специфической химиотерапии, показана четкая корреляция прекращения бактериовыделения, тестируемого методом ПЦР, и клинико-рентгенологическими признаками эффективного лечения туберкулеза легких.

Основные положения, выносимые на защиту: 1.Исследование образцов мокроты для обнаружения МБТ методом ПЦР обладает высокой диагностической эффективностью: чувствительность анализа для впервые диагностированных пациентов - 76%, специфичность - 99,4%, диагностическая эффективность метода -94,3%.

2. Метод ПЦР-анализа при исследовании мокроты или промывных вод бронхов может служить достаточно надежным критерием слежения за эффективностью лечения больных туберкулезом легких.

3. Методы на основе ПЦР и ПЦР-рестрикционного анализа могут быть использованы для видовой идентификации микобактерий.

Практическая значимость: Обоснование высокой эффективности применения ПЦР-анализа для выявления МБТ в диагностических материалах позволит ускорить внедрение этого метода в клиническую практику фтизиатрических учреждений с целью своевременной диагностики и контроля лечения, больных туберкулезом легких.

Возможности молекулярно-генетической идентификации микобактерий штамма БЦЖ, показанные в настоящей работе, открывают перспективу практического применения этого метода в исследовании материалов, полученных при поствакцинальных осложнениях.

Внедрение в практику: Материалы работы внедрены в практику клиники фтизиопульмонологии ММА им. И. М. Сеченова. Материалы диссертации используются при чтении цикла лекций на курсах усовершенствования врачей клинико-диагностических лабораторий на кафедре иммунологии РМАПО и в семинарских занятиях для аспирантов и ординаторов НИИ и клиники фтизиопульмонологии.

Практические рекомендации. Полученные результаты работы отражены в приказе Минздрава РФ № 109 от21.03.2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», в котором отмечено, что допускается применение ПЦР-анализа для ускоренной идентификации микобактерий туберкулезного комплекса и для их обнаружения в мокроте и промывных водах бронхов.

Апробация работы и публикации: Основные материалы диссертации доложены на: 4-й Всероссийской научно-практической конференции

Генодиагностика инфекционных заболеваний» (2002), международной конференции «Туберкулез - старая проблема в новом тысячелетии» (2002), 7-ом Российском съезде фтизиатров (2003), конференции молодых ученых НИИ Фтизиопульмонологоии ММА им. И. М. Сеченова (2004). По теме исследования имеется 12 печатных работ. Апробация диссертации состоялась 21. 01. 2005 г. на заседании апробационного совета НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 рисунками и 6 таблицами. Список литературы содержит 55 отечественных и 109 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Александров, Андрей Александрович

ВЫВОДЫ

1. Чувствительность ПЦР-анализа при использовании иммуномагнитной сепарации МВТ в качестве метода пробоподготовки образцов мокроты, полученных от 141 больного с различными клиническими формами впервые выявленного туберкулеза легких составляет, в среднем, - 76%, что существенно превышает уровень чувствительности культурального исследования (48%). Диагностическая эффективность ПЦР-анализа составляет - 93,4%.

2. При исследовании методом ПЦР образцов мокроты и других диагностических материалов, полученных от 510 пациентов с различными неспецифическими заболеваниями специфичность ПЦР-анализа составила -99,4%.

3. При динамическом исследовании образцов мокроты 47 больных с впервые выявленным туберкулезом легких в период от начала лечения до 2,5 - 7 месяцев специфической химиотерапии установлено, что применение ПЦР-анализа позволяет выявлять бактериовыделение в течение более длительного времени (на 2-2,5 мес) по сравнению с традиционными микробиологическими методами. Среднее время прекращения бактериовыделения у больных с деструктивными формами туберкулеза легких составило: для метода ПЦР - 4,8 + 0,3 месяца; для культурального метода исследования - 2,3 ± 0,25 месяца; для метода люминесцентной микроскопии -3,1 + 0,3 месяца.

4. Прекращение бактериовыделения, определяемое методом ПЦР, четко коррелирует с исчезновением клинико-рентгенологических признаков активности туберкулезного процесса.

5. Показана возможность идентификации медленно растущих видов микобактерий с помощью ПЦР-рестрикционного анализа (ПРА) при исследовании культур микобактерий.

6. Исследование методом ПЦР образцов, полученных при положительных результатах культивирования диагностических материалов в жидкой питательной среде (система ВАСТЕС) позволяет проводить идентификацию микобактерий туберкулезного комплекса в течение одного рабочего дня. Специфичность анализа - 100%.

7. ПЦР - анализ областей делеций (RD - регионов) в геноме микобактерий туберкулезного комплекса, позволяет дифференцировать вакцинные штаммы М. bovis BCG от вирулентных штаммов М. tuberculosis и М. bovis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проблема быстрого, высокоспецифичного и чувствительного обнаружения возбудителя туберкулеза в клиническом материале остается весьма актуальной. Традиционные лабораторные методы выявления МБТ зачастую являются малочувствительными, трудоемкими или длительными в исполнении, что ограничивает их применение не только в целях диагностики, но и в качестве средства лабораторного контроля эффективности проводимой химиотерапии туберкулеза.

С 90 -х годов прошлого столетия для обнаружения МБТ в патологическом материале применяются многочисленные методы, заимствованные из молекулярной биологии [50]. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее часто используемым в лабораторной диагностике туберкулеза молекулярно-генетическим методом.

В настоящей работе мы изучили эффективность применения ПЦР-анализа для обнаружения МБТ в клинических диагностических материалах, а также показали возможности этого метода для слежения за эффективностью лечения туберкулеза легких и видовой идентификации микобактерий.

В соответствии с первой задачей нашего исследования изучалась диагностическая значимость - чувствительность и специфичность ПЦР-анализа с использованием модифицированного метода пробоподготовки диагностических образцов с целью обнаружения микобактерий туберкулеза.

Диагностическая чувствительность метода ПЦР была установлена при исследовании образцов мокроты, полученных от 141 больного с различными клиническими формами туберкулеза легких. Наряду с ПЦР-анализом, образцы мокроты исследовались методом посева на среду Левенштейна-Йенсена.

Были исследованы образцы мокроты следующих групп пациентов: 16 больных с очаговым туберкулезом легких и туберкуломой, 25 больных с инфильтративным туберкулезом без деструкции легочной ткани, 77 больных с инфильтративным туберкулезом легких в фазе распада, 11 больных с диссеминированным и 12 больных с фиброзно-кавернозным туберкулезом легких.

Средняя чувствительность метода ПЦР для всех клинических форм туберкулеза легких составляет 76%, тогда как уровень чувствительности культурального исследования образцов мокроты этих же пациентов составил 48%.

Основной прирост чувствительности ПЦР-анализа приходится на ограниченные формы туберкулеза легких без деструкции легочной ткани.

В частности, при ограниченных формах туберкулеза легких без деструкции легочной ткани (очаговый туберкулез легких, туберкулома и инфильтративный туберкулез легких в фазе инфильтрации) чувствительность ПЦР-анализа составила 54%, тогда как использование культурального метода исследования тех же образцов позволило обнаружить МБТ лишь в 19% случаев. Для инфильтративного туберкулеза легких в фазе распада чувствительность ПЦР-анализа составила 82% при 52% чувствительности культурального исследования. Статистические различия при сравнении этих методов исследования для выше перечисленных групп больных были высоко достоверны (Р< 0,01). Максимальный уровень чувствительности ПЦР-анализа -92% был показан при распространенных формах туберкулеза легких (диссеминированный и фиброзно-кавернозный) с признаками деструкции легочной ткани. В этих группах различия между сравниваемыми методами исследования не были достоверными.

Диагностическая значимость положительных результатов метода ПЦР при исследовании образцов мокроты от больных с впервые выявленным туберкулезом легких составила 97%, диагностическая значимость отрицательных результатов ПЦР-анализа - 94%, показатель диагностической эффективности метода ПЦР - 94,3%.

Специфичность ПЦР-анализа устанавливалась при исследовании клинических материалов, полученных от пациентов с различными неспецифическими заболеваниями. Исследовано 510 клинических образцов, в том числе 352 образца мокроты и БАЛЖ, 48 образцов плевральной жидкости, 11 образцов жидкости перикарда, 72 образца мочи и 27 образцов спинномозговой жидкости. Ложноположительный результат ПЦР был получен в трех случаях при исследовании образцов мокроты у больных пневмонией (2 случая) и раком легких (1 случай). Таким образом, специфичность ПЦР анализа составила - 99, 4%.

Для выделения ДНК МБТ из исследуемых клинических образцов мокроты с целью последующего проведения ПЦР-анализа мы применили метод иммуномагнитной сепарации микобактерий [11]. В кратком изложении процедура была следующей. Мокроту гомогенизировали добавлением равного объема 4% №ОН и Т<1-ацетил-Ь-цистеина (50-70 мг на образец). Затем образцы нейтрализовали с помощью 1 М раствора трис-гидрохлорида (рН 1,67), добавляли по 100 мкл. иммуномагнитного сорбента и инкубировали пробы в течение 40-50 мин при постоянном перемешивании. Затем, с помощью магнитного устройства извлекали образовавшиеся комплексы «иммуносорбент+МБТ» из клинических образцов и переносили их в микропробирки Эппендорф (1,5мл) с нейтральным буферным раствором, затем микрочастицы осаждали и лизировали МБТ при прогревании в 2% растворе тритона Х-100 при 95° С. Супернатант использовали в качестве ДНК-содержащего материала при проведении ПЦР-анализа (см. главу «Материалы и методы», п.2.4.3.).

Для выделения ДНК МБТ из образцов БАЛЖ и спинномозговой жидкости пробы центрифугировали при 3000 об./мин (2700§); к осадкам добавляли 30-40 мкл 2% раствора тритона Х-100 и прогревали при 95°С в течение 40 мин. Выделение ДНК МБТ при исследовании образцов мочи, плеврального и перикардиального экссудатов проводилось с помощью фенол-хлороформенной экстракции с последующим осаждением ДНК МБТ в этаноле [50, 113].

В ПЦР амплифицировали фрагмент повторяющегося инсерционного элемента IS6110 ДНК МБТ. Использовались олигонуклеотидные праймеры: T4(5/-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3/) и Т5(5' - CTCGTCCAGCGCCGCTTC-GG-^). Размер продукта амплификации - 123 н.п.[82,83]. Учет результатов ПЦР-анализа производили в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.

Полученные нами результаты по чувствительности и специфичности ПЦР-анализа не противоречат опубликованным данным [19, 42]. Наиболее известные и хорошо изученные тест-системы для ПЦР-анализа, сертифицированные FDA (Food and drug administration, США) - Roche «Amplicor МТБ» и полуавтоматизированная «Cobas Amplicor» (Roche Diagnostic Systems, Швейцария) основаны на амплификации фрагмента гена 16S рРНК МБТ. Они позволяют обнаружить возбудитель туберкулеза в мокроте в течение 1-2 дней с чувствительностью на уровне наиболее качественного культурального микробиологического анализа, т.е. в 75-80% случаев активного туберкулеза легких. Специфичность анализа приближается к 100%» [66]. По данным Л.Н.Черноусовой и сотр. [42] чувствительность ПЦР-анализа при исследовании образцов мокроты больных с ограниченными формами туберкулеза легких составляет 51,6 %, а для распространенных форм - 72,5%.

На втором этапе исследования мы изучали возможность применения ПЦР-анализа в качестве средства оценкки эффективности проводимой химиотерапии у больных туберкулезом легких. Обследовано 47 больных с различными клиническими формами впервые выявленного туберкулеза легких в процессе их химиотерапевтического стационарного лечения. В этой группе наблюдали 12 больных с очаговым и инфильтративным туберкулезом легких без деструкции легочной ткани; 27 больных с инфильтративным туберкулезом легких в фазе распада и 8 больных с распространенными формами туберкулеза легких (диссеминированый туберкулез легких в фазе распада и фиброзно-кавернозный туберкулез легких). Возрастно-половой состав обследованной группы пациентов: мужчины -22 чел., женщины - 25 чел. Возраст: 18-67 лет.

Всем больным, в зависимости от длительности курса лечения, осуществлялось 2-х, 3-х, 4-х или пятикратное исследование образцов мокроты методом ПЦР через каждые 6-7 недель проводимой терапии. Параллельно с ПЦР - анализом, на тех же этапах лечения, в этой же группе пациентов, проводилось исследование образцов мокроты методами бактериоскопии и посева на среду Левенштейна-Йенсена.

Пробоподготовку образцов мокроты для ПЦР-анализа осуществляли при помощи иммуномагнитной сепарации микобактерий туберкулеза [11].

Определялось среднее время прекращения бактериовыделения для каждой формы туберкулеза легких при использовании методов ПЦР, посева и люминесцентной микроскопии. Полученные результаты анализировались с учетом клинико-рентгенологической динамики заболевания.

Статистический анализ полученных результатов производили с использованием критерия Р( {Стъюдента).

В результате проведенного сравнительного исследования было установлено, что при использовании различных методов обнаружения МБТ (ПЦР, люминесцентная микроскопия и посев) в процессе специфической химиотерапии у пациентов с деструктивными формами туберкулеза легких определяются различные сроки прекращения бактериовыделения.

Мы установили, что у обследованной группы больных, в условиях эффективно проводимой специфической химиотерапии туберкулеза легких, положительные результаты ПЦР - анализа конвертируются в отрицательные на более поздних этапах лечения, по сравнению с методами бактериоскопии и посева. Среднее время прекращения бактериовыделения для всех клинических форм туберкулеза с деструкцией легочной ткани, устанавливаемое методом ПЦР составило 4,8 ± 0,3 месяца, посева - 2,3 ± 0,25 месяца (Р<0,001), люминесцентной микроскопии - 3,1 ± 0,3 месяца (Р<0,001).

Таким образом, применение метода ПЦР у больных с клиническими формами туберкулеза легких с деструкцией легочной ткани позволило выявлять бактериовыделение в течение более длительного (на 2,5 месяца) периода наблюдаемого лечения по сравнению с культуральным исследованием и методом люминесцентной микроскопии - на 1,7 месяца.

При использовании метода люминесцентной микроскопии, несмотря на меньшую чувствительность исследования по сравнению с методом посева, в процессе специфической терапии определялось достоверно большее число положительных результатов исследования по сравнению с культуральным методом исследования (Р<0,05). Возможно, что это связано со снижением жизнеспособности или ростовых свойств МБТ в результате проводимой химиотерапии. Прекращение бактериовыделения, определяемого различными, включая ПЦР-анализ, методами сопровождалось положительной клинико-рентгенологической динамикой заболевания (рис.4). У больных деструктивным туберкулезом легких при рассасывании инфильтративных очагов и значительном уменьшении полости распада лишь в 1 случае из 27 результаты люминесцентной микроскопии были положительными, тогда как ПЦР - анализ был положительным у 7 пациентов (26%). При закрытии полостей распада ПЦР была положительной лишь в 1 случае, однако при последующем обследовании наступила конверсия и ПЦР-анализа. Мы также отмечали 1 случай отрицательной ПЦР при сохранении полости распада, которая в течение последующих 2-х месяцев перестала определяться, т.е. в этом случае полость была полностью санирована.

С помощью методов ПЦР-анализа, люминесцентной микроскопии и посева мы обследовали 7 больных с фиброзно-кавернозным и инфильтративным туберкулезом легких в фазе распада с бактериовыделением в начале лечения, которые не имели клинического эффекта от проводимой консервативной терапии. У 4 больных из этой группы бактериовыделение определялось всеми тремя методами на протяжении 6 и более месяцев лечения, тогда как ПЦР оставалась положительной у всех 7 этих пациентов. Два пациента, с положительной ПЦР при отрицательных микроскопии и посевах, в связи с неэффективностью химиотерапии, определяемой рентгенологическими исследованиями, были прооперированы. В послеоперационный период ПЦР была отрицательной.

Полученные нами результаты не противоречат опубликованным литературным данным [14,42, 105,110, 160,162].

Yuen К. Y., в 1993 г., обследовал 41 больного туберкулезом легких подтвержденного культуральным исследованием. Через 4 недели лечения положительный результат в ПЦР имели 72% больных, 39% имели положительный результат в микроскопии и 32% положительный результат посева [160].

Levee G., в 1994 г. методами ПЦР, микроскопии и посева оценил эффективность лечения 19 больных туберкулезом легких. На старте химиотерапии 11(58%) пациентов имели положительные результаты микроскопии или посева и 13 (74%) пациентов имели положительные результаты ПЦР-анализа. Через 2 месяца лечения ни один из пациентов не имел положительных результатов микроскопии и посева, но 4 (21%) пациента имели положительные результаты ПЦР-анализа. Через 3 месяца специфической терапии только двое из обследованных пациентов имели положительные результаты ПЦР-анализа [110]. Однако авторы не сообщают о клинических формах туберкулеза легких у обследованных пациентов.

