Современные ПЦР-системы для индикации и идентификации микобактерий и диагностическая значимость полимеразной цепной реакции при туберкулезе крупного рогатого скота

Борисова, Татьяна Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Современные ПЦР-системы для индикации и идентификации микобактерий и диагностическая значимость полимеразной цепной реакции при туберкулезе крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Современные ПЦР-системы для индикации и идентификации микобактерий и диагностическая значимость полимеразной цепной реакции при туберкулезе крупного рогатого скота"

На правах рукописи

Борисова Татьяна Анатольевна

СОВРЕМЕННЫЕ ПЦР-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ И ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.07 - Микробиология

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АВТОРЕФЕРАТ

Казань-2004

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования - «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана».

Научные руководители: - заслуженный деятель науки РФ и РТ,

доктор ветеринарных наук, профессор Хазипов Нариман Залилович

- доктор биологических наук, профессор Иванов Аркадий Васильевич

Официальные оппоненты: - доктор ветеринарных наук, профессор

Алимов Азат Миргасимович

- доктор биологических наук, профессор Багаева Татьяна Вадимовна

Ведущая организация: ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных

г.Омск

Защита состоится «¿¿_у> 2004 г. в «/&> часов на заседании

диссертационного совета Д - 220.012.01 при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте (420075, г. Казань, Научный городок- 2, ВНИВИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (г. Казань).

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, ст. научный сотрудник

В.И. Степанов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время туберкулез крупного рогатого скота занимает ведущее место в структуре инфекционных заболеваний.

Основным методом прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является внутрикожная туберкулиновая проба. Однако в связи с образованием неспецифических или парааллергических реакций на туберкулин возникают сомнения в правильности диагностики туберкулеза и диагностической ценности туберкулина. Не все зараженные возбудителем туберкулеза животные реагируют на внутрикожное введение туберкулина. Оставаясь в стаде, такие животные способны инфицировать внешнюю среду и заразить здоровых животных. Установлено также, что здоровые от туберкулеза животные дают положительную реакцию на введение туберкулина и подвергаются необоснованной сдаче на убой, нанося значительные экономические затраты.

Лабораторная диагностика туберкулеза отличается продолжительностью выполнения и относительно низкой эффективностью. Срок бактериологического исследования составляет 3 месяца. Эффективность бактериологического метода зависит от качества питательных сред, концентрации возбудителя в исследуемом материале, степени загрязненности последнего посторонней микрофлорой и времени, прошедшего с момента заражения животного.

Сравнительно недавно для диагностики инфекционных болезней в ветеринарной практике стали применять метод полимеразной цепной реакции. В России, начиная с 1992 года были созданы отечественные наборы реагентов, предназначенные для определения возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота. Однако, остаются пока открытыми вопросы стандартизации и контроля качества тест-систем. В основе метода тест-систем лежит подготовка проб к проведению ПЦР с использованием метода экстракции ДНК, позволяющий концентрировать препараты ДНК и одновременно очищать их от ингибиторов ПЦР и амплификация специфического участка ДНК микобактерий за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы, с последующей регистрацией результатов реакции гель-электрофорезом.

Для ПЦР-анализа пригодны различные биологические материалы - слизь, моча, мокрота, кровь, сыворотка, молоко, соскобы эпителиальных клеток, кусочки органов, гистологические препараты. ПЦР - метод относится к прямым методам обнаружения возбудителя, позволяющий обнаружить до одной молекулы ДНК в исследуемой пробе, даже когда организм является нежизнеспособным. Результаты исследования можно получить в день проведения анализа.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

¿тещ?

1.2 Цель исследований. Изучение эффективности отечественных тест-систем для выявления и идентификации ДНК микобактерий, при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в неблагополучных и ранее неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, определение роли и места ПЦР-метода для выявления ДНК штамма M.bovis BCG у иммунизированных животных, а также его пригодности для прижизненной и посмертной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и внедрение ПЦР в ветеринарную практику.

1.3 Задачи исследований.

1. Определить пригодность полимеразной цепной реакции для прижизненной и посмертной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота с использованием существующих на сегодняшний день отечественных тест-систем с определением их чувствительности и специфичности.

2. Отработать различные методы подготовки генетического материала для ПЦР и определить наиболее эффективный для использования при выделении ДНК M.bovis.

3. Разработать наиболее информативные и специфичные паймеры для ПЦР, проанализировать их эффективность по сравнению с существующими рекомендованными праймерами.

4. Определить пригодность полимеразной цепной реакции для установления сроков выявления ДНК вакцинного штамма Мbovis BCG у иммунизированных животных.

5. Проводить системное исследование биологического материала от животных, положительно реагирующих на внутрикожное введение туберкулина из благополучных и ранее неблагополучных хозяйств.

1.4 Научная новизна. Установлено, что наиболее чувствительными отечественными тест-системами являются тест-система «МТВ-сот», позволяющая обнаруживать ДНК M.tuberculosis-bovis и тест-система НПО «Нарвак», которая позволяет идентифицировать M.bovis от M.tuberculosis.

Впервые при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для подготовки генетического материала применялся метод магнитного сорбента, который оказался наиболее эффективным при работе с пробами патматериала, молока, культур. При выделении ДНК из крови установлено, что наиболее эффективным является «Набор обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови методом ПЦР».

Установлено, что праймер, обеспечивающий синтез региона M.tuberculosis-bovis размером 500 н.п. является достаточно чувствительным и специфичным.

Впервые изучена динамика выявления вакцинного штамма M.bovis BCG методом ПЦР и установлено, что ДНК M.bovis BCG обнаруживается в крови и молоке иммунизированных коров в течение 3 месяцев после вакцинации (100%) и через 4 и 5 месяцев у 30% животных.

Установлено, что при посмертной диагностике в неблагополучных и ранее неблагополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании 400 проб лимфатических узлов полученных от положительно реагирующих на туберкулин коров, ПЦР-метод дает положительный результат в 17,75 % случаях, бактериологический метод в 5,75 % случаях, патологоанатомический в 15% случаях.

Полученные результаты регулярно представлялись в Главное Управление ветеринарии КМ РТ для использования в оперативной работе по профилактике туберкулеза крупного рогатого скота.

1.5 Практическое значение. Полимеразную цепную реакцию целесообразно использовать для отличия больных животных от животных, иммунизированных вакциной BCG.

Тест-систему «МТВ-com» и праймер, образующий в результате амплификации последовательность размером 500 н.п. из региона М. tuberculosis-bovis, целесообразно использовать в лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для индикации Mycobacterium tuberculosis-bovis. Для идентификации микобактерий целесообразно

использовать тест-систему НПО «Нарвак».

Для более эффективного выделения ДНК из патматериала, молока, полевых культур целесообразно использовать метод магнитного сорбента, из крови - «Набор, реагентов для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови».

Использование ПЦР-метода в ветеринарной службе РТ позволили сократить сроки диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

1.6 Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:

• Всероссийской научной конференции (Казань, КГАВМ, 2002 г);

• Конференции молодых ученых и специалистов Казанской государственной академии ветеринарной медицины (22 января 2004

г);

• Международной научной конференции, посвященной 131-летию КГАВМ (Казань, 2004);

• Научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», посвященной 200-летию КГУ (Казань, июнь 2004);

• III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», посвященная 30-летию ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии (Москва, 2004);

• Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 19-21 октября 2004 г).

1.7 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

1.8 На защиту выносятся следующие положения. 1. Результаты исследований методом полимеразной цепной реакции в прижизненной и посмертной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.

2. Сравнительная оценка ГЩР-метода по сравнению с другими методами исследования, такими как аллергическая проба и бактериологический метод, а также возможность определения сроков выделения с молоком вакцинного штамма M. bovis BCG у иммунизированных данной вакциной животных.

3. Использование полученных данных в работе ветеринарной службы Республики Татарстан.

1.9. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов, списка литературы, включающего 222 источника, из них 91 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 11 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований.

Работа выполнена в 2001-2003 гг. в Казанской государственной академии ветеринарной медицины и апробирована в ранее неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Республики Татарстан, в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Бугурусланского района Оренбургской области РФ.

Материалом для исследования служили:

1. Лимфатические узлы (подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные) от положительно реагирующего на внутрикожное введения туберкулина поголовья крупного рогатого скота. Материал доставляли из благополучных и ранее неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйств Республики Татарстан, а также из неблагополучных хозяйств Бугурусланского района Оренбургской области. Лимфатические узлы отбирали во время контрольно-диагностического убоя на 0 0 0 «Казанский мясокомбинат» и 00 0 «Бугурусланский мясокомбинат», замораживали и доставляли в Республиканскую ветеринарную лабораторию.

2. Кровь и сыворотка крови от ППД - положительных животных, от животных иммунизированных вакциной BCG, не имеющих положительной реакции введения туберкулина. Кровь консервировали 3%-ным раствором Трилона Б из расчета 10:1, в этот же день доставляли в РВЛ, либо замораживали.

3. Молоко от ППД - положительных животных и от животных иммунизированных вакциной BCG, не имеющих положительной реакции на введения туберкулина. Молоко в этот же день доставляли в РВЛ, либо замораживали.

4. Полевые культуры штамма M.bovis, M.tuberculosis, выращенные в Республиканской ветеринарной лаборатории в термостате при 37°С на питательных средах: Левенштейна-Йенсена, Фаст -3L, также на среде быстрого роста «ВКГ со стимулятором роста для ускоренного выявления возбудителей туберкулеза».

5. Вакцинный штамм M.bovis BCG, произведенный ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь). Один миллиграмм культуры содержит 10 - 30 млн. микробных клеток.

6. Паренхиматозные органы (селезенка, печень) морских свинок, зараженные M.bovis и павшие в результате биопробы в РВЛ.

7. Музейный препарат лимфатического узла от ППД-положительного животного, принадлежавшего Учебному хозяйству КГАВМ и хранившийся в формалине на кафедре патологической анатомии как музейный экспонат.

8. Атипичные культуры микобактерий: 2 штамма M.bovis 55/96, M.xinopi, Mphlei, M.battey, M.smegmaticus, M.fortuitum, M.scrofulaceum, M.terrae, M.gordonae, M.marinum, полученные на кафедре эпизоотологии КГАВМ и штамм MMola (ВНИВИ г. Казань).

9. Отечественные тест-системы для постановки полимеразной цепной рекации (ПЦР): тест-система для индикации и дифференциации M.bovis и M.tuberculosis методом полимеразной цепной реакции НПО «Нарвак» (г.Москва); тест-система для выявления возбудителей туберкулеза M.bovis и M.tuberculosis «MTB-com» ООО «ИнтерЛабСервис» ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ (гМосква); тест-система «Политуб» для обнаружения ДНК Mycobacterium tuberculosis-bovis НПФ «Литех» (г.Москва).

10. Отечественные наборы для подготовки генетического материала: набор реагентов для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови методом полимеразной цепной реакции НПФ «Литех» (г. Москва); набор реагентов для выделения ДНК из биопроб для анализа методом полимеразной цепной реакции «ДНК-экспресс» НПФ «Литех» (г. Москва); набор «Выделение ДНК на магнитном сорбенте»;

11. Праймеры, образующие в результате амплификации последовательность размером 352, 357, 390, 347, 500 и 247 н.п.

Методы исследования

1. Данные из хозяйств о количестве положительно реагирующего скота на туберкулин взяты из годовых отчетов по проведению диагностических мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота Главного управления ветеринарии КМ РТ.

