Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Использование полимеразной цепной реакции в целях мониторинга благополучия по микобактериальным инфекциям зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Использование полимеразной цепной реакции в целях мониторинга благополучия по микобактериальным инфекциям зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных"

На правах рукописи

КАЛМЫКОВ Виктор Михайлович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОИ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ЦЕЛЯХ МОНИТОРИНГА БЛАГОПОЛУЧИЯ ПО МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫМ ИНФЕКЦИЯМ ЗООПАРКОВЫХ, ЦИРКОВЫХ И СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

005050947

Щелково - 2013

005050947

На правах рукописи

КАЛМЫКОВ Виктор Михайлович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗИОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ЦЕЛЯХ МОНИТОРИНГА БЛАГОПОЛУЧИЯ ПО МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫМ ИНФЕКЦИЯМ ЗООПАРКОВЫХ, ЦИРКОВЫХ И СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Щелково-2013

Работа выполнена в лаборатории микобактериозов ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии (ВИЭВ).

Научный руководитель Найманов Али Хусинович - доктор ветеринарных

наук, профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ, заведующий лабораторией микобактериозов ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

Официальные оппоненты: Матвеева Ирина Николаевна - доктор

биологических наук, заведующая отделом молекулярной биологии и вирусологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН

Букова Наталия Константиновна — доктор биологических наук, профессор, учёный секретарь ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

Ведущая организация: Институт ветеринарной экспертизы, санитарии и

экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств».

Защита диссертации состоится «06» марта 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щёлковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; тел./факс: 8 (496) 56 - 723 - 63; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН»

Автореферат разослан «05» февраля 2013 г. и размещен на сайте http://www.vak.ed.gov.ru.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю.Д.Фролов

1 Общая характеристика работы

1.1 Актуальность проблемы. Внедрение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лабораторную диагностику туберкулёза животных в нашей стране показало необходимость дальнейшего совершенствования этого метода с целью исключения возможности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов и повышения достоверности исследования.

Известно, что наиболее трудоёмким этапом ПЦР-анализа является выделение нуклеиновых кислот. Автоматизация этапа выделения ДНК позволяет сократить количество лабораторных ошибок и повысить эффективность выявления микобактерий туберкулёза из исследуемого материала (B.C. Зайцев с соавт., 2007; M.J. Espy et al., 2001, 2006; P. Hammer et al., 2002; J.H. Knepp et al., 2003; J.R. Stabel et al., 2004; S. Ravas, L.H. Stanker, 2005; D. Herthnek et al., 2006; C.V. Jaravata et al., 2006). Поэтому, дальнейшие совершенствования в области молекулярной диагностики туберкулёза животных должны быть направлены на автоматизацию ПЦР-анализа.

За рубежом проблемам диагностики и профилактики инфекционных болезней диких животных уделяется особое внимание, т.к. места их содержания (зоопарки, цирки и др.) считаются зонами повышенного риска. В зоопарках ряда стран имеются специальные рекомендации по диагностике и профилактике инфекционных болезней диких животных. Однако в РФ подобных рекомендаций не существует, и ветеринарные специалисты вынуждены руководствоваться только рекомендациями, разработанными для домашних и сельскохозяйственных животных. Это создаёт серьёзные проблемы для сохранения здоровья диких животных (Г.И. Блохин, 2006; М.В. Альшинецкий, 2004, 2009; R.J. Montali, S.K. Mikota, L.I. Cheng, 2001; A. Lecu, R. Ball, 2011).

В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» (2002) основным методом прижизненной диагностики туберкулёза животных является внутрикожная туберкулиновая проба. Однако провести туберкулинизацию диких животных в зоопарках и цирках не всегда

з

представляется возможным из-за их агрессивности. Некоторые животные (слоны, бегемоты, носороги) имеют толстую кожу, в которую практически невозможно ввести туберкулин и, поэтому, внутрикожная туберкулиновая проба не может использоваться как основной метод диагностики туберкулёза данных животных. Кроме того, в 2003 г. в статье «Экологический мониторинг при туберкулинодиагностике крупного рогатого скота», опубликованной в издании «Агроеколопчний журнал» №1 В.В. Власенко, А.П. Лысенко с соавт. утверждали, что существующий технологический регламент изготовления ППД-туберкулина для млекопитающих (ФГУП «Курская биофабрика») не обеспечивает стерильность и специфичность препарата. Это, по мнению авторов статьи, способствует поступлению с туберкулином в организм крупного рогатого скота адаптивных форм возбудителя туберкулёза. Для обеспечения общепринятого международного требования безопасности туберкулиновых препаратов разработчик включил в технологический регламент тест на специфическую безвредность ППД-туберкулина для млекопитающих, результаты которого подтверждают отсутствие в готовом препарате живых микобактерий.

Паратуберкулёз крупного рогатого скота был и остаётся одной из сложно контролируемых и диагностируемых хронических инфекций. В последние годы в зарубежной литературе появились сообщения об успешном испытании ПЦР при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота и овец. Авторы оценивают ПЦР как более точный и экспрессный метод идентификации возбудителя паратуберкулёза и рекомендуют его для диагностики и включения в программы борьбы с этой инфекцией (N.G. Jaimes et al., 2008; J. Szteyn et al., 2008; A. Doosti, S. Moshkelani, 2010).

В отечественной литературе данных о возможности применения ПЦР для диагностических исследований на паратуберкулёз крупного рогатого скота нами не обнаружено.

Поэтому, на современном этапе борьбы с туберкулёзом и паратуберкулёзом животных, учитывая недостаточную изученность некоторых важных вопросов диагностики, длительность, трудоёмкость и

сравнительно низкую эффективность классических методов прижизненной и лабораторной диагностики, изучение возможности применения метода ПЦР при диагностике микобактериальных инфекций зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных является своевременным и актуальным.

1.2 Цель исследований: оптимизация ПЦР-анализа и изучение возможности применения полимеразной цепной реакции для мониторинга микобактериальных инфекций зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных.

1.3 Основные задачи исследовании:

1 Провести культуральные и молекулярно-генетические исследования всех трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике при диагностике туберкулёза и паратуберкулёза животных (ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM), на наличие микобактерий и ДНК микобактерий.

2 Провести сравнительное изучение эффективности автоматического и «ручного» выделения ДНК из различных видов биоматериала с целью оптимизации ПЦР-анализа для мониторинга микобактериальных инфекций животных.

3 Провести ПЦР-исследование различных видов биоматериалов и объектов внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина и определить возможность применения ПЦР для мониторинга благополучия животных по туберкулёзу.

4 Определить диагностическую ценность и возможность применения ПЦР в общем комплексе лабораторных исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.

1.4 Научная новизна. Впервые проведено исследование всех трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике для прижизненной диагностики туберкулёза и паратуберкулёза животных на наличие микобактерий и ДНК микобактерий. Исследованием методами:

культуральным, ПЦР и секвенирования установлено, что ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза животных и ДНК нетуберкулёзных микобактерий.

Впервые определена эффективность автоматического выделения ДНК микобактерий из различных видов биоматериала в сравнении с «ручным» методом, что позволило оптимизировать ПЦР—анализ микобактериозов животных. Установлено, что при автоматическом выделении ДНК повышается информативность и достоверность метода за счёт увеличения объёма исследуемой пробы до 1,0 мл, сокращается время проведения исследований, исключается возможность контаминации реагентов и проб, снижается вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПЦР.

Впервые показана возможность применения ПЦР в целях мониторинга благополучия диких животных по туберкулёзу в зоопарках и цирках при исследовании различных видов биоматериала от данных животных и объектов внешней среды.

Впервые установлена возможность применения ПЦР и определено её место в общем комплексе диагностических исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.

1.5 Практическая значимость. Результаты исследований включены в сборник «Методические наставления по проведению исследований при микобактериозах животных», рассмотренные и одобренные на заседании учёного совета Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) (протокол № 1 от 25.01.2011 г.), на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 27.04.2011 г.), утверждённые Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 03.10.2011 г. Методические наставления награждены Дипломом XIV Российской агропромышленной выставки «Золотая осень» (Москва, 2012 г.)

По результатам научно-исследовательской работы разработаны Методические наставления «Мониторинг благополучия диких животных по туберкулёзу в зоопарках и цирках Российской Федерации», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (протокол № 4 от 16.04.2012 г.), на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 4 от 21 сентября 2012 г.), утверждённые Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 09.11.2012 г.

1.6 Основные положения, выносимые на защиту:

- ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM производства ФГУП «Курская биофабрика» не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза и ДНК нетуберкулёзных микобактерий.

-Оптимизация ПЦР-анализа путём автоматического выделения ДНК микобактерий из различных видов биоматериала для мониторинга микобактериозов животных.

- Результаты ПЦР-исследований различных видов биоматериала и объектов внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина на Цветном бульваре в целях мониторинга благополучия животных по туберкулёзу.

- Диагностическая ценность и возможность применения ПЦР в общем комплексе лабораторных исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.

1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В

соответствии с формулой специальность 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» представляет собой область науки, изучающей систематику, структуру, физиологию, биохимию, генетику, экологию патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов), имеющих ветеринарное

значение, эпизоотологические и экологические закономерности возникновения, распространения инфекционных болезней и иммунологию сельскохозяйственных, домашних и диких животных, изучающая и разрабатывающая методы, средства и организационные основы диагностики, лечения, профилактики и ликвидации этих болезней. В диссертационной работе приведены результаты исследований всех аллергенов, используемых для диагностики туберкулёза и паратуберкулёза животных, на наличие микобактерий и их ДНК, сравнительного изучения «ручного» и автоматического выделения ДНК из биоматериалов, ПЦР-исследований различных видов биоматериалов и объектов внешней среды от разных видов диких животных зоопарка и цирка в целях мониторинга благополучия по туберкулёзу, возможности применения ПЦР в общем комплексе лабораторных исследований при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота.

Результаты научного исследования соответствуют пункту 5 паспорта специальности.

1.8 Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования методом ПЦР и обобщение результатов по теме диссертационной работы выполнены автором самостоятельно. Аллергические исследования проведены совместно с профессором А.Х.Наймановым, культуральные исследования - с ведущим научным сотрудником лаборатории микобактериозов ВИЭВ Н.Г. Толстенко, секвенирование фрагментов ДНК микобактерий - совместно с научными сотрудниками ЦНИИЭ Е.А. Долговой и М.В. Альварес Фигероа.

1.9 Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на: 7-ой Всероссийской научно—практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика—2010» (2010), межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ, Москва (2012).

Материалы диссертации используются в учебном процессе при проведении лекционных и практических занятий по дисциплине «Современные проблемы биологии» со студентами (магистры биологии) ветеринарно-биологического факультета Федерального бюджетного

государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина».

1.10 Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы четыре научные работы, в том числе три статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринарная медицина» —2 и «Российский ветеринарный журнал» -1), одна - в сборнике конференции с международным участием.

1.11 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 149 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы (258 источников, из которых 136 отечественных и 122 иностранных). Работа содержит 8 таблиц, 10 фотографий и 15 графиков.

Благодарности. Автор выражает благодарность главному ветеринарному врачу ГУК «Московский зоологический парк» М.В. Алыиинецкому, ветеринарному врачу Московского цирка Никулина С.Я. Герасиной за оказанную консультативную и методическую помощь.

2 Собственные исследования

2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2009-2012 гг. в лаборатории микобактериозов ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ), на опытной базе о. Лисий Вышневолоцкого отдела ВИЭВ и ФГБУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория (ЦНМВЛ).

Для исследования использовали три аллергена производства ФГУП «Курская биофабрика»: «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих» стандартный раствор, серия №3, контроль №3, изготовленный 27.01.09 г.; «Туберкулин очищенный (ППД) для птиц», серия 15, контроль 15, изготовленный 14.08.2008 г. «Аллерген сухой очищенный комплексный из

атипичных микобактерий (KAM)», серия 7, контроль 7, изготовленный 25.07.2007 г.

Культуральные исследования проводили путём посева аллергенов на 10 пробирок со средой Левенштейна-Йенсена и на 10 пробирок со средой ФАСТ-ЗЛ. За посевами наблюдали в течение трёх месяцев. Через 10, 30, 45 и 60 дней после посева для ПЦР были взяты смывы с поверхности питательных сред.

Для ПЦР использовали тест-системы «МТБ—КОМ», «МТБ—ДИФ», «АВИУМ» и «ПАРАТУБ» (ЦНИИЭ). Постановку ПЦР и анализ результатов проводили на приборе RotorGene-6000 производства «CorbettResearch» (Австралия), а также на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технологии», Россия).

Секвинирование специфических последовательностей 16S рДНК и internal transcribed spacer [ITS] региона проводили в соответствии с алгоритмом типирования микобактерий, предложенным American Society for Microbiology.

Для сравнительного изучения эффективности автоматического и «ручного» выделения ДНК использовали штамм M.bovis BCG «Предприятия по производству бактерийных и вирусных препаратов Ставропольского НИИ вакцин и сывороток» в разной концентрации и в разном объёме (0,1 и 1,0 мл), четыре музейные культуры микобактерий лаборатории микобактериозов ВИЭВ (M.bovis, M.tuberculosis, М.avium, M.paratuberculosis), две пробы патматериала от больных туберкулёзом коров, 13 проб фекалий и пять проб патматериала от подозрительных в заражении паратуберкулёзом коров.

Для «ручного» выделения ДНК использовали набор «ДНК-сорб-В» (ЦНИИЭ), автоматическое выделение ДНК проводили на приборе NucliSens EasyMag (Биомерье, Франция) в соответствии с инструкцией.

В целях мониторинга благополучия диких животных зоопарка и цирка по туберкулёзу для ПЦР—исследования двукратно были отобраны:

• в зоопарке — сборные пробы фекалий из 19 вольеров с разными животными (первый раз) и из 21 вольера (второй раз), от птицы - помёт из 19 клеток, а также с берегов большого и малого прудов; смывы с поверхности стен и пола, а также вода из поилок 19 вольеров с животными; смывы с пола и вода из поилок 11 клеток с дикой птицей;

• в цирке - носовая слизь и фекалии от девяти обезьян; смывы из хобота и фекалии от пяти слонов (трёхкратно в течение 10 дней с интервалом 3 дня); кровь, фекалии и носовая слизь от шести верблюдов; смывы с поверхности стен и пола, вода из поилок загонов для слонов, вольеров с обезьянами и верблюдами.

Перед ПЦР-исследованием обезьяны и верблюды были исследованы внутрикожной пробой с ППД-туберкулином для млекопитающих.

Для определения диагностической ценности и возможности применения ПЦР в комплексе исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота были исследованы 52 пробы фекалий и 17 проб патматериала (кусочки кишечника) от убитых с диагностической целью коров из двух хозяйств.

Статистическую обработку данных проводили по критерию у! с использованием программы «Microsoft Excel», пособия В.П.Ерёмина «Элементы математической обработки биологического эксперимента» (Ленинград, 1974).

2.2 Результаты исследований

Культуральные и молекулярно-генетические исследования всех трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике при диагностике туберкулёза и паратуберкулёза животных (ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и КАМ), на наличие микобактерий и ДНК микобактерий.

При культуральном исследовании трёх аллергенов на протяжении всего срока наблюдения (3 месяца) роста микобактерий на питательных средах не наблюдали. Для подтверждения отсутствия роста микобактерий дополнительно

il

исследованы смывы с поверхности всех питательных сред методом ПЦР через 10, 30, 45 и 60 дней после посева аллергенов.

Результаты культуральных и ПЦР—исследований аллергенов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты культурального и ПЦР-исследования аллергенов

Аллерген Культуральное исследование на питательной среде: ПЦР-исследование тест-системой:

Левенштейна— Иенсена ФАСТ-ЗЛ «МТБ-КОМ» «АВИУМ»

1 2 3 4 5

ППД-туберкулин для млекопитающих Отсутствие роста микобактерий в течение всего срока наблюдения ДНК М. bovis и M.avium не выделены

ППД-туберкулин для птиц

KAM

Смывы с поверхности питательных сред Левенштейна—Иенсена и ФАСТ-ЗЛ -

Как видно из данных таблицы 1, ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM не содержат микобактерий. В смывах с поверхности питательных сред ДНК M.bovis и M.avium также не обнаружены.

При исследовании ППД-туберкулина для млекопитающих, ППД— туберкулина для птиц методом ПЦР с использованием тест-систем «МТБ-КОМ» и «АВИУМ» ДНК M.bovis и M.avium не обнаружены.

Выделенные из трёх аллергенов ДНК были исследованы с помощью алгоритма типирования микобактерий, предложенного American Society for Microbiology, основанного на секвинировании специфических последовательностей 16S рДНК и internal transcribed spacer [ITS] региона. Данный алгоритм позволяет обнаруживать микобактерии и определять их видовую принадлежность путем сравнения анализируемой последовательности 16S рДНК и региона ITS с аналогичными

последовательностями, приведенными в международной базе данных RIDOM (http://rdna4.ridom.de/mycobacteria/index.html). При амплификации выделенной из аллергенов ДНК, согласно указанному протоколу, специфический ампликон получен не был, что свидетельствует об . отсутствии в исследованном материале ДНК микобактерий.

Таким образом, установлено, что ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM производства ФГУП «Курская биофабрика» не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза животных и ДНК нетуберкулёзных микобактерий и не могут быть источниками возбудителя туберкулёза животных, что соответствует технологическому регламенту изготовления данных аллергенов.

Сравнительное изучение эффективности автоматического и «ручного» выделения ДНК из различных видов биоматериала с целью оптимизации ПЦР-анализа для мониторинга микобактериальных инфекций животных

На начальном этапе работы была использована суспензия штамма М.bovis BCG в разной концентрации от 1х106 до 102 м.т./мл.

Для получения более достоверных результатов «ручного» выделения из подготовленных проб были сформированы контрольные панели, которые исследовали параллельно с нами в шести ветеринарных лабораториях.

Пробы, подготовленные для автоматического выделения, были исследованы автором в трёх повторах.

В соответствии с инструкцией к тест-системе для «ручного» выделения ДНК объём пробы составляет 0,1 мл, для автоматического - до 1,0 мл.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как показывают данные таблицы 2, при автоматическом выделении ДНК в пробах объёмом 1,0 мл эффективность выделения составляла 100 %.

В пробах объёмом 0,1 мл эффективность выделения ДНК при автоматическом выделении составила также 100% против 72 % при «ручном».

Таблица 2

Результаты ПЦР при разных способах выделения ДНК

Результаты ПЦР при автоматическом выделении ДНК М.bovis BCG из проб объёмом: Результаты ПЦР при «ручном» выделении ДНК M.bovis BCG

Концентрация исследуемого образца (м.к./мл) Кол-во проб 1 мл 0,1 мл Кол-во проб (объём 0,1 мл) Кол-во пол. рез-в % эффективности выделения ДНК

Кол-во пол. рез-в % . эффективности выделения ДНК Кол-во пол. рез-в % эффективности выделения ДНК

1 ООО ООО 3 3 100 3 100 7 7 100

100 ООО 3 3 100 3 100 7 7 100

10 000 3 3 100 3 100 7 7 100

1 000 3 3 100 3 100 7 7 100

100 3 3 100 3 100 7 5 72

Необходимо отметить, что диагностическая чувствительность тест-системы составляет 102—103 м.т./мл. Поэтому, эффективность «ручного» способа выделения ДНК при концентрации микобактерий в пробе 102 м.т./мл, ниже в среднем на 28%, чем при автоматическом выделении. Таким образом, мы не исключаем, что на качество выделения ДНК при «ручном» способе выделения оказывает влияние «человеческий» фактор. Именно по этой причине при выделении ДНК из 7 проб с концентрацией возбудителя 102 м.т./мл положительный результат получен только в пяти случаях (72%).

В дальнейшем мы провели сравнение эффективности выделения ДНК микобактерий «ручным» и автоматическим способами на четырёх музейных бактериальных культурах микобактерий (М.Ьоу1б, МДиЬегси1оз15, М.аушт, М. рагаШЬегси1оз1з) и различном патматериале. В пробах, не содержащих ДНК микобактерий, эффективность выделения ДНК определяли по прохождению внутреннего контрольного образца (ВКО).

Для ПЦР использовали тест—системы «МТБ—ДИФ», «ПАРАТУБ» и «АВИУМ» (ВКО входит в тест-системы «МТБ—ДИФ» и «ПАРАТУБ»). Результаты ПЦР-исследования культур микобактерий с разными способами выделения ДНК представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты ПЦР-исследования бактериальных культур микобактерий

Название культуры Тест-система, способ выделения ДНК и прохождение ВКО

«МТБ-ДИФ» «ПАРАТУБ» «АВИУМ»

ручной автом. ВКО ручной автом. ВКО ручной автом.

M.bovis + + + - - - - -

M.tuberculosis + + + - - - - -

M.avium - - - - - - + +

М.paratuberculosis - - - + + + - -

Примечание: «+» - положительный результат ПЦР, «-» - отрицательный результат ПЦР

Как видно из полученных результатов эффективность выделения ДНК из всех культур составила 100% не зависимо от способа выделения.

На следующем этапе были исследованы пробы фекалий крупного рогатого скота от подозрительных в заражении паратуберкулёзом коров и суспензии лимфоузлов от двух больных туберкулёзом коров и пяти подозрительных в заражении паратуберкулёзом коров.

Полученные результаты ПЦР-исследования фекалий показали отсутствие во всех пробах ДНК Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis при наличии ВКО. Однако при «ручном» способе выделения ДНК в одной пробе не прошёл ВКО, что указывает на возможную потерю ДНК в процессе выделения, при автоматическом выделении ВКО не прошёл в двух пробах. Результаты в таких пробах не учитывают, эти пробы подлежат повторному исследованию. При ручном выделении потеря ВКО чаще всего вызвана техническими погрешностями в работе, т.е. «человеческим» фактором. При автоматическом способе на эффективность выделения ДНК из фекалий влияет степень осветления суспензии на этапе подготовки проб.

При исследовании проб патматериала от двух больных туберкулёзом коров и пяти подозрительных в заражении паратуберкулёзом коров ДНК M.bovis выделена из патматериала от больных туберкулёзом коров, из патматериала от подозрительных в заражении паратуберкулёзом коров ДНК возбудителей туберкулёза и паратуберкулёза не выделена. ВКО прошёл во всех пробах. На

результат ПЦР при исследовании суспензии патматериала от крупного рогатого скота не повлиял способ выделения ДНК, эффективность составила 100%.

В проведённом эксперименте статистически значимых различий эффективности выделения ДНК разными способами не получено (Р>0,05). Однако результаты проведённых нами исследований показали, что на эффективность выделения ДНК оказывает влияние объём исследуемой пробы и «человеческий» фактор. Автоматическое выделение ДНК позволяет в 10 раз увеличить объём исследуемой пробы; в два раза сокращает время выделения ДНК и, соответственно, всего исследования; исключает возможность контаминации реагентов и проб; снижает вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Все указанные преимущества автоматического выделения ДНК значительно повышают эффективность ПЦР-анализа микобактериозов животных.

ПЦР-исследование различных видов биоматериалов и объектов внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина и определение возможности применения ПЦР для мониторинга благополучия животных по туберкулёзу

Исследования цирковых животных

1 В Московском цирке Никулина провели диагностическое исследование на туберкулёз девяти обезьян.

В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» обезьян исследовали аллергической туберкулиновой пробой с ППД-туберкулином для млекопитающих. Туберкулин вводили интрадермопальпебрально в верхнее веко правого глаза. Учёт результатов аллергических исследований обезьян проводили через 72 часа методом осмотра, пальпации и сравнения верхнего века правого и левого глаза.

При учёте результатов аллергических исследований девяти обезьян реагирующих на туберкулин животных не выявлено.

Отмечена сложность и трудоёмкость аллергических исследований

обезьян интрадермопальпебральной пробой. В связи со сложностью проведения аллергических исследований и с учётом того, что заражение обезьян туберкулёзом, как правило, происходит аэрогенным путём и через объекты внешней среды, нами было проведено двукратное ПЦР—исследование проб фекалий и носовой слизи обезьян, а также смывов со стен, воды из поилок и смывов с пола индивидуальных вольеров.

ПЦР—исследованием проб фекалий и носовой слизи обезьян, смывов со стен и полов индивидуальных вольеров, в которых содержатся обезьяны, а также воды из поилок ДНК М.bovis и M.tuberculosis не выделена ни из одной пробы.

На основании проведённых исследований и полученных результатов, нами сделано заключение, что обезьяны не инфицированы туберкулёзом, а в окружающей внешней среде ДНК M.bovis и M.tuberculosis отсутствуют.

2 В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» в нашей стране слонов рекомендуется исследовать внутрикожной туберкулиновой пробой с введением ППД-туберкулина для млекопитающих в подхвостовую складку. По данным литературы аллергическая диагностика туберкулёза у слонов недостаточно эффективна (S.K. Mikota et al., 2001, 2006; S.S. Lewerin et al., 2005).

В связи с тем, что в нашей стране отсутствуют специальные рекомендации по диагностике, профилактике и борьбе с туберкулёзом диких животных, в основу наших исследований, кроме «Наставления по диагностике туберкулёза животных», были положены «Рекомендации по борьбе с туберкулёзом слонов» (Guidelines for the control of tuberculosis in elephants, 2008. The national tuberculosis working group for Zoo and wildlife species, USA), а также исследования зарубежных авторов по данной проблеме.

В соответствии с этими документами для диагностики туберкулёза слонов рекомендуется исследовать смывы из хобота. Нами были отобраны смывы из хобота и пробы фекалий от пяти слонов. Пробы смывов из хобота были взяты

трёхкратно в течение 10 дней с интервалом три дня. Кроме того, были исследованы смывы со стен и пола загона и вода из поилок слонов.

Проведённые нами исследования показали, что в исследуемом материале от слонов, а также в смывах со стен и пола загона, в котором содержатся слоны, и в воде из поилок ДНК М.Ьоу15 и М.шЬегси1о5|'5 отсутствуют.

На основании проведённых исследований и полученных результатов нами сделано заключение, что слоны не инфицированы туберкулёзом, а в окружающей внешней среде ДНК М.Ьоу18 и М.1:иЬегси1оз1з отсутствуют.

3 В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» верблюдов исследуют внутрикожной туберкулиновой пробой с ППД-туберкулином для млекопитающих. В Московском цирке Никулина мы провели аллергическое исследование шести верблюдов. Туберкулин вводили в кожу брюшной стенки или область паха на уровне горизонтальной линии седалищного бугра. Учёт результатов проводили через 72 часа после введения туберкулина. При учёте результатов аллергического исследования реагирующих животных не выявили.

В дальнейшем мы провели ПЦР - исследование проб крови, носовой слизи и фекалий от этих верблюдов, а также воды из поилок, смывов со стен и полов вольеров.

ПЦР-исследованием проб крови, носовой слизи и фекалий от шести верблюдов, смывов со стен и полов индивидуальных вольеров, в которых содержатся верблюды, а также воды из поилок ДНК М.Ьоу^ и М.шЬегсЫоз^ не выделены.

На основании проведённых исследований и полученных результатов нами сделано заключение, что верблюды не инфицированы туберкулёзом, а в окружающей внешней среде ДНК М.Ьоув и М.1иЬегси1оз1з отсутствуют.

Таким образом, проведённый двукратно комплекс исследований различного биологического материала от диких животных цирка и объектов внешней среды с использованием метода ПЦР позволяет сделать вывод о

благополучии животных по туберкулёзу.

Исследования зоопарковых животных

В Московском зоопарке исследования фекалий от животных и объектов внешней среды провели двукратно.

В отличие от диких животных цирка, которые являются дрессированными и менее опасными для человека, дикие животные зоопарка представляют значительно большую угрозу для людей. Поэтому проведение аллергических исследований с целью выявления инфицированных туберкулёзом животных опасно для ветеринарных специалистов. Для мониторинга туберкулёза зоопарковых животных мы предлагаем ПЦР-исследование фекалий и объектов внешней среды в качестве основного метода выявления инфицирования животных туберкулёзом.

1 ПЦР-исследование фекалий от животных

Нами были проведены исследования фекалий методом ПЦР от разных видов диких животных зоопарка. В частности, как наиболее интересные объекты исследования, мы выбрали слона, жирафа и разные виды человекообразных (горилл, орангутанов, гиббонов) и нечеловекообразных (макак, кошачьих и красных лемуров, мартышек, колобусов, капуцинов, саймири, мандарил) обезьян, т.е. наиболее восприимчивых к заболеванию туберкулёзом животных зоопарка.

В результате двукратного мониторинга благополучия диких животных зоопарка по туберкулёзу с использованием метода ПЦР ДНК М.Ымэ и М.ШЬегси1оз15 не выделены ни из одной пробы фекалий, смывов со стен и полов вольеров, а также воды из поилок.

2 ПЦР-исследование помёта от дикой птицы

Нами были исследованы сборные и индивидуальные пробы помёта из клеток от белого какаду, перга, горного гуся, из вольеров и помещений, где содержатся ибисы, чирки, подорлики, семегалы, нельсыги, пеликаны, утки, и с берегов большого и малого прудов зоопарка от дикой перелётной

водоплавающей птицы.

ПЦР-исследованием 19 проб помёта, из одной сборной пробы помёта от дикой перелётной водоплавающей птицы с берега большого пруда зоопарка выделена ДНК M.avium, однако, из смывов со стен и полов индивидуальных клеток с птицами, закрытых помещений и вольеров, в которых содержится дикая птица, а также воды из поилок птиц, ДНК M.avium не выделена ни из одной пробы.

Таким образом, проведённый двукратно комплекс исследований фекалий и помёта от диких животных и птиц зоопарка и объектов внешней среды с использованием метода ПЦР позволяет сделать вывод о благополучии диких животных Московского зоопарка по туберкулёзу.

Выделение ДНК M.avium из одной сборной пробы помёта от дикой перелётной водоплавающей птицы, отобранной с берега большого пруда, указывает на необходимость проведения дальнейшего постоянного мониторинга и комплекса диагностических исследований на туберкулёз птиц в Московском зоопарке.

Определение диагностической ценности и возможности применения ПЦР в комплексе исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота

Комплекс диагностических исследований мы провели с целью уточнения диагноза на паратуберкулёз в одном хозяйстве Смоленской области и одном хозяйстве республики Удмуртия. В этих хозяйствах ветеринарными специалистами местной ветеринарной службы были выявлены подозрительные в заболевании паратуберкулёзом животные и выделен возбудитель паратуберкулёза. Оставалось объявить неблагополучие хозяйств по паратуберкулёзу и наложить ограничения на производственную деятельность хозяйств. Однако, в связи со сложностью установления диагноза на паратуберкулёз и некоторыми сомнениями в установленном диагнозе, дальнейшие исследования были проведены комиссионно, совместно со специалистами управления ветеринарии, районной ветеринарной службой и

сотрудниками лаборатории микобактериозов ВИЭВ.

Анализ предоставленных местной ветеринарной службой актов аллергических и серологических исследований, актов клинического осмотра поголовья, актов убоя реагирующих животных, экспертиз лабораторных исследований проб фекалий и патматериала от убитых с диагностической целью животных показал, что предварительный диагноз на паратуберкулёз был установлен на основании обнаружения методом бактериоскопии в фекалиях кислотоустойчивых палочек характерной морфологии, выделения культуры микобактерий на обычных питательных средах, используемых для диагностики туберкулёза, без добавления фактора роста (экстракта из М.рЫе1), т.е. без учёта основных специфических положений «Наставления по диагностике паратуберкулёза животных» от 2001 г. Необходимо указать, что возбудитель паратуберкулёза в первых генерациях растёт и размножается на питательных средах только в присутствии фактора роста и для идентификации выделенных культур микобактерий необходимо было эти культуры посеять на питательные среды с фактором роста и без него. Это важное условие идентификации культур микобактерий и диагностики паратуберкулёза не было выполнено, поэтому выделенные культуры нетуберкулёзных медленнорастущих (атипичных) микобактерий были ошибочно охарактеризованы как М.рагаШЬегсЫоэ^.

Проведённые комиссионные клинические, аллергические, патологоанатомические, гистологические, бактериологические и молекулярно-генетические исследования позволили установить, что в обоих хозяйствах отсутствуют животные с характерными клиническими признаками паратуберкулёза. При диагностическом убое комиссионно отобранных наиболее подозреваемых в заболевании паратуберкулёзом (истощённых) коров, патологоанатомическом осмотре и гистологическом исследовании патматериала характерных для паратуберкулёза изменений не обнаружено. При бактериологическом исследовании патматериала от убитых коров — посеве на обычные и специальные питательные среды с добавлением фактора роста (микобактин) — возбудитель паратуберкулёза также не выделен.

Кроме того, от подозреваемых в заболевании паратуберкулёзом животных были отобраны 52 пробы фекалий, а от шести убитых с диагностической целью коров — пробы патматериала для исследования методом ПЦР. Исследования провели с использованием тест-систем «ПАРАТУБ» и «АВИУМ». ДНК Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis и ДНК Mycobacterium avium не выделены ни из одной пробы.

На основании проведённых исследований нами сделано заключение, что поголовье крупного рогатого скота хозяйств благополучно по паратуберкулёзу.

Полученные нами результаты исследований убедительно доказывают, что обнаружение при микроскопии в исследуемом патматериале или фекалиях кислото-спиртоустойчивых палочек является только показателем наличия микобактерий. В связи с многообразием различных форм и видов микобактерий в живом организме, фекалиях и окружающей внешней среде, обнаружение кислотоустойчивых микобактерий не может являться основанием для установления диагноза на паратуберкулёз, так же, как и на туберкулёз. Поэтому, считаем, что в подобных случаях ПЦР-исследование фекалий и выделенных культур микобактерий обладает значительной диагностической ценностью, т.к. такие исследования позволяют дифференцировать микобактерии (M.bovis, M.tuberculosis, M.avium и M.paratuberculosis от нетуберкулёзных микобактерий).

В связи с тем, что при паратуберкулёзе поражается желудочно-кишечный тракт, а возбудитель болезни, в основном, выделяется во внешнюю среду с фекалиями, то ПЦР-исследование фекалий от подозреваемых в заражении паратуберкулёзом животных может стать основным методом в комплексе диагностических исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.

3 Выводы

1 ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и КАМ производства ФГУП «Курская биофабрика» не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза и ДНК нетуберкулёзных микобактерий и не могут быть источниками возбудителя туберкулёза животных, что соответствует технологическому регламенту изготовления данных аллергенов.

2 Установлено, что при ПЦР-исследовании с «ручным» выделением ДНК из различных видов биоматериала от животных эффективность выделения ДНК и конечный результат ПЦР зависят от объёма исследуемой пробы и «человеческого» фактора.

При автоматическом выделении ДНК повышается информативность и достоверность результатов ПЦР—анализа за счёт увеличения объёма исследуемой пробы, сокращается время проведения исследований, исключается возможность контаминации реагентов и проб, снижается вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПЦР, что позволяет оптимизировать ПЦР-анализ для мониторинга микобактериальных инфекций животных.

3 Показана возможность применения ПЦР для мониторинга благополучия по туберкулёзу зоопарковых и цирковых животных. Отсутствие реагирующих в аллергическом исследовании цирковых животных, а также отрицательные результаты ПЦР-исследования биоматериала от слонов, обезьян и верблюдов и объектов внешней среды из вольеров на наличие ДНК M.bovis и ДНК M.tuberculosis указывает на благополучие животных по туберкулёзу.

4 Исследование фекалий и объектов внешней среды методом ПЦР является основным по выявлению инфицированных туберкулёзом зоопарковых животных в связи с опасностью для ветеринарных специалистов проведения аллергических исследований.

5 ПЦР-исследованием проб фекалий от зоопарковых животных (слона, жирафа и разных видов обезьян), проб помёта от разных видов дикой птицы, а также объектов внешней среды из вольеров и клеток ДНК M.bovis, ДНК M.tuberculosis и ДНК М.avium не выделены, что указывает на благополучие этих животных по туберкулёзу.

6 ПЦР-исследованием сборной пробы помёта от дикой перелётной водоплавающей птицы (с берега большого пруда зоопарка) выделена ДНК M.avium, что указывает на необходимость проведения дальнейшего постоянного мониторинга и комплекса диагностических исследований на

туберкулез птиц.

7 В общем комплексе исследований при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота, ПЦР-исследование фекалий и патологического материала от подозреваемых в заражении паратуберкулёзом животных является эффективным дополнительным тестом для подтверждения или исключения заражения M.paratuberculosis.

4 Практические предложения

1 Рекомендуется мониторинг благополучия по туберкулёзу диких животных зоопарков и цирков проводить методом ПЦР—исследования проб фекалий и объектов внешней среды.

2 В комплексе исследований при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота необходимо использовать метод ПЦР для исследования фекалий и патологического материала от подозреваемых в заражении и убитых с диагностической целью животных.

5 Список опубликованных работ

1 Калмыков, В.М. Использование прибора EASYMAG при выделении ДНК Mycobacterium bovis /В.М. Калмыков, А.Х. Найманов, М.С. Калмыкова // Сборник трудов VII Всероссийской научно—практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». — М., 2010. — т.2. — С.114-117.

2 Калмыков, В.М. Использование полимеразной цепной реакции в целях контроля благополучия по туберкулёзу зоопарковых животных / В.М.Калмыков // Ветеринарная медицина. — 2011. — №3-4. — С.48-50.

3 Калмыков, В.М. ПЦР — исследование аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике при диагностике туберкулёза животных / В.М. Калмыков, А.Х. Найманов, М.С. Калмыкова, Е.А. Долгова, М.В. Альварес Фигероа // Ветеринарная медицина. — 2011.— №3-4. — С.72-74.

4 Найманов, А.Х. ПЦР при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, В.М.Калмыков // Российский ветеринарный журнал. - 2012. - № 3. - С.30-32.

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВКО — внутренний контрольный образец

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

KAM — комплексный аллерген из атипичных микобактерий

MAP - Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis

мкл - микролитр

м.т./мл — микробных тел в 1 мл

ПКО — положительный контрольный образец

ППД — Purified Protein Derivate (очищенный дериват белка)

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ЦНИИЭ — Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

BCG — бацилла Кальметта—Герена (Bacillus Calmette—Guerin) —вакцинный штамм Mycobacterium bovis М. — Mycobacterium

М.avium — возбудитель туберкулёза птичьего вида М.bovis — возбудитель туберкулёза бычьего вида M.paratuberculosis — возбудитель паратуберкулёза M.phlei — вид нетуберкулёзной микобактерии M.tuberculosis — возбудитель туберкулёза человеческого вида

Отпечатано в типографии ООО «Мещера», ИНН 5050006864, Московская область, г. Щёлково, ул. Свирская, д.8а. Заказ №014. Тираж 100 экз. 2013 г.