В 1994г., Kennedy N. методами нестед-ПЦР, люминесцентной микроскопии и посева обследовал образцы мокроты, полученные от 10 больных туберкулезом легких. В процессе специфического лечения туберкулеза бактериовыделение, определяемое методом ПЦР, по сравнению с культуральным исследованием и методом флуоресцентной микроскопии, сохранялось на 1-2 месяца дольше, что совпадает с нашими результатами [105]. Недостатком работы является небольшое количество обследованных пациентов. В работе не сообщается о составе группы обследованных пациентов по клиническим формам туберкулеза легких.

Бахрманд А. ,Р. и соавт. в 2000 г. наблюдали за ходом специфической химиотерапии туберкулеза легких (четыре антибиотика в течение 6-8 месяцев) у 29 больных, инфицированных лекарственно-устойчивыми штаммами МБТ. Только для 19 (65,5%) из них по окончании шести месяцев терапии лечение было закончено. У пяти из 10 продолживших лечение пациентов положительный результат ПЦР наблюдался и по окончании 8 месяцев терапии. Авторы делают вывод, что ПЦР-анализ особенно важен для мониторинга терапевтического воздействия на пациентов, плохо отвечающих на специфическую химиотерапию [14].

Velayati А.А., в 2002 г., использовал методы ПЦР, посева и люминесцентной микроскопии для контроля эффективности лечения у пациентов с нормальным и пониженным ответом на проводимую химиотерапию туберкулеза легких [162]. Из 162 пациентов, обследованных на старте лечения, положительный результат в ПЦР имели 156 (96%) больных, положительный результат бактериоскопического исследования имели 106 (65%) пациентов и 124(77%) имели положительный результат посева. Через 6 месяцев лечения 137(85%) больных считались клинически излеченными. Из всей группы излеченных пациентов положительный результат ПЦР в конце лечения был получен только у 7 больных. Впоследствии у 3 из них диагностировали релапс туберкулезного процесса.

В наших исследованиях на значительном клиническом материале - 47 больных с впервые выявленным туберкулезом легких проведено динамическое наблюдение микобактериовыделения с помощью метода ПЦР-анализа и сравниваемых традиционных методов (люминесцентная микроскопия и культуральное исследование) в процессе всего курса эффективной химиотерапии. Полученные данные были сопоставлены и убедительно коррелировали с клинико-рентгенологической динамикой уменьшения инфильтративных изменений и закрытия полостей распада легочной ткани в процессе эффективного лечения.

Третий этап нашего исследования посвящен применению молекулярно -генетических методов для видовой идентификации микобактерий.

Быстрое и точное определение вида микобактерий является необходимым компонентом в формировании тактики последующего лечения. Видовая идентификация микобактерий особенно важна при проведении дифференциальной диагностики туберкулеза у пациентов с наличием иммунодефицитов различного происхождения. Методами ПЦР и ПРА (ПЦР -рестрикционного анализа) дифференцировались виды микобактерий, имеющие наибольшее клиническое значение. Работа велась по трем направлениям. Первое направление включило в себя поиск оптимального молекулярно -генетического метода видовой идентификации среди нетуберкулезных (атипичных) микобактерий. Во второй части работы мы применили ПЦР -анализ для дифференциации вакцинных штаммов М. bovis BCG от вирулентных штаммов M.tuberculosis и М.bovis. В третьей части нашего исследования изучалась эффективность использования ПЦР для быстрой идентификации МБТ в образцах культур.

Методом ПРА мы идентифицировали 5 медленно растущих видов микобактерий. Молекулярный вес видоспецифичных продуктов рестрикции микобактериальной ДНК в нашем исследовании (рис.5) совпал с имеющимся в базе данных ПРА [94].

ПЦР-анализ областей делеций в геноме микобактерий комплекса МБТ [129], позволил нам дифференцировать вакцинные штаммы М. bovis(BCG) от вирулентных штаммов М. tuberculosis и М. bovis (рис.6). В дальнейшем, знание этих генетических межвидовых различий может быть использовано для быстрой и специфичной диагностики поствакцинальных осложнений. Кроме того, изучение межвидовых различий среди представителей комплекса МБТ сможет пролить свет на эволюционное развитие возбудителя туберкулеза [121].

В третьей части исследования мы применили ПЦР-анализ для быстрой идентификации микобактерий комплекса М. tuberculosis непосредственно в образцах микобактериальных культур. В ПЦР использовались праймеры к эленту IS 6110 ДНК МБТ. Исследовались 80 образцов культур, с положительными результатами (появление флуоресценции) культивирования диагностических материалов в жидкой питательной среде (система ВАСТЕС MGIT 960). В результате исследования 1 мл супернатанта этих культур методом ПЦР было получено подтверждение обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса в 62 случаях. При последующем микробиологическом исследовании этих же образцов с проведением видовой идентификации этих культур было установлено, что в 6 из 18 отрицательных результатов ПЦР блыла выявлена неспецифическая флора, а в 12 случаях - атипичные виды микобактерий. Таким образом, специфичность анализа составила 100%.

В остальных случаях была подтверждена принадлежность культур к туберкулезному комплексу и при традиционном микробиологическом исследовании. Время проведения анализа - 1 рабочий день. Использование

ПЦР-анализа позволяет сократить время идентификации микобактерий туберкулезного комплекса с 7 до 1 дня.

Несомненным достоинством методов ПЦР-анализа является возможность работы с инактивированными культурами микобактерий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Александров, Андрей Александрович, Москва

1. Андросова М. В. Видовая идентификация микобактерий туберкулеза с помощью моноклональных антител: Автореф. дис . канд. биол. н. М.: МНИИТ МЗ РФ, 1990. - 20 с.

2. Блум Б. Р. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ. М.: Медицина, 2002. - 676с.

3. Вакцинация БЦЖ: характеристика препаратов и причины поствакцинальных осложнений // Д. Т. Леви, В. А. Аксенова, Н. Р. Закирова и др. / Проблемы туберкулеза. 2003. - С. 4 - 7.

4. Волчкова И Л., Олейник Л.О. К отбору детей на вакцинацию БЦЖ М в условиях роддома // Туберкулез сегодня: Материалы 7-го Росс, съезда фтизиатров. - М.: БИНОМ. - 2003. - С. 166.

5. Гинцбург А.Л. Генодиагностика инфекционных заболеваний // Журн. Микробиол. Эпидем. Иммунобиол. 1998. - № 3. - С. 86 - 95.

6. Грузевский A.A. Современные данные о роли фотохромогенных микобактерий в патологии человека // Проблемы туберкулеза. 1999. - №6. -С. 58-61.

7. Заболеваемость туберкулезом в Росси: ее структура и динамика // Е.М. Белиловский, С.Е. Борисов, A.B. Дергачев и др. / Проблемы туберкулеза. -2003.- №7. -С. 4- 11.

8. Значение полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа в диагностике мочеполового туберкулеза // К. Муканбаев, М.А. Владимирский, Л.К. Шипина и др. / Туберкулез сегодня: проблемы иперспективы: Сб. науч. тр. М.: МНПЦБТ, 2000. -С. 19- 80.

9. Кантор И.Н., Ким С.Д., Фриден Т. Лабораторная служба в программах борьбы с туберкулезом: Культуральное исследование: Пер. с англ. М.: ВОЗ, 2002. - 96с.

10. Кантор И.Н., Ким С.Д., Фриден Т. Лабораторная служба в программах борьбы с туберкулезом: Организация и менеджмент: Пер. с англ. М.: ВОЗ, 2002.- 63с.

11. Кузнецов A.A. Применение магнитоуправляемых микрочастиц в медицине // Применение биомагнитных носителей в медицине: Материалы 1-го симпозиума. М.: ИБХФ РАН, 2001. - С. 3 - 14.

12. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки: Пер. с англ. М.: Мир, 1976. - С. 753 - 786.

13. Литвинов В.И., Мороз A.M. Лабораторная диагностика туберкулеза. М.: МНПЦБТ, 2001.- 184 с.

14. Мальков И.Г. Дифференциация М. tuberculosis и М. bovis от атипичных видов микобактерий методами ДНК ДНК гибридизации и полимеразной цепной реакции: Автореф. дисс . канд. биол. наук. - М.: ВНИИВС ГЭ, 1993. -21с.

15. Мейснер А.Ф., Фролова О.П. Вакцинация БЦЖ детей с иммунодефицитными состояниями // Туберкулез сегодня: Материалы 7-го Росс, съезда фтизиатров. М.:БИНОМ. - 2003. - С. 171.

16. Микросферы для биомедицинского применения. Области применения и способы получения // В. И. Филиппов, А. А. Кузнецов, JI. А. Гончаров и др. / Применение биомагнитных носителей в медицине: Материалы 1-го симпозиума. М.: ИБХФ РАН, 2001. - С.15 - 20.

17. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в России // JI.H. Черноусова, Н.Е. Курепина, С.Н. Андреевская и др. / Материалы юбилейной научной сессии ЦНИИТ РАМН. М.:ЦНИИТ РАМН, 2000. - С. 88 - 89.

18. Молекулярное типирование микобактерий туберкулеза, выделенных от больных из пенитенциарного учреждения // JI.H. Черноусова, С.Н. Савинкова, Т.Г. Смирнова и др. / Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы: Сб. науч. тр. М.: МНПЦБТ, 2000. - С. 224.

19. Осложнения после прививки БЦЖ // Л.В. Поддубная, С.А. Силайкина, А.А. Лукомская и др. / Туберкулез сегодня: Материалы 7-го Росс, съезда фтизиатров. М.:БИНОМ. - 2003. - С. 172.

20. Патент № 5500341. США. Species specific detection of Mycobacterium kansasii / Опубл. 19. 03. 96 / Becton Dickinson and Co / Spears P. A. - Реф.

21. Сборник: Вып.: Туберкулез М.: ВИНИТИ РАН, 1998. - №5 - С. 22.

22. Перельман М.И. Основные итоги противотуберкулезной работы в России в 2001г. // Проблемы туберкулеза. 2003. - №2. - С. 3 - 10.

23. Перельман М.И., Левашев Ю.Н. Диагностика и лечение внелегочного туберкулеза: Практическое руководство. М.: Медицина и жизнь., 2002. - 60 с.

24. Перельман М.И., Корякин В.А., Протопопова М.Н. Туберкулез: учебник. -М.: Медицина, 1990,- С.28 45.

25. Петри А., Сэбин К. Наглядная статистика в медицине: Пер. с англ. М.: ГЭОТАР - МЕД, 2003. - С. 64 - 66.

26. Полозов А.И. Методы активного выявления туберкулеза при обследовании населения в территориях с повышенным радиационным фоном: Дис . канд. мед. наук. М.,1996. - 145 с.

27. Попов С.А. Дифференциация культур микобактерий туберкулеза методами газожидкостной хроматографии: Автореф. дисс . канд. мед. наук. М.: МНИИТ МЗ РФ, 1991. - 22 с.

28. Приказ №109 МЗ РФ от 21.03.2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». М., 2003.

29. Применение ПЦР анализа для видовой идентификации микобактерий // А. А. Александров, О. А. Иртуганова, Н. С. Смирнова и др. / Туберкулез сегодня: Материалы 7-го Росс, съезда фтизиатров. - М.:БИНОМ. - 2003. - С. 105.

30. Роль ПЦР анализа в комплексных бактериологических исследованиях во фтизиатрии // JI. Н. Черноусова, Е. Е. Ларионова, Э. В. Севастьянова, В. И. Голышевская / Проблемы туберкулеза. - 2001. - № 3. - С. 58 - 60.

31. Степаншин Ю. Г., Степаншина В. Н., Шемякин И. Г. Нетуберкулезные микобактерии: лекарственная устойчивость и эпидемиология // Реферат. Сборник: Сер.: Медицина: Вып.: Туберкулез. М.: ВИНИТИ РАН, 1998. - № 5. - С. 1 -8.

32. Тиц У. Энциклопедия клинических лабораторных тестов: Пер. с англ. М.: Лабинформ, 1997. - С. 665 - 668.

33. Тунгусова О. С., Марьяндышев А. О. Молекулярная генетика туберкулеза // Проблемы туберкулеза. 2003. - № 11. - С. 39 - 42.

34. Урбах В. Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М,: Медицина, 1975. - 296 с.

35. Федоров Н. А., Суханов Ю. С., Асади Мобархан А. X. Полимеразная цепная реакция: Методическое пособие. М.,1996. - 30 с.

36. Филиповский А. В. Значение микобактерий комплекса Avium Intracellular в инфекционной патологии // Проблемы туберкулеза. - 1999. - №5. - С. 46 -48.

37. Харриес А., Мэхер Д. ТВ / ВИЧ: Клиническое руководство ВОЗ: Пер. с англ. М.: Права человека, 2002. - С. 19 - 26.

38. Херрингтон С., Макги Д. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ. М.: Мир, 1999. - 558 с.

39. Шилова М. В. Эпидемиологическая обстановка по туберкулезу в России // Справочник фельдшера и акушера. М.: ЗАО МЦФЭР, 2004. - №. 3. - С. 7 -12.

40. Шипина JI.K. Иммунобиотехнологические методы определения микобактерий туберкулеза: Автореф. дис . канд. биол. наук. М.: МНИИТ МЗ РФ, 1997.- 15 с.

41. Эпидемиология внелегочного туберкулеза // Ф.А. Батыров, В.А. Хоменко, Л.Н. Шмакова и др. / Проблемы туберкулеза. 2003. - № 8. - С. 49 - 50.

42. Ященко Т.Н., Мечева И.С. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. М.: Медицина, 1973. - 260 с.

43. A DNA array sensor utilizing magnetic microbeads and magneto electronic detection // Miller M. M., Sheehan P. E., Edelstein R. L. et al. / J. Magnetism and Magnet. Material. - 2001. - V. 225. - P. 138 - 1441.

44. Barnes W.M. PCR amplification of up 35 kb DNA with high fidelity and high yield from bacteriophage templates // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1994. - V. 91. - P. 2216-2220.

45. Butler W. R., Gutherts L. S. Mycolic acid analysis by high - performance liquid chromatography for identification of Mycobacterium species // Clin. Microbiol. Rev. - 2001. - V. 14. - P. 704 - 726.

46. Butler W. R., Jost K. S., Kilburn J. O. Identification of Mycobacteria by high -performance liquid chromatography // J. Clin. Microbiol. 1991. - V. 29. - P. 2468 - 2472.

47. Chedore P., Jamieson F. B. Rapid molecular diagnosis of tuberculosis meningitis using the Gen Probe Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test in a large Canadian public health laboratory // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2002. - V.6. -P. 913-919.

48. Chemiluminescent detection of strand displacement amplified DNA from species comprising the Mycobacterium tuberculosis complex // Spargo C. A., Haaland P. D., Jurgensen S. R. et al. / Molecular and Cell. Probes. 1993. - V. 7. - P. 395 -404.

49. Clinical evaluation of the polymerase chain reaction for the rapid diagnosis of tuberculosis // Cheng V. C., Yam W. C., Hung I. F. et al. / J. Clin. Pathol. 2004. -V. 57.-P. 281-285.

50. Comparison of the ABI 7700 System (Taq Man) and Competitive PCR for Quantification of IS 6110 DNA in sputum during treatment of tuberculosis // Desjardin L. E., Chen Y., Perkins M. D. et al. / J. Clin. Microbiol. 1998. - V.36. -P. 1964- 1968.

51. Comparison of three different primer pairs for the detection of Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction in paraffin embedded tissues // Ozkara H. A., Kocagoz T., Ozcelik U. et al. / Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 1998. - V. 2.-P. 451 -455.

52. D Amato R. F., Muller A. Rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis using Roche AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis PCR test // Methods in Molecul. Biol. -1998. V.92.-P. 203 - 14.

53. Daniel T. Antibody and antigen detection for the immunodiagnosis of tuberculosis: why not? What more is needed? Where do we stand today? // J. Infect. Dis. 1998. - V.158. - P. 678 - 680.

54. De Wit D., Maartens G., Steyn L. A comparative study of the polymerase chain reaction and conventional procedures for the diagnosis of tuberculosis pleural effusion // Tubercle Lung. Dis. 1992. - V. 73. - P. 262 - 267.

55. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence // Cole S. T., Brosch R., Parkhill J. et al. / Nature. 1998. - V. 393.-P. 537 -544.

56. Detection and differentiation of Mycobacterium tuberculosis and Nontuberculosis mycobacterial isolates by Real Time PCR // Shrestha N. K., Tuohy M. J., Hall G. S. et al. / J. Clin. Microbiol. - 2003. - V. 41. - P. 5121 - 5126.

57. Detection and identification of mycobacteria by amplification of r RNA // Boddinghaus B., Roggal T., Flohr T. et al. / J. Clin. Microbiol. 1990. - V. 28. -P. 1751 - 1759.

58. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum sediments by amplification of rRNA // Jonas V., Alden M. J., Curry J. I. et al. / J. Clin. Microbiol. 1993. - V. 31. - P. 2410 - 2416.

59. Detection of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical specimens by a commercial polymerase chain reaction kit // Stauffer F., Mutschlechner R., Hasenberger P. et al. / Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1995. - V. 14. - P. 1046-51.

60. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system // Kolk A. H. J., Shuitema A. R. J., Kuijper S. et al. / J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30. - P. 2567 - 2575.

61. Detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens using the new ABBOTT LCx MTB assay // Sheehan S., Shroder G., Garland J. et al. / Clin. Lab. 1997. -V.43. - P. 769-771.

62. Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria // Wallase R. J., OBrien R., Glassroth J. et al. / Am. Rev. Respir. Dis. 1990. - V.142. P. 940-953.

63. Diagnosis of tuberculosis by DNA amplification in clinical practice evaluation // Brisson Noel A., Aznar C., Chureau C. et al. / Lancet. - 1991. - V.338. - P. 364 -366.

64. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum by polymerase chain reaction and DNA hybridization // Nolte F. S., Metchock B., McGowan J. E. et al. / J. Clin. Microbiol. 1993. - V. 31. - P. 1777 - 1782.

65. Edwards K.M., Kernolde D.S. Possible hazards of routine bacillus Calmette -Guerin immunization in human immunodeficiency virus infected children // Pediatr. Infect. Dis. J. - 1996. - V. 15. - P. 836 - 838.

66. Eisenach K. D., Crawford J. T., Bates J. H. Genetic relatedness among strains of the Mycobacterium tuberculosis complex. Analysis of restriction fragment heterogenity using cloned DNA probes // Am. Rev. Respir. Dis. 1986. - V: 133. -P. 1065 - 1068.

67. Eisenach K. D., Crawford J. T., Bates J. H. Repetitive DNA sequences as probes for Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1988. - V. 26. - P. 2240 -5.

68. Eisenach K. D., Sifford M. D., Cave M. D. Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain reaction // Am. Rev. Respir. Dis. 1991. - V. 144. - P. 1160 - 1163.

69. Evaluation of a polymerase chain reaction for the diagnosis of tuberculosis // Manjunath N., Shankara P., Rogan I. et al. / Tubercle. 1991. - V. 72. - P. 21 - 27.

70. Forbes B. A., Hieks K. E. Ability of PCR assay to identify Mycobacterium tuberculosis in BACTEC 12 B vials // J. Clin. Microbiol. 1994. - V.32. - P. 1725

71. Frothingham R. Differentiation of strains in Mycobacterium tuberculosis complex by DNA sequence polymorphisms, including rapid identification of M. bovis

72. BCG // J. Clin. Microbiol. 1995. - V.33. - P. 840 - 844.

73. Frothingham R., Meeker O Connell W. A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats // Microbiology. - 1998. - V. 144. - P. 1189 - 1196.

74. Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence determination: report of 2 year experience in a clinical laboratory // Kirschner P., Springer B., Vogel U. et al. / J. Clin. Microbiol. - 1993. - V. 31. - P. 2882 - 2889.

75. Gillespie S., Newport L., McHugh T. IS6110- based PCR methods for detection of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34. - P. 1348 -1349.

76. Hallier Soulier S. An immunomagnetic separation PCR assay for rapid and ultrasensitive detection Cryptosporidium parvum in drinking water // FEMS microbiology. - 1999. - V.176. - P. 285 - 9.

77. Heifets L. B., Good R.C. Current laboratory methods for the diagnosis of tuberculosis // Tuberculosis: pathogenesis, protection and control. Washington DC, 20 005: American Society for microbiology. - 1994. - Chapter 7. - P. 85 -110.

78. Hsp65 PCR restriction enzyme analysis (PRA) for identification of mycobacteria in the clinical laboratory // Silva C. F., Ueki S. Y., Geiger D. P. et al. / Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo. -2001. - V. 43. - P. 25 - 28.

79. Identification of a new DNA region specific for members of Mycobacterium tuberculosis complex // Magdalena J., Vachee A., Supply P. et al. / J. Clin. Microbiol. V. 36. - P. 937 - 943.

80. Identification of clinical isolates of mycobacteria with gas liquid chromatography : a 10 month follow - up study // Tisdall P. A., De Young D. R., Roberts G. D. et al. / J. Clin. Microbiol. - 1982. - V. 16. - P. 400 - 402.

81. Identification of novel intergenic repetitive units in a mycobacterial two -component system operon // Supply P., Magdalena J., Himpens S. et al. / Mol. Microbiol. 1997. - V. 26. - P. 991 - 1003.

82. Immunosuppression and mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis: results from patients with and without HIV infection // Peters M., Schiirmann D., Mayr A. C. et al. / Epidemiol. Infect. - 1989. - Y. 103. - P. 293 - 300.

83. Insertion element IS 986 from Mycobacterium tuberculosis: a useful tool for diagnosis and epidemiology of tuberculosis // Hermans P. W. M., van Soolingen

84. D., Dale J. W. et al. / J. Clin. Microbiol. 1990. - V. 28. - P. 2051 - 2058.

85. Jackson D. P., Hayden J. D., Quirke P. Extraction of nucleic acid from fresh and archival material // PCR: a practical approach. N. Y.: Oxford University Press. - 1993.-P. 30-36.

86. Kennedy N., Gillespie S. H., Saruni A. O. Polymerase chain reaction for assessing treatment response in patients with pulmonary tuberculosis // J. of Infect. Dis. 1994. - V. 170. - P. 713 - 6.

87. Kent P. T., Kubica G. P. Public health mycobacteriology: guide for the level ||| laboratory. US Department of Health and Human Services, CDC, USA, 1985.

88. Kirschner P., Bottger E. C. Species identification of Mycobacteria using rDNA sequencing // Meth. in Molec. Biol. 1998. - V. 101. - P. 349 - 361.

89. Kolk A. H., Kox L. F., Van Leeuwen J. Clinical utility of the polymerase chain reaction in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis // Europ. Respir. J. -1998.-V. 11. P.1222 - 6.

90. Lamm D.L. Complications of Bacillus Calmette Guerin immunotherapy // Urol. Clin. N. Am. - 1992. - V.19. - P. 565 - 572.

91. Levee G., Glaziou P., Gicquel B. Follow up of tuberculosis patients undergoing standard anti - tuberculosis chemotherapy by using a polymerase chain reaction // Research in microbiology. - 1994. - V. 145. - P. 5 - 8.

92. Longo M. C., Berninger M. S., Hartley J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry - over contamination in polymerase chain reactions // Gene. - 1990. -V.93. - P. 125 - 128.

93. Magdalena J., Supply P., Locht C. Specific differentiation between Mycobacterium bovis BCG and virulent strains of the Mycobacterium tuberculosis complex // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36. - P. 2471 - 2476.

94. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. N. Y.: Cold Spring Harbor laboratory. - 1982.

95. Miller N., Hernandez S. G., Cleary T. J. Evaluation of Gen Probe Amplified

96. Mycobacterium Direct Test and PCR for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens // J. Clin. Microbiol. 1994. - V. 32. - P. 393 -7.

97. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis // Mahairas G. G., Sabo P. J., Hickey M. J. et al. / J. Bacteriol. 1996. - V.178. - P. 1274 - 1282.

98. Molecular typing of Mycobacterium tuberculosis based on Variable Number of Tandem DNA Repeats used alone and in association with spoligotyping // Filliol I., Ferdinand S., Negroni L. et al. / J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 2520 -2524.

99. Mullis K.B., Faluna F.A. In methods in enzimology // Academic Press. -London. 1987. - V.155. - P.335 - 50.

100. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high density DNA probe arrays // Troesch A., Nguyen H., Miyada C. G. et al. / J. Clin. Microbiol. - 1999. - V. 37. - P. 49 - 55.

101. Nested polymerase chain reaction for detection of M. tuberculosis in clinical samples // Myazaki Y., Koga H., Kohno S. et al. / J. Clin. Microbiol. 1993. - V. 31.-P. 2228-2232.

102. Our experience on 17 adults with tuberculous meningitis // Perilli A., Traditi F., Giovagnoli G. et al. / J. Infect, and parasit. Dis. 1996. - V.l 1. - P. 109 - 110.

103. PCR based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of Genomic Deletions // Huard R.C., Lazzarini L. C., Buttler W. R. et al. / J. Clin. Microbiol. - 2003. - V. 41. - P. 1637 - 1650.

104. PCR on Disseminated Tuberculosis in Bone Marrow and Liver Biopsy specimens: correlation to histopathological and clinical diagnosis // Akcan Y., Tuncer S., Hayran M. et al./Scand. J. Infect. Dis. 1997. - V.29. - P. 271 - 274.

105. Pilheu J.A. Tuberculosis 2000: problems and solutions // Int. J. Tuberc. Lung Dis.-1998.-Vol.2.-No.9.-P.696-703.

106. Polymerase chain reaction amplification of a repetitive DNA sequence specific for Mycobacterium tuberculosis // Eisenach K. D., Cave M. D., Bates J.H. et al. / J. Infect. Dis. 1990. - V. 161. - P. 977 - 81.

107. Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis // Sjobring U., Meclenburg M., Andersen A. B. et al. / J. Clin. Microbiol. 1990. -V. 28. - P. 2200 - 2204.

108. Polymerase chain reaction of pleural biopsy specimens for rapid diagnosis of tuberculous pleuritis // Takagi N., Hasegawa Y., Ichiyama S. et al. / Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1998. - V.2. - P. 338 - 41.

109. Portillo Gomes L., Morris S. L., Panduro A. Rapid and efficient detection of extra - pulmonary Mycobacterium tuberculosis by PCR analysis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2000. - V. 4. - P. 361 - 370.

110. Rail A., Naghily B. Efficiency of polymerase chain reaction for the diagnosis of tuberculosis meningitis // Southeast Asian. J. Trop. Med. Public Health. 2003. -V. 34.-P. 357-60.

111. Rapid and simple approach for identification of Mycobacterium tuberculosis complex isolates by PCR based Genomic Deletion Analysis // Parsons L. M., Brosch R., Cole S. T. et al. / J. Clin. Microbiol. - 2002. - V. 40. - P. 2339 - 2345.

112. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M. et al. / J. Clin. Microbiol. 1990. - V. 28. - P. 495 - 503.

113. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens, blood and other non respiratory specimens by amplification of rRNA // Gamboa F., Manterola J. M., Lonca J. et al. / Int. J. Tub. Lung Dis. - 1997. - V. 1. - P. 542 -555.

114. Rapid diagnosis of tuberculosis by amplification of mycobacterial DNA in clinical samples // Brisson Noel A., Gicquel B., Lecossier D. et al. / Lancet. -1989. -V. 2. - 1069-71.

115. Rapid diagnosis of tuberculosis in various biopsy and body fluid specimens by