Характеристика клинически значимых биологических свойств возбудителя туберкулеза, выделенного из резецированных участков лёгких больных туберкулёзом

Белоусова, Ксения Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика клинически значимых биологических свойств возбудителя туберкулеза, выделенного из резецированных участков лёгких больных туберкулёзом
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика клинически значимых биологических свойств возбудителя туберкулеза, выделенного из резецированных участков лёгких больных туберкулёзом"

На правах рукописи

БЕЛОУСОВА Ксения Валерьевна

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЁГКИХ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЁЗОМ

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г г МАЙ 2014

005548517

Екатеринбург - 2013

005548517

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Екатеринбург.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Скорняков Сергей Николаевич кандидат биологических наук Кравченко Марионелла Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Немцева Наталия Вячеславовна

доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой фтизиопульмонологии ГБОУ ВГТО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России Шурыгин Александр Анатольевич

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Южно-Уральский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

Защита диссертации состоится «27» июня 2014 года в 12.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 при ФГБУН Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс:(342)280 92 11.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegrn.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegrn.ru).

Автореферат диссертации разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы исследования

В настоящее время эффективность химиотерапии, которая является главным средством лечения туберкулеза, остается невысокой. Одной из основных причин этого является лекарственная устойчивость (ЛУ) микобактерий туберкулеза (МБТ). Проблема ЛУ возбудителя туберкулёза приобрела в последнее время глобальное значение (Viljanen М.К., Vyshnevskiy B.L, Otten T.F., 1998; Пунга B.B., Капков Л.П., 1999; Friedman L.N., 2001; Туберкулез в РФ 2007 г., 2008; Бюллетень программы ВОЗ по борьбе с туберкулезом в РФ, 2012). Клиническое излечение у впервые выявленных больных с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) МБТ остается низким и составляет в Российской Федерации 16,2%, что в 3,1 раза ниже уровня клинического излечения туберкулеза у больных с лекарственно чувствительным (ЛЧ) возбудителем туберкулеза (Шилова М.В., 2007). В то же время, у значительного числа пациентов на этапах терапевтического лечения получить сведения о ЛЧ возбудителя к противотуберкулёзным препаратам (ПТП) невозможно в силу ограниченности и олигобактериальности процесса.

При туберкулёмах обнаружение МБТ в мокроте и промывных водах бронхов (ПВБ) составляет около 10,0% (Репин Ю.М., Авестян А.О., 2001). При посеве резецированного участка легкого выявление МБТ достигает 24,2% - 57,9% (Репин Ю.М., 1991; Григорян В.А., Головченко Р.Н., 2003; Карсканова С.С., 2007). При бактериологическом исследовании резецированных участков легких выявляется от 16,0% до 49,0% МБТ с ЛУ (Головченко Р.Н., Григорян В.А., 2001; Григорян В.А., Головченко Р.Н., 2003). Свойства возбудителя непосредственно в очагах туберкулезного поражения остаются малоизученными. Важность исследования ЛЧ МБТ заключается в необходимости назначения больным адекватной химиотерапии.

В связи с тем, что классические бактериологические методы обнаружения, идентификации и определения ЛЧ МБТ требуют длительного времени (до 3-х месяцев), а также весьма ресурсоемки, в последние годы активно применяются молекулярно-генетические методы, лишенные перечисленных недостатков (Нопоге-Bouakline S., Vincensini J.P., 2003; Cheng V.C., Yew W.W, 2005; Галкина К.Ю.,

Носова Е.Ю., 2007; Барило В.Н., Кузьмин A.B., Черноусова JI.H., 2009; Гаева Н.Д., Жилин О.В., 2010).

Изучение резецированного участка легкого дает наиболее полные сведения об особенностях процесса, возбудителе заболевания, его видовой принадлежности, чувствительности к ПТП и эффективности лечения. Значение бактериологических и молекулярно-генетических методов исследования резецированного участка легкого определяется необходимостью проведения послеоперационного курса химиотерапии с учетом данных о возбудителе и его чувствительности к ПТП.

Цель работы. Изучение клинически значимых биологических свойств возбудителя туберкулеза, выделенного из резецированных участков лёгких.

Основные задачи исследования:

1. Оценить роль культуральных и молекулярно-генетических методов выявления микобактерий туберкулеза и определения их лекарственной чувствительности при исследовании резецированных участков легких и респираторного материала (мокроты, промывных вод бронхов), полученных от больных, находящихся на хирургическом этапе лечения туберкулеза.

2. Провести сравнительный анализ клинически значимых биологических свойств (лекарственная чувствительность, массивность и скорость роста) возбудителя туберкулёза, выделенного из резецированных участков легких и респираторного материала, полученного на терапевтическом и хирургическом этапах лечения больных.

3. Провести анализ вариантов мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость, у микобактерий туберкулеза, выделенных из резецированных участков легких.

4. Разработать алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких больных, перенесших хирургический этап лечения по поводу туберкулёза легких.

Научная новизна

Установлена высокая диагностическая значимость исследования операционного материала больных туберкулезом легких молекулярно-

генетическими методами. Показана возможность исследования операционного материала методом биочипов, а также установлена высокая частота совпадений результатов определения лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду и рифампицину методом биочипов и методом абсолютных концентраций при исследовании резецированных тканей легких. Впервые представлен анализ вариантов мутаций, обуславливающих лекарственную устойчивость МБТ, полученных из операционного материала, показана частота встречаемости выявленных мутаций. Выявлена идентичность генотипов изолятов МБТ, выделенных из различного биологического материала.

Научная новизна исследований подтверждается получением патента РФ на промышленный образец «Схема проведения исследования резецированных участков легких» № 82727 от 16 августа 2012 г.

Теоретическая и практическая значимость работы Результаты исследований, выполненных в рамках данной диссертационной работы, позволили обосновать необходимость бактериологического исследования резецированных участков легких как обязательного этапа диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза и внедрить исследование операционного материала в клинико-лабораторную практику ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» г. Екатеринбурга, ГБУЗ Свердловской области «Противотуберкулезный диспансер» г. Екатеринбурга и ГБУЗ «Челябинский областной клинический противотуберкулезный диспансер» г. Челябинска.

Полученные данные позволили оценить роль бактериологических и молекулярно-генетических методов выявления МБТ и определения их ЛЧ при исследовании резецированных участков легких и респираторного материала и включить материалы исследования в программы последипломной подготовки врачей-фтизиатров и бактериологов в ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» г. Екатеринбурга и в учебные курсы кафедры фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России г. Екатеринбурга.

Кроме того, результаты исследования вошли в проект концепции по химиотерапии туберкулеза в Российской Федерации (приложение №4) (Медицинский альянс, 2013. №1. С. 5-21).

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Молекулярно-генетические методы исследования имеют большую разрешающую способность и сокращают сроки выявления микобактерий туберкулеза из резецированных участков легких и определения их лекарственной чувствительности по сравнению с культуральными методами.

2. Результаты определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза методом биочипов совпадают с результатами определения лекарственной чувствительности методом абсолютных концентраций.

3. Резецированные участки легких являются информативным материалом, позволяющим получить достоверные сведения о возбудителе туберкулеза непосредственно из очага туберкулезного поражения.

4. Алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких от больных, оперированных по поводу туберкулеза, позволяет повысить диагностическую значимость и сократить время данного исследования.

Апробация работы и публикации

Основные результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Модернизация фтизиатрии. Современные технологии оказания противотуберкулезной помощи населения» (г. Екатеринбург, 2011 г.); Юбилейной сессии, посвященной 90-летию ЦНИИТ РАМН «Актуальные вопросы борьбы с туберкулезом» (г. Москва, 2011 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом» (Санкт-Петербург, 2011 г.); конференции молодых ученых с международным участием «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (г. Москва, 2012 г.); научно-практической конференции «Инновационные медицинские и образовательные технологии в обеспечении качества и доступности противотуберкулезной помощи населению» (г. Екатеринбург, 2012 г.); I Конгрессе Национальной ассоциации фтизиатров

«Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации» (г. Санкт-Петербург, 2012 г.); Региональной научно-практической конференции с международным участием «Пути повышения качества и эффективности деятельности противотуберкулезных учреждений» (г. Екатеринбург, 2013 г.); Научной сессии Уральского НИИ фтизиопульмонологии с международным участием «Фундаментальные исследования практический фтизиатрии» (г. Екатеринбург, 2013 г.).

По теме диссертации опубликовано 12 работ, 3 из них - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и выводов, списка литературы. Объем диссертации - 148 страниц печатного текста. Диссертация содержит 24 таблицы и 15 рисунков. Список литературы включает 105 отечественных и 125 иностранных источников.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора Разработанная автором тема выполнялась в рамках комплексного исследования Уральского НИИ фтизиопульмонологии «Лечебно-диагностические и организационные технологии повышения медико-социальной эффективности специализированной и высокотехнологичной медицинской помощи больным туберкулезом основных локализаций» (номер государственной регистрации 01200953414). Ее результаты вошли в отчеты учреждения о выполнении государственного задания по фундаментальным НИР.

систематизации результатов работы. Автором разработан алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких, сформулированы основные положения и выводы диссертационной работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа проводилась в лаборатории экспериментальных и диагностических методов исследования ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» Минздрава России в период с 2010 по 2013 годы.

Материалом исследования служили:

1. Результаты ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, прооперированных в клинике Уральского НИИ фтизиопульмонологии по поводу туберкулеза легких в 2010-2011 гг. (п=291).

2. Результаты проспективного исследования резецированных участков легких (п=291), мокроты и промывных вод бронхов (п=219) от оперированных больных по поводу туберкулеза легких; культуры МБТ (п=102), выделенные из мокроты и резецированных участков легких больных, оперированных по поводу туберкулеза легких.

Всего было исследовано 510 образцов биологического материала и 102 культуры МБТ, полученных от 291 больного различными формами туберкулеза легких. У 259 (89,0% (95% ДИ 84,8%-92,4%)) больных туберкулезом легких был установлен диагноз «туберкулема легкого», у остальных 32 (11,0% (95% ДИ 7,7%-15,2%)) - «кавернозный» и «фиброзно-кавернозный туберкулез легких».

Среди оперированных больных было 198 (68,0% (95% ДИ 62,3%-73,3%)) мужчин и 93 (32,0% (95% ДИ 26,7%-37,7%)) женщины в возрасте от 16 до 61 года. Средний возраст пациентов составил 34 (26;42) года.

Методы исследования. Дизайн исследования представлен на рис. 1. Культуральными и молекулярно-генетическими методами у больных исследовали двукратно мокроту или промывные воды бронхов (при возможности получения материала) непосредственно перед операцией и резецированные участки легкого.

Известные данные по возбудителю туберкулеза

Гистологическое исследование

Пациент

Операционный материал

2х кратное исследование ' мокроты или ПВБ пород операцией

Культурзльные

методы исследования

Бактериоскопия

ОпределениеЛУ методомабсолютных концентраций

VNTR генотипирование

.......,

ПЦР

гг.::

:Bn04Hn-MDR!> «Биочип-FQ*

Рисунок 1 - Дизайн исследования

Бактериологические методы исследования. Бактериологическое исследование включало люминесцентную микроскопию фиксированных препаратов из деконтаминированных осадков мокроты, промывных вод бронхов и гомогенизированных кусочков операционного материала и посев осадка на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена («Himedia Laboratories», Индия).

При микроскопическом исследовании количественную оценку препаратов проводили согласно приказу № 109 от 21.03.2003г. («О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», приложение №11).

Анализ JI4 МБТ проводили методом абсолютных концентраций с использованием плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена. Культуры М. tuberculosis по чувствительности к основным ПТП делили на ЛЧ и ЛУ в соответствии с приказом МЗ РФ № 109 от 21.03.2003г (концентрация изониазида (Н) - 1 мкг/мл, рифампицина (R) - 40 м кг/мл, этамбутола - 2 мкг/мл, стрептомицина -10 мкг/мл, канамицина-30 мкг/мл).

Молекулярио-генетические методы исследования. Обработку первичного материала для выделения ДНК проводили коммерческим набором «ДНК-сорб-В»

(«Амплисенс», Россия). Операционный материал предварительно гомогенизировали. Для амплификации специфической нуклеотидной последовательности IS6110 геномного материала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в «режиме реального времени» использовали тест-систему «АмплиСенс®МТС-РЬ» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) и амплификатор iCycler iQ5 (Bio-Rad, США).

Для молекулярно-генетического исследования мутаций ЛУ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам (FQ) был использован метод гибридизации с флуоресцентным изображением на биологическом микрочипе «ТБ-БИОЧИП®» и «ТБ-БИОЧИП®-2» (ООО «Биочип-ИМБ», Москва). Доминирующие олигонуклеотиды, размещенные на биочипах, способны обнаруживать мутации в генах rpoB, katG, irthA, ahpC и gyrA. Анализ результатов гибридизации проводили на приборе «Чипдетектор-01» с использованием специализированного программного обеспечения «Imageware» (ООО «Биочип-ИМБ», Москва).

Методом MIRU-VNTR типирования было исследовано 18 культур МБТ, полученных от 7 больных (7 изолятов, выделенных из операционного материала, и 11 изолятов, выделенных из респираторного материала этих же больных). Изоляты были генотипированы с использованием 7 локусов: MIRU10, MIRU26, MIRU31, Mtub21, ETRA, QUB26, QUBllb. Для постановки ПЦР использовали реактивы производства «Интерлабсервис» (Москва) и праймеры для ПЦР ООО «Синтол» (Москва). ПЦР осуществляли в термоциклере «Терцик» (ООО «ДНК-технология», Москва). Продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле с использованием камеры для горизонтального электрофореза Sub Cell GT System (Bio-Rad, США). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США). Принадлежность к генетической линии определяли путем сравнения полученных MIRU-VNTR профилей изолятов с имеющимися в базе данных «MIRU-VNTRp/iW» (http://www.miru-vntrplus.org).

Статистическая обработка результатов исследований. Результаты проведенных исследований статистически обработаны с использованием лицензионной компьютерной программы MedCalc® V12.6.1 (MedCalc Software,

Бельгия). Для всех статистических критериев ошибка первого рода устанавливалась равной 0,05.

Собственные результаты исследований и их обсуждение

Для изучения роли культуральных и молекулярно-генетических методов выявления МБТ и определения их лекарственной чувствительности при исследовании резецированных участков легких и респираторного материала исследовали мокроту, промывные воды бронхов и операционный материал от 291 больного туберкулёзом лёгких следующими методами: микробиологическим (бактериоскопия, посев на плотные питательные среды) и молекулярно-генетическим (Real-time PCR, Биочип).

При сравнении выявляемости МБТ различными методами из респираторного и операционного материала были получены следующие данные. При исследовании респираторного материала, полученного непосредственно перед оперативным этапом лечения, были найдены кислотоустойчивые микобактерии методом бактериоскопии в 13,7% (95% ДИ 9,2%-19,3%) (27 из 197) образцов; МБТ методом посева выявлены в 18,8% (95% ДИ 13,6%-25,0%) (37 из 197) образцов; ДНК М. tuberculosis complex методом ПЦР в режиме «реального времени» обнаружена в 19,9% (95% ДИ 14,0%-2б,9%) (32 из 161) образцов. При исследовании резецированных участков легких были обнаружены кислотоустойчивые микобактерии методом бактериоскопии в 59,5% (95% ДИ 53,6%-65,2%) (173 из 291) образцов; культуры МБТ методом посева на среде Левенштейна-Йенсена выявлены в 22,3% (95% ДИ 17,6%-27,5%) (65 из 291) образцов; ДНК М. tuberculosis complex методом ПЦР найдена в 97,9% (95% ДИ 95,5%-99,2%) (285 из 291) образцов.

При сравнительном анализе биологических свойств МБТ, полученных из различного материала, было установлено, что скорость роста МБТ (п=37), выделенных из респираторного материала, составила 59 (15) суток; скорость роста МБТ (п=65), выделенных из операционного материала, составила 56 (17) суток. В скорости роста культур МБТ, выделенных из респираторного и операционного материала, статистических различий не найдено (р=0,261).

Вместе с тем, массивность роста культур МБТ, полученных из респираторного и операционного материала статистически различалась (р=0,01). При посеве операционного материала в 40,0% (95% ДИ 28,0%-52,9%) (26 из 65) случаев отмечали умеренный рост, в 36,9% (95% ДИ 25,3%-49,8%) (24 из 65) - обильный, в 23,1% (95% ДИ 13,5%-35,2%) (15 из 65) - скудный. При посеве респираторного материала скудный рост отмечали в 69,4% (95% ДИ 51,8%-83,6%) (26 из 37) случаев, обильный - 19,5% (95% ДИ 8,2%-36,1%) (7 из 37), умеренный - 11,1% (95% ДИ 3,1%-26,0%) (4 из 37). Это, по-видимому, можно объяснить тем, что в операционном материале содержится большее количество МБТ, чем в респираторном материале.

Лекарственная чувствительность МБТ была определена методом абсолютных концентраций в 18,8% (95% ДИ 13,6%-25,0%) (37 из 197) образцов респираторного материала и в 22,3% (95% ДИ 17,6%-27,5%) (65 из 291) образцов операционного материала. С помощью метода биочипов было определено наличие или отсутствие мутаций, обуславливающих лекарственную устойчивость к ПТП, в геноме МБТ в 7,5% (95% ДИ 3,9%-12,7%) (12 из 161) образцов респираторного материала и в 95,9% (95% ДИ 92,3%-97,9%) (279 из 291) образцов операционного материала.

Таким образом, при исследовании операционного материала молекулярно-генетические методы имеют достоверно большую разрешающую способность по сравнению с культуральными методами (х2= 325,5; р<0,01) и позволяют выявить МБТ из резецированных участков легких и установить их лекарственную чувствительность в 4 раза чаще. Однако при исследовании респираторного материала, полученного на этапе хирургического лечения, разрешающая способность молекулярно-генетических и культуральных методов достоверно не отличается (х2= 0,068; р=0,79).

Важно отметить, что при выявлении МБТ и определении их ЛЧ классическими культуральными методами на плотных средах этот процесс занимает от 2 до 3 месяцев. Применение молекулярно-генетических методов значительно сокращает сроки выполнения анализа и получения результатов до 5 дней.

У культур МБТ, выделенных из резектатов легких, при определении ЛЧ методом абсолютных концентраций показатель устойчивости к стрептомицину и изониазиду оказался наиболее высоким и составил 92,3% (95% ДИ 82,9%-97,5%); показатели устойчивости к рифампицину и этамбутолу также достаточно высоки и составили 90,8% (95% ДИ 81,0%-96,6%) и 80,0% (95% ДИ 68,2%-88,9%), соответственно. Более низкий показатель устойчивости был отмечен для канамицина - 35,4% (95% ДИ 23,9%-48,2%). Обращает на себя внимание превалирование штаммов МБТ, выделенных из операционного материала, устойчивых ко всем препаратам первого ряда в 84,6% (95%ДИ 73,5%-92,4%) (55 из 65) случаев.

Данные о лекарственной чувствительности МБТ, полученные методом биочипов, представлены в табл.1. Анализ устойчивости к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам методом биочипов показал, что 69,9% (95% ДИ 64,1%-75,2%) (195 из 279) изолятов МБТ имели мутации в генах гроВ, каЮ, тИА, промоторной области аИр-охуЯ и а 30,1% (95% ДИ 24,8%-35,9%) (84 из 279) изолятов этих мутаций не имели.

Таблица 1

Спектр лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного материала, полученный методом _биологических микрочипов_

Чувствительность/ устойчивость, препарат Количество

абс. % абс. %

Чувствительность ко всем препаратам 84 30,1 84 30,1

устойчивость к Н 36 12,9

Моноустойчивость устойчивость к Я 7 2,5 46 16,5

устойчивость К Р<3 3 1,1

Множественная устойчивость к Н, Я 120 43,0 149 53,4

устойчивость (МЛУ) устойчивость к Н, Я, ТО 29 10,4

Всего: 279 100,0 279 100,0

У 7 больных удалось сравнить результаты определения ЛЧ МБТ, выделенных из резецированного материала и респираторного материала, полученного перед

операцией, двумя методами (методом абсолютных концентраций и методом биочипов). Данные о ЛЧ МБТ, выделенных из различного материала на хирургическом этапе лечения, совпали.

Совпадение результатов по ЛЧ МБТ, полученных из операционного материала, методом биочипов и методом абсолютных концентраций составило 87,3% (95% ДИ 76,5%-94,4%). Сравнение результатов по ЛУ МБТ к изониазиду и рифампицину, полученных культуральными и молекулярно-генетическими методами, показало высокий процент совпадения: 88,9% (95% ДИ 78,5%-95,4%) -для изониазидаи 85,8% (95% ДИ 74,7%-93,3%) - для рифампицина.

Несовпадение результатов определения лекарственной чувствительности, полученных различными методами, объясняется тем, что не все возможные мутации, ответственные за устойчивость, можно определить с помощью биочипов; не все мутации имеют фенотипическое проявление при культивировании штаммов на плотной питательной среде, а также в образцах материала может находиться смешанная популяция, включающая как устойчивые, так и чувствительные МБТ.

Для подтверждения идентичности генотипов МБТ, выделенных из респираторного материала с генотипами МБТ, полученных из очага туберкулезного поражения, было проведено VNTR-генотипирование МБТ из респираторного и операционного материала.

Исследовано 18 изолятов М. tuberculosis, полученных от 7 больных (7 изолятов выделенных из операционного материала и 11 изолятов, выделенных из мокроты и/или ПВБ этих же пациентов). По результатам исследования все изученные изоляты М. tuberculosis отнесены к группе Beijing (100%) и разделены на 5 кластеров. Генотипы микобактерий туберкулеза, выделенных при исследовании резектатов легких, по 7 локусам были идентичны генотипам микобактерий туберкулеза, полученных при исследовании респираторного материала.

Анализ операционного материала (п=279) на биочипах выявил широкий спектр мутаций в генах М. tuberculosis, связанных с лекарственной устойчивостью к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам, и продемонстрировал преобладание мутаций в 531 кодоне гена rpoB (Ser->Leu) в 45,5% (95% ДИ 39,6%-51,5%) (рис.2-а)

и 315 кодоне гена каЮ (8ег->ТЬг(1)) в 62,7% (95% ДИ 56,7%-68,4%) случаев (рис.2-Ь). В гене '¿уг А преобладают мутации в 90 кодоне в 3,6% (95% ДИ 1,7%-6,5%) случаев (А1а->Уа1) и в 94 кодоне в 2,5% (95% ДИ 1,0%-5,1%) (Азр->С1у) случаев (рис. 2-е.). Остальные мутации представлены единичными случаями (рис. 2,).

а)

с)

Ь)

5ег531->61п 0,4

Н|5526->А$р 0,4

Бег531->Тгр 0,7

1_еи533->Рго 0,7

1.еи511->Рго 0,7

Н<552б->Туг 0,7

Н)5526->Су^ : 0,7

А5р516->Туг 1 0,7

Азр516->Туг 1 1,1

5ег531->Суз 1 1.4

Ме1515->11е 1 1,4

Н(5526 >Л5П 1 1.4

Н^526->1еи Ш 1,8

5ег531->1_еи ^даяйшеша»

аНрСб ! 0,4

аЬрС_Т12 1 0,4

¡пИА_е8 1 0,4

5ег315->6!у 1 0,4

аНрС_Т10 1 0,7

)пЬА_в16 1 1Д

1пЬА_А8 1 1Д

¡пЬА_Т15 Свг^тС чТЬгМ \

5ег9Б->ТЬг Ш ....... . 1 0,4

Бег91_Ь 1 0,4

АьрЭ4->Н)з 1 0,4

Аьр94->Туг 1 0,7

А5р94->А5П I 0,7

5ег91->Рго Я 1,4

А$р94->А1а т 1,8

А5р94->С1у И 2,5

А!а90->Уз1 К з,б

45,5

62,7

Рисунок 2 - Частота встречаемости (%) мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость к а) рифампицину, Ь) изониазиду, с) фторхинолонам, у микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного материала

Анализ данных о выявленных мутациях и их сочетаниях в генах показал широкое распространение множественно лекарственно устойчивых штаммов МБТ с комбинированной мутацией 8ег531->Ьеи (в гене гроВ) и 5егЗ 15->ТЬг (в гене ШС), обладающих высокой устойчивостью как к рифампицину, так и к изониазиду в 72,4% (95% ДИ 63,6%-80,1%) случаев. Также было выявлено сочетание этих же мутаций с мутациями Азр94->01у, А1а90->Уа1. А5р94->А1а (в гене gугА), ответственными за ЛУ к фторхинолонам в 19,4% (95% ДИ 7,5%-37,5%), 16,1% (95% ДИ 5,4%-33,7%), 16,1% (95% ДИ 5,4%-33,7%) случаев соответственно.

Для изучения особенностей лекарственной чувствительности МБТ больные по данным ретроспективного анализа историй болезни были разделены на две группы. Первая группа включала 168 (57,7% (95%ДИ 51,8%-63,4%)) больных без бактериовыделения, то есть лекарственная чувствительность МБТ у них не была установлена. Вторая группа была представлена 123 (42,3% (95%ДИ 36,6%-48,2%)) больными с бактериовыделением, лекарственная чувствительность МБТ этих больных была известна на этапе терапевтического лечения (до хирургического вмешательства).

На рис. 3 представлены результаты молекулярно-генетического определения лекарственной чувствительности МБТ, выделенных из операционного материала, у разных групп больных. В группе больных с ранее неустановленной лекарственной чувствительностью доля МБТ с МЛУ составила 46,0% (95% ДИ 38,1%-54,0%) (74 из 161). Доля МБТ с МЛУ в группе бактериовыделителей была 63,6% (95% ДИ 54,2%-72,3%) (75 из 118). Таким образом, у обеих групп больных преобладали МБТ с множественной лекарственной устойчивостью.

15,2

Бактериовызелитета i

Больные oe'j багаериовыделешш

□ Чувствительные МВТ В Моноустойчнвые МБТ ®МБТсМЛУ

Оощее количество пациентов

Рисунок 3 - Результаты молекулярно-генетического определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного материала,

у разных групп больных

Данные о лекарственной чувствительности МБТ, полученных из респираторного материала на этапе терапевтического лечения и из операционного материала, совпадают в 58,5% (95% ДИ 49,0%-67,5%) (69 из 118) случаев. У 41,5% (95% ДИ 32,5%-50,9%) (49 из 118) больных спектр лекарственной чувствительности МБТ, полученных из операционного материала, отличается от спектра лекарственной чувствительности МБТ, выделенных из респираторного материала на этапе терапевтического лечения. В 34,7% (95% ДИ 26,2%-44,0%) (41 из 118) случаев на этапе терапевтического лечения были выявлены лекарственно чувствительные МБТ, тогда как при исследовании операционного материала этих же больных обнаружены МБТ с лекарственной устойчивостью. У остальных 6,8% (95% ДМ 3,0%-12,9%) (8 из 118) больных на этапе терапевтического лечения были выявлены МБТ с лекарственной устойчивостью, однако из операционного материала на этапе хирургического лечения обнаружены лекарственно чувствительные МБТ. Таким образом, на этапах терапевтического и хирургического лечения спектр лекарственной чувствительности МБТ отличался.

На рис. 4 изображен алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких, разработанный и внедренный в УНИИФ (патент РФ на промышленный образец «Схема проведения исследования резецированных участков легких» № 82727 от 16 августа 2012 г.).

Суть алгоритма заключается в том, что предложенная схема исследования операционного материала включает в себя следующие методы исследования: бактериоскопию, посев на плотные питательные среды с последующим определением ЛЧ методом абсолютных концентраций, молекулярно-генетические методы (ПНР и метод биочипов) и гистологическое исследование с целью верификации диагноза.

Особенностью данного алгоритма является то, что нефиксированный резецированный материал в течение одного часа после операции доставляется в бактериологическую лабораторию, где в стерильных условиях патологоанатом из наиболее крупной туберкулемы или каверны (при наличии распада - из зоны распада) скальпелем вырезает кусочки ткани для культуральных и молекулярно-генетических методов исследования. Оставшийся материал отправляется в лабораторию патоморфологии для проведения гистологического исследования.

.'- щи и !| Операционный

I материал |

- <* 1 • ••Г*" таешш

г ______ . _______________1 ___________

1 1

Бактериоскопия Посев на плотные (

питательные среды ; исследование

_____Биочип-МОВ

ОпределениеЛЧ Биочип-РО. методом абсолютных | концентраций

Рисунок 4 — Алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких

ПЦР Гистологическое

Сочетание бактериоскопии, культурального и молекулярно-генетического методов является оптимальным при исследовании операционного материала. Данный алгоритм позволяет ускорить диагностику и повысить эффективность лечения больных туберкулёзом лёгких после оперативного вмешательства за счет своевременной корректировки химиотерапии.

ВЫВОДЫ

1. Молекулярно-генетическое исследование резецированных участков легких имеет большую диагностическую ценность при выявлении микобактерий туберкулеза и определении их лекарственной чувствительности по сравнению с культуральными методами.

2. Совпадение результатов исследования лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, выделенных из резектатов легких, культуральными и молекулярно-генетическими методами составило 87,3% (95% ДИ 76,5%-94,4%).

3. Генотипы микобактерий туберкулеза, выделенных при исследовании резектатов легких, идентичны генотипам микобактерий туберкулеза, полученных при исследовании респираторного материала, полученного непосредственно перед оперативным вмешательством, по 7 локусам.

4. Анализ операционного материала на биочипах выявил широкий спектр мутаций в генах М. tuberculosis, связанных с лекарственной устойчивостью к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам, и продемонстрировал преобладание мутаций в 531 кодоне гена rpoB (Ser->Leu) в 45,5% (95% ДИ 39,6%-51,5%) случаев, 315 кодоне гена katG (Ser->Thr(l)) в 62,7% (95% ДИ 56,7%-68,4%) и 90 и 94 кодонах гена gyr/l в 3,6% (95% ДИ 1,7%-6,5%) (Ala->Val) и в 2,5% (95% ДИ 1,0%-5,1%) случаев (Asp->Gly) соответственно.

5. В результате проведенного исследования установлено, что больше, чем у половины (57,7% (95% ДИ 51,8%-63,4%)) больных при поступлении на хирургический этап лечения в клинику Уральского НИИ фтизиопульмонологии отсутствуют данные о лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза. При исследовании резецированных участков легких молекулярно-генетическими

методами удалось выявить микобактерии туберкулеза в 95,8% (95% ДИ 91,б%-98,3%) случаев и определить наличие микобактерии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью в 46,0% (95% ДИ 38,1%-54,0%) случаев у данной группы пациентов.

6. У бактериовыделителей при сопоставлении данных о лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного материала и из респираторного материала, полученного на этапе терапевтического лечения, установлено, что у 41,5% (95% ДИ 32,5%-50,9%) больных изменился спектр лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в сторону нарастания последней.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Бобровская (Белоусова), К.В. Определение лекарственной устойчивости М. tuberculosis к рифампицину и изониазиду методом абсолютных концентраций и анализ мутаций на биологических микрочипах / К.В. Бобровская, Е.Ю. Камаев, Д.В. Вахрушева, М.А. Кравченко // Омский научный вестник. - 2009. - №1 (84). - С. 9-13.

2. Бобровская (Белоусова), К.В. Изучение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, полученных из резецированных участков легких / К.В. Бобровская, М.А. Кравченко, Е.Ю. Камаев, Р.Б. Бердников // Туберкулёз и болезни лёгких. - 2011. - №4. - С. 56-57.

3. Бобровская (Белоусова), К.В. Лекарственная чувствительность микобактерий туберкулеза, полученных из мокроты и операционного материала больных с туберкулемами легких / К.В. Бобровская, М.А. Кравченко, Р.Б. Бердников // Уральский Медицинский журнал. - 2013. - №2 (107). - С. 50-53.

Публикации в других журналах и сборниках

4. Бобровская (Белоусова), К.В. Оценка частоты и спектра лекарственной устойчивости возбудителя туберкулёза молекулярно-генетическими и культуральными методами при изучении резецированных участков лёгких / К.В. Бобровская, М.А. Кравченко, С.Н. Скорняков, С.С. Карсканова, Е.Ю. Камаев //

Совершенствование медицинской помощи больным туберкулёзом: Сборник трудов научно-практической конференции. - Санкт-Петербург, 2010. - С. 314-315.

5. Бобровская (Белоусова), К.В. Определение спектра и частоты встречаемости мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости, М. tuberculosis, выделенных из резецированных участков лёгких методом биологических микрочипов / К.В. Бобровская, М.А. Кравченко, Е.Ю. Камаев // Молекулярная диагностика-2010: сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции. - Москва, 2010. - С. 103-106.

6. Камаев, Е.Ю. Сравнительная оценка результатов применения различных лабораторных технологий определения множественной лекарственной устойчивости у изолятов М. tuberculosis / Е.Ю. Камаев, К.В. Бобровская (Белоусова), Н.И. Еремеева, М.А. Кравченко, Д.Н. Вахрушева // Молекулярная диагностика-2010: сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции. - Москва, 2010.-С. 148-149.

7. Бобровская (Белоусова), К.В. Генотипирование микобактерий туберкулеза, полученных из резектатов легких и респираторного материала / К.В. Бобровская, Т.В. Умпелева, М.А. Кравченко, Е.Ю. Камаев, Д.В. Вахрушева // Сборник трудов научно-практической конференций «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом». - Санкт-Петербург, 2011. - С. 39-40.

8. Бобровская (Белоусова), К.В. Активность туберкулезного процесса и лекарственная чувствительность микобактерий туберкулеза, полученных из резецированных участков легких / К.В. Бобровская, Е.М. Береснева // Сборник трудов конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза у детей и взрослых». - Москва, 2012. - С. 12-14.

9. Бобровская (Белоусова), К.В. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза, выделенных из резецированных участков легких, и активность туберкулезного процесса / К.В. Бобровская, М.А. Кравченко, Р.Б. Бердников // Фтизиатрия и пульмонология. - 2012. — №1(4). - С. 12-19.

10. Бобровская (Белоусова), К.В. Опыт применения молекулярно-генетических методов исследования операционного материала при диагностике

туберкулеза / К.В. Бобровская, М.А. Кравченко, С.Н. Скорняков, Е.М. Берсенева // Медицинский академический журнал. Приложение. Материалы II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия». - Москва, 2012. - С. 405-407.

11. Бобровская (Белоусова), К.В. Возможности лабораторного исследования резектатов легких в оценке биологических свойств возбудителя туберкулеза / К.В. Бобровская, М.А. Кравченко, Р.Б. Бердников // Материалы 1-го Конгресса Ассоциации «Национальная Ассоциация фтизиатров». - Санкт-Петербург, 2012. - С. 238-239.

12. Бобровская (Белоусова), К.В. Лекарственная чувствительность микобактерий туберкулеза, выделенных от больных с туберкулемами легких на разных этапах лечения / К.В. Бобровская, М.А. Кравченко, Р.Б. Бердников // Сборник трудов конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей». - Москва, 2013.-С. 7-8.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЛУ - лекарственная устойчивость

МБТ - микобактерии туберкулеза

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

ЛЧ - лекарственная чувствительность

ПТП - противотуберкулезные препараты

ПВБ - промывные воды бронхов

H - изониазид

R - рифампицин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция FQ - фторхинолоны

MIRU - mycobacterial interspersed repetitive units VNTR - variable number of tandem repeats

БЕЛОУСОВА Ксения Валерьевна

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 20.12.2013 г. Заказ № 223. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России, г. Екатеринбург, ул. Репина,3.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белоусова, Ксения Валерьевна, Екатеринбург

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ УРАЛЬСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФТИЗИОПУЛЬМОНОЛОГИИ

04201459202

БЕЛОУСОВА КСЕНИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

На правах рукописи

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЁЗА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЁГКИХ БОЛЬНЫХ

ТУБЕРКУЛЁЗОМ

03.02.03 - Микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.м.н. Скорняков Сергей Николаевич к.б.н. Кравченко Марионелла Анатольевна

Екатеринбург - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................5

Глава 1. ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА (обзор литературы)...............................................................15

1.1. История формирования представлений о лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза................................................................................15

1.2. Классификация лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза ..............................................................................................................................19

1.3. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам......................................................21

1.4. Методы диагностики лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза.........................................................................................................27

1.4.1. Культуральные методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза................................................................................27

1.4.2. Молекулярно-генетические методы определения лекарственной

чувствительности микобактерий туберкулеза................................................33

Резюме.................................................................................................................40

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................41

2.1. Общая характеристика материалов исследования..................................41

2.2. Методы исследования.................................................................................43

2.2.1. Бактериологические методы исследования..........................................47

2.2.2. Молекулярно-генетические методы исследования..............................51

2.2.2.1. Выделение ДНК микобактерий туберкулеза из клинического материала и лизирование культур микобактерий туберкулеза.....................51

2.2.2.2. Обнаружение ДНК М tuberculosis complex методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)...........................................................................52

2.2.2.3. Определение ЛЧ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам методом биочипов..............................................................................................54

2.2.2.4. Типирование культур М. tuberculosis методом MIRU-VNTR..........56

2.2.3. Методы статистической обработки результатов исследований.........59

Резюме.................................................................................................................60

Глава 3. РОЛЬ КУЛЬТУР АЛЬНЫХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ И РЕСПИРАТОРНОГО МАТЕРИАЛА................61

3.1. Выявляемость микобактерий туберкулеза и определение их лекарственной чувствительности культуральными методами.....................61

3.2. Выявляемость микобактерий туберкулеза и определение их лекарственной чувствительности молекулярно-генетическими методами.69

3.3. Сравнительная оценка бактериологических и молекулярно-генетических методов исследования.......................................................................................74

3.4. Алгоритм бактериологического исследования резецированных участков

легких .................................................................................................................79

Резюме.................................................................................................................81

Глава 4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ЛЕГКИХ И РЕСПИРАТОРНОГО МАТЕРИАЛА.......................................................................................................83

4.1. Сравнительный анализ скорости и массивности роста микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных................................83

4.2. Сравнительный анализ лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных................................84

4.3. Генотипирование микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала, полученных на хирургическом этапе лечения больных......................................................................................88

4.4. Сравнительный анализ лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза, выделенных из операционного и респираторного материала,

полученного на терапевтическом этапе лечения больных............................89

Резюме.................................................................................................................93

Глава 5. АНАЛИЗ ВАРИАНТОВ МУТАЦИЙ, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ

ТУБЕРКУЛЕЗА, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РЕЗЕЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ

ЛЕГКИХ................................................................................................................96

Резюме...............................................................................................................108

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................109

ВЫВОДЫ............................................................................................................116

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................................118

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................119

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.....................................121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее время эффективность химиотерапии, которая является главным средством лечения туберкулеза, остается невысокой. Одной из основных причин этого является лекарственная устойчивость (ЛУ) микобактерий туберкулеза (МБТ). Проблема ЛУ возбудителя туберкулёза приобрела в последнее время глобальное значение [10, 73, 104, 218]. Клиническое излечение у впервые выявленных больных с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) МБТ остается низким и составляет в Российской Федерации 16,2%, что в 3,1 раза ниже уровня клинического излечения туберкулеза у больных с лекарственно чувствительным (ЛЧ) возбудителем туберкулеза [104]. В то же время, у значительного числа пациентов на этапах терапевтического лечения получить сведения о ЛЧ возбудителя к противотуберкулёзным препаратам (ПТП) невозможно в силу ограниченности и олигобактериальности процесса.

При туберкулёмах обнаружение МБТ в мокроте и промывных водах бронхов (ПВБ) составляет около 10,0% [75]. При посеве резецированного участка легкого выявление МБТ достигает 24,2% - 57,9% [32, 74]. При бактериологическом исследовании резецированных участков легких выявляется от 16,0% до 49,0% МБТ с ЛУ [27, 32]. Свойства возбудителя непосредственно в очагах туберкулезного поражения остаются малоизученными. Важность исследования ЛЧ МБТ заключается в необходимости назначения больным адекватной химиотерапии.

Все это определяет актуальность обсуждаемой проблемы, цель и задачи данной работы.

Основные задачи исследования

Личный вклад автора

Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, осуществлялось на всех этапах работы и выразилось в проведении научно-информационного поиска, анализе и обобщении данных специальной литературы, в разработке дизайна исследования, в сборе и подготовке диагностического материала для проведения комплекса бактериологических и молекулярно-генетических исследований, в проведении лично автором всех молекулярно-генетических исследований, статистической обработке и систематизации результатов работы. Автором разработан алгоритм бактериологического исследования резецированных участков легких, сформулированы основные положения и выводы диссертационной работы. Автор принимал непосредственное участие во внедрении в практику ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» алгоритма бактериологического исследования резецированных участков легких как обязательного этапа диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза.

Научная новизна

Установлена высокая диагностическая значимость исследования операционного материала больных туберкулезом легких молекулярно-генетическими методами. Показана возможность исследования операционного материала методом биочипов, а также установлена высокая частота совпадений результатов определения лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду и рифампицину методом биочипов и методом абсолютных концентраций при исследовании резецированных тканей легких. Впервые представлен анализ вариантов мутаций, обуславливающих лекарственную устойчивость МБТ, полученных из операционного материала, в результате которого показана частота встречаемости выявленных мутаций. Выявлена идентичность генотипов изолятов МБТ, выделенных из различного биологического материала.

Практическая и теоретическая значимость

Результаты исследований, выполненных в рамках данной диссертационной работы, позволили обосновать необходимость бактериологического исследования резецированных участков легких как обязательного этапа диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза и внедрить исследование операционного материала в клинико-лабораторную практику ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» г. Екатеринбурга, ГБУЗ Свердловской области «Противотуберкулезный диспансер» г. Екатеринбурга и ГБУЗ «Челябинский областной клинический противотуберкулезный диспансер» г. Челябинска.

Полученные данные позволили оценить роль бактериологических и молекулярно-генетических методов выявления МБТ и определения их ЛЧ при исследовании резецированных участков легких и респираторного материала и включить материалы исследования в программы последипломной подготовки врачей-фтизиатров и бактериологов в ФГБУ «Уральский НИИ фтизиопульмонологии» г. Екатеринбурга и в учебные курсы кафедры фтизиатрии, пульмонологии и торакальной хирургии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России г. Екатеринбурга.

Кроме того, результаты исследования вошли в проект концепции по химиотерапии туберкулеза в Российской Федерации (приложение №4) [45].

Методология и методы исследования

Материалом исследования служили:

2. Результаты проспективного исследования резецированных участков легких (п=291), мокроты и промывных вод бронхов (п=219) от оперированных больных по поводу туберкулеза легких; культуры МБТ (п=102), выделенные из мокроты и резецированных участков легких оперированных больных по поводу туберкулеза легких.

Всего было исследовано 510 образцов биологического материала и 102 культуры МБТ, полученных от 291 больного различными формами туберкулеза легких. У 259 (89,0% (95% ДИ 84,8%-92,4%)) больных туберкулезом легких был установлен диагноз «туберкулема легкого», у остальных 32 (11,0% (95% ДИ 7,7%-15,2%)) - «кавернозный и фиброзно-кавернозный туберкулез легких».

Известные данные по возбудителю туберкулёза

Пациент

__1___

Операционный материал

2х кратное исследование мокроты или ПВБ перед операцией

Гистологическое исследование

Культуральные

методы исследования

Бактериоскопия

ПЦР

«Биочип-MDR» «Биочип-FQ»

Определение ЛУ

VNTR

методом абсолютных генотипирование

концентраций

Рисунок 1 Дизайн исследования

Анализ ЛЧ МБТ проводили методом абсолютных концентраций с использованием плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена. Культуры М. tuberculosis по чувствительности к основным ПТП делили на ЛЧ и ЛУ в соответствии с приказом МЗ РФ № 109 от 21.03.2003г (концентрация изониазида (Н) - 1 мкг/мл, рифампицина (R) - 40 мкг/мл, этамбутола - 2 мкг/мл, стрептомицина - 10 мкг/мл, канамицина- 30 мкг/мл) [71].

Молекулярно-генетические методы исследования. Обработку первичного материала для выделения ДНК проводили коммерческим набором «ДНК-сорб-В» («Амплисенс», Россия). Операционный материал предварительно гомогенизировали. Для амплификации специфической нуклеотидной последовательности IS6110 геномного материала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в «режиме реального времени»

использовали тест-систему «АмплиСенс®МТС-РЬ» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) и амплификатор iCycler iQ5 (BioRad, США).

Для молекулярно-генетического исследования мутаций ЛУ МБТ к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам (FQ) был использован метод гибридизации с флуоресцентным изображением на биологическом микрочипе «ТБ-БИОЧИП®» и «ТБ-БИОЧИП®-2» (ООО «Биочип-ИМБ», Москва). Доминирующие олигонуклеотиды, размещенные на биочипах, способны обнаруживать мутации в генах rpoB, katG, inhA, ahpC и gyrA. Анализ результатов гибридизации проводили на приборе «Чипдетектор-01» с использованием специализированного программного обеспечения «Imageware» (ООО «Биочип-ИМБ», Москва).

Информация о работе

Белоусова, Ксения Валерьевна
кандидата биологических наук
Екатеринбург, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Характеристика клинически значимых биологических свойств возбудителя туберкулеза, выделенного из резецированных участков лёгких больных туберкулёзом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы