Использование полимеразной цепной реакции в целях мониторинга благополучия по микобактериальным инфекциям зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных

Калмыков, Виктор Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Использование полимеразной цепной реакции в целях мониторинга благополучия по микобактериальным инфекциям зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Использование полимеразной цепной реакции в целях мониторинга благополучия по микобактериальным инфекциям зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных"

На правах рукописи

005050992

КАЛМЫКОВ Виктор Михайлович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗИОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ЦЕЛЯХ МОНИТОРИНГА БЛАГОПОЛУЧИЯ ПО]У1ИКОБАКТЕРИАЛЬНЫМ ИНФЕКЦИЯМ ЗООПАРКОВЫХ, ЦИРКОВЫХ И СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ животных

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

г 8 ПАР 2013

Щелково - 2013

005050992

На правах рукописи

КАЛМЫКОВ Виктор Михайлович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ЦЕЛЯХ МОНИТОРИНГА БЛАГОПОЛУЧИЯ ПО МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫМ ИНФЕКЦИЯМ ЗООПАРКОВЫХ, ЦИРКОВЫХ И СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Щелково-2013

Работа выполнена в лаборатории микобактериозов ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии (ВИЭВ).

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Найманов Али Хусинович - доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ, заведующий лабораторией микобактериозов ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

Матвеева Ирина Николаевна - доктор биологических наук, заведующая отделом молекулярной биологии и вирусологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН

Букова Наталия Константиновна — доктор биологических наук, профессор, учёный секретарь ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

Ведущая организация: Институт ветеринарной экспертизы, санитарии и

экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств».

Защита диссертации состоится «06» марта 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щёлковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; тел./факс: 8 (496) 56 - 723 - 63; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН»

Автореферат разослан «05» февраля 2013 г. и размещен на сайте http://www.vak.ed.gov.ru.

Учёный секретарь диссертационного совета, -г"

кандидат биологических наук Ю.Д.Фролов

1 Общая характеристика работы

1.1 Актуальность проблемы. Внедрение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лабораторную диагностику туберкулёза животных в нашей стране показало необходимость дальнейшего совершенствования этого метода с целью исключения возможности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов и повышения достоверности исследования.

Известно, что наиболее трудоёмким этапом ПЦР-анализа является выделение нуклеиновых кислот. Автоматизация этапа выделения ДНК позволяет сократить количество лабораторных ошибок и повысить эффективность выявления микобактерий туберкулёза из исследуемого материала (B.C. Зайцев с соавт., 2007; M.J. Espy et al., 2001, 2006; P. Hammer et al., 2002; J.H. Knepp et al., 2003; J.R. Stabel et al., 2004; S. Ravas, L.H. Stanker, 2005; D. Herthnek et al., 2006; C.V. Jaravata et al., 2006). Поэтому, дальнейшие совершенствования в области молекулярной диагностики туберкулёза животных должны быть направлены на автоматизацию ПЦР-анализа.

За рубежом проблемам диагностики и профилактики инфекционных болезней диких животных уделяется особое внимание, т.к. места их содержания (зоопарки, цирки и др.) считаются зонами повышенного риска. В зоопарках ряда стран имеются специальные рекомендации по диагностике и профилактике инфекционных болезней диких животных. Однако в РФ подобных рекомендаций не существует, и ветеринарные специалисты вынуждены руководствоваться только рекомендациями, разработанными для домашних и сельскохозяйственных животных. Это создаёт серьёзные проблемы для сохранения здоровья диких животных (Г.И. Блохин, 2006; М.В. Альшинецкий, 2004, 2009; R.J. Montali, S.K. Mikota, L.I. Cheng, 2001; A. Lecu, R. Ball, 2011).

В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» (2002) основным методом прижизненной диагностики туберкулёза животных является внутрикожная туберкулиновая проба. Однако провести туберкулинизацию диких животных в зоопарках и цирках не всегда

представляется возможным из-за их агрессивности. Некоторые животные (слоны, бегемоты, носороги) имеют толстую кожу, в которую практически невозможно ввести туберкулин и, поэтому, внутрикожная туберкулиновая проба не может использоваться как основной метод диагностики туберкулёза данных животных. Кроме того, в 2003 г. в статье «Экологический мониторинг при туберкулинодиагностике крупного рогатого скота», опубликованной в издании «Агроеколопчний журнал» №1 В.В. Власенко, А.П. Лысенко с соавт. утверждали, что существующий технологический регламент изготовления ППД-туберкулина для млекопитающих (ФГУП «Курская биофабрика») не обеспечивает стерильность и специфичность препарата. Это, по мнению авторов статьи, способствует поступлению с туберкулином в организм крупного рогатого скота адаптивных форм возбудителя туберкулёза. Для обеспечения общепринятого международного требования безопасности туберкулиновых препаратов разработчик включил в технологический регламент тест на специфическую безвредность ППД-туберкулина для млекопитающих, результаты которого подтверждают отсутствие в готовом препарате живых микобактерий.

Паратуберкулёз крупного рогатого скота был и остаётся одной из сложно контролируемых и диагностируемых хронических инфекций. В последние годы в зарубежной литературе появились сообщения об успешном испытании ПЦР при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота и овец. Авторы оценивают ПЦР как более точный и экспрессный метод идентификации возбудителя паратуберкулёза и рекомендуют его для диагностики и включения в программы борьбы с этой инфекцией (N.G. Jaimes et al., 2008; J. Szteyn et al., 2008; A. Doosti, S. Moshkelani, 2010).

В отечественной литературе данных о возможности применения ПЦР для диагностических исследований на паратуберкулёз крупного рогатого скота нами не обнаружено.

сравнительно низкую эффективность классических методов прижизненной и лабораторной диагностики, изучение возможности применения метода ПЦР при диагностике микобактериальных инфекций зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных является своевременным и актуальным.

1.2 Цель исследований: оптимизация ПЦР-анализа и изучение возможности применения полимеразной цепной реакции для мониторинга микобактериальных инфекций зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных.

1.3 Основные задачи исследований:

1 Провести культуральные и молекулярно-генетические исследования всех трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике при диагностике туберкулёза и паратуберкулёза животных (ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM), на наличие микобактерий и ДНК микобактерий.

2 Провести сравнительное изучение эффективности автоматического и «ручного» выделения ДНК из различных видов биоматериала с целью оптимизации ПЦР-анализа для мониторинга микобактериальных инфекций животных.

3 Провести ПЦР—исследование различных видов биоматериалов и объектов внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина и определить возможность применения ПЦР для мониторинга благополучия животных по туберкулёзу.

4 Определить диагностическую ценность и возможность применения ПЦР в общем комплексе лабораторных исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.

1.4 Научная новизна. Впервые проведено исследование всех трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике для прижизненной диагностики туберкулёза и паратуберкулёза животных на наличие микобактерий и ДНК микобактерий. Исследованием методами:

культуральным, ПЦР и секвенирования установлено, что ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза животных и ДНК нетуберкулёзных микобактерий.

Впервые определена эффективность автоматического выделения ДНК микобактерий из различных видов биоматериала в сравнении с «ручным» методом, что позволило оптимизировать ПЦР-анализ микобактериозов животных. Установлено, что при автоматическом выделении ДНК повышается информативность и достоверность метода за счёт увеличения объёма исследуемой пробы до 1,0 мл, сокращается время проведения исследований, исключается возможность контаминации реагентов и проб, снижается вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПЦР.

Впервые показана возможность применения ПЦР в целях мониторинга благополучия диких животных по туберкулёзу в зоопарках и цирках при исследовании различных видов биоматериала от данных животных и объектов внешней среды.

Впервые установлена возможность применения ПЦР и определено её место в общем комплексе диагностических исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.

1.5 Практическая значимость. Результаты исследований включены в сборник «Методические наставления по проведению исследований при микобактериозах животных», рассмотренные и одобренные на заседании учёного совета Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) (протокол № 1 от 25.01.2011 г.), на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 27.04.2011 г.), утверждённые Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 03.10.2011 г. Методические наставления награждены Дипломом XIV Российской агропромышленной выставки «Золотая осень» (Москва, 2012 г.)

По результатам научно-исследовательской работы разработаны Методические наставления «Мониторинг благополучия диких животных по туберкулёзу в зоопарках и цирках Российской Федерации», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (протокол № 4 от 16.04.2012 г.), на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 4 от 21 сентября 2012 г.), утверждённые Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 09.11.2012 г.

1.6 Основные положения, выносимые на защиту:

- ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM производства ФГУП «Курская биофабрика» не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза и ДНК нетуберкулёзных микобактерий.

-Оптимизация ПЦР-анализа путём автоматического выделения ДНК микобактерий из различных видов биоматериала для мониторинга микобактериозов животных.

- Результаты ПЦР-исследований различных видов биоматериала и объектов внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина на Цветном бульваре в целях мониторинга благополучия животных по туберкулёзу.

- Диагностическая ценность и возможность применения ПЦР в общем комплексе лабораторных исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В

соответствии с формулой специальность 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» представляет собой область науки, изучающей систематику, структуру, физиологию, биохимию, генетику, экологию патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов), имеющих ветеринарное

значение, эпизоотологические и экологические закономерности возникновения, распространения инфекционных болезней и иммунологию сельскохозяйственных, домашних и диких животных, изучающая и разрабатывающая методы, средства и организационные основы диагностики, лечения, профилактики и ликвидации этих болезней. В диссертационной работе приведены результаты исследований всех аллергенов, используемых для диагностики туберкулёза и паратуберкулёза животных, на наличие микобактерий и их ДНК, сравнительного изучения «ручного» и автоматического выделения ДНК из биоматериалов, ПЦР-исследований различных видов биоматериалов и объектов внешней среды от разных видов диких животных зоопарка и цирка в целях мониторинга благополучия по туберкулёзу, возможности применения ПЦР в общем комплексе лабораторных исследований при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота.

Результаты научного исследования соответствуют пункту 5 паспорта специальности.

1.8 Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования методом ПЦР и обобщение результатов по теме диссертационной работы выполнены автором самостоятельно. Аллергические исследования проведены совместно с профессором А.Х.Наймановым, культуральные исследования - с ведущим научным сотрудником лаборатории микобактериозов ВИЭВ Н.Г. Толстенко, секвенирование фрагментов ДНК микобактерий — совместно с научными сотрудниками ЦНИИЭ Е.А. Долговой и М.В. Альварес Фигероа.

1.9 Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на: 7-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (2010), межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ, Москва (2012).

Материалы диссертации используются в учебном процессе при проведении лекционных и практических занятий по дисциплине «Современные проблемы биологии» со студентами (магистры биологии) ветеринарно-биологического факультета Федерального бюджетного

государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина».

1.10 Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы четыре научные работы, в том числе три статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринарная медицина» -2 и «Российский ветеринарный журнал» -1), одна - в сборнике конференции с международным участием.

1.11 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 149 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы (258 источников, из которых 136 отечественных и 122 иностранных). Работа содержит 8 таблиц, 10 фотографий и 15 графиков.

Благодарности. Автор выражает благодарность главному ветеринарному врачу ГУК «Московский зоологический парк» М.В. Альшинецкому, ветеринарному врачу Московского цирка Никулина С.Я. Герасиной за оказанную консультативную и методическую помощь.

2 Собственные исследования

2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2009-2012 гг. в лаборатории микобактериозов ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ), на опытной базе о. Лисий Вышневолоцкого отдела ВИЭВ и ФГБУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория (ЦНМВЛ).

Для исследования использовали три аллергена производства ФГУП «Курская биофабрика»: «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих» стандартный раствор, серия №3, контроль №3, изготовленный 27.01.09 г.; «Туберкулин очищенный (ППД) для птиц», серия 15, контроль 15, изготовленный 14.08.2008 г. «Аллерген сухой очищенный комплексный из

атипичных микобактерий (КАМ)», серия 7, контроль 7, изготовленный 25.07.2007 г.

Культуральные исследования проводили путём посева аллергенов на 10 пробирок со средой Левенштейна-Йенсена и на 10 пробирок со средой ФАСТ-ЗЛ. За посевами наблюдали в течение трёх месяцев. Через 10, 30, 45 и 60 дней после посева для ПЦР были взяты смывы с поверхности питательных сред.

Для ПЦР использовали тест-системы «МТБ-КОМ», «МТБ-ДИФ», «АВИУМ» и «ПАРАТУБ» (ЦНИИЭ). Постановку ПЦР и анализ результатов проводили на приборе RotorGene-6000 производства «CorbettResearch» (Австралия), а также на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технологии», Россия).

Секвинирование специфических последовательностей 16S рДНК и internal transcribed spacer [ITS] региона проводили в соответствии с алгоритмом типирования микобактерий, предложенным American Society for Microbiology.

Для сравнительного изучения эффективности автоматического и «ручного» выделения ДНК использовали штамм M.bovis BCG «Предприятия по производству бактерийных и вирусных препаратов Ставропольского НИИ вакцин и сывороток» в разной концентрации и в разном объёме (0,1 и 1,0 мл), четыре музейные культуры микобактерий лаборатории микобактериозов ВИЭВ (M.bovis, M.tuberculosis, M.avium, M.paratuberculosis), две пробы патматериала от больных туберкулёзом коров, 13 проб фекалий и пять проб патматериапа от подозрительных в заражении паратуберкулёзом коров.

Для «ручного» выделения ДНК использовали набор «ДНК-сорб—В» (ЦНИИЭ), автоматическое выделение ДНК проводили на приборе NucliSens EasyMag (Биомерье, Франция) в соответствии с инструкцией.

В целях мониторинга благополучия диких животных зоопарка и цирка по туберкулёзу для ПЦР-исследования двукратно были отобраны:

• в зоопарке - сборные пробы фекалий из 19 вольеров с разными животными (первый раз) и из 21 вольера (второй раз), от птицы - помёт из 19 клеток, а также с берегов большого и малого прудов; смывы с поверхности стен и пола, а также вода из поилок 19 вольеров с животными; смывы с пола и вода из поилок 11 клеток с дикой птицей;

• в цирке - носовая слизь и фекалии от девяти обезьян; смывы из хобота и фекалии от пяти слонов (трёхкратно в течение 10 дней с интервалом 3 дня); кровь, фекалии и носовая слизь от шести верблюдов; смывы с поверхности стен и пола, вода из поилок загонов для слонов, вольеров с обезьянами и верблюдами.

Перед ПЦР-исследованием обезьяны и верблюды были исследованы внутрикожной пробой с ППД-туберкулином для млекопитающих.

Для определения диагностической ценности и возможности применения ПЦР в комплексе исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота были исследованы 52 пробы фекалий и 17 проб патматериала (кусочки кишечника) от убитых с диагностической целью коров из двух хозяйств.

Статистическую обработку данных проводили по критерию у2 с использованием программы «Microsoft Excel», пособия В.П.Ерёмина «Элементы математической обработки биологического эксперимента» (Ленинград, 1974).

2.2 Результаты исследований

Культуральные и молекулярно-генетнческне исследования всех трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике при диагностике туберкулёза и паратуберкулёза животных (ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и КАМ), на наличие микобактерий и ДНК микобактерий.

При культуральном исследовании трёх аллергенов на протяжении всего срока наблюдения (3 месяца) роста микобактерий на питательных средах не наблюдали. Для подтверждения отсутствия роста микобактерий дополнительно

исследованы смывы с поверхности всех питательных сред методом ПЦР через 10, 30, 45 и 60 дней после посева аллергенов.

Результаты культуральных и ПЦР-исследований аллергенов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты культурального и ПЦР-исследования аллергенов

Аллерген Культуральное исследование на питательной среде: ПЦР-исследование тест—системой:

Левенштейна-Иенсена ФАСТ-ЗЛ «МТБ-КОМ» «АВИУМ»

1 2 3 4 5

ППД-туберкулин для млекопитающих Отсутствие роста микобактерий в течение всего срока наблюдения ДНК М. bovis и М.avium не выделены

ППД-туберкулин для птиц

KAM

Смывы с поверхности питательных сред Левенштейна-Иенсена и ФАСТ-ЗЛ -

Как видно из данных таблицы 1, ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД—туберкулин для птиц и KAM не содержат микобактерий. В смывах с поверхности питательных сред ДНК М.bovis и М.avium также не обнаружены.

При исследовании ППД-туберкулина для млекопитающих, ППД— туберкулина для птиц методом ПЦР с использованием тест-систем «МТБ-КОМ» и «АВИУМ» ДНК M.bovis и М.avium не обнаружены.

Выделенные из трёх аллергенов ДНК были исследованы с помощью алгоритма типирования микобактерий, предложенного American Society for Microbiology, основанного на секвинировании специфических последовательностей 16S рДНК и internal transcribed spacer [ITS] региона. Данный алгоритм позволяет обнаруживать микобактерии и определять их видовую принадлежность путем сравнения анализируемой последовательности 16S рДНК и региона ITS с аналогичными

последовательностями, приведенными в международной базе данных RIDOM (http://rdna4.ridom.de/mycobacteria/index.html). При амплификации выделенной из аллергенов ДНК, согласно указанному протоколу, специфический ампликон получен не был, что свидетельствует об отсутствии в исследованном материале ДНК микобактерий.

Таким образом, установлено, что ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM производства ФГУП «Курская биофабрика» не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза животных и ДНК нетуберкулёзных микобактерий и не могут быть источниками возбудителя туберкулёза животных, что соответствует технологическому регламенту изготовления данных аллергенов.

Сравнительное изучение эффективности автоматического и «ручного» выделения ДНК из различных видов биоматериала с целью оптимизации ПЦР-анализа для мониторинга микобактериальных инфекций животных

На начальном этапе работы была использована суспензия штамма М.bovis BCG в разной концентрации от 1х106 до 102 м.т./мл.

Для получения более достоверных результатов «ручного» выделения из подготовленных проб были сформированы контрольные панели, которые исследовали параллельно с нами в шести ветеринарных лабораториях.

Пробы, подготовленные для автоматического выделения, были исследованы автором в трёх повторах.

В соответствии с инструкцией к тест-системе для «ручного» выделения ДНК объём пробы составляет 0,1 мл, для автоматического - до 1,0 мл.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как показывают данные таблицы 2, при автоматическом выделении ДНК в пробах объёмом 1,0 мл эффективность выделения составляла 100 %.

В пробах объёмом 0,1 мл эффективность выделения ДНК при автоматическом выделении составила также 100% против 72 % при «ручном».

Результаты ПЦР при разных способах выделения ДНК

Результаты ПЦР при автоматическом выделении ДНК M.bovis BCG из проб объёмом: Результаты ПЦР при «ручном» выделении ДНК M.bovis BCG

Концентрация исследуемого образца (м.к./мл) Кол-во проб 1 мл 0,1 мл Кол-во проб (объём 0,1 мл) Кол-во ПОЛ. рез-в % эффективности выделения ДНК

Кол-во пол. рез-в % эффективности выделения ДНК Кол-во пол. рез-в о/ /о эффективности выделения ДНК

1 ООО ООО 3 3 100 3 100 7 7 100

100 ООО 3 3 100 3 100 7 7 100

10 000 3 3 100 3 100 7 7 100

1 000 3 3 100 3 100 7 7 100

100 3 3 100 3 100 7 5 72

Необходимо отметить, что диагностическая чувствительность тест-системы составляет 102-103 м.т./мл. Поэтому, эффективность «ручного» способа выделения ДНК при концентрации микобактерий в пробе 102 м.т./мл, ниже в среднем на 28%, чем при автоматическом выделении. Таким образом, мы не исключаем, что на качество выделения ДНК при «ручном» способе выделения оказывает влияние «человеческий» фактор. Именно по этой причине при выделении ДНК из 7 проб с концентрацией возбудителя 102 м.т./мл положительный результат получен только в пяти случаях (72%).

В дальнейшем мы провели сравнение эффективности выделения ДНК микобактерий «ручным» и автоматическим способами на четырёх музейных бактериальных культурах микобактерий (M.bovis, M.tuberculosis, М.avium, М. paratuberculosis) и различном патматериале. В пробах, не содержащих ДНК микобактерий, эффективность выделения ДНК определяли по прохождению внутреннего контрольного образца (ВКО).

Для ПЦР использовали тест-системы «МТБ-ДИФ», «ПАРАТУБ» и «АВИУМ» (ВКО входит в тест-системы «МТБ-ДИФ» и «ПАРАТУБ»), Результаты ПЦР-исследования культур микобактерий с разными способами выделения ДНК представлены в таблице 3.

Результаты ПЦР-исследования бактериальных культур микобактерий

Название культуры Тест-система, способ выделения ДНК и прохождение ВКО

«МТБ-ДИФ» «ПАРАТУБ» «АВИУМ»

ручной автом. ВКО ручной автом. ВКО ручной автом.

M.bovis + + + - - - - -

M.tuberculosis + + + - - - - -

М.avium - - - - - - + +

М.paratuberculosis - - - + + + - -

Примечание: «+» - положительный результат ПЦР, «-» - отрицательный результат ПЦР

Как видно из полученных результатов эффективность выделения ДНК из всех культур составила 100% не зависимо от способа выделения.

На следующем этапе были исследованы пробы фекалий крупного рогатого скота от подозрительных в заражении паратуберкулёзом коров и суспензии лимфоузлов от двух больных туберкулёзом коров и пяти подозрительных в заражении паратуберкулёзом коров.

Полученные результаты ПЦР-исследования фекалий показали отсутствие во всех пробах ДНК Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis при наличии ВКО. Однако при «ручном» способе выделения ДНК в одной пробе не прошёл BKO, что указывает на возможную потерю ДНК в процессе выделения, при автоматическом выделении ВКО не прошёл в двух пробах. Результаты в таких пробах не учитывают, эти пробы подлежат повторному исследованию. При ручном выделении потеря ВКО чаще всего вызвана техническими погрешностями в работе, т.е. «человеческим» фактором. При автоматическом способе на эффективность выделения ДНК из фекалий влияет степень осветления суспензии на этапе подготовки проб.

При исследовании проб патматериала от двух больных туберкулёзом коров и пяти подозрительных в заражении паратуберкулёзом коров ДНК M.bövis выделена из патматериала от больных туберкулёзом коров, из патматериала от подозрительных в заражении паратуберкулёзом коров ДНК возбудителей туберкулёза и паратуберкулёза не выделена. ВКО прошёл во всех пробах. На

результат ПЦР при исследовании суспензии патматериала от крупного рогатого скота не повлиял способ выделения ДНК, эффективность составила 100%.

В проведённом эксперименте статистически значимых различий эффективности выделения ДНК разными способами не получено (Р>0,05). Однако результаты проведённых нами исследований показали, что на эффективность выделения ДНК оказывает влияние объём исследуемой пробы и «человеческий» фактор. Автоматическое выделение ДНК позволяет в 10 раз увеличить объём исследуемой пробы; в два раза сокращает время выделения ДНК и, соответственно, всего исследования; исключает возможность контаминации реагентов и проб; снижает вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Все указанные преимущества автоматического выделения ДНК значительно повышают эффективность ПЦР-анализа микобактериозов животных.

ПЦР-исследование различных видов биоматериалов и объектов внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина и определение возможности применения ПЦР для мониторинга благополучия животных по туберкулёзу

Исследования цирковых животных

1 В Московском цирке Никулина провели диагностическое исследование на туберкулёз девяти обезьян.

В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» обезьян исследовали аллергической туберкулиновой пробой с ППД-туберкулином для млекопитающих. Туберкулин вводили интрадермопальпебрально в верхнее веко правого глаза. Учёт результатов аллергических исследований обезьян проводили через 72 часа методом осмотра, пальпации и сравнения верхнего века правого и левого глаза.

При учёте результатов аллергических исследований девяти обезьян реагирующих на туберкулин животных не выявлено.

Отмечена сложность и трудоёмкость аллергических исследований

обезьян интрадермопальпебральной пробой. В связи со сложностью проведения аллергических исследований и с учётом того, что заражение обезьян туберкулёзом, как правило, происходит аэрогенным путём и через объекты внешней среды, нами было проведено двукратное ПЦР-исследование проб фекалий и носовой слизи обезьян, а также смывов со стен, воды из поилок и смывов с пола индивидуальных вольеров.

ПЦР—исследованием проб фекалий и носовой слизи обезьян, смывов со стен и полов индивидуальных вольеров, в которых содержатся обезьяны, а также воды из поилок ДНК М.bovis и М.tuberculosis не выделена ни из одной пробы.

На основании проведённых исследований и полученных результатов, нами сделано заключение, что обезьяны не инфицированы туберкулёзом, а в окружающей внешней среде ДНК M.bovis и M.tuberculosis отсутствуют.

2 В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» в нашей стране слонов рекомендуется исследовать внутрикожной туберкулиновой пробой с введением ППД-туберкулина для млекопитающих в подхвостовую складку. По данным литературы аллергическая диагностика туберкулёза у слонов недостаточно эффективна (S.K. Mikota et al., 2001, 2006; S.S. Lewerin et al., 2005).

В связи с тем, что в нашей стране отсутствуют специальные рекомендации по диагностике, профилактике и борьбе с туберкулёзом диких животных, в основу наших исследований, кроме «Наставления по диагностике туберкулёза животных», были положены «Рекомендации по борьбе с туберкулёзом слонов» (Guidelines for the control of tuberculosis in elephants, 2008. The national tuberculosis working group for Zoo and wildlife species, USA), а также исследования зарубежных авторов по данной проблеме.

В соответствии с этими документами для диагностики туберкулёза слонов рекомендуется исследовать смывы из хобота. Нами были отобраны смывы из хобота и пробы фекалий от пяти слонов. Пробы смывов из хобота были взяты

трёхкратно в течение 10 дней с интервалом три дня. Кроме того, были исследованы смывы со стен и пола загона и вода из поилок слонов.

Проведённые нами исследования показали, что в исследуемом материале от слонов, а также в смывах со стен и пола загона, в котором содержатся слоны, и в воде из поилок ДНК М.Ыпчэ и М.ШЬегси1оз18 отсутствуют.

На основании проведённых исследований и полученных результатов нами сделано заключение, что слоны не инфицированы туберкулёзом, а в окружающей внешней среде ДНК М.Ьоуш и М.1иЬегси1оз1з отсутствуют.

3 В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» верблюдов исследуют внутрикожной туберкулиновой пробой с ППД-туберкулином для млекопитающих. В Московском цирке Никулина мы провели аллергическое исследование шести верблюдов. Туберкулин вводили в кожу брюшной стенки или область паха на уровне горизонтальной линии седалищного бугра. Учёт результатов проводили через 72 часа после введения туберкулина. При учёте результатов аллергического исследования реагирующих животных не выявили.

В дальнейшем мы провели ПЦР — исследование проб крови, носовой слизи и фекалий от этих верблюдов, а также воды из поилок, смывов со стен и полов вольеров.

ПЦР-исследованием проб крови, носовой слизи и фекалий от шести верблюдов, смывов со стен и полов индивидуальных вольеров, в которых содержатся верблюды, а также воды из поилок ДНК М.Ыпав и МЛиЬегси1озЬ не выделены.

На основании проведённых исследований и полученных результатов нами сделано заключение, что верблюды не инфицированы туберкулёзом, а в окружающей внешней среде ДНК М.Ьоу^ и МДиЬегси1о51з отсутствуют.

Таким образом, проведённый двукратно комплекс исследований различного биологического материала от диких животных цирка и объектов внешней среды с использованием метода ПЦР позволяет сделать вывод о

благополучии животных по туберкулёзу.

Исследования зоопарковых животных

В Московском зоопарке исследования фекалий от животных и объектов внешней среды провели двукратно.

В отличие от диких животных цирка, которые являются дрессированными и менее опасными для человека, дикие животные зоопарка представляют значительно большую угрозу для людей. Поэтому проведение аллергических исследований с целью выявления инфицированных туберкулёзом животных опасно для ветеринарных специалистов. Для мониторинга туберкулёза зоопарковых животных мы предлагаем ПЦР-исследование фекалий и объектов внешней среды в качестве основного метода выявления инфицирования животных туберкулёзом.

1 ПЦР-исследование фекалий от животных

Нами были проведены исследования фекалий методом ПЦР от разных видов диких животных зоопарка. В частности, как наиболее интересные объекты исследования, мы выбрали слона, жирафа и разные виды человекообразных (горилл, орангутанов, гиббонов) и нечеловекообразных (макак, кошачьих и красных лемуров, мартышек, колобусов, капуцинов, саймири, мандарил) обезьян, т.е. наиболее восприимчивых к заболеванию туберкулёзом животных зоопарка.

В результате двукратного мониторинга благополучия диких животных зоопарка по туберкулёзу с использованием метода ПЦР ДНК М.Ьоу^ и МЛиЬегси1оз18 не выделены ни из одной пробы фекалий, смывов со стен и полов вольеров, а также воды из поилок.

2 ПЦР-исследование помёта от дикой птицы

Нами были исследованы сборные и индивидуальные пробы помёта из клеток от белого какаду, перга, горного гуся, из вольеров и помещений, где содержатся ибисы, чирки, подорлики, семегалы, нельсыги, пеликаны, утки, и с берегов большого и малого прудов зоопарка от дикой перелётной

водоплавающей птицы.

ПЦР-исследованием 19 проб помёта, из одной сборной пробы помёта от дикой перелётной водоплавающей птицы с берега большого пруда зоопарка выделена ДНК М.аушт, однако, из смывов со стен и полов индивидуальных клеток с птицами, закрытых помещений и вольеров, в которых содержится дикая птица, а также воды из поилок птиц, ДНК М.аушт не выделена ни из одной пробы.

Таким образом, проведённый двукратно комплекс исследований фекалий и помёта от диких животных и птиц зоопарка и объектов внешней среды с использованием метода ПЦР позволяет сделать вывод о благополучии диких животных Московского зоопарка по туберкулёзу.

Выделение ДНК М.аушт из одной сборной пробы помёта от дикой перелётной водоплавающей птицы, отобранной с берега большого пруда, указывает на необходимость проведения дальнейшего постоянного мониторинга и комплекса диагностических исследований на туберкулёз птиц в Московском зоопарке.

Определение диагностической ценности и возможности применения ПЦР в комплексе исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота

Комплекс диагностических исследований мы провели с целью уточнения диагноза на паратуберкулёз в одном хозяйстве Смоленской области и одном хозяйстве республики Удмуртия. В этих хозяйствах ветеринарными специалистами местной ветеринарной службы были выявлены подозрительные в заболевании паратуберкулёзом животные и выделен возбудитель паратуберкулёза. Оставалось объявить неблагополучие хозяйств по паратуберкулёзу и наложить ограничения на производственную деятельность хозяйств. Однако, в связи со сложностью установления диагноза на паратуберкулёз и некоторыми сомнениями в установленном диагнозе, дальнейшие исследования были проведены комиссионно, совместно со специалистами управления ветеринарии, районной ветеринарной службой и

сотрудниками лаборатории микобактериозов ВИЭВ.

Анализ предоставленных местной ветеринарной службой актов аллергических и серологических исследований, актов клинического осмотра поголовья, актов убоя реагирующих животных, экспертиз лабораторных исследований проб фекалий и патматериала от убитых с диагностической целью животных показал, что предварительный диагноз на паратуберкулёз был установлен на основании обнаружения методом бактериоскопии в фекалиях кислотоустойчивых палочек характерной морфологии, выделения культуры микобактерий на обычных питательных средах, используемых для диагностики туберкулёза, без добавления фактора роста (экстракта из М.рИЫ), т.е. без учёта основных специфических положений «Наставления по диагностике паратуберкулёза животных» от 2001 г. Необходимо указать, что возбудитель паратуберкулёза в первых генерациях растёт и размножается на питательных средах только в присутствии фактора роста и для идентификации выделенных культур микобактерий необходимо было эти культуры посеять на питательные среды с фактором роста и без него. Это важное условие идентификации культур микобактерий и диагностики паратуберкулёза не было выполнено, поэтому выделенные культуры нетуберкулёзных медленнорастущих (атипичных) микобактерий были ошибочно охарактеризованы как М.рага(иЬегси1оз15.

Проведённые комиссионные клинические, аллергические, патологоанатомические, гистологические, бактериологические и молекулярно-генетические исследования позволили установить, что в обоих хозяйствах отсутствуют животные с характерными клиническими признаками паратуберкулёза. При диагностическом убое комиссионно отобранных наиболее подозреваемых в заболевании паратуберкулёзом (истощённых) коров, патологоанатомическом осмотре и гистологическом исследовании патматериала характерных для паратуберкулёза изменений не обнаружено. При бактериологическом исследовании патматериала от убитых коров — посеве на обычные и специальные питательные среды с добавлением фактора роста (микобактин) — возбудитель паратуберкулёза также не выделен.

Кроме того, от подозреваемых в заболевании паратуберкулёзом животных были отобраны 52 пробы фекалий, а от шести убитых с диагностической целью коров - пробы патматериала для исследования методом ПЦР. Исследования провели с использованием тест-систем «ПАРАТУБ» и «АВИУМ». ДНК Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis и ДНК Mycobacterium avium не выделены ни из одной пробы.

На основании проведённых исследований нами сделано заключение, что поголовье крупного рогатого скота хозяйств благополучно по паратуберкулёзу.

Полученные нами результаты исследований убедительно доказывают, что обнаружение при микроскопии в исследуемом патматериале или фекалиях кислото-спиртоустойчивых палочек является только показателем наличия микобактерий. В связи с многообразием различных форм и видов микобактерий в живом организме, фекалиях и окружающей внешней среде, обнаружение кислотоустойчивых микобактерий не может являться основанием для установления диагноза на паратуберкулёз, так же, как и на туберкулёз. Поэтому, считаем, что в подобных случаях ПЦР-исследование фекалий и выделенных культур микобактерий обладает значительной диагностической ценностью, т.к. такие исследования позволяют дифференцировать микобактерии (M.bovis, M.tuberculosis, М.avium и M.paratuberculosis от нетуберкулёзных микобактерий).

В связи с тем, что при паратуберкулёзе поражается желудочно-кишечный тракт, а возбудитель болезни, в основном, выделяется во внешнюю среду с фекалиями, то ПЦР-исследование фекалий от подозреваемых в заражении паратуберкулёзом животных может стать основным методом в комплексе диагностических исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.

3 Выводы

1 ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM производства ФГУП «Курская биофабрика» не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза и ДНК нетуберкулёзных микобактерий и не могут быть источниками возбудителя туберкулёза животных, что соответствует технологическому регламенту изготовления данных аллергенов.

2 Установлено, что при ПЦР-исследовании с «ручным» выделением ДНК из различных видов биоматериала от животных эффективность выделения ДНК и конечный результат ПЦР зависят от объёма исследуемой пробы и «человеческого» фактора.

При автоматическом выделении ДНК повышается информативность и достоверность результатов ПЦР-анализа за счёт увеличения объёма исследуемой пробы, сокращается время проведения исследований, исключается возможность контаминации реагентов и проб, снижается вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПЦР, что позволяет оптимизировать ПЦР-анализ для мониторинга микобактериальных инфекций животных.

3 Показана возможность применения ПЦР для мониторинга благополучия по туберкулёзу зоопарковых и цирковых животных. Отсутствие реагирующих в аллергическом исследовании цирковых животных, а также отрицательные результаты ПЦР-исследования биоматериала от слонов, обезьян и верблюдов и объектов внешней среды из вольеров на наличие ДНК М.bovis и ДНК M.tuberculosis указывает на благополучие животных по туберкулёзу.

4 Исследование фекалий и объектов внешней среды методом ПЦР является основным по выявлению инфицированных туберкулёзом зоопарковых животных в связи с опасностью для ветеринарных специалистов проведения аллергических исследований.

5 ПЦР-исследованием проб фекалий от зоопарковых животных (слона, жирафа и разных видов обезьян), проб помёта от разных видов дикой птицы, а также объектов внешней среды из вольеров и клеток ДНК M.bovis, ДНК M.tuberculosis и ДНК М.avium не выделены, что указывает на благополучие этих животных по туберкулёзу.

6 ПЦР-исследованием сборной пробы помёта от дикой перелётной водоплавающей птицы (с берега большого пруда зоопарка) выделена ДНК М.avium, что указывает на необходимость проведения дальнейшего постоянного мониторинга и комплекса диагностических исследований на

туберкулез птиц.

7 В общем комплексе исследований при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота, ПЦР—исследование фекалий и патологического материала от подозреваемых в заражении паратуберкулёзом животных является эффективным дополнительным тестом для подтверждения или исключения заражения M.paratuberculosis.

4 Практические предложения

1 Рекомендуется мониторинг благополучия по туберкулёзу диких животных зоопарков и цирков проводить методом ПЦР-исследования проб фекалий и объектов внешней среды.

2 В комплексе исследований при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота необходимо использовать метод ПЦР для исследования фекалий и патологического материала от подозреваемых в заражении и убитых с диагностической целью животных.

5 Список опубликованных работ

1 Калмыков, В.М. Использование прибора EASYMAG при выделении ДНК Mycobacterium bovis /В.М. Калмыков, А.Х. Найманов, М.С. Калмыкова // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». - М., 2010. -т.2. — С.114-117.

2 Калмыков, В.М. Использование полимеразной цепной реакции в целях контроля благополучия по туберкулёзу зоопарковых животных / В.М.Калмыков // Ветеринарная медицина. - 2011. - №3-4. - С.48-50.

3 Калмыков, В.М. ПЦР - исследование аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике при диагностике туберкулёза животных / В.М. Калмыков, А.Х. Найманов, М.С. Калмыкова, Е.А. Долгова, М.В. Альварес Фигероа // Ветеринарная медицина. — 2011,— №3-4. - С.72-74.

4 Найманов, А.Х. ПЦР при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, В.М.Калмыков // Российский ветеринарный журнал. - 2012. -№ 3. - С.30-32.

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВКО — внутренний контрольный образец

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

KAM - комплексный аллерген из атипичных микобактерий

MAP - Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis

мкл - микролитр

м.т./мл - микробных тел в 1 мл

ПКО - положительный контрольный образец

ППД - Purified Protein Derivate (очищенный дериват белка)

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЦНИИЭ — Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

BCG - бацилла Кальметта—Герена (Bacillus Calmette—Guerin)—вакцинный штамм Mycobacterium bovis М. - Mycobacterium

М.avium - возбудитель туберкулёза птичьего вида М.bovis — возбудитель туберкулёза бычьего вида М.paratuberculosis - возбудитель паратуберкулёза M.phlei - вид нетуберкулёзной микобактерии M.tuberculosis - возбудитель туберкулёза человеческого вида

Отпечатано в типографии ООО «Мещера», ИНН 5050006864, Московская область, г. Щёлково, ул. Свирская, д.8а. Заказ №014. Тираж 100 экз. 2013 г.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Калмыков, Виктор Михайлович

Используемые сокращения

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Микобактериозы животных

2.2 Взаимосвязь микобактериозов человека и животных

2.3 Методы прижизненной диагностики туберкулёза животных

2.3.1 Аллергический метод

2.3.2 Бактериологический метод

2.3.3 Полимеразная цепная реакция

2.4 Особености диагностики туберкулёза диких животных (слонов, 40 обезьян, верблюдов, птиц)

2.5 Диагностика паратуберкулёза крупного рогатого скота

3 Собственные исследования 57 3.1 Материалы и методы

4 Результаты исследования

4.1 Культуральные и молекулярно-генетические исследования всех 66 трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике при диагностике туберкулёза и паратуберкулёза животных (ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM), на наличие микобактерий и ДНК микобактерий

4.2 Сравнительное изучение эффективности автоматического и 69 «ручного» выделения ДНК из различных видов биоматериала с целью оптимизации ПЦР-анализа для мониторинга микобактериальных инфекций животных

4.3 ПЦР-исследование различных видов биоматериалов и объектов 80 внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина и определение возможности применения ПЦР для мониторинга благополучия животных по туберкулёзу

4.4 Определение диагностической ценности и возможности 91 применения ПЦР в комплексе исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Использование полимеразной цепной реакции в целях мониторинга благополучия по микобактериальным инфекциям зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных"

Актуальность темы. К микобактериальным инфекциям относят инфекционные болезни человека и животных, вызываемые патогенными или условно-патогенными микобактериями. Среди микобактериозов животных особое место занимают туберкулёз и паратуберкулёзный энтерит крупного рогатого скота.

Туберкулёз наносит значительный экономический ущерб животноводству и представляет реальную опасность в заражении людей. Против туберкулёза нет достаточно эффективных средств специфической профилактики и лечения. Поэтому основой профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулёзе животных является своевременная и точная диагностика, т.е. выявление и убой инфицированных животных.

Основным методом прижизненной диагностики туберкулёза животных является внутрикожная проба с ППД-туберкулином для млекопитающих. Однако, она обладает определёнными недостатками: выявление неспецифических реакций на туберкулин у здоровых животных и недовыявление инфицированных туберкулёзом животных в неблагополучных стадах. Кроме того, в 2003 г. в статье «Экологический мониторинг при туберкулинодиагностике крупного рогатого скота», опубликованной в издании «Агроеколопчний журнал» №1 В.В. Власенко, А.П. Лысенко с соавт. утверждали, что существующий технологический регламент изготовления ППД-туберкулина для млекопитающих (ФГУП «Курская биофабрика») не обеспечивает стерильность и специфичность препарата. Это, по мнению авторов статьи, способствует поступлению с туберкулином в организм крупного рогатого скота адаптивных форм возбудителя туберкулёза.

Лабораторные методы диагностики туберкулёза животных также являются недостаточно эффективными, длительными, трудоёмкими (до 6 месяцев) и не позволяют в короткие сроки поставить точный диагноз.

В связи с указанными проблемами диагностика туберкулёза животных должна быть комплексной с применением различных дополнительных методов диагностики.

Достижения в области молекулярной биологии привели к разработке новых подходов к индикации возбудителя в диагностическом материале. Развитие новейших технологий на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования открыло новые перспективы в диагностике туберкулеза, в частности детекции и дифференциации возбудителей, проведении их генотипирования и молекулярно-эпизоотологического мониторинга (Н.Л. Першикова с соавт., 2007; О.В. Нарвская с соавт., 2007; М.А. Гордукова с соавт., 2010; И.О. Концевая с соавт., 2011; Т. Gamier et al.„ 2003; N. Haddad et al., 2004; K. Brudey et al., 2006 и др.).

В доступной отечественной литературе имеются сообщения об успешном применении ПЦР при диагностике многих инфекционных болезней животных, в том числе и по изучению возможности применения ПЦР при диагностике туберкулёза (И.Л. Обухов с соавт., 1995, 1997; И.П. Суханов, 1999; А.Н. Шаров, 2003; Т.А. Борисова с соавт., 2004; А.С. Донченко с соавт., 2004; Е.П. Осипова, 2004; Т.В. Гребенникова с соавт., 2004; И.Н. Корнева, 2004; А.Х. Найманов с соавт., 2004, 2009; Е.Е. Ларионова, 2005; Т.Н. Алипер с соавт., 2006; М.С. Калмыкова с соавт., 2006, 2007, 2008; Н.Л. Першикова с соавт., 2007, 2008; Н.И. Хаммадов, 2009 и др.). Тем не менее, до настоящего времени единого мнения о диагностической значимости метода ПЦР при туберкулёзе животных не имеется.

Проблемами ПЦР-диагностики туберкулёза, ограничивающими её применение в ветеринарии, являются ложноположительные и ложноотрицательные результаты исследования.

Источниками получения ложноположительных результатов могут быть ампликоны, попадающие в окружающую среду при детекции продуктов ПЦР методом электрофореза, перекрёстная контаминация от пробы к пробе на этапах подготовки проб и выделения ДНК, сбора реакционной смеси для ПЦР.

Основной причиной ложноотрицательных результатов ПЦР, кроме преаналитических процедур, может быть небольшой объём (от 100 до 200 мкл) исследуемой пробы, потери ДНК на этапе ее выделения за счёт так называемого «человеческого» фактора.

В последние годы в ветеринарной лабораторной практике от детекции продуктов ПЦР методом электрофореза перешли к гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме «реального времени», получившей название «Real-time PCR». Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации исследуемых проб и реагентов продуктами ПЦР и, таким образом, уменьшить число ложноположительных результатов.

Внедрение ПЦР в лабораторную диагностику туберкулёза крупного рогатого скота в нашей стране показало необходимость дальнейшего совершенствования метода с целью повышения достоверности результатов исследования, исключению возможности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Известно, что наиболее трудоёмким этапом ПЦР-анализа является выделение (экстракция) нуклеиновых кислот из патологического материала от животных. Правильность и качество выделения ДНК оказывает значительное влияние на остальные этапы ПЦР-анализа и достоверность полученных результатов. Автоматизация этапа выделения ДНК позволяет сократить количество лабораторных ошибок и повысить эффективность выявления микобактерий туберкулёза из исследуемого материала. При автоматическом выделении нуклеиновых кислот в несколько раз повышается чувствительность и информативность метода (B.C. Зайцев, Е.В. Богословская, Г.А. Щипулин с соавт., 2007; M.J. Espy et al., 2001, 2006; P. Hammer, С. Kiesner, H.G. Walte, K.Knappstein, P. Teufel, 2002; J.H. Knepp, M.A. Geahr, M.S. Forman, A. Valsamakis, 2003; J.R. Stabel, T.L. Bosworth, T.A. Kirkbride, R.L. Forde, R.H. Whitlock, 2004; D. Herthnek, S. Englund, P.T.J. Willemsen, G. Bolske, 2006; C.V. Jaravata, W.L. Smith, G.J. Rensen, J.M. Ruzante, J.S. Cullor, 2006). Поэтому, no нашему убеждению, дальнейшее совершенствование в области молекулярной диагностики туберкулёза животных должно быть направлено на автоматизацию этапов ПЦР-анализа.

Особо необходимо выделить проблему диагностики туберкулёза диких животных зоопарков, заповедников, национальных парков и цирков, которые являются одной из важнейших составляющих системы сохранения, восстановления редких и исчезающих видов диких животных. Зоопарки и цирки обычно находятся на территории крупных городов и выполняют роль культурно-просветительских учреждений, которые посещает огромное количество людей (как правило, с детьми). При этом концентрация самых разнообразных животных на ограниченных площадях ставит перед ветеринарными специалистами сложную задачу разработки и совершенствования диагностики и профилактики различных инфекционных заболеваний диких животных и, особенно, зооантропонозов.

К сожалению, чётко разработанной системы профилактики инфекционных заболеваний у разных видов животных, содержащихся в неволе, нет. Проблема дополнительно осложняется редкостью и, как следствие этого, высокой стоимостью диких животных, сложностью обработки клеток, вольеров и других помещений, где содержатся высокоценные дикие животные. При этом вновь поступившие дикие животные являются вероятным источником хронической или с длительным инкубационным периодом инфекции, которая может проявиться уже после окончания сроков карантинирования.

За рубежом проблемам диагностики и профилактики инфекционных болезней диких и экзотических животных уделяется особое внимание, т.к. организации, где содержатся подобные животные, всегда считаются зонами повышенного риска. Во всех зоопарках мира существуют чёткие рекомендации по диагностике и профилактике инфекционных болезней диких животных, которые выполняются ветеринарными специалистами под контролем государственных служб (J.D. Wallach, W.J. Boever, 1983). К сожалению, подобных рекомендаций в России не существует, и ветеринарные специалисты зоопарков и государственные инспектора вынуждены руководствоваться рекомендациями, разработанными для домашних и сельскохозяйственных животных, что зачастую создаёт серьёзные проблемы как для здоровья животных, так и для здоровья обслуживающего персонала и всего населения данной территории (Г.И. Блохин, 2006; М.В. Альшинецкий, 2004, 2009; R.J. Montali, S.K. Mikota, L.I. Cheng, 2001; A. Lecu, R. Ball, 2011).

В связи с тем, что туберкулёз является широко распространённым общим инфекционным заболеванием людей и животных, все вышеперечисленные проблемы в первую очередь относятся именно к этой хронической инфекции.

Возбудителями туберкулёза у диких животных являются М. tuberculosis и M.bovis, представляющие значительную опасность для человека, особенно, если зоопарковые животные содержатся в вольерах, не имеющих барьерных стёкол между животными и посетителями, т.к. основным путём распространения инфекции является воздушно-капельный (Т.А. Schlisser, R.L. Snyder, 1978; W.C. Shellabarger, 1993; N. Rastogi, E. Legrand, C. Cola, RJ. Montali, S.K. Mikota, L.I. Cheng, 2001). Кроме того, больные туберкулёзом люди представляют не меньшую опасность для животных. С учётом сложной эпидемической ситуации по туберкулёзу актуальность проведения системы мониторинга социально-опасных инфекционных болезней диких животных, в частности, туберкулёза, значительно возрастает. На необходимость контролировать заболеваемость туберкулёзом диких животных и птицы, содержащихся в зоопарках, указывают и зарубежные исследователи (M.D. Stetter, S.K. Mikota, A.F. Gutter et all., 1995; J. Maslow, 1997; N. Rastogi, E. Legrand, C. Cola, 2001; A. Lecu, R. Ball, 2011).

В соответствии с утверждёнными нормативными документами основным методом прижизненной диагностики туберкулёза животных является внутрикожная туберкулиновая проба с ППД-туберкулином для млекопитающих. Однако, провести туберкулинизацию диких животных в зоопарках, заповедниках и цирках не всегда представляется возможным из-за высокой агрессивности животных и, как следствие этого, опасности, которую они представляют для человека. Проведение прижизненного лабораторного мониторинга туберкулёза у диких животных зоопарков классическими методами (культуральный и биологический) не эффективно из-за длительности и трудоёмкости используемых методов. Некоторые зарубежные авторы (F.M. Rock, M.S. Landi, L.D. Meuntier et all., 1995; S. Sreevatsan, X. Pan, K.E. Stockbauer et all., 1997; A. Michel et al., 2003; M.L. Panarella, R.S. Bimes, 2010) получили хорошие результаты при использовании метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Паратуберкулёз крупного рогатого скота был и остаётся одной из сложно контролируемых и диагностируемых инфекций, т.к. инкубационный период может длиться от 6 месяцев до 15 лет. При этом животные могут не иметь клинических признаков болезни, но являться носителями микобактерий и, периодически выделяя возбудителя с фекалиями во внешнюю среду, заражать восприимчивых животных (N.G. Jaimes, М.А. Santillan Flores, J.A. Hernandez Cruz, D. Cordova Lopez, C.C. Guzman Ruiz et al., 2008).

Возбудителя болезни относят к Mycobacterium avium подвида paratuberculosis (MAP). MAP на 99% генетически родственны с Mycobacterium avium, но отличаются микобактин - зависимостью, т.е. растут на питательных средах с содержанием фактора роста (микобактина). В последние годы возбудитель паратуберкулёза отнесён к комплексу Mycobacterium avium -intracellulare.

Скрытость инфекции, низкая специфичность и чувствительность методов диагностики, трудности выделения и культивирования микобактерий паратуберкулёза и, главное, отсутствие возможности воспроизведения болезни на лабораторных животных - основные причины сложности установления диагноза на паратуберкулёз.

В последние годы в доступной зарубежной литературе появились сообщения об успешном испытании ПЦР при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота и овец. Авторы оценивают ПЦР как более точный и экспрессный метод идентификации MAP и рекомендуют его для применения при установлении диагноза на паратуберкулёз и включения в программы борьбы с этой инфекцией (N.G. Jaimes et al., 2008; J. Szteyn, A. Wiszniewska -Laszczych, A. Ruszczynska, 2008; A. Doosti, S. Moshkelani, 2010).

В отечественной литературе данных о возможности применения ПНР для диагностических исследований на паратуберкулёз крупного рогатого скота нами не обнаружено.

Поэтому, на современном этапе борьбы с туберкулёзом и паратуберкулёзом животных, учитывая недостаточную изученность некоторых важных вопросов диагностики, длительность, трудоёмкость и сравнительно низкую эффективность классических методов прижизненной и лабораторной диагностики, изучение возможности применения метода ПЦР при диагностике микобактериальных инфекций зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных является своевременным и актуальным.

2 Цель исследований

Оптимизация ПЦР-анализа и изучение возможности применения полимеразной цепной реакции для мониторинга микобактериальных инфекций зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных.

3 Основные задачи исследований

3 Провести ПЦР-исследование различных видов биоматериалов и объектов внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина и определить возможность применения ПЦР для мониторинга благополучия животных по туберкулёзу.

4 Научная новизна

Впервые проведено исследование всех трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике для прижизненной диагностики туберкулёза и паратуберкулёза животных на наличие микобактерий и ДНК микобактерий. Исследованием методами: культуральным, ПЦР и секвенирования установлено, что ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и КАМ не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза животных и ДНК нетуберкулёзных микобактерий.

Впервые установлена возможность применения ПНР и определено её место в общем комплексе диагностических исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.

5 Практическая значимость

Результаты исследований включены:

- в сборник «Методические наставления по проведению исследований при микобактериозах животных», рассмотренные и одобренные на заседании учёного совета Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) (протокол № 1 от 25.01.2011 г.), на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 27.04.2011 г.), утверждённые Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 03.10.2011 г. (Приложение 1); Методические наставления награждены Дипломом XIV Российской агропромышленной выставки «Золотая осень» (Москва, 2012 г.) (Приложение 2);

- в Методические наставления «Мониторинг благополучия диких животных по туберкулёзу в зоопарках и цирках Российской Федерации», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (протокол № 4 от 16.04.2012 г.), на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 4 от 21 сентября 2012 г.), утверждённые Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 09.11.2012 г. (Приложение 3).

6 Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с формулой специальность 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» представляет собой область науки, изучающей систематику, структуру, физиологию, биохимию, генетику, экологию патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов), имеющих ветеринарное значение, эпизоотологические и экологические закономерности возникновения, распространения инфекционных болезней и иммунологию сельскохозяйственных, домашних и диких животных, изучающая и разрабатывающая методы, средства и организационные основы диагностики, лечения, профилактики и ликвидации этих болезней. В диссертационной работе приведены результаты исследований всех аллергенов, используемых для диагностики туберкулёза и паратуберкулёза животных, на наличие микобактерий и их ДНК, сравнительного изучения «ручного» и автоматического выделения ДНК из биоматериалов, ПЦР-исследований различных видов биоматериалов и объектов внешней среды от разных видов диких животных зоопарка и цирка в целях мониторинга благополучия по туберкулёзу, возможности применения ПЦР в общем комплексе лабораторных исследований при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота.

Результаты научного исследования соответствуют пункту 5 паспорта специальности.

7 Основные положения, выносимые на защиту. Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

- Оптимизация ПЦР-анализа путём автоматического выделения ДНК микобактерий из различных видов биоматериала для мониторинга микобактериозов животных.

Никулина на Цветном бульваре в целях мониторинга благополучия животных по туберкулёзу.

8 Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:

• 7-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010», г. Москва (2010);

• Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертационной работе, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ, Москва (2012);

• Материалы диссертации используются в учебном процессе при проведении лекционных и практических занятий по дисциплине «Современные проблемы биологии» со студентами (магистры биологии) ветеринарно-биологического факультета Федерального бюджетного государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина» (Приложение 4).

9 Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликованы четыре научные работы, в том числе три - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринарная медицина» - 2 и «Российский ветеринарный журнал» - 1), одна - в сборнике конференции с международным участием.

10 Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 149 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Калмыков, Виктор Михайлович

выводы

3 Показана возможность применения ПЦР для мониторинга благополучия по туберкулёзу зоопарковых и цирковых животных. Отсутствие реагирующих в аллергическом исследовании цирковых животных, а также отрицательные результаты ПЦР-исследования биоматериала от слонов, обезьян и верблюдов и объектов внешней среды из вольеров на наличие ДНК M.bovis и ДНК M.tuberculosis указывает на благополучие животных по туберкулёзу.

5 ПЦР-исследованием проб фекалий от зоопарковых животных (слона, жирафа и разных видов обезьян), проб помёта от разных видов дикой птицы, а также объектов внешней среды из вольеров и клеток ДНК М.Ытэ, ДНК М.йхЬегси1о81з и ДНК М.аушт не выделены, что указывает на благополучие этих животных по туберкулёзу.

6 ПЦР-исследованием сборной пробы помёта от дикой перелётной водоплавающей птицы (с берега большого пруда зоопарка) выделена ДНК М.аушт, что указывает на необходимость проведения дальнейшего постоянного мониторинга и комплекса диагностических исследований на туберкулез птиц.

7 В общем комплексе исследований при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота, ПЦР-исследование фекалий и патологического материала от подозреваемых в заражении паратуберкулёзом животных является эффективным дополнительным тестом для подтверждения или исключения заражения М.рагайхЬегси1о81з.

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные результаты исследований использованы при разработке:

- «Методических наставлений по проведению исследований при микобактериозах животных», рассмотренных и одобренных на заседании учёного совета Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) (протокол № 1 от 25.01.2011 г.), на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 27.04.2011 г.), утверждённых Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 03.10.2011 г.;

- Методических наставлений «Мониторинг благополучия диких животных по туберкулёзу в зоопарках и цирках Российской Федерации», рассмотренных и одобренных на заседании ученого совета Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (протокол № 4 от 16.04.2012 г.), на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 4 от 21 сентября 2012 г.), утверждённых Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 09.11.2012 г.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Калмыков, Виктор Михайлович, Щелково

1. Агафонова, С.Г. Туберкулез у больных с терминальной хронической почечной недостаточностью (Обзор литературы) / С.Г. Агафонова, Е.И. Прокопенко // Нефрология и диализ. 2004. - Т.6. - №2. - С.7-8.

2. Аленова, А.Х. Информативность полимеразной цепной реакции в диагностике туберкулезного процесса // Проблемы туберкулеза. 2002. - №1. - С.45-46.

3. Аликаева, А.П. Туберкулёз // Ветеринарная лабораторная практика. -М., 1963. Т.1. - С.279-289.

4. Алипер, Т.И. ПНР в реальном времени для диагностики туберкулёза / Т.И. Алипер, Н.И. Потапова, Е.А. Непоклонов, А.Д. Забрежный, Т.В. Гребенникова // Ветеринарная жизнь. 2006. - № 7-8. - С. 13.

5. Альварес Фигероа, М.В. Разработка ПЦР-тест-системы с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации для видового дифференцирования Mycobacterium tuberculosis complex / М.В.

6. Альварес Фигероа, Е.А. Долгова, Г.А. Шипулин // Сб.тр.б-ой Всероссийской научн.-практич. конф. с междунар.участием «Молекулярная диагностика-2007». М., 2007. - Т.З. - С.52-60.

7. Альшинецкий, М.В. Диагностика туберкулёза зоопарковых животных / М.В. Альшинецкий // Ветеринарная патология. 2004. - № 1-2. - С. 147-148.

8. Альшинецкий, М.В. Актуальные ветеринарные проблемы в зоопарках / М.В. Альшинецкий // Материалы Международного семинара. Межведомственный сборник научных и научно-методических трудов. М.: Московский зоопарк, 2009. - С.9-15.

9. Андреевская, С.Н. Молекулярно-биологическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis W кластера: Автореф. дисс.канд. мед. наук: 03.00.07 / С.Н. Андреевская; Центральный научно-исследовательский институт туберкулёза РАН. Москва, 2008. - 25 с.

10. Антонов, Б.И. Использование метода ПЦР при диагностике острых инфекционных болезней животных / Б.И. Антонов // Н.Новгород: Медицинский центр «Наследственность», 2002. №2. - С.2-3.

11. Антонова, О.В. Биочипы на основе гидрогеля для анализа генома Mycobacterium tuberculosis: методы и применение в клинической практике / О.В. Антонова, Д.А. Грядунов, С.А. Лапа, A.B. Кузьмин, А.Ю. Краснова, Л.Н.

12. Черноусова, О.И. Скотникова, A.M. Мороз, A.C. Заседателев, В.М. Михайлович // Сб.тр.б-ой Всероссийской научн.-практич. конф. с междунар.участием «Молекулярная диагностика-2007». М., 2007. - Т.З. -С.5-10.

13. Бакулов, И.А. Инфекционные болезни диких животных списка А, В, С в странах мира (2002-2004 гг.) / И.А. Бакулов, В.М. Котляров // Труды Междунар. научно-практ. конф. «Болезни диких животных». Покров, 2004. -С.4-12.

14. Баратов, М.О. Эпизоотические особенности и совершенствование метода диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в условиях Дагестана: Дисс.канд. вет. наук: 16.00.03 / М.О. Баратов. Махачкала, 2006. -118 с.

15. Белобородова, A.A. Повышение эффективности лабораторной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота: Автореф. дисс.канд. вет. наук: 16.00.03 / A.A. Белобородова; ИЭВСиДВ. Новосибирск, 2008. - 20 с.

16. Бессарабов, Б.Ф. Инфекционные заболевания певчих и декоративных птиц (продолжение) // Ветеринарная клиника. 2002. - №12. - С.2-5.

17. Блохин, Г.И. Зоотехнические, зоогигиенические и ветеринарные аспекты зоокультуры/Г.И. Блохин//Ветеринарная патология.-2006.-№2.-С.4-7.

18. Боганец, Н.С. Бактериологическая диагностика туберкулёза животных и её усовершенствование: Автореф. дисс.доктора вет. наук: 16.00.03 / Н.С. Боганец; ВНИИБТЖ. Омск, 2006. - 38 с.

19. Букова, Н.К. Питательная среда ВКГ для ускоренного выращивания микобактерий / Н.К. Букова, К.В. Шумилов, Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, JI.A. Таранова, О.В. Клименкова // Ветеринарная патология. 2004. - №1-2. -С.107-109.

20. Бушмелёва, П.В. Новые экспериментальные модели для биологической пробы при диагностике туберкулёза сельскохозяйственных животных: Автореф. дисс.канд. биол. наук: 06.02.02 / П.В. Бушмелёва; ИЭВСиДВ. Новосибирск, 2011. - 20 с.

21. Валиев, Р.Ш. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулёза / Р.Ш. Валиев, Т.Х. Фаизов, Л.И. Зайнуллин, Н.Р. Валиев // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2005. - №3. - С. 25-27.

22. Владимирский, М.А. Эффективность обнаружения микобактерий туберкулеза методом полимеразной цепной реакции (результаты рандомизированного исследования) / М.А. Владимирский с соавт. // Проблемы туберкулеза. 2003. - №12. - С.28-30.

23. Власенко, В.В. Экологический мониторинг при туберкулинодиагностике крупного рогатого скота / В.В. Власенко, А.П. Лысенко, М.А. Дзюмак, И.Г. Конопко, И.В. Березовский, C.B. Гирич // Агроеколопчний журнал. 2003. - №1. - С.76-79.

24. Воеводина, Ю.А. Микобактериозы крупного рогатого скота в природных условиях Вологодской области: Дисс.канд. вет. наук: 16.00.03 / Ю.А. Воеводина; Вологда, 2008. 215 с.

25. Гильмутдинов, Р.Я. Инфекционные болезни экзотических и диких животных / Р.Я. Гильмутдинов, A.B. Иванов, А.Н. Панин // М.: «КОЛОС», 2010.-С. 1-6, 271-477.

26. Гребенникова, Т.В. Молекулярные методы исследования в диагностике туберкулёза / Т.В. Гребенникова, С.Л. Кальнов, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов // Ветеринарная патология. 2004. - №1-2. - С.92-93.

27. Грищенко, О. Непальских слонов защищают от туберкулёза / О. Грищенко // Белый слон. 2006. - №12. - С. 5-6.

28. Гулюкин, М.И. Оздоровительные мероприятия при туберкулёзе крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин, А.Х. Найманов, В.А. Ведерников, Н.Г. Толстенко, Н.К. Букова, H.A. Ярёменко // Ветеринария.-2012.-№1.-С.З-8.

29. Гусев, В.В. Вирусные и бактериальные инфекции у обезьян. Научно-методическое руководство по диагностике, лечению и профилактике инфекционных болезней у обезьян // Калуга: Изд. «Контур Лтд.», 1998. С. 110-146.

30. Гусев, В.В. Туберкулёз обезьян / В.В. Гусев // Ветеринария. 1998. -№9. - С.46-47.

31. Данко, Ю.Ю. Эпизоотологический надзор при туберкулезе крупного рогатого скота: Автореф.дисс.доктора вет. наук: 16.00.03 / Ю.Ю. Данко. -С.-Пб., 2000.-36 с.

32. Данко, Ю.Ю. Туберкулёз уссурийского пятнистого оленя в условиях северо-запада России / Ю.Ю. Данко, A.A. Кудряшов, И.К. Русанов, И.А.К узнецов, Ю.Ю.Данко //Ветеринарный консультант.-2006.-№7.-С.16-18.

33. Деева, Г.В. Кожные болезни попугаев / Г.В. Деева // Материалы 8-го Международного конгресса по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных. М., 2000. - С. 166-168.

34. Донченко, A.C. Разработка и внедрение научно обоснованных мер борьбы с туберкулезом с/х животных / A.C. Донченко, H.A. Донченко // Ветеринария Сибири. 2000. - №4. - С. 17-21.

35. Донченко, A.C. Диагностика туберкулёза крупного рогатого скота / A.C. Донченко, Н.П. Овдиенко, H.A. Донченко. Новосибирск, 2004. - 306 с.

36. Донченко, H.A. Усовершенствование средств и методов диагностики и профилактики туберкулёза крупного рогатого скота: Автореф.дисс.доктора.вет. наук: 16.00.03, 16.00.04 / Н.А. Донченко; ИЭВСиДВ. Новосибирск, 2008. -36 с.

37. Дубилей, С.А. Молекулярно-генетические методы идентификации лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis / С.А. Дубилей, А.Н. Игнатова, И.Г. Шемякин // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005. - №1. - С.3-7.

38. Ефимычев, И.В. Как правильно трактовать полученный результат при диагностике методом ПЦР / И.В. Ефимычев // Н.Новгород: Медицинский центр «Наследственность», 2002. №3. - С .5-6.

39. Журавлёв, В.Ю. Генодиагностика диссеминированного туберкулёза / В.Ю. Журавлёв, И.Н. Васильев, О.В. Нарвская // Сб.тр.б-ой Всероссийской научн.-практич. конф. с между нар.участием «Молекулярная диагностика-2007». М., 2007. - Т.З. - С. 17-20.

40. Забережный, А.Д. Перспективные направления развития ветеринарной диагностики / А.Д. Забережный // Сб. тр. VII Всероссийской научн.-практ. конф. с междунар. участием «Молекулярная диагностика 2010». М., 2010. -Т.2. -С.99-103.

41. Завгородний, А.И. Паратуберкулёз сельскохозяйственных животных / А.И. Завгородний, С.А. Позмогова, В.А. Головко // Ветеринарна Медицина. -2010. -Вып.94. С.171-173.

42. Иртуганова, О.А. Современные возможности микробиологической лаборатории / О.А. Иртуганова // Клиническая лабораторная диагностика.-2006-№1- С.21-35.

43. Калмыкова М.С. Сравнительное испытание тест-систем для ПЦР-диагностики туберкулёза животных / М.С. Калмыкова // Ветеринарная патология. 2006. -№3. - С. 151-154.

44. Калмыкова, М.С. Диагностическая ценность ПНР тест-систем при туберкулёзе животных: Автореф. дисс. канд. вет. наук: 16.00.03 / М.С. Калмыкова; ВИЭВ. - Москва, 2007. - 27 с.

45. Капков, Л.П. Туберкулез в России в XX веке / Л.П. Капков // Здравоохранение Российской Федерации. 2002. - №3. - С.20-24.

46. Касьянова, Е.А. Оптимизация комплекса видовой идентификации микобактерий: Автореф. дисс.канд. вет. наук: 06.02.02 / Е.А. Касьянова; ВИЭВ. Москва, 2010. - 31 с .

47. Карягина, А.С. Геномика и генная инженерия: рациональные подходы для разработки новых средств борьбы с туберкулёзом / А.С. Карягина, Б.С. Народницкий, А.С. Апт, А.Л. Гинцбург // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2005. - №4. - С.94-99.

48. Киншт, В.Н. Оценка эпидемиологической напряжённости по туберкулёзу с использованием комплекса бактериологических и молекулярно-биологических методов / В.Н. Киншт, А.Г. Чередниченко, М.Л. Филипенко,

49. М.А. Рот // Сб. тр. 6-ой Всероссийской научн.-практич. конф. с междунар. участием «Молекулярная диагностика-2007». М., 2007. - Т.З. - С.21-24.

50. Козлов, В.Е. Оценка эффективности и специфичности коммерческих серий туберкулина (ППД) для млекопитающих отечественного производства / В.Е. Козлов, Н.К. Букова, А.Х. Найманов // Ветеринарная патология. 2004. -№1-2. - С.82-85.

51. Концевая, И.С. Молекулярная эпидемиология туберкулёза: задачи, методы, перспективы / И.С. Концевая, В.В. Николаевский, Я.М. Балабанова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. - №1. - С.3-10.

52. Корнева, И.Н. Конструирование ПЦР^гест^систем для обнаружения и идентификации микобактерий туберкулёза у животных / И.Н. Корнева, В.В. Дёмкин // Ветеринарная патология. 2004. - №1-2. - С.95-96.

53. Курандо, Е.Э. Совершенствование бактериологической диагностики туберкулёза животных в условиях изменяющейся эпизоотической ситуации: Автореф. дисс.канд. биол. наук: 06.02.02 / Е.Э. Курандо; ВИЭВ. Москва, 2010.-23 с.

54. Кучеров, A.JT. Рамки ВОЗ для эффективной борьбы с туберкулезом: приемлемы ли они для России? / A.JI. Кучеров // Туберкулез и экология. -1995. № 2. - С.38-40.

55. Ларионова, Е.Е. Информативность полимеразной цепной реакции для диагностики туберкулёза лёгких: Автореф. дисс.канд. биол. наук: 03.00.07./ Е.Е. Ларионова. Москва, 2005. - 24 с.

56. Лиманский, А.П. Компьютерный анализ инвертированных повторов в геноме микобактерий туберкулёза/ А.П. Лиманский, О.Ю. Лиманская, Ю.Л. Волянский // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2004. - №5. - С.48-52.

57. Мальков, И.Г. Дифференциация M.tuberculosis и M.bovis от атипичных видов микобактерий методами ДНК-ДНК гибридизации и полимеразной цепной реакции: Автореф. дисс.канд. биол. наук: 03.00.23. / И.Г. Мальков. -Москва. 1993.-21с.

58. Мельник, В.М. Клиническая оценка эффективности выявления микобактерий туберкулёза на среде ВКГ / В.М. Мельник, Л.В. Турченко, Ю.И. Фещенко // Ветеринарная патология. 2004 - №1-2. - С.110-113.

59. Найманов, А.Х. Аллергическая диагностика микобактериальных инфекций крупного рогатого скота: Автореф. дисс.докт. вет. наук: 16.00.03 / А.Х. Найманов; ВИЭВ. Москва, 1993. - 29 с.

60. Найманов, А.Х. Дифференциация аллергических реакций на туберкулин / А.Х. Найманов // Ветеринария. 2002. - №3. - С.10-13.

61. Найманов, А.Х. Проблемы диагностики и профилактики туберкулёза крупного рогатого скота в современных условиях / А.Х. Найманов // Ветеринарная патология. 2004. - №1-2. - С. 18-23.

62. Найманов, А.Х. ПЦР при диагностике туберкулёза крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, Н.П. Овдиенко, Е.П. Осипова, И.В. Солодова, B.C. Суворов, И.Н. Корнева, В.В. Дёмкин // Ветеринария. 2004. - №1-2. - С.19-23.

63. Найманов, А.Х. Диагностическое значение ПЦР на современном этапе борьбы с туберкулёзом крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, М.С. Калмыкова, Е.П. Осипова//Ветеринарная патология-2009.-№3 (30).-С.33-39.

64. Найманов, А.Х. Новые пути распространения и сенсибилизации крупного рогатого скота нетуберкулёзными микобактериями / А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко, B.C. Суворов, О.В. Якушева // Труды ВИЭВ. М., 2010. -Т.76. - С.71-80.

65. Найманов, А.Х. Внутрикожная туберкулиновая проба на службе у ветеринарии / А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко // Ветеринарная жизнь. 2012. -№ 6. - С.14-15.

66. Наставление по диагностике паратуберкулёза (паратуберкулёзного энтерита) животных: Утв. 05.04.2001 г. М., 2001. - 22 с.

67. Наставление по диагностике туберкулёза животных: Утв. 18.11. 02. -М., 2002. 64 с.

68. Низова, A.B. Определение устойчивости клинических штаммов Mycobacteria tuberculosis к пиразинамиду / A.B. Низова, В.Н. Степаншина,

69. H.B. Майская и др. //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2008. №4. - С.23-26.

70. Нуратинов, Р. А. Туберкулез крупного рогатого скота в Республиках Северного Кавказа и Калмыкии (эпизоотология, проблемы дифференциальной диагностики и меры борьбы): Дисс.докт. вет. наук: 16.00.03 / Р. А. Нуратинов; М. 1998. - 349 с.

71. Нуратинов, P.A. Взаимосвязь туберкулеза крупного рогатого скота и людей в условиях Республики Дагестан / P.A. Нуратинов, Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов // Состояние, проблемы и перспективы развития вет. науки России. -М., 1999.-Т.1.-С.158-163.

72. Обухов, И.Л. Лабораторная диагностика инфекционных болезней методом ДНК-амплификации при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) / И.Л. Обухов, К.Н. Груздев // Сб.науч.трудов / ВГНКИ. Москва, 1995 (1996). - Т.57. - С.36-45.

73. Обухов, И.Л. Использование полимеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях / И.Л. Обухов, К.Н. Груздев, А.Н. Панин // Ветеринария. 1997. - №2. - С.24-27

74. Обухов, И.Л. Усовершенствование коммерческих ПЦР-тест-систем для диагностики туберкулёза животных / И.Л. Обухов, Н.К. Букова, О.В. Клименкова // Ветеринарная патология. 2004. - №1-2. - С.94.

75. Овдиенко, Н.П. Эпизоотология и диагностика туберкулеза крупного рогатого скота в условиях интенсификации животноводства: Автореф. диссдокт. вет. наук: 16.00.03 / Н.П. Овдиенко; ВИЭВ. -М. 1991.-49 с.

76. Овдиенко, Н.П. Туберкулёз как международная и национальная медико-ветеринарная проблема в современных условиях / Н.П. Овдиенко, А.Х.

77. Найманов, Н.Г. Толстенко, В.Н. Хруленко, Н.А. Ярёменко, П.П. Рахманин, Н.В. Мельник, С.В. Крюков, В.Н. Боровой // Ветеринарный врач. 2009. - №2.- С.14-17.

78. Осипова, Е.П. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации микобактерий и её диагностическая значимость при туберкулёзе крупного рогатого скота: Автореф. дисс.канд. биол. наук: 16.00.03 / Е.П. Осипова; ВИЭВ. Москва, 2004. - 21с.

79. Оттен, Т.Ф. Микобактериоз лёгких: клинико-бактериологические критерии диагностики / Т.Ф. Оттен // Большой целевой журнал о туберкулёзе.- 1999.-№ 5.-С. 25-30.

80. Оттен, Т.Ф. Обследование очагов туберкулезной инфекции с использованием молекулярно-генетических методов: в кн. Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы / Т.Ф. Оттен, О.В. Нарвская, О.В. Гращенкова и др. //М., 2000.-229 с.

81. Оттен, Т.Ф. Микобактериоз / Т.Ф. Оттен, А.В. Васильев // СПб.: Медицинская пресса, 2005. 218 с.

82. Ощепков, В.Г. О значении симультанной аллергической пробы при диагностических исследованиях крупного рогатого скота на туберкулёз / В.Г. Ощепков, JI.A. Таллер, Н.И. Овсянова, Г.М. Дюсенова // Сб. научн. Тр. ВНИИБТЖ. 2003. - С.20-26.

83. Ощепков, В.Г. Ускоренная диагностика туберкулёза животных/ В.Г. Ощепков, JT.A. Таллер, Е.Ю. Секин, Т.А. Вассимирская, А.Д. Слепченко // Ветеринарна медицина. 2010. -№94. - С.136-137.

84. Павлов, Н.Г. Совершенствование диагностики и комплексных мер профилактики туберкулеза крупного рогатого скота: Дисс.канд. вет.наук: 16.00.03 / Н.Г. Павлов. Якутск, 2006. - 170 с.

85. Першикова, H.JI. Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые реакции у сельскохозяйственных животных: Автореф. дисс.канд, биол. наук: 16.00.03 / H.J1. Першикова; ИЭВСиДВ. -Новосибирск, 2008.-23 с.

86. Помыканов, Н.П. Совершенствование диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в индивидуальных и общественных хозяйствах: Дисс. .канд.вет.наук: 16.00.03 / Н.П. Помыканов; ВИЭВ. Москва, 2005. - 166 с.

87. Селицкая, Р.П. О полиморфизме DRBl-локуса системы HLA и восприимчивость к туберкулёзу / Р.П. Селицкая, М.Н. Болдырева, И.А. Гуськова // Иммунология. 2009. - №30(6). - С.ЗЗ 8-341.

88. Сидорчук, В.А. Паратуберкулёз овец, коз и кроликов в экспериментальных условиях: Автореф. дисс.канд. вет. наук: 06.02.02 / В.А. Сидорчук; ВГНКИ. Москва, 2010. - 30 с.

89. Скородумов, Д.И. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных: справочник / Д.И. Скородумов. Москва, 2005. - С. 222236, 273-293.

90. Скотникова, О.И. Молекулярно-биологические методы во фтизиатрии / О.И. Скотникова // Проблемы туберкулёза и болезни лёгких-2005.-№8.-С.5-9.

91. Смолянинов, Ю.И. Метод ускоренной постановки биологической пробы на морских свинках в диагностике туберкулёза животных / Ю.И. Смолянинов, Н.С. Боганец, А.Д. Панкратова // Ветеринарная патология. -2004. №1-2.-С.115-118.

92. Суханов, И.П. Диагностика туберкулёза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции: Автореф. дисс.канд. биол. наук: 16.00.03 / И.П. Суханов; ВГНКИ. Москва, 1999.-25 с.

93. Таллер, JI.A. Совершенствование лабораторной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота / Л.А.Таллер, В.Г. Ощепков, Е.Ю. Секин, А.Д. Слепченко/УДостижения науки и техники АПК. 2011. - №9. - С.67-69.

94. Токаревич, К.Н. Важнейшие инфекционные болезни, общие для животных и человека / К.Н. Токаревич // Л.:Медицина, 1979. С.189-197.

95. Тунгусова, О.С. Молекулярная генетика микобактерий туберкулеза / О.С. Тунгусова, А.О. Марьяндышев // Проблемы туберкулеза. 2003. - №2. -С.43-45.

96. Тупота, Н.Л. Диагностическая значимость различных методов выявления микобактерий / Н.Л. Тупота, C.B. Ионина, H.A. Донченко, С.Г.Т упота, В.Н. Донченко // Ветеринария. 2010. - № 3. - С.56-58.

97. Хаммадов, Н.И. Изучение эффективности различных молекулярно-генетических методов идентификации и дифференциации возбудителей туберкулёза и атипичных микобактерий: Дисс.канд.биол.наук, 06.02.02 / Н.И. Хаммадов; Казань, 2009. 151 с.

98. Черноградский, И.П. Бактериовыделение при туберкулезе в условиях Якутии / И.П. Черноградский, Г.И. Алексеева, В.Т. Захаров и др. // В кн.: Вопросы адаптации человека на Севере. Якутск, 1990. - С.11-13.

99. Черноусова, Л.Н. Роль ПЦР-анализа в комплексных бактериологических исследованиях во фтизиатрии / Л.Н. Черноусова, Е.Е. Ларионова, Э.В. Севастьянова, В.И. Голышевская // Проблемы туберкулеза. -2001. -№ 3. — С.58-60.

100. Черноусова, Л.Н. Современные тенденции и возможности микробиологической диагностики туберкулеза /Л.Н. Черноусова // Российский медицинский журнал. 2002. - № 10 (16). - С.697-698.

101. Шаров, А.Н Тест-системы ПНР при туберкулёзе / А.Н. Шаров, В.А. Седов // Ветеринария. 1998. -№3. - С.20-22.

102. Шаров, А.Н. ПЦР при диагностике туберкулёза / А.Н. Шаров, Л.А. Ерошенко, И.П. Суханов, С.Л. Кальнов, Т.В. Гребенникова, В.В. Грабовецкий // Ветеринария. 2000. - №10. - С. 19-22.

103. Шаров, А.Н. Эффективность методов прижизненной диагностики туберкулёза / А.Н. Шаров, Л.А. Ерошенко, И.П. Суханов, С.Л. Кальнов, Т.В. Гребенникова, В.В. Грабовецкий // Ветеринария. 2002. - № 2. - С.16-18.

104. Шаров А.Н. Проблемы ПЦР-диагностики туберкулёза / А.Н. Шаров // Ветеринарный консультант. 2003. - №21-22. - С. 14-15.

105. Шаров, А.Н. О бактериологической диагностике туберкулёза / А.Н. Шаров // Ветеринарная жизнь. 2005. - №6. - С.7.

106. Шевнин, В.М. Эпизоотологические и патологоанатомические аспекты туберкулёза маралов: Автореф. дисс.канд. вет. наук: 16.00.03 / В.М. Шевнин; НИИ пантового оленеводства. Баранул, 2005. - 18 с.

107. Шенжанов, К.Т. Биотехнологические основы совершенствования диагностики туберкулёза / К.Т. Шенжанов // Ветеринарная патология. 2004. -№1-2. - С.137-138.

108. Шуляк, Б.Ф. 110 лет со дня открытия возбудителя паратуберкулёза / Б.Ф. Шуляк // Российский ветеринарный журнал. 2005. - №9. - С.238-239.

109. Янченко, Т.А. Усовершенствование лабораторной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота: Автореф. дисс.канд. биол. наук: 06.02.02 / Т.А. Янченко; ВНИИБТЖ. Новосибирск, 2011. - 18 с.

110. Abu-Amero, K.K. Evaluation of the Cobas Amplicor MTB test for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex // East Mediterr Health J. 2004. - V.10(3). - Pp.329-335.

111. Ackermann, L. Mycobacterium tuberculosis infection in a parrot (Amazona Farinosa) / L. Ackermann, S. Benbrook, В. Walton // Amer. Rev. Respir. Dis. 1974. - V.109. - Pp.388-390.

112. Aldous, W.K. Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR / W.K. Aldous, J.I. Pounder, J.L. Cloud, G.L. Woods // J. Clin Microbiol. 2005. -V.43(5).-Pp.2471-2473.

113. Aradaib, I. Evaluation of Conventional Methods and Nested PCR (nPCR) for Detection of Paratuberculosis in Goats / I. Aradaib, Z. Abbas, B. Abbas, S. Sanousi //Veterinary Research Communications.-2005.-V.29 .-№5- Pp.381-385.

114. Archibald, L.K. Detection of bloodstream pathogens in a bacille Calmette-Guerin (BCG)-vaccinated pediatric population in Malawi: a pilot study / L.K. Archibald, O. Nwanyanwu, P.N. Kazembe et al. // J.Clin. Microbiol. Infect. 2003. - № 3(9):234-8.

115. Ashford, D. Epidemiology of selected mycobacteria that infect humans and other animals / D. Ashford, E. Whithey, P. Raghunathan, 0. Cosivi // Rev. Sei. et techn.: Off int.epizoot. 2001. - V.20. - №1. - Pp.325-337.

116. Assesment of food as a Sourse of Exposure to Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) (revive) / Food Protection. 2010. - V.73. -№7. - Pp.1357-1397.

117. Ayele, W.Y. Distribution of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in organs of naturally infected bull-calves and breeding bulls / W. Ayele, M. Bartos, P. Svastova, I. Pavlik // J. Vet. Microbiol. 2004. - V.103. - Pp.209-217.

118. Boom R., Salimans M.M.H. // J.Clin.Micbiol. 1990. - Vol.28. -№.2. -P.495-503.

119. Bradshaw, G.A. Elephant breakdown. Social trauma: early disruption of attachment can affect the physiology, behaviour and culture of animals and humans over generations / G.A. Bradshaw, A.N. Schore , J.L. Brown et al. // Nature, 2005. -Vol.433.-P.807.

120. Brammer, D.W. Tuberculosis infection in squirrel monkeys / D.W. Brammer, C.M. O'Rourke, L.A. Heath, C.E. Chrlsp, G.K. Peter, G.L. Hofing // J. Medical Primatology. 1995. - V.24. - №4. - Pp.231-235.

121. Brown, T. Assosiation between Mycobacterium tuberculosis strains and phenotypes / T. Brown, V. Nikolaevsky, P. Velji et al. // Emerg. Infect. Dis. 2010. - V. 16. - №2. - Pp.272-280.

122. Brudey K. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology / K. Brudey et al. // BMC Microbiol. 2006. -№6. -P.23.

123. Burjanova, B. Tuberkuloza vyvolana Mycobacterium bovis v ludskej populaci SSR v obdobi rokov 1979-1983 / B. Burjanova, M. Nagyova // Stud. Pneum. et phtiseol. Cechosl. 1985. - V.45. - №5. - Pp.346-348.

124. Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // J. Mol. Endocrinol. 2000. -№25.-Pp. 169-193.

125. Bustin, S.A. Quantitation of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems // J.Mol. Endocrinol. 2002. -№29.- Pp. 2339.

126. Bustin, S.A. Pitfalls of quantitative real-time reverse-trasncription polymerase chain reaction / S.A. Bustin, T. Nolan // J. Biomol. 2004. - №15. - Pp. 155-166.

127. Calle, P.P. Tuberculin responses in orangutans / P.P. Calle, M.E. Fowler, R.E. Miller, W.B. Saunders // In Zoo and wild animal medicine, 1999. Pp.392396.

128. Cheng V.C. Molecular diagnostics in tuberculosis / V.C. Cheng, W.W. Yew, K.Y. Yuen // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2005. - V.24(ll). -Pp.711-720.

129. Cleary, T.J. Rapid and specific detection of Mycobacterium tuberculosis by using the Smart Cycler instrument and a specific fluorogenic probe / TJ. Cleaiy, G. Roudel, O. Casillas, N. Miller // J Clin Microbiol. 2003. - V.41. - Pp.47834786.

130. Clifon-Hadley, R. Mycobacterium bovis infections. In: E.William, I.Barker (eds.) / R. Clifon-Hadley, C. Sauter-Louis, I. Lygton et.al. // Diseases of Wild Mammals. 3th ed. London: Manson Publishing Ltd., 2001. - Pp.340-361.

131. Com, J.L. Isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from free-ranging birds and mammals on livestock premises / J.L. Com, E.J. Manning, S. Sreevatsan, J.R. Fischer // Appl.Environ Microbiol 2005. - №71. - Pp.6963-6967.

132. De Lisle, G.W. The emergence of Mycobacterium paratuberculosis in farmed deer in New Zealand a review of 619 cases / G.W. De Lisle, G.F. Yates, R.H. Montgomery // New Zealand Veterinary Journal.-2003.-V.51.-№2.-Pp.58-62.

133. Djonne, B. Detection by immunomagnetic PCR of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk from dairy goats in Norway / B. Djonne, M.R. Jensen, I.R. Grant, G. Holstad // J. Veterinary Microbiology. 2003. - V.92. - №1. -Pp. 135-143.

134. Doosti, A. Application of IS900 nested-PCR for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis directly from faecal specimens / A. Doosti, S. Moshkelani // Bulg. J. Veter. Med. 2010. - Vol.13. - №2. - P.92-97.

135. Elephants blamed for TB outbreak at Tenn. refuge / The Associated Press, 2011.-№2/16.

136. Enarson, D.A. Use of the tuberculin test in children // Paediatr Respir Rev. -2004.-V.5.- Pp.77.

137. Eppleston, J. Isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from the semen of rams with clinical Johne's disease / J. Eppleston, R.J. Whittington // Aust. Vet. J. 2001. - V.79. -Pp.776-777.

138. Espy M. J. Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing / M.J. Espy, J.R. Uhl, L.M. Sloan, S.P. Buckwalter, M.F. Jones, E.A. Vetter et al. //Clin Microbiol Rev. 2006.- №19(1). - Pp.165-256.

139. Fleischmann, R.D. Whole- Genome Comparison of Mycobacterium tuberculosis Clinical and Laboratory Strains / R.D. Fleischmann, J. Alland // J.Clin.Microbiology. 2002. - V.184. - №19. - Pp.5479-5490.

140. Freeeksen, E. Die sogenennten atypischen Mycobacterien // Klin.Wschr. -1960. №38. - Pp.297-308.

141. Garcia, M.A. Diagnosis of tuberculosis in macaques, using whole-blood in vitro interferon-gamma (PRIMAGAM) testing / M.A. Garcia, J. Yee, D.M. Bouley, R. Moorhead, N.W. Lerche // J. Comp. Med. 2004. - №54. - Pp.86-92.

142. Gamier T. The complete genome sequence of Mycobacterium bovis / T. Gamier, K. Eiglmeier, J. Camus // PNAS. 2003. - Vol. 100. - №.13. - P.7877-7882.

143. Glawisching, W. Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from the testicles of a clinically infected breeding animal / W. Glawisching, M. Awad-Massalmeh, D. Khaschabi // Berl.Munch. Tierarztl. Wochenschr. -2004. V.l 17. - Pp.136-139.

144. Gortazar, C. Progress in Oral Vaccination against Tuberculosis in Its Main Wildlife Reservoir in Iberia, the Eurasian Wild Boar / C. Gortazar, R.J. Delahay, R.A. McDonald, M. Boadella, G.J Wilson et al. //Mammal Review. 2012. -V. 42. -№3.-Pp. 193-206.

145. Guidelines for the control of tuberculosis in elephants: The national tuberculosis working group for Zoo and wildlife species. 2008. - 43 p.

146. Haddad, N. Molecular differentiation of Mycobacterium bovis isolates. Review of main techniques and applications / N. Haddad, M. Masselot, B. Durand // Research in Veterinary Science. 2004. - Vol. 76. - Pp.1-18.

147. Hammer, P. Heat resistance of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in raw milk tested in a pilot plant pasteurizer / P. Hammer, C. Kiesner, H.G. Walte, K. Knappstein, P. Teufel // Kiel. Milchwirtsch. Forschungsber. 2002. - V.54. -Pp.275-303.

148. Herthnek, D. Sensitive detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in bovine semen by real-time PCR / D. Herthnek, S. Englund, P.T.J. Willemsen, G. Bolske // J. of Applied Microbiology. 2006. - №100. -Pp. 1095-1102.

149. Ichihara, M.Y. Tuberculin reactivity in a population of schoolchildren with high BCG coverage / M.Y. Ichihara et al. // Rev. Panam. Salud. Publica. 2003. -№13.-Pp.285.

150. Jalmes, N.G. Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis by nested-PCR of ovine fecalsamples / N.G. Jalmes, M.A. Santillan-Flores, O.A. Hernandez Cruz et al. // Veterinaria Mexico.-2008.-V.39. №4. - Pp.377-386.

151. Kennedy, D.J. Control of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis infection in agricultural species / D.J. Kennedy, G. Benedictas // Rev.Sci.Tech. -2001. -№20. Pp.151-179.

152. Kinne, J. Camel tuberculosis-a case report / J. Kinne, B. Johnson, K. Jahans, N. Smith, A. Ul-Haq, U. Wernery // J. Tropical Animal Health and Production. 2006. - V.38. - №3. - Pp.207-213.

153. Kleeberg, H.H. Human tuberculosis of bovin origin in relation to public health // Rev. sei et techn. Off. int. epizoot. 1984. - V.3. - №1. - Pp.11-32.

154. Klein, D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations // Trends. Mol. Med. 2002. - №8. - Pp.257-260.

155. Knepp, J.H. Comparison of automated and manual nucleic acid extraction methods for detection of enterovirus RNA / J.H. Knepp, M.A. Geahr, M.S. Forman, A. Valsamakis // J. Clin. Microbiol. 2003. - №41. - Pp.3532-3536.

156. Kruse, H. Wildlife as source of zoonotic infections / H. Kruse, A.-M. Kirkemo, K. Handeland //Emerg.Infect.Dis 2004. - V.10. - №12. - Pp.2067-2072.

157. Lyashchenko, K.P. Antibody responses in New Word camelids with tuberculosis caused by Mycobacterium microty / K.P. Lyashchenko, R. Greenwald, J. Esfandiari et al. // Vet. Microbiol. 2007. - V.125. - №3-4. - Pp.265-273.

158. Lecu, A. Mycobacterial infections in zoo animals: relevance, diagnosis and management / A. Lecu, R. Ball // International Zoo Yearbook.-V.45. 2011. - № 1. -Pp. 183-202.

159. Lin, P.L. Immunological concepts in tuberculosis diagnostics for nonhuman primates: a review / P.L. Lin, J.A. Yee, E. Klein, N.W. Lerche // J. Medical Primatology. 2008. - V.37. - №1. - Pp.44-51.

160. Luu-The, V. Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction / V. Luu-The, N. Paquet, E. Calvo, J. Cumps // Biotechniques. 2005. - №38. - Pp. 287-293.

161. Mackay, I.M. Real-time PCR in the microbiology laboratory // Clin Microbiol Infect. 2004. - V.10. - Pp. 190-212.

162. Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines Text. / OIE, 2008. -Chapter 2.1.11.-P.276.

163. Martino, M. Tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) in a pregnant baboon (Papio cynocephalus) / M. Martino, G.B. Hubbard, N. Schlabritz-Loutsevitch // J. Medical Primatology. 2007. - V.36. - №2. - Pp. 108-112.

164. Maslow, J. Tuberculosis and other mycobacteria as zoonoses / In Proc. American Association of Zoo Veterinarians Annual Conference // Houston, Texas, 1997.-Pp.110-115.

165. Mauricio, L. BCG vaccine: efficacy and indications for vaccination and revaccination / L. Mauricio, M.L. Barreto, S.M. Pereira, A.A. Ferreira // Jornal de Pediatria. 2006. - V.82. - №3. - Pp.177-189.

166. Michael, A. PCR protocols. A Guide to methods and applications / A. Michael, H. David, J. John // Academic press, Inc. 1990.

167. Michel, A. Mycobacterium tuberculosis infections in eight species at the National Zoological gardens of South Africa, 1991-2001 / A. Michel, L.Venter, I. Espie, M. Coeizee // J. Zoo Wildlife Med. 2003. - V.34. - №4. - P.364-370.

168. Mikota, S.K. Epidemiology and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis in captive Asian elephants (Elephas maximus) / S.K. Mikota, L. Peddie, J. Peddie, R. Isaza, F. Dunker, G. West et al. // J.Zoo Wildl. Med. 2001. - №32. - Pp.1-16.

169. Montali, RJ. Tuberculosis in captive exotic birds / R.J. Montali, M. Buch,

170. C. Thoen, E. Smith // J.Amer.Vet.Med.Assoc. 1976. - V.169. - Pp.920-927.

171. Montali, R.J. Mycobacterium tuberculosis in zoo and wildlife species / R.J. Montali, S.K. Mikota, L.I. Cheng // Rev.sci.tech.Off int.Epiz. 2001. - №20(1). -Pp.291-303.

172. Mostowy, S. Genomic interrogation of the dassie bacillus reveals it as a unique RD1 mutant within the Mycobacterium tuberculosis complex / S. Mostowy,

173. D. Cousins, M. Behr // J. Bacterid. 2004. - V. 186. - №1. - Pp. 187-188.

174. Mullis, K. Specific synthesis of DNA in vitro via a pokymerase-2catalyzed chaine reaction / K. Mullis, F. Falona // Meth. Enzymol. 1987. - V.155. - Pp.335350.

175. Nielsen, S.S. Transitions in diagnostic tests used for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infections in cattle // Vet. Microbiol. 2008. - V.132. - Pp.274-282.

176. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA / H. Okayama, H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe et al. / Nucleic Acids Res. -2000.-V. 28(12).-Pp.63

177. Palmer, M. Experimental deer to deer transmission of Mycobacterium bovis / M. Palmer, D. Whipple, W. Waters // Amer. J. Vet. Res. 2001. - V.62. -№5. -Pp.219-222.

178. Palmer, M. Isolation of Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis (MAP) from fecal cats on a dairy with MAP-infection cattle Text. / M. Palmer, W.C. Stoffegen, I.G. Carpenter, J.R. Stabel //J.Wild Dis.-2005.-№41. -Pp.629-635.

179. Panarella, M.L. A Naturally Occurring Outbreak of Tuberculosis in a Group of Imported Cynomolgus Monkeys (Macaca fascicularis) / M.L. Panarella, R.S. Bimes // The American Association for Laboratory Animal Science. 2010. -V.49. - №2. - Pp.221-225.

180. Pate, M. Outbreak of Tuberculosis Caused by Mycobacterium caprae in a Zoological Garden / M. Pate, T. Svara, M. Gombac, T. Paller, M. Zolnir-Dovc, I.

181. Emersic et al. // J. Veterinary Medicine. 2006. - Series B. - V.53. - №8. - Pp. 387-392.

182. Pavlik, I. IS900 RELP types of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in faeces and environmental samples on four dairy cattle farms /1. Pavlik, A. Horyathova, L. Bartosova, V. Babak, M. Moravkova // Veter. Med. -2010. V.55. - №1. - Pp.1-9.

183. Rastogi, N. The mycobacteria: an introduction to nomenclature and pathogenesis. In Mycobacterial infections in domestic and wild animals / N. Rastogi, E. Legrand, C. Sola et all. // Rev.sci.tech.off int. Epiz.~2001. № 20(1). - Pp.21-54.

184. Rock, F.M. Diagnosis of a case of Mycobacterium tuberculosis in a Cynomolgus monkey colony by polymerase chain reaction and immunosorbent assay / F.M. Rock, M.S. Landi, L.D. Meunier et all. // Lab.anim.Sci. 1995. - №45. -Pp.315-319.

185. Ryan, P. Tuberculosis in Circus Elephants // Southern California Veterinary Medical Association. 1997. - №1. - Pp.8-15.

186. Schlisser, T.A. Prevalence of tuberculosis and mycobacterial disease in some European zoos / In Proc. Symposium on mycobacterial infections in zoo animals, 1978.-P.29-32.

187. Shellabarger, W.C. Zoo personnel health program recommendations / In Infectious desease reviews American association of Zoo, 1993. -P.l-20.

188. Soave, 0. Atypical mycobacteria as the probable cause of positive tuberculin reactions in squirrel monkeys (Saimiri sciureus) / O. Soave, S. Jackson, J. Ghumyman // J. Lab. Animal Sei. 1981. - V. 31. - P.295-296.

189. Sternberg, S. Survey of tuberculin testing in Swedish zoos / S. Sternberg, K. Bemodt, A. Holmstrom, B. Rocken // J. Zoo wildlife Med. 2002. - V.33. -№4. - Pp.378-380.

190. Stetter, M.D. Epizootic of Mycobacterium bovis in a zoological park / M.D. Stetter, S.K. Mokota, A.F. Gutter et all. // J. Am. vet. med. assoc. 1995. -№207. -Pp.1618-1621.

191. Szteyn, I. Effectiveness of Mycobacterium paratuberculosis isolation from raw milk by means of direct isolation of DNA and classic culture / I. Szteyn, A. Wiszniwska-Laszczych, A. Ruszczynska // Pol. J. Veter. Sei. 2008. - V.ll. - №1. -Pp.25-28.

192. Thoen, C.O. Tuberculosis and other mycobacterial diseases in captive wild animals / C.O. Thoen, M.E. Fowler, W.B. Saunders // In Zoo and wild animal medicine, current therapy, 1993. P. 45-49.

193. Thoen, C.O. Tuberculosis. Zoonosis updates // J. Amer.Vet.Med.Assoc. -1995. V.3. - P.155-158.

194. Thoen, C. The importance of Mycobacterium bovis as a zoonosis / C. Thoen, P. LoBue, I. de Kantor // Veterinary microbiology and microbial disease. -2006. №112. - Pp.339-345.

195. Thorel, M.F. Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare infection in mammals / M.F. Thorel, H.F. Huchzermeyer, A.L. Michel // Rev. Sei. Tech. 2001. - V.20. - Pp. 204-218.

196. Tsolaki, A.G. Genomic Deletions Classify the Beijing. Watrains as a Distinct Genetic Lineage of Mycobacterium tuberculosis / A.G. Tsolaki, S. Gagneux, A.S. Pym et al. // J.Clin. Microbiol. 2005. - №43(7). - Pp.3185-3191.

197. Valentine-Thon E. Quality control in nucleic acid testing-where do we stand / J. Clin. Virol. 2002. - Vol. 25.- №3. - Pp. 13-21.

198. Voskuil, M. I. Regulation of the Mycobacterium tuberculosis PE/PPE genes / M.I. Voskuil, D. Schnappinger, R. Rutherford et al. // Tuberculosis (Edinb.). 2004. - №84(3-4). - Pp.256-262.

199. Wallach, J.D. Diseases of exotic animals: medical and surgical management / J.D. Wallach, W.J. Boever// Philadelphia: Saunders, 1983. 1159 p.

200. World Health Organization (WHO) /Communicable disease surveillance -tuberculosis. Ref. №15-17. 2000. - 173 pp.

Информация о работе

Калмыков, Виктор Михайлович
кандидата ветеринарных наук
Щелково, 2013
ВАК 06.02.02

Диссертация

Использование полимеразной цепной реакции в целях мониторинга благополучия по микобактериальным инфекциям зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы