Оптимизация комплекса видовой идентификации микобактерий

Касьянова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Оптимизация комплекса видовой идентификации микобактерий
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация комплекса видовой идентификации микобактерий"

894682941 На правах рукописи

Ж—

Касьянова Екатерина Александровна

Оптимизация комплекса видовой идентификации микобактерий

06.02.02- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

- 3 ИЮН 2010

Москва 2010

004602941

Работа выполнена в лаборатории микобактериозов ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор,

заслуженный деятель науки Российской Федерации Овдиенко Николай Павлович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Ленченко Екатерина Михайловна (МГУПБ) доктор ветеринарных наук Скляров Олег Дмитриевич (ВГНКИ)

Ведущая организация - ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Защита диссертации состоится «о/ » 2010г. в /¿"-¿2?часов

на заседании диссертационного совета Д 212.149.03 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук при ГОУ ВПО «Московский Государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, г.Москва, ул. Талалихина, д.ЗЗ, телефон/факс (495) 677-07-78, а также на официальном сайте http://www.msaab.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ Автореферат разослан 2010г.

Ученый секретарь М. Нитяга

диссертационного совета, кандидат биологических наук

1. Общая характеристика работы.

1.1. Актуальность темы. Микобактериапьные инфекции являются одним из наиболее сложных проблем инфекционной патологии человека и животных. Весьма напряженная эпидемическая обстановка по туберкулезу.

В эпизоотологии микобактериальных инфекций проблема видового состава микобактерий и их региональных особенностей имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение, так как создает основу для дифференцированного проведения профилактических и оздоровительных мероприятий. Определение видовой принадлежности выделенных культур микобактерий из организма животных и среды их обитания, позволяет определить ареал их распространения, источники инфицирования и патогенное воздействие на различные виды животных и человека.

Актуальность идентификации микобактерий диктуется необходимостью получения новых данных о возбудителях туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий, циркулирующих среди животных в современных условиях ведения животноводства. В большинстве ветеринарных лабораторий идентификация микобактерий осуществляется определением возбудителей туберкулеза и дифференциации нетуберкулезных микобактерий по группам Раньона (скотохромогенные, фотохромогенные, нефотохромогенные и быстрорастущие микобактерии).

Существующие в настоящее время методы идентификации микобактерий (культуральный, биохимический и биологический) являются трудоемкими, длительными, требуют дорогостоящих материалов. Продолжается поиск новых способов идентификации микобактерий.

микобактерий, восстановление нитритов, а также ниациновый, амидазный тесты, реакция с нейтральным красным, метиленовой синью, тесты на липазу, фосфатазу, редуктазу и др., но основным методом как дифференциации, так и определения видов возбудителей туберкулеза является биологическое исследование на морских свинках, кроликах, курах и других видах животных.

По мнению Л.М. Пинчук и соавт. (1990), одним из надежных методов идентификации вида микобактерий является метод газожидкостной хроматографии.

В последнее время проводятся активные исследования по применению ПЦР для диагностики туберкулеза и идентификации микобактерий. Ряд авторов высоко оценивают перспективы применения этого метода (А.Н. Шаров и соавт., 1998; 2000). Другие авторы (Е.М. Скрягина с соавт., 2001) считают, что метод ПЦР обнаруживает ДНК микобактерий, уже не способных к росту на питательных средах и дают ложноположительные результаты, вследствие возможной контаминации. Авторы считают, что интерпретировать положительный результат ПЦР следует в комплексе с результатами микробиологических тестов.

Необходимость оптимизации комплекса методов идентификации видов микобактерий представляется своевременной и актуальной и послужила основанием для выполнения настоящей работы.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение культурально-морфологических, биохимических и других свойств для оптимизации комплекса методов идентификации видов микобактерий.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить культуры микобактерий из проб биоматериала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота и из объектов внешней среды;

- изучить культурально-морфологические и биохимические свойства выделенных культур микобактерий;

- провести исследования по определению внутривидовых различий М. bovis с помощью молекулярно-генетических методов;

- испытать метод газожидкостной хроматографии для идентификации выделенных культур микобактерий;

установить возможность идентификации некоторых видов микобактерий с помощью ПЦР;

- оптимизировать схему идентификации основных видов микобактерий с применением культурально-морфологических, биохимических и молекулярно-генетических методов.

1.3. Научная новизна. Определен видовой состав микобактерий, выделяемых от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота и объектов внешней среды. Изучены и охарактеризованы культурально-морфологические, биохимические и биологические свойства возбудителей туберкулеза и основных видов нетуберкулезных микобактерий, выделяемых из биоматериала животных и объектов внешней среды. Впервые показаны внутривидовые различия культур М. bovis с применением YNTR- типирования с использованием 6 локусов: ETR-A, ETR-C, V2, V3, V6 и VII молекулярно-генетических методов. Показана целесообразность применения газожидкостной хроматографии для идентификации микобактерий. Оптимизирован комплекс методов идентификации наиболее часто встречающихся видов микобактерий.

эпизоотологическом обследовании хозяйств по туберкулезу. Оптимизированный комплекс методов идентификации основных видов микобактерий повышает качество бактериологических исследований и может быть использован в бактериологических и научных лабораториях.

Результаты исследований включены в «Методические рекомендации по диагностике микобактериальных инфекций животных», утвержденных директором ГНУ ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным 16 марта 2010г., в методические рекомендации «Система медико-ветеринарных мероприятий в сельских очагах туберкулеза», утвержденных директором ГНУ ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным, директором ВНИИТИБП, академиком Россельхозакадемии А.Я. Самуйленко и директором ФГУ «Центр ветеринарии» J1.K. Киш в июле 2009г. и «Методические рекомендации по идентификации М.avium subsp. paratuberculosis и других микобактерий комплекса avium-intracellulare», утвержденных директором ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным 16 марта 2010г. Методические рекомендации представлены в отделение ветеринарной медицины для утверждения.

1.5 Личный вклад соискателя заключается в бактериологическом исследовании проб биоматериала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота и проб из объектов внешней среды, изучении культурально-морфологических, биологических, молекулярно-генетических свойств микобактерий, анализе и обобщении результатов исследований, разработке оптимизированного комплекса методов идентификации наиболее часто встречающихся видов микобактерий.

1.6 Апробация работы. Материалы работы доложены на Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р. Коваленко (г. Москва, 2006г.), на заседаниях ученого совета ВИЭВ (2007,2008гг.), на 15 Международном ветеринарном конгрессе (г.Москва, 2009). Основные положения, выводы и практические предложения,

изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2010г.).

1.7 Основные положения, выносимые на защиту. Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие положения:

- результаты изучения культурально-морфологических и биохимических свойств различных видов микобактерий;

- внутривидовые различия М. bovis;

- результаты применения газовой хроматографии для идентификации микобактерий;

- результаты идентификации микобактерий в ПЦР;

- оптимизированный комплекс методов идентификации наиболее часто выделяемых видов микобактерий.

1.8 Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных статей, в.ч. одна в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.

1.9 Стру|сгура и объем диссертации. Диссертация изложена на 216 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 343 источника, в том числе 120 иностранных авторов.

1.10 Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам лаборатории микобактериозов и сектора патоморфологии ВИЭВ (проф. А.Х. Найманову, кандидатам ветеринарных наук Н.Г. Толстенко, О.В, Якушевой, B.C. Суворову, М.С. Калмыковой, Э.Л. Колосковой) и директору ВИЭВ, академику РАСХН М.И. Гулюкину, сотрудникам лаборатории инфекционных и инвазионных болезней сельскохозяйственных животных ГНУ «Научно-исследовательский институт Нечерноземной зоны РФ» профессору

А.Л. Лазовской, доктору биологических наук З.Г. Воробьевой, доктору ветеринарных наук К.Н. Слининой и директору НИВИ НЗ РФ, члену -корреспонденту РАСХН П.Н. Сисягину, кандидату биологических наук М.В. Макаровой и директору Московского городского научно-практического Центра борьбы с туберкулезом Комитета здравоохранения г. Москвы, академику РАМН В.И. Литвинову за содействие и участие в выполнении некоторых фрагментов диссертации.

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы исследования. Работа выполнена в 2005-2009 гг. в лаборатории микобактериозов Всероссийского научно -исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко и на опытной базе о. Лисий Вышневолоцкого отдела ВИЭВ в соответствии с заданием 02.01.01. Российской научно - технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований.

Для выделения культур микобактерий исследовали биоматериал от 75 животных и 83 пробы объектов внешней среды.

При культуральном исследовании биоматериал от животных обрабатывали по методу А.П. Аликаевой (1963), пробы из объектов внешней среды - по методу А.П. Аликаевой (1979) и засевали на среды Левенштейна -Йенсена и ФАСТ-ЗЛ. Взвесью биоматериала, использованного для посевов на питательные среды, заражали по 2 морские свинки подкожно в область паха в дозе по 1 см3 и по 2 головы белых мышей подкожно в дозе 0,5 см3.

Культуральные свойства и скорость роста субкультур микобактерий изучали на среде Левенштейна - Йенсена при 25 °С, 37 °С, 45 °С и 52 С, а также на мясо-пептонном агаре (МПА) и мясопептонном бульоне (МПБ) при 37 °С, после проверки их на чистоту бактериоскопией.

Культурально-морфологические и биохимические свойства микобактерий изучали в соответствии с методическими рекомендациями

«Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий»; с приказом Минздрава СССР от 08.06.78г. №558 «Об унификации микробиологических методов исследований при туберкулезе» и приказом Минздрава РФ от 21 марта 2003г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». В работе также использованы методические рекомендации «Новые методы исследования возбудителей антропозоонозов. Туберкулез». (Москва, 2003).

Идентификацию выделенных культур проводили соответственно ГОСТ 26072-84 «Методы лабораторной диагностики туберкулеза» и ГОСТ 27318-87 «Методы идентификации атипичных микобактерий».

Газожидкостную хроматографию и рестрикционный анализ культур микобактерий, индивидуальную характеристику штаммов M.bovis и ферментативные свойства микобактерий с помощью систем бумажных индикаторов (СИБ), проводили в лаборатории по изучению туберкулеза НИВИ НЗ РФ совместно с доктором медицинских наук A.JI. Лазовской, доктором биологических наук З.Г. Воробьевой и доктором ветеринарных наук К.Н. Слининой согласно методическим рекомендациям «Использование состава клеточных жирных кислот для идентификации микобактерий» (г.Горький, 1991) и «Методическим рекомендациям по стандартизации методов идентификации бактерий с применением систем индикаторных бумажных» (г.Горький, 1991).

ПЦР - исследования проводили согласно методических рекомендаций «Определение вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacterium tuberculosis - методом рестрикционного анализа» (М., 2007). При этом использовали тест-систему «Туб-Диф», разработанную в Институте молекулярной генетики РАН (И.Н. Корнева и соавт., 2002) и «MAIS-Диф», разработанную в МНПЦБТ (г.Москва).

Для определения вида возбудителя туберкулеза использовали биологическое исследование на морских свинках, кроликах и курах.

Для опыта брали кроликов средней массой тела 1500-1600 г, которых заражали внутривенно в краевую вену уха, морских свинок - массой 200 - 300 г и заражали подкожно в области паха, кур - в возрасте 5 мес и массой 12001800г. заражали внутривенно в подкрыльцовую вену в дозе по 1 мг в 1 см3.

Морских свинок, кроликов и кур перед заражением исследовали ППД-туберкулином для млекопитающих и комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (KAM).

Опытных животных содержали в течение 3 месяцев в соответствии с «Ветеринарно-санитарными правилами содержания опытных (лабораторных) животных в вивариях научно-исследовательских институтов, станций, лабораторий, учебных заведений, а также в питомниках», утвержденных Главным управлением ветеринарии МСХ СССР в 1964 году.

Если в течение 3 месяцев животные не погибали, то проводили эвтаназию морских свинок и кур путем декапитации с помощью гильотины, кроликов путем воздушной эмболии, согласно «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (г. Москва, 1978г). Павших и убитых животных после истечения срока опытов подвергали патологоанатомическому вскрытию. От всех экспериментальных животных биоматериал исследовали бактериологически и гистологически. Бактериологическое исследование, включая биопробу на лабораторных животных, проводили совместно с кандидатом ветеринарных наук Н.Г Толстенко и аспиранткой Е.Э. Соколовой, гистологическое - с кандидатом ветеринарных наук О.В Якушевой.

2.2 Результаты исследований.

2.2.1 Выделение микобактерий из биоматериала от животных и из проб объектов внешней среды в хозяйствах с различным эпизоотическим статусом.

Нами проведено бактериологическое исследование биоматериала от 84 голов крупного рогатого скота, реагировавшего на туберкулин для млекопитающих, 12 коз, экспериментально зараженных М. bovís (3 гол.), М. tuberculosis (6 гол.) и М. avium (3 гол.), 6 кур, убитых с диагностической целью, одного гуся и одного тетерева, принадлежащего Московскому зоопарку, 7 проб торфа и 4 пробы древесных опилок.

В результате культуральных исследований выделили 65 культур кислотоустойчивых микобактерий (61,3%). Культуры микобактерий выделены из биоматериала 17 животных с патологическими изменениями (100%), из биоматериала без видимых изменений - от 37 голов (47,4%). Из 7 проб торфа выделено 8 и из 4 проб древесных опилок - 4 культуры микобактерий.

Одновременно взвесью биоматериала заражали по 2 морских свинок и по 2 белых мыши подкожно в область паха. Всего использовали 128 морских свинок и 128 белых мышей. Животных содержали в течение 3-х мес.

В течение содержания животных в опыте пало 12 морских свинок, зараженных биоматериалом от крупного рогатого скота с туберкулезными поражениями лимфатических узлов. При осмотре у всех животных установлен генерализованный туберкулез.

Оставшиеся морские свинки (116 голов) и мыши были убиты через 3 мес. после заражения. Ни в одном случае у морских свинок не обнаружено патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза. У мышей, зараженных биоматериалом от крупного рогатого скота с туберкулезными изменениями, в печени имелись единичные полупрозрачные очажки сероватого цвета. В остальных случаях макроскопических специфических туберкулезных поражений внутренних органах не отмечали.

От всех морских свинок и мышей провели посев биоматериала на среду ФАСТ-ЗЛ. Из биоматериала морских свинок выделили 17 (29,3%), а из биоматериала мышей - 23 (39,6%)культуры микобактерий.

Выявлено разнообразие характера роста культур микобактерий.

От животных с туберкулезными поражениями из неблагополучных по туберкулезу хозяйств и морских свинок, зараженных биоматериалом от этих животных, культуры характеризовались ростом мелких сероватых колоний на 28-33 день.

Из хозяйств, в которых животные инфицированы возбудителем туберкулеза птичьего вида, выделяли культуры, вырастающие вначале возле конденсационной жидкости в виде отдельных влажных серо-белого цвета глыбок, со временем превращающихся в сплошной налет и постепенным образованием изолированных круглой формы, влажных колоний по всей поверхности среды. Культуры легко снимались петлей с поверхности среды и хорошо эмульгировались в изотоническом растворе хлористого натрия.

Из хозяйств, где сенсибилизация животных обусловлена нетуберкулезными микобактериями, выделили 18 культур, которые вырастали на 5-10 день в виде отдельных слизистых колоний оранжевого или бледно-желтого цвета, в 8-форме.

В результате исследований биоматериала от коз, экспериментально зараженных возбудителями туберкулеза (опыт В.И.Строгонова), во всех случаях выделили культуры микобактерий. Культуры из биоматериала от коз, зараженных М.Ытв, росли скудно в виде мелких, гладких с ровными краями колониями цвета слоновой кости, Я-форма. Культуры из биоматериала от коз, зараженных М.шЬегсик^й, росли в Я- форме, а из биоматериала от коз, зараженных М.аушт, - в виде круглых, мелких, с ровными краями, не пигментированных колоний.

Выделенные культуры из биоматериала от животных без патологических изменений и из объектов внешней среды, обладали быстрым

ростом в течение 11-22 дней. Рост на питательных средах обильный- от скопления круглых мелких колоний до сплошного налета. Встречались как сухие, крошковатые, слабо эмульгируемые в физиологическом растворе, так и вязкие, слизистые с блестящей поверхностью колонии, легко эмульгируемые в растворах.

2.2.2. Результаты исследований культурально-морфологических свойств выделенных микобактерий.

Для сравнительного исследования культурально-морфологических свойств нами использованы 13 эталонных штаммов микобактерий, полученных из музеев культур ВИЭВ и ЦНИИТ (M.bovis, M.tuberculosis, М.avium, М. kansasii, М. smegmatis, М. phlei, М. marinum М. scrofulaceum, М. intracellulare, М. fortuitum), а также выделенные культуры из биоматериала животных и объектов внешней среды.

При изучении тинкториальных свойств в окраске по Цилю-Нильсену 67 штаммов и культур было выявлено, что все они являются кислотоустойчивыми и окрашиваются в красный цвет различных оттенков. У большинства нетуберкулезных культур, наряду с кислотоустойчивыми, наблюдали кислотоподатливые формы и неравномерность окраски. Наряду с палочками ярко красного цвета в одном поле зрения находили бледно розовые или голубоватые клетки.

В морфологическом плане M.tuberculosis и M.bovis представляли собой классические формы. Они характеризовались палочками различной длины и толщины, с выраженной зернистостью у M.tuberculosis.

М.avium в мазках из лимфатических узлов коров и птиц имели вид тонких палочек, как правило, фрагментированных. В мазках из субкультур преобладали мелкие интенсивно красного цвета палочки.

Культуры нетуберкулезных микобактерий отличались большим разнообразием форм, но типичным было наличие грубоватых коротких толстых

или очень мелких веретенообразной формы палочек, а также кокковидных форм.

При культивировании штаммов и культур на яичных питательных средах Левенштейна-Йенсена, ФАСТ-ЗЛ, мясопептонном бульоне и мясопептонном агаре выявили отличия в характере и скорости роста.

Культуры М.шЬегси1о518 при выделении росли медленно на яичных средах при 37 °С. Рост наблюдали через 25-32 дня в виде сухих крошковатых колоний (Я-форма), с трудом суспендируемых в физиологическом растворе. В последующих генерациях лабораторных культур рост был более быстрым и наблюдался в течении 2-3 недель.

Культуры М.ЫтБ на яичных средах (ФАСТ-ЗЛ, Левенштейна-Йенсена) через 28-35 дней росли скудно в виде мелких, гладких с ровными краями колоний, цвета слоновой кости (Б-форма). При пересевах рост ускорялся до 1421 дня.

Микобактерии птичьего вида на яичных средах вырастали первоначально из биоматериала через 9-14 дней, в субкультурах - через 7-10 дней, образуя мягкие, влажные, блестящие колонии (8-форма), серовато-белого или желтовато-белого цвета. Часто отдельные колонии сливались вместе, образуя сплошной влажный налет по всей поверхности среды.

Нетуберкулезные микобактерии (референтные штаммы) на среде Левенштейна-Йенсена при 37 °С росли в течении 7-10 дней.

М.Ьоу15 и М.шЬегси1о518 не росли на мясопептонном бульоне и мясопептонном агаре, а также при 18-22 °С и 45 °С.

У микобактерий туберкулеза птиц на мясопептонном бульоне рост был в пределах 10-30 дней. При этом бульон оставался прозрачным, на дне образовывался плотный осадок, дававший равномерное помутнение при встряхивании. На мясопептонном агаре рост выражен слабо и отмечался не у всех штаммов.

Приведенные результаты подтверждают возможность дифференциации M.bovis и М. tuberculosis от М. avium и нетуберкулезных микобактерий по культурапьно-морфологическим свойствам микобактерий.

Изучение пигментообразования 64 культур микобактерий показало, что 8 культур образуют пигмент от светло-желтого до оранжевого цвета, из них 3 культуры образовывали пигмент и в темноте. 17 культур не образовывали пигмента на свету и в темноте, были серовато-белого или желтовато-белого цвета.

Исследование культурально-морфологических свойств

кислотоустойчивых микобактерий позволило обособить группу микобактерий туберкулеза млекопитающих (10 культур) от других представителей рода Mycobacterium.

Остальные культуры были распределены по 4 группам Раньона:

К 1-й группе отнесли три медленно растущие в S-форме культуры, образующие пигмент под воздействием света и отсутствием роста при 45 °С.

Ко 2-й группе отнесли 5 медленно растущих в S-форме культур микобактерий, образующих пигмент на свету и в темноте. Рост при температуре 45 °С у микобактерий этой группы отсутствовал.

К 3-й группе отнесли 34 медленно растущих беспигментных культур, из которых 29 культур росли в S-форме и 5 - в R-форме.

К 4-й группе быстрорастущих микобактерий отнесли 12 культур, независимо от образования пигмента и формы роста, которые вырастали на среде Левенштейна-Йенсена при 25°С. Микобактерии росли в виде пристеночного кольца или пленки на поверхности МПБ в течение 3 дней.

2.2.3. Результаты изучения биологической активности группы микобактерий туберкулеза млекопитающих

Для изучения биологической активности и определения вида возбудителя туберкулеза культур, использовали 12 морских свинок, которых заражали подкожным методом в область паха и 12 кроликов, зараженных внутривенно в краевую вену уха в дозе по 1 мг в мл.

Таблица 1 - Результаты биологической активности культур микобактерий туберкулеза млекопитающих на морских свинках и кроликах

№ п/л Шифр хозяйств и номер животного Шифр и характер роста культуры на среде Левенштейна-Йенсена Патологические изменения у морских свинок Патологические изменения у кроликов Вид возбудителя туберкулеза

1 "Вп", 130 КРС 130, мелкие гладкие, цвета слоновой кости колонии генерализованный туберкулез генерализованный туберкулез М. bovis

2 "Л", 38 КРС 38, мелкие гладкие, цвета слоновой кости колонии генерализованный туберкулез генерализованный туберкулез М. bovis

3 "П", 42 КРС 42, мелкие гладкие, цвета слоновой кости колонии генерализованный туберкулез генерализованный туберкулез М. bovis

4 "Куч", 399 КРС 39, мелкие гладкие, цвета слоновой кости колонии генерализованный туберкулез генерализованный туберкулез М. bovis

5 "К", 57 КРС мелкие гладкие, цвета слоновой кости колонии генерализованный туберкулез генерализованный туберкулез М. bovis

6 "С", б/н КРС 40, мелкие гладкие, цвета слоновой кости колонии генерализованный туберкулез генерализованный туберкулез М. bovis

7 "В", б/н свинья 63, мелкие гладкие, цвета слоновой кости колонии генерализованный туберкулез генерализованный туберкулез М. bovis

Также изучили культуру, выделенную от свиньи (использовали 2 морские свинки и 2-х кроликов). По результатам исследований все 7 исследуемых культур отнесены к возбудителю туберкулеза бычьего вида ( М.

bovis) на основании генерализованного туберкулеза бычьего вида у морских свинок и кроликов.

2.2.4. Изучение индивидуальных характеристик штаммов микобактерий туберкулеза бычьего вида с помощью молекулярно-генетических методов и систем бумажных индикаторов (СИБ)

Для исследования были взяты 5 референс-штаммов и 8 штаммов микобактерий туберкулеза, выделенные от крупного рогатого скота в хозяйствах Московской, Пензенской и Рязанской областей, и идентифицированные по биологической пробе кандидатом ветеринарных наук Н.Г. Толстенко и научным сотрудником И.В. Солодовой. Один штамм M.tuberculosis выделен от больного туберкулезом человека.

Результаты VNTR - типирования показали, что из использованных в исследовании 10 локусов, достаточными для характеристики штаммов, является набор из 6 локусов: ETR-A, ETR-C, V2, V3, V6 и VII, поскольку они содержат наиболее отличающееся число повторов. Индекс дискриминации данного набора локусов при этом составляет 0,98. Из построенной дендрограммы видна степень родства штаммов, которая показывает, что штамм М. bovis 45 из хозяйства №1 Московской области значительно отличается от штаммов 44 и 46 из хозяйства №2, расположенного рядом с хозяйством №1. В то же время штаммы 44 и 46 отличаются от штаммов 47, 48, 49, 50 того же хозяйства. По результатам типирования по 10 VNTR локусам все штаммы образовывали группы. Так группировались штаммы 44 и 46, образовывали группу штаммы 47, 48, 49 и 50. Можно было предполагать два источника заражения крупного рогатого скота в этом хозяйстве. Особняком стоит штамм 45 из хозяйства №1. Отличается от московских штаммов штамм из хозяйства Рязанской области.

Значительным сходством обладают штаммы Ravenal, Vallee, 354. От всех штаммов бычьего вида отличается штамм BCG. Кардинальное отличие от

бычьих видов и между собой наблюдается у двух штаммов М. tuberculosis: референс-штамм Academia и штамм от больного туберкулезом из Нижнего Новгорода.

Для изучения ферментативных свойств штаммов микобактерий с помощью систем индикаторных бумажных (СИБ) были взяты 14 штаммов микобактерий (M.bovis-5, M.avium-intracellulare-7, M.xenopi и M.fortuitum).

В результате исследований показано, что из 18 систем бумажных индикаторов сработали только 9 (сорбит, инозин, манноза, глюкоза, В-галактоза, оксидаза, фенилаланин, аргинин, наличие лизина). M.bovis, M.avium-intracellulare, M.xenopi и M.fortuitum сходны по оксидазной активности. Отдельно взятые остальные показатели вариабельны, но расширяют характеристику штаммов микобактерий.

Результаты VNTR-типирования подтверждаются эпизоотологическими данными, совпадая с географическим распределением изолятов. Набор из 6 VNTR-локусов может с успехом использоваться для эпизоотологических исследований изолятов М. bovis.

2.2.5. Выделение и идентификация М. avium

Нами исследован биоматериал от крупного рогатого скота из хозяйств, в которых животные инфицированы возбудителем туберкулеза птичьего вида.

От каждого животного биоматериал высевали на среду Левенштейна-Йенсена. Посевы проводили раздельно обработанным по методу А.П. Аликаевой материалом из заглоточных и подчелюстных, бронхиальных и средостенных, предлопаточных, брыжеечных, портальных лимфоузлов и лимфоузлов илеоцекального соединения. Одновременно суспензией биоматериала, использованной для посева на питательные среды, заразили подкожно по 2 морские свинки и по 2 мыши. Всего использовано 40 морских свинок и 40 белых мышей.

Результаты исследований показали, что в хозяйстве №1 из 13 исследованных проб биоматериала в 7 случаях (53,8%) выделены культуры микобактерий. Культуры микобактерий чаще выделяли из брыжеечных лимфатических узлов. В одном случае (№ 920) культуры микобактерий выделены из заглоточных, подчелюстных, брыжеечных, портальных и предлопаточных лимфатических узлов, в одном случае (№ 2387) - из предлопаточных, в одном -чиз заглоточных, подчелюстных, брыжеечных и портальных, в двух случаях (№ 2298, 2047) - из брыжеечных и портальных, в одном случае (№, 2057) - из бронхиальных, средостенных и предлопаточных и в одном случае (№ 2147) - из заглоточных, подчелюстных, бронхиальных и средостенных лимфатических узлов. Всего из бронхиальных и средостенных лимфоузлов выделено 2 культуры, из заглоточных, подчелюстных и предлопаточных - 3 культуры и из брыжеечных и портальных - 4 культуры микобактерий.

В хозяйстве №2 культуры микобактерий выделены в двух случаях из лимфоузлов илеоцекального соединения, в хозяйстве №3 - из брыжеечных лимфоузлов (в одном случае) и из лимфоузлов илеоцекального соединения, в хозяйстве №4 -из брыжеечных лимфоузлов в одном из трех случаев.

Из биоматериала морских свинок выделили культуры микобактерий в 8 из 20 случаев (40%), а из биоматериала мышей - в 12 из 20 случаев (60%).

Выделенные культуры вырастали на 22-51 день в виде налета серо-белого цвета возле конденсационной жидкости. В дальнейшем постепенно образовывались по всей поверхности среды изолированные, выпуклые, круглые, блестящие влажные колонии. Культуры легко снимались с поверхности среды и хорошо эмульгировались в изотоническом растворе поваренной соли. Обильно росли при температуре 45 °С, скудно и с большей задержкой - при 22 °С.

С каждой выделенной культурой была поставлена биопроба на 2-х морских свинках, 2-х кроликах и 2-х курах. Культура в дозе по 1 см3 бакмассы в мл вводилась курам и кроликам внутривенно, морским свинкам - подкожно.

В течение месяца большинство кроликов и кур пали от туберкулеза. У морских свинок, убитых через 3 месяца, патологических изменений не обнаружено.

По результатам биологического исследования определены микобактерии туберкулеза птичьего вида.

2.2.6. Результаты исследований биохимических свойств микобактерий

Для биохимических исследований были взяты 23 испытуемых культур и 19 культур референтных штаммов.

Результаты исследований биохимических свойств референтных культур микобактерий изложены в табл. 2, а испытуемых - в таблице 3.

Представленные данные показывают, что референтные штаммы М. bovis и М. tuberculosis не росли на питательной среде Левенштейна-Иенсена с добавлением хлористого и салицилового натрия. У М. bovis отсутствовали никотинамидазная, пиразинамидазная и уреазная активность, в то время как у М. tuberculosis они были положительными. М. avium не росли на среде с 5% хлористым натрием и росли на среде с сапицилатом натрия.

Для М. avium характерны положительная каталазная, никотинамидазная и пиразинамидазная активность, отсутствие роста на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, отрицательная нитратредуктазная активность и термостабильная каталаза. Аналогичные результаты были получены и у М. intracellulare. Одинаковые показания биохимических свойств не позволяют дифференцировать виды М. intracellulare и М. avium.

У М. scrofulacerum имеется положительная каталазная активность и ее термостабильность, способность использовать мочевину, никотинамид и пиразинамид.

Для М. kansasii характерна положительная нитратредуктазная активность, отсутствие роста на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, положительная каталазная активность и ее термостабильность, способность использовать мочевину в процессе жизнедеятельности, отсутствие формамидазной и пиразинамидазной активности.

М. smegmatis росли на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, использовали никотинамид, формамид и мочевину.

Для них характерны наличие каталазной активности и ее термостабильность, положительная нитратредуктазная и отрицательная пиразинамидазная активность.

М. fortuitum используют никотинамидазу, формамид и мочевину, у них выявлена отрицательная пиразинамидазная активность.

М. phlei обладают каталазной активностью и ее термостабильностью, растут на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl и салицилата натрия, восстанавливают телурит калия, расщепляют уреазу, никотинамид и пиразинамид.

У М. vaccae такие же биохимические свойства, как и у М. phlei, только они обладают арилсульфатазной активностью.

М. chelonei растут на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, не обладают каталазной активностью, у них отрицательная уреазная, никотинамидазная и пиразинамидазная активность.

М. triviale восстанавливают нитраты, растут на среде Левенштейна-Йенсена с 5% NaCl и салицилатом натрия, не расщепляют уреазу, никотинамид и пиразинамид.

Таблица 2. - Результаты биохимического исследования референтных штаммов микобактерий

№ п/п Свойства микобактерий Виды микобактерий

Bovis tube геи 1 esis avium phlei vacc ае chel onei fortu ¡turn sine gma tis trivi ale flave seen s kans asii intra cellu lare xen opi scrofu laceu m terra e gord ona e

Пигментация колоний - . С Ф/С - - - - С Ф - С С - С

Форма колоний R R S S S S s s s s S s s s S s

Рост при 25С - - - + + + + + + + + + - + - - + + +

37С + + + + + + + + + + + + + + + +

45С - + - - - - + - + - - + - + - - -

1 Каталазная активность - - + + - + + - + + - - + - -

68С - - + - + + - + + - + - + + + - -

2 Востановление нитратов - + - - - - - - + - + - - - + - -

3 Рост с 5%NaCI - - - + + + + + + + - - - - + -

4 Рост на среде с салицилатом нартия + + + + + + + + + + + + + +

5 Арилсульфатазная активность: 3-дней + + + + + +

14-дней - + - + + + - - - - + - -

6 Гидролиз Твин-80; 5-дней _ + - _ _ + + + + +

10- дней - - - + - - - - - - - - - - - -

7 Востановление телурита калия + + + + + + + + +

8 Уреаза - + - + + - + + - + + - - + - -

9 Никотанамидаза - + + + + - + - + - + + - - - + -

10 Пиразинамидаза - + + + + - + - + - - + + + + - -

14 Скорость роста М М м в Б Б Б Б M M M M M M M M

15 Рост на МПА - - - + + + + + - - - - - - -

16 Рост на МПБ - - + - + + + + - - + - + - - - -

Обозначения: М- медленнорастущие, Б- быстрорастущие,"+" -положительная реакция;"+-" - не все штаммы

ферментируют данный амид,"-" -отрицательная реакция

Таблица 3 - Результаты бактериологических и биохимических исследований изучаемых культур микобактерий.

Свойства культур Номера испытуемых культур

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Пигментация Б Б Б Б Б Б Б Б Б Б Б Б С Б Б Б Б Б Б Б С Б Б

форма колоний R R R R R S S S R S S S S R R R S S S S R S S

Рост при: 25С - - - - - - - + - - - + - - + + + +

37С + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

45С - - + + - + - + - + - + - + - - + + - + +

Каталаза + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

68С + + - + - - - - + - -

Рост с 5% ЫаСЬ - - - - - - + - + - - - - - + - + - + - - - - + +

Рост на среде с салицилатом N8 • - - - - - - + - + - - + - ■ - + + - + + - - + - + - - + - - +

Арилсульфатазная активность: 3 дня - - - - - - - - - - - - - + - + - - - - - - -

14 дней + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + + + + +

Гидрозолиз Твин-80 - - - - - - - - - - - - - + - - + - - - - - - - -

Восстановление нитратов - - - - - - - - - - - - - + - + - - - - - - -

Восстановление телурита калия + + + + + + - - + - + + + + - + +

Уреаза + + + + + + - - + - + - - - - + - + - + + - - - - -

Никатинамидаза + + + + + + + + - + + - + + + + + + +

Пиразинамидаза - - - + - + - + + + + + + + + - + - + + + + + + + +

Соответствие виду М. bovis М. bovis M. bovis М. bovis М. bovis М. bovis МАС МАС МАС МАС МАС МАС M.xenopi M.fortuitum МАС M.fortuitum МАС МАС МАС МАС M.xenopi МАС МАС

Обозначения: Б- беспигментные, С- скотохромогенные, Я- шероховатые колонии, Б- гладкие колонии, «+»-

наличие роста или свойства культуры, «-»- отсутствие роста или свойства культуры, «+ -»- не постоянный признак, МАС-

микобактерии комплекса аушггытгасеПЫаге.

M. flavescens обладают каталазной активностью и ее термостабильностью, растут на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl и салицилата натрия, не обладают арилсульфатазной активностью, используют уреазу, никотинамидазу и пиразинамидазу.

М. xenopi обладают термостабильностью каталазы, не восстанавливают нитраты, не растут на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl и растут на среде с салицилатом натрия, не расщепляют уреазу и никотинамидазу и используют пиразинамидазу.

М. terrae каталазо не активны, растут на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl и салицилата натрия, не обладают арилсульфатазной активностью, в течение 5 дней расщепляют Твин-80, не восстанавливают телурит калия и не расщепляют уреазу, никотинамидазу и пиразинамидазу.

М. gordonae не растут на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, но растут на этой среде с добавлением салицилата натрия, имеют каталазную активность и ее термостабильность, отсутствует формамидазная, никотинамидазная, пиразинамидазная и нитратредуктазная активность.

Таким образом, испытанные референтные штаммы М. avium и нетуберкулезных микобактерий способны использовать никотинамид, формамид и мочевину в процессе метаболизма. Для всех этих штаммов характерны: положительная каталазная и нитратредуктазная активность, а также наличие термостабильной каталазы. Это не позволяет идентифицировать виды нетуберкулезных микобактерий только по биохимическим тестам и требует использование дополнительных исследований.

С учетом бактериологических и биохимических тестов были, в основном, идентифицированы виды микобактерий изучаемых культур. По комплексу этих тестов определены: 6 штаммов М. bovis, 13 штаммов комплекса MAC, 2 штамма М. fortuitum и 1 штамм M.xenopi.

2.2.7. Применение газожидкостной хроматографии для идентификации микобактерий.

Для исследования были взяты 16 культур микобактерий, идентифицированных по ключевым тестам (M.bovis-7, M.avium-intracellulare-12, M.xenopi-1 и M.fortuitum-1).

Результаты исследований показали противоречивость данных. В двух случаях (культура 233 и 138) результаты определения культур по ключевым тестам совпали с данными газожидкостной громатографии, в двух случаях (культуры 176 и 5) результаты исследований не совпали. По ключевым тестам культуры были определены как М. bovis, а при газожидкостной хроматографии - M.avium. В одном случае (культура 6) ключевые тесты свидетельствовали об М.bovis, а по газожидкостной хроматографии - M.intracellulare. В одном случае (культура 18) по ключевым тестам культура определена как М. avium-intracellulare, а по газожидкостной хроматографии - больше подозрений на М.bovis. В остальных случаях вместо видов, по результатам газожидкостной хроматографии культуры определены только как микобактерии.

Таким образом, метод газожидкостной хроматографии позволяет отделить микобактерии от других кислотоустойчивых микроорганизмов и в комплексе с другими тестами-идентифицировать отдельные виды микобактерий.

2.2.8. Результаты исследований культур микобактерий методом полимеразной цепной реакии

Нами, совместно с ведущим научным сотрудником Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения гор. Москвы, кандидатом биологических наук М.В. Макаровой, было исследовано 25 культур микобактерий, выделенных из различных источников. Исследования проводили согласно методических рекомендаций «Определения вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacretium tuberculosis методом рестрикционного анализа" (М.,2007).

Сравнение результатов ПЦР с испытуемыми культурами микобактерий с данными газожидкостной хроматографии, культурально-морфологических, биохимических и биологических исследований показало соответствие показаний газожидкостной хроматографии, биохимических и биологических исследований в четырех случаях по определению M.bovis.B двух случаях показания ПЦР свидетельствовали о принадлежности культуры к туберкулезному комплексу.

В одном случае (культура С-138) газовой хроматографией, биохимическими и биологическими исследованиями определены M.bovis, а ПЦР - микобактерии комплекса авиум-интрацеллюляре. Противоречивы показания исследований других культур микобактерий. В большинстве случаев показания биохимических исследований определяли принадлежность культур к комплексу авиум-интрацеллюляре, а показания ПЦР свидетельствовали о принадлежности к M.avium. В отдельных случаях по биохимическим показаниям культура была определена как M.fortuitum (культура М-Э5), а газовой хроматографией и ПЦР-исследования как M.avium. Также противоречия касались культуры (г-Э8). По биохимическим показаниям культура определена как M.xenopi, а по ПЦР-М. flavescens. Культура ВВ-1 определена по биохимическим показаниям как М. flavescens, а по ПЦР - как M.avium.

Таким образом, показания ПЦР не всегда совпадают с данными газожидкостной хроматографии и биохимических исследований.

2.2.9. Биологический метод идентификации_M.avium и

М. intracellulare.

Для исследования взяли референтные штаммы M.avium и M.intracellulare, полученные из ЦНИИТ МЗ РФ. Провели эксперимент на 15 морских свинках и 15 кроликах, которых разделили на 5 групп. Морских свинок 1 группы (3 гол) заражали бактериальной массой подкожно и кроликов (3 гол)- внутривенно M.avium в дозе по1 мг в см3. Вторую группу морских свинок (3 гол) заражали подкожно и кроликов (3 гол)-внутривенно M.intracellulare в дозе по1 мг в см3.

Третью группу морских свинок (3 гол.) заражали подкожно и кроликов (3 гол)-внутривенно М.avium в дозе по 0,1см3 в мл. Четвертую группу морских свинок (3 гол) заражали подкожно и кроликов (3 гол) внутривенно M.intracellulare в дозе по 0,1 мг в см3. Пятая группа морских свинок (3 гол) и кроликов (3 гол) была контрольной, животных этой группы не заражали.

Животных содержали в клетках бокса в течение 3-х мес. Перед заражением и через 30, 60 и 90 дней животных исследовали симультанной аллергической пробой ППД-туберкулином для млекопитающих и комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (KAM).

В результате исследований установлено, что M.avium и M.intracellulare не вызывают патологических изменений у морских свинок. M.avium у кроликов вызывает сепсис и падеж через 15-21 день после заражения в дозе 1,0 мг/см3 и 0,1мг/см3, в то время как M.intracellulare не вызывали гибели кроликов в течение 3-х месяцев. При послеубойном осмотре у кроликов не обнаруживали патологических процессов. При гистологическом исследовании биоматериала у двух из трех кроликов, зараженных M.intracellulare в дозе 1 мг/см3, в легких обнаружили пролифераты из эпителиоидных и гигантских клеток, а у зараженных кроликов в дозе 0,1 мг/см3 не выявили патоморфологических изменений.

Таким образом, заражение кроликов культурой в дозе 0,1 мг/см3 позволяет дифференцировать M.avium от M.intracellulare.

2.2.10. Оптимизированный комплекс методов идентификации наиболее часто выделяемых видов микобактерий.

В процессе разработки оптимизированного комплекса методов идентификации микобактерий руководствовались действующими нормативными документами, результатами собственных исследований, данными научных сотрудников и практических ветеринарных специалистов, занимающихся проблемой туберкулеза и микобактериозов.

Род Mycobacterium включает большое количество видов. Объединяющим их свойством является кислотоустойчивость. Однако частичную кислотоустойчивостью обладают и представители родов Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium. Для их дифференциации применяют культурально-морфологические исследования и в неопределенных случаях -газожидкостную хроматографию.

Колонии культур микобактерий растут в виде мелких или крупных, блестящих или матовых, гладких или шероховатых единичных колоний, либо в виде сплошного роста через 2-60 суток после посева при 37°С, сильно кислотоустойчивы.

Слабо кислотоустойчивые микроорганизмы, вырастающие на плотных яичных средах в первые 3-5 дней роста в виде слизистых колоний всех оттенков желтого и коричневого цветов, принадлежат нокардиям, коринебактериям и родококкам.

На хроматограммах нокардий, родококков и коринебактерий не обнаруживаются или определяются в следовых количествах жирные кислоты с числом атомов углерода более 20. На хроматограммах микобактерий выявляются жирные кислоты, содержащие от 12 до 26 углеродных атомов.

На втором этапе проводят дифференциацию возбудителей туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий путем определения скорости роста культур из биоматериала и в субкультуре 1-й адаптивной генерации, выявления пигментообразования и оценки морфологии колоний, росту на яичных питательных средах при разных температурах, росту на среде с 5% содержанием NaCl и с салициловым натрием, росту на МПА и МПБ.

Следующим этапом идентификации является разделение нетуберкулезных микобактерий на группы по Раньону по скорости роста колоний на плотных питательных средах, их способность образовывать пимент на свету и в темноте, росту на простых питательных средах (МПА и МПБ) при разных температурах.

В дальнейшем проводят определение видов микобактерий разных групп по ключевым тестам культурально-морфологических, биохимических, молекулярно-генетических и биологических свойств.

3. Выводы.

1. Выделение из биоматериала крупного рогатого скота и проб объектов внешней среды культур микобактерий с разнообразным характером роста на питательных средах и различными культурально-морфологическими, биохимическими и биологическими свойствами, требует их идентификации для определения эпизоотического статуса поголовья животных.

2. Исследование культурально-морфологических свойств культур микобактерий позволяет обособить группу возбудителей туберкулеза млекопитающих и дифференцировать нетуберкулезные микобактерии по группам Раньона. Из 64 выделенных культур микобактерий в 15,6% случаев определены М. bovis (10 культур). Остальные 54 культуры нетуберкулезных микобактерий отнесены к первой (3 культуры), второй (5 культур), третьей (34 культуры) и четвертой (12 культур) групп классификации Раньона.

3. Использование в биологическом исследовании беспородных белых мышей увеличивает на 10,3-20% выделение культур микобактерий из биоматериала реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота.

4. Для индивидуальной характеристики культур М. bovis следует изучать ферментативные свойства микобактерий с помощью систем индикаторных бумажных (СИБ) и использовать метод VNTR- типирования с набором из 6 локусов: ETR-A, ETR-C, V2, V3, V6 и VII, которые содержат наиболее отличающееся число повторов.

5. Заражение кроликов изучаемой культурой в дозах по 1 см3 и по 0,1 см3 бактериальной массы в 1 см3 позволяет дифференцировать M.avium и M.intracellulare. M.avium у кроликов в этих дозах вызывает сепсис и гибель

животных, а М. ¡ШгасеПЫаге в дозе 0,1 см3 бакмассы в 1 см3 не вызывает гибели и патологических изменений у них.

6. Оптимизированный комплекс методов идентификации, включающий культурально-морфологические, биохимические и биологические тесты, газожидкостную хроматографию и полимеразную цепную реакцию, позволяет определять видовую принадлежность выделяемых культур микобактерий.

4. Практические предложения.

1. Беспородных белых мышей использовать в качестве лабораторной модели для выделения культур микобактерий.

2. Для индивидуальной характеристики штаммов М.Ьоу^х использовать метод УМТЯ -типирования с набором из 6 локусов и систему индикаторных бумажных (СИБ).

3. Метод УЭТК-типирования применять при эпизоотологических обследованиях эпизоотических очагов туберкулеза для выяснения распространения возбудителя туберкулеза.

4. Дифференциацию М.аушт и М. ¡Шгасе11и1аге проводить биологической пробой на кроликах с заражением их выделенной культурой в дозах по 1мг\см3 и 0,1 мг\см3.

5. Идентификацию культур микобактерий осуществлять применением оптимизированного комплекса методов идентификации, включающий культурально-морфологические, биохимические и биологические тесты, газожидкостную хроматографию и полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

ФГУ «Центр ветеринарии» JI.K. Киш в июле 2009 года, в «Методические рекомендации по идентификации M.avium subsp. paratuberculosis и других микобактерий комплекса avium-intracellulare», утвержденных директором ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулкжиным 16 марта 2010г.

5. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Касьянова Е.А. О патогенности нетуберкулезных микобактерий для морских свинок и белых мышей /Толстенко Н.Г., Колоскова Э.Л., Суворов B.C., Касьянова Е.А., Соколова Е.Э// Материалы международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р. Коваленко. Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных. - М., 2006. - С.390-393.

2. Касьянова Е.А. Белые мыши как биологический объект для изучения микобактерий /Толстенко Н.Г., Касьянова Е.А., Суворов B.C.)// Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел. - М., 2008.- С.285-287.

3. Касьянова Е.А. Изучение культуральных свойств микобактерий, выращенных на среде ВКГ /Е.А. Соколова, Н.Г. Толстенко, Н.К. Букова, Е.А. Касьянова// Материалы Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел. - М„ 2008. - С.266-271.

4. Касьянова Е.А. Патологоанатомические исследования и дифференциальная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота /А.Х. Найманов, О.В. Якушева, Н.Г. Толстенко, Н.П. Овдиенко, B.C. Суворов, Э.Л. Колоскова, Н.В. Новосельцева, Е.Э. Соколова Е.А.

Касьянова// Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел. -М.,2008,- С. 195-203.

5. Касьянова Е.А. К вопросу взаимовлияния эпидемического и эпизоотического процессов туберкулеза и микобактериозов в Московской обл. /Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко, Е.А. Касьянова, В.Н. Хруленко, Е.Э. Соколова, М.А. Аникеев// Ветеринарный врач. -2009 .-№6 .- С. 17-20

-33-заметок

Салон оперативной полиграфии ООО «Ник-Групп» 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, Тел. 8-926-236-16-56. Подписано в печать 10.04.10. Формат 60x90/16. Объем 1 п.л. Печать цифровая Тираж 100 экз. Заказ №42

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Касьянова, Екатерина Александровна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Микобактерии. Возбудители туберкулеза и нетуберкулезные микобакт.

2.1.1. Микобактерии, не растущие на искусственных средах.

2.1.2. Микобактерии, требующие «стимуляторов» роста.

2.1.3. Микобактерии, вызывающие туберкулез у человека и животных.

2.1.4. Микобактерии, вызывающие туберкулез у холоднокровных.

2.1.5. Нетуберкулезные микобактерии.

2.2. Классификация микобактерий.

2.3. Методы идентификации микобактерий.

2.3.1. Дифференциация возбудителей туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий.

2.3.2. Идентификация видов возбудителей туберкулеза млекопитающих и птиц.

2.3.3. Идентификация видов нетуберкулезных микобактерий.

2.3.4. Методы молекулярного генотипирования.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Оптимизация комплекса видовой идентификации микобактерий"

1.1. Актуальность темы. Микобактериальные инфекции являются одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии человека и животных. Весьма напряженная эпидемическая обстановка по туберкулезу.

В эпизоотологии микобактериальных инфекций проблема видового состава микобактерий и их региональных особенностей имеет не только теоретическое, но и большое практическое знечение, так как создает основу для дифференцированного проведения профилактических и оздоровительных мероприятий. Определение видовой принадлежности выделенных культур микобактерий из организма животных и сред их обитания, позволяет определить ареал их распространения, источники инфицирования и патогенное воздействие на различные виды животных и человека.

В дифференциации видов микобактерий туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий широкое признание получили биохимические тесты по определению каталазной, пероксидазной, формамидазной, декарбоксилазной, дегидрогеназной, пиразинамидазной, никатинамидазной, уреазной активности микобактерий, восстановление нитритов, а также ниациновый, амидазный тесты, реакция с нейтральным красным, метиленовой синью, тесты на липазу, фосфатазу, редуктазу и др., но основным нетодом как дифференциации, так и определения видов возбудителей туберкулеза является биологическое исследование на морских свинках, кроликах, курах и других видах животных.

По мнению JI.M. Пинчук и соавт. (1990), одним из надежных методов идентификации вида микобактерий является метод газожидкостной хроматографии.

В последнее время проводятся активные исследования по применению ПЦР для диагностики туберкулеза и идентификации микобактерий. Ряд авторов высоко оценивают перспективы применения этого метода (А.Н. Шаров и соавт., 1998; 2000). Другие авторы (Е.М. Скрягина с соавт. 2001) считают, что метод ПЦР обнаруживает ДНК микобактерий, уже не способных к росту на питательных средах и дают ложноположительные результаты, вследствие возможной контаминации. Авторы считают, что интерпретировать положительный результат ПЦР следует в комплексе с результатами микробиологических тестов.

Необходимость оптимизации системы идентификации видов микобактерий представляется своевременной и актуальной и послужила основанием для выполнения настоящей работы.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение культурально-морфологических, биохимических и других свойств для оптимизации системы идентификации видов микобактерий.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить культуры микобактерий из проб биоматериала от реагирующих на туберкулин крупного рогатого скота и из объектов внешней среды;

- изучить культурально-морфологические свойства выделенных культур микобактерий;

- изучить биохимические свойства выделенных культур микобактерий;

- испытать метод газожидкостной хроматографии для идентификации выделенных культур микобактерий установить возможность идентификации некоторых видов микобактерий с помощью ПНР;

1.3. Научная новизна. Определен видовой состав микобактерий, выделяемых от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота и объектов внешней среды. Изучены и охарактеризованы культурально-морфологические, биохимические и биологические свойства возбудителей туберкулеза и основных видов нетуберкулезных микобактерий, выделяемых из биоматериала животных и объектов внешней среды. Впервые показаны внутривидовые различия культур М. bovis с применением VNTR-типирования с использованием 6 локусов: ETR-A, ERT-C, V2, V3, V6 и VII. Показана необходимость применения газожидкостной хроматографии для идентификации микобактерий. Оптимизирована схема идентификации наиболее часто встречающихся видов микобактерий.

1.4. Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований по определению видового спектра микобактерий, выделенных от крупного рогатого скота и объектов внешней среды, создают основу дифференцированного проведения профилактических и оздоровительных мероприятий при микобактериальных инфекциях. Набор из VNTR- локусов может использоваться/ для выяснения источника заражения при эпизоотологическом обследовании хозяйств по туберкулезу. Оптимизированная схема идентификации основных видов микобактерий повышает качество бактериологических исследований и может быть использована в бактериологических и научных лабораториях.

Результаты исследований включены в «Методические рекомендации по диагностике микобактериальных инфекций животных», утвержденных директором ГНУ ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным 16 марта 2010г., в методические рекомендации «Система медико-ветеринарных мероприятий в сельских очагах туберкулеза»,.утвержденных директором ГНУ ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным, директором ВНИИТИБШ; академиком Россельхозакадемии А.Я. Самуйленко и директором ФГУ «Центр ветеринарии JI.K. Киш в июле 2009г., в «Методические рекомендации по идентификации M.aviurn subsp. paratuberculosis и других микобактерий комплекса avium-intracellulare», утвержденных директором ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным.

1.5 Личный вклад; соискателя заключается в бактериологическом исследовании проб биоматериала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота и проб из объектов внешней среды, изучении культурально-морфологических, биологических, молекулярно-генетических свойств микобактерий; анализе и обобщении результатов исследований, разработке оптимизированной схемы идентификации.

1.6 Апробация работы. Материалы работы доложены на Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р. Коваленко (г. Москва, 2006г.), 15 Московском Международном ветеринарном конгрессе (г. Москва, 2007г.) на заседаниях ученого совета ВИЭВ; (2007,2008гг.). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2010г.).

- результаты изучения культурально-морфологических и биохимических свойств разных видов микобактерий;

- внутривидовые различия М. bo vis; результаты применения газожидкостной хроматографии для идентификации микобактерий;

- результаты идентификации микобактерий в ПЦР;

- оптимизированная схема идентификации наиболее часто выделяемых видов микобактерий.

1.8 Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных статей, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК Минобр науки РФ.

1.9 Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам лаборатории микобактериозов и сектора патоморфологии ВИЭВ (проф. А.Х. Найманову, кандидатам ветеринарных наук Н.Г. Толстенко, О.В, Якушевой, В.С, Суворову, М.С, Калмыковой, Э.Л. Колосковой) и директору ВИЭВ, академику РАСХН М.И. Гулюкину, сотрудникам лаборатории инфекционных и инвазионных болезней сельскохозяйственных животных ГНУ «Научно-исследовательский институт Нечерноземной зоны РФ» (профессору A.JT. Лазовской, доктору биологических наук З.Г. Воробьевой, доктору ветеринарных наук К.Н. Слининой ) и директору НИВИ НЗ РФ, член-корреспонденту РАСХН П.Н. Сисягину, кандидату биологических наук М.В. Макаровой и директору Московского городского научно-практического Центра борьбы с туберкулезом Комитета здравоохранения Москвы, академику РАМН

В.И. Литвинову за содействие и участие в выполнении некоторых фрагментов диссертации.

2. Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Касьянова, Екатерина Александровна

5.Выводы.

5. Заражение кроликов изучаемой культурой в дозах по 1 см3 и по 0,1 о 3 см бактериальной массы в 1 см' позволяет дифференцировать M.avium и M.intracellulare. M.avium у кроликов в этих дозах вызывает сепсис и гибель

2 О животных, а М. intracellulare в дозе 0,1 см бакмассы в 1 см не вызывает гибели и патологических изменений у них.

1. Беспородных белых мышей использовать в качестве лабораторной модели для выделения культур микобактерий.

2. Для индивидуальной характеристики штаммов M.bovis использовать метод VNTR -типирования с набором из 6 локусов и систему индикаторных бумажных (СИБ).

3. Метод VNTR-типирования применять при эпизоотологических обследованиях эпизоотических очагов туберкулеза для выяснения распространения возбудителя туберкулеза.

4. Дифференциацию M.avium и М. intracellulare проводить биологической пробой на кроликах с заражением их выделенной культурой в

3 3 дозах по 1мг\см" и 0,1 мг\см .

Практические предложения включены в «Методические рекомендации по диагностике микобактериальных инфекции животных», утвержденных директором ГНУ ВИЭВ, академиком Росельхозакадемии М.И Гулюкиным 16 марта 2010г., в методические рекомендации «Система медико-ветеринарных мероприятий в сельских очагах туберкулеза», утвержденных директором ГНУ ВИЭВ М.И Гулюкиным, директором ВНИТИБП А .Я Самуйленко и директором ФГУ «Центр ветеринарии» Л.К. Киш в июле 2009 года, в «Методические рекомендации по идентификации M.avium subsp. Paratuberculosis и других микобактерий комплекса avium-intracellulare», утвержденных директором ВИЭВ, академиком Россельхозакадемии М.И. Гулюкиным 16 марта 2010г.

2.4. Заключение.

Приведенные литературные данные показывают, что основополагающим в системе противомикобактериальных мероприятий является комплекс диагностических исследований для определения эпизоотического статуса поголовья животных и выработки профилактических и оздоровительных мероприятий. Этот комплекс состоит из туберкулинизации поголовья скота для прижизненного выявления инфицированных и больных животных, патологоанатомического исследования для установления патологических изменений, бактериологическое исследования биоматериала от убитых с диагностической целью животных для выделения и идентификации культур микобактерий. В группе заболеваний, вызываемых микобактериями, подавляющую часть составляет туберкулез.

Наряду с возбудителями туберкулеза, с течением времени все более актуальной становится проблема нетуберкулезных микобактерий и вызываемых ими микобактериальных инфекций. Как полагают Dovulder с соавт. (1971), эти инфекции представляют собой новый вид патологии, которая распространяется во всех странах мира как бы вопреки эффективным усилиям, направленным на борьбу с туберкулезом. По мнению JT.B. Громашевского (1962, 1965), новая болезнь в историческом развитии человека может возникнуть, если микроб, обладающий по крайней мере потенциальной патогенностью для человека, приспосабливается к новому механизму передачи инфекции.

Весьма вероятно, что мы являемся свидетелями зарождения новых болезней, вызываемых нетуберкулезными микобактериями, обладающими одним из этих условий — потенциальной патогенностью. Если в процессе исторического развития будут созданы условия для усиления вирулентности этих потенциально патогенных микобактерий, а также систематическая их передача от одного человека к другому, или другой механизм передачи, возможно возникновение новых инфекционных заболеваний человека (М.П. Зыков, Т.Б. Ильина, 1978).

Нетуберкулезные микобактерии широко распространены во внешней среде. Их выделяют из различных объектов среды, от больных туберкулезом или микобактериозом людей, из биоматериала сельскохозяйственных животных, а также от диких и холоднокровных животных.

Идентификация видов микобактерий и изучение их роли в патологии человека и животных была и остается актуальной. В связи с появлением новых видов микобактерий стал остро вопрос об их классификации, которая постоянно совершенствуется, но не совсем отвечает запросам ветеринарной практики. Тоже самое касается и классификации нетуберкулезных микобактерий.

Число известных науке видов нетуберкулезных микобактерий довольно велико. Имеются явные межвидовые различия в степени патогенности и в культуральных свойствах, но проблема научно обоснованной классификации микобактерий пока не решена. Широко используется не вполне совершенная классификация Runyon (1959), основанная на различиях в быстроте роста бактерий и характере пигментообразования при их культивировании. По мнению самого автора , а также J.R. Weiszfeiler (1975), эта группировка не может быть признана научной классификацией, так как она не отражает генетической близости различных микобактерий, а также их патогенности для человека и животных. Вместе с тем, такая группировка удобна и в настоящее время ею пользуется большинство исследователей.

Широкое распространение, антропозоонозный характер туберкулеза, способность возбудителя этой болезни мигрировать между различными видами животных, между животными и человеком, многотипность и широкие антигенные связи с нетуберкулезными микобактериями, ставят идентификацию микобактерий в ряд злободневных проблем. От точности и быстроты дифференциации видов возбудителя туберкулеза и микобактериозов зависит успех определения источников инфекции, закономерностей ее проявления и эффективность проведения противоэпизоотических мероприятий.

За последние десятилетия осуществлена расшифровка генома возбудителей туберкулеза человека и крупного рогатого скота. Разрабатываются новые молекулярно - генетические методы диагностики и определения видов возбудителей туберкулеза и микобактериозов человека и животных. В эпидемиологии и эпизоотологии туберкулеза необходимым является изучение миграции штаммов, выявление первичного очага инфекции с целью его локализации и уничтожения. Это может быть достигнуто знанием индивидуальных характеристик штаммов на основе изучения их ДНК либо других культурально - биохимических и биологических свойств.

3. Собственные исследования. I

3.1. Материалы и методы исследования.

Работа выполнена в лаборатории микобактериозов Всероссийского научно - исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко и на опытной базе о. Лисий Вышневолоцкого отдела ВИЭВ в соответствии с заданием 02.01.01. Российской научно - технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований.

Для выделения культур микобактерий исследовали биоматериал от 37 голов крупного рогатого скота, реагировавших на туберкулин для млекопитающих, 12 коз, экспериментально зараженных М. bovis (3 гол.), М. tuberculosis (6 гол.) и М. avium (3 гол.), 6 кур, убитых с диагностической целью, и 83 проб объектов внешней среды (пробы торфа, комбикорма, почвы, воды и др.). Пробы отбирали в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных» (М., 1992).

При бактериоскопическом исследовании биоматериала от животных готовили мазки из внутренних органов и тканей, высушивали и красили их по Циль - Нильсену.

При культуральном исследовании биоматериал от животных обрабатывали по методу А.П. Аликаевой (1963), пробы из объектов внешней среды - по методу А.П. Аликаевой (1979), и засевали на среды Левенштейна -Йенсена и ФАСТ-ЗЛ. Взвесью биоматериала, использованного для посева на питательные среды и нейтрализованного двууглекислой содой до рН 7,0, заражали по 2 морские свинки подкожно в область паха в дозе по 1 см3, и по 2 головы белых мышей подкожно в дозе 0,5 см'. Через 2-3 дня пробки пробирок парафинировали, посевы культивировали на протяжении 3 месяцев при температуре 37-38С0. При появлении роста определяли характер колоний, готовили мазки и красили их по Циль-Нильсену.

Культуральные свойства и скорость роста субкультур микобактерий изучали на среде Левенштейна - Йенсена при

25 °С, 37 °С, 45 °С и 52 °С, а также на мясо-пептонном агаре (МПА) и мясопептонном бульоне (МПБ) при 37 °С, после проверки их на чистоту бактериоскопией.

Для пересева культур платиновой петлей снимали бактериальную массу в объеме 1-2 петель, переносили в стерильную центрифужную пробирку, тщательно растирали стеклянной палочкой и суспендировали физиологическим раствором, доводили концентрацию микобактерий до 10 мг/см3 по бактериальному стандарту вакцины БЦЖ.

По три-четыре капли, приготовленной бактериальной взвеси каждой культуры, вносили пастеровской пипеткой в 7 пробирок со средой Левенштейна - Йенсена, из которых по одной пробирке ставили в термостат при различных тепловых режимах 25 °С, 37 °С,45 °С и 52 °С, две пробирки использовали для изучения пигментообразования. Для определения толерантности культуры к 5% натрий хлор ее засевали в пробирку со средой с добавлением к ней хлористого натрия.

Одновременно засевали по одной пробирке культуры на мясо-пептонный бульон (МПБ) для дифференциации туберкулезных и бысторастущих культур от медленно растущих нетуберкулезных микобактерий и выращивали в термостате при 37 °С.

При исследовании пигментообразования культур на свету и в темноте две пробирки микобактериями, засеянными на среду Левенштейна - Йенсена, ставили в термостат при 37 °С, причем одну пробирку заворачивали в черную светонепроницаемою бумагу, а другую не заворачивали.

Когда в незавернутых пробирках наблюдался обильный рост, снимали черную светонепроницаемую бумагу с пробирок и осматривали выросшие культуры. Пробирки с непигментированными культурами подвергали на 7-й -12-й дни после посева микобактерий воздействию света электрической лампочки мощностью 100 ВТ в течение 2-х часов на расстоянии 50-80 см от источника света и пробирки оставляли на ночь в термостате.

Из биохимических тестов выделенных культур микобактерий изучали каталазную активность; термостабильность каталазы; гидролиз твин-80; реакцию осаждения лимонноамиачного железа; формамидазную, арилсульфатазную, амидазную, уреазную активность; толерантность к 5% хлористому натрию; редукцию теллурита; редукцию нитратов в нитриты и активность фосфатазы.

Определение каталазной активности по методу G. Middlebrook (1954) проводили путем добавления к каждой культуре микобактерий с достаточно интенсивным ростом, выращенной на среде Левенштейна - Йенсена, разведенного пополам дистиллированной водой свежеприготовленного раствора перекиси водорода в объеме, покрывающем всю культуру. Срок роста для быстрорастущих микобактерий составляет одну, а для медленно растущих - три недели. Пробирки устанавливали в наклонном положении так, чтобы раствор полностью покрывал культуру микобактерий. Учет реакции проводили по интенсивности образования пузырьков газа в течение 5 минут, измеряя максимальную высоту столбика пены в миллиметрах. При этом оценивали столбик пены в 45 мм и выше как положительную реакцию.

Термостабильность каталазы определяли по методу G. Kubica end G. Pool (1960). Для этого в бактериологические пробирки наливали по 0,5 см3 стерильного 0,067 М фосфатного буферного раствора (рН 7,1) и суспендировали одну петлю 3-4 недельной испытуемой культуры, выращенной на среде Левенштейна - Йенсена. Затем пробирки закрывали резиновыми пробками и выдерживали на водяной бане в течение 20 минут при температуре

68С°. В охлажденные до комнатной температуры пробирки добавлял по 0,5 мл каталазного реагента, состоящего из 10% -ного раствора Твин-80 на дистиллированной воде и 30%-ной перекиси водорода.

Положительной реакцией считали образование пузырьков кислорода в течение 20 мин после добавления каталазного реагента, что свидетельствовало об активности термостабильной каталазы.

Контролем являлись пробирки с одновременно и аналогично приготовляемой взвесью микобактерий, но без нагревания при 68 °С в течение 20 мин., а также референтные штаммы М. phlei и М. smegmatis, дающую положительную реакцию.

Реакцию гидролиза Твин-80 проводили по методу L.Wayne (1962). К 100 мл фосфатного буферного раствора рН 7,0 добавляли 2 мл. 0,1 % -ного водного раствора основного нейтрального красного (0,1 гр. нейтрального красного в 85 мл дистиллированной воды) и 0,5 мл. Твин-80. Смешав все три реактива, смесь разливали по 4 мл в пробирки и стерилизовали при 120 °С в течение 15 мин. Проверяли на стерильность в течение суток при 37 °С. Твин-80 связывает нейтральный красный, и раствор до реакции имеет соломенно-желтый цвет. При энзимном гидролизе Твина-80 происходит освобождение нейтрального красного, и окраска восстанавливается до красной.

После проверки раствора на стерильность в течение суток при 37 °С брали со среды Левенштейна-Йенсена одну петлю культуры, суспендировали в пробирках с приготовленным раствором и оставляли в термостате при 37 °С в течение 48 часов.

При положительной реакции цвет среды изменялся от розового до темно-красного, а при отрицательной - не менялся. Контролем являлись пробирки с питательной средой без засеянных культур, а также раферентный штамм М. phlei, дающий положительную реакцию.

При проведении реакции осаждения лимонно-аммиачного железа по методу J. Szabo and Е. Vandra (1963), готовили 2%-ный раствор реактива на дистиллированной воде и стерилизовали его при 120 °С в течение 15 мин.

В начале появления роста микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена в каждую пробирку добавляли по 0,5 см" приготовленного раствора и выращивали в термостате при температуре 37 °С в течение 10 суток. Положительной реакцией считали культуры, окрашенные в коричневый цвет, а отрицательной - культуры без изменения окраски. Контролем являлся референтный штамм М. phlei, дающий положительную реакцию с 2%-ным лимонно-аммиачным железом.

При определение формамидазной активности у изучаемых культур микобактерий по методу Н. Nagayama, К. Konno and S. Oka (1961) в модификации М.М. Дыхно (1964), использовали реактив Русселя, рабочий раствор формамида и фосфатный буферный раствор Соренсена, рН 7,2.

Реактив Русселя состоит из 0,07 % раствора сернокислого марганца на дистиллированной воде, фенолового реактива и раствора гипохлорита.

Приготовление фенолового реактива: 50,0 фенола растворяли в 20 см3 дистиллированной воды, энергично встряхивали и добавляли 1-3 мл 20%-ного едкого натра. Объем раствора доводили дистиллированной водой до 200 мл. Готовили свежий раствор в день проведения реакции.

Приготовление раствора гипохлорита: 25,0 свежей хлорной извести с содержанием активного хлора не менее 26% растворяли в 300 см3 горячей воды, доводили до кипения в течение нескольких минут, чтобы улетучился аммиак и добавляли при помешивание 135 смЗ 20%-ного раствора углекислого калия, нагревая до температуры 90 °С. После нагревания раствор охлаждали, доводили о объем до 500 см' и фильтровали через бумажный фильтр. В работе использовали только прозрачный фильтрат. о

Приготовление раствора формамида: 0,04 см формамида растворяли в 100 см3 дистиллированной воды и проверяли на наличие спонтанного аммиака. о

Для этого 0,5 см рабочего раствора формамида последовательно добавляли 0,1 см3 сернокислого марганца, 1 см3 фенолового реактива и 0,5 см3 раствора гипохлорита.

Приготовление буферного раствора Соренсена: 9,078 гр. калия фосфорнокислого однозамещенного растворяли в 1 л дистиллированной воды, 11,876 гр. натрия фосфорнокислого двухзамещенного растворяли также в 1л дистиллированной воды. Затем брали 274 см3 первого раствора и 726 см3 второго и смешивали, разливали по колбам и автоклавировали при 120 °С в течение 10 мин., рН раствора должен быть 7,2.

Методика проведения реакции: из выращенной на среде Левенштейна-Йенсена культуры готовили взвесь микобактерий из расчета 10 мг/см3 по оптическому стандарту БЦЖ на фосфатном буферном растворе Соренсена при о рН 7,2 и разливали в две пробирки по 0,5 см . Одну пробирку использовали в качестве контроля. о

В первую пробирку добавляли 0,5 см' рабочего раствора формамида, а в контрольную - вместо раствора формамида - 0,5 см3 фосфатного буферного раствора. Пробирки встряхивали и помещали в термостат на 4 часа при температуре 37 °С. Затем в каждую пробирку последовательно добавляли 0,1 см3 раствора сернокислого марганца, 1 см3 фенолового реактива и 0,5 см3 гипохлорида кальция. Пробирки энергично встряхивали и сразу помещали в кипящую водяную баню на 20 мин.

Положительной реакцией считали появление синей или зеленовато-синей окраски раствора, что указывает на количественное присутствие аммиака в зависимости от интенсивности окраски.

При исследовании арилсульфатазной активности изучаемых культур микобактерий по методу S. Pattyn, М. Hermans-Boveroulle (1965) готовили 0,01 молярный раствор трикалийфенолфталеиндисульфата, для чего 130 мг вещества растворяли в 2,5 см дистиллированной воды и добавляли к 200 мл жидкой среды Локеманна без пиру вата натрия.

Состав среды: 1) аспарагин - 5,0; 2) двузамещенный фосфорнокислый натрий - 3,0; 3) однозамещенный фосфорнокислый калий - 3,0; 4) лимоннокислый натрий - 2,5; 5) сернокислый магний - 2,5; 6) лимоннокислое аммиачное железо - 0,01; 7) глюкоза - 1,0; 8) глицерин - 15 мл; 9) свежая инактивированная сыворотка крови крупного рогатого скота - 30 мл; 10) вода дистиллированная - до 1 литра.

Первые семь компонентов среды растворяли в приведенной последовательности в дистиллированной воде и фильтровали через бумажный о о фильтр. К 200 см профильтрованного раствора добавляли 2,5 см' раствора трикалийфенолфталеиндисульфата и три миллилитра глицерина, а затем устанавливали рн 6,3 и стерилизовали при 120 °С в течение 30 мин. К охлажденному раствору добавляли 6 мл стерильной инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота и разливали в пробирки по 2 см3. В каждую пробирку добавляли одну петлю культуры микобактерий со среды Левенштейна-Йенсена, энергично встряхивали и одни сутки инкубировали в

0 3 термостате при температуре 37 С. Затем добавляли 0,5 см молярного раствора углекислого натрия.

Учет реакции проводили по изменению окраски среды, характеризующей наличие свободного фенолфталеина., Положительной реакцией считали розовую или красную окраску среды, сомнительной — бледно-розовую и отрицательной - неизмененную среду. Для контроля использовали референтный штамм М. avium, который дает отрицательную реакцию.

При определении амидазной активности исследуемых культур по методу A. Tacguet, F. Tison, P. Roos and В. Devulder (1967), нами была использована синтетическая агаровая среда, на которой выращивали культуры микобактерий. Состав среды: 1) пептон - 2,0; 2) агар-агар - 40,0; 3) хлористый натрий - 10,0; 4) глюкоза - 2,0; 5) однозамещенный фосфорнокислый калий -4,0; 6) глицерин - 20мл; 7) дистиллированная вода до двух литров; рн среды

6,9. Среду разливали в пробирки по 5 мл и автоклавировали при температуре 120 °С в течение 20 мин. Растворы амидов готовили в следующих

3 3 концентрациях: мочевина - 40мг/см ; никотинамид - ЗОмг/см"; пиразинамид — 20мг/мл. Стерилизовали растворы никотинамида и пиразинамида нагреванием до 100 °С в течение 30 мин, а раствор мочевины фильтровали через фильтр Зейтца. В каждую пробирку добавляли по 0,25 см3 раствора амида и ставили на 48 часов в термостат при температуре 37 °С для впитывания средой амидов. В реакции использовали реактив Неслера, состоящий из двуйодистой ртути -30,0, йодистого калия - 26,0, едкого натрия - 50,0 и дистиллированной воды до одного литра.

Методика проведения реакции. Взвесь микобактерий готовили по стандарту БЦЖ из расчета 1мг/см" и вносили в 4 пробирки с питательной средой по 0,2 см , а затем на 3 недели ставили в термостат при температуре 30°С. Каждая из трех пробирок с культурами содержала по одному амиду: никотинамид, пиразинамид и мочевину. Четвертая пробирка являлась контрольной и не содержала амидов.

При появлении роста культур в каждую пробирку добавляли по 0,5 см3 реактива Неслера. Положительной реакцией считали появление коричневой окраски, что свидетельствовало о присутствии аммиака. При отрицательной реакции в исследуемых и контрольных пробирках коричневой окраски не обнаруживали.

Для исследования толерантности культур к хлористому натрию по методу D. Kestle, V. Abboti end G. Kubica (1967), при приготовлении среды Левенштейна-Йенсена добавляли 5% хлористого нартия. Взвесь микобактерий о готовили по оптическому стандарту БЦЖ в концентрации 1 мг/ см и засевали 0,1 см3 взвеси на приготовленную среду. Пробирки с засеянными культурами ставили в термостат на 4 недели при температуре 37 °С и по истечении этого срока проводили учет роста. Наличие роста культур микобактерий на среде считали положительной, а отсутствие его - отрицательной реакцией.

Контролем являлись пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, но без добавления в них хлористого натрия.

Редукция теллурита калия по методу J. Kilburn, V. Silcox and G. Kubica (1969). Для определения восстановления теллурита готовили 0,2%-ный раствор теллурита калия на дистиллированной воде и стерилизовали при температуре 120 °С 15 мин. Среду Локеманна без глицерина разливали в пробирки по 2 см3 и добавляли по одной петле взвеси микобактерий в концентрации 5 мг/см3.

Культуры микобактерий, выращенные в течение 7 дней на этой среде, тщательно взбалтывали до образования суспензии. К 2 см суспензии культуры добавляли стерильной пипеткой 2 капли стерильного 0,2%-ного раствора теллурита калия и выдерживали в термостате при 37 °С. Начиная с третьего дня ежедневно на протяжении двух недель следили за окраской осадка на дне пробирки. При появлении обильного черного осадка, а у пигментированных культур - коричневого осадка реакцию считали положительной. Для контроля использовали референтный штамм М. phlei, дающий отрицательную реакцию.

Редукция нитратов в нитриты по методу М. Tsukamura (1961) в модификации Т.Б. Ильиной с соавт. (1972). Культуру микобактерий со среды Левенштейна-Йенсена в количестве 10 мг влажной массы суспендировали в 1 см3 0,067 м фосфатного буфера рН 7,1 с 0,1%-ным азотнокислым натрием. Пробирку помещали в термостат на 20 часов, после чего проверяли образование нитрита добавлением двух капель 2%-ного раствора Р-диметиламинобензальдегида в 10%-ном растворе соляной кислоты. Появление желтого окрашивания раствора свидетельствовало о восстановлении нитратов и наличии нитритов, в этом случае реакция считалась положительной. Отсутствие желтого окрашивания указывало на отрицательную реакцию. В качестве контроля использовали 1 см' фосфатного буфера, в который добавляли реактив. Фермент нитроредуктаза наиболее активен у молодых культур (1-3 недели).

Рост на среде с салициловым натрием по методу М. Tsukamura (1962). Культуры микобактерий выращивали на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 0,5 и 1,0 мг/см' салицилового натрия.

Количество салицилового натрия, которое необходимо добавить в среду, рассчитывали следующим способом: 1) навеску 100 мг салицилового натрия растворяли в 2 см" стерильной дистиллированной воды и получали 1-е

3 3 разведение, равное 50 мг/см или 50000 мкг/см'; 2) к 1 мл 1-го разведения о добавляли 9 см дистиллированной воды и получали 2-е разведение,

3 3 содержащее 5 мг/см' или 5000 мкг/см .

После свертывания среды штамм засевали в 3 пробирки со средой Левенштейна-Иенсена, содержащие 0,5 и 1 мг/см салицилового натрия, а также не содержащую препарата. Последняя пробирка служила контролем.

Определение уреазной активности по методу R. Bonicke (1967) представляет собой тест биохимической идентификации нетуберкулезных микобактерий. Уреаза - энзим, редуцирующий мочевину в аммиак и углекислый газ: выделяющийся аммиак улавливается в реакции с реактивом Неслера. Состав реактива Неслера: йодистый калий- 12г, хлористая ртуть — 15г, 10% раствор едкого натрия - 150 мл (удельный вес 1,33), дистиллированная о вода - 100 мл. В небольшой пробирке готовили 0,3 см бактериальной взвеси о исследуемой культуры и прибавляли 0,3 см 0,5%-ного раствора мочевины в дистиллированной воде. Пробирку помещали в термостат при температуре 37 °С, затем добавляли к ней 5-10 капель реактива Неслера. При положительной реакции взвесь окрашивалась в желтый цвет, иногда с коричневым оттенком. Активность фосфатазы по методу W. Kappler (1965). Для исследования активности фосфатазы брали культуры со среды Левенштейна-Йенсена. Быстрорастущие штаммы выдерживали 10 дней при 37 °С, а медленно растущие- при 37 °С в течение 20 дней.

Массу микобактерий брали стерильной петлей с питательной среды Левенштейна-Йенсена, суспендировали в физиологическом растворе и приготавливали взвесь. Затем центрифугировали 15 мин при 3000 мин-1 и из полученного осадка вновь приготавливали взвесь в дистиллированной воде. о

Бактериальную взвесь готовили в концентрации 20 мг/см . В пробирку наливали 0,5 см3 буферного раствора и 0,5 см3 бактериальной взвеси при помощи пипетки, закрывали резиновой пробкой, взбалтывали и оставляли на 4 л о часа при 37 С. Затем на каждый мл раствора прибавляли по 0,5 см раствора карбоната натрия. Для контроля брали пробирку с растворами, но без бактериальной взвеси и проверяли на возможное наличие гидролитически освобожденного фенолфталеина.

Учет реакции проводили на основании окрашивания. Положительной реакцией считали появление темно-красного или розового окрашивания, а при отрицательной реакции цвет не менялся.

Культурально-морфологические и биохимические свойства микобактерий изучали в соответствии с методическими рекомендациями: «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий»; с приказом Минздрава СССР от 08.06.78г. №558 «Об унификации микробиологических методов исследований при туберкулезе» и приказом Минздрава РФ от 21 марта 2003г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». В работе также использованы методические рекомендации «Новые методы исследования возбудителей антропозоонозов. Туберкулез». (Москва, 2003).

Газожидкостную хроматографию и рестрикционный анализ культур микобактерий проводили в лаборатории по изучению туберкулеза Государственного научного учреждения «Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ» совместно с главным научным сотрудником, доктором медицинских наук A.JI. Лазовской, ведущим научным сотрудником, доктором биологических наук З.Г. Воробьевой и старшим научным сотрудником, кандидатом ветеринарных наук К.Н. Слининой.

Для рестрикционного анализа микобактерий ДНК выделяли согласно методу Palittapongarnpim, для чего бактерии, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена, суспендировали в ТЕ буфере (рН 7,8). Полученную суспензию клеток объемом 450 мкл помещали в пробирки «эппендорф» и оставляли на водяной бане при 70 °С на 25 мин. Затем добавляли 50 мкл раствора лизоцима (10 мг/мл) и оставляли на 15 мин при 37 °С, после чего добавляли 10%-ный раствор SDS (додеци л сульфат натрия) и протеин азу К (конечная концентрация 500 мкл/мл) и инкубировали при 65 °С. Через 50 мин к лизатам добавляли 180 мкл NaCl (5,ОМ), перемешивали содержимое пробирок и оставляли при 65 °С на 20 мин. Хромосомную ДНК экстрагировали из полученных клеточных лизатов смесью хлороформ-изоамиловый спирт в соотношении 24:1. К водной фазе добавляли 0,6 объемов изопропилового спирта и оставляли на ночь при - 20 °С. На следующий день ДНК осаждали центрифугированием, полученный осадок промывали 70%-ным этанолом и растворяли в 100 мкл деионизированной воды (Шагинян И.А. и соавт., 1996).

Для проведения ПЦР-амплификации спейсерных последовательностей анализируемых микобактерий использовали последовательности праймеров PLI (5 -G AAGTCGT А AC A AGG-3) и PLI2 (5-CAAGGCATCCACCAT-3).

Олигонуклеотидные праймеры, комплементарные спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК (рДНК) Mycobacterium синтезировали на синтезаторе ASM-102U фирмы Bioset ЬТД (Россия), согласно методическим рекомендациям фирмы - производителя. Очистку олигонуклеотидов осуществляли хроматографией высокого давления на гидрофобном носителе С16 (фирма «Элсика», Россия).

ПЦР проводили в объеме 50 мкл, реакционная смесь состояла из 50 нг матричной ДНК, 1 мкм каждого праймера и 2,5 ед Tag - полимеразы в реакционном буфере, содержащем 200 мкм каждого dNtp (Fermentas, МВ1), 10мМ Tris-HCI (pH 8,0), 50mM KCI, 2,5 mM MgCI2, 0,01% желатина. После предварительной денатурации (95 °С - 3 мин) проводили 30 циклов ПЦР в следующем режиме: денатурация - 95 °С 40 сек., отжиг праймеров -45С0 40 сек., элонгация - 72 иС 46 сек. Амплифицированную ДНК анализировали методом электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле в присутствии этидиум бромида.

Рестрикционный анализ проводили следующим образом: 8,5 мкл ПЦР — продукта гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Haelll (Fermentas, МВ1) в общем объеме 10 мкл при 37 °С в течение 2,5ч. Продукты гидролиза разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. Размер фрагментов ДНК на электрофореграмме вычисляли с помощью программы компьютерного анализа «BANDLEADER» (рестрикционный анализ каждого образца повторяли трижды).

Для определения вида возбудителя туберкулеза использовали биологическое исследование на морских свинках, кроликах и курах. Морских свинок для опыта брали массой 250 - 300 г и заражали подкожно в дозе по 1 мг/см3 в область паха. Каждой проверяемой культурой заражали по 3 морские свинки.

Кроликов для опыта брали средней массой тела 1500 - 1600 г, которых заражали внутривенно в краевую вену уха в дозе по 1 мг/см3.

Морских свинок, кроликов и кур перед заражением исследовали ППД-туберкулином для млекопитающих и комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (КАМ). Туберкулин вводили морским свинкам внутрикожно в область брюшка с одной стороны тела в дозе 25 ТЕ, КАМ с другой стороны в дозе 10 ЕД в 0,1 см3. Реакцию на аллергены учитывали через 24 часа. Кроликам туберкулин в дозе 50 МЕ/0,1 мл вводили в кожу наружной поверхности левого, а КАМ - правого уха. Реакцию учитывали через 24 и 48 часов. Курам вводили 0,1 мл ППД - туберкулина для птиц, реакцию учитывали через 30-36 часов.

Опытных животных содержали в течение 3 месяцев в соответствии с «Ветеринарно-санитарными правилами содержания опытных (лабораторных) животных в вивариях научно-исследовательских институтов, станций, лабораторий, учебных заведений, а также в питомниках, утвержденных Главным управлением ветеринарии МСХ СССР в 1964 году.

Если в течение 3 месяцев животные не погибали, то проводили эвтаназию морских свинок путем декапитации с помощью гильотины, кроликов путем воздушной эмболии, согласно «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1978г). Павших и убитых животных после истечения срока опытов подвергали патологоанатомическому вскрытию. От всех экспериментальных животных биоматериал исследовали бактериологически и гистологически. Бактериологическое исследование, включая биопробу на лабораторных животных, проводили совместно с кандидатом ветеринарных наук Н.Г Толстенко и аспирантом Е.С. Соколовой, гистологическое - с кандидатом ветеринарных наук О.В Якушевой.

Методики отдельных исследований и экспериментов изложены в соответствующих разделах диссертации.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Касьянова, Екатерина Александровна, Москва

1. Акулов, А.В. Сенсибилизирующие свойства и патогенетическая роль атипичных микобактерий \ А.В. Акулов, B.C. Тырина \\ Ветеринария.-1969,-№10- С. 43-45

2. Александров, Н.А. Выделение кислотоустойчивых сапрофитных микроорганизмов из некоторых объектов окружающей среды /Н.А. Александров// Труды Саратовской н.-и. ветеринарной станции. 1967. т.7. С. 9095.

3. Александров, Н.А. Внутрикожная проба для дифференцирования микобактерий туберкулеза бычьего и человеческого видов \ Н.А. Александров, Г.К. Коваль \\ Пробл. Туб.-1970.-№12.- С.65-68.

4. Александров, А.А. Применение ПЦР -анализа для видовой идентификации микобактерий \ А.А. Александров, О.А. Иртуганова, Н.С. Смирнова \\ В кн.: Туберкулез сегодня: Материалы YII российского съезда фтизиатров.- М.: Издательство БИНОМ.- 2003.- С105.

5. Алешукина, А.В. Медицинская микробиология: Учебное пособие / А.В. Алешукина.- Ростов н\д: Феникс, 2003.-480С.

6. Аликаева, А.П. Ускоренный метод типирования туберкулезных культур / А.П. Аликаева// Труды ВИЭВ.-М., 1951.-Т.18.-С197-202.

7. Аликаева А.П. Туберкулез. Лабораторные методы исследования в ветеринарии/А.П. Аликаева-М.: «Сельхозгиз», 1954.-Т.З.-С.25-27

8. Аликаева, А.П. Метод выделения чистых культур возбудителя паратуберкулеза /А.П. Аликаева// Ветеринария,-1957,-№5,-С.79-81

9. Аликаева, А.П. Туберкулез. Ветеринарная лабораторная практика /А.П. Аликаева//М.: «Сельхозиздат», 1963.-Т1.-С.279-289

10. Аликаева, А.П. Лабораторные методы диагностики паратуберкулеза /А.П. Аликаева/В.Е. Щуревский/В кн.: Достижения ветеринарной науки.-М.,-1966, -С.73-90

11. Аликаева, А.П. Достижения науки и практики в борьбе с паратуберкулезом /А.П. Аликаева// Труды ВИЭВ.-1967.-Т.34.-С.368-380

12. Аликаева, А.П. Об идентификации выделенных от кур атипичных микобактерий /А.П. Аликаева, О.В. Якушева //Труды ВИЭВ.-М.Д978.-Т47-С.48-51

13. Басыбеков, С.Д. Животные источники микобактериозов у человека \ С.Д. Басыбеков , Я.А. Благодарный, Н.Ж. Жанузаков.- Алма-Ата: «Кайнар».-1985.-1 ЮС.

14. Батуро, А.П. Дифференциация атипичных штаммов микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов при помощи внутрикожной пробы на морских свинках / А.П. Батуро //Пробл. туберкулеза.-1964.-№6.- С.71-74

15. Берджи, Д.- Определитель микробов / Берджи Д.- Киев: 1936

16. Берджи, Д.Определитель Берджи\ Д. Берджи,- 1974.-1246с.

17. Бескровный, П.С. Микобактериозы, обусловленные M.fortuitum \П.С. Бескровный, Ю.С. Варенко, Г.П. Устинова\\ Пробл. туб.-1980.-№2.-С.68-69

18. Благодарный, Я.А. Туберкулез как антропозооноз. /Я.А. Благодарный.-Алма-Ата.-1972.-199с.

19. Блохина, И.Н. Первичная структура ДНК и систематика бактерий/ И.Н.Блохина, Г.Ф. Леванова //В к.: Строение ДНК и положение организмов в системе. -М.: Изд. МГУ.-1972. С.91-134

20. Борисов, С.Е. Противотуберкулезная помощь населению / С.Е. Борисов, Е.М. Белиловский, И.Р. Дорожкова // Всемирная организация здравоохранения. Рабочая группа высокого уровня по туберкулезу в Российской Федерации. — 2003.-152 С.

21. Бортюк, Я.А. Дифференциация возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота от атипичных микобактерий в реакции ДНК -ДНК гибридизации : Автореф. дис. канд.биол.наук.03.00.23/Я.А. Бортюк; ВИЭВ,- М .- 1991.-25 С.

22. Брудная, Я.А. О нуклеотидном составе ДНК некоторых видов условно патогенных микобактерий / Ю.Е. Брудная, Н.М. Макаревич, Н.Ф. Амфитеатрова // Пробллуб.-1980.-№12.- С.51-53.

23. Валиев, Р.Ш. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза / Р.Ш.Валиев, Т.Х. Фаизов,Л.И. Зайнулин, Н.Р. Валиев // Проблемы туберкулеза и болезней легких.- 2005.- №3.- С.25-27

24. Вишневский, П.П. Туберкулез крупного рогатого скота \ П.П. Вишневский: М., Сельхозгиз.- 1935.- С.106

25. Вишневский, П.П. Паратуберкулезный энтерит рогатого скота (болезнь Ионе/ П.П. Вишневский: М., ОГИЗ-Сельхозгиз., М., 1941.-128 С.

26. Вишневский, П.П. Туберкулез / П.П. Вишневский // Болезни птиц.- М., «Сельхозиздат».- 1951.- С.17-24

27. Войтова, Д.И. Микобактериоз у больных с хроническими неспецифическими заболеваниями легких/ Д.И. Войтова, Т. Ф. Оттен, Т.Б. Ильина // Пробл.туб.-1992.- № 7-8.-С.38-40

28. Воробьев, А.А. Идентификация микобактерий методом газожидкостной хроматографии / А.А. Воробьев, Н.М. Бадукшанова, И.Р. Дорожкова и др. // Пробл.туб.-1991.-№7.-С.46-50

29. Галкина, К.Ю. Определение вида микобактерий молекулярно-биологическими методами / К.Ю. Галкина, Н.С. Смирнова, О.И. Скотникова // Туберкулез сегодня : Материалы 7 Российского съезда фтизиатров.- М.: Бином,- 2003.- 108С.

30. Гелетюк, В.З. Сравнительное изучение микобактерий, выделенных из торфа и M.avium/В.З. Гелетюк //Ветеринария.- 1967.- 12.- С.106-107

31. ГОСТ 26072. Животные и птица сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики туберкулеза .- М.: Гос. комитет СССР по стандартам, 1984.- ЮС.

32. ГОСТ 26073. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики паратуберкулеза.- М.: Гос. комитет СССР по стандартам, 1984.-11С.

33. ГОСТ 27318-87. Сельскохозяйственные животные. Методы идентификации атипичных микобактерий.- М.: Изд-во стандартов, 1987.- 16С.

34. Гребенникова, Т.В. Дифференциальная диагностика микобактерий с помощью ПЦР /Т.В. Гребенникова, В.В. Грибовецкий, C.J1. Кальнов и др. // Ветеринария.- 1999.- №3.- С. 17-20.

35. Гребенникова, Т.В. Молекулярные методы исследования в диагностике туберкулеза /Т.В. Гребенникова, C.JI. Кальнов, А.Д. Забережный и др. // Вет. пат.- 2004.- № 1-2 (9).- С.92-93

36. Данко,Ю.Ю. Распространение потенциально-патогенных микобактерий в природе и среди домашних животных ЯО.Ю. Данко, Т.Б. Ильина // Пробл. туберкулеза,- 1983.-№11.-С.15-20.

37. Деггева, Г.К. Блохина, И.Н. // Успехи микробиол.-1984.-Т.19.-С.З-34

38. Донченко, А.С. Геномная дактилоскопия в эпидемиологии и эпизоотологии туберкулеза /А.С. Донченко, А.Т. Пузырев // Генетика, 1998.-Т.2 №2.- С.2-7.

39. Донченко, А.С. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота / А.С. Донченко, Н.П. Овдиенко, Н.А. Донченко Новосибирск,- 2004.- 308С.

40. Домнин, Б.Г. Влияние кислотоустойчивых микобактерий на организм крупного рогатого скота / Б.Г. Домнин // Ветеринария.- 1967.-№4.- С.33-35.

41. Донченко, Н.А. Генетическое типирование микобактерий туберкулезного комплекса с помощью анализа ПДФР ампликонов / Н.А. Донченко, А.С. Донченко, В.И. Семенихин // Ветеринарная патология.- 2004.-№1.~ 2(9).- 71С.

42. Дорожкова, И.Р. Микробиологическая диагностика туберкулеза и микобактериозов / И.Р. Дорожкова // Туберкулез (ред. А.Г. Хоменко).- М.: "Медицина", 1982.- С.102-128.

43. Драбкина, P.O. Можно ли пользоваться белыми мышами для определения вирулентности туберкулезных штаммов / P.O. Драбкина, Т.С. Гинзбург // Пробл. туб.- 1949.- №5.- С.55-58.

44. Драбкина, P.O. Микробиология туберкулеза / P.O. Драбкина.- М.: "Медгиз",- 1963.-256С.

45. Драбкина, P.O. Антигенные особенности и природа атипичных кислотоупорных микобактерий, выделенных от больных туберкулезом / P.O. Драбкина, М.С. Марова // Пробл. туб.- 1965.- №10.- 63С.

46. Драбкина, P.O. Частота выявления, значение в клинике атипичных микобактерий и методы их идентификации в условиях централизованной бактериологической службы / P.O. Драбкина, A.M. Хома-Лемешко, Н.М. Макаревич // Проб, туб.- 1974.- №10.- С.22-24.

47. Жданов, В.М. Эволюция заразных болезней человека./ В.М. Жданов.-М<: Медицина, 1964.- 375С.

48. Жданов, В.М. Эволюция возбудителей инфекционных болезней: / В.М. Жданов, Д.К. Львов -М.: Медицина, 1984.- 272С.

49. Журнакова, М.А. Атипичные аллергические реакции на туберкулин у кур. / М.А. Журнакова, В.И. Шоршнев // Бруцеллез и туберкулез сельскохозяйственных животных. М.: Колос.- 1967.- С.243-249

50. Журнакова, М.А. Влияние кислотоупорной микрофлоры подстилочного торфа на аллергическое состояние кур / М.А. Журнакова // Сб. трудов ВНИИБП.- 1969.- №3.- С.95-100

51. Завгородний, А.И. Атипичные микобактерии у крупного рогатого скота в зоне Лесостепи и Степи Украинской ССР / А.И. Завгородний.: Автореф. дисс. канд. вет. наук: 16.00.03. Харьков, 1987.- 19С.

52. Завгородний, А.И. Виды микобактерий и их эпизоотологическое значение для крупного рогатого скота / А.И. Завгородний // Вет. медицина / Инт эксперим. и клин. вет. медицины.- Харьков, 2000.- Вып. 78, т. 1.- С. 108-113

53. Загородняя, J1.И. Типы микобактерий и пораженность туберкулезом / Л.И. Загородняя, Г.Н. Калмыкова, Л.М. Тесля // Проблемы туберкулеза. 1977.-№5.- 78С.

54. Зыков, М.П. Всемирное распространение, выделение и классификация микобактерий / М.П. Зыков // ЖМЭИ.- 1966.- №4.- С. 115-121

55. Зыков, М.П. Потенциально-патогенные микобактерии и лабораторная диагностика микобактериозов / М.П. Зыков, Т.Б. Ильина.- М.: Медицина, 1978.-176С.

56. Иванова, Н.М. О течении экспериментального туберкулеза у белых мышей при подкожном заражении / Н.М. Иванова, Э.З. Раскина / Пробл. туб.-1958.-№2.- С.95-104

57. Ильина, Т.Б. Современное состояние проблемы потенциально патогенных микобактерий / Т.Б. Ильина, М.Н. Зыков // Труды 9 Всесоюзного съезда фтизиатров.- Кишинев.- 1979.- С. 178-179

58. Ильина, Т.Б. Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий / Т.Б. Ильина//Метод, рекомендации.- Л., 1980.- 21С.

59. Ильина, Т.Б. Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий / Т.Б. Ильина // Пробл. туб.- 1981.- №7.- С.68-73

60. Ильина, Т.Б. Дифференциация микобактерий tuberculosis и bovis с помощью салицилового теста и редукции нитратов / Т.Б. Ильина // Пробл. туб.-1987.-№1.- С.57-61

61. Ильина, Е.А. Частота выделения атипичных микобактерий из мокроты больных с деструктивными процессами в легких / Е.А. Ильина // Материалы Юбилейной сессии ЦНИИТ,- М., 2001.- С.81-82

62. Иртуганова, О.А. Современные возможности микобактериологической лаборатории / О.А. Иртуганова // Клиническая лабораторная диагностика М., 2006.-№1.- С.21-35

63. Ищенко, JI.A. Связи между типичными и атипичными микобактериями, выделяемыми от крупного рогатого скота / JT.А. Ищенко // Проблемы туберкулеза.- 1973.-№ 10.- С.72-75

64. Кадочкин, A.M. Изучение атипичных нефотохромогенных микобактерий комплекса авиум интрацеллюляре и их патогенности для лабораторных животных и крупного рогатого скота: Автореф. дис. канд. вет. наук: 16.00.03 /

65. A.M. Кадочкин.-ВИЭВ М., 1979.-13С.

66. Кадочкин, A.M. Методика серологической идентификации по Шефферу нефотохромогенных микобактерий / A.M. Кадочкин // Бюлл. ВИЭВ.- 1979.1. B.34, С.33-35

67. Кадочкин, A.M. Потенциально патогенные микобактерии, выделенные от людей, больных микобактериозами и их значение для крупного рогатого скота / A.M. Кадочкин, Н.М. Макаревич, А.В. Ткачев Кузьмин, О.В. Якушева // Труды ВИЭВ. М., 1984.- Т.61.- С.62-67

68. Кадочкин, A.M. Дифференциация и идентификация микобактерий / A.M. Кадочкин //Ветеринария.- 1984.- №9.- С.62-63

69. Калмыкова, М.С. Диагностическая ценность ПЦР-тест-систем при туберкулезе животных: Автореф.дисс. канд. вет. наук: 16.00.03 / М.С. Калмыкова :ВИЭВ.- М., 2007.- 27С.

70. Каримова, Л.М. Характеристика микобактерий, выделенных от крупного рогатого скота, реагирующего на туберкулин в хозяйствах Западной Сибири и их идентификация: автореф. дис. канд. вет. наук: 16.00.03 / Л.М. Каримова.-Омск, 1993.- 18С.

71. Каримова, JI.M. Биологическая характеристика М. fortuitum / JLM. Каримова// Материалы Международной научно-практической конф., поев. 100-летию Я.Р. Коваленко.- М., Изографъ.- 2006.- С.243-245

72. Каримова, J1.M. Дифференциация микобактерий на питательных средах / Л.М. Каримова // Морфология, физиология, патология и терапия животных и пушных зверей клеточ. содержания.- Омск, 1997.- С.88-91

73. Козлов, Н.Н. Изменения у свиней при поражении атипичными микобактериями / Н.Н. Козлов // Ветеринария.- 1982.- №6.- С.34-38

74. Козлов, Н.Н. О туберкулезных изменениях у свиней в некоторых районах Эстонской ССР / Н.Н. Козлов // Тезисы докладов распубликанской-научно-производственной конференции по туберкулезу.- Минск.- 1977.- С.95-97

75. Козулицына, Т.И. Современные методы идентификации кислотоустойчивых микобактерий / Т.И. Козулицина, Н.М. Макаревич, A.M. Кадочкин //Материалы Всесоюз. науч. конф.- Омск, 1980.- С.65-68

76. Козулицына, Т.И. Генетические процессы у микобактерий / Т.И. Козулицына, Н.В. Козлова//Пробл. туб.- 1983.- №11.- С.61-67

77. Козулицына, Т.И. Возбудитель туберкулеза и его свойства / Т.И. Козулицына // Туберкулез органов дыхания. Под ред. А.Г. Хоменко.- М.: Медицина, 1988.- С.5-16

78. Колесов, К.А. Лепра / К.А. Колесов // Общая и частная эпидемиология. Под. ред. проф. И.И. Елкина.- М.: Медицина, 1973.- С.436-446

79. Косенко, В.И. О патогенности М. scrofulaceum для морских свинок / В.И. Косенко, Н.Г. Толстенко // Труды ВИЭВ, 1991; Т.69.- С. 123-126

80. Кудяков, В.Н. Атипичные микобактерии выделенные из объектов внешней среды и молока / Н.В. Кудяков // Бюл. ВИЭВ.- М., 1983.- Вып. 50.-С.22-24

81. Кудяков, В.Н. Атипичные быстрорастущие микобактерии и их роль в патологии крупного рогатого скота: Автореф. дис. канд. вет. наук: 16.00.03./ В.Н. Кудяков; ВИЭВ.- М., 1984.- 24С.

82. Лабораторная диагностика туберкулеза / Под. ред. В.И. Литвинова, A.M. Морозова.- М.: МНПЦБТ, 2001,- 184С.

83. Лазовская, А.Л. Быстрорастущие микобактерии, вызывающие микобактериозы у людей и животных / А.Л. Лазовская, Л.В. Смирнова, Т.В. Гончарова//Успехи соврем, биол.- 1989.- Т. 107.- №1.- С.121-130

84. Лазовская, А.Л. Патогенные и условно патогенные микобактерии / А.Л. Лазовская, И.Н. Блохина// Горький.- 1916 113С.

85. Лазовская, А.Л. Таксономия микобактерий туберкулеза / А.Л. Лазовская // В кн.: Вопросы эпизоотологии, диагностики и мероприятия по ликвидации туберкулеза и бруцеллеза животных.- Новосибирск.- 1987.- С.78-84

86. Лазовская, А.Л. Использование метода газовой хроматографии жирных кислот в таксономии микобактерий / А.Л. Лазовская, Л.М. Пинчук // Современные аспекты систематики микроорганизмов.- Алма-ата,- 1985.- С.30

87. Леванова, Г.Ф. Эубиотики промышленного изготовления как материал для выделения и изучения ДНК / Г.Ф. Леванова, В.Н. Мазина, С.Ю. Кашников // ЖМЭИ, 2000.- №6.- С.68-70

88. Литвинов, В.И. Нетуберкулезные микобактерии /В.И. Литвинов, М.В. Макаров, М.А. Краснова. М.: МНПЦБТ.- 2008.- 256С.

89. Лотоцкая, Р.А. К вопросу о нетуберкулезных микобактериях и микобактериозе / Р.А. Лотоцкая, Е.Е. Кузнецова, В.М. Саулите и др. // Пробл. туб.- 1979.- №9.- С.58-61

90. Лотоцкая, Р.А. Нетуберкулезные микобактерии и бактериологическая диагностика микобактериоза / Р.А. Лотоцкая, А.К. Зеберга, Л .Я. Илькена // Тез. докл. 10 Всесоюзного съезда фтизиаторов.- Киев.- 1989.- С.87

91. Лысенко, А.П. Стимулятор роста и среда ВКГ для ускоренного выделения микобактерий, культуральные свойства изолируемых культур / А.П. Лысенко, В.В. Власенко, Т.Н. Агеева // Ветеринарная медицина.- 2004.- №6.- С.24-27

92. Майорова, А.А. Видовая идентификация микобактерий методом ПЦР-секвенирования гена 16S rRNA / А.А. Майорова, В.Н. Степаншина, И.Г. Шемякин // Туберкулез сегодня: Материалы 7 Российского съезда фтизиатров,-М.: Бином,- 2003.- С. 111-112

93. Макаревич, Н.М. Атипичные микобактерии: методы идентификации, источники выделения, значение в клинике туберкулеза: Автореф. дисс. доктор мед. наук.- М., 1973.- С.31

94. Макаревич, Н.М. Нетуберкулезные микобактерии, выделенные на некоторых территориях СССР / Н.М. Макаревич, Т.Б. Яблокова, Т.Б. Ильина и др. // Тез. докл. 9 Всесоюзн. съезда фтизиатров.- Кишинев,- 1979.- С. 181-182

95. Макаревич, Н.М. Диагностика заболеваний легких, вызванных нетуберкулезными микобактериями / Н.М. Макаревич, Н.М. Рудой, Р.А. Лотоцкая и др. // Тез. докл. 10 Всесоюзн. съезда фтизиатров.- Киев.- 1986.- С.85

96. Макаревич, Н.М. Пути совершенствования современных методов лабораторной диагностики туберкулеза / Н.М. Макаревич, И.Р. Дорожкова // Бюл. ВИЭВ.- 1983.- Вып.51.- С.24-28

97. Макаревич, Н.М Бактериологическая диагностика туберкулеза и микобактериоза / Н.М. Макаревич, В.И. Голышевская, И.Р. Дорожкова // Тез. докл. зонального совещания.- Новосибирск., 1987.- 53С.

98. Макаревич, Н.М. Совершенствование методов выделения и диагностики кислотоустойчивых микобактерий / Н.М. Макаревич, Я.А. Благодарный, A.M. Кадочкин и др. // Труды ВИЭВ.- М., 1985,- Т.63.- С.26-31

99. Макаревич, Н.М. Диагностика заболеваний легких, вызванных нетуберкулезными микобактериями / Н.М. Макаревич, Н.М. Рудой, Т.Б. Ильина и др. // 10-й Всесоюзный съезд фтизиатров: Тезисы докладов.- Киев,- 1986.-85С.

100. Макарова, М.В. Идентификация M.bovis, M.avium, M.kansasii, M.smegmatis с помощью моноспецифических сывороток: Автореф. дис. канд. биол. наук: 16.00.03 /М.В. Макарова ВИЭВ.- М., 1991.- 23С.

101. Макарова, М.В. Нетуберкулезные микобактерии: классификация, эпидемиология, патология у людей и животных, лабораторная диагностика (обзор литературы) / М.В. Макарова // Проблемы туберкулеза и болезней легких.- 2007.- №10.- С.7-17

102. Макарова, М.В. Специфические антисыворотки к микобактериям (M.bovis, M.avium, M.kansasii, M.smegmatis) /М.В. Макарова, О.А. Калинина, З.Е. Мурзахметова и др // Журн. микробиология, эпидемиология и иммунология. 1993.- №5.- С.3-6

103. Мальков, И.Г. Дифференциация культур микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов с помощью ДНК-зонда / И.Г. Мальков // Ветеринария.- 1993.- №2.- С.52-54

104. Маянский, А.Н. Микобактерии: туберкулез и микобактериозы /А.Н. Маянский.- Нижний Новгород, Нижегородская Госмедакадемия, 2000.- 74С.

105. Мартынова, Е.С. Изучение микобактерий лазерной спектроскопией : Автореф. дисс. канд. вет. наук : 16.00.03 / Е.С. Мартынова; Омский гос. институт вет. медицины.- Омск, 1995.- 21С.

106. Мартма, О.В. Патогенность атипичных микобактерий для морских свинок / О.В. Мартма // Ветеринария.- 1958.- №3.- 21С.

107. Мартма, О.В. Характеристика и патогенность для крупного рогатого скота микобактерий, выделенных из торфа / О.В. Мартма // Ветеринария.-1967.-№6.- С.35-38

108. Мартма, О.В. Об атипичных микобактериях, выделенных из молока коров / О.В. Мартма // Мат. конф. вет. врачей Прибалтийских республик — Рига.- 1968.- С.87-88

109. Мартма, О.В. Определение патогенности атипичных микобактерий при помощи белых мышей и интратестикулярного заражения морских свинок / О.В. Мартма // В сб. научных трудов ЭстНИИ животноводства и ветеринарии.-№18.- 1969.- С.5-9

110. Мартма, О.В. Атипичные микобактерии и их диагностическое и эпизоотическое значение при туберкулезе крупного рогатого скота: Автореф. дис. д-ра. вет. наук .- 16.00.03 / О.В. Мартма// Тарту., 1971.- 46С.

111. Мартма, О.В. Наследственная устойчивость семейств коров к микобактериозу / О.В. Мартма // Теоретические и практические вопросы ветеринарии.- Тарту.- 1978.- С. 186-188

112. Мартма, О.В. О возбудителях и течении микобактериоза / О.В. Мартма, К.К. Тяхнас // В кн.: Туберкулез крупного рогатого скота и меры борьбы с ним.-Новосибирск.- 1986.- С.78-82

113. Мартма, О.В. О патоморфологических изменениях у лабораторных животных, зараженных атипичными микобактериями / О.В. Мартма, Э.Э. Лепп // В кн.: Теоретические и практические вопросы ветеринарии. Тарту, 1983.-Т.2.- С. 16-20

114. Мартма, О.В. Наследственная устойчивость семейств коров к микобактериозу /О.В. Мартма // В кн.: Теоретические и практические вопросы ветеринарии.- Тарту.- 1978.- С.186-187

115. Мартма, О.В. Современное состояние проблемы атипичных микобактерий / О.В. Мартма//Ветеринария.- 1982.- №5.- С.22-24

116. Мартма, О.В. Этиология (туберкулеза) / О.В. Мартма // Туберкулез животных и меры борьбы с ним. Под ред. д.в.н. Ю.Я. Кассича. Киев, Урожай,-1990.- С.5-27

117. Мартма, О.В. Классификация микобактерий / О.В. Мартма, Н.П. Овдиенко, А.В. Ткачев-Кузьмин // Туберкулез сельскохозяйственных животных.- М.: Агропромиздан,- 1991.- С.9-17

118. Мартма, О.В. Патогенность и вирулентность различных видов микобактерий / О.В. Мартма, Н.П. Овдиенко, А.В. Ткачев-Кузьмин // Туберкулез сельскохозяйственных животных.- М.: Агропромиздат,- 1991.-С.28-32

119. Методические рекомендации по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных.- М.: ВАСХНИЛ.- 1992.- 56С.

120. Методические рекомендации. Новые методы исследования возбудителей антропозоонозов. Туберкулез /Сисячин П.Н., Лазовская А.Л., Воробьева З.Г., Слинина К.Н., Ильина Е.А. //Россельхозакадемия.- М.- 2003,- 48С.

121. Методические указания по диагностике туберкулеза животных.- М.: МСХ СССР.- 1976.- 44С.

122. Методические рекомендации. Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами. /М.А. Краснова, Г.Е. Фреймон // Департамент здравоохранения г. Москвы.- М.- 2009.-22С.

123. Микобактерии // В: Определитель бактерий БЕРДЖИ / Д. Хоулт, Н. Криг, П. Снит, Дж. Стейл, С. Уильяме ,- М.: "Мир",- 1997.- Т.2.- С.606-612

124. Михайлова, К.И. Дикие птицы- носители микобактерий туберкулеза / К.И. Михайлова// Ветеринария.- 1972.- №8.- 72С.

125. Модель, Л.М. Биология туберкулезных микобактерий и иммунобиология туберкулеза: Монография / Л.М. Модель 2-е изд., перераб.- М.: Мадгиз, 1958.-316С.

126. Многотомное руководство по туберкулезу. В 4 т. Т.1 Общие проблемы туберкулеза / Ред: тома: B.JT. Эйнис, А.И. Струков; Редак: Бунина Б.З., Драбкина P.O., Клебанова А.А. и др.- М.: Медги.- 672С.

127. Мокроусов, И.В. ПЦР-риботипирование и идентификация видов микобактерий / И.В. Мокроусов, О.В. Нарвская, Т.В. Оттен, Б.И. Вишневский // Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза: Сб. науч. трудов.-СПб., 1998.- С.24-28

128. Медведева, Т.В. Генотипирование штаммов М. tuberculosis, циркулирующих на территории Восточной Сибири / Т.В. Медведева, О.Б. Огарков, О.М. Некипелов и др. // Туберкулез сегодня: Материалы 7 Российского съезда фтизиатров,- М.: Бином,- 2003.- 113С.

129. Найманов, А.Х. Полимеразная цепная реакция при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, Н.П. Овдиенко, Е.П. Осипова и др. // Ветеринарная патология.- 2004.- № 1-2(9).- С.96-99

130. Наставление по диагностике туберкулеза животных.- М., 1986.- 43С.

131. Наставление по диагностике туберкулеза животных.- М., 2002.- 63С.

132. Нестеренко, О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина // .- Киев, 1985.- 342С.

133. Нечваль, И.Т. Изучение микобактерий, выделенных от свиней / И.Т. Нечваль, Н.П. Ляшенко, A.M. Кадочкин // Ветеринария. 1979.- № 7.- С.26-27

134. Нечваль, И.Т. Эпизоотология и диагностика туберкулеза свиней и совершенствование мер борьбы с этим заболеванием / И.Т. Нечваль, В. Д. Свиридов // Мат. всесоюзн. научн. конф., ВАСХНИЛ.- Омск, 1980.- С. 159-161

135. Нечваль, И.Т. Туберкулез свиней: диагностика и меры борьбы. / И.Т. Нечваль//Ветеринария,- 1982,-№6.- С.31-34

136. Нуратинов, Р.А. Характеристика бактерий родов Mycobacterium, Rhodococcus и Nocardia, изолированных из объектов внешней среды в Республике Дагестан / Р.А. Нуратинов, М.М. Халиманов // ЖМЭИ.- 2004.- №5.-С.103-105

137. Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе. Приказ Минздрава СССР №558 от 8 июня 1978г.- М., 1978.- 72С.

138. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации. Приказ Минздрава РФ от 21 марта 2003г. №109.- М., 2003.- С.31-55

139. Обухов, И.Л. Усовершенствование коммерческих ПЦР-тест-систем для диагностики туберкулеза животных / И.Л. Обухов, Н.К. Букова, О.В. Клименкова // Ветеринарная патология.- 2004.- №1-2(9).- С.94-95

140. Овдиенко, Н.П. Выделение микобактерий и чувствительность крупного рогатого скота к туберкулинам / Н.П. Овдиенко // Ветеринария.- 1989.- №9.-С.26-28

141. Овдиенко, Н.П. Видовая принадлежность микобактерий, выделяемых от крупного рогатого скота и из объектов внешней среды / Н.П. Овдиенко, В.И. Косенко, А.Х. Найманов и др. // Пробл. туб.- 1990.- №2.- С.46-48

142. Овдиенко, Н.П. О патогенности атипичных микобактерий для лабораторных животных / Н.П. Овдиенко, В.И. Косенко, Н.Г. Толстенко и др // Ветеринарная патология.- №1-2(9).- 2004.- С. 150-153

143. Овдиенко, Н.П. Идентификация различных видов микобактерий методом иммуноферментного анализа /Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, М.В. Головченко и др.//Инфекционная патология животных: Сб. науч. тр./ВНИИБТЖ.-Омск, 2001-Юбил. вып.-С. 171-172.

144. Овдиенко, Н.П. Никакого перемирия в борьбе с туберкулезом /Овдиенко Н.П., Найманов А.Х., Ведерников В.А. // Ветеринарная газета.- 2002.- №6.- С.4-5

145. Околелов, В.И. Новые физико-химические методы и способы их применения в ветеринарии: Автореф. дисс. докт. вет. наук: 16.00.03 / В.И. Околелов; ИЭВСДВ.- Новосибирск, 1997.-46С.

146. Определитель бактерий Берджи.-9-е изд .-В 2т.-М.: Мир, 1997. С. 606-612.

147. Оттен, Т.Ф. Проблема микобактериальных микстов- микобактериоз и туберкулез / Т.Ф. Оттен, А.В. Зайцев, Н.С. Соловьева // Проблемы туберкулеза и болезни легких.- 2005.- №6.- С.58-62

148. Оттен, Т.Ф. Микобактериоз / Т.Ф. Оттен, А.В. Васильев.- СПб: Медицинская пресса, 2005.- 224С.

149. Оттен, Т.Ф. Характеристика нетуберкулезных микобактерий -потенциальных заболеваний человека /Т.Ф. Оттен // Пробл. туб.- 1994. №3.-С.56-59.

150. Оттен, Т.Ф. Методы ускоренной бактериологической идентификации нетуберкулезных микобактерий /Т.Ф. Оттен // Туберкулез и экология.- 1997.-№2.-С.29-31.

151. Оттен, Т.Ф. Возможности и перспектива бактериологической диагностики микобактериоза /Т.Ф. Оттен, И.В. Мокроусов, О.В. Нарвская, Б.И. Вишневский //Туберкулез сегодня. Материалы 7 Российского съезда фтизиатров.- М., 2003.-С.90.

152. Оттен, Т.Ф. Возможности и перспективы бактериологической диагностики микобактериоза. /Т.Ф. Оттен, И.В. Мокроусов, О.В. Нарвская и др. //Пробл. туб.-2004.-№5.-С.32-35.

153. Осипова, Е.П. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации микобактерий и ее диагностическая значимость при туберкулезе крупного рогатого скота : Автореф. дис. канд. биол. наук : 16.00.03 / Е.П. Осипова // ВИЭВ.- М., 2004.- С.21

154. Пинчук, JI.M. Липиды в таксономии и идентификация микобактерий /Л.М. Пинчук, А.Л. Лазовская. Горький.-1989.-126С.

155. Полетаев, С.Д. Атипичные микобактерии и микобактериозы: Учебное пособие/С.Д. Полетаев.-М.: ЦОЛИУВ, 1978.- 15С.

156. Полетаев, С.Д. Туберкулез и лепра. /С.Д. Полетаев, В.Н. Погорелов.-М.: Медицина, 1986.-128С.

157. Пинчук, JI.M. Идентификация вида микобактерий методом газожидкостной хроматографии /JI.M. Пинчук, A.JI. Лазовская, О.Ф. Рачкова // Пробл. туберкулеза.-1990.-№3.-С.36-41.

158. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных.-М.-1978.-11С.

159. Рабухин, А.Е. Микобактериоз, вызванный М. fortuitum / А.Е. Рабухин, Н.М. Макаревич, Д.Я. Баканова // Пробл. туб.-1972.-№ 10.-53С.

160. Розанов, Н.И. Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных /Н.И. Розанов.- М., "Сельхозгиз", 1952.- 508С.

161. Свиридов, В.Д. Роль микобактерий птичьего вида в эпизоотическом процессе. /В.Д. Свиридов //Междун. конф. Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы.- Харьков, -1995.- С.68-70.

162. Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов: Справочник /М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Федотов; Под ред. М.А. Сидорова.- М.: Колос, 1995.-319С.

163. Скородумов, Д.И. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных /Д.И. Скородумов, В.В. Субботин, М.А. Сидоров, Т.С. Костенко. М.: "Изографъ".- 2005.-654С.

164. Скрягина, Е.М. Выявления микобактерий туберкулеза различными методами /Е.М. Скрягина, О.М. Залуцкая, А. Рот и др. //Проблемы туберкулеза.- 2001.- №3.- С.56-57.

165. Степаншина, В.И. Идентификация нетуберкулезных микобактерий с помощью молекулярно-биологических тестов /В.И. Степаншина, О.Ю. Манзенюк, И.Г. Шемякин, О.В. Коробова // ЖМЭИ, 2000,- № 6.- С.61-65.

166. Стериопуло, С.С. О туберкулезных бациллах и других кислото и спиртоустойчивых бациллах и о их взаимном соотнашении.- Дис. М., 1908.-765С.

167. Скотникова, О.И. Молекулярно-биологические методы во фтизиатрии /О.И. Скотникова// Проблемы туберкулеза и болезней легких.- 2005.-№ 8.- С.5-10.

168. Судаков, М.П. Роль микобактерий комплекса авиум интрацеллюляре в этиологии микобактериозов // Тез. докл. 11 респ. конф. Эстонской ССР по фтизиатрии и пульмонологии.- Таллин,- 1988.- С.112-113.

169. Татаринов, А.П. Ультрафиолетовая резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния и ее применение для идентификации микобактерий: Автореф. дисс. канд. физико-математических наук: 03.00.02. / А.П. Татаринов; МГУ.- М., 1993.- 20С.

170. Тебекин, А.Б. Применение бумажных индикаторов для идентификации микобактерий /А.Б. Тебекин, A.JI. Лазовская, Г.Н. Ладыкина // Пробл. туберкулеза. М. Медицина. 1997.- №12.- С.68-71.

171. Ткачев-Кузьмин, А.В. Роль некоторых видов атипичных микобактерий в сенсибилизации крупного рогатого скота к туберкулину /А.В. Ткачев-Кузьмин: // Бюллетень ВИЭВ.- М.,-1981.- № 43.- С.27-29.

172. Ткачев, А.В. Серологическая идентификация атипичных скотохромогенных микобактерий / А.В. Ткачев, A.M. Кадочкин // Бюллетень ВИЭВ.- 1983.- № 50,- С.24-25.

173. Толстенко, Н.Г. Экспериментальное изучение патогенности атипичных микобактерий. /Н.Г. Толстенко, Н.П. Овдиенко, В.И. Косенко и др. / Тезисы докладов // 12 съезд фтизиатров.- Саратов,- 1994.- 234С.

174. Толстенко, Н.Г Патогенные свойства некоторых видов микобактерий, выделенных от животных и объектов внешней среды: Автореф. дис. канд. ветнаук: 16.00.03 /Н.Г. Толстенко; Всерос. научно-исслед. институт экспер. ветеринарии.- М., 2006.-27С.

175. Тырина, B.C. Микобактерии птичьего типа, выделенные от крупного рогатого скота и овец, их свойства и идентификация./В.С. Тырина.//Доклады ВАСХНИЛ.-1968.-№10.-С.34-35.

176. Тырина, B.C. Сравнительное изучение различных групп кислотоустойчивых микобактерий и методов их дифференциации: Автореф.дисс.канд.биол.наук: 03.096/B.C. Тырина; ВИЭВ. М.,-1969.-20С.

177. Туберкулез сельскохозяйственных животных: Монография /В.И. Ротов, П.И. Кокуричев, П.Е. Савченко, Ю.А. Грач; Под. ред. В.И. Ротова.-2-е изд., дополн. и перераб.- Киев,: Урожай, 1978.-240С.

178. Туберкулез органов дыхания: Руководство для врачей /А.Г. Хоменко, М.М. Авербах, А.В. Александрова и др.; Под. ред. А.Г. Хоменко.-2-е изд., перераб. и доп.-М.: Медицина, 1988,-576С.

179. Тузова, Р.В. Туберкулез сельскохозяйственных животных и птиц /Р.В. Тузова.- Минск: "Урожай", 1983.-264С.

180. Тунгусова, О.С. Молекулярная генетика микобактерий туберкулеза /О.С. Тунгусова, А.О. Марьяндышев // Проблемы туберкулеза и болезней легких.-2003.-№2.-С.43-45.

181. Турланов, К.М. Видовая принадлежность микобактерий, выделенных в условиях мясо-молочных предприятий /К.М. Турланов, Э.В. Сидоркина // Вопросы взаимосвязи туберкулеза человека и животных.-Алма-Ата.-1981.1. С.174-179.

182. Туркебаева, К.А. Патанатомия туберкулеза млекопитающих и виды микобактерий./К.А. Туркебаева, Я.А. Благодарный/-Алма-Ата: Кайнар, 1981.С.118-221.

183. Туркебаева, К.А. Роль атипичных микобактерий в патанатомии туберкулеза./ К.А. Туркебаева/ В кн.: Современные вопросы эпидемиологии выявления туберкулеза.-Алма-Ата, 1979.-С.70-73.

184. Тюри Э.И. Патогенность различных микобактерий для морских свинок при интратестикулярном и подкожном заражении/Э.И. Тюри, М.Э. Тюри //Проблемы туберкулеза.- 1964.-№10.- С.74-79.

185. Тюри, Э.И. Способ интратестикулярного заражения морских свинок и применения его при определении патогенности атипичных микобактерий.: Автореф. дисс.канд. мед. Наук:/Э.И. Тюри,- Тарту, 1966.- 18С.

186. Тяхнас, К.К. О наличии атипичных микобактерий в молоке/К.К. Тяхнас // Ветеринария. Таллин, 1970.-10С.

187. Тяхнас, К.К. Изучение парааллергических туберкулиновых реакций и вызывающих их атипичных микобактерий у молодняка крупного рогатого скота: Автореф. дисс.д-ра ветнаук : 16.00.03 /К.К. Тяхнас;-Таллин, 1975.-37С.

188. Тяхнас, К.К. Результаты идентификации изолированных от крупного рогатого скота атипичных микобактерий //К.К. Тяхнас.-Таллин.-1978.-69С.

189. Фадеева, Н.И. Белковый спектр микобактерий в зависимости от их таксономической принадлежности и устойчивости к противотуберкулезным препаратам /Н.И. Фадеева, В.И. Голышевская, Е.А. Бибергаль, С.Г. Сафонова //Пробл. туб.-1991.-№6.-С.65-68.

190. Финкель, Е.А. Биологический метод исследований при туберкулезе /Е.А. Финкель, JI.B. Михайлова.-Фрунзе: "Кыргыстан", 1976.-160С.

191. Хоменко, А.Г. Опыт коллективного изучения нетуберкулезных микобактерий /А.Г. Хоменко, Н.М. Макаревич, М. Кубин и др. //Проблемы туберкулеза.-1981.-№8.-С.62-66.

192. Хоменко, А.Г. Современные представления о строении микобактерий туберкулеза /А.Г. Хоменко, В.В. Ерохин //ЖМЭИ,-1982.-№12.-С.ЗЗ-40.

193. Шагинян, И.А. Исследование геномного полиморфеума шт. M.tuberculosis /И.А. Шагинян, JT.H. Нестеренко, Т.Гришина и др. //ЖМЭИ, 1996,-№3.-С.65-68.

194. Шаров, А.Н. Полимеразная цепная реакция при диагностике туберкулеза /А.Н. Шаров, И.П. Суханов, Л.А. Ерошенко //Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России.-М.-1999.-Т.1.-188С.

195. Шаров, А.Н. ПЦР при диагностике туберкулеза /А.Н. Шаров, Л.А. Ерошенко, И.П. Суханов и др. //Ветеринария.-2000.-№10.-С. 19-22.

196. Шаров, А.Н. ПЦР при диагностике туберкулеза /А.Н. Шаров, Л.А. Ерошенко, И.П. Суханов, С.Л. Кальнов и др. //БИО.-2002.-№12.-С.29-30.

197. Шаров, А.Н. Проблемы ПЦР-диагностики туберкулеза /А.Н. Шаров //Ветеринарный консультант.-2003.-№21-22.-С. 14-15.

198. Шемякин, И.Г. Использование молекулярно-биологических методов для индивидуальной характеристики штаммов M.tuberculosis /И.Г. Шемякин //ЖМЭИ, 2000,-№2.-С.6-9.

199. Шемякин, И.Г. Генетические особенности современных микобактерий туберкулезного комплекса /И.Г. Шемякин, В.Н. Степаншина // Журн. микробиол.-2006,-№6.-С.71-76.

200. Шоршнев, В.И. Изучение кислотоустойчивых бактерий, выделенных из неиспользованного подстилочного торфа/В.И. Шоршнев //Ветеринария.-1965.-№10.-С.41-43.

201. Щуревский, В.Е. Атипичные микобактерии и их патогенность для сельскохозяйственных животных /В.Е. Щуревский, Н.П. Овдиенко, A.M. Кадочкин //Ветеринария.-1978.-№4.-С.32-35.

202. Щуревский, В.Е. Быстрорастущие атипичные микобактерии и их значение в патологии крупного рогатого скота /В.Е. Щуревский, Н.П. Овдиенко, A.M. Кадочкин, В.И. Кудяков //Ветеринария.-1984.-№9.-С.29-30.

203. Юдин, Г.А. Методы дифференциации и сенсибилизирующие свойства различных штаммов микобактерий /Г.А. Юдин //Ветеринария.-1966.-№5.-С. 1013.

204. Юдин, Г.А. Патогенные свойства кислотоупорных сапрофитов, выделенных от реагирующих на туберкулин животных ГГ.А. Юдин, А.В. Акулов, З.С. Земскова//Пробл. тубер.-1968.-№6.-С.60-64.

205. Якушева, О.В. Оценка патологоанатомических изменений у лабораторных животных при определении вида микобактерий туберкулеза /О.В. Якушева, В.Е. Щуревский, Н.П. Овдиенко, В.А. Шаров //Бюлл. ВИЭВ.-В.44.-М.-1981.-С.32-35.

206. Ященко, Т.Н. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе /Т.Н. Ященко, И.С. Мечева//М.: "Медицина", 1973.-260С.

207. Ayele, W.Y. Mikobakterium avium subspecies Paratuberculosis cultured from locally and commercially pasteurized cows milk in the Czech Republik. /Ayele, W.Y., Svastova. P., Roubae P et al. //Appl. Erviron. Microb., 2005, 71,3, 1210-1214.

208. Agasino, C., de Leon P., Jasmer R. // Jnt. J. Tuberc. Lung Dis.-1998.-Vol. 2.-P.518-520/

209. Balars, D., Cosocaru R., Damian H.// Jnt. J. Tuberc. Long Dis.- 1999.- Vol.3.-P.13-16.

210. Batler, W. Mycolic acid analysis by high performance liguid chromatography for identification of Mycobacterium species /Batler W., Guthertz L. //Clin. Microbiol. Rev.- 2001.-Vol. 14,- P.704-726.

211. Beerwerth, W. Zur Okologie der Mykobacterien. Zbl. Bacteriol. Parasitenkunde. Infektionskrankh. Hyg./W. Beerwerth, J. Schurmann // J. Abb. Orig.-211.-1969.-1-S.58-69.

212. Beerwerth, W. Zur epizootologischen Bedeutung der Sagemehleinstren fur das Auftreten der Schweinetuberkulose /W. Beerwerth, K.Popp //Zbl. Veter.-Med.-(West)- Berlin.-1971.-18.-8.-S.634-645.

213. Bergeys Manual of determinative bacteriology.- Baltimore, Williams and Wilkins, 1974, 8 ed.-1246 P.

214. Castelnuovo, J., Yamanaka, Y., Loppis, M. Dott, E. // Tubercle.- 1962.- Vol. 50,-№2 .-P. 194-202.

215. Chapman, J. The Ecology of the Atipical Mycobacteria /J. Chapman., M. Dallas//Arch. Environ. Health.- 1971.-22.-1.-41-46.

216. Chatterjee, K.R. Life cycle of Mycobacterium leprae./ K.R. Chatterjee.-Lepsosy in Jndia, 1980.- Vol. 52.- №3.- P. 267-275.

217. Collins, D.M. DNA restriction endonuclease analysis of M. bovis and other membes of the tuberculosis compleso /Collins D.M., De Lisle G.W. //Clin. Microbiol., -1985,-21,- №4.- P.562-564.

218. Cole, S.T. Comparative and functional qenomics of the Mycobacterium tuberculosis complex./ Cole S.T. //Microbiology.- 2002;- 148 (10).-P. 2919-2928.

219. Cole, S. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genom seguence /S. Cole, R. Brosch, J. Parkhill et al. // Nature.- 1998.- V. 393.-P. 537-544.

220. Cobb, A.J. The Gro E S antigens of Mycobacterium avium and Mycobacterium paratuberculosis /Cobb A.J., Frothingham R. //Veter. Microbiol.-1999.- Vol. 67, №1.- P.31-35.

221. Cole, S., Barell B. //Nature.- 1998.- Vol. 393.- P.537-544. Cousins, D.V., Williams S.N., Ross B.C., Ellis T.M. //Vet. Microbiol.- 1993.- Vol. 37.- P. 1-17.

222. Cole, S.T. Learning from the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. /Cole S.T. //FEBS Lett.- 1999.- 452 (1-2): 7- P.7-10.

223. Collins, M.D. Lipids in the classification and identification of corineform bacteria containing peptidoglicans based on 2,4 diaminobutyric acid /M.D. Collins, D.Jones // Z. Appl. Bacteriol.- 1980.- 48.- №3.- P.459-470.

224. Crow, H.A limited clinical, pathologic and epidemiologic study of patients with pulmonary lesions associated with atypical acid-fast bacilli in the sputum / Crow H., King C., Smith E. et al. //Am. Rev. Tuberc.- 1957.- Vol. 75.- P.2492-2496.

225. Crowle, A.J. Jntracellulare killing of mycobacteria (Crowle A.J. //Res. Microbiol.- 1990.- Vol.-141,- №2.- P.231-236.

226. Damiel, T.M., Balestrino, C.C. et al. //Amer. Rev. resp. Dis.-1982.- Vol. 126.-P.600-606.

227. Davis, B.J //Am. N.Y. Acad. Sci.- 1964.- Vol. 121.- P.404-409.

228. Davidson, P.T. The diagnosis and management of disease caused by M .avium complex, M. kansasii, and other mycobacteria /Davidson P.T //Clin. Chest. Med.-1989.- Vol. 10, №3.- P.431-443.

229. Dawson, D. Mycobacterial terminology / Dawson D. //J. Clin. Microbiol.-2000.- Vol. 38.-P.3935.

230. Denis, Ch. Infection pulmanarire due a une mycobacterie rare Mycobacterium malmoense /Denis Ch., Saltel J.C., Choffel Ce., Baufine-Ducrocq H.// Rev. Malad. Respire.-1987.-Vol. 4,8, №3.- P.133-135.

231. Deveze, B. Generalites sur les mycobacteries de lenvironnement /B.Deveze// Eurobiologiste.-1998.-Vol. 32.- N233.-P.31-32.

232. Douglas J.G Mycobacterium gordonae: A new pathogen / Douglas J.G., Calder M.A.// Thorax.-1986.- Vol. 41, №2.- P.152-153.

233. Devulder, В. Микобактериозы человекаб клинические формы и лечение: / Devulder В., Debryne J. Tacquet A., Gernez-Rieu Ch. // Тр. 21-й Международный конф. по туберкулезу.-М., 1972.-С.135-143.

234. De Riemer К. Tuberculosis transmission based on molecular epidemiologic research / De Riemer K., Daley Ch. // Seminars in respiratory and critical med.-2004.- Vol. 24, №3.- P.297-306.

235. Eilertsen, E. Atypical Mycobacteria and reservoir in water / E. Eilertsen //Scand. J. resp. Dis.- 1970.- Suppl.- 69.-S. 85-88.

236. Ellner J., Goldberger M., Parenti D. Mycobacterium avium infectio and AIDS: a therapeutic dilemma in repid evolution // J. infect. Dis.- 1991.- Vol.163.- P.1326-1336.

237. Fisanotti, G.C. Molecular epidemiology of M.bovis isolates from South America / Fisanotti G.C. // Veter. Microbiol., 1998,-60.- №2/4.- P.251-257.

238. Field, S., Lung disease due to the more common nontuberculons mycobacteria / Field S., Cowie R.// Chest.- 2006.- Vol.129.- P. 1653-1672.

239. France, A.J. Mycobacterium mamoense infections in Scotland on increased problem / France A.J // Thorax.-1987.- Vol. 42, №8.- P.593-595.

240. Godlee, F. // Br. Med.J.- 1993.- Vol. 306.- №6886.- P.l. 147-1147.

241. Goodfellow, M. The genera Nocardia and Rhodococcus \ M. Goodfellow, D.E. Minikin \\ The prokaryotes.- Berlin.- 1981.- P.2016-2027.

242. Goodfellow, M. Taxonomy and of mycobacteria / M. Goodfellow, L.G. Wayne // In: The biology of mycobacteria.-V.l.- Academic Press.- 1982.- London New York.

243. Grande, J.M. Mycobacterium avium // Europ. J. Respir. Dis., 1984, 65,6, 399401.

244. Grande, J.M.A. A fluorigenic substrate for the rapid differentiation of Mycobacterium fortuitum from Mycobacterium chelonei on the basis of heat ctable esterase activity. / Grande J.M.A // Tubercle,- 1977,-58,- №3,- P. 147-150.

245. Grande, J.M. Incidence and nature of human tuberculosis due to Mycobacterium africanum in South-East England: 1977-87 / Grande, J.M., Yates M.D // Epidemiol and Jnfec.- 1989.- 103, № 1 -C. 127-132.

246. Grande, J. Leprosy of the past and today / Grande J., Lethaby J. //Seminars in respiratory and critical med.- 2004.- Vol. 24, № 3.- P.271-282.

247. Gross, W.H. Nucleic acid homology in the genus Mycobacteria / W.H. Gross, L.G. Wayne // J. Bacterid.- 1970.- Vol.104.- P.630-634.

248. Heifets, L. Mycobacterial infections caused by nontuberculous mycobacteria / Heifets L. // Semin. Respir. Crit. Care Med.- 2004.- Vol. 25.- P.283-295.

249. Heifets, L. Choice of antimicrobial agents for M. avium disease based on guantitative tests of drug susceptibility / Heifets L., Jseman M. // N. Engl. J. Med.-1990.- Vol. 323,- P.419.

250. Hettick, J. Proteomic profiling of nitact mycobacteria by matrix assisted laser desorplion / ionization time - of - flight mass spectrometry / Hettick J. // Anal. Chem.- 2004.- Vol.76.- P.5769-5776.

251. Jenkins, P.A. Infections with Mycobacterium malmoense in England and Wales. / Jenkins P.A., Tsukamura M. // Tubercle.- 1979.- Vol. 60.- P.71-76.

252. Jenkins, P.A. Nontuberculous mycobacteria and disease / Jenkins P.A. // Europ. J. resp. Dis.-1981.- Vol.62.- P.69-71.

253. Joubert, L. Diagnostic differential bacterioimmunologi des mycobacteries an laboratoire / Joubert L., Prave M. //Jnform. Techn. Serv. Veter.- 1975.- №49/50.-P.47-53.

254. Kantor, Z. Tuberculows infection in cattle not detected by slanghterhonse inspection /Kantor Z., A.Nader., A. Bernardelli, D.O.Giron, E. Man // J. Vet. Med.-1987.- Vol. 34.- №3.-P.202-205.

255. Katoch, V. Atipical mycobacterial infections. / Katoch V., Kumar M. // Tuberculosis / Ed. L. Sharma.- New. Delhi, 2001.- P.439-451.

256. Katoch, V. Infection due to non tuberculous mycobacteria (NTM) / Katoch V. // Indian . Med. Res.- 2004.- Vol. 120.- P. 290-304.

257. Karlson, A.G. Mycobacterium avium in tuberculous adenitis of swine / Karlson A.G., Thoen C.O.// Amer. J. vet. Res.- 1971.-Vol. 32, n.8.- P.1257-1261.

258. Kazda, I. Atypische mykobacterien im Trinkwasser die Ursache von paraallergien gegenuber Tuberkulin bei Tieren / I. Kazda // Z. Tiberk.- 1967.- 127.-P.lll-113.

259. Kearns, A.M. Rapid of Mycobacterium bovis BCG by the detection of the RD1 deletion using a multiplex PCR technique / A.M. Kearns, S.G. Magee, A. Gennery et al. // J. Clin. Microbiol.- 1999.- P.566-569.

260. Kent, P. Public Health Mycobacteriology (A Guide for the Level 3 Laboratory) / Kent P., Kubica G.- Atlanta, 1985.

261. Koch, R. Aetiologie der tuberculose / Koch. R // Berlin. Klin. Wschr.- 1882,-P.15.

262. Kappler, W. Эпидемиология легочных заболеваний, вызванных атипичными микобактериями / Kappler W., Kzebs A., Konetzke G. W., Fisher P. // Тр. 21-й Междунар. конф. по туберкулезу.- М.,- 1971.- С.143-145.

263. Коппо, К. Классификация и идентификация атипичных микобактерий / Коппо К//Тр. 21-й Междунар. конф. по туберкулезу.-М., 1971.- С.255-257.

264. Kubica, G.P. Classification and nomenclature of the mycobacteria. // Kubica G.P. // Ann. mycrobiol. 1978.- A129.- №1,- P.7-12.

265. Lewis, A. A clinical study of the chronic lung disease due to nonphofochromogenic acid-fast bacilli / Lewis A., Lasche E., Armstrong A. et al. // Ann. Jntern. Med.- I960.- Vol.53.- P.273-285.

266. London, R.D., Mycobacterium gordonae: an unusual peritoneal pathogen in a patient undergoing continuous ambulatory peritoneal dialysis / London R.D., Damsker В., Neibart E.P. et al. // Amer. J. Med.- 1988.- Vol. 85.- P.703-704.

267. Методы общей бактериологии: В Зт. Т.З. Систематика / Под. ред. Ф. Герхардта и др., Перевод с англ. под. ред. Е.Н. Кондратьевой и JI.B. Калуцкого.-М: Мир. 1984.- ЗТ.- С.5-7.

268. Мир микробов: в Зт Т.З. Классификация бактерий / Стейниер. Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Пер. с англ. под ред. Е.Н. Кондратьевой, С.В. Шестаковой.-М: Мир., 1979.- С.5-38.

269. Mokrousov J., Otten Т., Vyazoaya A. et al. // Eur. J. Clin Microbiol. Infect. Dis.- 2003.-Vol. 22,- P.342-348.

270. Mullis, K.B., Faloona F.A. // Meth. Enzymol.- 1987.- Vol. 155.- P.335-350.

271. Paterson, А.В. The incidence and causes of tuberculin reactions in nontuberculosis cattle.- Fortschrette der Tuberculose forschung. 1956. 7. 101.

272. Paterson, A.B. The tuberculin test in tuberculosis free cattle.- Prac. R. Soc. Med. 1957. 60. 4. 23.

273. Paull, A. An environmental study of the opportunist mycobacteria / A. Paull // Medical Laboratory Technology,- 1973.-30.-1.-11-19.

274. Peterson, K. Mycobacterium fortuitum as a cause of bovine mastitis: tuberculin sensitivity following experimental infections /К. Petercon //.- J. Am. Vet. Med. Assoc.- 1965.- 147.- 12.- 1600-1607.

275. Petitprez, A. Aspect intrastureral de Mycobacterium phlei / A. Petitprez., Ph. Roos, A. Taguet//J. Microscop.- 1967.- V. 6,- N2.- P.229-232.

276. Pizzini, D.L. Tuberkelbacillen in den Lymphdrusen NichttuberkuloserA Pizzini, D.L.W Zeitschrift fur Kl. Medicin. 1892. Bd. 21, H 3-4. S 329-342.

277. Popovic, M. Eksperimentalna tuberculoza svinja / Popovic M. // Veter. Glasnik.-1975.- Vol. 29, №3.- P.173-182.

278. Peterson, K. Mycobacterium fortuitum as a cause of bovine mastitis tuberculin sensitivity following experimental infection / Peterson K. // J. Amer. Vet. Med. Assoc.- 1965.- 147, 12.- P.1600-1607.

279. Public Health Mycobacteriology. A Guide for the Level 2 Laboratory. Centers for Disease Control.- Athanta, 1985.- P.207.

280. Ratledce, C. Mycobacterium / Ratledce C., Stanford J. // The Biology of the Mycobacteria.- London, New York: Academic Press, 1983.- P.371-393.

281. Retzlaff, N. Untezsuchungen zuz Morphologie der durch Mykobacterien hervegerufenen Lymphkno tenveranderungen des Schweines / Retzlaff N. // Schlacht Viehhof-Ztg.- 1971.- Bd. 71, n.9.- S.348-350.

282. Roberts, M.C. Whole chromosomal DNA probes for rapid identification of M. tuberculosis and M. avium complex / M.C. Roberts, C. Mc Millan, M.B. Coyb,\\ J.Clin Microbiol.- 1987.- V.25.- №7.- P.1237-1243.

283. Romero, R.E. Identification of Mycobacterium bovis in bovine clinical somples by PCR species-specific primers / R.E. Romero, D.L. Garzon, G. A. Mejia // Can. J. Res.- 1999.- P.101-106.

284. Runyon, E.H. Mycobacterium /Е.Н. Runyon, A.G. Karlson, G.P. Kubica.-Jn.: Manual of clinical microbiology. 2 hd. ed II Amer. Soc. Microbiol., 1981.- P. 150179.

285. Sampson, S.L. Disruption of coding regions by IS 6110 insertion in M. tuberculosis / Sampson S.L., Warren R.M., Richardson M. // Tubercle and Lung Disease, -1999,- 79, №6.-P.349-359.

286. Schaefer, W.B. Pathogenicity of transparent opague and rough variants of Mycobacterium avium in ckickens and mice. / Schaefe W.B., Davis C.L., Colm M.L // Amer. Rev. resp. Dis.- 1970,-Vol. 102.- P.499-506.

287. Schlisser, Th. Atypische Mykobakterien bei Tieren L. Tuberk., 1967, Vi, 127, 101-108.

288. Schliesser, Th. Die Bedenfung der atypischen skotochrompgenen Mycobacterien fur die Gesundheit von Tier und Mensch / Schliesser Th. // Berl. Munch. Tiearztl. Wschr.- 1968.- 81.-20.-S.407-409.

289. Schliesser, T. Infektionen mit Mycobacterium bovis. Bekampfung und Profylake / T. Schliesser // Handbuch der bakteriellen Infektionen bei Tieren.- Jena.-1985.-5.-S.246-251.

290. Schroder, K. Der Nachweis von Tuberculose bakterin in Untersuchungs-material Vergkich von Kultur and Tierversuch / K. Schroder, M. Topfer // Prac. Pneumol.- 1974.- 28.-7.-S.361-363.

291. Schroder, K.H. Die problematic atypischen mykobakterien \ Schroder, K.H. // Klin. Lab.- 1992.-38, №7, 8, C.345-346 / нем., рез. англ.

292. Schinsky, M.F. Mycobacterium septicum sp. nov., a new rapidly growing species associated with catheter-related bacteriemia / Schinsky M.F., Mc Neil M.M., Whitey A.M. et al. // Int. S. syst. evol. Microbiol.- 2000.- Vol. 50, №2.- P.575-581.

293. Schuls, W. Die Mycobakteriose des Schweines / Schuls W. // Mh. Veter. Med.- 1976.- Bd. 31, №19.- S.747-752.

294. Seeger, I. Vorkommen and Bedeutung atypischer Mykobacterien der Gruppe 2 nach Runyon bei Schweinen, Huhnern and Hunder /1. Seeger // Zbl. I. Abl. Orig.-1959.-210.-4.-S.246-251.

295. Seeger, F. Die Bedeutung der atypischen skotocromogenen Mycobacterien fur die yesimdheit von Nier Mensch / Seeger F. // Berl. Vunh. Tierarztl. Wsohr.- 1986.81, 20.- P.407-409.

296. Shinnik, T.M. Diagnostic mycobacteriology laboratory practices / Shinnik T.M., Good R.C. // Clin, infect. Dis.- 1995.- Vol. 21.- P.291-299.

297. Singer, E. Nonspecific sensibilization to old tuberculin. Mycobacteria in water. / Singer E., Rodda G. // Tuberc.,- 1965,-46,-2,- P.209-213.

298. Sofrenovic, D., Tuberculoza micobacterioza svinja / Sofrenovic D., Matis G. // Veter. Glasmik .-1972.- Vol. 26, n.7.- P.493-497.

299. Stinson, S.C. // Chem. Eng. News.- 1999.- Vol. 77.- №13.- P.36-38.

300. Stuart, P. Bovine mastitis resembling tuberculosis caused by M. lacticola and other rapidly growing acid-fast bacteria / P. Stuart, P., P. Harvey // Vet. Rec.- 1951.63, 52.- P.881-885.

301. Szabo, J., A setes atipusos Mycobacteriumok okozta lymphadeitise. / Szabo J., Tuboly S., Szeky A// Mag. Allatotv. Lap.- 1974.- 29.8.- P.511-515.

302. Tarnok, J. Stoffwechsel dez mycobacterien / Tarnok J. // Mykobakterien und mykobakteriella Krankheiten.- Jena: Veb. Gustow Fischer. Verlag. 1980.- S.41-224.

303. Thorel, M.F. Isolation of Mycobacterium africanum from monkeys. / Thorel M.F. // Tubercle. 1981, №3, 101-104.

304. Timpe, A. The relationship of "atypical" acid fast bacteria to human disease / Timpe A., Runyon E.H. // J. Lab. Clin. Med.- 1954.- № 44.- P.202-209.

305. Vialler, J.G. Epidemiologic der infection rnit atypischen Mycobacterien / Vialler J.G., Jonbert U.E. // Praxis der Pneumologu 1973.- P.272.

306. Василев, B.H. Микобактериозы и микозы легких / В.Н. Васильев -София, 1971.- С.387 (пер. с болгарского)

307. Wayne, L.G. Classification and identification of mycobacteria / Wayne L.G., Doubek J.R., Diaz G.A. // Amer. Rev. resp. Dis., 1967, V. 96,- P.88-95.

308. Wayne, L.G. Таксономические и генетические аспекты мирового распространения атипичных микобактерий. / Wayne L.G // Тр. 21-й Междунар. конф. по туберкулезу.- М.,-1971.- С. 145-147.

309. Wayne, L.G. Mycobacterial taxonomy: a search for discontinuities / Wayne L.G. // Ann. microbial., 1978.- № 1,- P. 13-27.

310. Wayne, L.G. Agents of newly recognized or infreguently encountered mycobacterial diseases / L.G. Wayne., H.A. Sramek // Clin. Microbiol. Rev.- 1992.-Vol. 5., № 1. P. 1-25.

311. Вейсфейлер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичных микобактерий / Ю.К. Вейсфейлер- Будапешт. Академия наук Венгрии.- 1975.- С. 15-19.

312. Wallace, R. Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria / Wallace R., О Brein R., Glassroth J. et al. // Am. Rev. Respir. Dis.-1990.- Vol. 142.- P.940-953.

313. Wallace, R. Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculosus mycobacteria (American Thoracic Society Statement) / Wallace R., Glassrth J., Griffith D. et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med.- 1997,- Vol. 156.- P. 1-25.

314. Weber, A. Zum Nachweis vol soq, atypischen Mycobacterien in Korf und Darmlymphknoten micht taberkulose Schlachtschwein / Weber F., Schliesser T. // Zbl. Vet. Med.- 1974,- Bd. 21, № 10.- S.799-806.

315. Witebsky, F. Identification of mycobacteria by conventional methods. / Witebsky F., Kruszak Filipov P. // Clin. Lab. Med.- 1996.- Vol. 16.- P.569-602.

316. Wolinsky, E. Mycobacteria in soil their relation to disease associated atrains. / Wolinsky E. // Amer. Rev. Resp. Dis.- 1968.- 97.- 1032.

317. Wolinsky, E. Micobacterial diseases other than tuberculosis / Wolinsky E. // Clin. Infect. Dis.- 1992.- Vol. 15.- P.l-12.

318. Wright, W.E., Piatsek A.M., Rainey W.E., Snoy J.W. // Dev. Genet.- 1996.-№ 18.-P. 173-179.

319. Yamamoto, M. Современное состояние вопроса о легочных заболеваниях, вызванных атипичными микобактериями в Японии / Yamamoto М. // Тр. 21-й Междунар. конф. по туберкулезу.- М., 1971.- С.255-257.

320. Yonemary, М. Typing of Mycobacterium avium by various member tandem repeats (VNTR) analysis / Yonemary M., Shirai Т., Nozawa M. et al. // Europ. Respir. J.- 2006.- Vol. 28,- Suppl. 50.- P. 1691.

321. Zorawski, C. Badania and Wystepowa niem pralkow ptasichi atypowych u swin / Zorawski C., Karpinski Т., Skwarek P. // Medycyna weteryjna,- 1974,- № 12,-S.711-714.

322. Zorawski, C. Mycobacterium intracellularae, serotype 8 (Davies), existing in sawdust as a cause of mass infection of pigs / Zorawski C., Karpinski T // Bull. Veter. Inst, in Pulawy.- 1983.- Vol. 26.- P. 1-4.

Информация о работе

Касьянова, Екатерина Александровна
кандидата ветеринарных наук
Москва, 2010
ВАК 06.02.02

Диссертация

Оптимизация комплекса видовой идентификации микобактерий - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы