Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое определение микобактерии туберкулеза у больных различными формами туберкулеза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Носова, Елена Юрьевна

Список сокращений.

Введение.

Часть 1. Обзор литературы.

Глава 1. Лабораторные методы выявления М.tuberculosis.

Глава 2. Молекулярно-генетические методы выявления M.tuberculosis.

Глава 3. Полимеразная цепная реакция - как наиболее простой и эффективный молекулярно-генетический метод выявления M.tuberculosis.

Часть 2. Собственные исследования.

Глава 4. Материал и методы исследования.

4.1. Пациенты и клинические образцы.

4.2. Забор материала.

4.3. Обработка образцов.

4.3.1.Обработка осадков образцов для «Cobas

Amplicor».

4.3.2.0бработка осадков образцов для «Нестед

ПЦР».

4.4. Проведение анализа.

4.4.1. Приготовление реакционной смеси для ПЦР на «Cobas Amplicor».

4.4.2. Приготовление реакционной смеси для «Нестед-ПЦР».

4.5. Регистрация и анализ продуктов амплификации.

4.5.1. Анализ результатов на «Cobas Amplicor».

4.5.2. Анализ результатов после проведения «Нестед-ПЦР».

4.6. Чувствительность и специфичность «Cobas Amplicor

M.tuberculosis» теста.

4.7.0пределение чувствительности «Нестед-ПЦР».

4.8.0пределение специфичности «Нестед-ПЦР».

4.9.Стандартные характеристики системы.

Глава 5. Сравнительный анализ ПЦР с микробиологическими методами выявления M.tuberculosis.

Глава 6. Эффективность выявления M.tuberculosis у больных разными формами туберкулеза с помощью вариантов метода ПЦР.

Глава 7. Результаты применения ПНР для контроля за эффективностью проводимого лечения.

Глава 8. Результаты выявления M.tuberculosis с помощью ПЦР у пациентов в случае дифференциальной диагностики заболеваний легких.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое определение микобактерии туберкулеза у больных различными формами туберкулеза"

Актуальность р^Зоты. В последние годы эпидемиологическая ситуация по туберкулезу как в России, так и за рубежом значительно ухудшилась, возросли заболеваемость и смертность [Приймак А.А., Шилова М.В., 1996; Сон И.М., 1997; Кучеров А.Л., 2000;]. Существенно увеличилось число больных с тяжелыми и хроническими формами, особенно с лекарственно-устойчивым туберкулезом [Хоменко А.Г., Голышевская В.И., 1999; Colston M.J., 1997].

Диагностические затруднения при туберкулезе общеизвестны. Это связано в первую очередь с клинической универсальностью туберкулеза, способного поразить любые органы и ткани, с разрывом по частоте между инфицированием и развитием туберкулеза как болезни, медленным ростом возбудителя и сложностью его выделения непосредственно из клинического материала, трудностью выявления измененных, ультрамелких форм, способных персистировать в организме человека [Нестеренко JI.H., Аксенов М.Ю., 1994; Борисов С.Е., 2000].

В связи с этим проблема раннего выявления возбудителя туберкулеза в последние годы стала особенно актуальной. Классические методы диагностики туберкулеза, такие как бактериоскопия, культуральный, иммуноферментный, цитологический весьма эффективны, но отличаются или недостаточной чувствительностью, или длительностью выявления Mycobacterium tuberculosis (МБТ) [Радюк С.Н., Рыжов К.А., 1998].

Развитие и совершенствование молекулярно-диагностических методов открыло новые перспективы для быстрого выявления микобакте-рий в клинических образцах. Наиболее широко распространенным методом является полимеразная цепная реакция (ПЦР), в основе которой лежит амплификация специфического участка ДНК возбудителя. Реакция ПЦР позволяет проводить идентификацию МБТ в диагностическом материале за 5-6 часов (включая обработку материала) и обладает высокой специфичностью и чувствительностью (в диапазоне от 1-10 клеток в образце) [Shinnick Т., Jonas V., 1994; Ramon 1., Sandin R.,1996].

Существуют различные тест-системы для ПЦР-диагностики туберкулеза, которые позволяют обнаружить возбудитель за короткий промежуток времени даже у больных со скудным бактериовыделением или в случаях, когда возбудитель находится в латентной фазе или в замороженных образцах. Все они высокоспецифичны. Чувствительность же, по данным из разных литературных источников, составляет 70 - 96% [Dalovisio J., Montenegro J., 1996; Hengtler M., Klaveln P. 1996]. В то же время эффективность выявления M.tuberculosis методом ПЦР существенно колеблется при различных формах туберкулеза и в зависимости от стадии процесса и эффективности лечения [Стаханов В.А., Леви Д.Т., Владимирский М.А., 2000; Черноусова J1.H., Ларионова Е.Е., 2000]. Эти данные весьма противоречивы и, по существу, нет работ, в которых была бы сделана попытка обобщения результатов применения различных вариантов ПЦР и ее сравнения с другими современными методами диагностики, прежде всего культуральными, что и явилось целью данного исследования.

Цель работы - определить эффективность выявления M.tuberculosis в различных клинических образцах от больных разными формами туберкулеза с помощью тест-систем «Cobas Amplicor» и «не-стед-ПЦР».

Задачи работы.

1. Проанализировать выявляемость M.tuberculosis с помощью ПЦР по сравнению с другими лабораторно-диагностическими тестами, прежде всего культуральными методами определения микобактерий.

2. Оценить эффективность использования ПЦР для выявления M.tuberculosis у больных разными формами туберкулеза.

3. Провести сравнительный анализ двух тест-систем - «Cobas Amplicor» и «нестед-ПЦР» по выявлению M.tuberculosis у больных разными формами туберкулеза.

4. Изучить вероятность использования ПЦР, для дифференциальной диагностики туберкулеза и ряда других заболеваний легких.

5. Установить возможности метода ПЦР для контроля за эффективностью лечения туберкулеза основными противотуберкулезными препаратами.

Научная новизна работы заключается в разработке молекулярно-биологического комплекса тестов для выявления M.tuberculosis у больных туберкулезом на разных фазах процесса, мониторинга проводимого лечения и дифференциальной диагностики с другими заболеваниями легких.

В клинической практике для диагностики ряда форм туберкулеза была применена неизвестная ранее собственная тест-система - «нестед-ПЦР», не уступающая по эффективности коммерческой тест-системе, но значительно более дешевая.

Кроме того, в связи с тем, что используемая нами коммерческая тест-система «Cobas Amplicor» (Hoffman La Roche) предназначена для выявления микобактерии туберкулеза в респираторных образцах (мокрота, бронхоальвеолярные секреты), была решена задача адаптирования ее для выявления M.tuberculosis в нереспираторных образцах (кровь, экссудат, спинномозговая жидкость).

Практическое значение работы. Разработаны надежные и эффективные методы раннего выявления M.tuberculosis в различном клиническом материале при разных формах туберкулеза легких. Это позволяет своевременно назначить больным адекватное лечение, что в свою очередь способствует уменьшению пребывания больных в стационаре и соответственно сокращает стоимость лечения каждого больного.

Положения, которые выносятся на защиту:

1. Результаты сравнения выявления Mtuberculosis методом ПЦР с другими лабораторно-диагностическими методами, прежде всего культуральным, показали, что использование ПЦР повышает выявляе-мость M.tuberculosis на 30 % по сравнению с культуральным методом и на 50 % - с бактериоскопией.

2. Эффективность выявления M.tuberculosis методом ПЦР наиболее высока у больных с деструктивными формами туберкулеза - фиб-розно-кавернозным, инфильтративным. Выявляемость ДНК M.tuberculosis снижается при очаговых и внелегочных формах туберкулеза.

3. Результаты сравнения «Cobas Amplicor» и «нестед-ПЦР» показали, что «нестед-ПЦР» более чувствительная тест-система, однако больше подвержена контаминации. Использование же двух ПЦР тест-систем на разные участки ДНК уменьшает риск появлению ложноотри-цательных результатов.

4. Использование метода ПЦР, как одного из методических подходов для дифференциальной диагностики туберкулеза, позволило ускорить постановку диагноза и назначить адекватное лечение у больных с подозрением на рак легких и в случае неспецифических заболеваний легких. В случае дифференциальной диагностики с саркоидозом, об абсолютной эффективности подобного метода определения M.tuberculosis трудно говорить, тем более что этиология заболевания не известна. Для анализа экссудативных плевритов метод, в используемом нами варианте, оказался недостоверным.

5. Применение ПЦР для контроля эффективности лечения туберкулеза основными противотуберкулезными препаратами способствовало быстрой и достоверной оценки результатов лечения, особенно у больных с отрицательными результатами бактериоскопии и культураль-ного посева и у, так называемых, абациллярных больных.

Внедрение результатов исследования в практику. Полученные результаты, в настоящее время, используются в практической работе Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом Комитета здравоохранения Москвы по выявлению M.tuberculosis в клиническом материале для своевременной диагностики туберкулеза, в случаях неясного диагноза и для контроля за лечением. Материалы диссертации были использованы при составлении методических рекомендаций «Выявление ДНК микобактерий туберкулезного комплекса (M.tuberculosis и M.bovis) методом полимеразной цепной реакции (Н-ПЦР) в различных биологических пробах», сданы в печать.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 1Усъезде научно-медицинской ассоциации фтизиатров, Йошкар-Ола, 1999; 3 Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000; на конференции памяти М.М. Авербаха «Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы», Москва, 2000.

Содержание работы. Диссертация изложена на 77 страницах машинописного текста и состоит из: введения, 3-х глав литературного обзора, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов. В тексте содержится 11 таблиц. Библиография включает 118 источников литературы, из них 32 на русском и 86 на иностранных языках.

Часть I. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Носова, Елена Юрьевна

Выводы

1. Использование метода ПЦР для выявления ДНК M.tuberculosis в клиническом материале от больных туберкулезом повышает выявляемость возбудителя туберкулеза на 30 % по сравнению с культуральным методом и на SO % по сравнению с бактериоскопией.

2. Определение M.tuberculosis в биологическом материале методом ПЦР напрямую зависит от формы и локализации специфического процесса. Самый большой процент выявляемости имеет место у больных с деструктивными формами туберкулеза: фиброзно-кавернозный и инфильтративный. При очаговых формах, особенно туберкуломах и процессах с внелегочной локализацией выявляемость ДНК M.tuberculosis падает, но и в этих случаях диагностические преимущества ПЦР перед другими лабораторными методами очевидны.

3. Для повышения эффективности выявления возбудителя туберкулеза, желательно проводить определение минимум 3-х разных биологических образцов от каждого больного и использовать одновременно тест-системы на разные участки ДНК M.tuberculosis.

4. Метод ПЦР значительно более эффективен для оценки проводимого лечения по сравнению с традиционными способами, особенно у больных с отрицательными результатами культурального посева и микроскопии во время проводимой химиотерапии.

5. Применение ПЦР, как одного из лабораторных диагностических тестов, наиболее эффективно для дифференциальной диагностики туберкулеза с онкологическими и неспецифическими воспалительными заболеваниями легких.

Заключение

Неблагоприятная эпидемиологическая ситуация по туберкулезу и увеличение количества случаев заболевания с признаками множественной лекарственной устойчивостью требует разработки и внедрения современных методов для более быстрой и ранней диагностики туберкулеза. Существующие лабораторные методы детекции МБТ, основанные на прямом или косвенном выявлении возбудителя туберкулеза, весьма эффективны, но либо недостаточно чувствительны, либо характеризуются длительностью получения ответа. К прямым методам относятся бактериоскопия и культуральные бактериологические исследования, которые направлены на поиск и идентификацию возбудителя.

Бактериоскопическое исследование является первым, наиболее быстрым и дешевым методом выявления кислотоустойчивых микобактерий. Однако возможности его ограничены. Даже при использовании самой совершенной оптической техники обнаружение МБТ возможно только при наличии не менее 1000 микробных тел в мл материала. Такое количество микобактерий содержится в мокроте больного с выраженными деструктивными процессами, тогда как большинство больных выделяют МБТ в количестве ниже предела метода бактериоскопическо-го исследования. Кроме того, при этом виде исследования не представляется возможным дифференцировать микобактерии туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий.

Культуральный метод обладает большими возможностями и является более информативным. Он позволяет выявлять возбудитель туберкулеза при наличии не менее 100 жизнеспособных клеток в посадочном материале. Так же на выделенных культурах может быть осуществлена идентификация микобактерий, определена чувствительность МБТ к противотуберкулезным препаратам, изучена вирулентность и другие свойства микроорганизмов. Посев патологического материала осуществляют на различные плотные питательные среды (Левенштейна-Йенсена, Финна, Гельберга и др.), а также на вошедшие недавно в практику, полностью автоматизированные системы культивирования МБТ на жидких средах: BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson) и МВ/ВасТ (Organon Teknika). Основным недостатком плотных сред является весьма медленный рост на них МБТ. Использование жидких сред позволило сократить сроки выявления МБТ до 7-14 дней против 4-12 недель на плотных средах [Иртуганова О.А. и др., 2001; Bruce A. et al., 1999]. Однако существует ряд факторов, который ограничивает широкое применение этих новейших культуральных методов. Это сложности, связанные с обработкой патологического материала перед посевом, а также использованием дорогостоящих жидких питательных сред и оборудования. Все это снижает эффективность внедрения данных методов в клиническую практику.

К непрямым методам определения наличия МБТ в организме больного относятся современные тесты серодиагностики туберкулеза [Литвинов В.И. и др., 1995; Литвинов В.И., Гергерт В.Я., Мороз A.M., 1999]. Наиболее перспективным является ИФА, основанный на определении в различных биологических секретах антител к МБТ. Чувствительность ИФА позволяет определять минимальные количества (нано-граммы) вещества. Однако большое разнообразие и многочисленность антигенных детерминант у МБТ приводит к перекрестным серологическим реакциям и тем самым снижает специфичность метода. Его, в основном, используют для скрининга туберкулеза и отбора больных для дальнейшего обследования.

Таким образом, недостатки перечисленных методов показывают, что использование их в диагностике туберкулеза имеет свои ограничения. А появление морфологически измененных (зернистых, ультрамелких и L-форм) микобактерий еще больше осложняет выявление МБТ. Все выше сказанное подчеркивает необходимость использования новых более совершенных методов обнаружения МБТ, сочетающих высокую специфичность и быстроту детекции. В этом отношении одним из наиболее перспективных направлений в развитии методов прямой детекции МБТ является использование технологий, основанных на обнаружении ДНК микобактерий туберкулеза. Наиболее широко применяются в практике методы ДНК-ДНК гибридизации, изотермальной амплификации при смещении цепи ДНК (SDA), изотермальной амплификация посредством транскрипции (ТМА), обратная транскрипция и амплификация (RT-PCR), лигазная цепная реакция и полимеразная цепная реакция. Все они направлены на выявление в биологическом материале специфических нуклеотидных последовательностей, находящихся в геноме МБТ. С помощью этих методов можно быстро определить возбудитель туберкулеза в диагностическом материале, дифференцировать МБТ между собой в микобактериальном комплексе или от других нетуберкулезных (атипичных) микобактерий, использовать для штаммовой идентификс. ции [Stauffer F. et al., 1998; Черноусова J1.H., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., 2001]. Эти методы используются исследователями для решения узких научных проблем. Для выявления МБТ при большом потоке клинического материала, они оказываются слишком громоздкими.

Наиболее эффективным и удобным, для прямого обнаружения нуклеиновых кислот возбудителя туберкулеза в клиническом материале, оказался метод ПЦР. Полимеразная цепная реакция радикально снижает время проведения анализа, обладает высокой чувствительностью (от 1 до 10 клеток в образце) и специфичностью (обладает избирательной амплификацией генетического материала МБТ или МБТ-комплекса). Кроме того, ПЦР имеет особое преимущество при выявлении возбудителя, находящегося в латентной фазе или в малых количествах, когда не удается его обнаружить традиционными методами. Для детекции МБТ в клинических образцах разработаны и используются несколько тест-систем, которые в качестве мишени для амплификации используют различные участки генома МБТ: области повторяющихся последовательностей IS6110 и IS986; фрагменты ДНК-генов, кодирующие микобактери-альные антигены - белок 65 кДа, МРВ 64, антиген Ь; фрагмент гена 16s РНК. Оценка диагностической значимости каждой из систем амплификации показала, что чувствительность метода ПЦР составляет 80-97 %. Совместное использование в ПЦР анализе двух или трех систем амплификации позволяет повысить чувствительность до 98 %, а использование трех образцов от каждого пациента до 100 % [Andersen A. et al., 1993; Yamazaki Т., Nakamura R., 1993; Sandin R., 1996].

Эффективность выявления МБТ методом ПЦР, по клиническим данным ряда авторов, существенно колеблется при различных формах туберкулеза, в зависимости от стадии процесса и эффективности лечения. Также имеются работы по применению ПЦР в дифференциальной диагностике туберкулеза. Но все эти данные весьма противоречивы и по сути нет работ, в которых были бы освещены возможности и пределы метода ПЦР, обобщенные результаты применения различных вариантов ПЦР тест-систем и сравнение их с другими современными методами диагностики, что и явилось целью данного исследования.

Цель исследования - изучить эффективность выявления МБТ в различных клинических образцах от больных разными формами туберкулеза путем адаптации тест-системы «Cobas Amplicor» (Hoffman La Roche), а также применение собственной тест-системы «Нестед-ПЦР», разработанной на базе МНПЦБТ.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать возможности выявления МБТ с помощью ПЦР по сравнению с другими лабораторно-диагностическими тестами, прежде всего культуральными и методами определения микобактерий.

2. Оценить эффективность применения ПЦР для выявления МБТ у больных разными формами туберкулеза.

3. Провести сравнительный анализ двух ПЦР тест-систем -«Cobas Amplicor» и «Нестед-ПЦР» по выявлению МБТ у больных разными формами туберкулеза.

4. Изучить вероятность использования метода ПЦР для дифференциальной диагностики туберкулеза и ряда других заболеваний легких.

5. Установить возможности метода ПЦР для контроля за эффективностью лечения туберкулеза основными противотуберкулезными препаратами.

Для решения поставленных задач было выполнено исследование 994 различных биологических образцов полученных от 606 больных. Образцы включали: мокроту, бронхоальвеолярные смывы, плевральный экссудат, спинномозговую жидкость, кровь. Материал был взят у больных с разными формами туберкулеза легких (инфильтративный - 163, фиброзно-кавернозный - 62, туберкулез внутригрудных лимфатических узлов - 37, туберкулезный менингит - 24, экссудативный плеврит - 28, очаговые формы - 39, диссеминированный - 40), находящихся на лечении в МНПЦБТ, диагноз которым был поставлен на основании клинико-рентгенологических исследований. Также были обследованы 213 больных в случае необходимости дифференциальной диагностики туберкулеза со злокачественными новообразованиями легких, саркоидозом и лица, направленные на консультацию с воспалительными респираторными заболеваниями неясной этиологии.

Респираторные образцы предварительно обрабатывали реактивом NALC/NaOH для разжижения и деконтаминации. Кровь обрабатывали хлористым аммонием. Спинномозговую жидкость осаждали центрифугированием. Дальнейшую обработку осадков образцов проводили согласно рекомендациям фирмы La Roche для проведения ПЦР на тест-системе «Cobas Amplicor». Для «Нестед-ПЦР» осадки обрабатывали с использованием детергента 1% тритона (х-100).

Подготовку образцов и выявление МБТ на жидких средах МВ/ВасТ (Organon Teknika) выполняли согласно рекомендациям фирмы.

Исследования проводили, используя две ПЦР тест-системы:

1. «Cobas Amplicor - PCR» - качественный диагностический тест для определения МБТ в клинических образцах только респираторного характера (мокрота, бронхиальный секрет) с технологией амплификации и гибридизации нуклеиновых кислот для детекции МБТ. Тест основан на амплификации 584 сегмента участка ДНК МБТ в гене 16S рРНК, отвечающего за синтез рРНК. Были расширены возможности использования этой тест-системы путем подбора условий обработки образцов не респираторного характера - крови, спинномозговой жидкости и тем самым повышения эффективности ее использования.

2. Собственная тест-система - «Нестед-ПЦР», разработанная на базе МНПЦБТ, в основе которой лежит амплификация элемента IS 6110 инсерционных последовательностей, специфичных для ДНК МБТ и M.bovis.

Из литературы известно, что инсерционные последовательности IS6110 наиболее часто используются исследователями для выявления МБТ [Eisenach К. el al., 1990]. Этот факт объясняется тем, что эти последовательности имеются в МБТ от 8-16 копий, что увеличивает вероятность выявления инфекции. Кроме того, известно, что на процесс амплификации влияет качество обработки образцов. В литературе имеются данные о многочисленных методических подходах, используемых исследователями для выявления ДНК возбудителя. Введение дополнительных этапов предварительной обработки мокроты и крови по собственной схеме, позволили понизить количество ингибиторов в образце и увеличить выявляемость МБТ для тест-системы «Cobas Amplicor». Для собственной тест-системы «Нестед-ПЦР» в задачу исследований входило выбрать метод обработки образцов, который был бы не громоздким при большом потоке образцов. Поэтому, обработка NALC/NaOH с последующим прогреванием осадка в трис-буфере с 1 % тритоном при 95 °С, оказался простым и вместе с тем эффективным. Кроме того, сам подход двухэтапной ПЦР известен как увеличивающий эффективность выявления возбудителя [Ramon 1., Sandin R., 1996]. На первом этапе исходный образец достаточно разбавляется для предотвращения влияния ингибиторов амплификации, а на втором этапе нарабатываются ампликоны в нужном для детекции количестве, даже если на первом этапе их насин-тезировалось мало.

Таким образом, в дальнейших исследованиях использовали две тест-системы для выявления ДНК МБТ.

Для оценки реальной выявляемости МБТ методом ПЦР был проведен сравнительный анализ (глава 5), двух ПЦР тест-систем на разные участки ДНК МБТ - С А и Н-ПЦР с микробиологическими методами. Анализируемые респираторные образцы были получены от больных в активную фазу заболевания и независимо от формы туберкулеза. Каждый образец исследовали микроскопически, посевом на плотные и жидкие питательные среды и методом ПЦР. Полученный результат выявления МБТ методом ПЦР был собирательным, когда один из вариантов ПЦР дал положительный результат, и составил 89,1 % (см.табл. 3). Это на 30 % выше выявляемости культуральным методом и на 50 % - бактериоскопии. Такой процент выявляемости МБТ является обобщенным результатом для метода ПЦР, поскольку исследование проводили независимо от формы туберкулеза. Но так как выявление МБТ во многом зависит от формы процесса и его локализации, с нашей точки зрения более правильно проводить сравнительное исследование у больных с одной и той же формой туберкулеза и на одной фазе заболевания. Для этого были исследованы образцы респираторного и нереспираторного характера (спинномозговая жидкость, экссудат), полученные от больных с деструктивными, очаговыми и внелегочными формами туберкулеза. Полученный ПЦР результат для каждой формы туберкулеза является также собирательным (см.табл. 4) и напрямую зависит от распространенности специфического процесса. Так, самый большой процент выявляемости у больных с деструктивными формами туберкулеза - фиброзно-кавернозным и инфильтративным. По мере уменьшения выраженной деструкции легочной ткани и локализации процесса выявляемость МБТ методом ПЦР падает. При таком сравнительном анализе можно оценить реальные возможности ПЦР при различных формах туберкулеза, а также его преимущество перед другими лабораторными методами. Особенно ярко это видно при очаговых формах туберкулеза, когда из-за скудного выделения мокроты или ее отсутствия бактериологическая выявляемость МБТ затруднена, а также при внелегочных формах - туберкулезном менингите и экссудативном плеврите. Кроме того, исследование минимум 3-х образцов от одного пациента, использование тест-системы на разные участки ДНК и образцов разного характера, как при экссудативном плеврите, повышает эффективность выявления МБТ.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют преимущество ПЦР в выявлении МБТ по сравнению с традиционными методами.

Используемые в исследовании тест-системы, как сказано выше, основаны на амплификации разных участков ДНК МБТ. Поэтому, далее был проведен сравнительный анализ результативности выявления МБТ из клинического материала с помощью двух тест-систем ПЦР (СА и Н-ПЦР) у больных разными формами туберкулеза (глава 6). Параллельно, каждый больной был обследован культуральным методом в активную фазу заболевания. Результаты исследования показали, что тест-система Н-ПЦР более эффективна в выявлении МБТ из биологического материала по сравнению с СА (см.табл. 5). Это связано с тем, что количество ложноотрицательных результатов для респираторных образцов, анализируемых на СА, было более 20 % (по показателям внутреннего контроля), что, вероятно, связано с технологией обработки образцов (см.табл.

6), а также, по нашим данным, с присутствием ингибиторов реакции в образцах. В то же время, Н-ПЦР менее чувствительна к ингибиторам амплификации, что и объясняет ее преимущество над СА. Это наглядно видно из таблицы 7, где приведены результаты сравнения этих двух систем в выявлении МБТ из различного клинического материала. В то же время, в образцах со спинномозговой жидкостью амплификации на СА ничего не мешает и она проходит в 100 % случаях (по внутреннему контролю), но, по-видимому, количества клеток возбудителя в образцах такого типа недостаточно для выявления ДНК МБТ методом СА. Использование Н-ПЦР повышает эффективность выявления МБТ в спинномозговой жидкости у больных туберкулезным менингитом. Но необходимо отметить, что при работе с двухэтапной Н-ПЦР увеличивается риск контаминации. Это может происходить на этапе переноса наработанных ампликонов из первой реакции амплификации в пробирки для проведения второй реакции амплификации и тем самым способствовать появлению ложноположительных результатов. Поэтому применение Н-ПЦР может быть осуществлено только в хорошо оснащенных диагностических центрах и требует соблюдения всех правил и норм, предъявляемым лабораториям генодиагностики.

При работе с образцами крови собственные исследования показали, что для цельной крови необходима многократная отмывка осадка промывающим раствором для С А при высоких оборотах центрифугирования. Такая тщательная обработка материала необходима, поскольку гемоглобин является мощным ингибитором амплификации [Gamboa F., Manterola J., Lonca J., 1997]. Полученные результаты выявления ДНК МБТ из крови методом ПЦР демонстрируют, что метод может быть полезным в диагностике туберкулеза и использоваться для скрининга и отбора больных с подозрением на туберкулез для последующего тщательного обследования [Mittermayer Н., Tuncer S., 1997; Tuncer S. et al., 1997].

Таким образом, проведенные исследования демонстрируют необходимость использования двух ПЦР тест-систем на разные участки ДНК МБТ при анализе клинического материала на наличие МБТ. Это связано с преимуществами и недостатками каждой из используемых тест-систем. Также желательно исследовать различный биологический материал от одного больного в связи с возможными потерями МБТ при заборе и обработке клинических образцов.

Самым существенным фактором, обеспечивающим успешное лечение больных туберкулезом, является контроль за эффективностью действия лекарственных препаратов. Для оценки эффективности лечения у больных с разными формами туберкулеза был проведен сравнительный анализ выявления возбудителя туберкулеза методом ПЦР с традиционными методами диагностики в зависимости от сроков лечения (глава 7). Метод ПЦР оказался самым эффективным, так как после проведенной терапии, когда результаты культурального и бактериоскопиче-ского тестов были отрицательными, с помощью ПЦР до 3-х месяцев лечения в среднем по всем формам туберкулеза удавалось обнаружить МБТ в 30 % случаях, а после 3-х месяцев в среднем в 23 % (см.табл. 8). Кроме того, по результатам исследования больные были условно разделены на четыре группы: пациенты, у которых лечение было оценено как не эффективное, поскольку результаты ПЦР и культурального посева оставались положительными; пациенты, у которых лечение проходило с эффектом. Результаты ПЦР и культурального посева после 3-х месяцев лечения были отрицательными; пациенты, у которых только по результатам ПЦР можно подтвердить диагноз туберкулеза и оценить эффективность проводимого лечения. Это группа так называемых «абациллярных больных»; пациенты, которых можно отнести к группе риска реактивации туберкулеза в случае приостановки лечения на этом этапе, поскольку при отрицательных результатах бактериоскопии и культурального посева, ПЦР оставалась положительной.

Таким образом, полученные результаты подчеркивают возможность и необходимость использования ПЦР для мониторинга лечения.

Для оценки эффективности выявления МБТ методом ПЦР в случае дифференциальной диагностики заболеваний легких были исследованы клинические образцы, полученные от больных с предварительным диагнозом злокачественных новообразований легких, саркоидоза и неспецифических заболеваний легких, а также в случае установления этиологии экссудативного плеврита (глава 8). Полученные результаты показали, что в группе больных с первичным диагнозом рак легких использование ПЦР весьма эффективно. Так из 27 больных с предварительным диагнозом рак легких у 5 была обнаружена ДНК МБТ в диагностическом материале методом ПЦР и в дальнейшем у 4 из них был подтвержден диагноз туберкулеза. В одном случае на фоне старого неактивного очагового туберкулеза был обнаружен плоскоклеточный рак.

В группе больных с предварительным диагнозом неспецифические заболевания легких применение ПЦР оказалось также весьма эффективным. Из 52 обследованных больных у 10 в клиническом материале были обнаружены МБТ методом ПЦР. В дальнейшем у 8 из них был поставлен туберкулез. В двух случаях произошла контаминация. Такой результат исследования может послужить для быстрой постановки диагноза и назначения адекватного лечения.

В то же время, у больных с дифференциальным диагнозом саркоидоза и туберкулеза методом ПЦР ДНК МБТ была выявлена у 15 из 83 больных с гранулематозным поражением легких неясной этиологии. В дальнейшем, у 12 (14,5 %) был подтвержден диагноз саркоидоза, у 4 (4,8 %) - туберкулеза. Такой процент выявляемости микобактерий у больных саркондозом с одной стороны говорит об определенной роли МБТ в развитии этого заболевания [Saboor S., Johnson N., Мс Fadden J., 1992] и с другой показывает трудности дифференцировки туберкулеза и саркоидоза. Применение метода ПЦР для выявления ДНК МБТ в этих случаях не является абсолютно эффективным.

Используя экссудат для выявления МБТ методом ПЦР при дифференциальной диагностике плевритов, было установлено, что только в 50,3 % случаев с подтвержденным диагнозом туберкулезного плеврита ДНК МБТ была обнаружена в экссудате. Такой результат выявляемости недостаточен для верификации диагноза туберкулезный плеврит, что вероятно связано с тем, что у большинства больных этой формой туберкулеза МБТ в экссудате не выявляется никаким из известных лабора-торно-диагностических методов [Villegas М., Labrada L., Saravia N., 2000] и даже для такого чувствительного метода как ПЦР количество МБТ не достаточно. Это делает, с нашей точки зрения, недостаточно эффективным применение метода ПЦР в диагностике плевритов.

Таким образом, проведенные исследования демонстрируют возможности и пределы метода ПЦР в дифференциальной диагностике туберкулеза и других заболеваний легких.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Носова, Елена Юрьевна, Москва

1. Борисов С.Е. Диагностика туберкулеза: возможности и пределы // В сб.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. М. - 2000 - с. 92-97.

2. Винник J1.A., Стрельцова Е.Н. Избранные лекции «Туберкулез». Астрахань. 1999. - 256 с.

3. Владимирский М.А., Шипина JI.K. Молекулярно-биологические методы определения возбудителя туберкулеза // Реферативный сборник «Туберкулез». -1997. № 2. - с. 1-5.

4. Гинцбург A.JI. Генодиагностика инфекционных заболеваний // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1998. № 3. - с. 8695.

5. Голышевская В.И., Корнеев А.А., Черноусова JI.H. и др. Применение новых микробиологических технологий в диагностике туберкулеза // Проблемы туберкулеза. -1996. № 6. - с. 28-31.

6. Гребникова Т.В., Гусева М.А., Власов А.В. Применение метода ОТ-ПЦР для контроля внутрибольничной инфекции // Тезисы научно-практической конференции «Нозокомиальная туберкулезная инфекция». М.-2001. - с. 47.

7. Журавлев В.Ю., Соловьева Т.Н., Суворов А.Н. Этиологическая диагностика олиго и абациллярного туберкулеза органов дыхания // В сб.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. М - 2000. - с. 71-73.

8. Иртуганова О.А., Смирнова Н.С., Слогоцкая J1.B и др. Автоматизированные методы культурального определения M.tuberculosis на жидких средах // Проблемы туберкулеза. 2001. - № 3. - с. 53-56.

9. Иртуганова О.А., Смирнова Н.С., Слогоцкая JI.B. и др. Бактериологические методы определения лекарственной устойчивости микобак-герий туберкулеза // В сб.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. М. - 2000. - с. 73-75.

10. Кучеров А.Л. Организация борьбы с туберкулезом в современных условиях // В сб.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. М. -2000.-с. 172-173.

11. Козулицына Т.И., Макаревич Н.М. Унификация микробиологических методов исследования при туберкулезе // Приказ МЗ СССР № 558. 1978.

12. Литвинов В.И., Гергерт В.Я., Мороз A.M. Иммунология туберкулеза // Вестник РАМН. 1999. - № 7. - с. 8-11.

13. Литвинов В.И., Мороз A.M. Развитие и перспективы иммунологии и иммуногенетики туберкулеза // Проблемы туберкулеза. 1996. - № 6. - с. 14-18.

14. Литвинов В.И., Мороз A.M., Скотникова О.И. и др. Способ диагностики туберкулеза // Патент № 2163022.

15. Литвинов В.И., Черноусова Л.Н., Куликовская Н.В. и др. Принципы и методы иммунодиагностики туберкулеза // Вестник АМН. 1995. -№7.-с. 9-13.

16. Нестеренко Л.Н., Аксенов М.Ю. Тест-системы на основе полиме-разной цепной реакции для идентификации возбудителя туберкулеза // Проблемы туберкулеза. 1994. - № 2. - с. 29-32.

17. Нуратинов Р.А. Питательная среда для выращивания микобактерий // Реферативный сборник «Туберкулез». 1999. - № 1. - с. 16-19.

18. Приймак А.А., Шилова М.В. Эпидемиология туберкулеза и организация противотуберкулезной помощи в России // Российский медицинский журнал. 1996 - № 6 - с. 5-8.

19. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука. - 2000. - с. 527.

20. Пунга В.В. Своевременное выявление больных туберкулезом приоритетное направление в борьбе с этой инфекцией // Реферативный сборник «Туберкулез». - 1997. - № 1. - с. 6-8.

21. Радюк С.Н., Рыжов К.А. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1998. № 3. - с. 95-98.

22. Рональд В. Лабораторный справочник по микробиологии кислотоустойчивых бактерий. 1979. - 35 с.

23. Сон И.М. Заболеваемость туберкулезом // Реферативный сборник «Туберкулез». 1997. - № 6. - с. 1-14.

24. Стаханов В.А., Леви Д.Т., Владимирский М.А. Диагностика туберкулеза методом полимеразной цепной реакции // В сб.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. М. - 2000. - с. 85-87.

25. Херрингтон С., Макги Д. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир. - 1999. - с. 558.

26. Хоменко А.Г., Голышевская В.И. Распространенность и микробиологическая характеристика штаммов M.tuberculosis с множественнойлекарственной устойчивостью // Реферативный сборник «Туберкулез».- 1999.-№ l.-c. 1-5.

27. Хоменко А.Г., Корнеев В.Н. Применение ДНК-зондов для диагностики туберкулеза // Проблемы туберкулеза 1993. - № 6. - с. 2 -5.

28. Черноусова JI.H., Ларионова Е.Е. Обнаружение M.tuberculosis в мокроте больных с ограниченными формами туберкулеза легких методом ПЦР // В сб.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. -М.-2000. -с. 89-90.

29. Черноусова JI.H., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В. Роль ПЦР-анализа в комплексных бактериологических исследованиях во фтизиатрии // Проблемы туберкулеза. 2001. - № 3. - с. 58-60.

30. Aguado J., Rebollo М. et al. Blood-based PCR assay to detect pulmonary tuberculosis // Lancet. 1996 .- v. 347. - p. 1836-1837.

31. Andersen A., Thybo S., Godfrey-Fausett P. et al. Polymerase chain reaction for detection of M.tuberculosis in sputum // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1993. - v. 12. - p. 922-927.

32. Aoki Y., Yamada H. Clinical application of microplate DNA-DNA hybridization procedure for rapid diagnosis of mycobacterial infections // Int. J. Tubercle and Lung Diseases. 1994. - v. 75. - p. 213-219.

33. Arora S., Babu N., Jindal S. Detection of M.tuberculosis in pleural fluids: Evaluation of the polymerase chain reaction technique // ТВ 2000. ASM Conference on Tuberculosis: Past, present and future. - 2000. - p. 16.

34. Bassey E., Catty D. Candidate antigens for improved serodiagnosis of tuberculosis // Int. J. Tubercle and Lung Disease. 1996. - v. 77. - p. 136-145.

35. Bodo R., Becker A, Sohns A. et al. Comparison of Roche Cobas Amplicor M.tuberculosis assay with In-House PCR and Culture for detection of M.tuberculosis // J. Clin. Microbiol. -1998. v. 36. - p. 2023-2029.

36. Brisson-Noel A., Lecossier D., Nassif X. et al. Rapid diagnosis of tuberculosis by amplification of mycobacterial DNA in clinical samples // Lancet. 1989. - v. 2. - p. 1069-1071.

37. Bruce A., Adelen E., Bruce L. et al. Multicenter evalution of the BACTEC MGIT 960 system for recovery of Mycobacteria // J. Clin. Microbiol. 1999. - v. 30. - p.748-752.

38. Buck G., O'Hara L., Summersgill J. Rapid, simple method for treating clinical specimens containing M.tuberculosis to remove DNA for polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - v. 30. - p. 1331-1334.

39. Cave M., Eisenach P., McDermott J. et al. IS 6110: conservation of sequence in the M.tuberculosis complex and its utilization in DNA fingerprinting // Mol. Cell. Probes. 1991. - v. 5. - p. 73-80.

40. Cheng S., Ma Y., Pan Y. A study on the diagnosis of pulmonary tuberculosis and silicotuberculosis by PCR // Chung Hua Chien Ho HoHu Shi Tsa Chin. 1993. - v. 16. - p.221-224.

41. Clarridge J., Shawar R., Shinnick P. et al. Large scale use of polymerasechain reaction for detection of M.tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory // J. Clin. Microbiol. 1993. - v. 31. - p. 2041-2056.

42. Colston M. Tuberculosis: Problem solved or global crisis // Educ.Chem. 1997. - v. 34. - p. 154-156.

43. Condos R., McClune A., William N. et al . Peripheral-blood-based PCR assay to identify patients with active pulmonary tuberculosis // Lancet. -1996.-v. 347.-p. 1082-1085.

44. Cooper G., Gronde J., McGregor J. et al. The potential use of DNA probes to identify and type strains within the mycobacterium complex // Lett. Appl. Microbiol. 1989. - № 8. - p. 127-130.

45. Dalovisio J., Montenegro J. Comparison of the amplicor MTB PCR and IS 6110 PCR for detection of MTB in respiratory specimens // Clin. Infec. Diseases. - 1996. - v. 23. - p. 1099-1108.

46. D'Amato R., Wall man A., Hochstein L. et al. Rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis by using Roche Amplicor Micobacterium tuberculosis PCR Test // J. Clin. Microbiol. 1995. - v. 2. - p. 18321834.

47. De Wit D., Maartens G., Steyn L. A comparative study of the polimerasechain reaction and conventional procedures for the diagnosis of tuberculous pleural effusion // Int. J. Tubercle and Lung Diseases. -1992. v. 73. - p. 262-267.

48. Dell Portillo P., Murillo L., Elkin M. Amplification of a species-specific DNA fragment of M.tuberculosis and its possible use in diagnosis// J. Clin Microbiol. 1991. - v. 29. - p. 2163-2168.

49. Eckert H. Atiologie und pathogenese der sarkoidose // Erkrank. Atmungsorgane. 1988. - № 3. - s. 241-243.

50. Eisenach К., Cane M., Bates J. et al. Polymerase chain reaction amplification of a repetitive DNA sequence specific for M.tuberculosis // J. Infect Disease. 1990. - v. 161. - p. 977-981.

51. Eisenach K., Crawford J., Bates J. et al. Repetitive DNA sequences as probes for M.tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1988. - v. 26. - p. 22402245.

52. Eisenach K. PCR detection of M.tuberculosis // In:. Persing D.H, Smith

53. T.F, Tenover F (eds): Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and applications. Washington, DC, Amer. Soc. Microbiol. 1992.

54. Engvall E., Perlman P. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. 1971. -v. 8. - p. 871-874.

55. Fobes В., Hicks К. Direct detection of M.tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1993. - v. 31. - p. 1688-1691.

56. Folqueira L., Delgado R., Palenque E. et al. Polymerase chain reaction for rapid diagnosis of tuberculous meningitis in AIDS patients // Neurology. 1994. - v. 44. - p. 1336-1338.

57. Gamboa F., Manterola J., Lonca J. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens, blood and other non-respiratory specimens by amplification of rRNA// Int. J. Tubercle and Lung Disease.- 1997.-v. l.-p. 542-555.

58. Gonzales R., Hana B. Evaluation of gen-probe DNA hybridization systemfor the identification of mycobacterium avium-intracellulare // Diagn. Microbiol. Infect. 1987. - № 8. - p.69-77.

59. Griffin H., Griffin A. PCR technology. Current innovations // CRC Press.- 1994.

60. Grosser M., Luther Т., Muller J. et al. Detection of M.tuberculosis DNA in sarcoidosis: correlation with T-cell response // Lab Invest. 1999. - v. 79. - p. 775-784.

61. Guliang H., Tefii L. Mycobacterium tuberculosis, L-forms // Health and Disease. 1998. - v. 10. - p. 129-133.

62. Hance A., Grandchamp D., Lavy-Frebault V. et al. Detection and indentification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA // J. Mol. Microbiol. 1989. - v.3. - p. 843-849.

63. Hengtler M., Klaveln P. Evaluation of the Amplicor M.tuberculosis amplification and detection kit in a clinical laboratory. Results and experiences // Clin. Lab. 1996. - v. 42. - p. 387-393.

64. Jonas V., Alden M., Gurry J. et al. Detection and identification of M.tuberculosis directly from sputum sediments by amplification of rRNA // J. Clin. Microbiol. 1993. - v. 31. - p.2410-2416.

65. Kaltwasser G., Garsia S, Salinas A. et al. Enzymatic DNA amplification

66. PCR) in the diagnosis of extrapulmonary M.tuberculosis infection // Mol. Cell. Probes. 1993. - v.7. - p. 465-470.

67. Kocagoz Т., Yilmaz E., Ozkara S. et al. Detection of M.tuberculosis insputum samples by polymerase chain reaction using a simplified procedure // J. Clin. Microbiol. 1993. - v. 31. - p. 1435-1438.

68. Koga H., Hohno Clinical assessment of reagent for detection DNA M.tuberculosis complex by using PCR method // J. Jap. Assoc. Infec. Disease. 1997. - № 12. - p. 1246-1251.

69. Kolk A., Schuitema A., Kuijper S. et al. Detection of M.tuberculosis inclinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system // J. Clin. Microbiol. 1992. - v. 30. - p. 2567-2575.

70. Kolk A., Kox L., Lecuwen J. et al. Use of advanced technology in routinemycobacteriology: Quality control and cost benefit aspects // Int. J. Tubercle and Lung Diseases. 1995. - v. 76. - p. 144-146.

71. Koneco K., Onodera O., Miyatake T. et al. Rapid diagnosis of tuberculosis meningitis by polymerase chain reaction // Neurology. -1990.-v. 40.-p. 1617-1618.

72. Kox L., Rhienthong D., Miranda A. et al. A more reliable PCR for detection of M.tuberculosis in clinical samples // J. Clin. Microbiol. -1994. v. 32. - p. 632-678.

73. Kox L. Early diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chainreaction // Neurology. 1995. - v. 45. - p. 2228-2232.

74. Kwiatkowska S., Marczak J. Clinical utility of a commercial ligase chainreaction kit for the diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis // Int. J. Tubercle and Lung Diseases. 1999. - v. 1. - p. 421-425.

75. Lazrao R., El Baghdadi J., Guesdon J. et al. Evaluation of IS 6110 asamplification target for direct tuberculosis diagnosis // Pathol. Biol. -1999.-v. 47. p. 790-796.

76. Longo M., Beminger M., Hartly J. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reaction // Genetics. 1990. - v. 93. - p. 125-128.

77. Manjunath N., Stankar P., Rajan L. Evaluation of a polymerase chain reaction for the diagnosis of tuberculosis // Tubercle. 1991. - v. 72. - p. 21-27.

78. Miller N., Hernandez S., Cleary T. Evaluation of the Gen-Probe Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test and PCR for direct detection of M.tuberculosis in clinical specimens // J. Clin. Microbiol. -1994.-v.32.-p. 393-397.

79. Mittermayer H., Tuncer S. Community-acquired pneumonia-current statusof pathogen diagnosis // Acta Med Austriaca. 1997. - v. 24. - p. 8-9.

80. Miyazaki Y., Koga H., Kohno S. et al. Nested polymerase chain reaction for detection of M.tuberculosis in clinical samples // J. Clin. Microbiol. -1993.-v. 31.-p. 2228-2232.

81. Nolte F., Metchock В., McGowan J. et al. Direct detection of M.tuberculosis in sputum by polymerase chain reaction and DNA hybridization // J. Clin. Microbiol. 1993. - v. 31. - p. 1777-1782.

82. Noordhoek G., Kolk A , Bjune G. et al. Sensitivity and specificity of PCR for detection of M.tuberculosis: a blind comparison study among seven laboratories // J. Clin. Microbiol. 1994. - v. 32. - p. 277-284.

83. Otal I., Martin C., Vincent-Levy-Frebault V. Restriction fragment length polymorphism analysis using IS6110 as an epidemiological marker in tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1991. - v. 29. - p. 1252-1254.

84. Ozkara H., Kocagoz Т., Ozcelir U. Comparison of three different primerpairs for the detection of Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction in paraffin-embedded tissues // Int. J. Tubercle and Lung Diseases. 1998. - v. 2. - p. 451-455.

85. Pao C., Lin S., Wu S., Juang W. The detection of mycobacterial DNAsequences in uncultured clinical specimens with used Mycobacterinm tuberculosis DNA as probes // Tubercle. 1988. - v. 69. - p. 27-36.

86. Parandaman V., Narayanan S., Narayanan P. Utility of polymerase chainreaction using to probes for rapid diagnosis of tubercular pleuritis in comparison to conventional methods // Indian J. Med. Res. 2000. - v. 112.-p. 47-51.

87. Pierre C., Lecossier D., Boussougant Y. et al. Use of a reamplification protocol improves sensitivity of detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by amplification of DNA // J. Clin. Microbiol. 1991. - v. 29. - p. 712-717.

88. Propper H., Winter E., Hofler G. DNA of Mycobacterium tuberculosis in formalin-fixed paraffin-embedded tissue in tuberculosis and sarcoidosis detected by polymerase chain reaction // Am. J. Clin. Pathol. 1994. - v. 101-p. 738-741.

89. Ramon 1., Sandin R. Polymerase chain reaction and other amplification techniques in mycobacteriology // Clin, mycobacteriol. 1996. - v. 16. -p. 626-629.

90. Rigouts L., Maregega В., Traore H. et al. Use of DNA restriction fragment typing in the differentiation of M.tuberculosis complex isolatesfrom animals and human in Burundi // Int. J. Tubercle and Lung Diseases. 1996. - v. 77. - p. 264-268.

91. Rivera A., Tupasi T. Rapid and improved recovery rate of M.tuberculosisin mycobacteria growth indicator tube combined with solid Lowenstein Jensen medium // Int. J. Tubercle and Lung Diseases. 1997. - v.l. - p. 454-459.

92. Rusch-Geroles S., Domehl C., Nardi G. et al. Multicenter evaluation of the Mycobacteria Growth Indicator Tube for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to first-line drugs // J. Clin. Microbiol.1999.-v. 37.-p. 45-48.

93. Saiki R., Gelfand D., StofFel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA-polimerase // Science. -1988.-v. 239.-p. 487-491.

94. Saboor S., Johnson N., Mc Fadden J. Detection of Mycobacterial DNA in

95. Sarcoidosis and Tuberculosis with polymerase chain reaction // Lancet. -1992.-v. 339.-p. 1012-1015.

96. Sandin R. Polymerase chain reaction and other amplification techniques inmycobacteriology // In: Heifets L (ed): Clinics in Laboratory Medicine. Clinical mycobacteriology. 1996. - v. 16. - p. 617-639.

97. Schluger N., Condos R., Lewis S. et al. Amplification of DNA of Mycobacterium tuberculosis from peripheral blood of patients with pulmonary tuberculosis // Lancet. 1994. - v. 344. - p. 232-233.

98. Setki S., Abul A. Detection of M.tuberculosis by ligase chain reaction inthe respiratory specimens from patients with pulmonary tuberculosis // ТВ 2000. ASM Conference on Tuberculosis: Past, present and future. 2000.-p. 13-15.

99. Shankar P., Manjunath N., Mohan K. et al. Rapid diagnosis of tuberculosis meningitis by polymerase chain reaction // Lancet. — 1991. — v.337. p. 5-7.

100. Shawar R., el-Zaatari F., Nataraj A. et al. Detection of M.tuberculosis clinical samples by two-step polymerase chain reaction and nonisotopic hybridization methods // J. Clin. Microbiol. 1993. - v. 31. - p. 61-65.

101. Shinnick Т., Jonas V. Molecular approaches to the diagnosis of tuberculosis // Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control. -1994.-ch. 30.-p. 517-527.

102. Sjobring U., Mecklenburg M., Andersen A. et al. Polymerase chain reaction for detection of M.tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1990. - v. 28. - p. 2200-2204.

103. Sritharan V., Barker R. A simple method for diagnosing M.tuberculosis infection in clinical samples using PCR // Mol.Cell. Probes. 1991. - v. 5. - p. 385-395.

104. Stauffer F., Haber H., Rilger A. et al. Genus level identification of mycobacteria from clinical specimens by using an easy-to-handle mycobacterium-specific PCR assay // J. Clin. Microbiol. 1998. - v. 36. -p. 614-617.

105. Takagi N., Hasegawa J. Polymerase chain reaction of pleural biopsy specimens for rapid diagnosis of tuberculous pleuritis // Int. J. Tubercle and Lung Disease. 1998. - v. 2. - p. 338-341.

106. Thierry D., Brisson-Noel A., Vincent V. et al. Characterization of a M.tuberculosis insertion sequence IS 6110 and its application in diagnosis // J. Clin. Microbiol. 1990. - v. 28. - p. 2668-2673.

107. Totsch M., Bocker W., Brommelkamp E. et al. Diagnostic value of different PCR assays for the detection of Mycobacterial DNA in granulomatous lymphadenopathy // J. Pathol. 1996. - v. 172. - p. 221226.

108. Tuncer S., Tekin M., Ozen H et al. Detection of bacillus Calmette-Guerin in the blood by the polymerase chain reaction method of treated bladder cancer patients // J. Urol. 1997. - v. 158. - p. 2109-2112.

109. Victor Т., du Toit R., van Helden P. Purification of sputum samples through sucrose improves detection of M.tuberculosis by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - v. 30. - p. 1514-1517.

110. Villegas M., Labrada L., Saravia N. Evaluation of polymerase chain reaction, adenosinedeaminase and interferon-gamma in pleural fluid for the differential diagnosis of pleural tuberculosis // Chest. 2000. - v. 118.-p. 1355-1364.

111. Walker G., Fraiser M., Schram J. Strand displacement amplification an isothermal in vitro DNA amplification technique // Nucleic Acids Res.1992. v.20. - p.1691-1696.

112. Walker G., Linn C. Detection of M.tuberculosis DNA with thermophilic strand displacement amplification and fluorescence polarization // Clin. Chemistry. 1996. - v.42. - p. 1604-1608.

113. Walker G., Nadeau J., Linn C. A DNA probe assay using strand displacement amplification (SDA) and filtration to separate reacted and unreacted detector probes // Mol. Cell Probes. 1995. - v. 9. - p. 399403.

114. Wilson S., McNerney R., Nye P. et al. Progress towards a simplified polymerase chain reaction and its application to diagnosis of tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1993. - v. 31. - p. 776-782.

115. Yamazaki Т., Nakamura R. Detection of Mycobacterium intracellulare by PCR // Kekkaku. 1993. - v. 68. - p. 687-693.

116. Yuen K., Chan K., Chan C. et al. Use of PCR in routin diagnosis of treated and untreated pulmonary tuberculosis // J. Clin. Pathology.1993.-v. 46.-p. 318-322.