2. Для окраски мазков-отпечатков, приготовленных из исследуемых органов животных и культур микобактериальных клеток, использовали метод Циль-

Нильсена. Окрашенные препараты исследовали под световым микроскопом с использованием иммерсионной системы.

3. Выращивание чистой культуры возбудителя производили на средах Левенштейна-Йенсена и Фаст-3Ь. Через 3 дня после посева среды просматривали, с невосстановившимся цветом среды и ростом посторонней микрофлоры удаляли, а в остальных ватно-марлевые пробки заменяли резиновыми. Культивирование проводили при температуре 37°С до 3 месяцев, еженедельно проводя контроль роста. При появлении роста из культур готовили мазки, окрашивали по Циль-Нильсену и проводили бактериоскопические исследования, а также определяли их видовую принадлежность методом заражения морских свинок.

4. Биопробу ставили на морских свинках.

5. Экстракцию генетического материала (ДНК возбудителя туберкулеза), постановку ПЦР-амплификации участка ДНК и электрофоретический анализ продуктов ПЦР производили согласно предложенным методикам и инструкциям тест-систем.

6. Постановку полимеразной цепной реакции проводили по инструкции тест-систем «Нарвак», «МТВ-сот» и «Политуб», а также с применением праймеров, образующие в результате амплификации последовательность размером 347, 500 и 247 н.п.

7. Работа по выяснению эпизоотической ситуации в отдельных хозяйствах проводилась в комплексе с участием работников ветеринарной службы республики Татарстан. Проводился диагностический убой животных и выращивание возбудителя в условиях Республиканской ветеринарной лаборатории РТ. В своей работе мы также руководствовались приказом №23 от 8.06.99г. департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ «О проведении широкого производственного испытания метода диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полученные результаты регулярно представлялись в ГУВ КМ РТ для использования в оперативной работе по профилактике туберкулеза крупного рогатого скота.

3. Результаты исследований На первоначальном этапе наших исследований проводилась сравнительная оценка трех отечественных тест-систем: тест-системы НПО «Нарвак» (г.Москва), тест-системы «МТВ-сот» ООО «ИнтерЛабСервис» ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ (г.Москва) и тест-системы «Политуб» НПФ «Литех» (г.Москва). Оценивались методы выделения ДНК микобактерий из исследуемого материала (крови, молока, патматериала, культур) и амплификация ДНК-участка праймерами, входящими в состав вышеназванных диагностикумов. С этой целью нами было происследовано 400 голов (850 проб) ППД-положительных животных (крупный рогатый скот). Исследование патматериала одновременно проводили с использованием всех тест-систем, параллельно используя бактериологические методы. Методом ПЦР нам удалось выявить 40 проб (10% животных) в которых при послеубойной диагностике

был обнаружен геном M.bovis из хозяйств - ОАО «Токарликова» Альметьевского района, АКХ «Подберезье» Кайбицкого района, АП «Балтач» Камско-Устьинского района ОПХ «Столбищенское» Лаишевского района, СХ «Яна-Арыш» Рыбно-Слободского района, колхозов - «Заветы Ленина» и «Новая жизнь» Бугурусланского района Оренбургской области и одну пробу с геномом M.tuberculosis из КП «Родина» Дрожжановского района РТ. При бактериологическом исследовании рост культур M.bovis регистрировался в 22 случаях, M.tuberculosis - в одной пробе. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Сравнительный анализ результатов исследований материала с применением отечественных коммерческих тест-систем ГЩР, предназначенных для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Количество Количество ПЦР-положительных проб в результате

исследованных использования тест-систем:

проб НПО «Нарвак» «МТБ-ком» «Политуб»

400 проб 41 41 34

лимфоузлов

12 культуральных 12 12 12

штаммов M.bovis

Культуральный 1 1 1

штамм

M.tuberculosis

Штамм 1 1 1

Mbovis BCG

12 атипичных - - -

штаммов

Музейный M.bovis

препарат

лимфоузла

Как видно из таблицы 1, наиболее чувствительными являются тест-система «МТВ-com» и тест-система НПО «Нарвак».

Тест-система «МТВ-com» применялась при исследовании 400 проб лимфатических узлов из хозяйств: ООО «Яшь-Куч» Алькеевского района, СПК «Макулово», ГГХ «Восход», СХПК им.Вахитова, СХПК «Волга», 0 0 0 «Красный Восток» Верхне-Услонского района, КП «Комсомолец», КП «Озерное», КП «Кугеево», КП «Косяковский», КП «Приволжье» Зеленодольского района, ОПХ «Столбищенское», СПК «Победа» Лаишескогорайона, СКП «Иске Рязап» Спасского района Республики Татарстан, колхоз «Восточный» Бугурусланского района Оренбургской Области и 150 проб крови и молока из хозяйств СПК «Урожай», ОАО «Токарликова» Альметьевского района, КП «Родина» Дрожжановского района, СХП «Мир», АККХ «Чулпан», АККХ «Заря», АККХ «Авангард», ТНВ

«Колос», АКХ «Юлдуз», АКХ «Подберезье», АККЪХ «Яна Юл» Кайбицкого района, ООО «Химокам-Агро» Нижнекамского района, КП «Фрунзе» Тюлячинского района, СКП «Весна» Чистопольского района Республики Татарстан, колхоз «Заветы Ленина», колхоз «Новая жизнь» Бугурусланского района Оренбургской области.

С помощью данной тест-системы нам удалось обнаружить геном M.tuberculosis-bovis в 41 случае при исследовании патматериала, во вех случаях при исследовании культуральных штаммов, а также в музейном препарате лимфатического узла, который хранился в формалине несколько лет на кафедре патологической анатомии КГАВМ как музейный экспонат.

Для повышения чувствительности и специфичности в данной тест-системе применяется такой прием как «горячий старт» - "Hot Start PCR", который заключается в физическом разделении компонентов реакционной смеси таким образом, чтобы реакция начиналась только после проведения в амплификаторе первого этапа денатурации ДНК. Он обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев (верхнего и нижнего), разделенной прослойкой из воска. Нижний слой содержит специфические праймеры, нижний - фермент Taq-полимеразу и ДНК-мишень. Это связано с тем, чтобы избежать неспецифической гибридизации праймеров с исследуемой ДНК на самом первом этапе изменения температуры от комнатной до температуры денатурации, праймеров между собой, так как смешение слоев происходит только при расплавлении воска на стадии денатурации Использование в процессе амплификации внутреннего контрольного образца (ВКО) позволяет контролировать процесс прохождения реакции амплификаиии и тестировать наличие в пробе веществ, ингибирующих полимеразную цепную реакцию. Кроме того, в данном наборе мишенью для праймеров выбраны участки К6110-элементов, которые представлены несколькими копиями на бактериальную хромосому (1-25).

Значительным преимуществом тест-системы НПО «Нарвак» является возможность дифференциации M.bovis и M.tuberculisis. С помощью этой тест-системы мы обнаружили геном M.bovis в 40 пробах и геном M.tuberculisis в одной пробе, во всех случаях при исследовании культуральных штаммов. Высокая специфичность данной тест-системы обеспечивается за счет применения так называемой «гнездовой» модификации метода ПЦР с использованием внутренних и внешних праймеров. Использование двухстадийной ПЦР позволяет достоверно выявить ДНК микобактерий, так как амплификация с использованием в качестве матрицы полученного на первой стадии внутреннего фрагмента является аналогом гибридизации. Реамплификация повышает чувствительность выявления потогена особенно тогда, когда он находится в клиническом материале в единичных экземплярах и не выявляется при помощи других тест-систем. Однако, многократный контакт исследуемого биологического материала с внешней средой может служить причиной контаминации и привести к ложноположительному результату анализа.

Тест системой «Политуб» мы обнаружили ДНК M. tuberculosis-bovis в 34 пробах патматериала и во всех случаях при работе с полевыми штаммами Мишенью в данной тест-системе является участок гена МРВ 64, представленный лишь одной копией на бактериальный геном. Кроме того, данная тест-система не позволяет дифференцировать M.tuberculosis и M.bovis, a также не содержит в своем составе контроль для выделения ДНК. Положительная контрольная ДНК M.tuberculosis, входящая в состав набора для проведения полимеразной цепной реакции, предназначена для использования в процессе амплификации и рассчитана на 10 реакций, поэтому не может быть использована как контроль в процессе подготовки проб. Отсутствие положительного контроля в наборе для выделения ДНК из клинических проб может искажать результаты исследований и в случае ингибиции ПЦР на стадии подготовки генетического материала, может приводить к ложноотрицательным результатам.

Ни одна из трех тест-систем не давала ПЦР-положительный результат при исследовании атипичных штаммов микобактерий - M.bovis 55/96, M.xinopi. M.phlei, M.battey, M.smegmaticus, M.fortuitum, M. scrofulaceum, M.terrae. M.gordonae, M.marinum и вирулентного штамма M.viola. Это свидетельствует о высокой специфичности данных наборов.

На втором этапе нашей работы проводилось сравнительное исследование ряда наборов, предназначенных для подготовки генетического материала из исследуемых проб с целью дальнейшей постановки полимеразной цепной реакции. Данными наборами служили: набор реагентов для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови НПФ «Литех» (г.Москва), набор реагентов для выделения ДНК из биопроб «ДНК-экспресс» НПФ «Литех» (г.Москва), набор «Выделение ДНК на магнитном сорбенте» (г. Пущино Московская область), а также мы использовали стандартный фенол-хлороформенный метод. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Сравнительный анализ результатов исследований материала с использование различных наборов, предназначенных для выделения ДНК._

Количество и наименование

проб

Количество ПЦР-положительных проб при использовании наборов:

ДНК-экспресс

Метод

магнитного

сорбента

Набор для выделения ДНК из сыворотки или плазмы крови

Фенол-хлороформен-ный метод

41 ПЦР-

положительная проба лимфоузлов

12 культуральных шгаммовЖ bovis

Культу ральный

штамм М. tuberculosis

Штамм MMvisBCG 1 1 ! 1

10 проб крови от 8 9 10 10

вакцинированных

вакциной BCG

коров

Использование набора «ДНК-экспресс» значительно сокращает время пробоподготовки и снижает опасность перекрестной контаминации проб. Данный набор всегда надежно работал при исследовании 12 культуральных штаммов M. bovis, штамма М.tuberculosis, M. bovis BCG, однако с помощью этого набора нам не удалось обнаружить геном M. bovis в 22 из 41 ПЦР-положительной пробы патматериала и геном M.bovis BCG из 1 пробы крови от вакцинированных коров. Это может быть связано с тем, что набор «ДНК-экспресс» является универсальным и предназначен для выделения любого генетического материала. Известно, что бактериальная стенка микобактерий содержит сшитые между собой молекулы пептидогликана, обладающие высокой механической прочностью, которая обусловлена межмолекулярными связями как внутри слоя, так и между слоями клеточной стенки.

В наборе «Выделение ДНК на магнитном сорбенте» магнитные частицы покрытые Si02 поставляются в виде водной суспензии в готовом для использования виде. Высокое содержание окиси железа позволяет быстро собирать частицы. Частицы прочно удерживаются на стенке пробирки магнитом, что облегчает промывку и отбор жидкости из пробирки.

Применяемые в наборе магнитные частицы обладают повышенной емкостью связывания ДНК по сравнению с обычными сорбентными методами.

Основные преимущества предлагаемых магнитных частиц по сравнению с обычными сорбентами на основе Si02:

• возможность выделения ДНК из образцов в выездных лабораториях, где отсутствуют условия для использования токопотребляемых приборов (центрифуги, встряхиватели и т.д.);

• отсутствие необходимости осаждать образец центрифугированием приводит к минимальному повреждению выделяемой ДНК;

• обладают более высокой удельной емкостью при связывании ДНК и способностью легче «отдавать» связанную ДНК при элюции;

• возможность практически полностью отбирать водную фазу без риска захватить мелкие частички сорбента, так как сорбент собирается и прочно удерживается на стенке пробирки, помещенной в магнитный штатив;

• возможность легко маштабировать эксперимент по выделению практически с линейным выходом. Что невозможно с сорбентами.

Для эффективного использования магнитных частиц предлагаются простые и удобные в использовании универсальные магнитные штативы.

С помощью данного набора нам удалось обнаружить геном микобактерий в 41 пробе лимфатических узлов, во всех полевых штаммах M.bovis, M.bovis BCG и M.tuberculosis, ДНК штамма M.bovis BCG в 9 из 10 пробах крови от вакцинированных животных.

Выделение ДНК микобактерий из крови представляет определенные трудности из-за большого содержания в них ингибиторов ПЦР - гепарина и гемоглобина. Набор реагентов НПФ «Литех» (г. Москва), для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови (либо стандартный фенол-хлороформный способ выделения ДНК из крови) оказался наиболее эффективными.

Суть метода заключается в подготовке генетического материала (ДНК микобактерий) фенол-хлороформенным методом. Данный набор нами был испытан на 12 полевых штаммах M.bovis, на одном штамме M.tuberculosis, штамме M.bovis BCG, 12 атипичных культур микобактерий, 41 пробе лимфатических узлов которые имели видимые туберкулезные поражения, 10 пробах крови, взятые от животных через 30 дней после иммунизации вакциной BCG. Во всех случаях набор работал надежно. В состав набора входит раствор т-РНК, который может существенно увеличить количество выделяемой ДНК за счет того, что РНК не будет конкурировать с ДНК за связывание с сорбентом. Рыхлый осадок, который образуется в результате центрифугирования на дне пробирки очень легко не заметить, поэтому при работе с ним рекомендуется ориентировать пробирки в роторе центрифуги, обозначая таким образом местоположение осадка. Набор предусматривает использование фенола, работать с ним нужно предельно осторожно и внимательно.

Анализ информативности и специфичности существующих и разработанных праймеров

Полимеразную цепную реакцию проводили с праймерами тест-систем «Нарвак», «Политуб», «МТБ-com» по инструкции изготовителя, также с праймерами, образующие в результате амплификации последовательность размером 347, 500 и 247 н.п.

Для подбора праймеров пользовались специально разработанными компьютерными программами и базой данных о нуклеотидной последовательности. Температуру плавления праймеров определяли с помощью специализированных компьютерных программ, в частности программы «Oligos». Грубый подсчет температуры плавления праймеров проводили вручную с помощью формулы: Tm = 4°C(G+C)+2C(A+T)-5°C. Считается, что данная формула справедлива для относительно коротких праймеров длиной до 20 нуклеотидов.

В отдельной пробирке готовили общую реакционную смесь по количеству образцов, в число которых входили положительный контроль ПЦР (ДНК M.bovis BCG) и отрицательный контроль (деионизованная вода). Состав реакционной смеси указан в таблице 3.

Таблица 3.

Состав реакционной смеси для ПЦР._

Реактивы Кол-во на 1 пробу (мкл) Кол-во на N проб (мкл)

1. Буфер для ПЦР 2,5 2,5 х (N+1)

2. Смесь трифосфатов (dNTP) (2.5 мМ каждого) 2,0 2,0 х (N+1)

3. Праймеры (5мкМ) 5,0 5,0 х (N+1)

4. Деионизованная вода 9,5 9,5 х (N+1)

6. ДНК 5,0

Реактивы вносили в последовательности, приведенной в таблице. Смесь перемешивали и разливали по 20 мкл в предварительно промаркированные пробирки для ПЦР. В каждую пробирку вносили по 5 мкл испытуемой ДНК и по 40 мкл (примерно 2 капли) минерального масла, затем пробы помещали в предварительно прогретый амплификатор.

Для амплификации использовали температурный режим, представленный в таблице 4.

Таблица 4.

_Температурный режим амплификации._

Праймеры

Р 1 - 347 н.п. Р2-500н.п. Р 3 - 247 н.п.

95°С-2мин 94°С-2 мин 95оС-2 мин

94оС-15 сек 61°С-20 сек 35 циклов 72°С-20 сек 94оС-1 мин 59°С -1 мин 35 циклов 72°С-1 мин 94°С-20сек 57°С-20 сек 35 циклов 2°С-20 сек

72оС-7 мин 72оС-7 мин 72оС-7 мин

Амплифицированную ДНК разделяли методом горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле с трис-боратным буфером в присутствии бромида этидия (результаты регистрировали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете), а также методом вертикального электрофореза в 6%-ном полиакриламидном геле, с последующим окрашиванием геля нитратом серебра.

При испытании праймеров, синтезирующих нуклеотидную

последовательность размером 347,500 и 247 н.п. на 12 культуральных штаммах M.bovis, на штамме M. tuberculosis, на вакцинном штамме M.bovis BCG и на атипичных культурах микобактерий - M.bovis 55/96, M.xinopi, M.phlei, M.battey, M-smegmaticus,M.fortuitum,M.scmfulaceum,M. terrae, M.gordonae, M.marinum, на вирулентном штамме M.viola мы получили следующий результат, представленный в таблице 5.

№

Таблица 5.

Анализ информативнрсти и специфичности пра!

Автор, год

или название тест-систем

Ген

Праймер

Длина ампли-фиката

меров

Амплифици-рует регион из генома

Streevatsan etal., 1999

M.bovis

hsp65 ggctggttacaccttcgatgcg agccgccgaaacccatct

347-bp

M.tuberculosi-bovis, Mbovs BCG,

атипичные микобактерии

Rodrigouz et al., 1995

M.bovis 1880 н.п.

гена белка с Мм 65 кДа

JB21

tcgtccgctgatgcaagtgc JB22

cgtccgctgacctcaagaag

500-bp

M.tuberculosi-bovis, M.bovis BCG

Magdalena etal., 1998

M.bovis BCG, Mirus

SenX3,Red X3 gcgcgagagccccgaactg gcgcagcagaaacgtcagc

247-bp

Mtuberculosi-bovis, M.bovis BCG

Тест-

система «Нарвак», 2003

M.bovis, M.tuberculosis

352 н.п. 377 н.п.

Тест-система «MTB-com», 2003

M. tuberculosis -bovis

390 н.п.

Тест-система «Политуб», 2003

M. tuberculosis -bovis

357н.п.

В результате наших исследований эыяснилось, что праймер, предложенный Streevatsan S. et al, образующий в результате амплификации участок генома размером 347 н.п. со всеми штаммами, в том числе и с атипичными микобактериями давал 100 %-ный ПЦР-положительный результат.

Праймер, предложенный Rodrigues J.G et al. со всеми полевыми штаммами M.bovis, штаммом M.bovis BCG и H.tuberculosis амплифицировал участок, размером 500 н.п., с атипичными микобактериями был получен ПЦР-отрицательный результат (рис.1)

Рисунок 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймером . JB21 и JB22 (500 н.п.) в 6% ПААГе. Обозначения: 1 -ДНК штамма М. bovis 55/96; 2 - ДНК штамма М. terrae; 3-ДНК штамма M.gordonae;

4 - ДНК штамма M.marinum;

5 - ДНК штамма M.viola;

6 - ДНК штамма M.scrofulaceum;

7 - ДНК штамма M..xinopi

8 - положительный контроль выделения ДНК (М. bovis BCG);

9 - положительный контроль ПЦР (ДНК М.bovis BCG);

10 - маркеры длин фрагментов ДНК: 1000 Ьр; 900 Ьр; 800 Ьр; 700 Ьр; 600 Ьр: 500 Ьр; 400 Ьр; 300 Ьр; 200 Ьр; 100 Ьр.

Праймер, образующий в результате амплификации регион размером 247 н.п. из генома M.bovis-tubarculosis, предложенный J.Magdalena не амплифицировал регион у одного полевого штамма M.bovis и у атипичных штаммов микобактерий (рис.2).

Рисунок 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймером РЗ (247 н.п.) в 6% ПААГе.

Обозначения: 1 -ДНК штамма M.bovis 55/96,

2 - ДНК штамма M.scrqfulaceum:

3 -ДНК штамма M.xinopi;

4 - ДНК штамма M.phlei:

5 - ДНК штамма M.battey;

6 -ДНК штамма M.smegmaticus;

7 - ДНК штамма M.fortuitum;

8 - ДНК штамма M.terrae;

9-ДНКштамма M.gordonae;

10-ДНК штаммаM.marinum;

11 - ДНК штамма М. viola;

12 - контроль выделения ДНК (M.bovis BCG),

13 - контроль ПЦР (ДНКМ. bovis BCG);

14 - маркеры длин фрагментов ДНК: 1000 Ьр; 900 Ьр; 800 Ьр; 700 Ьр; 600 Ьр,

500 Ьр; 400 Ьр; 300Ьр; 200 Ьр; 100 Ьр.

Праймеры, входящие в состав тест-систем дают ПЦР-положительный результат со всеми штаммами М.bovis, M.bovis BCG и М.tuberculosis и ПЦР-отрицательный результат с атипичными культурами микобактерий.

Динамика выявления ДНК вакцинного штамма M.bovis BCG в крови и молоке иммунизированных коров

В целях стабилизации эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота Правительством республики было принято постановление «О мерах по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан», от 10.07.95 г. В комплекс противотуберкулезных мероприятий была включена иммунопрофилактика животных вакциной BCG. Эффективность иммунизации крупного рогатого скота вакциной BCG доказана многочисленными исследованиями как в лабораторных условиях, так и в широких производственных опытах (Х.Г. Гизатуллин, М.А. Сафин, 1985 г).

Для решения этой задачи мы отобрали 10 коров, иммунизированных вакциной BCG и принадлежавших КФХ «Весна» Чистопольского района РТ. Хозяйство считается оздоровленным от туберкулеза. Через 30 дней после вакцинации у животных были взяты первые пробы крови и молока, а затем через каждые 30 дней в течение 6 месяцев и через год после вакцинации. Кровь консервировали 3%-ным раствором трилона Б, из расчета 10:1, а так же использовали пробы без трилона Б, молоко помещали в отдельные стерильные пробирки. В этот же день материал доставляли в Республиканскую ветеринарную лабораторию.

Пробы крови, консервированные 3%-ным раствором трилона Б, как свежие, так и замороженные, взятые через 30 дней после вакцинации, дали 100% ПЦР-положительный результат с использованием всех трех тест-систем. Свежие пробы молока и те, которые подвергали замораживанию, также регистрировались как ПЦР-положительные (рис.3).

K-l 2)4 3 ( 7 I 9 10 K+M

Рисунок 3. Выявление ДНК штамма M.bovis BCG в крови иммунизированных коров тест-системой «МТВ-com» через 30 дней после вакцинации.

Обозначения: К- - отрицательный контрольный образец (ОКО);

1-10 - пробы крови;

К+ - положительный контрольный образец (ПКО);

М - маркеры длин фрагментов ДНК: 955 Ьр, 585 Ьр, 341 Ьр, 250 Ьр, 141 Ьр, 105 Ьр.

Пробы крови, которые не консервировали трилоном Б, а также несвежие пробы молока, были ПЦР-отрицательные. В дальнейшем для исследования использовали только кровь, консервированную 3%-ным раствором трилона Б и свежие пробы молока. У всех животных в течение 3-х месяцев после вакцинации выявляется методом ПЦР ДНК штамма M.bovis BCG в крови и молоке. В сыворотке крови ДНК вакцинного штамма не обнаруживается. Через 4 и 5 месяцев ДНК M.bovis BCG обнаруживается только у 30% животных, а через 6,7 и 12 месяцев ДНК штамма M.bovis BCG в крови и молоке у крупного рогатого скота методом ПЦР не обнаруживается. Шесть голов из контрольной группы имели положительную реакцию на туберкулин и были убиты с диагностической целью, при этом характерных для туберкулеза изменений не обнаружено.

Следующим этапом нашей работы явилось проведение системного исследование материала от ППД-положительных животных и использование полученных результатов для принятия соответствующих мер.

Было установлено, что из 400 голов животных, положительно реагирующих на внутрикожное введение туберкулина и убитых с диагностической целью, после вскрытия характерные туберкулезные изменения в лимфатических узлах имелись у 60 голов (15 % животных), 30 голов (7,5 %) были поражены эхинококкозом из неблагополучных по туберкулезу хозяйств Бугурусланского района Оренбургской области и 1 % фасциолезом из ранее оздоровленных хозяйств Республики Татарстан.

При исследовании патматериала, 41 проба регистрировалась как ПЦР-положительная, из них рост культур M.bovis выявился в 22 случаях и в одной пробе был обнаружен рост M.tuberculosis. У 30 голов животных при жизни в крови и молоке был обнаружен геном M.bovis методом ПЦР (рис.4).

количество голов

400

350 300 250 200 150 100 50 0

Рисунок 4. Сравнительный анализ результатов исследований

Обозначения: 1 - количество ППД-положительных животных (400 гол);

2 - количество животных, имеющие характерные изменения в лимфатических узлах при вскрытии (60 гол);

3 - количество животных, зараженные эхинококкозом (30 гол),

4 - количество животных, зараженные фасциолезом (4 гол);

5 - количество ПЦР-положительных проб при исследовании лимфатических

узлов (41 проба);

6 - количество животных, у которых в крови и молоке при жизни был

обнаружен геном M. bovis (30 гол);

7 - количество животных, у которых диагноз подтвердился культуральным

методом исследования (23 гол).

В результате наших исследований установлено, что не всегда удается обнаружить возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота методом ПЦР в крови и молоке у больных животных. Это может быть связано с тем, что лимфатические узлы при первичном туберкулезе поражаются значительно чаще, чем органы, с которых они собирают лимфу (Н.З.Хазипов, М.А.Сафин, Г.З.Идрисов, 2000 г.) Судьба туберкулезных очагов, возникших в том или ином месте организма, может быть различной. Туберкулезные очаги, подверженные пролиферативному воспалению часто заканчиваются развитием плотной фиброзной ткани, в результате чего вокруг туберкулезного фокуса развивается фиброзная капсула, изолирующая поврежденный участок органа (закрытый процесс).

В других случаях туберкулезный очаг приобретает наклонность к дальнейшему распространению. Бугорки сливаются между собой, подвергаются казеозному распаду. Одновременно с этим происходит разрушение паренхиматозной ткани и стенок кровеносных сосудов. При этом бактерии попадают в кровь и разносятся по всему организму (открытый процесс).

Установлено также, что не все животные, которые дали положительную реакцию на туберкулин больны туберкулезом. Так, при контрольно-

диагностическом убое было установлено, что 90 % всех убитых животных и хозяйств Бугурусланского района Оренбургской области были больны эхиноккокозом, либо альвеококкозом и 1% из хозяйств РТ фасциолезом.

Отсутствие роста M.bovis на питательных средах во время бактериологического исследования ПЦР-положительных проб, может быть объяснено тем, что методы обеззараживания, которые используются для уничтожения сопутствующей микрофлоры, могут также иметь негативное влияние на M.bovis, в то время как ПЦР-метод способен обнаружить как живых, так и нежизнеспособных бактерий.

По данным Шлеевой М.О. и др. (2003) в популяции клеток Mycobactenum tuberculosis, пребывающих в длительной пост-стационарной фазе, обнаружены «некультивируемые» клетки. Такие клетки представлены небольшими овоидными и коккоидными формами небольшого размера (0,6-0,8 мкм) и неповрежденной клеточной стенкой и дыхательной активностью близкой к нулю, что позволяет рассматривать эти формы как покоящиеся. «Некультивируемые» клетки имеют низкую жизнеспособность на твердой среде, но небольшая часть популяции таких клеток может быть культивируема в жидкой среде. Способность к росту «некультивируемых» клеток (их оживление) в жидкой среде существенно повышается в присутствие супернатанта, полученного фильтрованием логарифмической культуры Mycobacterium tuberculosis, или бактериального фактора роста Rpf. В процессе оживления этих клеток их форма изменяется от овоидной к палочковидной, при этом на самых ранних стадиях оживления овоидные формы собираются в небольшие агрегаты. Восстановление культивируемости связано с появлением в культуре палочковидных форм. Полученные данные свидетельствуют о возможности образования покоящихся форм Mycobacterium tuberculosis in vitro, не способных к росту на твердых средах, но способных к оживлению в жидкой среде с помощью веществ(а), секретируемых активно растущими клетками

В заключение следует подчеркнуть, что туберкулез крупного рогатого скота имеет значительное распространение и потому требуется систематическое исследование по своевременной диагностике и принятие оздоровительных мер. Полимеразная цепная реакция, разработанная в последние годы, является высокочувствительной и специфичной, однако для широкого применения в условиях производства имеет целый ряд препятствий, а именно требуется соответственный набор приборов, реактивов и подготовленного персонала. Учитывая важность своевременной диагностики этой инфекции принимаются меры по оснащению ветеринарных лабораторий оборудованием для ПЦР, комплектными наборами с использование различных праймеров. Испытание их в производстве показывает, что ни один из них не является абсолютным и требует подтверждение несколькими методами. Это можно объяснить тем, что молекулярная генодиагностика туберкулеза крупного рогатого скота пока находится на начальном этапе своего разви ил. Полная расшифровка генома M.bovis произведена применительно к трем штаммам лишь в 2003 году, а рекомендованные праймеры базируются на

сведениях, полученных по секвенированию отдельных генов этого возбудителя. По мере накопления знаний о последовательности нуклеотидов всего генома более широкого круга штаммов, станет возможным подбор праймеров более специфичных, общих для всех известных штаммов M.bovis. Развитие молекулярной генодиагностики, методов секвенирования, разработка более совершенных методов анализа генома позволяют надеяться, что метод ПЦР займет ведущее место в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.

5. Выводы

1. Предложенные праймеры, образующие амплификаты размером 500 и 247 н.п. и отечественные тест-системы «МТВ-com» и НПО «Нарвак» являются достаточно чувствительными и специфичными при прижизненной и посмертной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом ПЦР.

2. Для подготовки генетического материала для ПЦР наиболее эффективным при работе с пробами крови является «Набор для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови методом полимеразной цепной реакции НПФ «Литех» (г.Москва); при исследовании патматериала, молока, культур -«Набор выделения ДНК на магнитном сорбенте».

3. ДНК вакцинного штаммаМ bovis BCG методом ПЦР обнаруживается в крови и молоке иммунизированных животных в течение 3 месяцев после вакцинации (100%) и через 4 и 5 месяцев у 30% животных.

4. Систематическим исследованием биологического материала из 32 хозяйств 16 районов РТ и 3 хозяйств Бугурусланского района Оренбургской области установлено, что при посмертной диагностике в неблагополучных и ранее неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, при исследовании 400 проб лимфатических узлов, полученных от положительно реагирующих на туберкулин коров, ПЦР-метод дает положительный результат в 17,75 % случаях, бактериологический метод в 5,75 % случаях, патологоанатомический в 15% случаях.

Практические предложения

1. ПЦР-метод целесообразно использовать для индикации Mycobacterium tuberculosis-bovis, применяя тест-систему «МТВ-com» ООО «ИнтерЛабСервис» (г.Москва), а также праймер, обеспечивающий синтез региона М. tuberculosis-bovis, размером 500 н.п. Для идентификации микобактерий рекомендуется применять тест-систему НПО «Нарвак» (г.Москва).

2. Для более эффективной подготовки генетического материала (ДНК) из крови рекомендуется использовать набор реагентов для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови (НПФ «Литех»), для выделения ДНК из патматериала, молока, полевых культур - набор выделения ДНК на магнитном сорбенте.

3. ПЦР-метод может быть использован для прижизненной, при

послеубойной лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, как дополнительный экспресс-метод.

6. Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Хазипов Н.З., Усольцев К.В., Аскарова А.Н., Борисова Т.А. Тест-системы ПЦР для диагностики туберкулеза крупного рогато скота // Материалы Всероссийской научной конференции. Казань, 2002 г, часть 1.-е. 132-133.

2. Борисова Т.А. Сравнительная оценка тест-систем ПЦР для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Ученые записки КГАВМ, 2002, том 174. -с.45-50.

3. Борисова Т.А., Хазипов Н.З., Иванов А.В. Обнаружение M.bovis методом ПЦР у крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной БЦЖ // ж-л Ветеринарный врач, 2003, № 3.-С.87-88.

4. Борисова Т.А. Выявление возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота методом ПЦР // Материалы международной конференции, посвященной актуальным вопросам микробиологии и инфекционной патологии животных (г. Омск).-с.231-234.

5. Борисова Т.А., Хазипов Н.З., Иванов А.В., Хамзин Р.А., Королева Л.В. Полимеразная цепная реакции для индикации микобактерий с использованием различных тест-систем в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 19-21 октября 2004).-с.205-208. .

6. Борисова Т.А. Индикация микобактерий методом полимеразной цепной реакции // Ученые записки КГАВМ, 2004, том 178. -с.32-39.

7. Борисова Т.А. Полимеразная цепная реакция для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Материалы научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», посвященной 200-летию КГУ, Казань, июнь 2004 (в печати).

8. Борисова Т.А., Хазипов Н.З., Иванов А.В., Метод полимеразной цепной реакции для индикации Mycobacterium bovis с использованием различных тест-систем в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан // Материалы III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», посвященная 30-летию ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, Москва, 2004 (в печати).

Подписано в печать 23.11.04. Формат 60x84/16

Заказ /й£Тираж 100 экз. Усл.-печ.л. 1,0

Центр информационных технологий КГАВМ 420074, Казань, Сибирский тракт, 35

# 2 3 4 9 0

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Борисова, Татьяна Анатольевна

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Биохимическая структура микобактериальной клетки

1.2 Иммунитет при туберкулезе

1.3 Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота

1.3.1 Эпизоотологические данные

1.3.2 Клинический метод

1.3.3 Аллергический метод

1.3.4 Патологоанатомический и гистологический методы

1.3.5 Бактериологический метод

1.3.6 Серологический метод

1.4 Иммуноферментный анализ

1.5 Геномная дактилоскопия

1.6 Сполиготипирование

1.7 Полимеразная цепная реакция

1.8 Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза

2. Материалы и методы исследований 39 •ф 2.1 Материалы

2.2 Методы исследования

3. Результаты собственных исследований

3.1 Оценка метода выделения ДНК и проведение полимеразной цепной 55 реакции тест-системой НПО «Нарвак» (г.Москва)

3.1.1 Оценка метода выделения ДНК и постановки полимеразной цепной 56 реакции тест-системой для выявления возбудителей туберкулеза M.bovis и M.tuberculosis «МТВ-com» ООО «ИнтерЛабСервис» ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ (г.Москва)

3.1.2 Оценка метода выделения ДНК и постановки полимеразной цепной 57 реакции тест-системой для обнаружения ДНК Mycobacterium tuberculosisfa bovis «Политуб» НПФ «Литех» (г.Москва)

3.2 Оценка метода выделения ДНК набором реагентов для 58 обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови методом полимеразной цепной реакции НПФ «Литех» (г.Москва)

3.2.1 Оценка метода подготовки генетического материала набором 59 реагентов для выделения ДНК из биопроб для анализа методом полимеразной цепной реакции «ДНК-экспресс» НПФ «Литех» (г.Москва)

3.2.2 Оценка метода подготовки генетического материала набором 61 «Выделение ДНК на магнитном сорбенте»

3.3 Анализ информативности и специфичности существующих и 62 разработанных праймеров

3.4 Динамика обнаружения вакцинного штамма M.bovis BCG в крови и 67 молоке крупного рогатого скота, иммунизированного данной вакциной

3.5 Эпизоотическая обстановка и результаты комплексного 69 исследования на туберкулез крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан.

4. Обсуждение результатов

5. Выводы

6. Практические предложения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Современные ПЦР-системы для индикации и идентификации микобактерий и диагностическая значимость полимеразной цепной реакции при туберкулезе крупного рогатого скота"

Сравнительно недавно для диагностики инфекционных болезней в ветеринарной практике стали применять метод полимеразной цепной реакции. В России, начиная с 1992 года, были созданы отечественные наборы реагентов, предназначенные для определения возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота. Однако, остаются пока открытыми вопросы стандартизации и контроля качества тест-систем. В основе метода тест-систем лежит подготовка проб к проведению ПЦР с использованием метода экстракции ДНК, позволяющий концентрировать препараты ДНК и одновременно очищать их от ингибиторов ПЦР и амплификация специфического участка ДНК микобактерий за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы, с последующей регистрацией результатов реакции гель-электрофорезом.

Для ПЦР-анализа пригодны различные биологические материалы -слизь, моча, мокрота, кровь, сыворотка, молоко, соскобы эпителиальных клеток, кусочки органов, гистологические препараты. ПЦР - метод относится * к прямым методам обнаружения возбудителя, позволяющий обнаружить до одной молекулы ДНК в исследуемой пробе, даже когда организм является нежизнеспособным. Результаты исследования можно получить в день проведения анализа.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение эффективности отечественных тест-систем для выявления и идентификации ДНК микобактерий, при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в неблагополучных и ранее неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, определение роли и места ПЦР-метода для выявления ДНК штамма M.bovis BCG у иммунизированных животных, а также его пригодности для прижизненной и посмертной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и внедрение ПЦР в ветеринарную практику.

Для выполнения ставились задачи:

4. Определить пригодность полимеразной цепной реакции для установления сроков выявления ДНК вакцинного штамма M.bovis BCG у иммунизированных животных.

Научная новизна. Установлено, что наиболее чувствительными отечественными тест-системами являются тест-система «МТВ-сот», позволяющая обнаруживать ДНК M.tuberculosis-bovis и тест-система НПО «Нарвак», которая позволяет идентифицировать M.bovis от М.tuberculosis.

Установлено, что при посмертной диагностике в неблагополучных и ранее неблагополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании 400 проб лимфатических узлов полученных от положительно реагирующих на туберкулин коров, ПНР-метод дает положительный результат в 17,75 % случаях, бактериологический метод в 5,75 % случаях, патологоанатомический в 15 % случаях.

Практическое значение. Полимеразную цепную реакцию целесообразно использовать для отличия больных животных от животных, иммунизированных вакциной BCG.

Для более эффективного выделения ДНК из патматериала, молока, полевых культур целесообразно использовать метод магнитного сорбента, из крови - «Набор реагентов для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:

• Всероссийской научной конференции (Казань, КГАВМ, 2002 г);

• Конференции молодых ученых и специалистов Казанской государственной академии ветеринарной медицины (22 января 2004 г);

• Международной научной конференции, посвященной 131-летию КГАВМ (Казань, 2004);

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Внедрение. Результаты исследований широко используются в практике ветеринарной службы Республики Татарстан, в лабораторных исследованиях КГАВМ, включены в учебный процесс по специальности эпизоотология, микробиология, биохимия.

На защиту выносятся: 1. Результаты исследований методом полимеразной цепной реакции в прижизненной и посмертной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. 2. Сравнительная оценка ПЦР-метода по сравнению с другими методами исследования, такими как аллергическая проба и бактериологический метод, а также возможность определения сроков выделения с молоком вакцинного штамма M.bovis BCG у иммунизированных данной вакциной животных. 3. Использование полученных данных в ветеринарной службе Республики Татарстан.

Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов, списка литературы, включающего 222

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Борисова, Татьяна Анатольевна

5. ВЫВОДЫ

Предложенные праймеры, образующие амплификаты размером 500 и 247 н.п. и отечественные тест-системы «МТВ-com» и НПО «Нарвак» являются достаточно чувствительными и специфичными при прижизненной и посмертной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом ПЦР.

Для подготовки генетического материала для ПЦР наиболее эффективным при работе с пробами крови является «Набор для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови методом полимеразной цепной реакции НПФ «Литех» (г.Москва); при исследовании патматериала, молока, культур - «Набор выделения ДНК на магнитном сорбенте».

ДНК вакцинного штамма M.bovis BCG методом ПЦР обнаруживается в крови и молоке иммунизированных животных в течение 3 месяцев после вакцинации (100%) и через 4 и 5 месяцев у 30% животных.

Систематическим исследованием биологического материала из 32 хозяйств 16 районов РТ и 3 хозяйств Бугурусланского района Оренбургской области установлено, что при посмертной диагностике в неблагополучных и ранее неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, при исследовании 400 проб лимфатических узлов, полученных от положительно реагирующих на туберкулин коров, ПЦР-метод дает положительный результат в 17,75 % случаях, бактериологический метод в 5,75 % случаях, патологоанатомический в 15 % случаях.

Практические предложения

ПЦР-метод целесообразно использовать для индикации Mycobacterium tuberculosis-bovis, применяя тест-систему «МТВ-сош» ООО «ИнтерЛабСервис» (г.Москва), а также праймер, обеспечивающий синтез региона М. tuberculosis-bovis, размером 500 н.п. Для идентификации микобактерий рекомендуется применять тест-систему НПО «Нарвак» (г.Москва). Для более эффективной подготовки генетического материала (ДНК) из крови рекомендуется использовать набор реагентов для обнаружения ДНК в сыворотке или плазме крови (НПФ «Литех»), для выделения ДНК из патматериала, молока, полевых культур -набор выделения ДНК на магнитном сорбенте.

ПЦР-метод может быть использован для прижизненной, при послеубойной лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, как дополнительный экспресс-метод.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Борисова, Татьяна Анатольевна, Казань

1. Авербах М.М. Иммунология и иммунопатология туберкулеза // М., Медицина. 1976. — с 312.

2. Авербах М.М., Мороз A.M., Никоненко Б.В. Иммуногенетика инфекционных заболеваний // М., Медицина, 1985.

3. Авербах М.М., Романова Р.Ю., Инсанов А.Б. и др. Циркулирующие иммунные комплексы и микобактериальные антигены в крови больных туберкулезом легких // ЖМЭИ, 1984.-№12. -с.91-94.

4. Аликаева А.П., Якушева О.В. Об идентификации выделенных от кур атипичных микобактерий // Труды ВИЭВ, 1978. -Т.47.-С.48-52.

5. Ахметов Т.М. Видеоспецифическая иммунохимическая характеристика антигенов M.bovis // Дис.канд.биол.наук. Казань, 1990.

6. Байгазанов А.Н. Совершенствование мероприятий при туберкулезе личных подсобных хозяйств // Туберкулез крупного рогатого скота и меры борьбы с ним// Новосибирск, 1986.-с.49-51.

7. Беклемишев А.Б., Хорошева Е.М. Дифференциальное выявление возбудителей туберкулеза в клиническом материале с использованиемдвухстадийной полимеразной цепной реакции. Билютень Сибирского отделения Рос. АМН. 1998 - №3. с.76 - 85.

8. Билько И.П., Матусевич В.Г. Современные представления об ультраструктуре и функции клеточной стенки микобактерий туберкулеза // Проблемы туберкулеза, 1986 № с.З.

9. Благодарный Я.А. Источники туберкулеза и меры профилактики // Алма-Ата, 1980. -с. 145.

10. Благодатный Я.А., Кривцова А.Е., Бионская Л.И., Блохман И.М. Оптимизация методов бактериологического исследования на туберкулез и некоторые особенности его возбудителя // Проблемы туберкулеза 1986 №9 - с.З.

11. Бокун А.О., Шербоха Ю.И. Патоморфологические изменения при псевдоаллергических реакциях на туберкулин у крупного рогатого скота* // Матер.б.Всесоюзн.конф. по патологической анатомии животных. -Тарту, 1977. -т.2. -с.105-106.

12. Болдырев А.А. Введение в биохимию мембран // М.: Высшая школа. 1986 — с.14 18.

13. Буряк Е.И. Эффективность разных способов при жизненной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота // Ветеринария, 1986. -с.23-26. -№6.

14. Ванеева Л.И., Цветкова Н.В. Иммуноферментный метод и его настоящее и будущее // Иммунология, 1980. -№2. -с. 13-19.

15. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких // София. Медицина и физкультура. 1971.-с.З 84.

16. Васильев Н.В. Биохимия и иммунология микробных полисахаридов // Томск: Издательство университета, 1984 -303с.

17. Вахидова Г.А., Гильбурд Б.Ш., Акзамов Р.А. Определение методом иммуноферментного анализа специфических к туберкулину антител

18. M.bovis класса при активных туберкулезе легких // Мед.ж. Узбекистана, 1987. -№9. -с.45-47.

19. Вейсфейлер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичных микобактерий //Будапешт: АН Венгрия, 1975. 335с.

20. Вишневская Е.Б. Особенности выделения ДНК для полимеразной цепной реакции при туберкулезе вне легочных локализаций. // Проблемы туберкулеза 1998 №5 - с.40 - 42.

21. Вишневский Б.И., Оттем Т.Ф., Марченко Л.А. применение прибора КЭФ для концентрации микобактерий туберкулеза // Лабораторное дело, 1986. -№5. -с.303-306.

22. Вишняков И.Ф., Цибанова Л.Я. Иммуноферментный анализ // Ветеринария, 1983. -№9. -с.68-70.

23. Выявление микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции у детей и подростков // Проблемы туберкулеза 1996 - №1 - с.27 - 29.

24. Гудкин B.C., Горбатов В.А., Овдиенко Н.П. и др. Актуальный вопросы взаимодействия микобактерий с макрофагами животных // Современные проблемы профилактики и лечения зоонозных заболеваний и лейкозов, Минск. -1982. -с.77-79.

25. Гулевская С.А., Немсадзе М.Н. К вопросу о микрокапсуле микобактерий туберкулеза и корд-фактора // Проблемы туберкулеза, 1974. -№3. -с.71-76.

26. Гуткин B.C., Горбатов В.А. Востряков А.П. Индуцированная биохемилюминесценция макрофагов при взаимодействии с клеточными оболочками микобактерий туберкулеза бычьего вида // Биохемилюминесценция в сельском хозяйстве. —М., 1986. —с.35-37.

27. Дзантиев Б.Б. Гетерогенные методы иммуноферментного анализа // Бюллетень ВИЭВ, 1985. -Вып.58. -с.10-22.

28. Дмитриев В.А. Иммунохимия бактериальных полисахаридов // 5 Всес. Биохим. Съезд «Наука. М., 1985 с.257.

29. Донченко А.С., Донченко В.Н., Мандро М.А., Середин В.А. Взаимосвязь клеточного и гуморального иммунитета при сенсибилизации различными микобактериями // Ветеринария, 1986. -№6. -с.28-30.

30. Емельяненко П.А., Дунаев Г.В., Кудлан Д.Г. и др. Ветеринарная микробиология -М., Колос, 1982.-245с.

31. Земская З.С., Дорожкова И.Р. Скрыто протекающая туберкулезная инфекция // М.: Медицина. 1984 с.86 - 94.

32. Зыков М.П., Ильина Т.Б. Потенциально патогенные микобактерии и лабораторная диагностика микобактериозов // М., Медицина, 1978. — 161с.

33. Каграманов А.И., Макаревич К.М. Современные вопросы эпидемиологии и выявления туберкулеза // М., Алма-ата. 1977.- с.20 — 21.

34. Каграманов А.И., Макаревич Н.М. Современные вопросы и эпидемиологии и выявления туберкулеза // М. Алма-Ата, 1977. -с.20-21.

35. Кадочкин А.Н., Иванова Н.А. Современные данные о возбудители туберкулеза// Ветеринария, 1971. -№3. -с.28-30.

36. Каплин Н.Н., Головачева С.Н. О роли противотуберкулезных антител к различным химическим субстанциям возбудителя // Проблемы туберкулеза, 1977 -№5. -с.64-66.

37. Каримова A.M. Использование питательных сред с добавлением различных препаратов для дифференциации микобактерий // Иммунология, диагностика и лечение инфекционных болезней с/х животных. Новосибирск, 1986. -с.27-38.

38. Карташева В.М. Об идентификации возбудителя туберкулеза // Ветеринария, 1971, №3. -с.28-30.

39. Кассич Ю.Я. РСК и ее применение при оздоровлении стад крупного рогатого скота от туберкулеза // Дисс.докт.вет.наук. -М., 1979.

40. Кассич Ю.Я., Борзяк А.Т., Комлексная диагностика туберкулеза // Ветеринария, 1985. -№4. -с.28-29.

41. Кныш С.В. Серологические реакции при экспериментальном туберкулезе телят // Вестник сельскохозяйственной науки, 1968, №1. — с.17-18.

42. Ковалев Г.К. О дифференциации микобактерий туберкулеза // Ветеринария, 1984, №3 с.72 - 73.

43. Коваленко И.В., Дорожкова И.Р. Обоснование и разработка выявления и идентификации форм микобактерий методом иммунофлюоресценции //ЖМЭИ, 1986. -№6. -с.35-38.

44. Козулицина Т.И., Макаревич И.М., Кадочкин A.M. Состояние и перспективы научных исследований по диагностике и профилактике туберкулеза и бруцеллеза и мерам борьбы с этим болезнями сельскохозяйственных животных // Тр. Сиб. НИВИ, Омск, 1980 с.65 -68.

45. Козулицина Т.И., Макоревич Т.М., Кадочкина A.M. Состояние и перспектива научных исследований по диагностике и профилактике туберкулеза и бруцеллеза и меры борьбы с этими болезнями с/х животных//Тр.сиб.НИВИ, г.Омск, 1980. -с.65-68.

46. Кокуричев П.И. Туберкулез // Атлас патологической анатомии с/х животных. -Д., 1973. -с.39-53.

47. Колычев Н.М. Методы индикации и обезвреживания микобактерий туберкулеза на объектах внешней среды // Дисс.докт.вет.наук. -Омск, 1983.

48. Кондратьев В.Г. Бактериологическая диагностика и биопроба при туберкулезе крупного рогатого скота // Всесоюзн.научн.конф. -Омск, 1980.

49. Конопаткин А.А., Бакулов И.А, Нуйкин Я.В. и др. Эпизоотология и инфекционные болезни с/х животных // М., Колос, 1984. -с. 163-172.

50. Коромыслов Г.Ф., Авилов B.C. Иммуноферментный анализ и применение его в ветеринарии // Бюллетень ВИЭВ, 1985. -Вып.58. -с.6-9.

51. Коромыслов Г.Ф., Устинова Г.И., Овдиенко Н.П., Козин А.И. Сравнительная иммунохимическая характеристика диагностических компонентов из микобактерий // Труды ВИЭВ, 1984. -т.61. -с.3-9.

52. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов// М., МГУ, 1984.-с. 18-68.

53. Коронелли Т.В. Липиды сапрофитных микобактерий // Дисс.канд.биол.наук. -М., 1980.

54. Кособуцкий Л.А. фаги микобактерий // Микробиология, 1971. -№1. -с.79-84.

55. Кузин А.И. Оздоровление животноводческих хозяйств от туберкулеза // М., Россельхозиздат. 1987. -141.с

56. Лазовская A.M., Сафронов В.П., Максимова Е.М. Серологическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота // Туберкулез крупного рогатого скота и борьбы с ним. Новосибирск, 1986. -с.90-96.

57. Лаптева Н.А., Исаева А.Г., Торашенидзе Л.А. Состояние местного иммунитета при экспериментальном туберкулезе легких у морских свинок // Иммунология, 1985. -№2. -с.70.

58. Малахова А.Г., Устинова Г.И., Газарх З.С. Способ получения протеинов из культур микобактерий туберкулеза и кислотоустойчивых сапрофитов для изготовления диагностических препаратов // Билютень ВИЭВ. 1979 №34 - с.36 - 37.

59. Маматова З.Б., Искандеров М.И. Иммуноферментный анализ для выявления бруцеллезных антигенов // Ветеринария, 1987. —№4. —с.26-27.

60. Марданлы С.Г., Васильева В.И., Рыбалкина Т.М. и др. Подбор специфических компонентов для постановки иммуноферментного метода с целью выявления маркеров вируса гепатита-А // Лабораторное дело, 1986. -№5. -с.294-296.

61. Мартма О.В. Современное состояние проблемы атипичных микобактерий в ветеринарии // Ветеринария, 1982. -№5. -с.22-26.

62. Мартма О.В., Тяхнас К.К. О возбудителях в течении бактериоза // Туберкулез крупного рогатого скота и меры борьбы с ним. — Новосибирск, 1986. -с.96-100.

63. Мирлина Е.Д., Ланцов В.А., Семеновский А.В., Олейник А.Н., Попова С.С., Маничева О.А., Вишневский Б.И. Диагностические возможности метода полимеразной цепной реакции при генитальном туберкулезе у женщин // Проблемы туберкулеза у 1998 - №1 - с.46 - 48.

64. Мникова Л.А., Авилов B.C., Гоголев М.М. Определение антител иммуноферментным методом // Ветеринария, 1983. -№4. -с.64-66.

65. Мникова Л.А., Авилов B.C., Гоголев М.М. Применение иммуноферментного анализа в диагностике ротовирусной инфекции крупного рогатого скота // Бюллетень ВИЭВ, 1985. -Вып.58. -с.26-29.

66. Найманов А.Х. Туберкулинизация крупного рогатого скота // Ветеринария, 1980.-№.6.-с.39-40.

67. Нарожный П.А. (1971) -В кн.: Ротов В.И., Кокуричев П.И., Савченко П.Е. // Туберкулез с/х животных. Киев, Урожай, 1978. —240.С.

68. Непоклонова И.В. Использование ИФА для выявления вируса инфекционного ринотрахеита и антител к нему у крупного рогатого скота// Дисс.канд.вет.наук, М., 1985.

69. Новак Д.Д. Туберкулез с\х животных. Алма-Ата, 1977. -140.С.

70. Новошинов Г.П. Иммуноферментный метод // Методические указания. -Казань, 1985. -с.27.

71. Нурулин А.А. Иммуноферментный анализ для выявления возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота в патологическом материале // Дисс.канд.биол.наук, -Казань, 1987.

72. Овдиенко Н.П., Козин А.И. Дифференциация неспецефических реакций на туберкулин для млекопитающих у крупного рогатого скота // Тезисы докладов Всесоюзн.научн.конф. -Омск, 1980. —с.33-35.

73. Овдиенко Н.П., Щуревский В.Е., Найманов А.Х., Сравнительное испытания туберкулинов для млекопитающих и птиц на крупном рогатом скоте // Актуальные проблемы инфекционной патологии с\х животных. Труды ВИЭВ, 1985. -т.62. -с.8-20.

74. Панин А.Н., Обухов И.Л., Шипулин Г.А. Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции // Ветеринария, 1997 №7 — с.19 — 21.

75. Пантелеев О.А., Ванеев Л.И. Непрямой твердофазный метод иммуноферментного анализа, его точность и источники погрешностей // ЖМЭИ, 1986. -№3. —с.95-99.

76. Пантелеев О.А., Ванеев Л.И., Демченко Е.Н., Семенова Г.Б. Проблемы подбора концентрации реагентов в твердофазном иммуноферментном методе при определении концентрации антител // ЖМЭИ , 1987. -№4.80-85.

77. Петров А.А., Гертман М.И., Хабибулина С.Х., Сембирцев В.Е. Сравнительная оценка различных методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Интенсификация молочного скотоводства и пути увеличения производства молока. Челябинск, 1986. -с.32-33.

78. Пинчук JI. М., Лазовская А. Л. Липиды в таксономии и идентификации микобактерий.-Горький, 1989 с.126

79. Пинчук Л.М., Лазовская А.Л. Идентификация микобактерий с применением метода газовой хромотографии жирных кислот // Вопросы взаимосвязи туберкулеза человека и животного. Алма-Ата, 1981. -с.148-156.

80. Пинчук Л.М., Лазовская А.Л., Герасимова Г.И., Воронова Е.А. Сравнительное изучение высших жирных кислот липидов M.tuberculosis и M.bovis // Проблемы туберкулеза, 1982. -№3. -с.62.

81. Пожалова Р.В., Попова Л.С., Кузьмина В.В. Сравнительная оценка классического и ускоренного методов бактериологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и птиц // Тр. Краснодарского НИВС, 1965. -т.З. -с.70-71.

82. Покровский В.И., Ермолин Т.А., Шабалина С.В., Настоящее и будущее иммуноферментного метода исследования в инфекционной патологии //ЖМЭИ, 1983. -№8. -с.3-7.

83. Приймак А.А., Владимирский М.А., Ермолин Г.А., Должанский В.М. Применение иммуноферментного твердофазного метода выявления антител к микобактериям для серологической диагностики туберкулеза //Лабораторное дело, 1986. -№9. -с.558-562.

84. Простяков А.П. Перспективы иммунохимических методов в ветеринарии // Ветеринария, 1983. -№11. -с.71-73.

85. Пташкин В.А., Гуткин B.C., Горбатов В.А. и др. РБТЛ и кожная аллергическая проба при сенстбилизации и экспериментальномтуберкулезе крупного рогатого скота // Труды ВИЭВ, 1985. —т.63. -с.21-25.

86. Радюк С.Н., Мацевич Г.Р. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза // Лабораторная диагностика, 1997 — c.l 1 33.

87. Ротов В.И., Кокуричев П.И., Савченко П.Е. и др. Туберкулез с/х животных//Киев, Урожай , 1978 — с.240.

88. Руманчик И.И., Соловенко А.А. Особенности аллергических исследований на туберкулез // Ветеринария , 1984. -№9. -с.30-31.

89. Сафин М.А. Совершенствование диагностики, профилактики и мер ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота // Дисс.докт.вет.наук. -Казань, 1980.

90. Сафин М.А. Туберкулез сельскохозяйственных животных и меры борьбы с ним // Учебное пособие. Казань, 1982. с.72.

91. Сафин М.А., Галкин Е.Б. Влияние гормональных препаратов на течение экспериментального туберкулеза // Матер.науч.конф. Казанского вет.ин-та. Казань, 1971. -с.251-252.

92. Сидоров А.К. Лабораторная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота // Ветеринария , 1969. -№12. -с.88-89.

93. Скотников О.И., Демпин В.В., Николаева Н.П., Мороз A.M., Литвинов В.И. Использование полимеразной цепной реакции в диагностике туберкулеза легких // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1999 №4 — с.81 — 84.

94. Солоненко А.А. Туберкулез и туберкулезоподобные болезни в Белоруссии //Дисс.докт.вет.наук.-Минск, 1983.

95. Солоненко А.А. Туберкулез и туберкулезоподобные болезни свиней в Белорусии // Дисс. док. вет. наук. Минск 1983.

96. Сорокина Н.В., Гаврилова Е.М., Егорова A.M., Колтовая Н.А. Свойства системы JgG—JgG человека в различных модификациях иммуноферментного анализа // ЖМЭИ, 1986. -№12. -с.68-72.

97. Тарасова Г.И. Корд-фактор, биологически активный гликолипид из туберкулиновых микобактерий // Успехи биологической химии, 1987. -т.8. -с.194-205.

98. Тузова Р.В. Патогенез туберкулеза птичьего типа у млекопитающих // Проблемы туберкулеза, 1966. -№ 1. -с.21.

99. Тузова Р.В. Туберкулез с/х животных и птиц. Минск, Урожай, 1983.-263с.

100. Туркебаева К.А., Благодарный Я.А. Патологическая анатомия туберкулеза млекопитающих и виды микобактерий // Алма-Ата, Наука, 1981.-c.216.

101. Урбан В.П., Широбокова М.М., Данко Ю.Ю. и др. Аллергическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота // Профилактика и ликвидация заразных болезней с/х животных и птиц. —JI., 1985. -с.80-85.

102. Фадеева Н.И., Дыхно М.М., Кочемасова З.Н., Кассирская Н.Т., Дегтярева Н. Выделение и изучение внутриклеточных белков туберкулезных микобактерий // ЖМЭИ, 1980 №12. -с. 39 — 42.

103. Федосеева B.C. Рубцова И.Н. Знание измененных форм возбудителя в диагностике туберкулеза // Научн. Техн. Бюл. СО ВАСХНИЛ, 1985 №32 -с.22 - 27.

104. Хазипов Н.З. Тюрикова Р.П., Нуруллин А.А. Метод твердофазного иммуноферментного анализа для выявления туберкулезных микобактерий в суспензиях // Науч.тр. Казанского вет.ин-та, 1985.-с.98-101 .

105. Хазипов Н.З., Сафин М.А., Идрисов Г.З. Туберкулез крупного рогатого скота // М., Агропромиздат, 1985. -127с.

106. Харитонов М.В. Совершенствование методов дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота // Дисс. канд. вет. наук. Казань, 1983 г.

107. Харитонов М.В. Разработка системы противотуберкулезных мероприятий в условиях широкого выявления неспецифических реакций на туберкулин. // Дисс. док. вет. наук. Казань, 1991 г.

108. Ходун Л.М. Оптимизация аллергической и лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. // Дисс. док. вет. наук. Омск, 1996 г.

109. Хоменко А.Г., Ерохин Н.В. Современные представления о строении M.tuberculosis // ЖМЭИ, 1982. -№12. -с.33-40.

110. Хоменко А.Г., Макаревич Н.М., Кубин М., Бурьянова Б., Винокурова М. Опыт коллективного изучения нетуберкулезных микобактерий // Проблемы туберкулеза, 1981 №8. с.62 — 66.

111. Хоменко А.Г., Фадеева Н.И., Голышевская В.И. Морфологические и биохимические изменения микобактерий туберкулеза в процессе химиотерапии // Проблемы туберкулеза, 1983. -№7. -с.48.

112. Чепик Г.В. Вопросы дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Матер.Всесоюзн.научн.конф., Омск, 1980. — с.56-57.

113. Шарифуллин Э.А. Серологическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота и идентификация микобактерий // Дисс.канд.вет.наук, Алма-Ата, 1981.

114. Шаров А.Н. Изучение эффективности применения симультанной пробы с комплексным аллеогеном из атипичных микобактерий (КАМ) при диагностике туберкулеза // Научн.труды ВГНКИ, 1985. -с.3-8.

115. Шаров А.Н., Седов В.А. Тест-системы ПЦР при туберкулезе. // Ветеринария, 1998.- № 3. -с.20 22.

116. Шаров А.Н. Эффективность методов прижизненной диагностики туберкулеза. // Ветеринария, 2000.-№2. -с. 16.

117. Шебанов Ф.В. Туберкулез // М., Медицина, 1981.

118. Шлыгин И.В., Лакман Э.Д. Значение иммунологических реакций при эпизоотическом обследовании свежих и стационарных очагов туберкулеза крупного рогатого скота // Сборник НИВ И, Омск, 1976. -Вып.27. -с.35-41.

119. Шуцкая Е.И., Земинский Ю.Г., Дербикова Т.И., Недточный В.В. Хемилюминисцентный метод в диагностике туберкулеза // Биохемилюминесценция в сельском хозяйстве. -М., 1986. -с.90-92.

120. Юдин Г.А., Чулков Н.А. Дифференциальная диагностика туберкулеза и ее экономическая эффективность // Научн.труды ВГНКИ, 1985.-с. 17-25.

121. Якупов Т.Р. Иммуноферментный анализ в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. // Дисс. канд. вет. наук, Казань, 1991 г.

122. Accaria N., Goldman D. Chemical composition of the cell wall of the H37RV strain of Mycobacterium tuberculosis // J.Bact., 1970. -№ 102. -p.733-736 .

123. Amicosante M. // Journal of Clinical Microbiology, Mar, 1995, p.629-630.

124. Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins withgluteraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies // Immunochemistry, 1969. -№6. -p.43.

125. Azuma J., Yamamura Т., Tahard Т., Onoue K. Isolation of tuberculin active peptides from cell wall fraction of human tubercle bacillus strain "Ayama B" // Jap. J.Microbiol, 1969. -V.13. -p.220-222.

126. Benjamin R.G., Debanne S.M., Ma Y., Daniel T.M. Evalution of micobacterial antigens in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the serodiagnosis of tuberculosis // J.Med.Microbiol., 1984. -V.18. — p.309-318.

127. Bennet J.J Les difficulties d'interpretation lors du depistage de la tuberculose bovine: remedes possible // Lyon, 1984. —p. 1-17.

128. Berthe M. Molecular typing of M.bovis isolates from Cameroon // JCN, January, 2001, -p. 222 227.

129. Bhattacharya A., Ranadive S.N., Kale M., Bhattacharya S. Antibody-based ELISA for determination of immune complexes in clinical tuberculosis // Am.Rev.Respir. Disease, 1986. -V.134, #2. -p.205-209.

130. Boguslaski R.C., Li T.M. Homogenous immunoassay // Appl. Bioch. And Technol., 1982. -V.7, #5. -p.401-414.

131. Caimi K. Sequence analysis of the direct repeat region in Mycobacterium bovis // JCM, March, 2001, -p. 1067 1072.

132. Chasey D. A simple and rapid immununepoxidasae test for the detection of virus antigens in tissue culture // J.Vet.record., 1980. #14. -p.506-507.

133. Cocito., Delville N. Biological chemical immunological and staining properties of bacteria isolated from tissues of leprosy patients // Eur. J. Epidemiology., 1983 №1 p.202 -206.

134. Costello E. Study of Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis and Spoligotypin for Epidemiological Investigation of M.bovis Infection // JCM, October, 1999, -p.3317 3322.

135. Cousine D. Evaluation of four typing techniques in epidemiological investigations of bovine tuberculosis // JCM, January 1998. -p.168 — 178.

136. Daniel T.M., Debanne S.M. The serodiagnosis of tuberculosis and other mycobacterial diseases by enzyme-linked immunosorbent assay // Amer.Rev.Respir. Diseases, 1987 . -V.135. -p.1137-1151.

137. Daniel T.M., Oxtoby M.J., Pinto S. The immune spectrum in potients with pulmonary tuberculosis // Am.Rev.Respir.Dis., 1981. -V.123. -p.556-559.

138. Drut R. Disseminated bacillus Calmette-Guerin milliary type: findings and diagnosis using polymerase chain reaction // Pediatric and Developmental Pathology 1, 1998, -p. 143-148.

139. Engvall E., Jonsson K., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochem ., 1971. —V.8. -p.871-874.

140. Fisher L.N.M., Mauch H. Detection of mycobacterial antigenes by enzyme-linked immunosorbent assay using policlunal antibodies // Zbl. Bacteriol., Microbiol. And Hys., 1986. -V.262, #2. -p.284.

141. Francis I., Seiler R.I., Frost A.I. The effeciency and dose bovine purified protein derivative tuberculin // Australian veter. J., 1978. -#54. — p.45-47.

142. Frothigham R. Differentiation of strain in mycobacterium tuberculosis complex by sequence polymorphisms, including rapid identification of M.bovis BCG // Journal of Clinical Microbiology, Apr, 1995. -p.840-844.

143. Gamier T. The complete genome sequence of Mycobacterium bovis // NCBI, Jun 2003. -p.7877 7882.

144. Gilmour N.J.R., Augus K.N. The specificity and senritivity of the fluorescent antibody test in cattle experimentally infected with M.avium and M.jonnei. // Res. In veter. Sc., 1976.-V.20. -#l.-p.69.

145. Grange J.M. The humoral immune response in tuberculosis : its nature, biological role and diagnostic usefulness // Advances in Tuberculosis Research, 1984. -№21. -p. 1-78.

146. Grange J.M., Gibson J., Antonia B. The specificity of the humoral immune response to soluble Mycobacterial antigens in tuberculosis // The Infer. J. of Tuberculosis, 1980. V.61, #3. -p.154-156.

147. Grange J.M., Kardjito T. Serological test for tuberculosis; con the problem of low specificity be evercome // Indian J. of Chest Diseases and Appl.Sci., 1982. -V.24, #2-3. -p.108-117.

148. Gray G.R., Wong M.N.Q., Denielson S.J. The major mycolic acids of M.smegmatic // Progr.Lipid.Res., 1982. -V.21, #2. -p.91-107.

149. Gray G.R., Wong M.Y., Denicison S. Y. The major acids of M.smegmatis // Prog.lipid. Res., 1982. V21, №91. -p. 107.

150. Grenner G. Principles and applications of homogeneus and heterogeneus enzyme immunoassay // Hoppe-Seyler's Z.Physiol.chem., 1982 -V.363. #9. -p.1005-1006.

151. Griender K., Wendt K., Fuchs H.W., Boretius J. Atipische Mycobacterion als Erreger enzootisch verlaufender Mastitigen // Mh.Veter.Med., 1984. -V.39, #21. -p.721.

152. Hawkey P.M. // Rev. Med. Microbiol. 1994. - Vol.5, №1 - 3. p.21 -32.

153. Hill H.R., Matsen J.M. Enzyme-linked immunosorbent assay and radioimmunoassay in the serologic diagnosis of infectious diseases // J.Infect.Diseases, 1983.-V. 147, #2. -p.250-263.

154. Hosen H. Moulds in allergy // J.Auth, a Res., 1977. #15. -p. 151-156.

155. Imaeda Т., Kanetsuna F., Galine B. Ultrastructure of cell walls of genus Mycobacterium // J.Ultrastruct. Res., 1968. -V.25, #1-2. -p.46-63.

156. Janicki B.W., Wright G.L., Daniel T.M. Iselation and characterisation of mycobacterial antigens. I. Culture filtrate antigens of M.tuberculosis H37RV strain // In processing, 10th , Joint US. Japan Tuberculosis Res. Conf., 1975. -p.206-227.

157. Jarnagin J.L., Colgruve G.S. Identification of M.bovis using miniaturised thin-layer chromatography and morphologic characteristics // Amer. J.Vet.Res., 1986. -V.47, #11. -p.2346-2348.

158. Juana Magdalena, Philip Supply, and Camille Locht. Specific Differentiation between Mycobacterium bovis BCG and Virulent Strains of the Mycobacterium tuberculosis Complex // Journal of Clinical Microbiology, September 1998. № 9. -p. 2471-2476.

159. Kalish S.B., Radin R.G., Pheir J.P. et al. Use of an enzyme-linked immunosorbent assay techique in the differential diagnosis of active purmonary tuberculosis in humanse // J.Infec.Diseases, 1983. —V.147, #3. -p.523-530.

160. Karen G.L., Joseph O.F. Identificatione of cytoplasmic membrane protein antigens of Mycobacterium avium, M. intracellulare and M. scrofulaceum // Can. J. Microbiol., 1989 v.35. -№5. - p.529 - 534.

161. Kato M. Immunochemical properties of anti-cord factor antibody // Infect.Immun., 1973.-p.9-13.

162. Kato M., Goren M. Synergistic action of cord factor and mycobacterial subfaticles on mytochochondria // Infect. Immunity, 1974. -v.10. — p.733 736.

163. Kemp H.A., Morgan M.R.A. Studies on the determental effects of bivalent binding in a microtitration plate ELISA and possible remidies // J. Immun. Meth., 1986. -V.94, #1-2. -p.65-72.

164. Khuller G.K., Malik U., Subrahmanyam B. Immunological studies wich sulpholipids of Mycobacteria // Tubercl., 1982 v63.-№2. - p. 107.

165. Lamb J.R., Yong D.B. A nuvel approach to the identification of T-cell epitopes in Mycobacterium tuberculosis using human T-lymphocyte clones // Immunology, 1987. -V.60. #1. -p. 1-5.

166. Larsson L. Use of gas chromatography-mass spectrometry selected ion monitoring for rapid diagnosis of mycobacterial infections, including tuberculosis // Rec.Rev. Mass Spectrom. Biochem., Meg. And Env. Res. 8. Amsterdam e.a., 1983. -p.49-54.

167. Lee H, Park HJ, Cho SN, Bai GH, Kim SJ. Species identification of mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of the rpoB gene. J Clin Microbiol 2000 Aug, 38(8). -p.2966-2971.

168. Lentonen O.P., Viljanen M.K. Antigen attachment in ELISA // J. of immunol. Meth., 1980. -#34. -p.61-70.

169. Magdalena J. Identification of a new region specific for members of Mycobacterium tuberculosis complex. Journal of Clinical Microbiology, September, 1998, -p.3471-2476.

170. Portillo P. Multiprimer PCR system for differential identification of Mycobacteria in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology, February 1996. -p.324-328.

171. Sales M.P.U. Genetic Diversity among M.bovis Isolates: a Preliminary Study of Strains from animal and Human Sources. JCM, December, 2001. -p.4558 4562.

172. Sechi L.A, Guido Leon, Stefano A. Lollai, Ilaria Dupre, Paola Molicotti,1 Giovanni Fadda,3 and Stefania Zanetti1 Different Strategies for Molecular Differentiation of Mycobacterium bovis Strains Isolated in

173. Sardinia, Italy. Applied and Environmental Microbiology, April, 1999. -p. 1781-1785.

174. Seichi L.A., Zanetti S., Dupre I., Deloga G. Fadda G. Enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences as molecular tagets for typing of Mycobacterium tuberculosis strains. J. of Clin. Microbiology. Jan., 1998. -p. 128- 132.

175. Ma Yu, Wang Yu-Mei, Daniel T.M. Enzyme-linked immunosorbent assay using Mycobacterium tuberculosis antigen 5 for the diagnosis of pulmonary -tyberculosis in China // Amer. Rev. Res. Diss., 1986. —V.134, №6.-p. 1273-1275.

176. Maggio T. Enzyme Immunoassay // CRG Press Inc. Boca Raton. -Florida, 1981.

177. Meyer T.J., Ribi E., Azuma J. Biologically active components from mycobacterial cell walls: suppression and regresior of strain 2 quinea pig hepatoma // J.Natl.Conser Instr., 1974. -V.52. -p.103-111.

178. Mieko G., Katsuko O., Vasio S. // I. Jap. Assoc. J. Infect. Dis 1995. v. 69. - №5. - p.539 - 545.

179. Minnikin D.B., Minnikin S., Megan J. Mycolic acid paterns of species of Mycobacterium // Arch. Microbiol., 1984 v. 139.- №2. - p.225 - 231.

180. Mitre H. Die differenzierung van bakyerienspezies mit hilfe electrophoretischer verfahren // Fortschr. Veter. -Med., 1978. -#28. —p.237-251.

181. Morris J.A., Stevens A.E., Stuart P. A pilot study to assess the usefulness of ELISA in detecting tuberculosis in bedgers // The Vet. Rec., 1979. —V.104, #1. -p.14.

182. Neil S.D., Hanna J., O'Brein J.J. Radiometric detection of mycobacteris in abattoir specimens from tuberculin reactive cattle // Vet. Rec., 1986. -V.118, #11. -p.304.

183. Ngo T.T., Bovaird J.H., Lenhoff H.M. Separation free amperometric enzyme immunoassay // Appl.Biochem. Biotechel., 1985. -V.l 1. -p.63-70.

184. Phillips A.P., Martin K.L., Horton W.H. The choise of methods for immunoglobulin IgG purification: yield and purity of antibody activity // J.Immun.Meth., 1984. -V.74, #2. -p.385-393.

185. Redmond W.B., Botes J.H., Engel H.W. Methods for bacteriophage typing of mycobacterium // Meth.Microbiol. London, 1979. -#13. -p.345-375.

186. Reich M., Affronti L.F., Wright G.L. Isolation and partial characterisation of the most immnologically reactive antigen from Mycobacterium tuberculosis H37RV culture filtrate // J. Tubercle, 1982. -V.63, #2. -p.99-106.

187. Rich A. The Patogenesis of Tuberculosis // Baltimore, 1951. —83P.

188. Richeldi L., Barnini S., Soltini S. // Eur.Res. J. 1995 - v.8. suppl.20 -p.689 —700.

189. Rizvan M. Metobolism of Mycobacteria // J. Bioscience., 1985. V. № 3-4.-p.421-431.

190. Rodriguez, J. G., G. A. Mejia, P. Del Portillo, M. E. Patarroyo, and L. A. Murillo. 1995. Species-specific identification of Mycobacterium bovis by PCR // Microbiology, -p.2131 -2138.

191. Romero RE, Garzon DL, Mejia GA, Monroy W, Patarroyo ME, Murillo LA. Identification of Mycobacterium bovis in bovine clinical samples by PCR species-specific primers // Can J Vet Res 1999, Apr; 63(2). -p.101-106.

192. Rouillon A., Perdrizet S., Parrot R. Transmission of tubercle bacilli: the effect of chemotherapy // Tubercle, 1976. -V.57. -p.275.

193. Rubenstein K.B., Schneider R.S., Ullman E.F. "Hamogeneoas" enzyme immunoassay, New Immunochemical technique // Biochem. Biophys. Res. Common., 1972.-V.47.-p.846-851 .

194. Runyon E.N. Differentiation des mycobacteries anonyms (atipiques) et des bacillus tuberculosis des mummifies // Bull. Un.Int.Tubers., 1959. — V.29. —p.72-82.

195. Sauer M.J., Foulken J.A., Morris B.A. Principles of enzyme immunoassay // Immunoassay Food Anal. London, New-York, 1985. -p.53-72.

196. Schaefer W.B. Serologic identification and classification of the atypical mycobacteria by their agglutination // Amer.Rew.Resp.Dis.,1965. -#92. -p.85-93.

197. Schuurs A.H., Van Weemen B.K. Enzyme immunoassay // Clin. Chem. Acta, 1977. -V.81. -p. 1-40.

198. Schuurs A.H.W.N., Gribnau T.C., Lauvering J.H.W. Affinity chromatogr and related techn // Theor. Aspects. Ind. And Biomed. Appl. Proc. Int. Symp., Veldhaqven, VI, 1981. -Amsterdam e.a., 1982. -p.343-356.

199. Soini H., Bottger E.C., Viljanen M.K. Identification of mycobacteria by PCR-based sequence determination of the 32-kilodalton protein gene // J. Clin. Microbiol, 1994. -№ 32 (12). -p. 2944-2947.

200. Straus E.W. Binding assay for detection of mycobacteria // USA, Montefiore Medical Center, 1983.

201. Stroebel A.B., Richandson H. ELISA based serological diagnosis of pulmonary infection by Mycobacterium tuberculosis 9 // Congr.lat.amer.microbiol., Sao Paulo, 1983,-Programa res. Sao Paulo, 1983. -p.234.

202. Takezo U., Yasuo M., Takeshi Y. Biochemical mechanisms of antibiotic resistance in a clinical isolate of M.fortuitum // Am.Rev.Resp.Dis., 1986. —V133, #4. -p.653.

203. Taylar F.G.R., Patel D., Baerne E. Comparison of sensitive of ELISA and radioimmunoassay for detection of class specific antibody in mour serum // J.Immun.Meth., 1983. -V.65, #1-2. -p.65-73.

204. Thoen C.O., Himes E.M. Pathogenesis of Mycobacterium bovis infectione // Prog. Vet. Microbiol. Immun., 1986. -v.2. -p 198 214.

205. Thoen C.O., Himes E.M. Patogenesis of Mycobacterium bovis infection // Prog.Vet.Microbiol.Immun., 1986. -V.2. -p. 198-214.

206. Thoen C.O., Malstrom C., Mills K. Use of enzyme-linked immunosorbent assay for detecting mycobacterial antigens in tissues of M.bovis infected cattle // Am.J.Vet.Res., 1981. -V.42, #10. -p.1814-1815.

207. Voller A., Barlett A., Bidwell D.E. Enzyme immunoassay with special reference to ELISA techiques //J.Clin., Patch., 1978. -V.31. -p.507-520.

208. Williams G.T., Williams W.J. Granulomatous inflammation a review //J.Clin.Patch., 1983. -V.36. -p.723-733.

209. Yo Komizo Y., Yugi H., Merkal H.S. A method for avoiding false-positivereactions in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for thediagnosis of bovine paratuberculosis // Jap.J.Vet.Sci., 1985. -V.47, #1. -p.lll.

210. Zhang Y. Molecular basis for the exquisite sensivity of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid. JCM, November, 1996. -p. 13212 -13216.

Информация о работе

Борисова, Татьяна Анатольевна
кандидата биологических наук
Казань, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Современные ПЦР-системы для индикации и идентификации микобактерий и диагностическая значимость полимеразной цепной реакции при туберкулезе крупного рогатого скота - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы