Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Усовершенствование лабораторной диагностики хламидийных инфекций свиней

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование лабораторной диагностики хламидийных инфекций свиней"

На правах, рукописи

САПЕГИН Виктор Михайлович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ СВИНЕЙ

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

5 ДЕК 2013

005541686 Курск-2013

005541686

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородская сельскохозяйственная академия имени В .Я. Горина».

Коваленко Анатолий Михайлович доктор ветеринарных наук, профессор

Бвглевский Анатолий Алексеевич доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова», профессор кафедры эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии

Шевцов Илларион Андреевич кандидат ветеринарных наук, ОБУ «Курская городская станция по борьбе с болезнями животных», руководитель

Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится «24» декабря 2013 г. в 15-00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.040.03 при ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И.Иванова» по адресу: 305021, г.Курск, ул. Карла Маркса, 70. Тел. (4712) 53-13-30. Факс (4712) 53-84-36.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова».

Автореферат размещен на официальном сайте ВАК Минобрнауки РФ http://vak.ed.gov.ru/ и на сайте ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» http://www.kgsha.ru/ «22» ноября 2013 года.

Автореферат разослан «22» ноября 2013 года.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь у

диссертационного совета - Рыжкова Галина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микроорганизмы из семейства Chlamydiaceae являются облигатными внутриклеточными бактериями, которые вызывают ряд заболеваний людей и животных, известных под общими названиями «хламидийные инфекции» или «хламидиозы». Возбудителями хламидийных инфекций свиней считаются четыре вида хламидий: Chlamydophila (Ср.) psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia (С.) suis.

Хламидийные инфекции являются одной из наиболее актуальных проблем современного промышленного животноводства, в том числе и свиноводства (Четвертных В.А. и др., 1998). Методам диагностики, профилактики и борьбы с хламидийными инфекциями свиней уделяется много внимания, но, несмотря на это, они остаются широко распространенными и наносят значительный экономический ущерб (Самуйленко А.Я. и др., 2003). Ущерб складывается главным образом из недополучения приплода в результате абортов у свиноматок во второй половине супоросности, мертворождения или рождения нежизнеспособного приплода, снижения привесов у молодняка и преждевременной выбраковки животных (Бортничук В.А., 1991). Из-за невозможности раннего диагностирования хламидийных инфекций и, как следствие, отсутствия своевременного проведения специфических профилактических и оздоровительных мероприятий, трудно найти свиноводческое хозяйство, где не было бы данных заболеваний (Равилов А.З., Хазипов Н.З., 1982; ШаткинА.А., 1984; Andersen A.A., 1996). Особенностью хламидийных инфекций, значительно усложняющей эпизоотический надзор за ними, является часто хроническое, со стертой клинической картиной, или латентное их течение (Караваев Ю.Д. и др., 2003). Следовательно, в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по профилактике и борьбе с данными заболеваниями большое значение имеет раннее и достоверное обнаружение их возбудителей при разных формах развития инфекционного процесса.

Каждый из возбудителей хламидийных инфекций свиней характеризуется своим спектром вызываемых заболеваний. Чаще всего С. suis вызывает энтерит и конъюнктивит. Ср. abortus обычно связывают с абортами и рождением слабого или нежизнеспособного потомства у свиноматок, а также полиартритами, которые чаще диагностируют у откормочных поросят. Ср. psittaci, как правило, обнаруживают в легких свиней больных пневмонией, редко— в маточной слизи абортировавших свиноматок. Установлена взаимосвязь Ср. pecorum со многими заболеваниями: энцефаломиелитом, пневмонией, артритом, конъюнктивитом, энтеритом, заболеваниями мочевых путей, метритом, нарушениями плодовитости и др. Кроме того, они имеют разный зоонозный потенциал, в частности Ср. pecorum может передаваться от свиней людям, а другие виды— нет. По этой причине в диагностике хламидийных инфекций большое значение приобретает идентификация вида(ов) хламидий, персистирующих у свиней и разработки мероприятий по борьбе с данными заболеваниями в хозяйстве.

В связи с этим существует необходимость в методе лабораторной диагностики, позволяющем выявлять и дифференцировать виды возбудителей хламидийных инфекций свиней. С этой целью был разработан целый ряд лабораторных методов прямого и косвенного выявления хламидий (Гаффаров Х.З. и др., 2000). Из них в ветеринарной практике нашли применение следующие методы: микроскопия, культуральный, серологический и молекулярно-генетический. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Сейчас наиболее перспективным методом прямой диагностики хламидийных инфекций считается молекулярно-генетический метод, а именно его наиболее популярная разновидность— полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Метод ПЦР выгодно отличается от других методов высокой специфичностью, позволяя идентифицировать возбудителя с точностью до вида и даже сероварианта, и высокой чувствительностью, позволяя обнаружить ничтожно малые количества возбудителей хламидийных инфекций (1-10 клеток) в образцах клинического материала. Кроме того, характеризуется простотой и удобством проведения анализа и дает возможность поставить диагноз в короткие сроки (4-6 часов). Немаловажным фактором является умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость проведения анализа.

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время известны ПЦР-тест-системы для семейственноспецифической детекции возбудителей хламидийных инфекций, а также для детекции и идентификации одного-двух видов хламидий. ПЦР-тест-системы для детекции и идентификации всех видов хламидий, патогенных для свиней, не разработаны. Данный факт послужил основанием для разработки ПЦР-тест-системы для детекции всех патогенных для свиней хламидий (Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus, Chlamydia suis) и дифференциации их между собой.

Цель и задачи. Цель данной работы— изучить распространенность хламидийных инфекций свиней в репродуктивных свиноводческих хозяйствах Белгородской области и усовершенствовать лабораторную диагностику хламидийных инфекций свиней с использованием полимеразной цепной реакции.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить распространенность хламидийных инфекций в свиноводческих хозяйствах Белгородской области.

2. Разработать схему ПЦР-амплификации фрагментов гена ompl, обеспечивающих возможность детекции и идентификации всех видов хламидий патогенных для свиней.

3. Сконструировать праймеры для ПЦР-амплификации семейственно- и видоспецифических фрагментов гена ompl согласно разработанной схеме.

4. Разработать гнездовую ПЦР-тест-систему для детекции и идентификации всех видов хламидий патогенных для свиней в образцах клинического материала с использованием электрофоретического анализа продуктов амплификации.

5. Оценить чувствительность и специфичность разработанной ПЦР-тест-системы при тестировании клинических образцов, отобранных от свиноматок из неблагополучных по хламидийным инфекциям хозяйств, в сравнении с коммерчески доступными ПЦР- и ИФА-тест-системами.

Научная новизна. Изучена распространенность хламидийных инфекций в репродуктивных свиноводческих хозяйствах Белгородской области.

Разработан новый способ видовой дифференциальной диагностики хламидийных инфекций свиней, вызываемых Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia suis (подана заявка на патент). Диагностика осуществляется путем применения двухступенчатой (гнездовой) полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров, комплементарных участкам гена отр-1.

На основе этого способа разработана и укомплектована высокочувствительная и высокоспецифичная ПЦР-тест-система «Хлами-суис» с детекцией в агарозном геле (ФГБОУ ВПО БелГСХА имени ВЛ. Горина) (зарегистрирована как секрет производства («ноу-хау»), охраняемого в режиме конфиденциальности, в региональном Депозитарии «ноу-хау» Белгородской области). Подтверждена ее высокая чувствительность и специфичность по сравнению с коммерчески доступными ПЦР- и ИФА-тест-системами.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в разработке нового способа диагностики хламидийных инфекций свиней и создании на основе этого способа высокочувствительной и высокоспецифичной ПЦР-тест-системы «Хлами-суис» для выявления ДНК Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia suis.

Разработанная ПЦР-тест-система «Хлами-суис» имеет большую практическую значимость, потому что она позволяет усовершенствовать схему мониторинга хламидийных инфекций на свиноводческих предприятиях. Данная тест-система дает возможность диагностировать хламидийные инфекции на всех стадиях развития инфекционного процесса, в том числе на ранних, а также выявлять животных с хроническим и латентным течением, что необходимо для проведения своевременных мер борьбы и профилактики хламидийных инфекций в хозяйстве. Идентификация хламидий до вида необходима для назначения специфических профилактических мероприятий. Таким образом, своевременная видовая диагностика хламидийных инфекций свиней и соответствующие специфические профилактические и оздоровительные мероприятия позволят уменьшить экономический ущерб, который складывается из недополучения приплода, снижения привесов молодняка, преждевременной выбраковки и т.п.

На основе полученных результатов исследований разработаны и утверждены следующие нормативно-технические документы:

- Временная инструкция по применению тест-системы «Хлами-суис» для выявления ДНК возбудителей хламидийных инфекций свиней (Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia suis) методом полимеразной цепной реакции;

— Технические условия на тест-систему «Хлами-суис» для выявления ДНК возбудителей хламидийных инфекций свиней (Chlamydophila psittaci, Chlamydophila ресошш, Chlamydophila abortus и Chlamydia suis) методом полимеразной цепной реакции.

Полученные результаты исследований послужили основой для разработки методических рекомендаций «Выявление возбудителей хламидиозов свиней методом полимеразной цепной реакции» (гриф Учебно-методического объединения высших учебных заведений Российской Федерации по образованию в области зоотехнии и ветеринарии от 04 апреля 2012 г. № 63-51). Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВПО БелГСХА имени В.Я. Горина и на кафедре эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО КГСХА имени профессора И.И. Иванова.

Основные положения диссертационной работы внедрены в ветеринарную практику свиноводческих хозяйств ООО «Белгранкорм»— «Томаровская свинина» и «Шебекинская свинина».

Положения, выносимые на защиту:

1. Распространенность хламидийных инфекций в свиноводческих хозяйствах Белгородской области.

2. Схема ПЦР-амплификации фрагментов гена ompl, обеспечивающих возможность обнаружения всех видов хламидий патогенных для свиней и дифференцирования их между собой.

3. Подбор праймеров для ПЦР-амплификации семейственно- и видоспецифических фрагментов гена ompl согласно разработанной схеме.

4. Разработка гнездовой ПЦР-тест-системы для детекции и идентификации всех видов хламидий патогенных для свиней в образцах клинического материала с использованием электрофоретического анализа продуктов амплификации.

5. Сравнение чувствительности и специфичности разработанной ПЦР-тест-системы с коммерчески доступными ПЦР- и ИФА-тест-системами при тестировании клинических образцов, отобранных от свиноматок из неблагополучных по хламидийным инфекциям хозяйств.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 8 работ, в том числе 2 в издании, включенном ВАК Минобрнауки РФ в «Перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора или кандидата наук».

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

— конкурсном отборе по программе «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса - 2009» (грант на выполнение НИОКР по договору № 14 с ООО «Плазмика») (Белгород, 2009);

— Международной студенческой научно-практической конференции «Модернизация аграрного производства: наука и практика» (Курск, 2010);

- II (Майский, 2010) и III (Ставрополь, 2010) этапах Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Минсельхоза России в номинации «Ветеринарные науки» (для аспирантов и молодых ученых в возрасте до 25 лет);

- Международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Модернизация АПК в контексте обеспечения продовольственной безопасности государства» (Курск, 2010);

- Белгородском областном конкурсе научных молодежных работ «Молодежь Белгородской области» (Белгород, 2011);

- Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвященной 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиологии и отдела охраны полезной энтомофауны (Москва, 2011);

- конкурсном отборе по программе «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса-2011» (грант на выполнение НИОКР по договору № 24 с ООО «Плазмика») (Старый Оскол, 2011);

- XVII Международной научно-производственной конференции «Проблемы и перспективы инновационного развития животноводства» (Майский, 2013).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 162 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и список литературы (всего 289 источников, в том числе 229 иностранных и 17 ссылок на сайты в Интернете). Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 12 рисунками. В приложении даны документы, подтверждающие научно-практическую значимость работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Научно-исследовательская работа проводилась с 2008 по 2013 гг. на кафедре инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Я. Горина», НПК «Синтол» (г. Москва) и ООО «Белгранкорм» производства «Шебекинская свинина» и «Томаровская свинина».

Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по хламидиозам свиней в свиноводческих хозяйствах Белгородской области осуществляли по данным, предоставленным ФГБУ «Белгородская межобластная ветеринарная лаборатория» за 2008-2012 гг. При эпизоотологическом обследовании стационарно неблагополучных по хламидиозам хозяйств «Томаровская свинина» и «Шебекинская свинина» использовали эпизоотологические, клинические, патологоанатомические, серологические и молекулярно-генетические методы исследований свиноматок. В основу методики

эпизоотологического обследования положены «Методические указания по эпизоотологическому исследованию» (Бакулов И.А. и др., 1982).

В качестве гена-мишени был выбран ген ompl. Наличие в гене ompl пяти консервативных областей и расположенных между ними четырех вариабельных доменов (VD I-VD IV) делает его наиболее удобной мишенью для детекции и дифференциации всех видов хламидий (BaehrW. et al., 1988). Консервативные области кодируют семейственно- и видоспецифические антигенные детерминанты, а вариабельные домены — серовароспецифические сегменты. Его нуклеотидная последовательность насчитывает около 1290 п.н. и определена учеными для всех видов хламидий.

Анализ нуклеотидных последовательностей для разработки схемы амплификации и подбора праймеров проводили по трем базам данных (GenBank, EMBL и DDBJ). Определение нуклеотидных последовательностей и положение консервативных (семейственно- и видоспецифических) участков, необходимых для подбора праймеров, проводили путем выравнивания нуклеотидных последовательностей гена ompl всех видов хламидий с помощью компьютерной программы Clustal Omega v. 1.1.0.

Подбор праймеров проводили с помощью компьютерной программы PerlPrimer v.l.1.21. При подборе праймеров следили за тем, чтобы их дизайн удовлетворял общим требованиям к праймерам, используемым в ПЦР (Ребриков Д.В. и др., 2009). Специфичность подобранных праймеров проверяли с помощью онлайн-сервисов FASTA и BLAST.

Разработанные праймеры синтезировали фосфоамитидным методом в НПК «Синтол» (г. Москва) на синтезаторе ASM-1000 (ООО «BioSet», Новосибирск, Россия). Все праймеры были обессолены и очищены методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) (Maxam A.M., Gilbert W., 1977).

Для создания ПЦР-тест-системы «Хлами-суис», рассчитанной на проведение 50 тестов, включая контрольные, необходимо было разработать реагенты для:

- «ДНК-сорб-хламиКС» вариант 50 — комплект реагентов для выделения ДНК из 50 проб клинического материла и культуры клеток, включая контроли;

- «ПЦР-комплект-хламиКС» вариант 50— комплект реагентов для ПЦР-амплификации 50 образцов ДНК Chlamydiaceae, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia suis, включая контроли;

- «ЭФ-хламиКС» вариант 200 — комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле. Рассчитан на 240 тестов.

Разработанный комплект «ДНК-сорб-хламиКС» вариант 50 состоял из следующих реагентов:__

Лизирующий раствор 1 флакон X 15,0 мл

Отмывочный раствор 1 флакон X 50,0 мл

Сорбент универсальный 2 флакона х 1,0 мл

ТЕ-буфер для элюции ДНК 2 флакона х 5,0 мл

ОКО (дополнительно) 1 пробирка X 1,2 мл

Проводили сравнение методов выделения ДНК из биологического материала с помощью коммерческих наборов реагентов Chelex 100 (Sigma, США) и ДНК-Сорб-В (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), разработанного нами набора реагентов для выделения ДНК сорбционным методом (по Boom R. et al., 1990), а также с помощью лизиса в буфере, содержащем неионные детергенты и протеиназу К (по Marmur J., 1961). В качестве биологического материала использовали инактивированные культуры хламидий, влагалищные смывы и конъюнктивальные соскобы. Результаты выделения ДНК оценивали спектрофотометрически (Maniatis T. et al., 1982).

В дальнейшем для исследования проб клинического материала (влагалищных смывов и конъюнктивальных соскобов) с помощью коммерческих ПЦР-тест-систем использовали ДНК, выделенную набором реагентов ДНК-сорб-В (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), а с помощью разработанной нами ПЦР-тест-системы «Хлами-суис»— ДНК, выделенную разработанным нами набором реагентов ДНК-сорб-ХламиКС (ФГБОУ ВПО БелГСХА имени В.Я. Горина).

Комплект «ПЦР-комплект-хламиКС» вариант 50 состоял из следующих эеагентов:

Смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ) по 2 мМ каждого 1 пробирка х 0,5 мл

10-кратный реакционный буфер для Taq-ДНК-полимеразы с 25 мМ MgCl2 4 пробирки х 0,5 мл

Тац-ДНК-полимераза 1 пробирка х 0,1 мл

Праймер 191 СНОМР 1 пробирка х 0,1 мл

Праймер СНОМР 336 1 пробирка х 0,2 мл

Праймер СНОМР 371 1 пробирка х 0,1 мл

Праймер 201 СНОМР 1 пробирка х 0,1 мл

Праймер SUIS 269 1 пробирка х 0,1 мл

Праймер 218 PSITT 1 пробирка х 0,1 мл

Праймер 204 PECOR 1 пробирка х 0,1 мл

Отрицательный контрольный образец К- 4 пробирки х 1,6 мл

Пробирки Эппендорф 0,5 мл 50 штук

Минеральное масло 1 пробирка х 5,0 мл

Реакцию амплификации проводили в объеме 50 мкл. Реакционная смесь имела следующий состав: 1 мкл прямого праймера и 1 мкл обратного (15-30 пмоль/мкл), 1 мкл дНТФ (по 2 мМ каждого), 0,2 мкл Taq-пoлимepaзы (5 ед./мкл), 41,8 мкл сИ Н20 (36,8 мкл в случае смывов) и 5 мкл реакционного буфера (10х). Состав реакционного буфера: 67 мМ Трис-НС1 (рН 8,3), 17 мМ 0ч1Н4)28О4, 25 мМ \lgCl2, 0,01% Твин-20, 0,12мг/мл бычьего сывороточного альбумина.

Сверху на реакционную смесь в пробирке наносили каплю минерального масла, чтобы избежать испарения. Непосредственно перед амплификацией в каждую пробирку под минеральное масло вносили по 5 мкл ДНК, выделенной из соскобов или культуры клеток, либо по 10 мкл ДНК, выделенной из смывов.

Собственно реакцию проводили в термоциклере (амплификаторе) iCycler iQ5 (Bio-Rad, США) с применением функции активного точного регулирования температуры.

Разработка режимов амплификации для проведения семейственно- и видоспецифической детекции хламидий включала установление оптимальных температур денатурации, отжига и элонгации, а также определение количества циклов амплификации. Определение оптимальных температур и количества циклов амплификации проводили отдельно для каждой пары праймеров.

Для семейственноспецифической амплификации использовали следующие режимы: 1 цикл начальной денатурации ДНК (95°С, 5 мин.); Ci циклов денатурации ДНК (95°С, 30 с), отжига праймеров (Ti°C, 30 с) и достройки праймеров (72°С, 30 с). Видоспецифическая амплификация включала: 1 цикл начальной денатурации ДНК (95°С, 30 с); С2 циклов денатурации ДНК (95°С, 30 с), отжига праймеров (Т2°С, 30 с) и достройки праймеров (72°С, 30 с). Оптимальные температуру отжига праймеров (Т\°С и Т2°С), а также количество циклов амплификации (Ci и С2) подбирали в ходе работы.

Оптимальный температурный диапазон отжига рассчитывали отдельно для каждой пары праймеров. В виду того, что праймеры содержали дегенерированные нуклеотиды, то расчет температур производили для тугоплавких и легкоплавких вариантов праймеров. Для расчетов использовали простой метод расчета температуры плавления (Wallace et al., 1979; Sambrook etal., 2001) с помощью онлайн калькулятора свойств олигонуклеотидов Oligo Calc. Затем точную оптимальную температуру отжига подбирали для каждой пары праймеров эмпирическим путем в ПЦР-лаборатории НПК «Синтол» (г. Москва).

Необходимое количество циклов амплификации подбирали при помощи добавления интеркалирующего красителя EvaGreen во все пробы и последующей детекции в режиме реального времени накопления продуктов амплификации.

Специфичность разработанной ПЦР-тест-системы проверяли путем амплифицирования каждой парой видоспецифических праймеров ДНК четырех патогенных для свиней видов хламидий.

Подбирали оптимальную концентрацию праймеров в реакционной смеси, варьируя их содержание 10, 20 и 30 пмоль/мкл. В качестве матрицы для семейственноспецифической амплификации использовали ДНК, выделенную из инактивированной культуры Ср. psittaci с титром хламидий 108 IFU/мл (inclusion-forming units— единиц, формирующих хламидийное включение). Делали последовательные разведения в титрах от 104 до 10"2 IFU/мл, выделяли ДНК и амплифицировали согласно оптимизированным режимам амплификации. Для видоспецифической амплификации в качестве матрицы использовали продукты амплификации, полученные в первом раунде амплификации в разведениях от 101 до 10"2 IFU/мл. Далее амплифицировали согласно разработанным режимам амплификации.

В качестве модификации ПЦР проводили амплификацию с использованием «горячего старта». Для этого парафиновой прослойкой разделяли реакционную смесь на два неактивных слоя. На дно пробирки для амплификации вносили реакционную смесь без Taq-пoлимepaзы. На смесь наслаивали 10-15 мкл расплавленного парафина так, чтобы он образовывал пробку. Поверх парафиновой пробки наносили раствор Тац-полимеразы и каплю минерального масла. Перед постановкой амплификации пробы выделенной ДНК вносили под слой минерального масла, стараясь не повредить парафиновую пробку.

Подготовленные пробирки с реакционной смесью ставили в амплификатор прогретый до 80°С. Для удобства проведения амплификации использовали функцию «паузы» на амплификаторе. В дальнейшем реакцию проводили согласно разработанным режимам амплификации.

Комплект «ЭФ-хламиКС» вариант 200 разрабатывали для электрофоретического анализа 240 образцов (из расчета 100 мл геля— 5 рядов по 24 лунки). Он состоял из следующих реагентов:_

Трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с бромидом этидия 1 флакона х 50,0 мл

Агароза для электрофореза ДНК 2 флакона х 1,7 г

Детекцию результатов амплификации проводили методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле. Результаты электрофореза визуализировали облучением геля ультрафиолетовым светом на трансиллюминаторе MacroVue UV-20 (Hoefer, США) и фотографировали при помощи компьютерной видеосистемы Gel Logic 100 Imaging System (Kodak, Германия).

Исследования сравнительной чувствительности и специфичности тест-систем проводили на клиническом материале,, отобранном от свиноматок, принадлежащих ООО «Белгранкорм» производства «Томаровская свинина» (п=45) и «Шебекинская свинина» (п=135). В исследование были включены свиноматки с клиническими признаками хламидиоза: длительными перегулами (несколько месяцев), абортами, эндометритами, рождением мертвых или нежизнеспособных поросят. От этих животных отбирали влагалищные смывы и конъюнктивальные соскобы, а затем совмещали полученные образцы. От свиноматок в «Томаровской свинине» дополнительно отбирали сыворотку крови для серологических исследований.

Сравнивали результаты, полученные с помощью коммерчески доступных ПЦР-тест-систем («Хла-ком» и «Хла-псит» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и разработанной нами ПЦР-тест-системой «Хлами-суис», с целью изучения их сравнительной чувствительности и специфичности.

Серологические исследования проводили с использованием ИФА-тест-систем (ИФА — иммуноферментный анализ) для трех классов иммуноглобулинов: A, G и М. (Chlamydia trachomatis- IgM- ИФА - БЕСТ Chlamydia trachomatis- IgG- ИФА- БЕСТ, Chlamydia trachomatis- IgA-ИФА — БЕСТ, Chlamydophila pneumoniae и Chlamydophila psittaci- IgM-

ИФА - БЕСТ, Chlamydophila pneumoniae и Chlamydophila psittaci - IgG - ИФА -БЕСТ производства ЗАО «Вектор-Бест»; ИФА-Хламидия-IgM, ИФА-Хламидия-IgG, ИФЛ-Хламидия-IgA производства ЗАО «Эколаб»),

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Распространенность хламидийных инфекций в свиноводческих хозяйствах Белгородской области

Проведенными ретроспективными эпизоотологическими исследованиями в свиноводческих хозяйствах Белгородской области с использованием молекулярно-генетических тестов было установлено их неблагополучие по хламидийным инфекциям. В период с 2008 по 2012 гг. было исследовано 197 проб клинического и патологического материала^ от свиноматок с клиническими признаками хламидийных инфекций, из которых 122 (61,93%) оказались положительными. В год выявляли от 57,14% до 66,67% больных хламидийными инфекциями свиней от общего количества подозреваемых в заражении. Динамика выявления хламидий у свиноматок выражалась выявлением последовательности ДНК хламидий у 66-83% абортировавших свиноматок. Постоянное неблагополучие в свинокомплексах, скорее всего, было связано с неполным выявлением существующими ПЦР-тест-системами всех инфицированных различными видами хламидий животных, которые являются постоянно присутствующими источниками возбудителя инфекции, обеспечивающими непрерывность эпизоотической цепи.

В ООО «Белгранкорм» свинокомплекс «Шебекинская свинина» при обследовании 5893 свиноматок, проведенном 1 апреля 2011 года, были выявлены клинические признаки хламидийных инфекций у 1431 (24,8%) свиноматки, а при обследовании 6025 свиноматок из свинокомплекса «Томаровская свинина», проведенном 24 ноября 2012 года, — у 1211 (20,1%).

Схема ПЦР-амплификации фрагментов гена ompl, обеспечивающих возможность обнаружения всех видов хламидий патогенных для свиней и дифференцирования их между собой

Была разработана схема ПЦР-амплификации гена ompl, которая проводится гнездовым методом и включает два раунда амплификации, поскольку гнездовая амплификация в сравнении с обычной обладает большей чувствительностью и специфичностью. Данная схема включала амплификацию семейственноспецифического фрагмента гена ompl в первом раунде и амплификацию видоспецифических фрагментов этого гена во втором раунде.

Были определены нуклеотидные последовательности и положение консервативных участков гена ompl путем выравнивания гена ompl всех видов хламидий с помощью компьютерной программы Clustal Omega v.l.1.0. На основании полученных данных было установлено следующее. Вариабельные домены с координатами аминокислотных остатков VD I (64-83), VD II (139-

160), УОШ (224-337), УОIV (288-317) отличаются длиной и последовательностью пар нуклеотидов. Вариабельные домены УО I и УО II содержат серовароспецифические сегменты. Консервативные области, расположенные выше УО I и между УО I и УО И, отличаются высокой гомологией среди разных видов хламидий, что затрудняет в них поиск видоспецифических олигонуклеотидных последовательностей. Остальные консервативные области характеризуются умеренной гомологией, что дает возможность подобрать к ним видоспецифические праймеры. В соответствии с этим поиск семейственноспецифических праймеров осуществляли в консервативных областях, расположенных между УО II и УО III, а также ниже УО IV, а видоспецифических — между VD II и УО III, УО III и УО IV, а также ниже УО IV.

Подбор праймеров для ПЦР-амплификации семейственно-и видоспецифических фрагментов гена отр1

В результате анализа нуклеотидных последовательностей по базам данных (ООВ1/ЕМВЬ/ОепВапк) с помощью программы Рег1Рпшег V. 1.1.21 были подобраны праймеры специфичные участкам гена отр1, согласно разработанной схеме гнездовой ПЦР-амплификации (таблица 1).

Таблица 1.

Последовательности праймеров для использования в идентификации хламидий _с помощью гнездовой полимеразной цепной реакции_

Таксон Праймер Последовательность*

Chlamydiaceae 191 CHOMP 5'-GCI YTI TGG GAR TGY GGITGY GCI AC-3'

Chlamydiaceae CHOMP371 5-TTA GAA ICK GAA TTG 1GC RTT IAY GTG IGC IGC-3'

Chlamydiaceae 201 CHOMP 5'-GGI GCW GMI TTC CAA TAY GCI CAR TC-3'

Chlamydiaceae CHOMP336 5'-CCR CAA GMT TTT CTR GAY TTC AW Y TTG TTR AT-3'

Chlamydia suis SUIS269 5-ACC ATT TAA CTC CAA TGT ARG GAG TG-3'

Chlamydophila psittaci 218PSITT 5'-GTA ATT TCI AGC CCA GCA CAA TTYGTG-3'

Chlamydophila pecorum 2Q4PECOR 5'-CCA ATA YGC АСА АТС KAA ACC TCG G-3'

'Дегенерированные нуклеотиды: К=С,Т; М=А,С; 11=А,0; \¥=А,Т; У=С,Т; 1=инозин.

Структура праймеров удовлетворяла общепринятым правилам: отсутствие самокомплементарности 3'-концов каждого олиГонуклеотида, отсутствие комплементарное™ З'-концов прямых и обратных праймеров, отсутствие вторичных структур, отсутствие тугоплавких повторов (более трех вС) на 3'-конце каждого праймера, отсутствие многократных АТ (или вС)-повторов внутри каждого праймера. Следовательно, ПЦР тест-система, разработанная на основе этих праймеров должна обладать высокой чувствительностью.

С помощью специализированных онлайн-сервисов FASTA и BLAST была установлена высокая гомология выбранных праймеров с геном ompl и не обнаружено их значимой гомологии с генами других бактерий, вирусов или эукариот. Таким образом, разработанные праймеры должны обладать высокой специфичностью.

Обобщенно процесс амплификации представлен на рисунке 1.

LP VD I VD II VD III VD IV —я штт mm ні і—

I раунд Семейственно-специфическая диагностика II раунд Видо- специфическая диагностика 191 СНОМР 1 > І576-597 п.н. І < 1 СНОМР 371 201 СНОМР 1 > і 250 п.н. 1 < 1 SUIS 269 204 PECOR 1 > ¡426-441 п.н.I < ІСНОМР336 218 PSITT О І389-404 п.н.| CD СНОМР 336

Рис. 1 - Схематичная структура гена хламидий ошрі

и схема выявления хламидий методом ПЦР с использованием специфических участков этого гена

При этом в первом раунде использовали семейственноспецифические праймеры, расположенные в консервативных областях между VDII/VD III (191 CHOMP) и ниже VD IV (СНОМР 371), которые ограничивали фрагмент гена длиной 576-597 пар нуклеотидов (п.н.). Во втором раунде использовали пары праймеров, примыкающие к VD III (201 СНОМР и SUIS 269) или VD III (СНОМР 336) и VD IV (204 PECOR, 218 PSITT). Пары праймеров специфичные для Ср. pecorum (СНОМР 336 и 204 PECOR), Ср. psittaci (СНОМР 336 и 218 PSITT) и С. suis (201 СНОМР и SUIS 269) образовывали ампликоны длиной 426^41 п.н., 389-404 п.н. и 250 п.н., соответственно. Разница в длине семейственно- и видоспецифических ампликонов гена ompl хламидий позволяла достоверно детектировать их электрофорезом в 1,5% агарозном геле.

Разработка и комплектование гнездовой ПЦР-тест-системы для детекции и идентификации всех видов хламидий патогенных для свиней в образцах клинического материала с использованием электрофоретического анализа продуктов амплификации

Сравнение эффективности выделения ДНК разными способами показало их одинаковую эффективность.

Оптимизация режимов амплификации включала подбор оптимальной температуры отжига праймеров и их количества в реакционной смеси.

Варьирование этих двух параметров оказалось достаточным для получения стабильных результатов. Было установлено, что оптимальная температура отжига для внешней пары праймеров составляет 51-57°С, а для внутренних — 46-56°С. Для семейственноспецифической амплификации была эмпирически подобрана температура отжига в 55°С, а видоспецифической— 50°С. Количество циклов амплификации в обоих случаях— 35, поскольку использование большего количества циклов амплификации способствовало бы увеличению чувствительности, но в тоже время вложенный анализ стал бы более уязвимым к загрязнению переноса. Было установлено, что оптимальной концентрацией праймеров является концентрация в 20 пмоль/мкл каждого праймера, что обеспечивает успешную амплификацию выбранных ДНК-мишеней и не приводит ни к конкуренции ДНК-матриц за праймеры, ни к наработке неспецифического продукта.

Было установлено, что по сравнению с обычной ПЦР применение методики «горячего старта» позволяет увеличить накопление целевых ампликонов и снизить образование неспецифических продуктов амплификации.

Используемая пара праймеров 201 СНОМР и SUIS 269 амплифицировала целевую последовательность ДНК С. suis, пара праймеров 218 PSITT и СНОМР 336 амплифицировала участок ДНК специфичный только Ср. psittaci, пара праймеров 204 PECOR и СНОМР 336 амплифицировала участок ДНК специфичный только для Ср. pecorum. Высокая специфичность разработанной ПЦР-тест-системы подтверждена отсутствием неспецифической амплификации.

Чувствительность ПЦР позволяла детектировать специфическую ДНК в ПЦР-пробе при титре 104-107 IFU/мл в первом раунде амплификации и при разведении Ю'-Ю7 IFU/мл во втором раунде.

Помимо оптимальных условий ПЦР высокие чувствительность и специфичность разработанной нами тест-системы обеспечивались наличием набора контрольных образцов, которые позволяли контролировать достоверность анализа, исключать некорректные (ложноположительные и ложноотрицательные) результаты и своевременно предпринимать меры по улучшению условий анализа. В набор входили ОКО, К- и ПКО. При помощи отрицательных контрольных образцов ОКО и К- контролировали отсутствие ложноположительных результатов в результате контаминации на этапах выделения ДНК и амплификации, соответственно. Положительный контрольный образец ПКО служил для оценки работы амплификационных реактивов и термоциклера, его амплификат являлся маркером длины специфического ПЦР-продукта при проведении электрофореза, в агарозном геле. Ложноотрицательные результаты могли быть вызваны недостаточной очисткой ДНК от ингибиторов, потерями ДНК при выделении из исследуемого материала или другими ошибками исследователя при постановке анализа.

Сравнение чувствительности и специфичности разработанной ПЦР-тест-системы с коммерчески доступными ПЦР- и ИФА-тест-системами

При проведении полевых испытаний разработанной нами ПЦР-тест-системы «Хлами-суис» в условиях ООО «Белгранкорм» производство «Шебекинская свинина» было выявлено наличие генетического материала Chlamydiaceae в 48% проб клинического материала в первом раунде (семейственноспецифическая амплификация) гнездовой ПЦР. Во втором раунде (видоспецифическая амплификация) обнаружена ДНК Ср. psittaci в 13% проб, Ср. abortus — в 5%, Ср. pecorum — в 12%, С. suis — в 18%. Коммерческая семейственноспецифическая тест-система «Хла-ком» выявила ДНК хламидий в 36% проб, что в сравнении с «Хлами-суис», на 12% меньше. При детектировании Ср. psittaci было установлено наличие ДНК данного возбудителя в 13% проб клинического материала с использованием ПЦР-тест-систем «Хлами-суис», что на 7% больше сравнении с «Хла-псит», выявившей Ср. psittaci в 6% проб.

Аналогичные исследования проводили в условиях свинокомплекса ООО «Белгранкорм»— «Томаровская свинина». При этом с помощью ПЦР-тест-системы «Хлами-суис» был выявлен генетический материал Chlamydiaceae в 46% пробах клинического материала в первом раунде гнездовой ПЦР. Во втором раунде было выявлено ДНК Ср. psittaci в 11% проб, Ср. abortus — в 6%, Ср. pecorum— в 13%, С. suis— в 16%. «Хла-ком» позволила вывить ДНК хламидий в 36% проб, что на 10% меньше, чем выявила «Хлами-суис». С помощью ПЦР-тест-системы «Хла-псит», также как и с помощью «Хлами-суис», детектировали наличие ДНК Ср. psittaci в 11% случаев.

Серологическими исследованиями (ИФА) сывороток крови, полученных от свиноматок из «Томаровской свинины», обнаружили антитела к С. suis в 11% случаев, а молекулярно-генетическими (ПЦР) выявили генетический материал С. suis в 16% случаев, то есть молекулярно-генетическими методами нами было выявлено на 5% инфицированных животных больше, чем серологическими. ИФА обнаружили антитела к Ср. psittaci в 7% случаев, а с помощью ПЦР выявили ДНК Chlamydophila psittaci в 11% случаях, что на 5% больше. ПЦР-тест-система «АмплиСенс Chlamydia trachomatis-FL», предназначенная для диагностики инфекций вызываемых Chlamydia trachomatis, не обнаружила в пробах ДНК Chlamydia suis, в то время как ИФА-тест-системы не позволяли дифференцировать антитела к С. suis и С. trachomatis. Проведенные исследования свидетельствуют о более высокой чувствительности и специфичности по выявлению инфицированных хламидийными инфекциями животных прямым методом детекции ДНК возбудителей с помощью ПЦР-тест-систем в сравнении с индикацией специфических антител, вырабатываемых на присутствие в макроорганизме антигенов, с использованием ИФА-тест-систем.

выводы

1. Методом ПЦР установлено наличие хламидийных инфекций в свиноводческих хозяйствах Белгородской области. В период с 2008 по 2012 гг. выявляли ДНК хламидий в 57,14-66,67% пробах клинического материала, полученных от подозреваемых в заражении свиноматок. При этом чаще всего подтверждали подозрение на хламидийные инфекции у свиноматок с нарушениями репродуктивной функции — в 66-83% случаев.

2. Разработанная схема гнездовой ПЦР с двумя раундами амплификации позволяет в первом раунде амплифицировать фрагмент гена ompl общий для всех представителей Chlamydiaceae, а во втором раунде— фрагменты гена ompl, специфичные для каждого вида хламидий, персистирующих у свиней.

3. Разработанные семейственно- (191СНОМР и СНОМР371) и видоспецифические (201 СНОМР, СНОМР 336, 2Û4PECOR, 218 PSITT, SUIS 269) праймеры позволяют проводить амплификацию участков гена ompl согласно предложенной схемы.

4. Разработанные и оптимизированные режимы амплификации позволили создать ПЦР-тест-систему «Хлами-суис» высокочувствительной и в тоже время избежать появления ложноположительных результатов. При использовании внешней пары праймеров оптимальная температура отжига составляет 55°С, а внутренних пар праймеров— 50°С. Оптимальное количество циклов амплификации в обоих случаях равняется 35. Определена оптимальная концентрация праймеров для семейственно- и видо-специфического раундов амплификации ДНК хламидий, которая составляет в обоих раундах 20 пмоль/мкл.

5. Разработанная ПЦР-тест-система «Хлами-суис» обладает высокой чувствительностью и специфичностью, превосходящей коммерческие аналоги. Апробация разработанной ПЦР-тест-системы в условиях ООО «Белгранкорм» производство «Шебекинская свинина» позволила выявить на 12% больше инфицированных хламидиями свиноматок по сравнению с «Хла-ком» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и на 7% больше животных, инфицированных Ср. psittaci, в сравнении с «Хла-псит» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Аналогичное исследование, проведенное в другом свинокомплексе ООО «Белгранкорм»— «Томаровская свинина», позволило выявить на 10% больше инфицированных хламидиями свиноматок по сравнению с «Хла-ком». ПЦР-тест-системы «Хлами-суис» и «Хла-псит» выявили по 11% проб с нуклеотидными последовательностями специфичными Ср. psittaci. Серологическими исследованиями обнаружили антитела к Ср. psittaci в 7% проб, что на 5% меньше, чем молекулярно-генетическими.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В связи с широкой распространенностью хламидийных инфекций проводить в свиноводческих хозяйствах мониторинговые эпизоотологические исследования данного заболевания с использованием метода ПЦР.

2. Для проведения мониторинговых эпизоотологических исследований по выявлению свиней инфицированных возбудителями хламидийных инфекций использовать гнездовую ПЦР-тест-систему «Хлами-суис» (ФГБОУ ВПО «БелГСХА имени В.Я. Горина), которая позволяет проводить детекцию и идентификацию всех видов хламидий патогенных для свиней.

3. Разрабатывать профилактические и оздоровительные мероприятия в свиноводческих хозяйствах с учетом выявленных видов хламидий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. МигноА.М., СапегинВ.М. Способ дифференциальной диагностики хламидиозов свиней с помощью ПЦР / A.M. Мигно, В.М. Сапегин // Модернизация аграрного производства: наука и практика (материалы Международной студенческой научно-практической конференции, 17-18 марта 2010 г.). — Курск: Изд-во Курск, гос. с.-х. ак., 2010.

2. Коваленко A.M., Сапегин В.М., Жабина В.Ю. Эпизоотологические исследования в отношении хламидийных инфекций свиней в репродуктивных хозяйствах Белгородской области / A.M. Коваленко, В.М. Сапегин, В.Ю. Жабина// Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвященной 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиологии и отдела охраны полезной энтомофауны (г. Москва, 26-27 апреля 2011 г.). — М.: ООО «Агентство творческих технологий», 2011, —С. 206-208.

3. Сапегин В.М., Жабина В.Ю., Левицкая И.Л. Разработка ПЦР тест-системы для детекции возбудителей хламидиозов свиней / В.М. Сапегин,

B.Ю. Жабина, И.Л. Левицкая // Модернизация АПК в контексте обеспечения продовольственной безопасности государства (материалы Международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, г. Курск, 8-10 декабря 2010 г.).— Курск: Изд-во Курск, гос. с.-х. ак., 2011.—

C. 179-183.

4. СапегинВ.М., Коваленко A.M., Паюхина М.А., Татарников К.В. Исследования эпизоотической ситуации по хламидийным инфекциям свиней в репродуктивных хозяйствах / В.М. Сапегин, A.M. Коваленко, М.А. Паюхина, К.В. Татарников // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. — 2012. — №4. — С. 64-66.

5. Сапегин В.М., Коваленко A.M. Выявление возбудителей хламидиозов свиней методом полимеразной цепной реакции: Методические рекомендации // В.М. Сапегин, A.M. Коваленко. — Белгород: Изд. БелГСХА,

2012.— 43 с. (гриф Учебно-методического объединения высших учебных заведений Российской Федерации по образованию в области зоотехнии и ветеринарии от 04 апреля 2012 г. № 63-51).

6. Сапегин В.М., Коваленко A.M. Сравнение чувствительности и специфичности разработанной ПЦР-тест-системы с коммерчески доступными аналогами / В.М. Сапегин, A.M. Коваленко // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии.— 2013.— №7.—

7. Коваленко A.M., Сапегин В.М. Исследование проб клинического материала от свинопоголовья с использование ПЦР-тест-системы / A.M. Коваленко, В.М. Сапегин // «Проблемы и перспективы инновационного развития животноводства» Материалы международной научно-производственной конференции. Белгород, 15-16 мая 2013 г.— п. Майский: Изд-во БелГСХА им. В.Я. Горина, 2013. — С. 55.

8. Сапегин В.М., Коваленко A.M. Сравнительные исследования ИФА и ПЦР тест-систем для выявления инфицированных животных/ В.М. Сапегин,

A.M. Коваленко // «Проблемы и перспективы инновационного развития животноводства» Материалы международной научно-производственной конференции. Белгород, 15-16 мая 2013 г. — п. Майский: Изд-во БелГСХА им.

B.Я. Горина, 2013. — С. 67.

С. 73-74.

Формат 60x84 1/16. Бумага для множительных аппаратов.

Печать на копировальном аппарате КГСХА. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 205.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Сапегин, Виктор Михайлович, Белгород

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ

АКАДЕМИЯ имени В.Я. Горина»

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ СВИНЕЙ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

На правах рукописи

04201453864

САПЕГИН ВИКТОР МИХАЙЛОВИЧ

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор

Коваленко А.М.

Белгород-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................13

1.1. Общая характеристика хламидий....................................................................13

1.1.1. Систематика хламидий............................................................................13

1.1.2. Патогешость возбудителей хламидиозов свилей...................................19

1.1.3. Распространенность хламидиозов свиней...............................................24

1.2. Диагностическая ценность лабораторных методов выявления и типирования возбудителей хламидиозов свиней........................................................................26

1.2.1. Немолекулярные методы...........................................................................27

1.2.2. Молекулярно-генетические методы.........................................................37

1.3. Общие правила подбора праймеров................................................................39

1.3.1. Выбор гена-мишени....................................................................................40

1.3.2. Дизайн праймеров.......................................................................................42

1.3.3. Вырожденные праймеры...........................................................................46

1.4. Факторы, воздействующие на амплификацию...............................................47

1.4.1. Температура и время денатурации..........................................................47

1.4.2. Температура и время элонгации...............................................................48

1.4.3. Реакционная смесь.....................................................................................48

1.4.4. Ингибирование ПЦР...................................................................................49

1.4.5. Количество циклов амплификации............................................................50

1.4.6. «Горячий старт» ПЦР..............................................................................51

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................................................53

2.1. Эпизоотологическое обследование.................................................................53

2.2. Подбор методов выделения ДНК хламидий из клинического и патологического материала, а также из культур...................................................54

2.2.1. Методы выделения ДНК............................................................................54

2.2.2. Сравнение эффективности выделения ДНК разными методами..........58

2.2.3. Определение концентрации ДНК..............................................................58

2.3. Методика проведения электрофореза в агарозном геле................................59

2.4. Разработка праймеров и схемы амплификации..............................................60

2.5. Методика проведения амплификации.............................................................61

2.5.1. Состав реакционной смеси........................................................................61

2.5.2. Режимы амплификации.............................................................................62

2.5.3. Контроли ПЦР...........................................................................................64

2.5.4. «Горячий старт».......................................................................................64

2.6. Схема опыта по изучению чувствительности и специфичности ПЦР-тест-систем..............................................................................................................65

2.7. Схема опыта по выявлению инфицированных животных с использованием ИФА-тест-систем и разработанной ПЦР-тест-системы........................................66

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..................................69

3.1. Распространенность хламидиозов свиней в Белгородской области..............69

3.2. Сравнение эффективности методов выделения ДНК....................................73

3.3. Разработка схемы ПЦР-амплификации..........................................................73

3.4. Разработка праймеров......................................................................................74

3.5. Оптимизация условий амплификации............................................................77

3.5.1. Разработка режимов амплификации.......................................................77

3.5.2. Подбор оптимальной концентрации праймеров......................................82

3.5.3. «Горячий старт».......................................................................................85

3.6. Изучение чувствительности и специфичности разработанной ПЦР-тест-системы............................................................................................................87

3.7. Сравнение чувствительности и специфичности разработанной ПЦР-тест-системы с коммерчески доступными аналогами..........................................90

3.8. Изучение возможностей ИФА- и ПЦР-тест-систем по выявлению животных, инфицированных возбудителями хламидийных инфекций.............100

ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................................104

ВЫВОДЫ.................................................................................................................109

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.................................................................111

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................112

ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................................................142

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ American Type Culture Collection (Американская коллекция типовых культур)

база данных нуклеотидных последовательностей Национального института здоровья США (National Institutes of Health, NIH)

European Molecular Biology Laboratory — Европейская молекулярно-биологическая лаборатория (база данных нуклеотидных последовательностей Европейского института биоинформатики (European Bioinformatics Institute, или EBI))

DNA Data Bank of Japan (база данных нуклеотидных последовательностей Национального института генетики Японии)

inclusion forming unit (единица, формирующая хламидийное включение)

main outer membrane protein (главный белок наружной мембраны)

дезоксирибонуклеиновая кислота иммуноферментный анализ куриные эмбрионы липополисахарид микроиммунофлуоресценция пара нуклеотидов прямая иммунофлюоресценция полимеразная цепная реакция реакция иммунофлуоресценции рибосомальная РНК реакция связывания комплемента ретикулярное тельце

ТБЕ-буфер — трис-борат-ЭДТА-буфер

ТЕ-буфер — трис-ЭДТА-буфер

Трис-НС1 — трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭТ — элементарное тельце

ЭФ — электрофорез

дАТФ — дезоксиаденинтрифосфат

ДГТФ — дезоксигуанидинтрифосфат

дНТФ — дезоксинуклеотидтрифосфат

ДТТФ — дезокситиминтрифосфат

дЦТФ — дезоксицитозинтрифосфат

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Микроорганизмы из семейства Chlamydiaceae являются облигатными внутриклеточными бактериями, которые вызывают ряд заболеваний людей и животных, известных под общими названиями «хламидийные инфекции» или «хламидиозы». Возбудителями хламидийных инфекций свиней считаются четыре вида хламидий: Chlamydophila (Ср.) psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia (С.) suis.

Хламидийные инфекции являются одной из наиболее актуальных проблем современного промышленного животноводства, в том числе и свиноводства [32]. Методам диагностики, профилактики и борьбы с хламидийными инфекциями свиней уделяется много внимания [16], но, несмотря на это, они остаются широко распространенными и наносят значительный экономический ущерб [18]. Ущерб складывается главным образом из недополучения приплода в результате абортов у свиноматок во второй половине супоросности, мертворождения или рождения нежизнеспособного приплода, снижения привесов у молодняка и преждевременной выбраковки животных [8]. Из-за невозможности раннего диагностирования хламидийных инфекций и, как следствие, отсутствия своевременного проведения специфических профилактических и оздоровительных мероприятий, трудно найти свиноводческое хозяйство, где не было бы данных заболеваний [30; 40; 46]. Особенностью хламидийных инфекций, значительно усложняющей эпизоотический надзор за ними, является часто хроническое, со стертой клинической картиной, или латентное их течение [19]. Следовательно, в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по профилактике и борьбе с данными заболеваниями большое значение имеет раннее и достоверное обнаружение их возбудителей при разных формах развития инфекционного процесса.

Каждый из возбудителей хламидийных инфекций свиней характеризуется своим спектром вызываемых заболеваний. Чаще всего С. suis вызывает энтерит и конъюнктивит. Ср. abortus обычно связывают с абортами и рождением слабого или нежизнеспособного потомства у свиноматок, а также полиартритами, которые

чаще диагностируют у откормочных поросят. Ср. psittaci, как правило, обнаруживают в легких свиней больных пневмонией, редко — в маточной слизи абортировавших свиноматок. Установлена взаимосвязь Ср. pecorum со многими заболеваниями: энцефаломиелитом, пневмонией, артритом, конъюнктивитом, энтеритом, заболеваниями мочевых путей, метритом, нарушениями плодовитости и др. Кроме того, они имеют разный зоонозный потенциал, в частности Ср. pecorum может передаваться от свиней людям, а другие виды — нет. По этой причине в диагностике хламидийных инфекций большое значение приобретает идентификация вида(ов) хламидий, персистирующих у свиней, и разработка мероприятий по борьбе с данными заболеваниями в хозяйстве.

Эффективность работы свиноводческих предприятий во многом зависит от их эпизоотического благополучия. Только здоровые животные могут обеспечивать наибольшую продуктивность. Следовательно, одним из основных факторов успешного функционирования и развития свиноводческих предприятий является разработка мер профилактики и борьбы с инфекционными заболеваниями. Особую актуальность это приобрело благодаря реализации региональной программы «Развитие свиноводства в Белгородской области на 2005-2010 гг.» [6]. В рамках этой программы происходило активное строительство и функционирование крупных свинокомплексов (155 в 2010 году), развитие всей необходимой инфраструктуры и увеличение свинопоголовья (с 534,6 тыс. в 2005 до 2,2 млн. в 2010 и до более 3,5 млн. в 2013 году) [10; 25; 42].

В связи с этим существует необходимость в методе лабораторной диагностики, позволяющем выявлять и дифференцировать виды возбудителей хламидийных инфекций свиней. С этой целью был разработан целый ряд лабораторных методов прямого и косвенного выявления хламидий [31]. Из них в ветеринарной практике нашли применение следующие методы: микроскопия, культуральный, серологический и молекулярно-генетический. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Сейчас наиболее перспективным методом прямой диагностики хламидийных инфекций считается молекулярно-

генетический метод, а именно его наиболее популярная разновидность — полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Метод ПЦР выгодно отличается от других методов высокой специфичностью, позволяя идентифицировать возбудителя с точностью до вида и даже сероварианта, и высокой чувствительностью, позволяя обнаружить ничтожно малые количества возбудителей хламидийных инфекций (1-10 клеток) в образцах клинического материала. Кроме того, характеризуется простотой и удобством проведения анализа и дает возможность поставить диагноз в короткие сроки (4-6 часов). Немаловажным фактором является умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость проведения анализа.

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время известны ПЦР-тест-системы для семейственноспецифической детекции возбудителей хламидийных инфекций, а также для детекции и идентификации одного-двух видов хламидий. ПЦР-тест-системы для детекции и идентификации всех видов хламидий, патогенных для свиней, не разработаны. Данный факт послужил основанием для разработки ПЦР-тест-системы для детекции всех патогенных для свиней хламидий (Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus, Chlamydia suis) и дифференциации их между собой.

Цель и задачи. Цель данной работы — изучить распространенность хламидийных инфекций свиней в репродуктивных свиноводческих хозяйствах Белгородской области и усовершенствовать лабораторную диагностику хламидийных инфекций свиней с использованием полимеразной цепной реакции.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить распространенность хламидийных инфекций в свиноводческих хозяйствах Белгородской области.

2. Разработать схему ПЦР-амплификации фрагментов гена ompl, обеспечивающих возможность детекции и идентификации всех видов хламидий патогенных для свиней.

3. Сконструировать праймеры для ПЦР-амплификации семейственно- и видоспецифических фрагментов гена omp 1 согласно разработанной схеме.

4. Разработать гнездовую ПЦР-тест-систему для детекции и идентификации всех видов хламидий патогенных для свиней в образцах клинического материала с использованием электрофоретического анализа продуктов амплификации.

5. Оценить чувствительность и специфичность разработанной ПЦР-тест-системы при тестировании клинических образцов, отобранных от свиноматок из неблагополучных по хламидийным инфекциям хозяйств, в сравнении с коммерчески доступными ПЦР- и ИФА-тест-системами.

Научная новизна. Изучена распространенность хламидийных инфекций в репродуктивных свиноводческих хозяйствах Белгородской области.

Разработан новый способ видовой дифференциальной диагностики хламидийных инфекций свиней, вызываемых Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia suis (заявка на изобретение RU 2012125109/10 A, C12Q1/68, 15.06.2012). Диагностика осуществляется путем применения двухступенчатой (гнездовой) полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров, комплементарных участкам гена отр-1.

На основе этого способа разработана и укомплектована высокочувствительная и высокоспецифичная ПЦР-тест-система «Хлами-суис» с детекцией в агарозном геле (ФГБОУ ВПО БелГСХА имени В.Я. Горина) (свидетельство №2013034 о регистрации в качестве ноу-хау результата интеллектуальной деятельности; зарегистрировано в Депозитарии «ноу-хау» БелГУ «30» апреля 2013 г.). Подтверждена ее высокая чувствительность и специфичность по сравнению с коммерчески доступными ПЦР- и ИФА-тест-системами.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в разработке нового способа диагностики хламидийных инфекций свиней и создании на основе этого способа высокочувствительной и высокоспецифичной ПЦР-тест-системы «Хлами-суис»

для выявления ДНК Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia suis.

Разработанная ПЦР-тест-система «Хлами-суис» имеет большую практическую значимость, потому что она позволяет усовершенствовать схему мониторинга хламидийных инфекций на свиноводческих предприятиях. Данная тест-система дает возможность диагностировать хламидийные инфекции на всех стадиях развития инфекционного процесса, в том числе на ранних, а также выявлять животных с хроническим и латентным течением, что необходимо для проведения своевременных мер борьбы и профилактики хламидийных инфекций в хозяйстве. Идентификация хламидий до вида необходима для назначения специфических профилактических мероприятий. Таким образом, своевременная видовая диагностика хламидийных инфекций свиней и соответствующие специфические профилактические и оздоровительные мероприятия позволят уменьшить экономический ущерб, который складывается из недополучения приплода, снижения привесов молодняка, преждевременной выбраковки и т.п.

На основе полученных результатов исследований разработаны и утверждены следующие нормативно-технические документы:

- Временная инструкция по применению тест-системы «Хлами-суис» для выявления ДНК возбудителей хламидийных инфекций свиней (Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia suis) методом полимеразной цепной реакции;

- Технические условия ТУ 9388-001-04717947-2011 на тест-систему «Хлами-суис» для выявления ДНК возбудителей хламидийных инфекций свиней (Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia suis) методом полимеразной цепной реакции.

Полученные результаты исследований послужили основой для разработки методических рекомендаций «Выявление возбудителей хламидиозов свиней методом полимеразной цепной реакции» (гриф Учебно-методического объединения высших учебных заведений Российской Федерации по образованию в области зоотехнии и ветеринарии от 04 апреля 2012 г. №63-51). Материалы

диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВПО БелГСХА имени В.Я. Горина и на кафедре эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО КГСХА имени профессора И.И. Иванова. Основные положения диссертационной работы внедрены в ветеринарную практику свиновокомплексов ООО «Белгранкорм» — «Томаровская свинина» и «Шебекинская свинина».

Положения, выносимые на защиту:

1. Распространенность хламидийных инфекций в свиноводческих хозяйствах Белгородской области.

2. Схема ПЦР-амплификации фрагментов гена отр1, обеспечивающих возможность обнаружения всех видов хламидий патогенных для свиней и дифференцирования их между собой.

3. Подбор праймеров для ПЦР-амплификации семейственно- и видоспецифических фрагмен