Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза"
05-10 829-5
На правах рукописи
ЕФРЕМЕНКО Дмитрий Витальевич
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭКСПРЕССНЫХ МЕТОДОВ ИНДИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА
03.00.23 - биотехнология 03.00.07 - микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Ставрополь - 2005
Работа выполнена в Ставропольском научно - исследовательском противочумном институте
Научный руководитель: доктор биологических наук,
Жарникова Ирина Викторовна
Научный консультант: доктор медицинских наук,
Будыка Дмитрий Александрович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Ведущая организация: научно - исследовательский институт микробиологии МО РФ, г. Киров
Защита диссертации состоится 22 ноября 2005 года в 10 часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина д. 1, корпус 2, аудитория 506.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 1.
Ивашев Михаил Николаевич
кандидат медицинских наук, доцент Казиев Азрет Хусеевич
Автореферат разослан 15 октября 2005 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
Т.Н. Джандарова
РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА
__2005
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Анализ сложившейся эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулёзом в нашей стране носит характер эпидемии (Онищенко Г.Г., 2002; Пунга В.В., Капков Л.П., 1999). В России при диагностике туберкулёза большое внимание уделяется культуральным методам, за рубежом - микроскопии мазка. Но оба эти метода имеют существенные недостатки. В связи с этим, актуальным является разработка диагностических препаратов для выявления микобактерий туберкулёза (МТБ) и методов исследований, обладающих высокой специфической активностью, экспрессностыо и информативностью.
Цель исследования: совершенствование биотехнологий иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза. Основные задачи исследования:
- отработать методические подходы по извлечению полноценных антигенных комплексов из микробных биомасс возбудителя туберкулёза и получить высокоактивные иммунные туберкулёзные сыворотки;
- разработать магнитные сорбенты с фиксированными на их поверхности антигенами гетерологичных штаммов для удаления из туберкулёзных иммунных сывороток неспецифических антител;
- отработать биотехнологию изготовления высокочувствительных и стабильных туберкулёзных липосомалыю-иммунопероксидазных конъюгатов;
- разработать эффективные способы получения суспензионных диагностикумов на основе полиакролеиновой (латексной) и алюмосиликатной матриц для реакций агглютинации;
- отработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами для диагностики туберкулёза в экспрессных методах (иммуноферментном анализе -ИФА, количественном иммунофлуоресцентном анализе - КИФА);
- определить диагностическую ценность применения разработанных иммунобиологических препаратов на экспериментальном и клиническом материале.
Научная новизна работы. Полученные в результате исследований данные представляют интерес с точки зрения поиска путей извлечения полноценных специфических водорастворимых антигенных комплексов из микобактерий туберкулёза.
Разработан и применён аффинный магносорбент при проведении иммуно-сорбции гетерологичных антител из иммунных туберкулёзных сывороток, позво-
ляющий получать специфичный препарат с сохранением его первоначальной активности, ускорять и упрощать процесс сорбции.
Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства липосомальных туберкулёзных иммунофермеитных конъюгатов, обладающих высокой чувствительностью и стабильностью.
Разработаны приёмы по предварительному селективному концентрированию микобактерий туберкулёза и их антигенов на магноиммуносорбентах (МИС) с последующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИФА), позволяющие исследовать объекты внешней среды, материал от больных людей или животных, в том числе и сильно загрязненные, неограниченного объёма пробы с низкой концентрацией микобактерий с чувствительностью, в 1 ООО и более раз превышающей общепринятые экспрессные методы.
Приоритетность ряда выполненных исследований подтверждена 2 патентами РФ на изобретения: № 2192265 «Способ получения комплекса фосфолипидов» (2002 г.) и № 2195296 «Способ получения ганглиозидов» (2002 г.).
Теоретическая и практическая значимость работы. Основная теоретическая значимость проделанной работы заключается в определении научно-методических аспектов разработки иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза, которые учитывают характерные особенности антигенной структуры микобактерий, свойства матриц биотической (липиды) и абиотической (органокремиезёмы, латексы) природы, методы конъюгации лигандов и маркёров, определяя направления последовательных стадий и операций биотехнологии производства диагностических туберкулёзных препаратов.
Разработаны научно-методические приёмы по получению полноценного антигенного материала из бакмасс микобактерий, высокоактивных иммунных сывороток, удалению из них перекрёстно реагирующих антител с помощью магнитных сорбентов. Оптимизация параметров иммобилизации антител обеспечила конструирование высокоактивных и специфических диагностических препаратов (иммунофермеитных, суспензионных латексных и алюмосиликатиых для реакции агглютинации, магноиммупосорбентных).
Разработанные методические подходы по ковалентной фиксации на поверхности мембраны липосом ферментов и иммуноглобулинов позволили повысить
стабильность и увеличить срок годности диагностической системы без потери активности с сохранением каталитических свойств.
Сконструированные туберкулёзные магноиммуносорбенты в сочетании с экспрессными методами диагностики повышают их чувствительность до 50 -100 микробных клеток в пробе, одновременно сокращая время проведения анализа до 1-1,5 часов за счёт селективного концентрирования на своей поверхности ми-кобактерий, ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов.
Результаты проведённых исследований по сочетанным методам магноиммуно-сорбции с экспрессными анализами и использование липосомальных препаратов дополняют новыми научными данными сведения о возможности использования иммобилизованных систем, способствующих стабильности, увеличению чувствительности методов и проведению эффективной детекции микобактерий туберкулёза.
Материалы научных разработок легли в основу двух методических рекомендаций: «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденных Главным Государственным санитарным врачом России Г.Г. Онищенко 06.04.2000 г., и «Применение магноим-муносорбентов для выявления микобактерий туберкулёза», утверждённых директором СтавНИПЧИ (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ №3 от 3.03.2005 г.).
На Федеральном уровне утверждены зам. главного санитарного врача РФ E.H. Беляевым технические условия (ТУ) 9154-00-01897080-2004 на фосфолипиды для получения липосом (письмо № 12 ФЦ/ 2514 А от 19. 08. 2004 г.). На учрежденческом уровне утверждены два регламента: на липосомальную основу для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 4 от 20.04.2004 г.) и на тест-систему липосомаль-ио - иммунопероксидазную магноиммуносорбентную для выявления антигена туберкулёза иммуиоферментным методом, утверждённую директором СтавНИПЧИ (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 3 от 3.03.2005 г.).
Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ по экспресс-диагностике туберкулёза и применению магноиммуно-сорбентных препаратов п мониторинге микобактерий.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Научно-методические подходы к получению высококачественного биологического сырья (антигенов и антител) для производства диагностических туберкулёзных препаратов. Получены водорастворимые антигены микобактерий, содержащие полный набор высокоэффективных антигенных комплексов с высокой активностью (1:32-1:64 в реакции иммунодиффузии (РИД). Подобрана производственная схема для получения иммунных сывороток с высокими титрами антител, основанная на оптимальной комбинации комплекса специфических антигенов и им-муномодуляторов.
2. Методические приёмы конструирования и применения аффинных сорбентов с магнитными свойствами при проведении иммуносорбции неспецифических антител из иммунных туберкулёзных сывороток. Разработанные сорбенты с иммобилизованными гетерологичными антигенами и метод сорбции позволили за один этап получить не только высокоспецифичную сыворотку, но и сохранить её первоначальную серологическую активность.
3. Научно-методические основы изготовления липосомалыю - иммунопероксидаз-ного коныогата для выявления антигена туберкулёза иммуноферментным методом. Иммобилизованные на мембране липосом фермент и туберкулёзные иммуноглобулины повышают свою стабильность, что приводит к увеличению срока годности диагностической системы.
4. Биотехнология производства суспензионных латексных и алюмосиликатных диагностикумов, обеспечивающая высокую эффективность обнаружения микобактерий туберкулёза в экспериментальных и клинических условиях. Разработанные препараты по чувствительности аналогичны традиционным методам, но превосходят их по простоте изготовления и экспрессности (постановка и учёт результатов реакции с алюмосиликатным диагностикумом 1-3 мин).
5. Научно-методические основы биотехнологии изготовления твёрдофазных микрогранулированных аффинных магноиммуносорбентов для избирательного концентрирования микобактерий и их использования в экспрессных методах (ИФА, КИФА). Разработанные препараты позволяют повысить чувствительность более чем в 1 ООО раз при увеличении вероятности выявления микобактерий за счёт селективного концентрирования антигена на антителе, находящемся на твёрдой матрице.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология XXI века» (Саратов, 28-30 сентября 2004); 1 -й Всероссийской конференции «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 10-11 октября, 2004); региональном обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Ставрополь, 17 февраля 2005); научно-практической конференции «Актуальные вопросы эпид.надзора за природно-очаговыми и особо опасными инфекциями в регионе Северного Кавказа» (Ставрополь, 14 - 16 апреля 2005), на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 10 опубликованных научных работах (2 патента на изобретение, 1 депонированная работа и 7 трудов в научных сборниках).
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Она'изложена на 178 страницах, содержит 18 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 178 отечественных и 99 зарубежных литературных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований. В работе использовано 27 штаммов микроорганизмов II, III и IV групп патогеиности родов Mycobacterium, Brucella, Nocardia, Streptococcus, Staphylococcus, Salmonella, Listeria.
В опытах были использованы: 34 кролика обоего пола породы «Шиншилла», 30 беспородных белых мышей, 15 морских свинок.
Для работы применялся материал (моча и мокрота) от больных туберкулезом лёгких, почек, мужских половых органов, глаз и т.д., полученный из Краевого клинического противотуберкулезного диспансера (ККПТД).
Водорастворимые антигены изолировали комплексным методом: водно-солевой экстракцией и дезинтеграцией микроорганизмов (Афанасьев E.H., Таран И.Ф., Тюменцева И.С., 1986).
Иммунизацию осуществляли по схеме, разработанной И.С.Тюменцевой (1994) и Е.Н.Афанасьевым (2000). Контроль титра антител в сыворотках определяли в непрямой реакции иммунофлюоресценции по Т.Н.Weller, A.H.Coons (1954). Микроскопию препаратов осуществляли в люминесцентном микроскопе серии "Люмам". Анализ антигенного состава микроорганизмов и качества сывороток проводили в реакции иммунодиффузии в 1 % агаровом геле (Difco, USA) по О. Ouchterlony (1949).
Для осаждения иммуноглобулинов (Ig) применяли сульфатный метод (Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1980), метод фракционирования белковых смесей с использованием линейного полимера - полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) по A.Polson и др. (1964) и каприловой кислоты (Steibuch G., Andran R., 1969).
Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных каприловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969), с ФИТЦ (C2iH,iN05S) фирмы «Sigma» проводили по Х.Шторц (Stortz, 1987). Прямой метод окраски препаратов осуществляли по A.H.Coons, М.Н. Kaplan (1950). Очистку конъюгатов проводили методом восходящей хроматографии на бумаге (Носков Ф.С., 1985).
Фосфолипиды, из которых конструировали липосомы, выделяли из мозга крупного рогатого скота (к.р.с.) и свиней. Состав липидов определяли по методике, описанной в книге М.Кейтс (1975), с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах «Силуфол». Формирование липосом и определение их размеров контролировали на электронном микроскопе Hol (Япония) JEM - 100SX.
Иммунопероксидазные коныогаты получали методом перйодатного окисления по P.K.Nakane, A.Kawaoi (1974) в модификации Е.А.Ткаченко с соавт. (1982). Рабочий титр и специфическую активность определяли по методике M.Clark и A. Adams (1977) в "сэндвич"-варианте ИФА. Очистку конъюгатов проводили на хроматографической колонке фирмы LKB, используя сефадекс G-100.
Количественное определение белка осуществляли по методу O.Warburg и W.Christian (1941) сравнением спектра поглощения белков при длине волн 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).
Микроструктуру поверхности магносорбентов (МС) исследовали по методу, описанному в работе Д.Фрайфелдера (1980). Удельная поверхность МС определялась по методу А.А.Клячко-Гурвича (1961), суммарный объем и радиус пор МС -по методуН.В.Кельцева(1984).
Лиофилизацию препаратов проводили в камере LZ-9c (Чехословакия). Готовые препараты разливали в ампулы, замораживали в низкотемпературном столе LZ-280/75 при температуре минус (45 ± 5) °С не менее 18 ч и высушивали в сушильной камере под вакуумом.
Математическую обработку результатов экспериментов проводили на компьютере (программа EXCEL). Для подтверждения воспроизводимости и достоверности результатов применяли статистические методы (Тамбовцев Е.П., Ахметка-лиев С.Г., Пятницкий Н.П., 1969; Скуч Д., Уэст Д., 1979).
Результаты исследований
Оптимизация способов получения высокоактивного специфического биологического сырья (антигенов (Аг) и антител (AT)
Водорастворимые туберкулёзные антигены изолировали комплексным методом: водно-солевой экстракцией, осаждением белковых фракций сульфатом аммония, механической и ультразвуковой дезинтеграцией. Выход белковых фракций составил около 20 мг/мл. Использование данного метода позволило получить наиболее полный антигенный комплекс из бакмасс микобактерий туберкулёза с активностью в РИД 1:32-1:64.
В дальнейшем водорастворимый туберкулёзный антиген использовали для иммунизации животных с применением в качестве иммунокорректоров тималина, циклофосфана и феракрила.
При контроле специфичности туберкулёзных сывороток установлено, что наблюдаются перекрёстные реакции с В. abortus 19, Nocardia brasiliensis, М. intracellulars #23, М. Kansasii Yoss. Из данных культур получали бакмассы, выделяли водорастворимые антигены и использовали в качестве лигандов при получении аффинных сорбентов. При конструировании аффинного сорбента с магнитными свойствами в качестве матрицы использовали оксид железа и алюмосиликат. Рекомендованы следующие оптимальные условия получения МС: соотношение
Al-Si л
/
(Fe2 Оз)
ЯОН ------------------¿
í
(Fe2 03)
компонентов синтеза 2:2:1, соответственно Fe203, декстран, алюмосиликат; время гелеобразования -2 час, значение рН гелеобразования -7,0.
Для придания магносорбенту аффинных свойств на его поверхность, активированную натрием перхлората, иммобилизовали белковые лиганды (рис.1) - водорастворимые антигены, полученные из гетерогенных штаммов микроорганизмов в равных соотношениях. Оптимальными факторами, способствующими получению МИС, являются: время иммобилизации 2 часа при значении рН раствора водорастворимых антигенов 6-7 и температуры в интервале (24 - 37) °С.
NaC104 Al-Si/] ^О AI- S¡/
С ^ +H2N -Аг -► CH=N-Ar
\H -H 20 >
(Fe2 ОзГ
Рисунок 1. Схема получения МИС на декстраноалюмосилнкагеле
Полученные МИС характеризуются стандартностью структурных характеристик (3 года срок наблюдения), механической, химической и микробиологической устойчивостью.
При сорбции иммунной сыворотки использование данного магноиммунно-сорбента позволило не только освободить препарат от неспецифических антител на одном этапе, но и сохранить первоначальную активность нативных сывороток. Магнитные свойства МИС значительно упростили процесс отделения его от жидкой фазы в магнитном поле и исключили процесс длительного центрифугирования. Сорбент можно регенерировать и многократно использовать. Разработка биотехнологии лнпосомяльно-нммунопероксндазного конъюгатя
Последующие процессы получения иммунобиологических препаратов относятся к стадиям, предусматривающим конъюгацию лиганда с ферментом (имму-ноферментные препараты для ИФА). В результате исследований получены высокоактивные (до 1:800), специфичные (отсутствуют перекрёстные реакции с гете-рологичными штаммами) иммуноферментные конъюгаты, благодаря проведённой сорбции гетерологичных антител из сыворотки крови, но срок их годности ограничен и составляет 1 год при надлежащем хранении. Перед нами поставлена задача, иммобилизовать фермент-пероксидазу хрена в носитель и присоединить ли-ганд - туберкулёзные иммуноглобулины. Наиболее подходящей матрицей для фермента-пероксидазы хрена и поставленной задачи оказались липосомы. Липо-сомы получали методом «выпаривания в обращённой фазе», используя в качестве
и
сырья хлороформные растворы фосфолипидов и ганглнозидов, выделенных из мозга к.р.с. и свиньи, в соотношении 20:1.
Для исключения негативного влияния ультразвука на липиды смесь перемешивали до образования стойкой эмульсии типа «вода в масле», упаривали в вакууме и добавляли 5 мл 0,01 М ФСБ рН 7,2, интенсивно встряхивали до образования гомогенной структуры липосом. На электронном микроскопе были обнаружены липосомы со средним размером 150-300 нм. Полученные липосомы были использованы в качестве «твёрдой» фазы при получении иммуноферментного препарата для диагностики МТБ. Ковалентно фиксируясь на поверхности мембраны липосом, фермент и иммуноглобулин снижают способность к коиформационным изменениям структуры своих молекул под воздействием факторов внешней среды, что способствует повышению стабильности и увеличению срока годности диагностической системы.
Затем на наружной мембране липосом последовательно фиксировали пе-роксидазу хрена и туберкулёзные ^ в. Ковалентное связывание липосом с ферментом достигалось за счёт части активированных групп пероксидазы и аминогрупп, находящихся в молекулах ганглиозидов, встроенных в мембрану липосом при их приготовлении. Несвязавшуюся пероксидазу удаляли хроматографически на колонке с сефадексом в-ЮО. Фиксацию ^ в на поверхности липосом с иммо-билизированной пероксидазой хрена проводили при температуре (22+4) °С, помешивая на шуттеле в течение 1 -24 ч, и стабилизировали боргидридом. При этом в за счёт свободных аминогрупп связывались с оставшимися свободными альдегидными группами углеводной части пероксидазы. Для очистки конъюгата от не-связавшихся ^ О проводили гель-хроматографию, используя сефадекс в-100.
Наиболее высокочувствительный липосомальный иммунофермептный ди-агностикум был получен при концентрации белка иммуноглобулинов 5 мг/мл и времени их инкубации с липосомальным ферментным конъюгатом 2 ч.
Для увеличения срока годности препарат замораживали и лиофилизирова-ли в течение (18 ±2) ч до конечной температуры 25 °С. В готовом препарате контролировали физико-химические и иммунологические свойства после лиофилиза-ции и в процессе хранения в течение 2 лет (срок наблюдения). Чувствительность конъюгата в ИФА с гомологичными штаммами - 1x105 - 1x104 м.к./мл, при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами.
Таким образом, в результате проведённых исследований разработана биотехнология изготовления иммобилизованного ферментного препарата, значительно увеличивающая его стабильность.
Оптимизация параметров получения туберкулёзных суспензионных диагностикумов
Нами проведена научно-технологическая разработка латексных (полиакро-леиновых) диагностикумов. Наличие альдегидных групп на поверхности латексных частиц позволяет легко образовывать ковалентиую связь с аминогруппами белков. Были отработаны оптимальные условия их изготовления: использование иммуноглобулинов для сенсибилизации только из адсорбированных туберкулёзных сывороток; оптимальная нагрузка иммуноглобулинов - 400 мкг/мл, время сенсибилизации 6 часов, температура - 50 °С, рН раствора при сенсибилизации и постановке анализа - 7,2±0,1.
Проведены исследования по разработке диагностикумов суспензионных алюмосиликатных иммуноглобулиновых для реакции суспензионной агглютинации (РСА) на стекле методом формирования пористой структуры кремнезёмной матрицы, обладающей высокой адсорбционной активностью. Получены положительные результаты при использовании алюмосиликата с аурамином в качестве красителя. Установлено, что для оптимальной иммобилизации достаточной является концентрация белка 1,5 мг/мл, время иммобилизации - 2 час при температуре (26+4) °С, рН -7,0 (рис.2).
Чувствительность сконструированных диагностикумов суспензионных в РСА на стекле составила 7,8 х 105 -1,56x10 6 м.к./мл, что соответствует чувствительности диагностикумов латексных в реакции агглютинации латекса. При этом учет результатов РСА на стекле возможен через 1-3 мин, а окончательный результат реакции агглютинации латекса (РАЛ) (макрометод)- через 16-18 ч. При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт.(1969), в серии опытов титр РАЛ Гравен 5,2 х105 м.к./мл (+14,1 %;-12,3 %), титр РСА - Гра-веи 0,92x106 м.к./мл (+7,2 %;-6,7 %).
Чувствительность, м.к./мл
2(1) 2(11) 4(111) 4 (IV) Время, ч
1,111 - температура 24 "С, II, IV - температура 45"С
Рисунок 2. Влияние температурного, временного факторов и рН на чувствительность суспензионного диагностиками при его изготовлении
Таким образом, преимущество алюмосиликатного туберкулезного диагностикума состоит в простоте постановки РСА и быстроте получения результатов.
Сочетанные методы детекции микобактерий туберкулёза с магноиммуносорбентами
В последнее время актуальным является разработка и применение магносор-
бентов, благодаря которым упрощаются, ускоряются все этапы исследований при высокой чувствительности препаратов и возможности автоматизации учёта реакций.
Цель наших исследований - конструирование тест-системы диагностической магноиммуносорбентной туберкулёзной для иммуноферментного анализа.
Нами разработана биотехнология органокремнезёмного магносорбенга с использованием окиси железа (III) и алюмосиликата. Модифицирование поверхности осуществляли в присутствии полимера - декстрана. На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оптимальные условия получения алю-мосиликатных МС: соотношение компонентов синтеза 2:2:1, соответственно Fe2Cb, декстран и алюмосиликат, при времени гелеобразования - 2 ч и значении рН гелеобразования - 7,0.
Далее проводили иммобилизацию магносорбентов туберкулёзными иммуноглобулинами. В качестве сшивающего агента использовано поверхностно-активное вещество (ПАВ)-вторичный алкилсульфат натрия, при этом прочность связи антител с магносорбентом повышается за счёт создания дополнительных связей, которые образуются между активными группами белка, полиглюкина (декстрана) и вторичного алкилсульфата натрия. Оптимальной для полного насыщения
антителами сорбента в объеме 0,4 мл является концентрация белка иммуноглобулинов 2,0 мг/мл.
Эффективными факторами, способствующими получению активного МИС, являются: время иммобилизации 2 часа при значении рН раствора иммуноглобулинов 6,0-7,0 и температуры в интервале (22 +4) °С и 37 °С. На чистых культурах и модельных опытах получены положительные результаты при наличии в объеме пробы 0,5-1x102 м.к. и выше. Магиоиммуносорбенты характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической и микробиологической устойчивостью.
При использовании традиционного иммуноферментного метода имеются следующие недостатки, которые отсутствуют в предложенной тест-системе в связи с использованием магнитоуправляемого магносорбеита с включёнными антителами: 1)для исследования берётся ограниченный (0,2) мл объём исследуемого материала (т.к. объём лунки - 0,4 мл), в то время как при использовании магноимму-носорбента объём неограничен; 2)время постановки иммуноферментного анализа около 20 часов, включая 18-ти часовую сенсибилизацию, а время проведения анализа с магноиммуносорбентами - 1-1,5 ч; 3Чувствительность иммуноферментного метода 5х104 - 1x10 5 м.к./мл, а чувствительность представленной тест-системы составляет 1x102 м.к./мл, при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичны-ми штаммами. При этом отпадает необходимость использования сенсибилизированных микропланшет.
В последние годы при выявлении микобактерий туберкулёза широко применяют люминесцентную микроскопию. Наиболее перспективными являются методы диагностики, основанные на образовании комплекса антиген-антитело, особенно в связи с возможностью использования в иммунофлуоресценции твёрдых носителей (Стоев К.Г. с соавт., 1981; Подзолкова Г.Г. с соавт., 1989 и т.д.). Нами апробирован данный метод с использованием магноиммуносорбентов для обнаружения антигенов возбудителя туберкулёза и определены оптимальные параметры постановки количественного иммунофлуоресцентного анализа (КИФА), чувствительность и специфичность метода.
На чистых культурах и в модельных опытах на воде, контаминироваиной различными концентрациями туберкулёзных микроорганизмов, получены положительные результаты при наличии в объеме пробы 0,5-1x102 м.к. и выше, при от-
сутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами. Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служил люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой типа ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный типа В7-76. С помощью КИФА появилась возможность учитывать реакцию не только визуально, но и инструментально (в условных единицах по показаниям вольтметра). Схема проведения экспресс-анализов при выявлении антигенов МТБ с применением МИС представлена на рис.3.
ИФА
Исследуе- Отмыпка
мый МИС материал
КИФА
Рисунок 3. Схема проведения экспресс-анализов при выявлении антигенов МТБ с применением МИС
Обозначения: 1 - гранулы МИС туберкулёзные; 2- туберкулезный антиген;
3 - постоянный магнит.
Нами приготовлено по 5 серий тест-систем магноиммуносорбентных для диагностики возбудителя туберкулёза в ИФА и КИФА, в которые входят туберкулёзные магноиммуносорбеиты-10 % взвесь, 3 амп. по 2 мл; положительный кон-троль-обеззараженные клетки микобактерий туберкулёза, 1x10 9 м.к./мл, 1 амп. -1 мл; иммуноглобулины туберкулёзные флуоресцирующие - рабочее разведение 1:16-1:64-1 амп; липосомально-иммунопероксидазный конъюгат-1 амп и все необходимые ингредиенты для постановки ИФА.
При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с со-авт. (1969) в серии опытов титр ИФА Гравен 0,8x10 2 м.к./мл (+8,7 %;-8,0 %), КИФА -0,82x102 м.к./мл (+7,9 %;-7,3 %).
Установлено, что туберкулёзные магнонммуносорбенты в жидком виде стабильны без потери физико-химических и иммунологических свойств, без микробиологического пророста в течение 3 лет (срок наблюдения).
Изучение диагностической ценности разработанных днагностикумов и тест-систем для выявления антигена возбудителя туберкулеза
Разработанные диагностические препараты и тест-системы для выявления микобактерий туберкулёза испытаны в лабораторных и клинических условиях.
Целью наших исследований являлось максимально возможное лабораторное выявление МТБ у наиболее эпидемически опасной категории больных. Сбор, хранение, транспортировку и работу с диагностическим материалом (моча, мокрота) проводили согласно приказу МЗ РФ № 109, приложение № 10 от 21.03.2003. Было исследовано 286 проб клинического материала (моча, мокрота) от больных различными формами туберкулёза из ККПТД, 12 проб материала от больных с нетуберкулёзными заболеваниями и 11 проб от здоровых людей, у которых исследовали мочу и мокроту. Тестирование микобактерий осуществлено методами: РАЛ, РСА, ИФА, ИФА и КИФА с МИС. Сравнительная характеристика методов представлена в табл.1.
Анализ полученных данных позволил установить, что использование адсорбированной туберкулёзной сыворотки при конструировании диагностических препаратов даёт возможность диагностировать заболевание туберкулёзом у людей, дифференцируя его от другой патологии.
ИФА и КИФА с МИС превосходят по информативности РСА, РАЛ и традиционный ИФА, проводимый в полистироловых планшетах. Это связано с тем, что при использовании МИС специфический антигенный материал предварительно концентрируется на сорбенте из проб большого объёма.
Отсутствие 100 % специфичности разработанных диагностических систем объясняется тем, что, хотя при их изготовлении использована туберкулёзная сыворотка, адсорбированная гетерологичными антигенами на твёрдом носителе, однако полного удаления из неё гетерологичных иммуноглобулинов, вероятно, не произошло, так как, род микобактерий составляют более 100 видов.
Таблица 1. Сравнение методов диагностики туберкулёза
№ п/п Метод Время детекции Выявляемость Литературный источник
1. Туберкулинодиагностнка 72 ч 67 % Чутаев Ю.П. с соавт, 1996
2. Культивирование МТБ 1-3 мес. 0,5-14 % Клименко М.Т. с соавт, 1987
3. Микроскопия (флуоресцентная с аурамином) 2,5 ч 14% Кашок А.Н., 1995
4. РСЛ 5 мин 65% Собственные данные
5. РАЛ 2 ч 66%
6. ИФА 3 ч* 76%
7. IIФА с МИС 1-1,5 ч 91 %
8. КИФА с МНС 1-1,5 ч 91 %
*- без учёта 18 часовой сенсибилизации планшет
Обобщая преимущества данных тест-систем, следует отметить, что разработанные новые диагностические средства для выявления возбудителя туберкулёза на основе МИС, позволяют обнаруживать корпускулярные и растворимые антигены возбудителя при их низкой концентрации в материале (50-100 микробных клеток в пробе), проводить исследования с пробами большого объёма. Эти системы относятся к средствам экспресс-диагностики туберкулёза, т.к. позволяют получить результат через 1-1,5 ч после начала исследования. Немаловажным является и тот факт, что туберкулёзный МИС не теряет своих физико-химических и иммунологических свойств при хранении на протяжении 3 лет (срок наблюдения). При этом обнаружение туберкулёзных антигенов возможно у больных с различной локализацией патологического процесса при взятии материала на исследование у них бесконтактным способом (моча, мокрота).
Результаты сравнительной характеристики традиционных и сочетанных экспресс-анализов и их технико-экономическое обоснование показывают явные преимущества применения селективного концентрирования микобак-терий туберкулёза на магноиммуносорбентах с последующим проведением экспресс-анализов (табл.2).
Таблица 2. Сравнительная характеристика традиционных и сочетанных экспресс-анализов и их технико- экономическое обоснование
s в о д Статьи затрат
Анализы i ¡1 < Срок годности твёрдой фаз X S я =; й Время nocí новки, ч Заработная плата Начисления на зар. плату (35,8 Сырьё и материалы Оборудование Накладные расходы (90 %) Стоимост 10 анализо Р)б
тра- 5x104 20 дн. 10 3** 135,8 48,62 45,0 19,2 223,76 472,38
ПФА ДИИ.
соче- 1x10' Зг.* 10 1 78,6 28,14 42,0 19,2 151,15 319,09
тай.
РИФ тра-днн. 5x10 4 6 мес 10 2 109,2 39,09 28,1 21,3 177,92 375,61
КИФА сочетав. lxlO2 Зг.* 10 1 78,6 28,14 19,9 24,8 136,29 287,73
Примечание: * срок наблюдения
**время постановки традиционных анализов НФА без учёта 18 часовой сенсибилизации планшет.
ВЫВОДЫ
1. Сочетанное использование водно-солевой экстракции, механической и ультразвуковой дезинтеграции позволило выделять из обеззараженных ацетоном мико-бактерий туберкулеза полноценные антигенные комплексы с серологической активностью 1:32-1:64 в реакции иммунодиффузии с туберкулёзной сывороткой. Данная биотехнология оказалась пригодной для изолирования антигенов из близкородственных возбудителю туберкулёза в серологическом отношении микроорганизмов.
2. При получении высокоактивных туберкулёзных иммунных сывороток для иммунизации кроликов применяли выделенные антигенные комплексы с иммуномо-дуляторами феракрилом, тималином и циклофосфаиом. Специфическая активность полученных сывороток в непрямой реакции иммунофлуоресценции достигала 1:400 -1:600, а в реакции иммунодиффузии -1:32-1:64.
3. Удаление из туберкулёзных иммунных сывороток перекрёстно реагирующих антител с помощью магнитных сорбентов с ковалентно фиксированными на их
поверхности антигенами гетерологичных штаммов обеспечило получение сырья, пригодного для конструирования различных диагностических препаратов.
4. Разработанная биотехнологии изготовления липосомальных туберкулёзных иммунопероксидазных конъюгатов обеспечила получение высокочувствительного, специфического диагностикума, отличающегося повышенной стабильностью при хранении по сравнению с традиционным иммунопероксидазным конъюгатом.
5. Впервые осуществлена научная разработка биотехнологии производства серии высокоспецифических диагностических препаратов и иммобилизованных систем для выявления возбудителя туберкулёза и его антигенов в искусственно контами-нированных пробах и в клиническом материале от больных (моча, мокрота).
6. Чувствительность разработанного туберкулёзного латексного диагностикума в реакции агглютинации латекса (РАЛ) составила 3,9x10 5-7,8х105 м.к./мл, а алюмо-силикатного туберкулёзного диагностикума в реакции суспензионной агглютинации (РСА) на стекле- 7,8x105-1,56x106 при учёте результатов РАЛ через 16-18 ч, а РСА - через 1-3 мин. В клиническом материале (моча, мокрота) у больных туберкулёзом специфические антигены микобактерий выявлены в РАЛ в 66 % случаев, в РСА- в 65 %.
7. Туберкулёзные магнитные иммуносорбенты, полученные по разработанной биотехнологии, способны селективно концентрировать на своей поверхности ми-кобактерии туберкулёза, его антигены из исследуемых проб большого объёма, включая клинический материал от больных туберкулёзом, и выступать в качестве твёрдой фазы при осуществлении иммуноферментного и количественного имму-нофлуоресцептного анализов, обеспечивающих с высокой специфичностью выявление туберкулёзного микроба в течение 1-1,5 ч с чувствительностью 1x102 м.к./пробе.
8. В клиническом материале (моча, мокрота) у больных различными формами туберкулёза специфические антигены микобактерий при использовании туберкулёзных магнитшлх иммуносорбентов в сочетании с иммуноферментпым и количественным иммуиофлуоресцеитным методами выявлены в 91 %, что подчёркивает высокую диагностическую ценность разработанных препаратов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Патент РФ № 2192265 7А 61 К 35/30. Способ получения комплекса фосфоли-пидов/ Ефременко В.И., Оверченко В.В., Мисетова E.H., Савельева И.В., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Ефременко Д.В.-Заявка № 2000109191; Заявлено 12.04.2000; Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 10.11.2002, Бюл. №31.
2. Патент РФ № 2195296 7А 61 К 35/30. Способ получения ганглиозидов/ Ефременко В.И., Оверченко В.В., Мисетова E.H., Жилченко Е.Б., Савельева И.В., Таран Т.В., Ефременко Д.В. - Заявка № 2000109192; Заявлено 12.04.2000; Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 27.12.2002, Бюл. № 36.
3. Ефременко Д.В. Биотехнология приготовления диагностикума туберкулёзного магноиммуносорбентного// Сб. науч. трудов «Актуальные проблемы медицины». - Томск,- 2004. - Т.З.- № 2.- С. 318.
4. Ефременко Д.В. Получение аффинного сорбента для очистки туберкулёзной сыворотки от неспецифических иммуноглобулинов// Сб. науч. трудов «Актуальные проблемы медицины». - Томск.- 2004. - Т.З.- № 2.- С. 318.
5. Ефременко Д.В., Жарникова И.В., Головчепко Т.В., Васильева A.A. Метод детекции инфекционных заболеваний с помощью магносорбентов// Мат. Всерос. научн.-практич. конф.- Саратов.- 2004.-С.90-91.
6. Ефременко Д.В., Жарникова И.В., Васильева A.A., Алиева Е.В. Разработка иммуносорбентного диагностикума для детекции возбудителей инфекционных заболеваний// Сб. науч. трудов, посвящ. 75-летию НИИ микробиол. МО РФ. - Киров.- 2004. - С.80-82,
7. Ефременко Д.В., Макрушникова А.И., Аванесова ЮЛО. Модифицированный иммуноферментный анализ выявления микобактерий туберкулёза// Мат. 1 Всерос. конф. по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций». - Москва.-2004.- С.26.
8. Ефременко Д.В. Биотехнологическое конструирование магноиммуносор-бентов и получение тест-системы для выявления возбудителя туберкулёза с помощью иммуноферментного анализа. - Ставрополь.- 2005. - Деп. в ВИНИТИ 26.05.2005, № 346 - В 2005. - 12 с.
9. Ефременко Д.В. Получение липосомально-иммунопероксидазиого коныога-та для выявления туберкулёзных антигенов // Мат. VI Межгос. научн.-практич. конф. государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях». - Волгоград. - 2005.- С.234-235.
10. Жарникова И.В., Ефременко Д.В., Юркина И.В. Конструирование диагностических тест-систем на основе иммобилизованных препаратов при выявлении особо опасных и других инфекций // Мат. VI Межгос. научн.-практич.конф. государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях»,- Волгоград. - 2005.-С.236-237.
Набрано и сверстано в Крайкомстате Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60x84/16 Физ. печ. л.-1,2 Усл. печ. л. - 1,16 Заказ 205 Тираж-100 Отпечатано в цехе оперативной полиграфии краевого комитета государственной статистики г. Ставрополь, ул. Пушкина,4
Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Ефременко, Дмитрий Витальевич
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Анализ эпидемиологической обстановки по туберкулёзу и современного состояния экспресс-диагностики его возбудителя (обзор литературы)
1.1. Эпидемиологическая обстановка по туберкулезу в России. ¡
1.2. Анализ современного состояния конструирования диагностических препаратов и индикации возбудителя туберкулеза.
1.3. Носители иммобилизованных систем твёрдофазного иммуноана-лиза
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу
2.2. Питательные среды, условия культивирования микроорганизмов
2.3. Объекты исследования
2.4. Получение антигенных комплексов микроорганизмов
2.5. Лабораторные животные, использованные в экспериментах
2.6. Методы иммунизации животных
2.7. Методы контроля антигенов и сывороток
2.8. Выделение иммуноглобулинов
2.9. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюгатов
2.10. Получение и контроль липосом
2.11. Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов ^
2.12. Физико-химические методы
2.13. Иммунохимические методы анализа
2.14. Лиофилизация биологического материала
2.15. Характеристика реагентов, используемых для получения магно- 58 иммуносорбентов
2.16. Методы математической и статистической обработки материалов
ГЛАВА 3. Получение высокоактивного специфического биологического сырья (антигенов и антител) для конструирования диагностических препаратов
3.1. Получение антигенных комплексов микобактерий туберкулёза
3.2. Получение специфической туберкулёзной сыворотки ^
ГЛАВА 4. Получение иммуноферментных препаратов для экспресс-диагностики туберкулёза
4.1. Получение иммунопероксидазного конъюгата
4.2. Получение липосом и липосомально-иммунопероксидазного конъюгата
ГЛАВА 5. Получение туберкулёзных суспензионных диагности-кумов
5.1. Биотехнология изготовления латексного диагностикума
5.2. Разработка биотехнологии получения алюмосиликатного диагностикума
ГЛАВА 6. Конструирование магнитоуправляемых иммуносорбентов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза
6.1. Разработка метода селективного концентрирования возбудителя туберкулёза на магноиммуносорбенте с последующей постановкой иммуноферментного анализа.
6.2. Разработка метода селективного концентрирования возбудителя туберкулёза на магноиммуносорбенте с последующей постановкой количественного иммунофлуоресцентного анализа 1 ]
ГЛАВА 7. Изучение диагностической ценности разработанных ди-агностикумов и тест-систем для выявления антигена возбудителя туберкулеза
Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза"
Анализ сложившейся эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулёзом в нашей стране носит характер эпидемии (Онищенко Г.Г., 2002; Пунга В.В., Капков Л.П., 1999). По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) в промежутке времени с 2000 по 2020 гг. туберкулёзом в мире заболеют около 200 млн. человек, умрут около 35 млн. человек, будут инфицированы приблизительно 1 млрд. человек (WHO Fact Sheet, 2000). В связи с этим, одной из важных задач мировой медицины является разработка надёжных (активных и специфических), простых в использовании и дешёвых средств для быстрого выявления возбуди- -теля в исследуемом материале.
В нашей стране при диагностике туберкулёза большое внимание уделяется культуральным методам, за рубежом - микроскопии мазка. Но оба эти метода имеют существенные недостатки. Культивирование с момента посева составляет три месяца, причём положительных результатов- 0,5-14 % (Клименко М.Т. с соавт, 1985; Клименко М.Т. с соавт., 1987; Литвинов В.И., 1996). При микроскопии мазка (флуоресцентной) наблюдается до 14 % положительных результатов (Канюк А.Н., 1995). Таким образом, данные методы не могут претендовать на роль основных в лабораторной диагностике туберкулёза. Известны способы диагностики туберкулёза с помощью эритро-цитарных диагностикумов (Архангельский Н.И. с соавт., 1985), реакции аг-регатагглютинации (Хоменко А.Г. с соавт, 1992), реакции агглютинации латекса, масс-спектроскопии (Маякова Т.И. с соавт., 1995), но данные методы трудоёмки и малоактивны. Существуют препараты для ПЦР-диагностики, но они отличаются значительной дороговизной и сложностью исполнения и поэтому распространения ещё не получили. В связи с этим, актуальным является разработка диагностических препаратов и методов исследований, обладающих высокой специфической активностью, экспрессностью и информативностью.
ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель диссертационной работы: совершенствование биотехнологий иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза.
Основные задачи исследования:
- отработать методические подходы по извлечению полноценных антигенных комплексов из микробных биомасс возбудителя туберкулёза и получить высокоактивные иммунные туберкулёзные сыворотки;
- разработать магнитные сорбенты с фиксированными на их поверхности антигенами гетерологичных штаммов для удаления из туберкулёзных иммунных сывороток неспецифических антител;
- отработать биотехнологию изготовления высокочувствительных и стабильных туберкулёзных липосомально-иммунопероксидазных конъюгатов;
- разработать эффективные способы получения суспензионных диагности-кумов на основе полиакролеиновой (латексной) и алюмосиликатной матриц для реакций агглютинации;
- отработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами для диагностики туберкулёза в экспрессных методах (иммуноферментном анализе - ИФА, количественном иммунофлуоресцентном анализе - КИФА);
- определить диагностическую ценность применения разработанных иммунобиологических препаратов на экспериментальном и клиническом материале.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Полученные в результате исследований данные представляют интерес с точки зрения поиска путей извлечения полноценных специфических водорастворимых антигенных комплексов из микобактерий туберкулёза.
Разработан и применён аффинный магносорбент при проведении им-муносорбции гетерологичных антител из иммунных туберкулёзных сывороток, позволяющий получать специфичный препарат с сохранением его первоначальной активности, ускорять и упрощать процесс сорбции.
Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства липосомальных туберкулёзных иммуноферментных конъ-югатов, обладающих высокой чувствительностью и стабильностью.
Разработаны приёмы по предварительному селективному концентрированию микобактерий туберкулёза и их антигенов на магноиммуносорбен-тах (МИС) с последующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИ-ФА), позволяющие исследовать объекты внешней среды, материал от больных людей или животных, в том числе и сильно загрязненные, неограниченного объёма пробы с низкой концентрацией микобактерий с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей общепринятые экспрессные методы.
Приоритетность ряда выполненных исследований подтверждена 2 патентами РФ на изобретения: № 2192265 «Способ получения комплекса фос-фолипидов» (2002 г.) и № 2195296 «Способ получения ганглиозидов» (2002 г.).
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
РАБОТЫ
Основная теоретическая значимость проделанной работы заключается в определении научно-методических аспектов разработки иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза, которые учитывают характерные особенности антигенной структуры микобактерий, свойства матриц биотической (липиды) и абиотической (органокрем-незёмы, латексы) природы, методы конъюгации лигандов и маркёров, определяя направления последовательных стадий и операций биотехнологии производства диагностических туберкулёзных препаратов.
Разработанные научно-методические приёмы по получению полноценного антигенного материала из бакмасс микобактерий, высокоактивных иммунных сывороток, удалению из них перекрёстно реагирующих антител с помощью магнитных сорбентов. Оптимизация параметров иммобилизации антител обеспечила конструирование высокоактивных и специфических диагностических препаратов (иммуноферментных, суспензионных латексных и алюмосиликатных для реакции агглютинации, магноиммусорбентных).
Разработанные методические подходы по ковалентной фиксации на поверхности мембраны липосом ферментов и иммуноглобулинов позволили повысить стабильность и увеличить срок годности диагностической системы без потери активности с сохранением каталитических свойств.
Сконструированные туберкулёзные магноиммуносорбенты в сочетании с экспрессными методами диагностики повышают их чувствительность до 50-100 микробных клеток в пробе, одновременно сокращая время проведения анализа до 1-1,5 часов за счёт селективного концентрирования на своей поверхности микобактерий, ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов.
Результаты проведённых исследований по сочетанным методам магно-иммуносорбции с экспрессными анализами и использование липосомальных препаратов дополняют новыми научными данными сведения о возможности использования иммобилизованных систем, способствующих стабильности, увеличению чувствительности методов и проведению эффективной детекции микобактерий туберкулёза.
Материалы научных разработок легли в основу двух методических рекомендаций: «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденных Главным Государственным санитарным врачом России Г.Г. Онищенко 06.04.2000 и «Применение магноиммуносорбентов для выявления микобактерий туберкулёза», утверждённых директором СтавНИПЧИ (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 3 от 3.03.2005 г.).
На Федеральном уровне утверждены зам. главного санитарного врача E.H. Беляевым технические условия (ТУ) 9154-00-01897080-2004 на фосфо-липиды для получения липосом (письмо № 12 ФЦ/ 2514 А от 19. 08. 2004 г). На учрежденческом уровне утверждены два регламента: на липосомальную основу для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 4 от 20.04.2004 г.) и на тест-систему липосомально - иммунопероксидазную магноиммуносорбент-ную для выявления антигена туберкулёза иммуноферментным методом, утверждённую директором СтавНИПЧИ (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 3 от 3.03.2005 г.).
Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ по экспресс-диагностике туберкулёза и применению магноиммусорбентных препаратов в мониторинге микобактерий.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Научно-методические подходы к получению высококачественного биологического сырья (антигенов и антител) для производства противотуберкулёзных препаратов. Получены водорастворимые антигены микобактерий, содержащие полный набор высокоэффективных антигенных комплексов с высокой активностью (1:32-1:64 в РИД). Подобрана производственная схема для получения иммунных сывороток с высокими титрами антител, основанная на оптимальной комбинации комплекса специфических антигенов и им-муномодуляторов.
2. Методические приёмы конструирования и применения аффинных сорбентов с магнитными свойствами при проведении иммуносорбции неспецифических антител из иммунных туберкулёзных сывороток. Разработанные сорбенты с иммобилизованными гетерологичными антигенами и метод сорбции позволили за один этап получить не только высокоспецифичную иммунную сыворотку, но и сохранить её первоначальную серологическую активность.
3. Научно-методические основы изготовления липосомально - иммуноперок-сидазного конъюгата для выявления антигена туберкулёза иммунофермент-ным методом. Иммобилизованные на мембране липосом фермент и туберкулёзные иммуноглобулины повышают свою стабильность, что приводит к увеличению срока годности диагностической системы.
4. Биотехнология производства суспензионных латексных и алюмосиликат-ных диагностикумов, обеспечивающая высокую эффективность обнаружения микобактерий туберкулёза в экспериментальных и клинических условиях. Разработанные препараты по чувствительности аналогичны традиционным методам (РИФ, ИФА, РИГА), но превосходят их по простоте изготовления и экспрессности (постановка и учёт результатов реакции с алюмосиликатным диагностикумом в течение 1-3 мин).
5. Научно-методические основы биотехнологии изготовления твёрдофазных микрогранулированных аффинных магноиммусорбентов для избирательного концентрирования микобактерий и их использования в экспрессных методах (ИФА, КИФА). Разработанные препараты позволяют повысить чувствительность более чем в 1000 раз при увеличении вероятности выявления микобактерий за счёт селективного концентрирования антигена на антителах, находящихся на твёрдой матрице.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология XXI века» (Саратов, 28-30 сентября 2004 г.); 1-й Всероссийской конференции «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 10-11 октября,
2004 г.); региональном обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Ставрополь, 17 февраля 2005 г.); научно-практической конференции «Актуальные вопросы эпиднадзора за природно-очаговыми и особо опасными инфекциями в регионе Северного Кавказа» (Ставрополь, 14-16 апреля
2005 г.); на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005).
ПУБЛИКАЦИИ
Основное содержание диссертации отражено в 10 опубликованных научных работах (2 патента на изобретение, 1 депонированная работа и 7 трудов в научных сборниках).
СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Она изложена на 178 страницах, содержит 18 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 178 отечественных и 99 зарубежных литературных источников.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ефременко, Дмитрий Витальевич
ВЫВОДЫ
1. Сочетанное использование водно-солевой экстракции, механической и ультразвуковой дезинтеграции позволило выделять из обеззараженных ацетоном микобактерий туберкулёза полноценные антигенные комплексы с серологической активностью 1:32-1:64 в реакции иммунодиффузии с туберкулёзной сывороткой. Данная биотехнология оказалась пригодной для изолирования антигенов из близкородственных возбудителю туберкулёза в серологическом отношении микроорганизмов.
2. При получении высокоактивных туберкулёзных иммунных сывороток для иммунизации кроликов применяли выделенные антигенные комплексы с иммуномодуляторами феракрилом, тималином и циклофосфаном. Специфическая активность полученных сывороток в непрямой реакции иммунофлуоресценции достигала 1:400 -1:600, а в реакции иммунодиффузии-1:32-1:64.
3. Удаление из туберкулёзных иммунных сывороток перекрёстно реагирующих антител с помощью магнитных сорбентов с ковалентно фиксированными на их поверхности антигенами гетерологичных штаммов обеспечило получение сырья, пригодного для конструирования различных диагностических препаратов.
4. Разработанная биотехнология изготовления липосомальных туберкулёзных иммунопероксидазных конъюгатов обеспечила получение высокочувствительного, специфического диагностикума, отличающегося повышенной стабильностью при хранении по сравнению с традиционным им-мунопероксидазным конъюгатом.
5. Впервые осуществлена научная разработка биотехнологии производства серии высокоспецифических диагностических препаратов и иммобилизованных систем для выявления возбудителя туберкулёза и его антигенов в искусственно контаминированных пробах и в клиническом материале от больных (моча, мокрота).
6. Чувствительность разработанного туберкулёзного латексного диагно-стикума в реакции агглютинации латекса (РАЛ) составила 3,9x10 5-7,8х105 м.к./мл, а алюмосиликатного туберкулёзного диагностикума в реакции суспензионной агглютинации (РСА) на стекле- 7,8x105-1,56x106 при учёте результатов РАЛ через 16-18 ч, а РСА - через 1-3 мин. В клиническом материале (моча, мокрота) у больных туберкулёзом специфические антигены микобактерий выявлены в РАЛ в 66 % случаев, в РСА- в 65 %.
7. Туберкулёзные магнитные иммуносорбенты, полученные по разработанной биотехнологии, способны селективно концентрировать на своей поверхности микобактерии туберкулёза, его антигены из исследуемых проб большого объёма, включая клинический материал от больных туберкулёзом, и выступать в качестве твёрдой фазы при осуществлении имму-ноферментного и количественного иммунофлуоресцентного анализов, обеспечивающих с высокой специфичностью выявление туберкулёзного микроба в течение 1-1,5 ч с чувствительностью 1x10 м.к./пробе.
8. В клиническом материале (моча, мокрота) у больных различными формами туберкулёза специфические антигены микобактерий при использовании туберкулёзных магнитных иммуносорбентов в сочетании с имму-ноферментным и количественным иммунофлуоресцентным методами выявлены в 91 %, что подчёркивает высокую диагностическую ценность разработанных препаратов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Проводить извлечение антигенного материала путём водно-солевой экстракции, механической и ультразвуковой дезинтеграции для получения активных антигенных комплексов микобактерий туберкулёза.
2. Для повышения специфичности сыворотки проводить их иммуно-сорбцию от гетерологичных антител с помощью аффинных магноиммуно-сорбентов, полученных иммобилизацией с гетерологичными антигенами, что упрощает и ускоряет процесс очистки.
3. При конструировании суспензионных латексных и алюмосиликатных диагностикумов необходимо опытным путём подбирать нагрузку лиганда, временные и температурные параметры.
4. При получении магноиммуносорбентов для ИФА и КИФА использовать в качестве носителя - алюмосиликат, модификатора - полиглюкин, активатора - вторичный алкилсульфат натрия.
5. Проводить селективное концентрирование на магноиммуносорбенте туберкулёзных антигенов из объектов внешней среды и клинического материала, используя постоянный магнит, магнитные ловушки, с последующей постановкой ИФА, КИФА. Для постановки анализов следует использовать флаконы, пробирки, планшеты.
6. Для получения положительных результатов клинических испытаний препаратов необходимо иметь чёткое представление о специфике выявляемого заболевания, его локализации в организме человека, о свойствах возбудителя микобактерий туберкулёза, правильно проводить подготовку и сбор исследуемых материалов, так как от совокупности знаний этих составляющих зависит качество диагностики.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Ефременко, Дмитрий Витальевич, Ставрополь
1. Абелян В А., Африкян Э.Г. Иммобилизация циклодекстрин-гликозил-траисферозы и характеристика полученного биокатализатора // Журн. прикладная биохимия и микробиол. 1992. - Том 28 №2. - С. 205-209.
2. Адамов А.К. Свойства антител, фиксированных на частицах, и перспективы применения их в микробиологии. Сообщение VI // Журн. микробиол. -1965.-№2.-С. 100-105.
3. Адамов А.К., Агафонов В.И. Суспензионные антитела и иммуносорбен-ты.-М. 1969. - 175 с.
4. Аксёнова В.А. Эпидемическая ситуация по туберкулёзу у детей в России// Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. №8. - С. 57.
5. Алексеев В.В., Быкова О.И., Голосеев Ю.А. и др. Обоснование требований к люминесцирующим иммуноглобулиновым препаратам, предназначенным для количественного иммунофлуоресцентного анализа // Особо опасные инфекции на Кавказе. Ставрополь, 1987. - С.12-14.
6. Алексеев П. Названы социально значимые заболевания/ Мед. газета. -№100. 17.12. 2004
7. Алесковский В.В., Юффа А .Я. Модифицирование поверхности неорганическими соединениями // Журнал Всес. Хим. общ. Им. Д.И.Менделеева.-1989.-№3.- С.317-324.
8. Андреев Л.В., Склифас А.К. Биохимия и биофизика микроорганизмов.-Горький, 1997.- №5,- С.3-9.
9. Архангельский Н.И., Сихарулидзе А.И. Способ диагностики туберкулёза. А. с. №1171038. Бюл.№29 от 07.08.85.
10. Афанасьев E.H. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. . докт. мед. наук. Ростов, 2000. - 45 с.
11. Афанасьев E.H., Таран И.Ф., Тюменцева И.С. Антигенная структура бруцелл. Сообщ. I. Сравнительная оценка методов выделения водорастворимых антигенов бруцелл Ставрополь, 1986. - 16с. - Деп. в ВИНИТИ, № 6635-В86.
12. Базиков И.А. Разработка новых препаратов для экспрессных методов диагностики сифилиса: Дис. . .докт. мед. наук. Ставрополь, 2000. - 200 с.
13. Белиловский Е.М. Развитие государственной системы мониторинга туберкулёза, // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. №8. - С. 58.
14. Белиловский Е.М., Борисов С.Е., Дергачёв A.B., Гордина A.B., Марьина Н.С., Матвеева М.Б. Заболеваемость туберкулёзом в России: её структура и динамика // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. №7. - С. 4-11.
15. Бельская H.A., Митина B.C., Вейнблат В.И. Микрометод фракционирования и идентификация белков // Лаб. дело. 1972. - № 10. - С.514-616.
16. Бендикене В.Г., Песлякас И.Г., Веса B.C. Хроматография сериновых протеаз на хитине и его производных // Прикладная биохимия и микробиол. -1981.-Т. 17, №3,- С. 441-447.
17. Березин В.Б., Лахтин В.М., Ямсков И. А. Аффинный хроматографический сорбент, содержащий группировки конканавалина А, иммобили-зованного комплексообразованием с кобальтом // Прикладная биохимия и микробиол. 1995. -Т.31, N4. - С.400-404.
18. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия,- М., 1982. С.92.
19. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.-2002.- С.437- 441.
20. Брыкалов A.B. Получение биопрепаратов на основе методов аффинной сорбции и иммобилизации: Дисс. . докт. химич. наук. Санкт-Петербург, 1993.-330 с.
21. Брыкалов A.B. Сорбенты на основе кремнеземов и активированных углей в биотехнологии и медицине // Материалы конф. химиков Сев.Кавказа.- Нальчик, 1991.- С. 185-186.
22. Брыкалов A.B., Ковальков В.И., Тельбух В.П. и др. Способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов. Патент № 1084300 А С 12 №11/14 от 27.08.1982.
23. Бусеев А.И., Ефимов И.П. Словарь химических терминов.-М.,1971.- С. 92.
24. Василенко Н.Ф., Кронгауз И.В., Лопаткин О.Н. и др. Способ получения туляремийного антигена / А. с. № 1425910 от 22.05.1988.
25. Вейнблат В.И., Каминский В.В., Орлова Л.С. Иммунодискэлектрофорез антигенов чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов, 1971. Вып. 4(26). - С. 196-200.
26. Вишневская Е.Б., Бобченок А.П., Мельникова H.H. и др. Идентификация L- форм микобактерий туберкулёзного комплекса с применением полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) // Проблемы туберкулёза.-2001. №3. - С.38-39.
27. Владимцева И.В. Научно-методические аспекты приготовления и использования магнитоуправляемых иммобилизованных микробиологических систем: Автор. . докт. биол. наук. Ставрополь, 2002. - 39 с.
28. Владимцева И.В., Плеханова Н.Г., Смирнова В.И., Закревский В.И. Конструирование диагностической тест-системы на основе магносорбентов и ли-посом // ЖМЭИ. — 1990. №10. — С.103-106.
29. Власов Г.С., Салов В.Ф., Торчилин В.П., Бердичевский В.Р. Липисомы и перспективы их использования в прикладной иммунологии // ЖМЭИ. — 1982. №8. С.12-19.
30. Водолазова A.M., Никитина Л.Н. Электрофоретическая характеристика стадии риванолового осаждения иммуноглобулинов // Биологические препараты и иммунологическая реактивность организма. Томск, 1981.- С.14-15.
31. Гаврилова Е.М., Дзантиев Б.В., Егоров A.M. Иммуноферментный анализ: Тез.докл.З-го Всес.науч.симпоз. "Получение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине"-Л., 1980. С.37-38.
32. Гайда A.B., Староверов С.М. Модифицироранные кремнезёмные носители в биотехнологии // Журн. Всесоюзного хим. общества им.Менделеева.- 1989. Т34. № 3. - С. 356-363.
33. Герстунбергер М.Р., Сухоруков Г.Б., Радченко И.Л. и др. Новый метод получения биополимерных микрокапсул для создания лекарственных средств // Биотехнология- состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Меж-дун. Конгресса. М, 2002. - С.54.
34. Гинзбург A.JI. Генодиагностика инфекционных заболеваний // Журн. микробиол. 1998. - №3. - С.86-95.
35. Гонтарь И.П., Зборовский И.А., Александров А.В и др. Иммуномодули-рующий эффект магносорбентов в терапии реавматических заболеваний // Y Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тез. докл. 1998. - С.35.
36. Гучетль Е.В., Пономарёва Л.П. Опыт определения противотуберкулёзных антител в краевом противотуберкулёзном диспансере Краснодара // Клиническая лабораторная диагностика. 2002. - №9. - С.36
37. Дмитриев Г.А., Киселёва Т.А. Применение ИФА для серодиагностики сифилиса // Актуальные вопросы дерм, и венер.: Сб.тр. юбил конф., посвящ. 5-летию созд.кож. и вен. болезней педиатр. фак.РГМУ М., 1997. - С.36-37.
38. Домарадский И.В. Проблемы перекрёстного иммунитета// Проблемы туберкулёза.-1994. №1. - С.13-17.
39. Драбкина Р. Микробиология туберкулёза.М., 1963.-255с.
40. Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая химия. М.,1983. - С. 348, 352.
41. Дячина М.Н., Лукин Ю.В., Зубов В.П. и др. Микротитрационный вариант реакции латекс-агглютинации в диагностике лепры // Клин.лабат.диагн. -1995. №2. - С.24-26.
42. Елистратов Г.Д., Волчанова М.И., Малыгин И.В., Гирда Т.В. Способ получения сорбента // БИПМ.-№ 3. -2004.- С. 629.
43. Елистратов Г.Д., Волчанова М.И., Малыгин И.В., Шолошов А.П., Стрелков В.П., Гнутов В.Г., Григорьев Г.А., Гасысов Д.Г. Способ получения сорбента // БИПМ.-№ 3. -2004.- С. 629.
44. Ерохин В.В. Сотрудничество Российских фтизиаторов с международными организациями // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.-2003.-№8. -С. 57.
45. Ерохин Е.П. Метод пассивной агглютинации полимерных дисперсий для диагностики легионеллеза // Журн. микробиол. 1991. - № 11.- С. 41-43.
46. Ефременко В.И. Липосомы. Монография.- Ставрополь, 1999.-236.
47. Ефременко В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектов внешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней // Журн. микробиол. 1997. - №2. - С. 102-106.
48. Ефременко В.И., Брыкалов А.В., Жарникова И.В. Новые препараты для диагностики и ветеринарно-санитарного мониторинга // Пища. Экология. Человек : Тез.докл. междун. научн.-технич. конф. Москва, 1995. - С. 206.
49. Ефременко В.И., Климова И.М., Трофимов Е.Н. Магнитный иммуно-ферментный анализ антигенов чумного микроба // Журн. микробиол. 1989. -№7.- С.62-66.
50. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Василенко Н.Ф. и др. Разработка технологической линии производства в методах иммуноанализа микроорганизмов: Заключительный отчет о НИР, инв. № 02.9.70001181.- Ставрополь, 1996. 96 с.
51. Жарникова И.В. Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей Авт. док. дис.2005.
52. Жарникова И.В. Структурированный керамический носитель с магнитным материалом для иммобилизации антител // Биотехнология.- 2004. -№1.- С.71-79.
53. Журавлёв М.В., Арсенина J1.B., Виноградова И.Л., Проваторова Л.В.Эпидемиология и некоторые аспекты лабораторной диагностики туберкулёза// Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней.М.- 2002. -Вып.4,- С.194-197.
54. Закревский В.И. Некоторые аспекты применения липосом в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний // Молек. генетика, мик-робиол. и вирусол. 1985. - №1. - С.3-8.
55. Закревский В.И., Подзолков В.В., Мельников В.А. Способ включения веществ в липосомы: A.c. № 1005791, СССР, 1983.
56. Иванов Ю.В., Коровкин С.А. Флюоресценция с временным разрешением и ее применение для диагностики ООИ // Материалы VII съезда Всеросс. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. -М., 1997. Т. 1. - С. 442.
57. Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза. Приложение № 11 к приказу №109.М., 2003.
58. Инструкция по унифицированным методам микроскопических исследований для выявления кислотоустойчивых микобактерий в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. Приложение № 10 к приказу №109.М., 2003.
59. Калинина O.A., Емельянова И.В., Локтионова М.А. ИФА в серодиагностике сифилиса // Совр. вопр. дермато-венерологии: Сб. юбил науч. Тр., по-свящ.70-летию обл.кож.- вен.дисп.г. Курска. Курск,- 1997.- С.65-67.
60. Канюк А.Н. Комплексные бактериологические исследования в диагностики туберкулёза // Туберкулёз и экология.- 1995. №3.-С.31-33.
61. Карпенко В.В., Сачков В.И. Обезболивание животных в эксперименте: Метод, рек. М., 1985. - 53 с.
62. Карпов С.П., Прегер С.М., Синельников Г.Е. и др. Гипериммунные сыворотки. Томск, 1976. - 378 с.
63. Кейтс М.Техника липидологии. М. Мир, 1975.-С.68-82.
64. Кельцев Н.В. Основы адсорбционной техники .-М: Химия, 1984. С. 280.
65. Киселев A.B., Кустова Т.Л. Способ приготовления аэросилогелей // A.c. N264369 . -1976.
66. Кислицын Ю.В., Мешандин А.Г. Способ определения наличия противо-мозговых антител в ликворе. Заявка № 2000127007/14, Бюл № 20.- 20.06. 2002.
67. Клименко М.Т., Гинзбург Т.С., Сокало C.B. Результативность биологического и культурального методов исследования при диагностике туберкулёза // Проблемы туберкулёза 1987.- №8.-С.70-73.
68. Клименко М.Т., Гинзбург Т.С., Сокало C.B., Бочко И.В., Крикун А.И. Микробиологическая диагностика туберкулёза почек // Проблемы туберкулёза- 1985.- №8.-С.37-40.
69. Клячко-Гурвич A.A. Методы определения удельной поверхности //Из-во АН СССР.-1964. -№ 10.-С. 1885.
70. Коваленко Г.А, Комова О.В. Симаков A.B. и др. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов //Биотехнология.-2002. №3. - С.55-66.
71. Кольцов С.И., Алесковский В.Б. Силикагель, его строение и физико-химические свойства. JI: Госхимиздат, 1973. - С.96.
72. Коротченко С.И. Состояние и перспективы борьбы с туберкулёзом// Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней.М.- 1999. Вып.З.-С.139-142.
73. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. СПб, 2002.- С.480-481.
74. Кузовлева A.A., Шаханина K.JI. Сравнение различных способов иммобилизации препаратов чистых антител и неспецифических иммуноглобулинов // Лаб.дело. 1982. - N 3. - С.9-12.
75. Кузовлева A.A., Шаханина К.Л. Сравнение различных способов иммобилизации препаратов чистых антител и неспецифических иммуноглобулинов // Лаб.дело. 1982. - N 3. - С.9-12.
76. Кулаков Ю. К., Горелов В. Н., Мотин В. Л. и др. Высокочувствительная неизотопная система гибридизации ДНК с применением амплификации (ПЦР) для идентификации бруцелл // Молекуляр. генетика, микробиол. и вирусол. -М., 1992. -№ 7-8. С. 23.
77. Кунижев С.М., Воробьёва О.В., Денисова Е.В. и др. Разработка способа получения универсальной матрицы для энтеросорбентов // Биотехнология- состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Международного Конгресса. М., 2002. - С.75.
78. Лавриненко И.А., Костровский В.Г. Использование высокоёмких иммуноносителей при определении антител к вирусу иммунодефицита человека // Журнал микробиол. -1997. -№1. С.18-22.
79. Лазовская А.Л., Воробьёва З.Г., Слинина К.Н. Способ выявления мико-бактериальных антигенов. Патент № 2188428, Бюл.№24. 27.08.2002.
80. Лазовская А.Л., Воробьёва З.Г., Слинина К.Н. Способ выявления мико-бактериальных антигенов. Патент № 2188428, Бюл.№24. 27.08.2002.
81. Ларионова Е.Е., Кузьмин A.B. Актуальные вопросы туберкулёза и других гранулематозных заболеваний// Сборник материалов науч.-практ. конференции молодых учёных.- М., 2001.- С.28-29., 2001
82. Ларионова Е.Е., Кузьмин A.B., Васильева И.А., Сравнительная характеристика молекулярных и микробиологических методов контроля химиотерапии у впервые выявленных больных туберкулёзом лёгких// Проблемы туберк-лёза и болезней лёгких.- 2004. №6. - С. 31-34.
83. Лисичкин Г.В. Достижения, проблемы и перспективы химического модифицирования поверхности минеральных веществ // Журн. Всесоюз. хим. общества им.Менделеева. -1989.-Т.34, № 3. С. 291-297.
84. Литвинов В.И. Иммунодиагностика туберкулёза // Проблемы туберкулёза- 1996.- №1.-С.56-59.
85. Литчфилд У.Д., Фрейтаг Д.У. Иммуноанализ с помощью ферментов, заключенных в липосомы // М., 1998. С.122-129.
86. Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В. Оптимизация параметров метки иммуноглобулинов изотиоцианатом флуоресцеина // Болезни с природной очаговостью на Кавказе: Тез. докл. Ставрополь, 1982.- С.173-175.
87. Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В. Повыщение специфичности сывороток при использовании метода твёрдофазной адсорбции// Профилактика чумы и других природно-очаговых инфекций: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. Ставрополь, 1983. -Т.2. - С.81-82.
88. Лукин Ю.В., Трифонов В.Д., Туркин С.И. и др. Полиакролеиновые латесы в качестве иммунореагентов // Тр. МХТИ.- 1985. Вып. 185. - С. 88-92.
89. Марголис Л.Б. Механизмы взаимодействия липосом с клетками: перспективы и ограничения применения липосом в науке и практике //Биол. мембраны. 1987.-Т.4, №5. - С.453-467.
90. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками // М.:Наука, 1986. 240 с.
91. Масько A.A., Морозова A.A., Лыга Л.К. и др. Иммобилизация трипсина на углеволокнистых носителях, различающихся структурой, пористостью и химией поверхности // Прикладная биохимия и микробиология. -М., Наука, 1992. -Том 28, №2. С. 211-216.
92. Медицинская и санитарная микробиология. Под ред. Воробьёва A.A., Кривошеина Ю.С., Широбокова В.П.-М., 2003.-С.213-217.
93. Медицинская микробиология. Под ред. Покровского В.И., Позднеева О.И. М., 1998.-С.499-509.
94. Методические указания «Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза». М, 2001.
95. Милютина JI.H., Скопинская С.Н., Ярков С.П. Липосомальный имму-ноанализ в диагностике сальмонеллеза у детей //Эпидемиол. и инф. болезни. 1996.-№ 3. - С.48-52.
96. Муромец В.И., Наградова Н.К. Иммобилизованные олигомерные ферменты. М: Наука, 1984. - С. 10.
97. Носков Ф.С. Очистка конъюгатов от непрореагировавшего флюорохрома // Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Под ред. Т.В.Перадзе, П.Халонена. М.Д985.-С. 254.
98. Носков Ф.С. Флуоресцирующие антитела и их применение в вирусологии.- В кн.: Респираторные вирусные инфекции. Л.,1969. - С.217-242.
99. Ометов В.К., Моргуль М.П., Уразовская Е.В. и др. О применении имму-ноферментного анализа в диагностике сифилиса // Вестн. дермат.- 1997.- №3.-С.24-35.
100. Онищенко Г.Г. (Материалы к докладу) Главного государственного санитарного врача РФ на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов// М., 26-28 марта 2002.
101. Онищенко Г.Г. Эпидемиологическая ситуация в Российской Федерации и меры по её стабилизации// Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. -№11.-С. 4-9.
102. Остро М.Д. Липосомы // В мире науки. 1987. ТЗ. - С.71-79.
103. Петров Р.В. Иммунология. М.,Медицина.-1983.-С.5-16.
104. Петрухина М.И., Русакова Е.В., Ющенко Г.В. Эпидемиологический надзор за туберкулёзом в современных условиях// ЖМЭИ. 2003.-№5.-С.93-96.
105. Подзолкова Г.Г., Климова И.М, Ефременко В.И. и др. Применение количественной иммунофлуоресценции для определения адсорбционной способности магнитных иммуносорбентов // Журн. микробиол. 1988. - № 5. -С.56-58.
106. Подоляко М.П., Баташев В.В., Уралева B.C. и др. Иммуноферментный метод обнаружения бруцеллезных антител и антигена в сыворотках крови животноводов из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств // Журн. микробиол. 1995. - № 6. - С. 53 - 54.
107. Постнова A.M., Пак В.Н., Кольцов С.И. Исследование протонной кислотности титаносодержащих силикагелей, полученных методом молекулярного наслаивания // Журн. физ.химии. 1981. - Т.35, N8. - С.2140-2142.
108. Приказ № 109. О совершенствовании противотуберкулёзных мероприятий в Российской федерации. М., 2003.
109. Приказ № 558. Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулёзе. М., 1978.
110. Пунга В.В., Капков Л.П. Туберкулёз в России // Проблемы туберкулёза-1999.-№1.- С.14-16.
111. Пушкарь В.Г., Климова И.М., Ефременко В.И. и др. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов // Метод, рекоменд. Волгоград, 1984.- 15 с.
112. Рекомендации для национальных программ ВОЗ, 1978;
113. Рогожина C.B., Варламов В.П., Вальковский Д.Г. Получение модифицированных кремнеземов для присоединения биологически активных соединений // Изв. АН СССР. 1975. - № 8. - С. 1718-1721.
114. Ротов К.А., Климова И.М., Васильев В.П. с соавт. Выявление антигенов в применением липосом в радиоиммуноанлизе // Матер. Рос. научн. конф. Тез. докл. (Волгоград, 21-22 окт., 1992). Волгоград. - 1992. - С.168.
115. Русакова Е.В., Иваненко Г.П., Иванова И.Н. и др. Состояние и перспективы борьбы с туберкулёзом //Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней.М.- 2002. Вып.4.- С. 186-190.
116. Самсонова С.А., Самсонов В.В., Гудима М.Ю. и др. Методы ПЦР для паспортизации и классификации микроорганизмов // Биотехнологиясостояние и перспективы развития: Материалы 1-го Междунар. Конгресса.-М., (14-18 октября) 2002. С.176.
117. Севастьянова Э.В., Ларионова Е.Е. //Материалы 9-го Национального конгресса по болезням органов дыхания.- М., 1999.- С. 122.
118. Скачек Д.В. Научно-методические основы стандартизации люминесци-рующих иммуноглобулинов для диагностики возбудителей особо опасных инфекций. Автореф. дисс. . канд.мед.наук. - Саратов, 1984. - 173.
119. С куч Д., Уэст Д. Основы аналитической химии. М: Мир, 1979. - Т.1.- С.71-73.
120. Смирнов В.В., Чаплинский В.Я., Андреева З.М. и др. Научные основы производства диагностических препаратов (Сыворотки для идентификации энтеробактерий). Киев: Наукова Думка, 1980. - 195с.
121. Стоев К.Г., Чибисова В.А., Шаханина К.А. и др. Новый количественный иммунофлуоресцентный метод определения IgE с помощью специфического сефарозного иммуносорбента и люминесцентного микроскопа // Журн. иммунология. М, 1981. - N1. - С.85-88.
122. Сухоруков A.M., Пономарёва A.M. Изучение сорбционных свойств полистироловых планшетов, используемых в иммуноферментном анализе // Журн. микробиол.- 1987,- №9.-С. 18-22.
123. Сюнамото Дзюндзо, Акиёси Кадзунари, Сато Тосинори. Роль липосом в биологических дисциплинах // Biosci. and Ind.-1989. V.47, N 5. P. 475-485.
124. Табаков П.К, Чибрикова Е.В., Шуркина И.И. и др. Быстрый способ получения меченых флуоресцентными красителями антител // Журн. микробиол.- 1962. -Т 10. -С.26-30.
125. Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций // Журн. микробиол. -1969.- № 10.-С.26-31.
126. Темишевская Л.Я. Использование техники иммобилизации клеток для непрерывного культивирования токсинообразующих анаэробов // Журн. мик-робиол.- 1995.- №6. С.21-22.
127. Тишин A.M., Спичкин Ю.И. Пористый магнитный сорбент // БИПМ.-№ 9.-2004.- С. 643.
128. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М:Мир, 1983. - С.23.
129. Тунгусова О.С., Марьяндышев А.О. Молекулярная генетика микобакте-рий туберкулёза//Проблемы туберкулёза.-№2,- 2003.- С.43-45.
130. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей ОО и других инфекций: Автореф. дис. . доктор, мед. наук. — Саратов, 1996. -57 с.
131. Тюменцева И.С., Жданова Е.В., Афанасьев E.H. Усовершенствование производственной схемы иммунизации животных моно- и поликомпонентными антигенами Ставрополь, 1994 г. - 15 с. -Деп. в ВИНИТИ 04.11.94, № 2507-В94.
132. Фихте Б.А. Дезинтеграция микроорганизмов. Задачи и перспективы// В сб.: Дезинтеграция микроорганизмов: Матер. Всесоюзн. конф. по дезинтеграции микроорганизмов (25-27 окт., 1972 г.) Пущино-на-Оке, 1972. - С.5-14.
133. ФрайфелдерД. Физическая биохимия. М: Мир, 1980.-С.73.
134. Фримель Г. Иммунологические иетоды. M., 1987.-С.110-112.
135. Фролова О.П.Проблемы туберкулёза у больных ВИЧ-инфекцией // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. №8. - С. 58.
136. Фролова Ф.Н., Кулаков И.М., Зайнутдинова Н.Г., Фатыхова Р.Х. О заболеваемости туберкулёзом в г. Казань// Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней.М,- 2002. -Вып.5.- С.144-146.
137. Хмельницкий P.A. Физическая и коллоидная химия. Изд. Высшая школа. -М., 1988.-С. 342-343.
138. Ходж Ф. Органические реакции с использованием реагентов или субстратов, ковалентно закрепленных на функционализированных неорганических носителях // Журн. Всесоюз. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева. -1989.-Т.34, N3. С.331-339.
139. Хоменко А.Г., Авербах М.М., Романова Р.Ю., Горина Л.Г., Литвинов В.И. Способ определения микобактерий туберкулёза в крови больных туберкулёзом. А. с. № 1123128. Бюл.№3 от 23.01.92.
140. Хоменко В.А., Александров М.Т., Брагина М.Н., Смирнова В.В., Лизу-нова И.А. Применение метода ЛФД для диагностики и оценки эффективности лечения внелёгочного туберкулёза/ Клиническая лабораторная диагностика.-9.- 2004.- С. 37.
141. Хохлова Т.Д., Гаркавенко Л.Г., Никитин Ю.С. Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах// Прикладная биохимия и микробиология,- М., Наука. 1991. Т. 27, №5. - С. 720-724.
142. Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. -Л., 1991. -239 с.
143. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Денисова Т.С. и др. Генодиагностика в современной медицине// Материалы Всероссийской науч.-практ. конференции.- М.2000.- С.291-292.
144. Чибисова В.А. Приготовление и стандартизация люминесцирующих сывороток для непрямого метода иммунофлуоресценции: Автореф. дисс. . канд. мед наук. М., 1975. - 25 с.
145. Чутаев Ю.П., Падерин В.Ф., Теряева М.В. Диагностические возможности метода внутрикожного введения денатурированного гамма-глобулина при кониотуберкулёзе внутригрудных лимфатических узлов// Проблемы туберкулёза.- 1996. №4. -С. 16-17.
146. Шаханина К.Л. Иммуносорбенты и их использование для выделения чистых антител // Биохим. и биофиз. микроорганизмов. -1981. В.9. - С.15-23.
147. Шаханина К.Л. Приготовление люминесцирующих антител. -В кн.: Иммунофлуоресценция в медицине. М.:Медицина, 1977. -С.23-46.
148. Шаханина К.Л., Манько М.И. Избирательное концентрирование бактерий и риккетсий при помощи поликонденсационных иммуносорбентов //Журн. микробиол. 1969.-N9-C.140-144.
149. Шаханина К.Л., Походзей И.В. Приготовление сефарозных пневмококковых диагностикумов и их использование в клинике легочных заболеваний // Журн. микробиол. 1978. - N3. - С.75-79.
150. Шаханина К.Л., Соколенко A.A., Павлова И.П. Выбор критериев пригодности твёрдофазных носителей на основе полистирола для проведения им-муноферментного анализа // Журн. микробиол. 1987. - N9 -С.86-89.
151. Шевченко Ю.Л. Приказ № 109 от 21.03.2003. О совершенствовании противотуберкулёзных мероприятий в РФ // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. №11. - С. 57.
152. Шешуков П.Ф., Готовский Ю.В.Некоторые аспекты современной диагностики туберкулёза // Материалы 8-й международной конференции «Теоретические и клинические аспекты применения биорезонансной и мультирезо-нансной терапии».М., 2002.- 4.1.-С. 167-169.
153. Яковлев А.Т. ИФА в лабораторной диагностике бактериальных особо опасных инфекций: Автореф. дисс. . доктора мед. наук.- Саратов, 1992.- 43 с.
154. Anaokar S., Garry P.J., Standefer J.C. Solid-phase enzyme immunoassay for serum ferritin //Clin.Chem.- 1979. V.25. - P. 1426-1431.
155. Ansari A.A. et. al., Purification antigemoglobin antibody using cross-einked immunoadsorbent //S. immunol. Methods. -1981. V. 42. - N 1, P. 45-51.
156. Ashford DA, Whitney E, Raghunathan P, Cosivi O. Epidemiology of selected mycobacteria that infect humans and other animals. Rev Sci Tech 2001; 20: 325-37.
157. Badak FZ, Goksel S, Sertoz B, Ermertcan S, Cavusoglu C, Bilgic A. Use of nucleic acid probes for identification Mycobacterium tuberculosis directly from MB/BacT bottles. J Clin Microbiol 1999; 37: 1602-5.
158. Beuntner E.H., et al. A reveas immunodiffusion assay for antibody protein concentration in antisera or conjugates to human IgG //Standartization in immunofluorescence. Oxford. Blackwell Scientific Publ, 1970. - Pat.2. - P.165-169.
159. Bricker B.J., Ewalt D.R., MacMillan A.P. et al. Molecular Characterization of Brucella Strains Isolated from Marine Mammals //J. Clin Microbiol.- 2000.-Vol.38(3).- P.1258-1262.
160. Bushway R.J., Perkins L.B., Hurst H.L., Ferguson B.S. //Food chemistry.-1992. V.43. - P. 283.
161. Butler WR, Jost KC, Kilburn JO. Identification of mycobacteria by highperformance liquid chromatography. J Clin Microbiol 1991; 29: 2468-72.
162. Butler WR, O'Connor SP, Yakrus MA, Gross WM. Cross-reactivity of genetic probe for detection of Mycobacterium tuberculosis with newly described species Mycobacterium celatum. J Clin Microbiol 1994; 32: 536-8.
163. Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet E. Magnetic enzyme-linked immunosorbent assay (Melisa) for determination of specific IgG in paracoccidiodomycosis //Sabouraudia.- 1984. V.22, N 4. - P.291-299
164. Chim C., Wold F. The preparation of matrix bound proteases and their use in the hydrolisis of proteins // Anal.Biochem. - 1974. - V. 61., N 2. - P. 379-391.
165. Choleragen mediated release of trapped glucose from liposomes containing ganglioside Gml /Moss J., Fishman P.H.,Richards R.L. et al. //Proc.Nat. Acad. Sci USA. - 1976. - V.73, № 10. - P.3480-3483.
166. Chua M.-M., Fan S.-T., Karush F. Attachment of immunoglobulin to liposomal membrane via protein carbohydrate //Biochim. et biophys. acta: Gen. Subj. 1984. - № 3. - P.291-300.
167. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus // J. Gen. Virol. 1977. - V.36, №3. - P.475-483.
168. Coons A.H., Greech H.G., Gones A.N. et al. The demonstration of pneumococcal antigens in tissue for the use of fluorescent antibody // J.Immunol.-1942.-V. 45, N3.-P. 159-170
169. Coons A.H., Kaplan M.H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. 1950. -V.91,N 1.-P.81-89.
170. Cunliffe D, Smart C.A., Tsibouklis J. et al. Bacterial adsorption to termore-sponsive polimer surfaces // Biotechnol. Lett.- 2000.-22. N 2.-P.141-145
171. Dankner WM, Davis CE. Mycobacterium bovis as a significant cause of tuberculosis in children residing along the United States-Mexico border in the Baja California region. Pediatrics 2000; 105: E79.
172. Dankner WM, Waecker NJ, Essey ME, Moser K, Thompson M, Davis CE. Mycobacterium bovis infection in San Diego: a clinicoepidemiologic stady of 73 patients and a historical review of a forgotten pathogen. Medicine (Baltimore) 1993; 72: 11-37.
173. Deng Shaoli, Yang Yuan. Zhongguo xiandai yixue zazhi. // J. Mod. Med. China 2002. - 12.№18. - C. 37-41.
174. Dolin PJ, Raviglione MC, Kochi A. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000. Bull WHO 1994; 72:213-20.
175. Duffey PS, Guthertz LS, Evans GC. Improved rapid identification of mycobacteria by combinding solid-phase extraction with high-performance liquid chromatography analysis of BACTEC cultures. J Clin Microbiol 1996; 34: 1939-43.
176. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. 1971. - V.8., N 9. -P. 871-879.
177. Eremenko E.I., Buravtseva N.P., Tsygancova O.I. et al. Scheme for solation and identification of Bacilus anthracis // Proceds of the 1st European Conference on Dangerous Pathogeus. Wiuchester (England), 1999. -P.43.
178. Ficapal A, Alonso-Urmeneta B, Velasco J. et al. Diagnosis of Brucella ovis infection of rams with an ELISA using protein G as conjugate //Vet. Ree. 1995. -V. 5137, N6.-P. 145-147.
179. Flechtner M.D., Bieniaz C., Shipchandier M., Adamczyk M. Fluorophores for encapsulation into liposomes: Pat. N 4912208, USA, 1990.
180. Ford EG, Snead SJ, Todd J, Warren NG. Strains of Mycobacterium terrae complex which react with DNA probes for M. tuberculosis complex. J Clin Microbiol 1993;31:2805-6.
181. Frieden Thomas R., Driver Cynthin R. Tuberculosis control: Past 10 years and future progress // Tuberculosis 2003.-№l-3.- C.82-85.
182. Gall D., Nielsen K., Forbes L. et al. Alidation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for the detection of serum antibodies to Brucella abortus in bison // J. Wildl. Dis. 2000. - Vol.36(3). - P.76-469.
183. Gangadharam PRJ, Droubi AJ. Identification of mycobacteria by smear examination of the culture. Tubercle 1981; 62: 123-7.
184. Ged.- 1949.-V.261,N 14.-P.1-9.
185. Goto M, Oka S, Okuzumi K, Kimur S, Shimada K. Evaluation of acridinium-ester labeled DNA probes for identification of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex in culture. J Clin Microbiol 1991;29:2473-6.
186. Guesdon J.L., Avrameas S. Solid-phase enzyme immunoassay //Appl. Bio-chem. and Bioeng. 1981. - V. 3. - P.207-232.
187. Harding N. Laboratory equipment digest // J.immunol. Meth. 1982. -V.20,- N 4.- P. 89-93.
188. Heifets LB, Jenkins PA. Specication of mycobacteria in clinical laboratories. In: Gangadharam PRJ, Jenkins PA, editors. Mycobacteria I basic aspects. USA: Chapman&Hall; 1998 p 308-50.
189. Hornung M., Ludwic M, Schmauder H.P. A New Technology for an optimised supply of emerged microbial cultures // 1-st International congress. Biotechnology- state of the art and prospects of development/ Russia. Moscow, (14-18 октября) 2002. C.202.
190. Interaction between glycophorin and ganglioside Gmj on liposomal membranes. Effect of the interaction on the susceptibility of membranes to HVI /Umeda M., Kanda S., Nojina S. et al. //J. Biochem. 1984. - V. 96, № 1. - P.229-236.
191. Kato K., Hamguchi Y., Fukui H. et al. Enzyme-linked immunoassay. Novel method for synthesis of the insulin D - galactosidase conjugate and its applicability for insulin assay // J.Biochem.- 1975. - V. 78. - P. 235-237.
192. Kluge H, Jakubowiak W, Pashkevich D, Danilova I, Ruybka L, Dara M, Lebrun L, Espinasse F, Povenda J, Vincent V. Evaluation of nonradioactive DNA probes for identification of mycobacteria. J Clin Microbiol 1992; 30: 2476-8.
193. Kriz K., Gerhrke J., Kriz D. Advancementstoward magneto immunoassays. Biosens Biolectron. 1998. - V. 13 (7-8). -P.817-823.
194. Lachman P.J. The production of antibodies specific to nunor immunoglobulins by the immunization of rabbit paralysed with IgG // In. Standartization in immunofluorescence. Oxford, 1970. - P. 225-234.
195. Laser-light seattering studies on mixed phosphatidylcholine + GMj ganglioside monolamellar vesicles /Masserini M., Sonnino S., Giuliani A., Tettamanti G. et al.//Ital. J. Biochem. 1984. - V. 33, № 3. - P.179-181.
196. Lea T., Vartdal F., Davies C., Ugelstad J. Magnetic monosired polymer pasti-cles for fast and specific fractionation of human mononuclear cells //Scand. J. Immunol. 1985. - V.22 , № 2. - P.207-216.
197. Leserman L.D., Aranol D., Barbet J. Et al. Antibody-bearing liposomes as probes of receptor-mediated endocytosis // Receptor-Mediated Target. Drugs. Proc. NATO Adv. Studi Inst., Cape Sounion, June 1, 1983. New York; London, 1984. P. 393-405.
198. Liposomes//Appl. Genet. News. 1988.-V.8, N10. P.14-15.
199. Liposomes and immunology / Eds. B.N.Tom, H.P. Six Elsevier. 1980. - P. 345.
200. Lowe C.R., Dean D.G. Affinity Chromatography. London- New-York-Toronto: Wiley- Intersci. Publ., 1974. P.135.
201. Marshall K., Ridgewee N, Simpson J. The acidity of surface groups of silicf // Chem. And Ind. 1974. V. 19. - P.775-776.
202. Maruyama S., Boonmar S., Morita Y. Seroprevalence of Bartonella henselae and Toxoplasma gondii amond healthy individuals in Thailand // J. Vet.Med.Ski.-2000.-Vol 62, N 6.- P.635-637.
203. McDougall I.R., Dunnick J.K., McNamee M.G., Kriss J.P. Distribution and fate synthetic vesicles in the mouse. A combined radionuclide and spin label study // Proc. Nat. Acad. Sei. USA 1974, V.71. -P.3487-3491.th
204. Miranda A .G. Crisis-driven migrants and the tuberculosis experience // 34 World Conference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD), Atlanta, GA, USA.-V. 7, № 11, 2003.- P. 113.
205. Molday R.S., Jen S.P.S., Rembaum A. Application of magnetic microspheres in labelind and separation of cells // Nature. 1977. - V.268. - P.437-438.
206. Murray CJL, Styblo K, Rouillon A. Tuberculosis in the developing countries: burden, invention and cost. Tuber Lung Dis 1990; 65: 6-24.
207. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody-a new method of conjugation // J.Histochem. Cytochem. -1974.- V. 22, N 4. P. 506-508; 1084-1091.
208. Nielsen K., Lin M., Gall D. et al. Fluorescence Polarization Immunoassay: Detection of Antibody to Brucella abortus // Methods. 2000.- Vol. 22(1). P- 71-76.
209. Nikolayeva O, Shpak O. Diagnosis of mediastinal lymph node tuberculosis // 34 World onference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD), Atlanta, GA, USA.-V. 7, № 11, 2003.-P. 314.
210. O'Reilly LM, Daborn CJ. The epidemiology of Mycobacterium bovis infections in animals and man: a review. Tubercle Lung Dis 1995; 76: 1.
211. O'Berry P.A. A comprasion of 3 methods of serum fractionation in the preparation of vibrio fetus fluorescent antibody conjugates // J. Vet. Res. 1964. -V.25. - P.1669-1672.
212. O'Sullivan M.J., Marks V. Method of preparation of enzymatibody conjugates for use in enzyme immunoassay // Meth. In Enzymol.- New.York, 1981. V. 73. -P. 147- 166.
213. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gel. // Arkiv for Kemi. Mineral.
214. Poison A., Potgieter G.M., Largier J.E. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh // Biochem. Biophis. Acta. 1964. -V.82. -P.463-475.
215. Portaels F. Epidemiology of non-tuberculosis Mycobacteria// 34th World Conference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD), Atlanta, GA, USA.-V. 7, № 11, 2003.- P. 123.
216. Ramadass P., Samuel B.,Nachimuthu K. A rapid latex agglutination test for detection of leprospiral antibodis // Vet.Microbiol.1999.-V. 70, N 1-2.- P.137-139.
217. Richardson J., Hill A., Luxton R et al. A novel measuring system for the determination of paramagnttic particles labels for use in magetj-immunossays. Biosens Bioelectron.- 2001. V.16. - P. 1127.
218. Rowe D.S. Production of specific antisera // In.: Standartization in immunofluorescebce. Oxford, 1970. - P.27-38.
219. Ruiz- Bravo A., Jimemez- Val era M. Perspectivas de la microbiología: El fuñiro immediato //Ais pharm. 1996. -V. 37. - N 2. - P.171-181.
220. Small P., van Embden J.D.A.//Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control / Ed. B.R.Bloom.- Washington. 1994.- P. 569-581;
221. Snyder L.R., Kirkland J.J. Introduction to modern liguid chromatography. N.Y.-Wiley, 1979.- 863 p.
222. Somoskovi A, Hotaling JE, Fitzgerrald M, Jonas V, Stasik D, Parsons LM, Salfinger M. False-positive results for Mycobacterium celatum with the AccuProbe Mycobacterium tuberculosis complex assay. J Clin Microbiol 2000; 38: 2743-5.
223. Steibuch G., Andran R. The isolation of IgG from imanalion serra with the acid of caprilic // Arch. Of Biochem. Stray and Biophys. 1969. - V.139. - P. 279284.
224. Sting R., Ortmann G. Erfahrungen mit einfachen ELISA-Testsystemes fur die Brucellose Serologie bei Rind, Schaf und Ziege //Berlin. Und munch. Wo-chenschr.- 2000. - Vol. 113.- N 1. - P. 22-28.
225. Stortz H. (Шторц X.) Иммунофлуоресценция //Иммунологические методы. -М.: Медицина, 1987. С. 128-148.
226. Sudre Р, Ten Dam HG, Kochi А. Tuberculosis: а global overviev of the situation today. Bull WHO 1992; 70: 149-59.
227. Sunamoto J. Funtionalized liposomes as biocompatible materials // Abstr. Pap: 194 th ACS Nat. Meet. (Amer. Chem. Soc.), New Orleans, La, Aug. 30. Sept. 4, 1987.-Washington, D.C, 1987.-P.301.
228. Tan W, Xia N, Cong Y. // Zhonghun Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Zazhi. -1998.-Vol.12, №2.-P.176-178
229. Tanaka Т., Matsunaga Т. Detection of HbA (Ic) by boronate affinity immunoassay using bacterial magnetic particles // Biosens Bioelectron.- 2001. — P. 1089.
230. Taylor D. The thermal expansion behaviour of the framework silicates // Mineral.Mag. 1972. - V.38, N297. - P.593-604.
231. Tcherneva E., Rijpens N., Jersek B. et al. Differentiation of Brucella species by random amplified polymorphic DNA analysis //J.- Appl. Microbiol. - 2000. — Vol. 88 (l).-P. 69-80.
232. Thibert L, Lapierre S. Routine application of high-performance liquid chromatography for identification of mycobacteria. J Clin Microbiol 1993; 31: 175963.
233. Turkova J. Leakage of the coupled affinant // J. Chromatogr. 1978. - V. 12. -P.189.
234. Van Weemen B.K., Schuurs A.N.W.M. immunoassays using hapten- enzyme conjugates // FEBS Lett.-1972.-Vol 24,N1.-P. 77-81.
235. Weetall H.H., Detor C.C. Covalent attachmend of proteins to inorganik supports directional activation cyanogen bromide // J. Biotechnol. and Biogen. -1975. V.17.-P.295-297.
236. Weimer B.C., Walsh M.K., Beer C. et al. // Appl. And Environ. Microbiol. -2001. -№3.-P. 1300-1307.
237. Weller T.H., Coons A.H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. 1954. - V.86. -P.789-794.
238. Weston P.D., Devries G.A., Wriggleworth R. Conjugation of enzyme to immunoglobulins using dimallimids //J. Bioch. Biophys. Acta. 1980. - V. 612. -P.40-49.
239. WHO Fact Sheet / Tuberculogia // № 104.- April, 2000.
240. WHO Geneva/ IUATL Paris. Guidelines for Surveilance of Drug Resistance in Tuberculosis // Int/ J. Tuberc. Lung Dis.- 1998.- Vol.-2.- P. 72-89.
241. Yu B.S., Choi Y.K., Chung H. Development of immunoassay methods by use of liposomes //Biotechnol. Appl. Biochem. 1987. - V.9, № 3. - P.209-216.
242. Yu H. Comparative studies of magnetic particle-based solid phase fluorogenic and electrochemiluminescent immunoassay // J. Immunol. Methods.- 1998.- V.218 (1-2).- P.1-8.
243. Zerbini E, Cardoso MM, Sequeira MD, Santi MN, Taher H, Larpin D, Latini O, Tonarelli G. Utility of gas chromatography for the identification of mycobacterial species. Medicina (B Aires) 1999; 59: 453-8.
-
Ефременко, Дмитрий Витальевич
-
кандидата медицинских наук
-
Ставрополь, 2005
-
ВАК 03.00.23
- Усовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота
- Разработка принципов ускоренной идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом
- Новые экспериментальные модели для биологической пробы при диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных
- Патоморфология экспериментального туберкулеза у белых крыс
- Совершенствование диагностики, профилактики и мер ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота в зоне длительного неблагополучия
