Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Молекулярно-генетические и иммунохимические методы в диагностике, индикации и идентификации возбудителей туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические и иммунохимические методы в диагностике, индикации и идентификации возбудителей туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота"

На правах рукописи

якупов талгат равилович

молекулярно-генетические и иммунохимические методы в диагностике, индикации и идентификации

возбудителей туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

1 2 МАЙ 2011

Казань-2011

4846484

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана»

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор

Алимов Азат Миргасимович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Юсупов Расых Халиуллович

доктор ветеринарных наук, профессор Байматов Валерий Нурмухаметович

доктор медицинских наук, профессор Поздеев Оскар Кимович

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт бруцеллеза и туберкулеза животных Сибирского отделения Российской академии Сельскохозяйственных наук» (ГНУ «ВНИИБТЖ»)

о>

Защита диссертации состоится % » мая 2011 г. в « Щ » часов на заседании диссертационного совета Д 220.034.01 при ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» по адресу: 420029, г.Казань, ул.Сибирский тракт, д.35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана».

Автореферат разослан « » О-Ь^еи&к 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

1. общая характеристика работы

Актуальность. Туберкулез и лейкоз крупного рогатого скота наиболее распространенные хронические инфекции в животноводстве и представляют собой важные проблемы не только ветеринарной медицины, животноводства, но биологии и экологии в целом и имеющие непосредственное отношение к безопасности здоровья человека. На современном этапе борьбы с туберкулёзом и лейкозом животных, основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остаётся своевременная и точная диагностика этих инфекций.

Огромный вклад в изучение эпизоотологии, диагностики и ликвидации туберкулеза сельскохозяйственных животных внесли такие ученые как П.П.Вишневский (1935), М.К.Юсковец (1963), О.В.Мартма (1971), В.П.Урбан (1980), М.А.Сафин (1981), Д.Д.Новак (1977, 1990), Н.М.Колычев (1992), А.С.Донченко (2002, 2004), В.г.Ощепков (2001,2009), Н.А.Донченко (2008), А.Х.Найманов (1993, 2006,2009) и другие.

Диагноз на туберкулез ставят комплексным методом на основе эпизоото-логических, клинических, аллергических, патологоанатомических и лабораторных исследований. Однако не возможно выделить какой-либо один метод диагностики туберкулеза, имеющий значительные преимущества перед другими, скорее они могут взаимодополнять друг друга и поэтому имеют право на существование (С.И.Татьков и др.,2006; В.А.Сазонов и др., 1996). По мнению А.М.Лысенко (1987), Е.В.Маслова (1986), Armbrust А. (1988) и др., для диагностики туберкулеза животных наиболее перспективен иммуноферментный анализ, который позволяет ставить диагноз на туберкулез в лабораторных условиях одновременно у большого количества животных, прост в применении и обладает высокой чувствительностью и специфичностью. В связи с этим, получение и изучение антигенных и иммуногенных характеристик микобактериаль-ных антигенов, специфических антител, возможностей их использования для диагностики туберкулеза, дифференциации неспецифических реакций животных на туберкулин в иммунохимических реакциях являются актуальной задачей для ветеринарной практики в плане повышения эффективности диагноста-

ки, индикации и идентификации возбудителей туберкулеза крупного рогатого скота.

Определение современными методами уровня и спектра противотуберкулезных антител далеко не исчерпало себя в качестве средства иммунодиагностики и характеристики особенностей течения туберкулеза, а сами противотуберкулезные антитела не достаточно используются для характеристики мико-бактериальных антигенов, приготовления диагностикумов и других целей (Л.Н.Черноусова и др., 1995, 2000). Разработка экспресс-методов индикации и идентификации возбудителя туберкулеза из биоматериала животных и дифференциации патогенных микобактерий от атипичных остается актуальной задачей научных исследований (А.Н.Шаров и др., 2000, 2003; М.С.Калмыкова, 2007). Более преспективной в этом отношении, наряду с методами иммуноферментного анализа, является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время, в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота и идентификации микобактерий, интенсивно разрабатываются различные подходы по применению ПЦР и других приемов генодиагностики (С.Н.Радюк, Г.Р.Мацевич, 1997; Е.Б.Вишневская, 1998; А.Н.Шаров, В.А.Седов, 1998; А.М.Алимов, 1999; А.Х.Найманов и др., 2004; Н.А.Донченко, 2008 и др.).

В структуре инфекционной патологии лейкоз крупного рогатого скота в РФ занимает лидирующее место и составляет более 50% от других нозологии (М.И.Гулюкин, 2003;). Широкая распространенность лейкоза крупного рогатого скота, отсутствие средств терапии и специфической профилактики определяют актуальность научных исследований по этой проблеме (Г.А.Симонян, 1980; Л.Г.Бурба, В.М.Нахмансон, А.Ф.Валихов, 1982; В.А.Бусол и др., 1999; М.И.Гулюкин, 2000, 2002; П.Н.Смирнов, 1998, 2005; И.М.Донник, 2005; М.А.Амироков, В.В.Храмцов 2007; А.М.Алимов, 2010).

Одним из приоритетных направлений исследований по изучению особенностей и закономерностей инфекционного процесса лейкоза крупного рогатого скота является разработка высокочувствительных методов прижизненной диагностики болезни (В.А.Бусол, 1999; Р.В; О.А.Верховский и др., 2002;

М.И.Гулюкин и др., 2002, 2005, 2007; П.Н.Смирнов, 2008; И.М.Донник и др., 2009, 2010).

В настоящее время, согласно стандартам МЭБ, узаконенными методами диагностики лейкоза крупного рогатого скота являются реакция иммунодиффу-зии в геле агара и метод иммуноферментного анализа.

Важным преимуществом иммуноферментных методов, наряду с более высокой чувствительностью и специфичностью, является то, что ИФА позволяет выявлять специфические антитела в пробах сборного молока. Если учесть доступность л простоту выполнения, то ИФА для выявления специфических антител в пробах молока может стать важнейшим элементом в системе проти-волейкозных мероприятий в хозяйствах (Nguyen V.K., Maes R.F., 1992; Sargeant J.M., Kelton D.Fetal., 1997).

Весьма актуальной задачей является изучение иммунологических аспектов патогенеза лейкоза крупного рогатого скота. Определение динамики образования и спектра антител, идентификация и изучение состава иммунных комплексов способствуют расшифровке молекулярно-клеточных механизмов взаимодействия вируса лейкоза с макроорганизмом и объяснению особенностей патогенеза.

Результаты подобных исследований явятся основой для разработки новых высокоспецифичных и ранних методов выявления инфицированное™ животных возбудителями туберкулеза и лейкоза, а также для создания более надежной системы мер борьбы с этими опасными инфекционными болезнями.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось усовершенствование иммунохимических и молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, а также средств индикации и идентификации возбудителей этих инфекций. В соответствии с целью решались следующие задачи:

- изучить антигенную структуру микобактерий и выявить наиболее специфичные антигенные компоненты;

- изыскать способы получения высокоспецифичных антигенов микобак-терий и антител, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, и дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин методом ИФА;

- определить эффективность иммуноферментного анализа для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;

- определить диагностическую ценность ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;

- изучить динамику образования специфических антител и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови и молоке инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота;

- определить диагностическую ценность ПЦР для выявления провирус-ной ДНК ВЛКРС в ЦИК сыворотки крови и молока;

- разработать ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке, и определить его диагностическую ценность;

- изучить динамики антителогенеза у крупного рогатого скота к различным структурным компонентам вируса лейкоза;

Научная новизна. Иммунохимическими и биохимическими методами изучена антигенная структура микобактерий и разработаны способы получения высокоспецифичных антигенов из инактивированных культур и антител к ним, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин. Установлено, что особенности антителогенеза, диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе являются важными факторами повышения эффективности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Впервые разработан способ получения антигенов микобактерий, обеспечивающих дифференциальную диагностику туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа («Способ получения антигена для

диагностики туберкулеза крупного рогатого скота» - положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение от 12.08.2010г., заявка №2009112145).

Показана высокая информативность разработанного ИФА для выяснения эпизоотической ситуации хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота.

Разработана технология повышения специфичности иммунных сывороток к микобактериальным антигенам, обеспечивающая индикацию и дифференциацию микобактерий в патологическом материале методом иммунофер-ментного анализа («Белково-глутаральдегидный метод очистки иммунной сыворотки против М.ЫтБ» - рационализаторское предложение №314-91 от 5.03.1991).

Разработан ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов в пробах («Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» - положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение от 26.01.2011 г., заявка №2010100016) и определена его диагностическая ценность. Установлено, что иммуноферментный анализ с предварительной диссоциацией иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке увеличивает выявляемость инфицированных ВЛКРС животных до 20%.

Впервые изучена динамика образования и спектр свободных антител и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке коров инфицированных ВЛКРС в естественных условиях. Установлено, что при уменьшении титров свободных антител в сыворотке крови повышается уровень циркулирующих иммунных комплексов. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр антител меняется. Данные факты свидетельствует о том, что разовые серологические тесты, основанные на выявление антител против только одного антигена, в диагностике лейкоза могут быть не эффективными.

Впервые методом полимеразной цепной реакции доказано присутствие в составе циркулирующих иммунных комплексов провирусной ДНК ВЛКРС, что

расширяет представления о патогенезе инфекции и способствует дальнейшему совершенствованию методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы. Разработанный способ выделения специфических микобактериальных антигенов повышает эффективность прижизненной дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота иммунологическими методами.

«Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА» и «Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий в патологическом материале» позволяют выяснить эпизоотическую ситуацию по туберкулезу в хозяйствах, и рекомендуются для включения в комплексную систему мероприятий по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота.

Разработанный иммуноблот анализ микобактериальных антигенов позволяет идентифицировать микобактерии и может быть использован в качестве дополнительного теста для диагностики туберкулеза.

Для повышения выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота целесообразно проводить ИФА с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов. Разработанный метод ИФА с предварительной диссоциацией ЦИК в исследуемых пробах открывает широкие перспективы для диагностики данной инфекции методом иммуноферментного анализа молока.

Обнаружение провирусную ДНК и специфических антител путем диссоциации циркулирующих иммунных комплексов повышает эффективность выявления контаминации сборного молока вирусом лейкоза.

Результаты научных исследований успешно апробированы и внедрены в хозяйствах Буинского, Дрожжановского, Зеленодольского, Черемшанского, Тюлячинского, Нижнекамского, Высокогорского, Арского и др. районов РТ. По результатам исследований подготовлены методические рекомендации, направленные на усовершенствование методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота:

Методические рекомендации по оценке контаминации молока вирусом лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные НТО ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол №5 от 10.02.2011 г. и Ученым советом ГНУ ВНИИВСГЭ и секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, протокол №6 от 31.03.2011 г.

Методические рекомендации по диагностике лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа сыворотки крови и молока, утвержденные НТС ГУВ КМ РТ, протокол №1 от 21.01,2008г.

Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА) молока, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 2 от 4.06.2009. и НТС ГУВ КМ РТ, протокол № 3 от 8.10.2010г.

Методические рекомендации по дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота методом ИФА, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 5 от 10.02.11г. и НТС ГУВ КМ РТ протокол № 1 от 16.02.2011 г.

Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и по дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота методом ИФА представлены в Федеральную службу по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ РФ для утверждения в установленном порядке.

«Тест-система иммуноферментная для выявления специфических антител против микобактерий» - утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.

«Тест-система иммуноферментная ля типизации микобактерий» - утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и одобрены на республиканских и Всероссийских научно-производственных конференциях по актуальным проблемам агропромышленного комплекса (Казань, 1989, 1990, 1991, 1993, 1999,2004, 2006, 2007, 2008, 2009,2010); Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии,

биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине» (Н.Новгород, 1990); межвузовской научно-производственной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс с/х производства» (Ставрополь, 1991); международной научной конференции посвященной 125-летию КГАВМ (Казань, 1998); международной научной конференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» (Москва, 1999); международной научно-производственной конференции посвященной 100-летию членкора ВАСХНИ-ИЛ В.Т.Котова (Воронеж, 1999); республиканских научно-производственных конференциях молодых ученых и специалистов (Казань, 1998, 2000); международной научной конференции посвященной 70-летию зооинженерного факультета КГАВМ (Казань, 2000); международной научной конференции «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки» (Троицк, 2000); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007); Международной научно-производственной конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008); Н-м съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997); IV-м съезде Российского общества биохимии и молекулярной биологии (Новосибирск, 2008). Международной научно-практической конференции посвященной 90-летию кафедры биологической и органической химии СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009).

Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований, выполненные по теме диссертации, опубликованы в 44 печатных работах, в том числе в 11 изданиях, рекомендованных ВАК, таких как «Ветеринарный врач», «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», «Ученые записки КГАВМ», монография «Иммуноферментный анализ в диагностике туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота», Казань, 2011,148 с.

и

Основные положения, выносимые на защиту:

- изучением антигенной структуры микобактерий получены высокоспецифичные антигены и антитела для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

- полимеразная цепная реакция и иммуноферментный анализ на основе очищенных антигенов и антител повышают эффективность диагностики туберкулеза и лейкоза, обеспечивают дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота, а также индикацию и типизацию микобактерий в патологическом материале.

- инфекционный процесс при лейкозе крупного рогатого скота сопровождается синтезом антител к различным компонентам вируса, уровень которых варьирует в зависимости от стадии болезни.

- диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе повышают эффективность диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 315 страницах стандартного компьютерного набора, содержит 42 таблицы и 26 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, заключения и выводов, предложений производству, списка литературы и приложений.

Библиографический список использованной литературы включает 421 источников, в том числе 175 на иностранных языках. Прилагаются акты производственных и комиссионных испытаний, акты внедрения, патенты на изобретение, методические рекомендации и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В

выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н. В.П.Коксин, к.б.н. К.С.Хаертдинов, к.в.н. Усольцев, к.б.н. Зиннатов Ф.Ф.

Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи научному консультанту д.в.н., профессору А.М.Алимову, д.в.н., профессору кафедры биохимии КГАВМ Н.З.Хазипову, ректору ФГОУ ВПО КГАВМ, д.в.н., профессору Г.Ф.Кабирову.

2. материалы и методы исследований

Исследования по теме диссертации проводились в период с 1990 по 2010 гг. на кафедре биологической и неорганической химии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана.

Объем работы и методы исследований определялись в зависимости от поставленных задач. Пробы крови, сыворотки крови и молока от крупного рогатого скота получали из благополучных и неблагополучных по туберкулезу и лейкозу хозяйств республики Татарстан. Патологический материал (заглоточные, средостенные, брыжеечные лимфоузлы) получали от поступившего на Казанский мясокомбинат крупного рогатого скота и от проб, поступивших для анализа в республиканскую ветеринарную лабораторию.

Таблица 1 - Объем выполненных исследований

Вид исследований j Количество проб

! ИФА для выявления антител к микобактериям в сы- j 6044 ! воротке крови |

I ИФА для выявления антител к ВЛКРС в сыворотке | 568 !крови |

ИФА для выявления антител к ВЛКРС в молоке 1 710

| ИФА для выявления микобактериальных антигенов i 69 в патматериале

Проведение ПЦР Проведение иммуноблот анализа

1057

Автоклавированные культуры микобактерий M. bovis, M.avium, M.nonchromogenes, M.scotochromogenes получены из Курской биофабрики. В опытах был использован штамм M.bovis BCG - коммерческий, производство ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь).

Иммуноферментный анализ ставили по стандартной методике в твердофазном неконкурентном варианте. Использовали микротитрационные планшеты для иммунологических реакций, изготовленные ВНИИ и МТ (г.Москва), а также планшеты полистироловые для иммуноферментного анализа производства «Медполимер» (г.Санкт-Петербург).

Коньюгат. Использовали антитела диагностические против иммуноглобулинов крупного рогатого скота, меченные пероксидазой, изготовленные МТО «Инциатива», прикладная биохимическая лаборатория г.Щелково, антитела диагностические проти IgG кролика, быка меченые пероксидазой, выпускаемые ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (фелиал «Медгамал»), Anti-Bovine IgG-Peroxidase, antibody produced in rabbit - производства фирмы «Сигма».

Иммуноферментный анализ для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, а также для изучения антигенной общности ВЛКРС и ВИЧ, проводили с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (BJ1KPC)» производства НПО «Нарвак», и «Тест-системы имму-ноферментной для выявления антител к вирусам иммунодефицита человека 1 и 2 типов» производства ЗАО «Вектор-бест». Учет результатов реакции проводили согласно инструкции диагностического набора.

Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали коммерческие тест-системы:

1 .Тест-система для индикации и дифференциации M.bovis и M.tuberculosis НПО «Нарвак» (г.Москва), «МТБ-com» (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, г.Москва).

2. «Лейкоз-КРС-Провирус» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, ФГУН ЦНИИЭ - фирмы «АмплиСенс», Gene Рак (фирмы «Biokom).

Изучение спектра антител в исследуемых пробах сывороток крови коров проводили методом иммуноблот анализа. Иммуноблотинг проводили на тест-системе "New LAV BLOT" фирмы Bio Rad (США). Денситометрию результатов иммуноблоттинга проводили в отраженном свете на сканере "Sharp Ix-330". В анализе денситограмм была использована программа "Image Master ID Prime" фирмы "Pharmacia Biotech.

Получение мнкобактериальных антигенов. Автоклавированную мико-бактериальную массу отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин 5 раз в физиологическом растворе. Для удаления свободных липи-дов, микробные клетки дважды обрабатывали ацетоном в соотношении 1:2, помещая их в термостат при 37°С на 1,5 часа и периодически перемешивая. По истечении этого времени, методом центрифугирования при 5000 об/мин в течение 15 мин, микробные клетки отделяли и подсушивали на воздухе. Обработанные ацетоном микробные клетки заливали раствором диметилсульфоксида (ДМСО) подогретым до 37°С, из расчета 6 мл на 1г бактерий и встряхивали в течение 30 мин при 37°С, после чего микробные клетки отделяли центрифугированием в том же режиме. Экстракт диапизировали против 0,01 М карбонатного буфера (pH 9,6) в течение двух суток. Диализат использовали в качестве антигена в дальнейших исследованиях (ДМСО-антиген).

Электрофоретическое фракционирование антигенов. Диск-электрофорез антигенов проводили по методу Laemli (1970) в пластинчатом полиакри-ламидном геле. Молекулярные массы белков, содержащихся в антигенных препаратах, определяли в соответствии с разгонкой белковых стандартов (Broad range - изготовитель Сигма и био-Рад) по логарифмической кривой длины пробега маркеров по K.Weber, M.Osborn (¡969) и Н.М.Филлипович (1978), а также инструментально при помощи оптического сканирования и денситометрирова-ния с дальнейшей компьютерной обработкой данных с использованием программы Image master.

Хроматографическое фракционирование антигенов. Фракционирование проводили методом гель-хроматографии и ионообменной хроматографии

на базе ДЕАЕ-целлюлозы. Подготовка ДЕАЕ-целлюлозы проводилась по общепринятой методике. Использовали хроматографические колонки с внутренним объемом 300 см3. Параметры градиентного элюирования определялись опытным путем. Для гель-хроматографии использовали колонку 4,5 х 60 см с сефадексом G-100 и уравновешенную 0,05М Na-фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 0,1M NaCl. Процесс элюирования фракций и регистрация результатов производился с помощью УФ-детектора UVTCORD -2, сбор фракций осуществлялся на коллекторе фракций FRAC -100.

Проведение иммуноблотинга. Электроперенос белков фракционированных в ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану проводили по методике, описанной Towbin et al. (1989).

Иммуноблот анализ проводили следующим образом: нитроцеллюлозную мембрану нарезали на полоски - стрипы, маркировали, помещали их в пластиковые канавки, вносили 2 мл ФСР-Т, выдерживали 5 минут, вносили по 10 мкл исследуемых сывороток на стрип, выдерживали 2 часа при комнатной температуре на шейкере, 3 раза промывали раствором ФСР-Т с 5 минутной инкубацией, после каждой промывки раствор аспирировали в дезинфекционную емкость с 6% перекиси водорода, вносили конъюгат в рабочем разведении, инкубировали 1 час при комнатной температуре на шейкере, стрипы 3 раза промывали раствором ФСР-Т, вносили субстратный, инкубировали до развития цветного окрашивания 15-30 минут, 3 раза промывали дистиллированной водой и высушивали. Учет реакции проводили визуально и инструментально при помощи оптического сканирования и денситометрирования по интенсивности окрашивания с использованием компьютерной программы Image master, версия 1.

Получение иммунных сывороток против микобактериальных антигенов. В качестве продуцентов гипериммунной сыворотки использовали кроликов. Иммунизацию животных проводили по методу, описанному Harboe N., Ingild А. (1977). Готовили раствор антигена в концентрации 2-4 мг/мл с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. На 1-й, 14-й, 28-й и 43-й день иммунизации кроликам вводили раствор антигена в объеме 1 мл. Инъекцию

производили в утолщенный участок кожи над лопаткой в 8-10 точках. На 50-й день отбирали кровь из ушной вены. Через каждые шесть недель брали очередную порцию крови, причем животному вводили тандартную смесь антигена за 8-10 дней до отбора крови. Специфичность полученных антисывороток изучали в динамике в РСК и ИФА с антигеном из гомологичных и гетерологичных бактериальных клеток.

Выделение микобактериальных антигенов из тканей патологического материала крупного рогатого скота. Проводили обработку патологического материала, с целью выделения микобактериальных антигенов, по методу описанному Хазиповым Н.З., Тюриковой Р.П., Нуруллиным A.A. (1986).

Для анализа брали 1-2 г лимфатических узлов (средостенных, заглоточных, брыжеечных и др.) и растирали их кварцевым песком в ступке. Разрушенную ткань суспендировали в гипотоническом растворе NaCl состоящем на 20 % от 0,05 %-го раствора MgCl2 и тщательно перемешивали. К полученной смеси добавляли равный объем физиологического раствора и перемешивали еще 10 мин. Суспензию сливали в узкогорлую колбу на 50 мл, добавляли 1 мл углеводорода (керосин), закрывали плотно резиновой пробкой и энергично встряхивали 10-15 минут. Добавляли в колбу дистиллированной воды до горлышка и оставляли смесь при комнатной температуре на 2 часа. По истечении этого времени с поверхности жидкости отбирали сливкообразный слой, помещали его в центрифужную пробирку, центрифугировали при 8000 об/мин 20 минут. Жидкую фазу сливали, а плотную (пленку) заливали, двойным объемом ацетона и выдерживали при 37°С 30-40 минут. После центрифугирования при 4000 об/мин 20 минут ацетон сливали. Этот процесс повторяли дважды. Выделенные фракции после высушивания при комнатной температуре обрабатывали ДМСО и исследовали в ИФА.

Постановка нммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ (ИФА) по определению специфических антител к микобактериям осуществляли в непрямом варианте на полистироловых планшетах для иммунологических реакций по методу, описанному Woller А. et al. (1976).

В лунки планшета вносили по 100 мкл растворов антигенов в 0,01 M карбонатном буфере (рН 9,6) и инкубировали 16-18 часов при комнатной температуре. После 3-х кратного промывания раствором для промывки в лунки вносили по 100 мкл исследуемых и контрольных сывороток разведенных в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с рН 7,3. Инкубировали 1 час при 37°С и промывали 3-4 раза. После этого в лунки вносили по 100 мкл конъюгата, разведенного в том же буфере. Инкубировали планшет в течение 30 мин при 37°С, промывали лунки планшета не менее 5 раз и вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата. После выдерживания планшет в течение 15 минут при 37°С, реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2н раствора серной кислоты в каждую лунку.

Учет результатов реакции ИФА проводили на вертикальном сканирующем спектрофотометре. Для оценки результатов реакции использовали коэффициент специфичности (К), который равняется отношению величины оптической плотности исследуемой пробы (ОП0) на величину оптической плотности контрольной пробы (ОПк). Положительно реагирующими считали пробы с К более 2 при разведении 1:200.

Выделение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Циркулирующие иммунные комплексы были выделены методом преципитации в поли-этиленгликоле (ПЭГ). Пробы смешивали в соотношении 1 : I с 7% раствором ПЭГ-6000 в 0,1 M боратном буфере (рН 8,8), перемешивали и инкубировали при +4°С в течение 72-х часов. Преципитат осаждали центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и трижды промывали десятикратным объемом ПЭГ в концентрациях: 3,5%, 7% и 10,5% в боратном буфере. Выделенные иммунные комплексы растворяли в физиологическом растворе и изучали их активность в ИФА. Комплексы разбивали с предварительной инкубацией проб при 50°С в течение 2 часов.

Результаты исследований подвергали математической обработке на ПК с использованием программного комплекса Microsoft Excel 2000. Уровень достоверности полученных данных определяли по критерию Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Микобактериальные антигены и их свойства

Получены ДМСО антигены из автоклавированных клеток M.bovis, M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes, M.phlei, а также из живых микобактериальных культур M.bovis-14, M.bovis BCG, M.tuberculosis, M.intracellulare, M.avium, M.phlei. Оптимизирована технология выделения антигенных препаратов. Установлено, что наиболее специфичные антигены получаются при вторичной обработке микобактерий с 10% -й ДМСО.

3.1.1. Электрофоретическая подвижность и характеристика антигенных компонентов микобактерий

Проводили сравнительное изучение электрофореграмм клеточных лиза-тов, ДМСО-антигенов живых микобактерий, а также автоклавированных культур M.bovis, M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes, M.phlei.

Установлено, что электрофоретические фракции клеточных лизатов и ДМСО-антигенов живых микобактериальных культур в основном расположены в диапазоне от 10 до 125 кД, а их количество варьирует в зависимости от вида микобактерий. Интенсивно выраженные белковые компоненты расположены в диапазоне от 16 до 69 кД и количество их в этом диапазоне максимальное. Антиген-экстракты автоклавированных микобактерий имеют четко обозначенные фракции, большая часть которых располагается в диапазоне молекулярных масс 46,5 кД - 38,5 кД. Злектрофореграммы ДМСО-антигенов автоклавированных микобактерий на 12 - 16 фракций содержат меньше чем у ДМСО-антигенов и клеточных лизатов живых культур. Видимо, в процессе ав-токлавирования часть белковых фракций, в частности, обладающие высокими молекулярными массами, денатурируют. Полученные результаты соответствуют имеющимся литературным данным. Так, по данным Власенко В.В. (1999), при нагревании антигенов при Ш0°С в течение 60 минут денатурируются групповые антигены, а видоспецифические сохраняются.

3.1.2. Иммуноблот анализ сероактивных компонентов микобактери-альных антигенов

Выявление белкового спектра после фракционирования антигенных препаратов в ПААГ и изучение серологической активности электрофоретических компонентов проводили также после переноса белков на мембранные фильтры методом иммуноблот анализа. Использовали гипериммунные кроличьи антк-сыворотки к ДМСО-антигенам, а также сыворотки крови от больных туберкулезом людей и животных.

Иммуноблоты ДМСО-антнгенов автоклавированных мнкобактерий с гипериммунными сыворотками против гомологичных антигенов показали, что большинство сероактивных фракций располагаются в диапазоне от 20 до 65 кД. Количество иммуногенных фракций у разных антигенов по-разному, при этом - мажорных 5-6, а минорных до 10.Большинство общих для всех видов мнкобактерий антигенных фракций лежат в диапазонах 40-60кД и 20-35 кД. Полученные результаты могут быть использованы в дифференциальной диагностике туберкулеза.

Учитывая тот факт, что одной из основных проблем в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота является дифференциация неспецифических туберкулиновых реакций, проводили иммуноблотинг ДМСО-антигенов мнкобактерий с антисывороткой к антигену М.Ьоу1з, полученной на кроликах. Аналогичные работы проводились и другими исследователями. Например, по данным Ахметова Т.М. (1990) в клеточном лизате и ДМСО-антигене живых клеток М.Ьоу|'з сероактивными с родственной антисывороткой оказалось 7 фракций, среди которых специфической является фракция с молекулярной массой ЗОкД.

Иммуноблот анализ ДМСО-антигенов автоклавированных мнкобактерий проводился впервые. ДМСО-антигены живых и автоклавированных клеток М.Ъоу'я по молекулярным массам сероактивных компонентов не совпадают. Фракции с молекулярными массами 20, 30, 45, 50, 97 кД антигена автоклавиро-

ванных культур являются общими для всех исследованных видов микобакте-рий: M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes. Фракция с Мм 60 кД является характерной только для антигена M.bovis. Однако, на иммуноблотах антигенов с сыворотками от больных туберкулезом людей такая сероактивная фракция обнаружена и у антигена М.tuberculosis.

M.Amadori, S.Tameni et al., (1997), утверждают, что крупный рогатый скот, инфицированный M.bovis, имеет тенденцию к более выраженному иммунному ответу к антигенам с молекулярными массами 27, 60, 74кД. По результатам иммуноблота мы также обнаружили, что в ДМСО-антигене автокла-вированных M.bovis присутствуют сероактивные фракции с Мм 27 и 74кД. Однако они являются общими для всех исследованных видов микобактерий и относятся к минорным фракциям.

На иммуноблотах ДМСО-антигена M.bovis с сыворотками от коров, реагирующих на ППД туберкулин, из 12 проб только 3 реагировали, образуя мажорные фракции с антигеном Мм 60. Еще у 3 проб — минорные фракции в этой области. Остальные пробы проявили на иммуноблотах фракции различной интенсивности в диапазоне 20-30 и 70-200 кД, что больше соответствует иммунным сывороткам против микобактерий птичьего вида и нехромотогенной группы.

Таким образом, иммуноблот анализ ДМСО-антигенов автоклавирован-ных микобактерий, успешно может быть использован в прижизненной диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, а также туберкулеза у людей.

3.1.3. Антигенные свойства ППД туберкулинов и ДМСО-антигенов

На первом этапе работы проводили фракционирование и изучение антигенных свойств фракций ДМСО-антигенов и ППД-туберкулинов.

Для фракционирования микобактериальных антигенов выбрали ионообменную хроматографию на базе ДЕАЕ-целлюлозы. С каждого антигена получены более 100 фракций. Градиентное элюирование фракций антигенов с уве-

личением ионной силы раствора давало на регистраторе до 5 малых пиков, градиентное элюирование с увеличением pH раствора дало также до 5 малых и от одного до 3-х больших пиков.

Изучение специфичности полученных больших пиков в реакциях ИФА, с гипериммунными кроличьими сыворотками, показало наличие между ними выраженных перекрестных реакций. Следовательно, эти пики хроматограмм представляли собой неспецифические, балластные белковые фракции антигенов. Наибольшей активностью в ИФА обладали пики, полученные при градиентной элюции, связанной с увеличением ионной силы раствора. Наиболее специфичными у антигенов М.bovis является 25-я; M.scotochromogenes - 31-я; M.nonchromogenes ~ 38-я; М.avium - 46-я фракция. Они позволяли дифференцировать иммунные сыворотки к гомологичным микобактериальным антигенам в ИФА с коэффициентом специфичности более 5.

Секретируемые белки микобактерий играют важную роль в защитном иммунитете. Они связаны с клеточной стенкой и входят в состав пептидоглика-нового комплекс и могут быть использованы для идентификации микобактерий в двухмерном электрофорезе культуральной жидкости и методом вестерн-блотгинга (Ohara N, H.Kitaura et al., 1995).

Если учесть, что ППД-туберкулины представляют собой культуральные белки, то сравнительное изучение иммуногенности фракций ППД-туберкулинов представляют собой определенный практический интерес. В этих целях использовали гельфильтрацию насефадексе G-200.

Молекулярные веса полученных фракций составили: для фракций ДМСО - антигена от 10 до 100 кД ППД-туберкулина для млекопитающих - от 4 до 55 кД и для ГОТД-туберкулина для птиц - от 4 до 60 кД.

Методом непрямого твердофазного ИФА определяли специфичность каждой фракции. Наибольшей специфичностью обладали фракция №16 ДМСО-антигена M.Bovis, фракции №14 и 15 ППД-туберкулина для млекопитающих и фракция №18 ППД-туберкулина для птиц. Коэффициенты специфичности этих фракций со специфическими антителами составили от 3,5 до 3,8 и показывали

перекрестные реакции с К не более 2. Молекулярные массы у них составляет около 15 кД, т.е. они представляют собой низкомолекулярные белки, полипептиды.

Таким образом, гель-хроматография позволяет избавиться от балластных белков и выделить специфичные, иммуногенные фракции антигенов. Полученные специфичные фракции ППД-туберкулинов могут быть использованы в дифференциальной диагностике туберкулеза животных.

Против ДМСО-антигенов и ППД туберкулинов получали гипериммунные сыворотки на кроликах. Специфичность антисывороток изучали в ИФА против гомологичных антигенов. Результаты показали, что иммунизация животных ППД-туберкулинами не позволяет получать специфичные иммунные сыворотки. Антисыворотки, против ДМСО антигенов микобактерий, хотя и обладали специфичностью, между некоторыми видами наблюдались значительные перекрестные реакции.

При иммунизации кроликов против гомологичных микобактериальных антигенов образуются различные по специфичности антитела. Наиболее специфичные антитела образуются в более поздних сроках иммунизации, в нашем случае на 170 день. В начальных стадиях иммунизации титры неспецифических антител примерно на одном уровне со специфическими.

3.2. Иммуноферментный анализ для выявления микобактериальных антигенов в патологическом материале

Огромный практический интерес представляет возможности иммунофер-ментного анализа при обнаружении и типизации микобактериальных антигенов в патологическом материале. ИФА является потенциально ценным для ускоренного обнаружения микобактерий и их антигенов в тканевых пробах при отрицательных результатах гистологических исследований. Разноречивые литературные данные о диагностической ценности ИФА связано качеством используемых антигенов и низкой специфичностью применяемых иммунных сывороток.

3.2.1. Иммуносорбентная очистка иммунных сывороток

Разработана технология повышения специфичности иммунных сывороток к микобактериальным антигенам. Для этой цели использовали белково-глутаральдегидный иммуносорбент, приготовленный на основе методик Аугатеая Б., Тегпупск Т. (1969), Рпете1 Н. (1984). По этому методу берутся целые микробные клетки всех видов, кроме тех, против которых истощается сыворотка. Предварительно микобактериальную массу отмывали от питательной среды и обрабатывали ацетоном (см. «Получение антигена»). После подсушивания микробных клеток на воздухе протирали их в ступке и отбирали в химический стакан на 50 мл навеску 500 мг., добавляли из расчета 1:4 бычий сывороточный альбумин. Полученную массу растворяли в 25 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0. К раствору по каплям, при постоянном перемешивании добавляли 7,5 мл 2,5% раствора глутарового альдегида. Через 3 часа при комнатной температуре образуется гель. Гель гомогенизировали в 200 мл 0,2 М фосфатного буфера с рН 7,3. Полученную суспензию центрифугировали 15 мин при 1000 g. Частицы белка отмывали фосфатным буфером до тех пор, пока оптическая плотность смыва при 280нм не стало менее 0,01. Затем гель трижды суспендировали в 200 мл 0,1 М глицин-НС1 буфере с рН 2,8 и вновь в 200 мл фосфатного буфера. Процесс повторяли до тех пор, пока оптическая плотность смыва при 280 нм не стала равной нулю. Отмытый гель переносили в центрифужную пробирку и добавляли соответствующее количество антисыворотки. После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре оставляли на 2 часа в термостате при 37°С. Надосадочной фракцией повторяли эту процедуру со свежим иммуносорбентом 5 раз.

Качество полученных антисывороток изучали в ИФА. В результате проделанной работы нам удалось в несколько раз повысить специфичность иммунных сывороток. Перекрестные реакции между различными видами антисывороток в ИФА на гомологичные микобактериальные антигены наблюдали только в разведениях 1:100 - 1:150, в то время как специфические сыворотки против со-

ответствующих антигенов работали при иммуноферментном анализе, в разведениях свыше 1:30000.

Применение антисывороток к ДМСО-антигенам, истощенных белково-глутаральдегидным иммуносорбентом в ИФА, позволяло дифференцировать микобактериапьные антигены с коэффициентами специфичности от 3,6 до 4,5, что является достаточно высоким показателем позволяющим использовать их при типизации этих штаммов.

3.2.2. Тест-система иммуноферментиая для типизации микобактерий в патологическом материале

Известно, что чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа могут существенно изменяться при варьировании условий проведения эксперимента. Поэтому выбор оптимальной концентрации реагентов и определение основных условий для постановки реакции ИФА, обеспечивающих достижения максимальной точности и чувствительности анализа, имеет важное значение (Дзантиев Б.Б., 1979, Miller D.A., Williams E.D, 1980 и др.).

Исходя из имеющихся данных, указывающих на то, что адсорбция на полистирол определяется количеством и строением молекулы используемого антигена, было проведено исследование по определению оптимальной концентрации ДМСО-антигена при адсорбции в лунки иммунологического планшета. Установлено, что максимальная величина коэффициента специфичности отмечается при адсорбции антигена в концентрации 2 мкг/мл. Для полного представления возможностей ИФА при выявлении микобактерий M.bovis в патологическом материале определили чувствительность метода, что составляет 100 микробных клеток на мг ткани.

Результаты работ по изучению возможностей использования ИФА для выявления возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота в патологическом материале, а также по определению чувствительности метода проверялись межвузовскими комиссионными испытаниями (акт от 05.01.90). В опытах использовали кроличьи гипериммунные сыворотки к ДМСО-антигенам истощен-

ные белково-глутаральдегидным иммуносорбентом. В качестве испытуемого материала брали ткани заглоточных, средостенных и брыжеечных лимфоузлов от заведомо здоровых и больных туберкулезом коров.

Комиссия заключила, что антиген, полученный из инактивированной бактериальной массы М.bovis, позволяет получать видоспецифическую сыворотку, пригодную для выявления возбудителя туберкулеза в патологическом материале крупного рогатого скота методом ИФА. Метод иммуноферментного анализа с использованием иммунной сыворотки к антигену М.bovis пригоден для обнаружения и типизации возбудителя туберкулеза в патологическом материале крупного рогатого скота.

На основании полученных результатов сконструирована тест-система иммуноферментная для индикации и дифференциации микобактерий в патологическом материале. Тест-система состоит из следующих компонентов: планшеты полистироловые для иммунологических реакций; положительные контрольные антигены - ДМСО-антигены M.bovis, M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes, M.phlei; положительные сыворотки - кроличьи антисыворотки против указанных микобактерий; отрицательная сыворотка; компоненты буферных растворов для разведения реагентов тест-системы; конъюгат, антивидовой иммунопероксидазный против антител кролика; ортофенилендиамин и стоп-реагент. Разработаны методические рекомендации по приготовлению реагентов тест-сксгемы, постановке реакции, оценке и интерпретации результатов анализа, которые утверждены на научно-техническом Совете КВИ (протокол №5 от 22.05.92).

Апробируя данную методику, проводили исследование патологического материала от 69 голов крупного рогатого скота, убитых на Казанском мясокомбинате. 33 пробы получены от реагирующих и 36 проб от нереагирующих на ППД туберкулин, но имеющие высокие титры сывороточных антител против M.bovis в ИФА.

При убое 33 голов крупного рогатого скота из группы положительно реагирующих на туберкулин, у 18 обнаружены характерные для туберкулеза пато-

логоанатомические изменения, а при анализе методом ИФА патматериапа дополнительно было выявлено еще 5 голов животных больных туберкулезом. В 5 случаях из тканей органов, с выраженным туберкулезным процессом, не удалось выделить микобактериальный антиген.

12 проб сыворотки крови этих же 33 животных показали отрицательные результаты при иммуноферментном анализе сывороток крови. Результаты па-талогоанатомического исследования и ИФА патматериапа показали отсутствие возбудителя туберкулеза в 10 из них. В двух случаях были обнаружены характерные для туберкулеза патологоанатомические изменения в средостенных лимфоузлах.

При убое 36 голов нереагирующих на туберкулин коров, но имеющих высокие титры специфических антител против M.bovis при ИФА, у 18 голов обнаружены характерные для туберкулеза изменения в лимфоузлах. В 11 случаях без видимых патологоанатомических изменений реакция в ИФА на обнаружение антигена M.bovis была положительной. Полученные данные подтверждены бактериологическими исследованиями в Республиканской ветеринарной лаборатории.

3.3. Иммуноферментнын анализ для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.

Изучая эффективность ИФА, и определяя его место в комплексе диагностических мероприятий при туберкулезе, исследовали пробы сывороток крови коров из различных по эпизоотической ситуации хозяйств.

Всего исследовано 4044 пробы, в том числе из благополучных по туберкулезу хозяйств - 1274, из неблагополучных - 2770. В 23 хозяйствах, где за последние три года не выявлено ни одного животного реагирующего на туберкулин, результаты иммуноферментного анализа были отрицательными.

2425 проб сыворотки крови из неблагополучных хозяйств были исследованы иммуноферментным методом в сравнении с результатами аллергической

пробы у тех же животных, в том числе 643 проб - от реагирующих и 1782 - от не реагирующих на туберкулин животных.

При иммуноферментном анализе проб сывороток крови от реагирующих на туберкулин коров, в 297 обнаружены противотуберкулезные антитела в высоких титрах, а в 346 пробах получены отрицательные результаты (46,2% и 53,8% соответственно).

При анализе методом ИФА для выявления антител в пробах сывороток крови от нереагирующих на туберкулин коров получены следующие результаты: 158 проб (8,86%) - с положительной реакцией, 1624 проб (91,14%) - с отрицательной реакцией.

Для определения степени достоверности полученных данных производился контрольный убой животных и бактериологические исследования в Республиканской ветеринарной лаборатории.

Результаты патологоанатомических исследований 36 коров нереагирующих на туберкулин, но положительные в ИФА, показали, что у 18 голов имеются характерные для туберкулеза изменения в лимфоузлах. Результаты патологоанатомического исследования и бактериоскопии патматериала от 12 коров реагирующих на туберкулин, но отрицательные в ИФА подтвердили отсутствие возбудителя туберкулеза в 10 из них.

Таким образом, нашими исследованиями установлено, что иммунофер-ментный анализ сывороток крови животных дает дополнительную информацию к аллергическим исследованиям. Повышается эффективность диагностических мероприятий, что выражается в увеличении достоверности выявления больных туберкулезом животных до 93%.

На основании полученных результатов приготовлен «Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА», который предназначен для исследования сывороток крови животных с целью выяснения эпизоотической ситуации по туберкулезу в хозяйствах.

Набор препаратов включает в себя все необходимые компоненты для постановки ИФА и 5 планшетов с адсорбированными на них антигенами М.bovis. К набору препаратов прилагается упаковочный лист и наставление по применению. Срок хранения иммунологических планшет определен экспериментально и составляет 1 год при 4°С.

На основании приказа по Казанскому ордена Ленина ветеринарному институту им.Н.Э.Баумана от 16.01.91 за № 2 пригодность «Набора препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА» проверялась межвузовским комиссионным испытанием.

На основании анализа результатов комиссионных испытаний, комиссия заключила, что предлагаемый авторами «Набор для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА» пригоден по своему целевому назначению и метод ИФА может служить для получения дополнительной информации к аллергической диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.

3.3.1. Дифференциальная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота методом иммунофермеитиого анализа.

Разработан способ получения микобактериальных антигенов для прижизненной дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций вызванных атипичными микобактериями методом ИФА (ДМСОм-антиген). Предлагаемый нами модифицированный способ получения антигенов позволяет избавиться от большинства неспецифических белковых фракций. Об этом свидетельствует и результаты электрофоретического фракционирования белковых компонентов. На диск-электрофорезе в 12,5% ПААГ, ДМСО-м антигены показали четко обозначенные фракции, большая часть которых располагается в диапазоне молекулярных масс 30 - 50 кД. Электрофореграммы окрашивали азотнокислым серебром. В электрофореграммах окрашенных кумасси G 250 четко выраженных белковых фракций антигенов выявить не удалось.

В целях производственного испытания эффективности полученных антигенов в дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота проводили ИФА для выявления антител в сыворотках крови, реагирующих на туберкулин коров, из различных хозяйств РТ. Всего исследовано 852 пробы. Для подтверждения полученных данных совместно с ГУВ РТ и Республиканской ветеринарной лабораторией были проведены дополнительные лабораторные исследования.

В пробах сывороток крови коров из 5 хозяйств («Урожай», «Яш-Куч», «Чачаклинский», «Акбаш», «Каракашлы»), благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота, не обнаружены антитела против ни одного вида ми-кобактериальных антигенов. Следовательно, причиной положительных туберкулиновых реакций животных являются не микобактерии туберкулеза, что подтверждался лабораторными исследованиями.

В ряде благополучных по туберкулезу хозяйств, в сыворотках крови коров обнаружены в высоких титрах антитела против атипичных микобактерии.

В КП «Алан» Тюлячинского района причиной туберкулиновых реакций животных являлась зараженность микобактериями птичьего вида. Парааллер-гические реакции на туберкулин, обусловленные сенсибилизацией организма атипичными микобактериями, аналогичным способом было установлено ещё в 3-х хозяйствах «(Камско-Устьинский» Камско-Устьинского, КП «Уют» Сабинского, «Нижнекамский» Нижнекамского районов).

В 4-х хозяйствах (КП «Память Ленина» Буинского. КП «Южный» Бавлин-ского, КП «Овощевод» и КП «Зеленодольский» Зеленодольского районов) проведенные исследования показали, что в основе туберкулиновых реакций у животных лежит паразитарные заболевания. Однако большая часть положительных в ИФА проб реагировали скотохромогенной группы микобактерий.

Подтверждая наши результаты бактериологическими методами был установлен туберкулез крупного рогатого скота в 6 хозяйствах («Волга», «Искра» Буинского, «Красный Октябрь» Новошишминского, АПХ им.Горького Камско-

Устьинского, «Ерсубайкино» Альметьевского и в совхозе-техникуме Чистопольского районов).

В 3-х хозяйствах («Екатериновский», «Агроснаб», «Нур» Спасского района) несколько проб сывороток крови положительно реагировали с антигеном M.bovis, однако результаты наших исследований не нашли подтверждения.

В целом, обобщая полученные результаты, можно сказать, что иммуно-ферментный анализ с использованием микобактериальных антигенов, полученных по нашему способу, успешно может быть использован в прижизненной дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Специфичность составляет более 90%.

3.4 Диагностическая ценность ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота

Диагностическая ценность ИфА была изучена в сравнении с ПЦР с применением ДМСО(м)-антигенов микобакгерий и набора препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза. Всего исследовано 698 проб сывороток и крови крупного рогатого скота.

В целях сравнительного изучения эффективности ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза исследовано 88 проб сыворотки и крови от одних и тех же животных реагирующих на туберкулин.

На основании полученных результатов совместно с ГУВ и Республиканской ветеринарной лабораторией в хозяйствах «Ерсубайкино» и «Красный Октябрь» Новошишминского района был установлен туберкулез крупного рогатого скота.

Из благополучных по туберкулезу хозяйств (КП «Овощевод» и КП «Тукай» Зеленодольского района) все пробы были отрицательные как в ИФА, так и в ПЦР. 2 пробы, из 21 исследованных по КП «Агроснаб» Спасского района, дали положительные результаты на M.bovis в ИФА, а в ПЦР все пробы были отрицательные.

Изучая сравнительную эффективность аллергической пробы, ПЦР и ИФА, с использованием ДМСОм-антигенов, исследовали 605 проб. Из благополучных по туберкулезу хозяйств - 288 проб сывороток и крови коров реагирующих на ППД, в т.ч. 50 - с отрицательной реакцией и 233 - с положительной реакцией в ИФА на атипичные микобактерии. Результаты ИФА и ПЦР в целом, совпали. Так, 50 проб отрицательные в ИФА в ПЦР также были отрицательные. Из 233 проб с положительной реакцией в ИФА на атипичные микобактерии 21 проба сывороток крови из 3-х хозяйств положительно реагировали на М.bovis. ПЦР крови от этих же животных показала положительные результаты только в пробах из хозяйства «Искра» Буинского района. Контрольно-диагностический убой коров и лабораторные исследования подтвердили результаты ПЦР.

Из неблагополучных по туберкулезу хозяйств было исследовано 322 пробы, в том числе 251 проба - от реагирующих и 71 - от нереагирующих на туберкулин животных. В данном случае результаты ИФА сывороток крови и ПЦР проб крови, совпали.

Полученные данные свидетельствуют о том, что по обнаружению противотуберкулезных сывороточных антител методом ИФА, не всегда удается диагностировать туберкулез. ПЦР в этом отношении является более чувствительным и специфичным. Однако, иммуноферментный анализ может помочь в определении статуса стада коров по туберкулезу, позволяя исключить туберкулез у части реагирующих на ППД, а также выявить больных туберкулезом из числа не реагирующих на ППД коров.

3.5. Иммуноферментный анализ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота

Диагностические исследования ВЛКРС-инфекций в РФ представлены, главным образом, реакцией иммунодиффузии в геле (РИД), тогда как в странах Европы и Америки широко применяется иммуноферментный анализ.

Важным преимуществом иммуноферментных методов перед РИД является то, что ИФА будучи более чувствительным позволяет выявлять специфические антитела в пробах молока и сборного молока. Если учесть простоту и доступность данного метода, то ИФА для выявления антител в пробах молока может стать важнейшим элементом в системе противолейкозных мероприятий в хозяйствах.

3.5.1. Диагностическая ценность ИФА для выявления антител в сыворотке крови и молоке при лейкозе крупного рогатого скота

В целях сравнительного изучения эффективности РИД и ИФА в диагностике лейкоза крупного рогатого скота исследовали 139 проб сыворотки крови, в том числе 96 проб положительные и 43 пробы отрицательные в РИД. Результаты исследований подтвердили более высокую чувствительность иммунофер-ментного анализа. 5 проб отрицательные в РИД, в ИФА показали положительные результаты.

Проводили сравнительный анализ эффективности ИФА для выявления специфических антител в пробах сыворотки крови и молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота относительно РИД исследованиям. Всего исследовано 35 проб сыворотки крови и молока от одних и тех же коров из хозяйств «Шингальчи» Нижнекамского района и «Кургуза» Верхне-Услонского района.

Полученные результаты свидетельствуют о более низкой эффективности ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота по сравнению с ИФА сывороток крови. ИФА для выявления специфических антител в молоке менее чувствителен и по сравнению с РИД анализом.

3.5.2. Диагностическое значение иммунных комплексов при лейкозе крупного рогатого скота

Возбудитель лейкоза крупного рогатого скота - РНК-содержащий вирус из семейства ЯейхтгЫае. При хронических инфекциях, вызванных вирусами этого семейства, в биологических жидкостях организма появляются иммунные

комплексы «антиген-антитело». Эти иммунные комплексы в результате взаимодействия с Fc-рецепторами поглощаются макрофагами, в которых вирус восстанавливает свою инфекционность (Абелян A.B., 1977). Вполне возможно, что одна из причин «феномена рецидивов» ВЛКРС инфекций в ранее оздоровленных стадах именно в этом.

Для исследований по обнаружению ЦИК, методом случайной выборки были отобраны, из числа положительно реагирующих в ИФА, по 30 проб сыворотки крови и молока. Циркулирующие иммунные комплексы были выделены методом преципитации в ПЭГ. Действие ПЭГ на белковые растворы сходно с действием органических растворителей, которые могут вызвать осаждение наряду с иммунными комплексами и свободных иммуноглобулинов. Поэтому проводили исследование по определению титра анти-ВЛКРС антител в пуле сывороток крови и молока до и после обработки с ПЭГ-6000. В результате было установлено, что после осаждения ЦИК из пула сывороток крови и молока 7%-ным раствором ПЭГ титры противолейкозных антител в ИФА не изменялись и были равны титрам антител в исходной пробе.

С целью выяснения структуры выделенных иммунных комплексов проводили ПЦР анализ на наличие в них провирусной ДНК с использованием двух тест-систем. Всего было исследовано 51 проба от серопозитивных животных. Из них 38 - с использованием тест-системы «Лейкоз-КРС-Провирус» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, ФГУН ЦНИИЭ - фирмы «Ампли-Сенс, Gene Pak (фирмы «Биоком»), 13 - с использованием тест-системы «Лейкоз» для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС) методом по-лимеразной цепной реакции, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г.Москва. Согласно инструкциям тест-систем положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу на уровне 444 и 294 п.н. большей или меньшей интенсивности соответственно. 24 пробы иммунных комплексов из 38 исследованных первой тест-системой и 8 из 13 исследованных второй тест-системой содержали провирусную ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Факт обнаружения иммунных комплексов, включающие в себя провирус-ные ДНК, выявляет новые аспекты патогенеза данного заболевания. Возможно, открыт новый способ распространения инфекции в организме. Провирус в составе ЦИК может путем фагоцитоза попасть в клетку и в процессе очередного кроссинговера ДНК встроиться в геном клетки. В результате таких событий зона поражения инфекцией организма путем митоза клетки может быстро расшириться.

Согласно исследованиям, проведенным Митиным Ю.А. (1997) подобные иммунные комплексы обладают низкой температурной устойчивостью и могут разрушаться в диапазоне от +38°С до +40°С (время инкубации от 30 минут до 2-х часов). Учитывая этот факт и целью выявления «скрытых» противовирусных антител, которые до этого находились в составе циркулирующих иммунных комплексов, мы в своей работе инкубировали пробы молока и сыворотки крови при 50°С в течение 2-х часов и определяли изменение титров антител.

Предварительные исследования, проведенные на 6 пробах сыворотки крови и молока от одних и тех же коров, показали, что после инкубирования во всех пробах титры свободных антител увеличились, и показания в ИФА повысились от 2 до 41 единицы.

В целях проверки достоверности полученных результатов были проведены исследования на большем количестве производственного материала.

Исследованы пробы сыворотки крови и молока коров из хозяйств Зеленодольского и Нижнекамского районов. Процент инфицированности животных в этих районах составляет, соответственно, 18,8 и 44%, а больных 2,9 и 2,3%. Пробы сывороток крови и молока получены от одних и тех же коров. Всего исследованы по 92 пробы.

53 пробы сыворотки крови были положительные в ИФА до и после термической обработки. Однако внутри этой группы обнаруживается увеличение титров анти-ВЛКРС антител после инкубации. Только в трех случаях титры антител до и после инкубации остались неизменными. Пробы молока от этих же коров показали положительные результаты только в 45 случаях. Однако, после

инкубации при 50°С в течение 2-х часов все пробы молока оказались положительными в ИФА. Таким образом, в данном случае чувствительность ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота составила, по сравнению с ИФА сывороток крови, 85%.

Из 38 проб сывороток крови с отрицательной реакцией в ИФА после инкубирования 13 стали положительными. 33 проб молока от этих же 38 коров до нагревания также были отрицательные. После нагревания 28 - отрицательные, 10 - положительные.

Увеличение титров свободных антител после инкубирования можно объяснить диссоциацией иммунных комплексов и спецификой динамики образования антител и иммунных комплексов при лейкозе.

Определение специфичных антител в составе иммунных комплексов позволяет увеличить достоверность выявления больных лейкозом животных по сравнению с традиционно применяемым методом обнаружения свободных антител в сыворотке крови и молоке. Диссоциация иммунных комплексов, проведенная при температуре 50°С в течение 2-х часов, обеспечивает повышение чувствительности ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке до 20%. Данный способ открывает перспективы для более широкого применения ИФА молока для диагностики лейкоза.

На основании полученных результатов разработан метод ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке с предварительной диссоциацией ЦИК в пробах. Для определения диагностической ценности данного метода исследовали пробы молока из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств. Всего исследовано 295 проб молока отрицательно и положительно реагирующих в РИД коров. ИФА ставили: 1). согласно наставления по применению набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота НПО «НАРВАК»; 2). с предварительной диссоциацией ЦИК по предложенной методике.

50 проб молока, полученные из благополучных по лейкозу хозяйств, в иммуноферментном анализе во всех случаях показали отрицательные результа-

ты. Результаты исследований проб полученных из неблагополучных хозяйств представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Сравнительная эффективность ИФА для выявления антител в молоке и РИД в диагностике лейкоза крупного рогатого скота

РИД Всего проб ИФА без обработки проб ИФА с обработкой проб

Полож. % Отр. % Полож. % Отр. %

Положит. 177 136 77 41 23 165 93 12 7

Отрицат. 68 9 13 59 87 11 16 57 84

Из 177 проб молока от положительно реагирующих в РИД коров без предварительной обработки 41 прореагировало отрицательно, что свидетельствуют о более низкой эффективности ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота по сравнению с РИД.

ИФА с предварительной диссоциацией ЦИК в пробах гораздо чувствительнее и не уступает РИД исследованиям сывороток крови. Как видно из представленных данных, ИФА для выявления антител в молоке по предложенной методике дополнительно выявляет инфицированных животных из числа РИД отрицательных, что имеет важное значение в системе оздоровительных от лейкоза мероприятий.

3.6. Диагностическая ценность ПЦР для выявления провирусной ДНК ВЛКРС в молоке

Исследовали 136 проб молока коров положительно реагирующих в РИД из неблагополучных по лейкозу хозяйств РТ. Пробы молока получены от коров инфицированного ВЛКРС стада со стабильной гематологической картиной на разных стадиях развития инфекционного процесса. Выделили 3 условные группы проб: 1) пробы молока коров реагировавших в РИД впервые; 2) через год после первой реакции; 3) в более поздних сроках развития инфекции.

В иммуноферментном анализе с предварительной диссоциацией ЦИК все пробы молока были положительными. ПЦР на обнаружение провируса в лей-

коцитах содержащихся в молоке показала положительные результаты в 37 пробах (27%). В дальнейшем из этих проб молока были выделены иммунные комплексы и проведен ПЦР анализ. Результаты исследований показали, что в 12 из них содержится провирусная ДНК и 9 из них относится к пробам третий, 3 -второй группы.

Роль провирус содержащих иммунных комплексов в патогенезе ВЛКРС инфекции не изучена. Очевиден тот факт, что появляются они в более поздних стадиях болезни при выраженной вирусемии организма, когда животное становится потенциально опасным источником заражения стада. Гематологические изменения в этот период могут оставаться стабильными.

Определяли влияния термической обработки молока в различных температурных режимах на выявляемость провирусной ДНК ВЛКРС полимеразной цепной реакцией. Исследовали 36 проб молока от больных лейкозом коров из неблагополучных хозяйств. В 10 пробах нативного молока (28%) и в 12 пробах выделенных из него ЦИК (33%) обнаружили провирусную ДНК. В 7 пробах молока провирусная ДНК выявлена как в соматических клетках, так и в ЦИК. В дальнейшем эти пробы молока подвергли термической обработке в 3-х режимах и исследовали в ПЦР.

Во всех 7 пробах молока, подвергнутых пастеризации и в 5 пробах из 7 после 5 минутного кипячения, обнаруживали провирусную ДНК. Пробы молока, подвергнутые 10 минутному кипячению, были свободны от провирусной ДНК ВЛКРС. Однако, при исследовании поверхностных пленок, образовавшихся после кипячения этих проб, ПЦР-анализ показал положительные результаты.

Влияние генетического материала ВЛКРС, содержащегося в молоке, на организм человека мало изучено. Тем более мало известно о нативных свойствах провирусной ДНК после пастеризации и кипячения молока, что должно стать объектом дальнейших научных исследований.

3.7. Динамика изменения титров антител против антигена gp51 у инфицированных ВЛКРС животных

Для выполнения поставленной задачи формировали опытную группу коров из 12 голов на базе ООО «Правда» Высокогорского района РТ.

Из них 2 головы гематологически больные, а остальные положительно реагирующие по РИД. Наблюдения велись в течение полугода. Титры связанных и свободных антител в исследуемых пробах определялись методом имму-ноферментного анализа через каждые две недели.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что изменения титров противолейкозных антител, в сыворотке крови естественно инфицированных ВЛКРС коров, значительно отличаются от данных экспериментального заражения. По данным Ивановой Л. (2ООО), при экспериментальном заражении коров вирусом лейкоза алгоритм изменения титров антител равен трем месяцам, а при естественном заражении он оказался разным.

За период исследования титры сывороточных антител в отдельных пробах оставались неизменными как в достаточно высоких, так и в относительно низких уровнях. Однако, в целом изменения титров антител в пробах происходили синусоидально.

Титры антител в молоке инфицированных коров не коррелируют с таковыми в сыворотке крови, что, по-видимому, обусловлено различиями качественного спектра антител в сыворотке крови и молоке.

Титры антител, как в молоке, так и в сыворотке крови у гематологически больных животных достоверно снижаются по мере развития болезни.

Сравнивая титры свободных и «связанных» антител в сыворотке крови можно сказать, что они с развитием болезни меняются, и прослеживается взаимосвязь между ними. При уменьшении титров свободных антител наблюдается, в большинстве случаев, увеличение титров «связанных» антител, т.е. повышается степень образования циркулирующих иммунных комплексов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что разовые серологические тесты в диагностике лейкоза крупного рогатого скота могут быть не достаточно эффективными. Изучение динамики образования иммунных комплексов раскрывают перспективы совершенствования ранней диагностики лейкоза животных.

3.8. Динамика антителогенеза у крупного рогатого скота к различным структурным компонентам вируса лейкоза

Для изучения изменения спектра антител с развитием болезни, проводили перекрестные исследования сывороток крови методом ИФА и иммуноблотана-лиза с антигенами вируса иммунодефицита человека.

В этих целях отобрали 25 проб сыворотки крови из числа положительно реагирующих в ИФА на лейкоз и исследовали «Тест-системой иммунофер-ментной для выявления антител к вирусам иммунодефицита человека 1 и 2 типов» производства ЗАО «Вектор-бест».

В результате 16 проб сывороток крови крупного рогатого скота показали положительную реакцию, с титрами антител к антигенам ВИЧ до 1:256. Титры специфических антител на gp51 ВЛКРС этих же проб составляли до 1:729.

С использованием «Набора для выявления антител к ВЛКРС» были исследованы сыворотки крови от ВИЧ-инфецированных людей. Из 20 исследованных проб только 3 показали отрицательные результаты.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ёр51 ВЛКРС обладает достаточно высокой гомологичностью белкам ВИЧ.

Однако между титрами антител против §р51 ВЛКРС и титрами антител реагирующих с белками ВИЧ, в сыворотках крови коров, больных лейкозом, закономерной взаимосвязи не просматривается. Более того, некоторые пробы с низкими титрами противолейкозных антител обнаруживают более высокие титры антител в ИФА на ВИЧ антигены. Полученные данные еще раз подтверждают то, что развитие лейкоза крупного рогатого скота сопровождается как

количественным, так и качественным изменением спектра специфических антител.

Изучение спектра антител в пробах сывороток крови коров проводили методом иммуноблоттинга на все структурные белки ВИЧ. На рисунке 1 представлены денситограммы иммунноблотграмм сероактивных полипептидов ВИЧ с положительными к ёр51 ВЛКРС сыворотками на разной стадии развития инфекции.

р24

А Б

№331 Ы' р40

В Г

Рис.1. Денситограммы иммуноблотограмм сероактивных полипептидов ВИЧ с положительными к §р51 ВЛКРС сыворотками на разной стадии развития инфекции

Обозначения: А - сыворотка крови коровы в начальной стадии инфекции, впервые реагировавшей на РИД положительно; Б, В - сыворотка крови коров в более поздних стадиях болезни; Г - сыворотка крови гематологически больной коровы;

В начальных стадиях развития болезни в сыворотки крови животных появляются антитела перекрестно реагирующие с антигенами ВИЧ р40, р25. В более поздних сроках - с р55, р97, §р120. СР120 ВИЧ - гликопротеин оболочки и соответствует gp51 ВЛКРС.

Таким образом, приведенные данные доказывают, что на разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр сывороточных антител меняется.

№274 -

р40 р24

ЬН|У

41

выводы

1. Комплекс диагностических мероприятий при туберкулезе и лейкозе крупного рогатого скота должен включать иммунохимические и молекулярно-генетические методы исследований.

2. Антигены от вирулентных и инактивированных микобактерий имеют разный электрофоретический профиль белковых фракций. Большинство сероактивных фракций ДМСО-антигенов микобактериальных культур располагаются в диапазоне от 20 до 65 кД. Серопозитивная фракция с Мм 60кД отмечается только в антигенных препаратах М.Ытэ и М.ШЬегсик^Б, что позволяет дифференцировать их от других микобактериальных культур.

3. Антисыворотки, полученные против микобактериальных антигенов и истощенные с использованием белково-глутаральдегидных иммуносорбен-тов, обладают высокой специфичностью. Использование антисывороток в ИФА позволяет дифференцировать микобактериальные антигены с коэффициентами специфичности от 3,6 до 4,5.

4. Нммуноферментный анализ сывороток крови животных дает дополнительную информацию к аллергическим исследованиям, повышается эффективность диагностических мероприятий. Если наряду с аллергическим методом диагностики туберкулеза применять и нммуноферментный метод анализа сывороток крови, то степень достоверно выявленных больных туберкулезом животных составляет 92%.

5. Микобактериальные антигены (ДМСОм-антиген), полученные по предложенному способу, позволяют дифференцировать в ИФА неспецифические реакции на туберкулин, вызванные атипичными микобактериями со специфичностью более 90%.

6. ИФА и ПЦР являются высокоточными методами диагностики туберкулеза. ИФА, как более массовый метод, перспективен в определении статуса стада коров по туберкулезу, позволяет исключить туберкулез у части реагирующих на ППД, а также выявить больных туберкулезом из числа нереаги-рующих на ППД коров в неблагополучных хозяйствах.

7. Значительная часть антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота находится в циркулирующих иммунных комплексах. Титры свободных и «связанных» в ЦИК антител в сыворотке крови с развитием болезни меняются. Изучение динамики образования иммунных комплексов свидетельствует о том, что разовые серологические тесты в диагностике лейкоза крупного рогатого скота не достаточно эффективны. В оздоравливаемых от лейкоза хозяйствах необходимо проводить двукратные (с интервалом в 2-3 месяца) исследования сывороток крови методом ИФА с предварительной диссоциацией иммунных комплексов в пробах.

8. Разработанный способ диссоциации иммунных комплексов в пробах сыворотки крови и молока позволяет повысить чувствительность методов ИФА до 20%. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом ИФА для выявления специфических антител в молоке, с предварительной диссоциацией ЦИК, не уступает по чувствительности и специфичности современным узаконенным методам диагностики этой инфекции. Данный метод, как экономически более выгодный, может применяться для мониторинга эпизоотической ситуации в хозяйствах.

9. В сыворотке крови и молоке инфицированных ВЛКРС коров выявляются иммунные комплексы, содержащие провирусные ДНК. Провирус содержащие иммунные комплексы появляются, в основном, в более поздних стадиях болезни, когда животное становится потенциально опасным источником перезаражения стада. Гематологические изменения в этот период могут оставаться стабильными. Поэтому при лейкозе крупного рогатого скота окончательная постановка диагноза должна быть направлена на обнаружение ДНК вируса в ЦИК методом ПЦР.

10. Обнаружение в молоке от инфицированных ВЛКРС коров циркулирующие иммунные комплексы, содержащие провирусную ДНК, а также специфических антител связанные в иммунных комплексах, являются важным критерием для оценки контаминации сборного молока в лабораториях предприятий по переработке молока и молочных продуктов.

11. Антитела против антигенов BJ1KPC обладают гомологичностью белкам гена gag ВИЧ в иммунохимической реакции. Степень гомологии анти-ВЛКРС антител к полипептидам ВИЧ резко меняется с развитием инфекционного процесса. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр свободно циркулирующих в сыворотке крови антител меняется, что свидетельствует о недостаточной эффективности серологических методов, основанных на выявление антител только против одного антигена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации по оценке контаминации молока вирусом лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные научно-техническим советом ФГОУ ВПО «КГАВМ» и ученым советом ГНУ ВНИИВСГЭ и секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2011);

2. Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА) молока, утвержденные научно-техническим советом ФГОУ ВПО «КГАВМ», Главного управления ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан и представленные в Федеральную службу по ветеринарному и фитосанитарно-му надзору МСХ РФ для утверждения в установленном порядке (2011);

3. Методические рекомендации по дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота методом ИФА, утвержденные научно-техническим советом ФГОУ ВПО «КГАВМ», Главного управления ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан и представленные в Федеральную службу по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ РФ для утверждения в установленном порядке (2011);

4. Методические рекомендации по диагностике лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа сыворотки крови и молока, утвержденные научно-техническим советом Главного управления ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан (2008);

5. Тест-система иммуноферментная для выявления специфических антител против микобактерий (методические рекомендации, утв. НТС КВИ, 1993);

6. Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий (методические рекомендации, утв. НТС КВИ, 1993);

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Якупов Т.Р. Выявление специфических антител против микобактерий в сыворотке крови крупного рогатого скота методом ИФА/ Т.Р.Якупов// Материалы республиканской научно-производственной конференции «Достижения ветеринарных и зоотехнических наук в животноводство».- Казань, 1989.- С.38.

2. Якупов Т.Р. Возможности использования метода ИФА для выявления возбудителя туберкулеза в патологическом материале и определение его чувствительности/ Т.Р.Якупов// Материалы республиканской научно-производственной конференции «Животноводству - комплексную программу развития»,- Казань, 1990,- С.66.

3. Хафизов Ш.Х. Динамика титра антител в сыворотке крови коров экспериментально зараженных туберкулезом после иммунизации вакциной БЦЖ// Ш.Х.Хафизов, М.Ш.Зайдуллин, Т.Р.Якупов// Материалы республиканской научно-производственной конференции «Животноводству — комплексную программу развития».-Казань, 1990 -С.61.

4. Якупов Т.Р. Выявление и типизация возбудителя туберкулеза иммуно-ферментным методом / Т.Р.Якупов // Материалы Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине» - Н.Новгород, 1990 - С.142-143.

5. Якупов Т.Р. Белково-глутарапьдегидный метод очистки иммунной сыворотки против М/bovis/ Т.Р.Якупов, Р.П.Тюрикова // Удостоверение на рац. Предложение,- №314.- Казань, 1991.

6. Якупов Т.Р. ИФА - в прижизненной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Т.Р. Якупов, В.И. Шилова // Материалы межвузовской науч-

но-практической конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс с/х производства».- Ставрополь, 1991. -С.133-134.

7. Хазипов Н.З. Иммуноферментный анализ сыворотки крови крупного рогатого скота в диагностике туберкулеза / Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, Т.Р. Якупов, A.A. Нуруллин // Межвузовский сборник научных трудов КВИ «Эффективные меры борьбы с туберкулезом с/х животных». - Казань, 1991. - С.3-9.

8. .Якупов Т.Р. Получение высокоспецифических иммунных сывороток против антигенов М.bovis, М.avium, M.phlei и др. / Т.Р. Якупов, Р.П. Тюрикова // Материалы научно-практической конференции «Достижения Казанской ветеринарной школы в практику животноводства». - Казань, 1991 - С. 10-11.

9. Якупов Т.Р. Иммуноферментный анализ в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота: Дис.... канд. вет. наук/Т.Р. Якупов; КГВИ. - К., 1991 - 127с.

10. Якупов Т.Р. Иммуноферментный анализ в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота: Автореф. дис. ... канд. вет. наук / Т.Р. Якупов; КГВИ. -К., 1991.- 17с.

11. Якупов Т.Р. Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота / Т.Р. Якупов, Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, М.А. Сафин // Материалы научно-практической конференции. - Казань, 1993. - С.32-33.

12. Хазипов Н.З. Антигенная структура микобактерий М.bovis / Н.З.Хазипов, Р.П. Тюрикова, Т.Р. Якупов, Т.М. Ахметов // Тезисы стендовых сообщений II съезда биохимического общества РАН. - Пущино, 1997. - С.542-543,- Шифр 97-14028-2.

13. Якупов Т.Р. Метод иммуноферментного анализа в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Т.Р.Якупов, Р.П.Тюрикова, К.В.Усольцев // Материалы международной научной конференции, посвященной 125-летию КГАВМ. - Казань, 1998. - С. 127-128.

14. Якупов Т.Р. Сравнительная характеристика современных методов диагностики туберкулеза / Т.Р.Якупов, Т.М.Ахметов // Материалы республиканской научно-производственной конференции «Молодые ученые - агропромышленному комплексу». - Казань, 1998 - С.68-69.

15. Якупов Т.Р. Роль специфических антител в диагностике туберкулеза / Т.Р.Якупов, Р.А.Хамзин, К.В.Усольцев // Проблемы инфек. и инваз. болезней в животноводстве на современном этапе. - МВА им. Скрябина, 1999. - С. 146-148.

16. Якупов Т.Р. Диагностическое значение определения противотуберкулезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота методом иммуно-ферментного анализа /Т.Р.Якупов, Р.А.Хамзин, К.В.Усольцев, А.А.Перлова // Материалы международной научно-производственной конф., посвященной 100-летию члена-корр. ВАСХНИЛ В,Т,Котова. - Воронеж, 1999 - С.132-134.

17. Якупов Т.Р. Сравнительная оценка эффективности ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза / Т.Р.Якупов, К.В.Усольцев// Материалы республиканской научно-производственной конференции. - Казань, 1999. - С.51-52.

18. Усольцев К.В. Изучение антигенной структуры микобактерий /.В.Усольцев, Т.Р.Якупов // Материалы Всероссийской конференции молодых ученых. АН РТ. - Казань, 2000 - С.42-43.

19. Якупов Т.Р. Эффективность ИФА сывороток крови в системе диагностических мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота / Т.Р.Якупов, К.В.Усольцев // Материалы международной научной конференции, посвященной 70-летию зооинженерного факультета Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана. - Казань, 2000. - С. 140-144.

20. Якупов Т.Р. Иммунофермент ысулын кулланып эре мегезле терлеклэрдэ туберкулезга диагноз кую турында / Т.Р.Якупов // Наука и язык.-2000.-№2, С.51-52.

21. Якупов Т.Р. Совершенствование способа получения микобактериаль-ных / Т.Р.Якупов, Н.З.Хазипов, К.С.Хаертдинов // Современные вопросы медицины и биологии. Сборник научных трудов БГАУ. - Уфа, 2000 - С.318-319.

22. Якупов Т.Р. ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота/ Т.Р.Якупов, К.В.Усольцев, А.Н.Аскарова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана. -Казань, 2002. - т. 172. - С.37-43.

23. Якупов Т.Р. Гель-хроматография ППД-туберкулина / Т.Р.Якупов // Материалы Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам Агропромышленного комплекса,- Казань, 2004- С.67-69.

24. Якупов Т.Р. Электрофоретические профили микобактериальных антигенов / Т.Р. Якупов, К.С. Хаертдинов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Казань, 2006. - С.66-68.

25. Волков А.Х. ИФА в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / А.Х. Волков, Т.Р. Якупов, В.А. Кокорев //Материалы Всероссийской научно-практической конференции,- Казань, 2006. - С.23-26.

26. Якупов Т.Р. Диагностическое значение иммунных комплексов при лейкозе крупного рогатого скота / Т.Р. Якупов, В.А. Кокорев, А.Х. Волков // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана. - Казань, 2007. - т. 128. - С.215-219.

27. Якупов Т.Р. Метод ИФА в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / Т.Р. Якупов, В.А. Кокорев, Ф.Ф. Зиннатов, А.Х.Волков // Материалы международной научной конференции "Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки" Троицк, 2007. - С.255-258.. -

28. Кокорев В.А. Показатели химического состава молока инфицированных ВЛКРС коров / В.А. Кокорев, А.Х. Волков, Т.Р. Якупов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции.- Казань, 2007.-С.112-113.

29. Якупов Т.Р. Обнаружение антител, общих к антигенам микобактерий и ВЛКРС / Т.Р. Якупов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции,- Казань, 2007. - С. 121-123.

30. Якупов Т.Р. Изучение активности антител против ВЛКРС в им-мунохимической реакции с антигенами ВИЧ / Т.Р. Якупов, Н.З. Хазипов, В.П. Коксин // Вятский медицинский вестник. - 2007, спецвыпуск. - № 4.- С.79-80.

31. Якупов Т.Р. Антигенное родство ВЛКРС с вирусами иммунодефицита человека / Т.Р. Якупов // Ветеринарный врач. -2008.- № 2,- С. 13-15.

32. Кокорев В.А. Изменение титров антител против антигена gp51 инфицированных ВЛКРС животных / В.А. Кокорев, Т.Р. Якупов, А.Х.Волков // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана.- Казань, 2008. -т.192.- С.83-84.

33. Хазипов Н.З. Внеклеточная провирусная ДНК лейкоза крупного рогатого скота в патогенезе инфекции / Н.З. Хазипов, Т.Р. Якупов, Ф.Ф. Зиннатов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана.- Казань, 2008.- т.192,- С.161-164.

34. Хазипов Н.З. Провирусная ДНК лейкоза крупного рогатого скота и ее роль в патогенезе инфекции / Н.З. Хазипов, Р.П.Тюрикова, Т.Р. Якупов, // Материалы 1У съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов,- Новосибирск, 2008.- С.505.

35. Хазипов Н.З. Внеклеточный провирус ВЛКРС в патогенезе лейкоза / Н.З.Хазипов, Р.П.Тюрикова, Т.Р. Якупов, Б.В. Камалов // Международная научно-практическая конференция «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии».- Москва, 2008,- С. 158.

36. Якупов Т.Р. Дифференциальная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа/Т.Р. Якупов, К.С. Хаер-тдинов, P.A. Хамзин и др.// Ветеринарный врач,- 2010,- № 6,- С.24-26.

37. Якупов Т.Р. Динамика изменений титров «свободных» и «связанных» антител у инфицированных ВЛКРС коров/ Т.Р.Якупов, Н.З.Хазипов// Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2009,- т.197.- С.150-154.

38. Якупов Т.Р. Возможности ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота/ Т.Р.Якупов, Н.З.Хазипов, А.М.Алимов, Б.В.Камалов// Ученые записки КГАВМ,- Казань, 2010,- т.201,- С. 133-136.

39. Якупов Т.Р. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа молока/ Т.Р.Якупов, Н.З.Хазипов, А.С.Козлов// «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии»,- 2009.- №4.-С.99-100.

40. Якупов Т.Р. Иммуноблот анализ в диагностике туберкулеза/ Т.Р.Якупов К.С.Хаертдинов// Ветеринарный врач.- 2011. -№1. - С.29-31

41. Зиннатов Ф.Ф. Диагностическая ценность выявления провирусной ДНК ВЛКРС в молоке/ Ф.Ф.Зиннатов, Т.Р.Якупов// «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии». - 2010.- №4,- С.21-22.

42. Якупов Т.Р. Новые подходы в диагностике лейкоза крупного рогатого скота/ Т.Р.Якупов// Ученые записки КГАВМ.- Казань, 2010,- т.204,- с.342-347.

43. Якупов Т.Р. Влияние термообработки молока на выявляемость провирусной ДНК ВЛКРС В ПЦР//А.М.Алимов, Т.Р.Якупов, И.Р.Гибадулина, А.Ю.Шаева// Ученые записки КГАВМ.- Казань, 2011. - т.205.- С.3-6.

44. Якупов Т.Р. Иммуноферментный анализ в диагностике туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота/ Т.Р.Якупов, А.М.Алимов, Н.З.Хазипов// Казань, 2011,- 148 с.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 06.04.2011 г. Печ.л.3,0 Заказ № К-7032. Тираж 100 экз. Формат 60x341/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.

Содержание диссертации, доктора ветеринарных наук, Якупов, Талгат Равилович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Антигенная структура микобактерий.

2.2. Иммунитет при туберкулезе.

2.3. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота.

2.3.1. Аллергическая диагностика и неспецифические реакции на туберкулин

2.3.2. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота иммуноферментным методом.

2.3.3. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза.

2.4. Антигенная структура вируса лейкоза крупного рогатого скота

2.5. Диагностика, профилактика и меры борьбы лейкозом крупного рогатого скота.

2.5.1. Иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция в диагностике лейкоза.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы и методы исследования.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Микобактериальные антигены и их свойства.

4.1.1. Электрофоретическая подвижность и характеристика антигенных компонентов микобактерий.

4.1.2. Иммуноблот анализ сероактивных компонентов микобактериальных антигенов.

4.1.3. Антигенные свойстваППД туберкулинов и ДМСО-антигенов

4.2. Иммуноферментный анализ для выявления микобактериальных антигенов в патологическом материале.

4.2.1. Иммуносорбентная очистка иммунных сывороток.

4.2.2. Тест — система иммунофернментная для типизации микобактерий в патологическом материале.

4.3. Иммуноферментный анализ для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота

4.3.1. Дифференциальная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

4.4. Диагностическая ценность ЙФА и ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.

4.5. Иммуноферментный анализ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

4.5.1. Диагностическая ценность ИФА для выявления антител в сыворотоке крови и молоке при лейкозе крупного рогатого скота.

4.5.2. Диагностическое значение иммунных комплексов при лейкозе крупного рогатого скота.

4.6. Диагностическая ценность ПЦР для выявления провирусной ДНК ВЛКРС в молоке.

4.7. Динамика изменения титров антител против антигена gp51 инфицированных ВЛКРС животных.

4.8. Динамика антителогенеза у крупного рогатого скота к различным структурным компонентам вируса лейкоза.

5. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Молекулярно-генетические и иммунохимические методы в диагностике, индикации и идентификации возбудителей туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота"

Туберкулез и лейкоз крупного рогатого скота наиболее распространенные хронические инфекции в животноводстве и представляют собой важные проблемы не только ветеринарной медицины, животноводства, но биологии и экологии в целом и имеющие непосредственное отношение к безопасности здоровья человека. На современном этапе борьбы с туберкулёзом и лейкозом животных, основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остаётся своевременная и точная диагностика этих инфекций.

Ветеринарная практика нашей страны располагает значительным числом средств и методов для эффективной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Следует отметить, что в плане диагностики туберкулеза отечественная ветеринарная наука проделала большой и сложный путь постоянного ее совершенствования. Огромный вклад в изучение эпизоотологии, диагностики и ликвидации туберкулеза сельскохозяйственных животных внесли такие ученые как П.П.Вишневский (1935), М.К.Юсковец (1963), О.В.Мартма (1971), В.П.Урбан (1980), М.А.Сафин (1981), Д.Д.Новак (1977, 1990), Н.М.Колычев (1992), А.С.Донченко (2002, 2004), В.Г.Ощепков (2001,2009), Н.А.Донченко (2008), А.Х.Найманов (1993, 2006, 2009) и другие.

Диагноз на туберкулез ставят комплексным методом на основе эпи-зоотологических, клинических, аллергических, патологоанатом и чески х и лабораторных исследований. Однако не возможно выделить какой-либо один метод диагностики туберкулеза, имеющий значительные преимущества перед другими, скорее они могут взаимодополнять друг друга и поэтому имеют право на существование (С.И.Татьков и др.,2006; В.А.Сазонов и др. 1996). По мнению А.М.Лысенко (1987), Е.В.Маслова (1986), M.Amadori (1998) и др., для диагностики туберкулеза животных наиболее перспективен иммуноферментный анализ, который позволяет ставить диагноз на туберкулез в лабораторных условиях одновременно у большого количества животных, прост в применении и обладает высокой чувствительностью и специфичностью. В связи с этим, получение и изучение антигенных и иммуногенных характеристик микобактериальных антигенов, специфических антител, возможностей их использования для диагностики туберкулеза, дифференциации неспецифических реакций животных на туберкулин в иммунохимических реакциях являются актуальной задачей для ветеринарной практики в плане повышения эффективности диагностики, индикации и идентификации возбудителей туберкулеза крупного рогатого скота.

Определение современными методами уровня и спектра противотуберкулезных антител далеко не исчерпало себя в качестве средства иммунодиагностики и характеристики особенностей течения туберкулеза, а сами противотуберкулезные антитела не достаточно используются для ха рактеристики микобактериальных антигенов, приготовления диагностику-мов и других целей (Л.Н.Черноусова и др., 1995, 2000). Разработка экспресс-методов индикации и идентификации возбудителя туберкулеза из биоматериала животных и дифференциации патогенных микобактерий от атипичных остается актуальной задачей научных исследований (А.Н.Шаров и др., 2000, 2003; М.С.Калмыкова, 2007). Более преспективной в этом отношении, наряду с методами иммуноферментного анализа, является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время, в диагсностике туберкулеза крупного рогатого скота и идентификации микобактерий, интенсивно разрабатываются различные подходы по применению ПЦР и других приемов генодиагностики (С.Н.Радюк, Г.Р.Мацевич, 1997; Е.Б.Вишневская, 1998; А.Н.Шаров, В.А.Седов, 1998; А.М.Алимов, 1999, 2000; А.Х.Найманов и др., 2004; Н.А.Донченко, 2008 и др.).

В структуре инфекционной патологии лейкоз крупного рогатого скота в РФ занимает лидирующее место и составляет более 50% от других нозологий (М.И.Гулюкин, 2005;). Широкая распространенность лейкоза крупного рогатого скота, отсутствие средств терапии и специфической профилактики определяют актуальность научных исследований по этой проблеме (Г.А.Симонян, 1980; В.А.Бусол и др., 1999; М.И.Гулюкин, 2000, 2002; Л.Г.Бурба, В.М.Нахмансон, А.Ф.Валихов, 1982; П.Н.Смирнов, 1998, 2005; И.М.Донник, 2005; М.А.Амироков, В.В.Храмцов 2007; А.М.Алимов, 2010).

Одним из приоритетных направлений исследований по изучению особенностей и закономерностей инфекционного процесса лейкоза крупного рогатого скота является разработка высокочувствительных методов прижизненной диагностики болезни (В.А.Бусол, 1999; О.А.Верховский и др., 2002; М.И.Гулюкин и др., 2002, 2005, 2007; П.Н.Смирнов, 2005; И.М.Донник и др., 2009. 2010).

В настоящее время, согласно стандартам МЭБ, узаконенными методами диагностики лейкоза крупного рогатого скота являются реакция им-мунодиффузии в геле агара и метод иммуноферментного анализа.

Важным преимуществом иммуноферментных методов, наряду с более высокой чувствительностью и специфичностью, является то, что ИФА позволяет выявлять специфические антитела в пробах сборного молока. Если учесть доступность и простоту выполнения, то ИФА для выявления специфических антител в пробах молока может стать важнейшим элементом в системе противолейкозных мероприятий в хозяйствах (У.К.^иуеп, Я.Р.Маез, 1992; .Т.М.Яагвеапг, О.Г.КеНоп е1 а1., 1997).

Весьма актуальной задачей является изучение иммунологических аспектов патогенеза лейкоза крупного рогатого скота. Определение динамики образования и спектра антител, идентификация и изучение состава иммунных комплексов способствуют расшифровке молекулярно-клеточных механизмов взаимодействия вируса лейкоза с макроорганизмом и объяснению особенностей патогенеза.

Результаты подобных исследований явятся основой для разработки новых высокоспецифичных и ранних методов выявления инфицированно-сти животных возбудителями туберкулеза и лейкоза, а также для создания более надежной системы мер борьбы с этими опасными инфекционными болезнями.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось усовершенствование иммунохимических и молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, а также средств индикации и идентификации возбудителей этих инфекций. В соответствии с целью решались следующие задачи:

- изучить антигенную структуру микобактерий и выявить наиболее специфичные антигенные компоненты;

- изыскать способы получения высокоспецифичных антигенов микобактерий и антител, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, и дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин методом ИФА;

- определить эффективность иммуноферментного анализа для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;

- определить диагностическую ценность ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;

- изучить динамику образования специфических антител и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови и молоке инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота;

- определить диагностическую ценность ПЦР для выявления прови-руспой ДНК ВЛКРС в ЦИК сыворотки крови и молока;

- разработать ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке, и определить его диагностическую ценность;

- изучить динамики антителогенеза у крупного рогатого скота к различным структурным компонентам вируса лейкоза;

Научная новизна. Иммунохимическими и биохимическими методами изучена антигенная структура микобактерий и разработаны способы получения высокоспецифичных антигенов из инактивированных культур и антител к ним, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин. Установлено, что особенности антителогенеза, диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе являются важными факторами повышения эффективности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Впервые разработан способ получения антигенов микобактерий, обеспечивающих дифференциальную диагностику туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа («Способ получения антигена для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота» - положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение от 12.08.2010г., заявка №2009112145).

Показана высокая информативность разработанного ИФА для выяснения эпизоотической ситуации хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота.

Разработана технология повышения специфичности иммунных сывороток к микобактериальным антигенам, обеспечивающая индикацию и дифференциацию микобактерий в патологическом материале методом иммуноферментного анализа («Белково-глутаральдегидный метод очистки иммунной сыворотки против М.Ьоуіб» — рационализаторское предложение №314-91 от 5.03.1991).

Разработан ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов в пробах («Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» - положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение от 26.01.2011г., заявка РФ №2010100016) и определена его диагностическая ценность. Установлено, что иммуноферментный анализ с предварительной диссоциацией иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке увеличивает выявляемость инфицированных ВЛКРС животных до 20%.

Впервые изучена динамика образования и спектр свободных антител и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке коров инфицированных ВЛКРС в естественных условиях. Установлено, что при уменьшении титров свободных антител в сыворотке крови повышается уровень циркулирующих иммунных комплексов. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр антител меняется. Данные факты свидетельствует о том, что разовые серологические тесты, основанные на выявление антител против только одного антигена, в диагностике лейкоза могут быть не эффективными.

Впервые методом полимеразной цепной реакции доказано присутствие в составе циркулирующих иммунных комплексов провирусной ДНК ВЛКРС, что расширяет представления о патогенезе инфекции и способствует дальнейшему совершенствованию методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы. Разработанный способ выделения специфических микобактериальных антигенов повышает эффективность прижизненной дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота иммунологическими методами.

Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА» и «Тест-система иммунофер-ментная для типизации микобактерий в патологическом материале» позволяют выяснить эпизоотическую ситуацию по туберкулезу в хозяйствах, и рекомендуются для включения в комплексную систему мероприятий по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота.

Разработанный иммуноблот анализ микобактериальных антигенов позволяет идентифицировать микобактерии и может быть использован в качестве дополнительного теста для диагностики туберкулеза.

Для повышения выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота целесообразно проводить ИФА с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов. Разработанный метод ИФА с предварительной диссоциацией ЦИК в исследуемых пробах открывает широкие перспективы для диагностики данной инфекции методом иммуноферментного анализа молока.

Обнаружение провирусную ДНК и специфических антител путем диссоциации циркулирующих иммунных комплексов повышает эффективное! ь выявления контаминации сборного молока вирусом лейкоза.

Результаты научных исследований успешно апробированы и внедрены в хозяйствах Буинского, Дрожжановского, Зеленодольского, Черем-шанского, Тюлячинского, Нижнекамского, Высокогорского, Арского и др. районов РТ. По результатам исследований подготовлены методические рекомендации, направленные на усовершенствование методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота:

Методические рекомендации по оценке контаминации молока вирусом лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол №5 от 10.02.2011 г. и Ученым советом ГНУ ВНИ-ИВСГЭ и секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, протокол №6 от 31.03.2011 г.

Методические рекомендации по диагностике лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа сыворотки крови и молока, утвержденные НТС ГУВ КМ РТ, протокол №1 от 21.01,2008г.

Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА) молока, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 2 от 4.06.2009. и НТС ГУВ КМ РТ, протокол № з от 8.10.2010г.

Методические рекомендации по дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота методом ИФА, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 5 от 10.02.11г. и НТС ГУВ КМ РТ протокол № 1 от 16.02.2011 г.

Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и по дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота методом ИФА представлены в Федеральную службу по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ РФ для утверждения в установленном порядке.

Тест-система иммуноферментная для выявления специфических антител против микобактерий» - утверждены НТС KB И, протокол №5 от 22.05.92г.

Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий» -утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и одобрены на республиканских и Всероссийских научно-производственных конференциях по актуальным проблемам агропромышленного комплекса (Казань, 1989, 1990, 1991, 1993, 1999, 2004, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010); Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине» (Н.Новгород, 1990); межвузовской научно-производственной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс с/х производства» (Ставрополь, 1991); международной научной конференции посвященной 125летию КГ ABM (Казань, 1998); международной научной конференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» (Москва, 1999); международной научно-производственной конференции посвященной 100-летию членкора ВАСХНИИЛ В.Т.Котова (Воронеж, 1999); республиканских научно-производственных конференциях молодых ученых и специалистов (Казань, 1998, 2000); международной научной конференции посвященной 70-летию зооинженерного факультета КГАВМ (Казань, 2000); международной научной конференции «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки» (Троицк, 2000); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007); Международной научно-производственной конференции «Достижения супрамоле-кулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008); П-м съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997); IV-м съезде Российского общества биохимии и молекулярной биологии (Новосибирск, 2008). Международной научно-практической конференции посвященной 90-летию кафедры биологической и органической химии СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009).

Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований, выполненные по теме диссертации, опубликованы в 44 печатных работах, в том числе в 11 изданиях, рекомендованных ВАК, таких как «Ветеринарный врач», «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», «Ученые записки КГАВМ», монография «Иммунофермент-ный анализ в диагностике туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота», I

Казань, 2011, 148с.

Основные положения, выносимые на защиту:

- изучением антигенной структуры микобактерий получены высокоспецифичные антигены и антитела для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

- полимеразная цепная реакция и иммуноферментный анализ на основе очищенных антигенов и антител повышают эффективность диагностики туберкулеза и лейкоза, обеспечивают дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота, а также индикацию и типизацию микобактерий в патологическом материале.

- инфекционный процесс при лейкозе крупного рогатого скота сопровождается синтезом антител к различным компонентам вируса, уровень которых варьирует в зависимости от стадии болезни.

- диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе повышают эффективность диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 315 страницах стандартного компьютерного набора, содержит 42 таблицы и 26 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, заключения и выводов, предложений производству, списка литературы и приложений.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Якупов, Талгат Равилович

ВЫВОДЫ

1. Комплекс диагностических мероприятий при туберкулезе и лейкозе крупного рогатого скота должен включать иммунохимические и молекулярно-генетические методы исследований.

2. ДМСО-антигены от вирулентных и инактивированных мико-бактерий имеют разный электрофоретический профиль белковых фракций. Большинство сероактивных фракций ДМСО-антигенов как от живых, так и автоклавированных микобактериальных культур располагаются в диапазоне от 20 до 65 кД. Серопозитивная фракция с Мм бОкД отмечается только в антигенных препаратах М.Ьоу1з и М.ШЬегси1оз1з, что позволяет дифференцировать их от других микобактериальных культур.

3. Антисыворотки, полученные против ДМСО-антигенов микобактериальных культур и истощенные с использованием белково-глутар-альдегидных иммуносорбентов, обладают высокой специфичностью. Использование антисывороток в ИФА позволяет дифференцировать мико-бактериальные антигены с коэффициентами специфичности от 3,6 до 4,5.

4. Иммуноферментный анализ сывороток крови животных дает дополнительную информацию к аллергическим исследованиям, повышается эффективность диагностических мероприятий. Если наряду с аллергическим методом диагностики туберкулеза применять и иммуноферментный метод анализа сывороток крови, то степень достоверно выявленных больных туберкулезом животных составляет 92%.

5. Микобактериальные антигены (ДМСОм-антиген), полученные по предложенному способу, позволяют дифференцировать в ИФА неспецифические реакции на туберкулин вызванные атипичными микобакте-риями со специфичностью более 90%.

6. ИФА и ПЦР являются высокоточными методами исследований туберкулеза. ИФА, как более массовый метод, перспективен в определении статуса стада коров по туберкулезу, позволяет исключить туберкулез у части реагирующих на 1111Д, а также выявить больных туберкулезом из числа не реагирующих на ППД коров в неблагополучных хозяйствах.

7. Значительная часть антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота находится в циркулирующих иммунных комплексах. Титры свободных и «связанных» в ЦИК антител в сыворотке крови с развитием болезни меняются. Изучение динамики образования иммунных комплексов свидетельствует о том, что разовые серологические тесты в диагностике лейкоза крупного рогатого скота не достаточно эффективны. В оздарав-ливаемых от лейкоза хозяйствах необходимо проводить двукратные (с интервалом в 2-3 месяца) исследования сывороток крови методом ИФА с предварительной диссоциацией иммунных комплексов в пробах.

8. Разработанный способ диссоциации иммунных комплексов в пробах сыворотки крови и молока позволяет повысить чувствительность методов ИФА до 20%. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом ИФА для выявления специфических антител в молоке, с предварительной диссоциацией ЦИК, не уступает по чувствительности и специфичности современным узаконенным методам диагностики этой инфекции. Данный метод, как экономически более выгодный, может применяться для мониторинга эпизоотической ситуации в хозяйствах.

9. В сыворотке крови и молоке инфицированных ВЛЕСРС коров выявляются иммунные комплексы, содержащие провирусные ДНК. Данный факт раскрывает новые аспекты патогенеза данного заболевания. Про-вирус содержащие иммунные комплексы появляются в основном, в более поздних стадиях болезни, при выраженной вирусемии организма, когда животное становится потенциально опасным источником перезаражения стада. Гематологические изменения в этот период могут оставаться стабильными. Поэтому при лейкозе крупного рогатого скота окончательная постановка диагноза должна быть направлена на обнаружение ДНК вируса в ЦИК методом ТТЦР

10. Обнаруживаемые в молоке от инфицированных ВЛКРС коров циркулирующие иммунные комплексы, содержащие провирусную ДНК, а также специфические антитела, связанные в иммунных комплексах, являются важным критерием для оценки контаминации сборного молока в лабораториях предприятий по переработке молока и молочных продуктов.

11. Антитела против антигенов ВЛКРС проявляют гомологич-ность белкам гена gag ВИЧ в иммунохимической реакции. Степень гомологии анти-ВЛКРС антител к полипептидам ВИЧ резко меняется с развитием инфекционного процесса. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр свободно циркулирующих в сыворотке крови антител меняется, что свидетельствует о недостаточной эффективности серологических методов, основанных на выявление антител только против одного антигена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации по оценке контаминации молока вирусом лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные научно-техническим советом ФГОУ ВПО «КГАВМ» и ученым советом ГНУ ВНИИВСГЭ и секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2011);

2. Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА) молока, утвержденные научно-техническим советом ФГОУ ВПО «КГАВМ», Главного управления ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан и представленные в Федеральную службу по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ РФ для утверждения в установленном порядке (2011);

3. Методические рекомендации по дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота методом ИФА, утвержденные научно-техническим советом ФГОУ ВПО «КГАВМ», Главного управления ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан и представленные в Федеральную службу по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ РФ для утверждения в установленном порядке (2011);

4. Методические рекомендации по диагностике лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа сыворотки крови и молока, утвержденные научно-техническим советом Главного управления ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан (2008);

5. Тест-система иммуноферментная для выявления специфических антител против микобактерий (методические рекомендации, утв. НТС КВИ, 1993);

6. Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий (методические рекомендации, утв. НТС КВИ, 1993);

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Своевременная и точная диагностика туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота была и остается залогом успеха в борьбе с этими инфекциями. Качество массовых диагностических исследований, по результатам которых проводится оздоровление хозяйств, на сегодняшний день остаётся недостаточно эффективным.

В своей работе, мы рассматривали некоторые аспекты диагностических методов применяемых при этих заболеваниях в целях их усовершенствования и повышения экономической эффективности противотуберкулезных и противолейкозных мероприятий проводимых в хозяйствах.

На сегодняшний день из современных методик наиболее доступными для массовых исследований по диагностике инфекционных заболеваний являются методы иммуноферментного анализа. Несмотря на свою высокую специфичность и чувствительность методы ИФА в настоящее время не нашли широкого применения как в диагностике туберкулеза, так и в диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Одним из сдерживающих факторов при этом является специфичность применяемых антигенов и антител.

Методами электрофореза, иммуноблоттинга и хроматографии изучали антигенную структуру микобактериальных культур. По результатам исследований оказалось, что наиболее подходящими для получения антигенных препаратов являются автоклавированные микобактериальные культуры. Под действием высокой температуры высокомолекулярные белковые фракции денатурируют. Так, ДМСО-антиген живой культуры М.Ьоуіб на электрофореграммах в 15% ПААГ содержит 63 фракций, а ДМСО-антиген автоклавированной М.Ьоуіб — 51. Кроме того, как показал иммуноблот анализ и по сероактивным фракциям они не совпадают.

Основываясь на полученные результаты разработали способы получения микобактериальных антигенов достаточно высокой специфичности и чувствительности, позволяющих их использовать для диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота (ДМСО-антигены)

Иммуноблоты ДМСО-антигенов автоклавированных микобактерий с гипериммунными сыворотками против гомологичных антигенов показали, что большинство сероактивных фракций располагаются в диапазоне от 20 до 65 кД. Количество иммуногенных фракций у разных антигенов по-разному, при этом - мажорных 5-6, а минорных до 10. Большинство общих для всех видов микобактерий антигенных фракций лежат в диапазонах 40-60кд и 20-35 кД. Фракция с Мм 60 кД является характерной только для антигена M.bovis и М.tuberculosis. Выделение этой фракции и использование её в серологических реакциях повысит специфичность методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Иммуноблот ДМСО-антигена M.bovis с сыворотками от коров реагирующих на ППД туберкулин, и с сыворотками от больных туберкулезом людей показали, что данный метод успешно может использоваться в прижизненной диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, а также туберкулеза у людей.

В целях сравнительного изучения иммуногенности фракций ДМСО-антигенов и ППД-туберкулинов использовали хроматографические методы исследований: ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе и гельфильтрацию на сефадексе G-200. Если результаты ионообменной хроматографии, по части специфических фракций, были сопоставимы имму-ноблотанализом (для M.bovis 25фракция - Мм бОкД), то при гельфильтра-ции наиболее специфичными оказались низкомолекулярные фракции. Так, фракция ППД-туберкулииа с Мм 15 кД может быть использована в дифференциальной диагностике туберкулеза животных.

Метод ИФА, с использованием специфических антисывороток, перспективен для выявления и типизации микобактериальных антигенов в патологическом материале от больных туберкулезом животных. Для повышения специфичности полученных иммунных сывороток использовали иммуносорбентную очистку иммунных сывороток. В результате, применение в ИФА гипериммунных сывороток против ДМСО-антигенов микобак-терий истощенных белково-глутаральдегидным иммуносорбентом позволяло дифференцировать микобактериальные антигены с коэффициентами специфичности от 3,6 до 4,5, что позволяет их при типизации этих штаммов.

Используя полученные антигены исследовали методом ИФА пробы сывороток крови коров из различных по эпизоотической ситуации хозяйств.

Обобщая результаты исследований можно сказать, что степень достоверности выявления больных туберкулезом животных аллергической пробой составила 69,7%. Если наряду с аллергическим методом диагностики туберкулеза применять и иммуноферментный метод анализа сывороток крови, то степень достоверно выявленных больных туберкулезом животных составляет 92,4%.

Таким образом, нашими исследованиями установлено, что иммуноферментный анализ сывороток крови животных дает дополнительную информацию к аллергическим исследованиям. Повышается эффективность диагностических мероприятий, что выражается в увеличении количества достоверно выявленных больных туберкулезом животных.

В целях производственного испытания эффективности полученных антигенов в дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатоI го скота методом ИФА исследовали пробы сывороток крови реагирующих на туберкулин коров из различных хозяйств РТ. Для подтверждения полученных данных совместно ГУВ РТ и Республиканской ветеринарной лабораторией были проведены ряд диагностических мероприятий, в том числе производился контрольный убой животных с последующим исследованием патматериала на выделение чистой культуры возбудителя.

Обобщая полученные результаты, можно сказать, что иммунофер-ментный анализ с использованием ДМСО(м)-антигенов успешно может быть использован в прижизненной дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Специфичность ДМСО(м)-антигена М.Ьоу1з составляет более 90%.

Эффективность ИФА диагностики туберкулеза с применением ДМСО(м)-антигенов микобактерий была изучена в сравнении с ПЦР. Была исследована эпизоотическая ситуация в 38 хозяйствах РТ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что по обнаружению противотуберкулезных сывороточных антител методом ИФА, не всегда удается правильно диагностировать туберкулез крупного рогатого скота. ПЦР в этом отношении является более чувствительным и специфичным методом. Однако, методы ИФА могут помочь в определении статуса стада по туберкулезу. Особенно ценны методы ИФА в ранней диагностике туберкулеза.

Лейкоз крупного рогатого скота относится к числу наиболее распространенных хронических инфекционных болезней сельскохозяйственных животных во многих странах мира, включая Россию. Доля лейкоза в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота составляет более 50 %. Уровень инфицированности крупного рогатого скота ВЛКРС составляет в среднем по стране 10,5 %, а в отдельных регионах достигает 20-40% и выше.

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) относится к семейству ретровирусов, роду дельтаретровирусов. Геномная молекула РНК

BJIKPC не инфекционна, тогда как вирион, в котором находятся две таких молекулы РНК, ею обладает. Транскрипция вирусных иРНК возможна только, если вирусная ДНК встроена в геном клетки, и она чаще происходит в незрелых В-лимфоцитах, чем зрелых (Н.З.Хазипов, Р.П.Тюрикова, 2008). Если провирус оказывается в активной зоне хромосомы, он может функционировать сразу, если в молчащей — то длительное время может себя не проявлять. Это зависит от многих факторов в конкретной клетке соответствующей фазе её развития.

Изучение гуморального и цитотоксического ответа на ВЛКРС инфекцию показало, что постоянным и характерным признаком инфицированно-сти животных является наличие антител к антигену ВЛКРС, следовательно, одним из важных моментов в диагностике лейкоза крупного рогатого скота является выявление инфицированных животных с помощью разных серологических методов.

В настоящее время согласно стандартам МЭБ (OIE. World Animal Health in 2005) узаконенными методами диагностики лейкоза крупного рогатого скота являются реакция иммунодиффузии в геле агара (РИД) и метод иммуноферментного анализа (ИФА). Ранее считали, что применение ИФА для выявления анти-ВЛКРС антител ограничено коротким промежутком времени, так как уровень специфических антител растет очень быстро и в связи с этим все методы диагностики равны по эффективности. Отчасти это действительно так, если иметь дело с классическим течением инфекционного процесса, однако существует немало факторов, влияющих на их чувствительность. К ним относятся инкубационный период болезни, продолжительность которого может быть до 2 месяцев, и вторичные им-мунодефициты, обусловленные пред- и послеродовым периодом у коров, некоторыми инфекционными и инвазионными болезнями, применением живых вакцин, а также особенности образования специфических антител и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).

Известно, что при хронических инфекциях, вызванных вирусами семейства Retroviridae, в биологических жидкостях организма появляются иммунные комплексы «антиген-антитело», которые имеют определенное значение в патогенезе этих инфекций.

Связывание вирусов антителами, лишенными нейтрализирующей активности, имеет одно необычное патологическое следствие: эти иммунные комплексы в результате взаимодействия с Fc-рецепторами поглощаются макрофагами, в которых вирус восстанавливает свою инфекцион-ность (А.В.Абелян, 1997). Вполне возможно, что одна из причин «феномена рецидивов» ВЛКРС инфекций в ранее оздоровленных стадах именно в этом. Кроме того, в результате исследований по выяснению структуры ЦИК нами доказано, что иммунные комплексы могут содержать провирус-ную ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота. Роль этих комплексов в патогенезе ВЛКРС инфекции не известна. Возможно, они формируются в процессе гибели инфицированных B-лимфоцитов путем соединения не встроенных в геном вирусных ДНК с поверхностными IgM, обладающими высокой аффинностью к ДНК. Очевиден тот факт, что появляются они в более поздних стадиях болезни при выраженной вирусемии организма, когда животное становится потенциально опасным источником перезаражения стада. Гематологические изменения в этот период могут оставаться стабильными. Поэтому при лейкозе крупного рогатого скота окончательная постановка диагноза должна быть направлена на обнаружение ДНК вируса в ЦИК методом ПЦР, что исключит необходимость гематологических исследований и повысит эффективность противолейкозных мероприятий.

Иммунные комплексы в сыворотке крови человека и животных могут формироваться из любых классов или подклассов иммуноглобулинов. По данным Н. Ungar-Waron et al. (1992) иммунные комплексы в сыворотке крови ВЛКРС-серопозитивных коров содержат антигены вируса и IgG и

Соотношение антител в комплексах («связанные антитела») меняется с возрастом животного и стадией болезни. При уменьшении титров свободных антител наблюдается, в большинстве случаев, увеличение титров «связанных» антител, т.е. повышается степень образования циркулирующих иммунных комплексов. При этом титры свободных антител могут снижаться до минимальных значений. Эти данные свидетельствуют о том, что разовые серологические тесты в диагностике лейкоза могут быть не эффективными.

Изучению ЦШС в сыворотке крови и молоке при лейкозе крупного рогатого скота посвящен ряд исследований отечественных и зарубежных исследователей. Большинством из них отмечается, что определение ЦИК имеет большое значение в мониторинге эпизоотической ситуации по лейкозу и может служить индикатором инфицированности животных вирусом.

Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом иммунофер-ментного анализа с выявлением специфических антител в составе иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке является весьма перспективным в повышении эффективности диагностических мероприятий и ликвидации этого заболевания.

Существуют различные способы диссоциации иммунных комплексов, которые основаны, главным образом на изменение значений рН и ионной силы раствора, на применение ферментов и др. Однако все эти методы приводят к снижению биологической активности антител и, в конечном итоге, к резкому снижению чувствительности сеологических методов при их определении.

Нами разработан способ обработки проб сыворотки крови и молока позволяющий диссоциировать ЦИК при лейкозе и выявлять в ИФА «связанные» антитела без изменения их активности. В своих ранних исследованиях, методом осаждения в ПЭГ, нами были выделены иммунные комплексы, как в пробах сыворотки крови, так и молока от больных лейкозом коров. Активность «связанных» антител изучали в ИФА и титры достигали до 1:1024. Определение специфичных антител в составе иммунных комплексов позволяет увеличить достоверность выявления больных лейкозом животных по сравнению с традиционно применяемым методом обнаружения свободных антител в сыворотке крови и молоке не менее чем на 20%.

Важным преимуществом иммуноферментных методов перед РИД является то, что ИФА, будучи более чувствительным, позволяет выявлять специфические антитела в пробах молока, молозива и сборного молока. Если учесть доступность и простоту выполнения данного метода, а также трудности, связанные с взятием крови и созданием стрессовых ситуаций для животных, то исследования проб молока и сборного молока являются привлекательными для оценки благополучия хозяйств (мониторинга) по лейкозу крупного рогатого скота.

Возможность повышения чувствительности данного метода, путем предварительной диссоциацией иммунных комплексов в исследуемых пробах, открывает большие перспективы для широкого применения его в практике, как менее трудоемкого. ИФА молока с предварительной диссоциацией ЦИК по чувствительности превосходит РИД анализ в диагностике лейкоза, что в конечном итоге проявляется в более полном выявлении инфицированных ВЛКРС животных. Особенно ценен данный метод для мониторинга эпизоотической ситуации в хозяйствах по сборному молоку.

Считается, что уровень специфических антител отражает степень активности инфекционного заболевания. У зараженных ВЛКРС животных в крови циркулируют антитела к р24, р15, р12, р10, gp30, ёр51 и другим антигенам. В настоящее время большинство серологических реакций применяемых в диагностике лейкоза крупного рогатого скота направлены на выявление анти^р51 антител. Однако титры и спектр антител меняется с развитием инфекционного процесса.

Одним из доказательств этого утверждения являются результаты наших исследований по определению степени активности и спектра антител против ВЛКРС в иммунохимических реакциях с антигенами вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2). При этом установлено, что антитела против антигенов ВЛКРС перекрестно реагируют с как неструктурными (р55, р40), так и структурным (р24/25) белком гена gag ВИЧ в иммунохимической реакции. Степень гомологии анти-ВЛКРС антител к полипептидам ВИЧ резко меняется с развитием инфекционного процесса. Увеличение титра антител против gp51 ВЛКРС в крови у больных лейкозом коров не всегда сопровождается увеличением титра перекрестно-реагирующих антител к антигенам ВИЧ. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр свободно циркулирующих в сыворотке крови антител меняется.

Данный факт свидетельствует о недостаточной эффективности серологических методов, основанных на выявление антител только против одного антигена.

В заключении следует отметить, что наиболее перспективным, в исключении недостатков существующих методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, может являться применение методов иммуноблот анализа.

Иммуноблотинг позволит изучать титры и спектр антител против всех антигенов ВЛКРС, а также продуктов их расщепления. Изучение спектра и динамики образования антител, ЦИК в крови и молоке животных по стадиям развития инфекции, определение взаимосвязи между антительным спектром и появлением в ЦИК провирусной ДНК позволили бы стандартизировать параметров и разработать тест-систему для диагностики лейкоза методом иммуноблотинга. Такая тест-система способна при массовых исследованиях заменить все серологические и гематологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, доктора ветеринарных наук, Якупов, Талгат Равилович, Казань

1. Абелян А.В. Иммунологическая нейтрализация вируса иммунодефицита человека первого типа/ А.В.Абелян// Успехи современной биологии, 1997. - Т. 117. - №5. - с.549-967.

2. Авдиенко В.Г., Грязнева Т.Н., Берестова Ю.О., Аракелов А.Б. Получение хроматографических фракций антигенов M.bovis 8 и их диагностическая оценка//Ветеринарная патология, 2003.-№1.-с.121-124.

3. Авербах M.M. Иммуногенетика инфекционных заболеваний /М.М. Авербах, В.И.Литвинов, А.М.Мороз //М.: Медицина, 1985.-253 с.

4. Авербах М.М. Иммунология и иммунопатология туберкулеза / М.М. Авербах. -М.: Медицина, 1976. -312 с.

5. Авербах М.М. Новые туберкулино-провокационные тесты в выявлении скрытой активности туберкулезного процесса /М.М.Авербах,

6. A.Е.Рабухин, А.С.Борзенко, и др.// Проблемы туберкулеза, 1976. № 2. - С. 26-27.

7. Авербах М.М. Повышенная чувствительность замедленного типа инфекций и инфекционный процесс / М.М. Авербах, В.Я. Гергерт,

8. B.И. Литвинов. -М.: Медицина, 1975. 248 с.

9. Авербах М.М. Циркулирующие иммунные комплексы и микобакте-риальные антигены в крови больных туберкулезом легких / М.М. Авербах, Р.Ю. Романова, А.Б. Инсанов // ЖМЭИ, 1984. № 12.1. C.91-94.

10. Авилов В.М. Проблемы оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза / В.М.Авилов, В.М.Нахмансон // Ветеринария, 1995. № 11.-С. 3-6

11. Адо А.Д. Общая аллергология / А.Д. Адо.- М., 1978. 427 с.1L Адо А.Д. Общая аллергология /А.Д. Адо. М., 1970. - 543 с.

12. Алимов А.М. Специфические и универсальные праймеры для индикации и идентификации возбудителей бактериальных инфекций / A.M. Алимов, Т.Х.Фаизов, А.З.Равилов// Сб. тезисов докладов 3-й всерос.научно-прак.конф., Москва, 2000.-С.339.

13. Алимов A.M. Влияние термообработки молока на выявляемость провирусной ДНК ВЛКРС в ПЦР/ А.М.Алимов, Т.Р.Якупов, И.Р.Гибадулина // Ученые записки КГАВМ, Казань, 2011.- т.205,-с.3-6.

14. Амироков М.А. Осчновные положения комплексной системы оздоровления и профилактики лейкоза крупного рогатого скота на сельхозпредприятиях Новосибирской области / М.А.Амироков, В.В. Храмцов, С.Н.Магер// Ветеринарный врач, 2007 № 3.- С. 5-6.

15. Андросова М.В.Иммунологический метод идентификации M.tuberculosis и M.bovis на основе применения моноклональных антител/ М.В.Андросова, М.А.Владимирский, Г.И.Алексеева //Проблемы туберкулеза, 1989.-№ 1.

16. Аракелов А.Б. Получение антигена МРВ83 Mycobacterium bovis для диагностики туберкулеза животных методом ИФА/ А.Б.Аракелов// Диссер.канд.биол.наук, Москва, 2006.

17. Аузиня А.К. Эффективность применения метода селекции в борьбе с лейкозом крупного рогатого скота / А.К. Аузиня // Лейкоз крупного рогатого скота, Рига. 1974. - С.90-93.

18. Аутеншлюс А.И. Антитела к антигенам микобактерий у больных туберкулезом легких / А.И.Аутеншлюс, А.Н. Шкунов // Проблемы туберкулеза, 2004.-№ 11.-е. 37-39.

19. Ахметов Т.М. Видоспецифическая и иммунохимическая характеристика антигенов М.ЬоугБ: Дис. . канд. биол. наук / Т.М. Ахметов; Каз. вет. ин-т. Казань, 1990.

20. Байгарин К.К. Выживаемость микобактерий туберкулеза бычьего вида во внешней среде / К.К. Байгарин // Вестник с/х науки Казахстана, 1988. № 4. -С.78-80.

21. Барабанов И.Н. К мероприятиям по оздоровлению ферм крупного рогатого скота от лейкоза // сб. науч. тр. ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии / И.Н. Барабанов, В,Ф. Гричко, В.М. На-хмансон и др. М.-1994. - Т.93. - Ч.П. - С.52-59.

22. Бароян О.В. Некоторые теоретические концепции иммунологии в период становления ее как науки / О.В.Бароян // Эпидемиологические аспекты современной иммунологии: Сб. ст. — М.: Медицина. 1972.-С. 42-47.

23. Бароян О.В. Эпидемиологические аспекты современной иммунологии / О.В. Бароян // Вестник академии мед.наук СССР. 1974. - С. 70-79.

24. Беклемишев Н.Д. Инфекционная аллергия / Н.Д. Беклемишев. Алма-Ата: Наука, 1968. - 375 с.

25. Белоусов В.И. Лабораторная диагностика туберкулеза животных в РФ / В.И. Белоусов, М.В. Калмыков, Л.А. Таранова // Ветеринарная патология, 2004. № 1-2. - С. 23-25.

26. Беляров В.М. Влияние организационных мер борьбы на оздоровление хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота / В.М. Беляров // Тез. докл. Всесоюзн. науч.произв. конф. Новосибирск.-1990.- С. 1617.

27. Билько И.П.Современные представления об ультраструктуре и функции клеточной стенки микобактерий туберкулеза /И.П.Билько, В.Г.Матусевич //Пробл. туберк., 1986. №9. 93 с.

28. Благодарный Я.А. Туберкулез как антропозооноз / Я.А. Благодарный. Алма-Ата, 1976. 44 с.

29. Бражин Е.Ф. Некоторые данные серологических исследований крупного рогатого скота в неблагополучных по лейкозу хозяйствах / Е.Ф. Бражин, Н.П. Бармашов //Бюлл.ВИЭВ, 1979. В.36. - С.24-25.

30. Бродилкин В.А. Микобактериоз вызванный M.fortuitum у крупного рогатого скота / В.А. Бродилкин, В.Г. Сафронов, H.A. Мякин // Профилактика и лечение инфекционных и инвазионных заболеваний с/х животных в Нечерноземье.- Горький, 1988. С. 14-16.

31. Бублий А.Ф. Борьба с лейкозом крупного рогатого скота / А.Ф. Буб-лий // Ветеринария, 1980, №11.- С.34-35.

32. Бурба Л.Г. Временные методические рекомендации по постановке реакции иммунодиффузии для выявления антител к антигену р24 он-корнавируса в сыворотках крови крупного рогатого скота при диаг1 ностике лейкоза / Л.Г. Бурба, А.Ф. Валихов. М., 1976.- 7 с.

33. Бурба Л.Г. Научные основы программы профилактики и борьбы с лейкозами животных / Л.Г. Бурба, В.М. Нахмансон, А.Ф. Валихов // сб. науч. тр. ВИЭВ, 1982.-Т.55. С. 16-20.

34. Бусол В.А. О генетической предрасположенности к лейкозу, к внутриутробной и "горизонтальной" передачи его у крупного рогатого скота / В.А. Бусол, H.H. Доронин, Н.С. Мандыгра и др.// Тез.докл.Всесоюзн.конф. Рига, 1973. - С.32-33.

35. Бусол В.А. Результативность оздоровления неблагополучных по лейкозу стад в Украинской ССР / В.А. Бусол //Тез. докл. респб. на-уч.произ. конф.- Белая Церковь.-1976. С. 63-64.

36. Бусол В.А.Тест-система для выявления ВЛКРС полимеразной цепной реакцией / В.А.Бусол, О.Ю.Лиманская, А.П.Лиманский, В.И.Цымбал // Ветеринария, 1999.-№6.-с.27-30.

37. Валихов А.Ф. Морфология, антигенные свойства вируса и серологическая диагностика онкорнавирусной инфекции крупного рогатого скота: Автореф. дис. д-ра биол. наук / А.Ф. Валихов. Москва, 1978. - 15 с.

38. Валихов А.Ф. Сывороточные преципитирующие антитела к онкор-навирусу типа С / А.Ф. Валихов // Ветеринария, 1976. № 1. - С. 4346.

39. Ванеева Л.И. Иммуноферментный метод его настоящее и будущее / Л.И.Ванеева, Н.В. Цветкова // Иммуноогия, 1980. -№ 2. С. 13-19.

40. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких / В.Н. Васильев // Медицина и физкультура. — София, 1971. 383 с.

41. Верховский О. А. Иммуноферментный анализ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / О.А.Верховский, В.В.Цибезов, М.В.Баландина, И. В.Непоклонова//Ветеринария, 2002.-№12

42. Вейсфейлер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичных микобактерий / Ю.К. Вейсфейлер // Будапешт: АН Венгрия, 1975. 335с.

43. Вейсфейллер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичные микобактерии / Ю.К. Вейсфейллер. (Пер. с нем.). -М., 1975.-334 с.

44. Вишневская Е.Б. Особенности выделения ДНК для полимеразной цепной реакции при туберкулезе внелегочных локализаций / Е.Б. Вишневская // Проблемы туберкулеза, 1998. № 5. - С. 40-42.

45. Вишневский Б.И. M.avium как возбудитель заболевания людей / Б.И. Вишневский, Т.Б. Ильина // Актуальные вопросы микробиологии туберкулеза: Сб. ст. Москва, 1975. - С. 145-151.

46. Вишневский П.П. Туберкулез крупного рогатого скота/ П.П.Врішнєвский// Москва, 1951 .-248с.

47. Вишняков И.Ф. Иммуноферментный анализ / И.Ф. Вишняков, Л.Я. Цибанова // Ветеринария. -1983. № 9. - С. 303-306.

48. Власенко В.В. Микробиология туберкулеза в фокусе проблем современности / В.В. Власенко. Винница, Гипанис, 1999.

49. Воспаление, иммунитет и гиперчувствительность; под ред. Мовэта Г.З. М.: Медицина. - 1975. 560 с.

50. Галеев Р.Ф. Теоретическое обоснование, экспериментальное подтверждение путей передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота, усовершенствование методов диагностики и мер борьбы с ним: Дис. . д-ра вет. наук / Р.Ф. Галлеев. -Уфа, 2000. — 276 с.

51. Гизатуллин Г.Х. Нетуберкулезные микобактерии и аллергическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота / Г.Х. Гизатуллин, М.А. Сафин // Тезисы докл. Респ.науч.-произв.конф.по туберкулезу. -Минск, 1977. С. 34-36.

52. Гизатуллин Г.Х. О туберкулиновых реакциях, обусловленных атипичными микобактериями / Г.Х. Гизатуллин, Б.Л. Мазур, М.А. Сафин // Ветеринария, 1972. № 9. - С. 52-53.

53. Грузевский, A.A. Современные данные о роли фотохромогенных микобактерий в патологии человека (обзор литературы)/ A.A. Грузевский // Пробл. Туберкулеза, 1999.-№ 6. с.58-60.

54. Гулюкин М.И. Эпизоотологическая оценка методов прижизненной диагностики лейкоза КРС / М.И. Гулюкин, Е.А. Дун, Н.В. Баркова, Н.И. Петров, С.М. Пау// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. -2000. -№3. -С. 60-62.

55. Гулюкин М. И. Разработка эффективных мероприятий против лейкоза крупного рогатого скота/ М. И. Гулюкин, Л. А. Иванова, Н. В. Замараева, Н. В. Баркова, Г. П. Грек, В. А. Храмцов, А. Донченко.// Ве-теринария-№ 12. -2002.-С.З

56. Гулюкин М.И. Обзор эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин,Г.А.Симонян, Н.А.Ажиркова// Ветеринарная жизнь», 2005- №6.

57. Гулюкин М.И. Исключить крайности в проведении противоэпизо-отических мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин // Ветеринарный консультант, 2005. № 13. - С. 4 - 6.

58. Гулюкин М.И., Симонян Г.А., Иванова Л.А. и др. Система мониторинга лейкоза крупного рогатого скота в Российской Федерации / Под редакцией академика РАСХН М.И.Гулюкина ВИЭВ, Москва, 2007.

59. Двоеглазов Н.Г. Сравнительный анализ разных коммерческих тест-систем и методов в диагностике ВЛКРС/Н.Г.Двоеглазов// Матер.Сибирской междунар.науч.прак.конф.:"Актуальные вопросы ветеринарии". Новосибирск.-2004.-С.304-309.

60. Двойников B.K. Система борьбы с эпизоотологией лейкоза крупного рогатого скота и результаты её реализации в районе / В.К. Двойников, П.Н. Смирнов // Ветеринария, 1994. № 12. - С. 6-9.

61. Дзадзиева М.Ф. Диагностическая ценность полимеразной цепной реакции при туберкулезе / М.Ф. Дзадзиева, Н.В. Жебуртович, A.JI. Бе-седнов и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и микробиологии. 1997. - № 5. - С. 85-87.

62. Дзантиев Б.Б. Гетерогенные методы иммуноферментного анализа / Б.Б. Дзантиев // Бюллетень ВИЭВ. -1985. Вып. 58. - С. 10-22.

63. Докукин И.С. К вопросу эпизоотологии лейкоза крупного рогатого скота/И.С. Докукин//науч.тр. КВИ, 1971.-Т.136.- С.5-6.

64. Докукин И.С. Краевая эпизоотология, диагностика и меры борьбы с гемабластозами крупного рогатого скота: Автореф. дис. . д-ра вет. наук / И.С. Докукин. Казань, 1989. - 34 с.

65. Донник И.М. Иммунный статус крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза/ И.М. Донник, E.H. Шилова, В.Б. Шилов/Материалы международного ветеринарного конгресса 2005 г. Новосибирск.- с. 129

66. Донник И.М. Региональная молекулярно-генетическая структура вируса лейкоза крупного рогатого скота/ И.М. Донник, М.В.Петропавловский// Ветеринария Кубани, 2010. № 3. - С. 1213.

67. Донник И.М. Опыт борьбы с лейкозом КРС в Уральском регионе/ И.М.Донник, А.Т.Татарчук, Б.М.Коритняк, С.С.Миронов//Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, 2009.-№ 1.-С. 57-60.

68. Донченко A.C. Внутривенная туберкулиновая проба у кроликов / A.C. Донченко, A.C. Лапыко // Вестник с/х наук, 1971-№8- С. 56-60.

69. Донченко A.C. Научно-практические основы профилактики туберкулеза крупного рогатого скота/ A.C. Донченко // Сибирский вестник с.-х. науки. 2004. - №3. - С. 81-88.

70. Донченко А. С. Дифференциальная диагностика туберкулиновых реакций в благополучных по туберкулезу хозяйствах: Методические рекомендации / A.C. Донченко, H.A. Донченко, Колосов А.А // Новосибирск, 2002.

71. Донченко H.A. Усовершенствование средств и методов диагностики и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота: Автореф. дис. .д-ра .вет. наук / H.A. Донченко. Новосибирск, 2008.

72. Драбкина P.O. Микробиология туберкулеза / P.O. Драбкина // М.: Медгиз, 1963.-148 с.

73. Дыхно М.М. Сравнительное изучение и методы дифференциации микобактерий туберкулеза: Автореф. дис. . канд. вет. наук / М.М. Дыхно; М., 1964. - 29 с.

74. Евглеевский A.A. Научные основы и практические подходы к разработке новых средств аллергической диагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота: Автореф. дис. . .д-ра вет. наук / A.A. Евглеевский; С.-Петербург, 1997.

75. Иванов О.В. Эффективность серологических методов исследования при лейкозе крупного рогатого скота / О.В. Иванов, О.Ю. Иванова, В .П. Федотов и др. // Ветеринария, 2008.- № 7. С. 6-8.

76. Иванова JI.A. Выявление иммунного ответа на вирус лейкоза крупного рогатого скота иммуноферментным методом /Л.А.Иванова// Автореф.дисс.канд.наук. М.-2000.

77. Ильина Т.Б. Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий / Т.Б. Ильина // Методические рекомендации. Москва, 1975.-21 с.

78. Ильинских H.H. Цитогенетический гомеостаз и иммунитет / H.H.

79. Ильинских, И.Н. Ильинских, Е.Ф. Бочаров// Новосибирск: Наука, СО. 1986. -254 с.

80. Каграманов А.И. О взаимоотношении туберкулеза человека и с/х животных / А.И. Каграманов // Проблемы туберкулеза, 1968. № 2. -С. 16-18.

81. Кадочкин A.M. Дифференциация и идентификация микобактерий / A.M. Кадочкин // Ветеринария. 1984. - № 9. - С. 62-63.

82. Кадочкин A.M. Современные данные о возбудителе туберкулеза / A.M. Кадочкин, H.A. Иванова // Ветеринария, 1983. № 6. - С. 30-32.

83. Калмыкова М.С. Диагностическая ценность ПЦР тест-систем при туберкулезе животных: Автореф. дис. . канд. вет. наук / М.С. Калмыкова. Москва, 2007.

84. Каплин H.H. О роли противотуберкулезных антител к различным химическим субстанциям возбудителя / H.H. Каплин, С.Н. Головачева // Проблемы туберкулеза, 1977. № 5. - С. 64-66.

85. Каркадиновская И.А. Аллергические реакции у телят, зараженных атипичными микобактериями туберкулеза / И.А. Каркадиновская, В.П. Урбан, М.М. Широбокова и др. // Сб. материалов XV научной конференции Ленингр.вет.института. -Ленинград, 1966. С. 16-18.

86. Кассич Ю.Я. Комплексная диагностика туберкулеза / Ю.Я. Кассич, А.Т. Борзяк // Ветеринария, 1985. № 4. - С. 28-29.

87. Кашкин К.П. Липосомы как носители полифункциональных имму-ногенов / К.П. Кашкин, В.И. Куликов, Г.А. Голованова и др. // Укр.биохим.журнал. 1987. - Т.59. - № 4. - С.1009107.

88. Кислицына, И. С. Возможность применения стандартной тест-системы иммуноферментной для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / И.С. Кислицына, Е.Ю. Поливодина, Е.В. Сидорин // Ветеринарная патология, 2003. № 1. - С.115-117.

89. Ковалев Г.К. О дифференциации микобактерий туберкулеза / Г.К. Ковалев // Ветеринария, 1984. № 3. - С. 72-73.

90. Колесов С.Г. Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты/С.Г. Колесов, Н.В. Лихачев Москва, 1963.-321 с.

91. Колокшанская Л.Б. Современная характеристика кислотоустойчивых микобактерий, выделяемых от крупного рогатого скотаи ее значение в диагностике туберкулеза: Автореф. дис. канд. вет. наук / Л.Б. Колокшанская; Белая Церковь, 1973. — 2 с.

92. Коломиец А.Г. Изучение роли молока больных лейкозом коров в горизонтальной передаче лейкоза крупного рогатого скота / А.Г. Коломиец, М.И. Парфанович, М.Д. Коломиец и др. // Вестник АН БССР,1979.- № 6. С. 93-99.

93. Колычев Н.М. Индикация и обезвреживание микобактерий туберкулеза во внешней среде/ Н.М.Колычев// Омск, 1992.- С.302.

94. Колчин П.Ф. Эффективность противолейкозных мероприятий с использованием серологического метода диагностики: Теоретические и практические вопросы ветеринарии / П.Ф. Колчин, Г.А. Си-монян. Тарту, 1987. - С. 14-15.

95. Кондратьев B.C. Оценка реакции иммунодиффузии в комплексе клинико-лабораторных методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота / B.C. Кондратьев, М.А. Хафез // Профилактика и ликвидация заразных болезней с-х животных, Л., 1985.- С.25-31.

96. Копылова М.К. Иммунология и иммунопатология туберкулеза: Автореф. дис. д-ра. мед. наук / М.К. Копылова; М.,1970. — 38 с.

97. Коромыслов Г.Ф. Биохимические и иммунологические тесты для прижизненной диагностики лейкозов крупного рогатого скота:

98. Этиология и иммунодиагностика лейкозов крупного рогатого скота / Г.Ф. Коромыслов, Н.М. Климов, И.И. Яременко и др.- Рига, 1979.- С. 84-88.

99. Коромыслов Г.Ф. Иммуноферментный анализ и применение его в ветеринарии / Г.Ф. Коромыслов, B.C. Авилов // Бюллетень / ВИЭВ. -1985. Вып.58. - С. 6-9.

100. Коронели Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов /Т.В. Коронели// М.: МГУ, 1984. С. 18-68.

101. Крикун В.А. Заражение телят вирусом лейкоза крупного рогатого скота через слизистые оболочки глаз и носоглотки / В.А. Крикун, М.К. Бутуев, В.П. Шишков // Сб. науч. тр. MB А. М.,1984. -С.13-17.

102. Крикун В.А. Специфическая профилактика лейкоза крупного рогатого скота/ В.А.Крикун, Т.В. Щекотурова // Бюллетень ВИЭВ.-1996.-№77.-С.49.

103. Кудяков В.Н. Атипичные быстрорастущие микобактерии и их роль в патологии крупного рогатого скота: Автореф. дис. . канд. вет. наук / В.Н. Кудяков. -М., 1984. с.

104. Кузин А.И. Оздоровление животноводческих хозяйств от туберкулеза / А.И. Кузин// М.: Россельхозиздат, 1987. — 141 с .

105. Кузин А.И. Туберкулез сельхоз животных и его профилактика /А.И. Кузин// М.: Агропромиздат, 1992. 189 с.

106. Кукайн P.A. Горизонтальная трансмиссия лейкоза крупного рогатого скота онкорнавирусами типа С. / P.A. Кукайн, Л.И. Нашае-ва, C.B. Чапенко и др.// Известия АН Латв.ССР.-1975.-№ 11. С. 4044.

107. Латыпов Ф.Р. Совершенствование методов дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота: Дис. . канд. вет. наук / Ф.Р. Латыпов. Н.Новгород, 2008.

108. Литвинов В.И. Выделение иммуносорбентной аффинной хроматографией антигена из M.bovis (BCG), его характеристика и использование для определения противотуберкулезных антител/ В.И.Литвинов, Л.Н.Черноусова, Б.Ш.Гильбург//Иммунология, 1988.-№5.-с.46-48.

109. Логинов С.И. Иммунные комплексы при лейкозе крупного рогатого скота/ С.И.Логинов// Ветеринарная патология: Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине , 2003 №1.- с.85-87.

110. Лысенко А.П. Специфические антигены различных штаммов M.bovis/А.П. Лысенко//Ветеринария, 1987,-№5.-с.34-36.

111. Лысенко А.П. Антигенный состав 1111Д-туберкулинов для млекопитающих / А.П. Лысенко // Ветеринария, 1989.-№ 5.-е. 3

112. Мазур Б.Л. Новый метод выделения культур бацил Коха из патологического материала / Б.Л. Мазур // Проблемы туберкулеза, 1936. -№ 5. — С. 65-68.

113. Малоголовкин С.А. Роль моноклональных антител в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / С.А. Малоголовкин // Вете-ринария,1997. № 4. - С.16.

114. Мальцева H.A. ПЦР-диагностика лейкоза крупного рогатого скота/ Н.А.Мальцева, Г.О.Шайхаев, А.Г.Ирский, С.Г.Постовой и др.//Ветеринарная патология. 2003. № 1. С. 129-131.

115. Маматова З.Б. Имму но ферментный анализ для выявления бруцеллезных антигенов / З.Б. Маматова, М.И. Искандеров // Ветеринария, 1987. -№4. -С. 26-27.

116. Марданлы С.Г. Подбор специфических компонентов для постановки иммуноферментного метода с целью выявления маркеров вируса гепатита-А / С.Г. Марданлы, В.И. Васильева, Т.Н. Рыбалкина и др. // Лабораторное дело, 1986. № 5. - С. 294-296.

117. Мартма О.В. Актуальные вопросы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота /О.В. Мартма, К.К. Тяхнас // Ветеринария, 1971.-№4. С. 35-38.

118. Мартма О.В. О возбудителях и течении микобактериоза / О.В. Мартма, К.К. Тяхнас // Туберкулез крупного рогатого скота и меры борьбы с ним. Новосибирск, 1986. - № 10. - С. 64-68.

119. Мартма О.В. О течении микобактериоза крупного рогатого скота в Эстонской ССР / О.В. Мартма // Материалы конференции: Эффективность мероприятий по борьбе с туберкулезом животных. -Киев, 1982. С. 23-24.

120. Маслов Е.В.Оптимизация непрямого иммуноферментного анализа для выявления антител к M.bovis/ Е.В.Маслов, А.А.Бойко, И.А. Хорьков //Ветеринария, 1986.-№10.-с.64-68.

121. Медуницын Н.В. Повышенная чувствительность замедленного типа / Н.В. Медуницын// М., 1983.- 160 С.

122. Мертвецов Н.П. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин/ Н.П.Мертвецов, А.Б.Бекмишев, И.М.Савич //Новосибирск, Наука-1987.

123. Мирлина Е.Д. Диагностические возможности метода полиме-разной цепной реакции при генитальном туберкулезе женщин / Е.Д. Мирлина, В.А. Ланцов, A.B. Семеновский и др. // Проблемы туберкулеза, 1998. № 1. - С. 46-48.

124. Митин Ю.А. Иммунологические аспекты патогенеза и диагностики ВИЧ-инфекции.: Автореф. дис. доктора мед.наук/ С.Петербург, 1997,- 40 с.

125. Мникова Л.А. Определение антител иммуноферментным методом / Л.А. Мникова, B.C. Авилов, М.М. Гоголев // Ветеринария, 1983.-№ 4. С. 64-66.

126. Мникова Л.А. Применение иммуноферментного анализа в диагностике ротовирусной инфекции крупного рогатого скота / Л.А. Мникова, B.C. Авилов, М.М. Гоголев // Бюллетень ВИЭВ,1985. -Вып.58. С. 26-29.

127. Модель М.М. Биология туберкулезных микобактерий и иммунология туберкулеза / М.М. Модель, В.П. Белогурова// М.: Медгиз, 1956.-316 с.

128. Найманов А.Х. Полимеразная цепная реакция при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота /А.Х. Найманов, Н.П. Овдиен-ко, Е.П. Осипова//Ветеринарная патология, 2004, 1-2(9), С. 96-99.

129. Найманов А.Х. Аллергическая диагностика микобактериапь-ных инфекций крупного рогатого скота; / А.Х. Найманов // Автореферат диссертации доктора ветеринарных наук. Москва, 1993. С. 29.

130. Найманов А.Х. Проблемы диагностики и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота в современных условиях /А.Х. Найманов// Ветеринарная патология, 2004- №1-2(9).- с. 18-23

131. Найманов А.Х. Сравнительная оценка прижизненных методов диагностики туберкулеза крупного рогатого ско-та/А.Х.Найманов//Ветеринария, 2009.-№2.-с.7-13.

132. Нахмансон В.М. Опыт борьбы с лейкозом крупного рогатого скота / В.М. Нахмансон, Л.Г. Бурба, Е.А. Дун и др. // Ветеринария, 1990.-№ 6. С. 6-10.

133. Нахмансон В.М. Серологический метод диагностики в системе противолейкозных мероприятий / В.М. Нахмансон, М.И. Гулюкин, Е.А. Дун // Ветеринария, 1997. № 3. - С. 7-10.

134. Нахмансон В.М. Течение эпизоотического процесса лейкоза крупного рогатого скота в неоздоравливаемом хозяйстве / В.М. Нахмансон, Л.Г. Бурба, Е.А. Дун и др. / Ветеринария, 1992.- № 6. С. 810.

135. Непоклонова И.В. Использование ИФА для выявления вируса инфекционного ринотрахеита и антител к нему у крупного рогатого скота: Дис. . канд. вет. Наук/И.В. Непоклонова. -М., 1985.

136. Новак Д. Д. Послеубойная диагностика туберкулеза/ Д.Д.Новак //Ветеринария, 1990.-№11.

137. Новак Д.Д. Туберкулез сельскохозяйственных животных / Д.Д. Новак// Алма-Ата, 1977. 140 с.

138. Новак Д.Д. Специфический компонент ППД туберкулина (СКТ) при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота/

139. Д.Д.Новак, Б.Н.Шакенов// Материалы 5-й научно-практической конференции НГАУ Новосибирск 2003.

140. Новошинов Г.П. Иммуноферментный метод / Г.П. Новошинов // Методические указания, Казань. 1985. -27 с.

141. Нуруллин A.A. Иммуноферментный анализ для выявления возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота в патологическом материале: Дис. . канд. биол. наук / A.A. Нуруллин; Каз. вет. ин-т. Казань, 1987.

142. Нымм Э.М. Опыт диагностики лейкоза крупного рогатого скота и совершенствование мероприятий по борьбе с ним: Лейкозы с-х животных / Э.М. Нымм, Ю.А. Симоварт// М.Колос.-1975. С. 217220.

143. B.Е. Шуревский, А.Х. Найманов // Актуальные проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных: сб. науч. тр. ВИ-ЭВ. 1985. - Т.62. - С. 8-20.

144. Одаренко К.И. Типовая принадлежность МТ сельскохозяйственных животных в Казахстане / К.И. Одаренко // Проблемы с туберкулезом и паратуберкулезом с/х животных. -Алма-Ата. 1965.1. C. 60-69.

145. Осипова Н.И. Полимеразная цепная реакция (система SENX3-REGX3) при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота/ Н.И. Осипова//Ветеринария, 2006- № 3- С. 829.

146. Ощепков В.Г. Дифференциальная диагностика туберкулеза с применением хемилюминисцентного метода/ В.Г.Ощепков, Л.А.Таллер, Г.М.Дюсенова, Т.А.Вассимирская, Е.Ю.Секин// Достижения науки и техники АПК, 2009- № 12.-С. 41-43.

147. Ощепков В.Г. Культурально-генетический метод диагностики туберкулеза крупного рогатого скота/ В.Г.Ощепков, Л.А.Таллер, Е.Ю.Секин и др.// Достижения науки и техники АПК, 2010- № 5- С. 64-65.

148. Падалица A.M. Факторы неспецифической реактивности крупного рогатого скота к туберкулину, способы их выявления и устранения / A.M. Падалица // Автореф. дис. канд. вет. наук Ин-т экспер. Ветеринарии Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1998. 19 с.

149. Пантелеев O.A. Непрямой твердофазный метод иммунофер-ментного анализа, его точность и источники погрешностей / O.A. Пантелеев, Л.И. Ванеева // ЖМЭИ. 1986. -№ 3. - С. 95-99.

150. Пантелеев O.A. Проблемы подбора концентрации реагентов в твердофазном иммуноферментном методе при определении концентрации антител / O.A. Пантелеев, Л.И. Ванеева, E.H. Демченко // ЖМЭИ. 1987. - № 4. - С. 80-85.

151. Петров Н.И. Изучение зараженности ВЛКРС молодняка в специализированных хозяйствах по выращиванию нетелей / Н.И. Петров, Д.И. Шелехов // Сб. науч. тр.ДВИ. 1993. - С.28-31.

152. Петров Н.И. Возрастные особенности проявления вируса лейкоза крупного рогатого скота / Н.И. Петров // Инфекционные болезни сельскохозяйственных животных: Сб.науч.тр.ЛВИ. J1. -1988. -С.78-81.

153. Петров Н.И. Сравнительная оценка систем в проведении оздоровительных мероприятий от лейкоза крупного рогатого скота в племенных хозяйствах / Н.И. Петров // Бюлл.ВИЭВ. 1988. - В.67.-С. 73-75.

154. Пинчук JI.M. Сравнительное изучение высших жирных кислот липидов M.tuberculosis и M.bovis / JI.M. Пинчук, Г.И. Герасимова, Е.А. Воронцова и др. // Проблемы туберкулеза, 1982. № 3. -С.62-65.

155. Поддубский И.В. Вопросы борьбы и диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / И.В. Поддубский // Ветеринария,1962. № 5. - С. 45-53.

156. Поздеев О. К. Медицинская микробиология. — Москва: ГЭО-ТАР-Мед., 2001.- 778с.

157. Покровский В.И. Настоящее и будущее иммуноферментного метода исследования в инфекционной патологии / В.И. Покровский, Т.А. Ермолин, C.B. Шабалина //ЖМЭИД983. № 8. - С. 3-7.

158. Пристужалов Ю.С. Система оздоровления и профилактики лейкоза крупного рогатого скота / Ю.С. Пристужалов, В.И. Околелов, Г.И. Максимов // Ветеринария, 1996. № 5. - С. 50-51.

159. Простяков А.П. Перспективы иммунохимических методов в ветеринарии / А.П. Простяков // Ветеринария, 1983. № 11. -С. 71-73.

160. Противотуберкулезный иммунитет. Научный обзор. Под ред. М.М.Авербаха. ВНИИ мед.и мед.-тех.инф.- М.,1973.- 13 с.

161. Радюк С.Н. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза / С.Н. Радюк, Г.Р. Мацеевич // Лабораторная диагностика, 1997.-С. 11-33.

162. Рачкус Ю.А. и др. // Авт. свид. 4811056/13. Опубл. 23.12.91., Бюлл.47.

163. Репин Ю.М. Хирургия туберкулеза легких / Ю.М. Репин // Медицина. Л., 1984. - С.34.

164. Решетников С.С., Гладкова С.Е., Офицеров в.И. Новая тест-система для серодиагностики туберкулеза / Новости «Вектор-Бест» №9, 1998.

165. Ротов В.И. О миграции микобактерий туберкулеза / В.И. Ро-тов, П.Е. Савченко // Ветеринария, 1971. № 10. - С. 38-39.

166. Ротов В.И. Туберкулез сельскохозяйственных животных /В.И. Ротов, И.И. Кокуричев, П.Е. Савченко и др. // Издательство Киев, 1978.-237 с.

167. Ройт А., Бростофф Дж., Миел Д. Иммунология/Пер. с англ. -М.: Мир, 2000. 592с.

168. Сазонов В.А. 13-й съезд. Тезисы: Украинское науч. общество микробиологов, эпидемиологов и паразитологов им.Д.К.Заболотного / В.А. Сазонов, П.З. Протченко, A.B. Филипповский. — Киев, 1996. -С. 65-68.

169. Сафин М.А. Совершенствование методов диагностики и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота: Дис. . д-ра вет. наук / М.А. Сафин; Каз. вет. институт. Казань, 1981.

170. Сафин М.А. Современные методы борьбы с туберкулезом животных/М.А. Сафин, Г.З. Идрисов// Казань, 1992. 168 с.

171. Сергеев В.А. Структура и биология вирусов животных / В.А. Сергеев, Б.Г. Орлянкин. М, 1983.

172. Симонян Г.А. Метол иммунодиагностики в системе мероприятий по борьбе с лейкозами крупного рогатого скота / Г.А. Симонян // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и живот-ных.-Ташкент, 1984. С. 163-164.

173. Симонян Г.А. Пути передачи оикорнавирусной инфекции в неблагополучных по лейкозу стадах крупного рогатого скота / Г.А. Симонян, Е.Ф. Бражин // Сб. науч. тр. Донского с-х ин-та.-1980. -Т. 15. В.4. - С.62-65.

174. Смирнов A.M. Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных /A.M. Смирнов // Ветеринарная патология, 2004- № 1-2(9)- с. 10-13.

175. Смирнов П.Н. Особенности патогенеза гемабластозов крупного рогатого скота и перспективы научных исследований в области вирусного лейкоза /П.Н.Смирнов, В.А.Белявская, Е.В.Дробот// Ма-тер.научн.-произ.конф, Екатеринбург- 2005- с. 197-205.

176. Смирнов П.Н. Выявление коров, больных лейкозом, путем постановки РИД с р24-антигеном ВЛКРС / П.Н. Смирнов // Методические рекомендации. Новосибирск. - 1991. - 7 с.

177. Смирнов П.Н. Использование реакции иммунодиффузии для оценки состояния стад крупного рогатого скота по лейкозу / П.Н. Смирнов, Л.Г. Бурба, А.Т. Левашов и др. // Науч. тех. бюлл. ВАСХ-НИЛ/ Сиб.отд. 1983. - В.37. - С.3-11.

178. Смирнов П.Н. Практические аспекты лейкоза крупного рогатого скота / П.Н. Смирнов // Ветеринарная газета, № 13. —1998. — 4 с.

179. Соколов М.И. Живые вакцины: Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней / М.И. Соколов. М., 1964. - 532 с.

180. Сорокина Н.В. Свойства системы JgG JgG человека в различных модификациях иммуноферментного анализа / Н.В. Соколова, Е.М. Гаврилова, A.M. Егорова // ЖМЭИ. -1986. - № 12. - С. 68-72.

181. Сюрин В.Н. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина// М.: МВА.1986. С. 76-85200. , Сюрин В.Н. Диагностика вирусных болезней животных / В.Н. Сюрин, Н.В. Фомина// М.:Агропромиздат, 1991. С.38-50

182. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных/ В.Н.Сюрин, А.Я.Самуйленко, Б.В.Соловьеви др.// М.: ВНИТИБП, 1998- с. 646.

183. Тарантул В.З. Имя ему СПИД/ В.З.Тарантул//Москва, 2005.-398с.

184. Татьков С.И. Применение рекомбинантных видоспецифиче-ских белков М.йдЬегси1оз1з для серологической диагностики туберкулеза / С.И. Татьков, О.В. Насарева, А.Н. Болдарев // Клиническая лабораторная диагностика, 2006. № 12. - С.26.

185. Тогунова А.И. Иммунизация живой вакциной против туберкулеза: Профилактика инфекции живыми вакцинами / А.И. Тогунова. -М.: Медгиз, 1960.

186. Тогунова А.И. Экспериментальное обоснование вакцинации против туберкулеза /А.И. Тогунова // ЖМЭИ. 1955. С. 3-8.

187. Тузова Р.В. Туберкулез сельскохозяйственных животных и птиц / Р.В. Тузова// Минск: Урожай, 1983. 263 с.

188. Урбан В.П. Аллергическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота /В.П. Урбан, М.М. Широбоков, Г.М. Громов // Сб. науч. тр. ЛВИ. Вып. 48. - 1977. С. 68-72.

189. Урбан В.П. Микобактериозы у крупного рогатого скота / Проблемы профилактики и терапии заразных заболеваний с/х животных и птиц / В.П. Урбан, М.М. Широбокова, Ю.Ю. Данко и др.-Л.,1986. -С.104-110.

190. Урбан В.П. Причины аллергических реакций на внутрикожное введение туберкулина у крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах /В.П. Урбан, Ю.Ю. Данко, В.А. Пескова // Сб. науч. тр. ЛВИ. Ленинград, 1988.

191. Усольцев К.В. Полимеразная цепная реакция и иммунофер-ментный анализ в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота: Дис. канд. вет. наук / К.В. Усольцев; Каз. вет. ин-т. — Казань, 2001.

192. Хазипов Н.З. Использование ИФА для выделения возбудителя туберкулеза в патологическом материале / Н.З. Хазипов, Р.П. Тюри-кова, A.A. Нуруллин //Актуальные вопросы эпизоотологии и меры борьбы с туберкулезом животных: Сб. ст. — Казань, 1989. С. 27-28.

193. Хазипов Н.З. Биохимическая структура клеточной стенки ми-кобактерий туберкулеза / Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, A.A. Нуруллин // Сб. науч. тр. Казань, 1986. - С. 10-19.

194. Хазипов Н.З. Туберкулез крупного рогатого скота /Н.З. Хазипов, М.А. Сафин, Г.З. Идрисов// М. Агропромиздат, 1985.-250 с.

195. Хазипов Н.З. Репродукция вируса лейкоза крупного рогатого скота и иммунный ответ на неё/ Н.З.Хазипов, Р.П.Тюрикова//Ученые записки КГАВМ, Казань, 2008- т. 192. С. 152-161.

196. Хамзин P.A. Иммуноферментный метод при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / P.A. Хамзин, М.А. Сафин, К.Г.

197. Идрисова // Диагностика, профилактика и меры борьбы с туберкулезом животных: Сб.ст. КВИ.- Казань, 1985. С. 6-7.

198. Хамзин P.A. Совершенствование диагностики, профилактики и мер ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота в зоне длительного неблагополучия/ Р.А.Хамзин//Диссер.док.вет.наук, Казань, 2006.

199. Хаммадов H.A. Изучение эффективности различных молеку-лярно-генетических методов идентификации и дифференциации возбудителей туберкулеза и атипичных микобактерий /Н.А.Хаммадов// Автореферат дисс.канд.биол.наук., Казань,-2010.-23С.

200. Харитонов М.В. Совершенствование методов дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота: Автореф. дис. . канд. вет. наук / М.В. Харитонов; Каз. вет. ин-т. -Казань, 1983. С. 21.

201. Хисамутдинов Ф.Ф. Диагностика и меры борьбы с лейкозом крупного рогатого скота / Ф.Ф. Хисамутдинов, Г.А. Симонян // Труды I-съезда вет.врачей Республики Татарстан.- Казань.-1996. С. 124128.

202. Ходун JI.M. Оптимизация аллергической и лабораторной диагностики туберкулеза КРС: Дис. д-ра вет. наук / JI.M. Ходун. Омск, 1996.

203. Хоменко А.Г. Современные представления о строении M.Tuberculosis / А.Г. Хоменко, В.В. Ерохин // ЖМЭИ, 1982.-№ 12. -С. 33-40.

204. Царев Ю.П. Сравнительные результаты исследования сыворотки крови крупного рогатого скота при лейкозе/ Ю.П.Царев// Матер.Сиб.Муждунар.вет.конгресса,-Новосибирск,-2005,-ISBN 5-96570029-6.

205. Цунская Н.И. Исследование сыворотки крови реагирующих на туберкулин животных иммуноферментным методом/ Н.И.Цунская, М.А.Владивирский //Сборник научных трудов, Омск.-1988.

206. Чард Т. Радиоиммунологические методы. / Т. Чард. М.: Мир, 1981.-247 с.

207. Чепик Г.В. Вопросы дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / Г.В. Чепик // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции, Омск.-1980. С. 56-57.

208. Черноусова JT.H. Аффинное выделение микобактериальных антигенов на моноклональных антителах / Л.Н.Черноусова, Е.Д.Суранова, О.А.Калинина //Пробл. туберк.,1995. -№2. -С.39-42.

209. Шаров А.Н. ПЦР при туберкулезе /А.Н. Шаров, A.A. Ерошен-ко, И.П. Суханов и др. //Ветеринария, 2000.-№ 10- С. 18-22.

210. Шаров А.Н. Эффективность методов прижизненной диагностики туберкулеза / А.Н. Шаров, JI.A. Ерошенко, И.П. Суханов и др.// Ветеринария, 2000. № 2. - С. 16.

211. Шаров А.Н. К вопросу диагностики туберкулеза //Ветеринария, 1982. -№9. -С. 40-44.

212. Шаров А.Н., Седов В.А. Тест-системы ПЦР при туберкулезе / А.Н. Шарова, В.А. Седов // Ветеринария, 1998. № 3. - С.20-22.

213. Шатохин Ю.Е. Ветеринарное обеспечение агропромышленного комплекса РФ. / Ю.Е. Шатохин // Труды первого съезда вет. врачей РТ. Казань: Тат. кн. изд-во. 1996. - С.35-40.

214. Шиков А.Т. Оздоровление племенных хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота / А.Т. Шиков // Ветеринария. Киев, 1979. -Т. 42.- С. 50-53.

215. Шишков В.П. Наступление на лейкозы животных / В.П. Шишков //Наука и человечество. М., 1988. - С-103-113.

216. Шлыгин И.В. Значение иммунологических реакций при эпизоотическом обследовании свежих и стационарных очагов туберкулеза крупного рогатого скота / H.B. Шлыгин, Э.Д. Лакман // Сб.ст. НИВИ. Вып. 27. - Омск, 1976. - С. 35-41

217. Юдин Г.А. Дифференциация туберкулиновых реакций / Г.А. Юдин // Ветеринария. 1970. - № 11. - С. 68-70.

218. Юдин Г.А. Неспецифические реакции на туберкулин у крупного рогатого скота и их профилактическое значение в системе противотуберкулезных мероприятий: Автореф. дис. . д-ра вет. наук / Г.А. Юдин.-М., 1986,-44 с.

219. Юдин Г.А. О неспецифических туберкулиновых реакциях / Г.А. Юдин // Ветеринария, 1971. № 10. - С. 62-64.

220. Юдин Г.А. О псевдоаллергических реакциях на туберкулин / Г.А. Юдин // Ветеринария, 1973. № 10, С. 8-12.

221. Юсковец М.К. Туберкулез сельскохозяйственных животных и птиц. / М.К. Юсковец// М.: Сельхозгиз.-1963.

222. Affronti L.P. Characterization and comparison of mycobacterial antigens by discontinues pore gradient gel electrophoresis/ L.P.Affronti,

223. G.L.Wright, M.Reich //J. Infect. Immun., 1972.-V.5.-p.474-481.

224. Aide S.L.M. Evalution of an Ensyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Using JgG Antibody to mycobacterium tuberculosis Antigen 5 in the diagnosis of Active Tuberculosis in children/ S.L.M.Alde,

225. H.M.Pinoseo, F.R.Pelosi et al.// Veterinary Microbilogy.-1988.-V.l 8.-P.51-61.

226. Alimov A.M. Detection and differentiation of mycobacterium M.bovis by DNA hybridization method /A.M.Alimov, N.Z.Khazipov, T.Kh.Faizov// 5-word congr. University of Afr. Elizabet 1999.-P.22-23.

227. Amadori M. Antibody Tests for Identification of Mycobacterium bovis infected Bovine Herds / M. Amadpri, S. Tameni, P. S. Cavirani // Journal of Clinical Microbiology. Feb., 1998, p.556-568.

228. Auer L.A. Antibodies to Mycobacteria in Cattle not infected with Mycobacterium bovis / L.A. Auer, S.M. Schleehauf // Veterinary Micro-bilogy.-1988.-V.18.- P.51-61.

229. Baelden M.C. Serological analysis of human tuberculosis by an ELISA immunoassay with mycobacterial antigen-60/ M.C.Baelden, B.Vandirelst // J.Inf. Dis., 1990.-v.22.-p.63-66.

230. Bendixen H. Ergebnisse der kontrol und Tilgungsmassnahmen der Rinderleukosebekampfung / H. Bendixen //Berg., Munch.tierarztl. Wschr.-1963.- V.76. № 5. - P. 112-114.

231. Bhattacharya A. Antibody-based ELISA for determination of immune complexes in clinical tuberculosis / A. Bhattacharya, S.N. Ranadive, M. Kale et al.// Am. Rev. Respir. Disease, 1986.-v.134, №2.-p.205-209

232. Boguslaski R.C. Homogenous immunoassay / R.C. Boguslaski, T.M. Li //Appl. Bioch. and Technol. -1982. ^V.7 -№5. -P.401-414.

233. Bothamley G. Clinical value of the measurement of Mycobacterium tuberculosis specific antibody in pulmonary tuberculosis /Bothamley G.; Rudd R.; Festenstein F.; Ivanyi J. //Thorax. -1992. -Vol.47. -P.270-275.

234. Brodeu R.S. Correlation of in vitro immune response with clinical course of malignant neoplasia in dogs/ R.S.Brodeu, I.J.Fidler, S.B.Nielsen // Am. J. Vet. Res., 1975.-v.36.-p.75-80.

235. Caminero J.A. Value of ELISA using A-60 antigen in the serodi-agnosis of tuberculosis / J.A.Caminero, F.R.Decastro, T.Carrillo et al. // Respiration., 1994.-61:5 (sep.-oct.).

236. Cardoso M.A. Direct detection of Mycobacterium bovis in bovine lymph nodes by PCR/ M.A.Cardoso, R.F.Cardoso, R.D.Hirata, M.N. Hi-rata// Zoonoses Public Health. 2009 0ct;56(8):465-70. Epub 2009 Jan 17.

237. Chander S. Comparison between serological and hematological diagnosis of bovine leucosis / S.Chander // Vet.Microbiol. -1976.-V. 192. -P. 1005-1007.

238. Chapars S.D. An analysis of cross reactions among mycobacteria by in vivo and vitro assays of cellular hypersensitivity / S.D.Chapars, C.J. Maloney // Am. Rev. Respir. Dis., 1978.-117:897-902

239. Chasey D. A simple and reaped immunoperoxidasae test for the detection of virus antigens in tissue culture / D.A. Chasey // J. Vet. Record. —1980. -№14. —P.506-507.

240. Chucroum N. Tubercle bacillus antigens. Biological properties of two substances isolated from paraffin oil extract of dead tubercle bacilli /N. Chucroum // Am.Rev.Tuberc., 1947.-V.56-p.203-226.

241. Cho Y.S. Definition of purified enzyme-linked immunosorbent assay antigens from the culture filtrate protein of Mycobacterium bovis by proteomic analysis/ Y.S.Cho, S.E.Lee, Y.J.Ko// J Immunoassay Immuno-chem. 2009;30(3):291-304.

242. Cho Y.S Enzyme-linked immunosorbent assay of bovine tuberculosis by crude mycobacterial protein 70/ Y.S.Cho, S.C.Jung, J.M.Kim, H.S.Yoo// J Immunoassay Immunochem. 2007;28(4):409-18.

243. Coates A.R. Antigenic diversity of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis detected by means of monoclonal antibodies / A.R. Coates, J.Q. Hewitt, B.W. Allen h pp. II Laneet.-1981.-V.l 1.-P.167-169.

244. Cocito C. Preparation and properties of antigen 60 from Micobacte-rium Bovis BCG / C. Cocito, F. Vanlinden // Clin, and Exp. Immunol., 1986. V.66, №2. - P.262-272.

245. Currie G.A. Serum mediated inhibition of the immunological reactions of the patient to his own tumor; a possible role for circulating antigen / G.A.Currie, C.Basham //Brit. J. Cancer., 1972.-v.26.-p.427-438.

246. Daniel T.M. Evolution of mycobacterial antigens in an ensyme-linked Immunosorbent assay for the serodiagnosis of tuberculosis / T.M. Daniel, S.M. Debanne // J. Med. Microbiol., 1984. V.18, №3. - P.309-318.

247. Daniel T.M. Specificity of Mycobacterium tuberculosis antigen 5 determined with mouse monoclonal antibodies / T.M. Daniel, N.J. Gon-chroff, J.A. Katzmann // Infect. Immun.-1984.-V.45.-№2.-P.52-55.

248. Daniel T.M. The serodiagnosis of tuberculosis and other mycobacterial diseases by enzyme-linked Immunosorbent assay / T.M. Daniel, S.M. Debanne // Amer.Rev.respir.Dis., 1987. V.135. P.l 137-1151.

249. Deshayes L. Identification of structural polypeptides of bovine leulemia vims / L. Deshayes, D. Levy, A.L. Parodi // In Bovine Leukosis: Various Methods of molecular virology.-1977.- P. 57-67.

250. Dsouza C.D. Use of the recombinant 38-kDa antigen of

251. M.tuberculosis as an immunogen for specific antisera production / C.D.

252. Dsouza, G.V. Kadivol, A.M. Samuel // Microbiology and immunology 38:10. 1994. P.797-800.

253. Engvall E. Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G / E. Engvall, P. Perlann // J. Immuno-chem. 1971-V. 8-P.871-874.

254. Euteneur B. Compares of the Exoproducts of Gram-negative bacteria by SDS Page / B.Euteneur, M. Loos // Sbl. Bairt., 1985.-v.259.-p.11-19.

255. Ferrer J.F. Bovine leukosis: Natural transmission and principles of control / J.F. Ferrer // J.A.V.M.A. 1979. - V.175. - P.1281 - 1286

256. Ferrer J.F. Bovine lymphosarcoma / J.F. Ferrer // Adv.Vet.Sci.Comp.Med., 24: 1-68, 1980.

257. Ferrer S.F. An evolution of the role of milk in the natural trasmis-sion of BLV / S.F. Ferrer, C.E. Piper // Am.rech.Vet.-1978. v.9.- P.803-807.

258. Ferrer S.F. Milk of dairy cows frequently contains a leukemogenic virus / S.F. Ferrer, S.S. Kenyon, P. Gupta // Science. -1981.- v.213. № 4511,- P.1014-1016.

259. Ferrer S.F. Role of colostrum and milk in the natural transmission of the Bovine leukemia virus / S.F. Ferrer, C.E. Piper / Cancer Res., 1981. V.41.-P. 4906-4909.

260. Fifis T. Purification and charaterization of major antigens from a Mycobacterium bovis culture filtrate/ T.Fifis, C.Costopoulos, A.J.Radford, A.Bacic //Infect. Immun.-1991, March; 59(3): 800-807.

261. Fitzgerald S.D. Coinfection of cow with Bovine leukemia virus and Mycobacterium bovis / S.D. Fitzgerald, D.G.Sledge, R/Maes// J.Vet. Di-agn. Invest., 2009.-№21(6):878-82.

262. Flensburg J.C. Serological evidence of infection with bovine leukemia virus (BLV) in Danish cattle // An account of the enzootic bovine leucosis control programme 1978/1980 4th Int.Symp.Bovine Leukosis. Bologna. -1982. P.500-508.

263. Francis J. The sensitivity and specificity of various tuberculin testsIusing bovine PPD and other tuberculins/ J.Francis, R.J.Seiler, I.W.Wilkie et al. // Vet. Ree., 1978.v.l03.-p-420-425.

264. Garbaccio S.G. Evaluation of an immunomagnetic capture method followed by PCR to detect Mycobacterium bovis in tissue samples from cattle/ S.C.Garbaccio, A.A.Cataldi// Rev Argent Microbiol. 2010 Oct-Dec;42(4):247-53.

265. Garcia-Drigoza E. Diagnostico de la tuberculosis pulmonal* cronica por el metodo de immunoensaeyc enzimatico (ELISA) / E.Garcia-Drigoza, A.Cutierres-Velasques. Rev.Latinoamer. Microbiol., 1982, v.24, № 3, p. 193-203.

266. Gamier T. The complete genome sequence of Mycobacterium bovis/ T.Garnier, K.Eiglmeier, J.C.Camus, N.Medina et all. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 2003.-v,100(13).-Jun 24.-p.7877-7882.

267. Gennaro M.L. Immunologic diagnosis of tuberculosis/ M.L.Gennaro// Clin. Infect. Dis. 2000. Jun; 30 Suppl 3: S. 243-6.

268. Gilmour N.J.R. The specificity and sensitivity of the fluorescent antibody test incattle experimentally infected with mycobacterium avium and mycobacterium icfinei / N.J.R. Gilmour, K.W. Angus. Res. In Veter. Sc., 1976, vol. 20, № 1. p. 6 - 9.

269. Giller N. Ingibition of retroviral protease activity by an aspartil proteinase inhibitor/ N.Giller, F.A.Florins, M.Boxus, C.Burteun// Retrovirology 2007.-V.4.-P.-18.

270. Goren M.B. Roles of lipid contents and hydrogen peroxide susceptibility in determining the quinoa pig virulence of Mycobacterium tuberculosis // M.B. Goren, J.M. Grange, V.R. Abers n ^p. Br., J. Exp. Path., 1982. — v.63. P.693-700.

271. Grange J. Environtal mycobacterium and BCG Vaccination / J. Grange // Tubercle 1986. - vol. 67. - № 1. - p. 1 - 4.

272. Grange J.M. Serological tests for tuberculosis: can the problem of low specificity be overcome? / J.M. Grange, T. Kardjito. Indian J. Of Chest Diseases and Appl.Sci., 1982, v.24, № 2-3. P. 108-117.

273. Grange M.J. The Humoral Immune Respons in Tuberculosis: Its natural, Biological Role and Diagnostic Usefulness / M.J. Grange // Adv.Tuberc.Rev., 1987.-V.21.-P 1-77 (Karget, Basel, 1984).

274. Gray G.R. The major micolic acids of M.smegmatis / G.R. Gray, M.Y. Wong, S.Y. Danielson//Prog. Lipid. Pes., 1982.-V.21, p.91-107.

275. Greenwald R.J. Improved serodetection of Mycobacterium bovis infection in badgers using multiantigen test formats/ RJ.Greenwald, S.Esfandiari, R.Lesellier et al. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2003.-v.46.-p. 197-203.

276. Grenner G. Principles and applications of homogenous and heterogeneous enzyme immunoassay / G. Grenner // Hoppe-Seyler's z.Physiol. Chem. -1982. -V.363. -№ 9. -P. 1005-1006.

277. Gross L. Oncogenic virus / L. Gross // Oxford, pergamon Press.-1974.

278. Guile H. Responses of bovine T celles to fractionated lysate and culture filtrate proteins of Mycobacterium bovis BCG / H. Guile, L.M.

279. Fray, E.P. Gormley h Ap. // Veterinary Immunology and Immunopathol-ogy 48: 1995, № l-2.-pl83-190.

280. Gupta V.K. Antigenic characterization of Mycobacterium Bovis BCG soluble antigens / V.K. Gupta, C.G. Ram, M.P. Bansal // Veterinary Microbiology 38: 1994, №3. p.227-240.

281. Gutiérrez G. Detection of bovine leukemia virus specific antibodies using recombinant p24-ELISA/ G.Gutiérrez, I.Alvarez, N.Fondevila, R. Politzki// Vet Microbiol. 2009 Jun 12;137(3-4):224-34.

282. Hanna J. Use of PPD and phosphatide antigens in the ELISA to detect the serological respons in experimental bovine tuberculosis / J. Hanna, S.D. Neill, J.J. O Brien // Research in Veterinary Science, 1989.-V.47.-№ 1 .-P.43-47.

283. Harboe M. Antigens of PPD, old tuberculin and autoclaved Mycobacterium bovis BCG studied by crossed Immunoelectrophoresis //Amer. Rew. Respir. Dis.-1981.-V.124.-p.80-87.

284. Harboe M. The 38-kDa protein of Mycobacterium tuberculosis: a review I M.Harboe, H.Wiker . //J.Infect.Dis. 1992. Vol.166. P.874-884.

285. Harboe M. Homology between the MPB70 and MPB83 proteins of Mycobacterium bovis BCG / M.Harboe, S.Nagai, H.Wiker, K.Sletten, S.Haga //Scand.J.Immunol. Vol.42 (1).- 1995.- P.46-51.

286. Heiander I.U. Isolation and electrophoretic analysis of bacterial lipopolysaccharides/I.U.Helander // Meth. Mol. Characterisat., 1985.-p.263-274.

287. Hemmatzadeh F. Sequencing and phylogenetic analysis of gp51 gene of bovine leukaemia virus in Iranian isolates/ F. Hemmatzadeh// Vet Res Comrnun. 2007 Aug;31(6):783-9. Epub 2007 Feb 8.

288. Hill H.R. Enzyme-linked Immunosorbent assay and radioimmunoassay in the serologic diagnosis of infectious diseases / H.R. Hill, J.M. Matsen // J. Infect. Diseases. -1983. -V.147. -№ 2. -P.250-263.

289. Jackson M. Mycobacterium tuberculosis Des-protein: An immunodominant target for the humoral response of tuberculeus patients/ M. Jackson, D. Portnoi, D. Catheline h jyp. // Infection and immuniti. V.65, №7, 1997. P.2883-2889.

290. Jacobs R.M. Inhibition of lymphocyte blastogenesis by sera from cows with lymphoma/ R.M.Jacobs // Am. J. Vet. Res., 1980.-v.41.-p.372-376.

291. Jeon B.Y. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay using milk samples as a potential screening test of bovine tuberculosis of dairy cows in Korea/ B.Y.Jeon, S.C.Kim, S.Je, J.Kwak// Res Vet Sei. 2010 Jun;88(3):390-3. Epub 2010 Jan 8.

292. Jenkins P. The identification of mycobacterium med in clinical pac-tice / P. Jenkins // Bull. un. int. Tuberc. 1988. - vol. 63. - № 3, p. 7 - 9.

293. Juliarena M.A. Determination of proviral load in bovine leukemia virus-infected cattle with and without lymphocytosis/ M.A. Juliarena, S.E.Guierrez, C.Ceriani// Amer.J.Vet.Pes., 2007., №68(11): 1220-5.

294. Kalish S.B. et al. Use of an enzyme-linked Immunosorbent assay technique in the differential diagnosis of active pulmonary tuberculosis in humans / S.B. Kalish, R.C. Radin, J.P. Pheir // J.Infec.Dis., 1983. V.147, - № 3. - P.523-530.

295. Kemp H.A. Studies on the detrimental effects of bivalent binding in a microtitration plate ELISA and possible remidies / H.A. Kemp, M.R.A. Morgan //J. Immun. Meth. 1986. -V.94. - № 1-2. - P.65-72.

296. Kono Y. Protection against bovine leukemia virus infection in sheep by active and passive immunization/ Y.Kono, K.Arai, H.Sentsui et. all. //Japan. J. of Vet. Sci.,1986.-v.48.-p.l 17-125.

297. Kumar S.P. Effect of mononuclear cells or Monocyte culture fluid on the antigen (PPD), induced blastodenic responses of lymphocytes / S.P. Kumar, C.C. Museoplat, D.W. Johnson // Indian vet.J.-1987.-V.64.-P. 1002-1007.

298. Kuckleburg C.J. Detection of bovine leukemia virus in blood and milk by nested and real-time polymerase chain reactions/ C.J.Kuckleburg, C.C.Chase, E.A.Nelson, S.A.Marras, M.A.Dammen// J Vet Diagn Invest. 2003 Jan;15(l):72-6.

299. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4/ U.K. Laemmli //Nature, London, 1970.-v.227.-p.680-685.

300. Lamb R.A. The synthesis of Sendai virus polypeptide in infected cells/ R.A.Lamb, B.V.Many, R.W. Groppin //Virology, 1976.-v.69.-P.116-131.

301. Larson V.L. Epizootologic studies on the natural transmission of Bovine leukemia / V.L. Larson, P.D. Sorensen II A.J.Vet. Res.-1970.-V.31. -№9. -P.1533-1538.

302. Lazevic V. CD8+ T-cells in tuberculosis/ V.Lazevic, J. Flinn// Am.J.Respir Crit Care Med. vol.l66.p.l 116-1121, 2002

303. Lee H. Species identification of mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of the rpoB gene / H. Lee, H.J. Pars, S.N. Cho h ap. // J.Clin.Microbiol., 2000. Aug.38(8):2966-71.

304. Lenzini L. The spectrum of human tuberculosis/ L.Lenzini, P.Rotolli, l.Rotolli. // Clin. Exp. Immunol., 1977.-v.27.-p.230-237.

305. Licursi.M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M.Licursi, Y.Inoshima, T.Yokoyama, E.Gonzalez, H.Sentsui // Virus.Res.-2002.-V.86.-P.101-110

306. Lightbody K.A. Mycobacterial antigen-specific antibody responses in bovine tuberculosis: an ELIS A with potential to confirm disease status/ K.A.Lightbody, R.A.Skuce, S.D.Neill, J.M.Polloc //Vet. Rec., 1998.-v.l42.-p.295-300.

307. Maes R. Evaluation of the avidity of IgG antimycobacterial antibodies in tuberculosis patients serum by an A-60 immunoassay/ R. Maes // Eur. J. Epidemionol., 1991.-v.7.-p.262-265. 1991

308. Maes R. Development of an enzyme immunoassay for the sérodiagnostic of tuberculosis and mycobacterioses / R. Maes, J.P. Homasson, M. Kabin h a p.// Medical Microbology and Immunology.-1989.- VI78.-P.323-335.

309. Mammerickx M. Experimental Gross-Transmissions of Bovine Leukemia virus (BLV) between several animal species / M. Mammerickx, D. Portetelle, A. Bumy // Zbl.Vet. Med.-1981.-V.28. P.68-81.

310. Moraes M. Cellular immune responses to Mycobacterium tuberculosis in a patient with Takayasus arteritis / M.Moraes, D.Ordway, L.Oliveira //Rev.Port.Cardiol. 1999. Vol.18. P.359-367.

311. Mary L.R. Serial circulating immune complex levels and mitogen responses during progressive tumor growth in WF rats/ L.R.Mary, S.Glenn, S.R.Donald et al. // J. Natl. Cancer Inst., 1983.-v70.-p.1113-1118.

312. Mauch H. Monoclonal antibodies selectively directed against the cell wall surface of M.tuberculosis / H. Mauch, N. Brechwer, H. Sonneborn // J.Clin.Microbiol.-1988.-V.26.-№9.-P. 1691 -1694.

313. Mieko G., Katsuko O., Vasio S. // I. Jap. Assoc. J. Infect. Dis -1995. V. 69 № 5 - P.539 - 545.

314. Michell S. The MPB83 antigen from mycobacterium bovis contains Olinked mannose and (1,3) mannobiose moieties / S.Michell, A.Whelan, P.Wheeler //J.Biol.Chem. Vol.278(4).- 2003.- P. 1815-1820.

315. Miller D.A. Immunoperoxidase quantitation / D.A. Miller, E.D. Williams // J. Pathol. -1980. -V. 131 № 3. - P. 279-286.

316. Miller J.M. Precipitating antibody to an internal antigen of the C-type virus associated with bovine lymphosarcoma / J.M. Miller, C. Olson // S.Nat.Cancer Ins. 1972. - V.49. - P. 1459-1462.

317. Minden P. Immunological evaluation of a component isolated from M.bovis BCG with a monoclonal antibody to M.bovis BCG/ P.Minden, P.J.Keliecher, J.H. Freed et al. // Infec. And Immun., 1984.-V.46.-p.519-525.

318. Misaki A. Structuraland immunochemical studies on D-arabino-D-mannans and D-mannans of Mycobacterium tuberculosis and other Mycobacterium species / A. Misaki, J. Azuna, Y. Yamamura // J. Biochem., 1977. -V.82. P. 1759-1763.

319. MorrisY.A. The identification of antigenic determinants of M.bovis Using Monoclonal antibodies / Y.A. Morris, C.Y. Fom // J.General Microbiol.-1985.- V.1131.- P. 1825-1831.

320. NagyD.W. Use of a polymerase chain reaction assay to detect bovine leukosis virus in dairy cattle/ D.W. Nagy, J.W.Tyler, S.B.Kleiboeker// J Am Vet Med Assoc. 2003 Apr l;222(7):983-5.

321. Nassau E. Specific tubercle antigen / E. Nassau, A.E. Nelstrop // Tubercle, 1976. — v.57. P. 197.

322. Nassau E. The detection of antibodies to Mycobacterium tuberculosis by microplate enzyme linked Immunosorbent assay (ELISA) / E. Nassau, E.R. Parson, C.D. Johnson. // Tubercle, 1976, № 57. P. 67-70.

323. Neill S.D. Isolation of Mycobacterium bovis from the respiratory tracts of skin test-negative cattle/ S.D.Neill, J.Hanna, D.P.Mackie, T.G.D Bryson // Vet.Rec., 1992.-V. 131 .-p.45-47.

324. Ngo T.T. Separation-free amperometric enzyme immunoassay / T.T. Ngo, J.H. Bovaird, H.M. Lenhoff // Appl. Bichem. Biotechnol. -1985.-V.11.-P. 63-70.

325. Nguyen V.K. evaluation of an enzyme-linked Immunosorbent assay for detection of antibodies to bovine leukemia virus in serum and milk / V.K. Nguyen, R.F. Maes // J.Clin.Microbiol., 1992.-31(4). 979-981.

326. Nossal 1.1st die Tuberculose lene boreites uber wundene Krankheit /1. Nossal // Tuber. 1965. - v. 123. - s. 203 - 217.

327. Nyendak M.R.New diagnostic methods for tuberculosis/ M.R.Nyendak, D.A.Lewinsohn, D.M.Lewinsohn// Curr Opin Infect Dis. 2009 Apr;22(2): 174-82.

328. Olson C. Role of C-type in bovine lymphosarcoma / C. Olson, L.D. Miller, S.M. Miller // Bibl.Haemat. 1973. - V.39. - P.198-205.

329. Orr M.B. Experimental challenge of red dur with mycobacterium avium / M.B. Orr, A.R. Hunter, T. Brand// Veterinary Record, 1978, 102, 484-485.

330. Ostyn A. Glycolipid antigen for use in diagnostic assays for bovine tuberculosis / A. Ostyn, M.A. Lancelle, M.F. Thorel // Research in Microbiology. 148:6, 1997. P.491-500.

331. Paul W.E. Иммунология / W.E. Paul. 1987.- T.2.- C.30.

332. Paulsen J. Antibodies to common ovine and bovine C-type virus specific antigen in serum from cheep with spontaneous leukosis and from inoculated animals / J. Paulsen, R. Rudolph, J.M. Miller // Med.Microbiol.Immunol. 1974. - V.159. - P.105-114.

333. Piper C.E. Prenatal and postnatal transmission of the bovine leukemia virus under natural conditions / C.E. Piper, J.F. Ferrer, D.A. Abt // J.Nat.Cancer.Inst. -1979. V.62. - P. 165-168.

334. Piper C.E. Seroepidemiological epidence of the horisontal transmission of the bovine C-tipe virus / C.E. Piper, D.A. Abt, S.F. Ferrer // cancer.Res. 1975. - V.35. - P.1714-1716.

335. Plackett P. An ELISA for the detection anergic Tuberculosis cattle / P. Plackett, J. Ripper, L. Corner и др./ZAustralian Vet.J. -1989. V.66. -№ 1.-P15-19.

336. Pollok J.M. Dynamic changes in circulating and antigenresponsive T-cell subpopulations post Mycobacterium bovis infection in cattle/

337. J.M.Pollok, D.A.Pollok, D.G.Campbell et al. // Immunology., 1996.-v-87.-p.236-241.

338. Portaeis F. The occurense of mycobacteria in the environment of man and animal / F. Portaeis, R. Bonicke// Exc. Med. Int. Congr. 1988. - vol. 37 - ser. - 119, - h. 361 - 368.

339. Pranav K. Use of immunoprecipitates to produce anti-BCG cell wall antibody of restricted specificity from Mycobacterium BCG/ K.Pranav, J.C.Baae, D.Groothuic //Protides. Biol. Fluids Proc. 33rd Col-log., 1985.-p.671-673.

340. Ranchoff B.I. Monoclonal antibodies specific to subspecies of mycobacteria / B.I. Ranchoff //Abstr.Ann.Meet.Amer.Soc.Microbiolog., 1986. Ann.Meet. Washington D.C.-1986. -23-28., March.-P.l 13-114.

341. Ressang AA Enzootische rinderleucose. Diagnostick Versproiding in bestrijding in Nederland/A.A.Ressang, N.Mastenbroeck, J.Quak //Tijdschr. Diergenesk.-1976.- V.101.- № 13. P.711-717.

342. Ridge S.E. A comparison of two ELISAs for the detection of antibodies to bovine leucosis virus in bulk-milk/ S.E.Ridge, J.W.Galvin// Aust Vet J. 2005 Jul;83(7):431-4.

343. Ritacco V. Reciprocal cellular and humoral immune responses in bovine tuberculosis/ V.Ritacco, B.Lopez, I.N. De Kantor et al. //Res. Vet. Sei., 1991.-v.50.-p.365-367.

344. Rodríguez J. G. Amplification of a 500-Base-Pair Fragment from Cultured Isolates of Mycobacterium bovis / J. G. Rodriguez , P. Fissanoti, Del Portillo et al. // Journal of Clinical Microbiology, July 1999, p. 23302332, Vol. 37, No. 7.

345. Rodriguez J.G. Species-specific identification of Mycobacterium bovis by PCR / J.G. Rodriguez, G.A. Mejia, P. Del Portillo h a p.// My-crobiology.,1995.-141:2131-2138.

346. Roger A. Différenciation serologyque de souches humaines et bovines de bacille tuberculaux par la reaction de mycobacteriostase / A. Roger, F. Roger// C.R.Acad.Sci.Ser.D., 1969.-268. 24.-2978-2981.

347. Romero R.E. Identification of Mycobacterium bovis in bovine clinical samples by PCR species-specific primers/ R.E.Romero, D.L.Garzon, G.A.Mejia, W.Monroy, L.A.Murillo //J.Vet.Res., 1999. Apr; 63(2): 101-6.

348. Rosskopf M. Comparison of two ELISA systems for the detection of antibodies against IBR/IPV and against enzootic bovine leukemia virus/ M.Rosskopf, E.Staub, M.Ackermann //Schweiz Arch. Tierheilkd., 1994.-v.l36.-p.58-67.

349. Rudenstein K.B. "Hamogeneoas" enzyme immunoassay. New immunochemical technique / K.B. Rudenstein, R.S. Schneider, E.F. Ullman // Biochem. Biophys. Res. Common. -1972. -V.47. P.846-851.

350. Rufka J. The improvement of monitoring methods of cattle infection with bovine leukemia virus (BLV)/ J.Rufka, P.Kubis, E.Buzala, S.Kamiriski// Pol J Vet Sci. 2003 ;6(3 Suppl):40-2.

351. Runyon E.N. Différenciation des mycobacteries anonymes (atipiques) et des bacilles tuberculeux des mammiferes / E.N. Runyon // "Bull. Un. int. tuberc.", 1959, v. 29, h. 72 -82.i

352. Runyon E.N. Mycobacterial and mycobacterioses //Kekkaku. 1972.-V.47.-№ 10.-P.3 31-337.

353. Sagata, N. Identification an some biochemical properties of the major XBL gene product of bovine leukemia virus / N. Sagata, M. Tsuzuku-Kawamura, F. Nagyoshi-Aida // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 78797883

354. Samuel B. Mycobacterium in arthropods of different biotypes / B. Samuel // Zentrabi. Bacteriol. Parasiten. Infectionskr 1976 - Hyg. Abt. l:Orig. — A-211 — p. 50-57.

355. Sargeant J.M. Evalution of bulk-milk ELISA test for the classification of herd-level bovine leukemia virus status/ J.M.Sargeant, D.F.Kelton, E.W.Martin, E.D.Mann //Prev. Vet. Med., 1997.-v.-31.-p.223-230.

356. Schultz R.D. Development of the fetal bovine immune responses: aireview/ R.D. Schultz //Cornell Vet., 633.507-535, 1973.

357. Schuurs A.N. Affinity Chromatogr. and Related techn / F.N. Schuurs, T.C. Gribnau, J.H. Lauvering // Theor. Aspects and Biomed. Appl. Prjc. Int. Symp. Veldhaven. 1981. - V.l. - P.343-356.

358. Sechi L.A. Different Strategies for Molecular Differentiation of Mycobacterium bovis Strains Isolated1 in Sardinia, Italy / L.A.Sechi, L.Guido, A.L.Stefano et al. // Applied and Environmental Microbiology, April 1999, p. 1781-1785, Vol. 65.

359. Seichi L.A. Enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences as molecular targets for typing of Mycobacterium tuberculosis strains / L.A. Seichi, S. Zanetti, I. Dupre h flp.// Clin.Microbiol., Jan.1998.-p.128-132.-V.36.

360. Shmeide H. Strudies an Atypical Mycobacteriosis with special emphasis on the Desease due to Mycobacterium kansasi «Kekkaku» / H. Shmeide. 547 550.

361. Smith-Franklin B.A. Follicular dendritic cells and the persistence of HIV infectivity: the role of antibodies and Fc receptors/ B.A.Smith-Franklin, B.F.Keele // The Journal of immunology. 2002. - V168. -P.2408-2414.

362. Sorensen A.L. Purification and characterization of a low-molecular mass T-cell antigen secreted by M.tuberculosis/ A.L.Sorensen, S.Nagai, G.Hauen, P. Andersen et al. // Infec. and Immun., 1999.-v.63 .-p.1710-1717.

363. Sreevatsan S. A multiplex approach to molecular detection of Brucella abortus and/or Mycobacterium bovis infection in cattle / S. Sreevatsan, J.B. Bookout, F. Ringpis h ,zjp. // J.Clin.Microbiol., 2000, Jul; 38(7): 2602-10.

364. Straus E.W. Binding assay for detection of mycobacteria / E.W. Straus // USA, Montefiore Medical Center, 1983.

365. Straus E.W. Clinical applications of the radioimmunoassay of secretory tuberculoprotein/ E.W.Straus, M.A.H.Quraishi, S.Levine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1981.-V78.-p.3214-3217.

366. Syamalima D. The complete genomic sequence of an in vivo low replicating BLV strain / D. Syamalima, A.Lynn, Dipak K. Dube// Viril-ogyJ., 2009, 6:120.

367. Taylar F.G.R. Comparison of sensitivities of class specific antibody in Moore serum / F.G.R. Taylar, D. Patel, E. Baerne // J. Immun. Meth. -1983. V.65. - № 1-2. - P. 65-73.

368. Teifke J.P. Detection of bovine leukaemia virus (BLV) in tissue samples of naturally and experimentally infected cattle/ J.P. Teifke, T.W.Vahlenkamp// Berl Munch Tierarztl Wochenschr. 2008 Jul-Aug;121(7-8):263-9.

369. Terukazu Odawara Circulating Immune Complex Levels in Cows with Enzootic Bovine Leukosis/ Terukazu Odawara, Misao Onuma, Hiroyasu Yochikawa et al. // Jpn. J. Vet. Sci., 1987.-v.49.-p657-661.

370. Thoen C.O. Use of enzyme-linked Immunosorbent assay for detecting mycobacterial antigenes in tissues of M.bovis infected cattle / C.O. Thoen, C. Malstrom, K. Mills // Am.J.Vet.Rev., 1981. V. 42. - № 10.-P.1814-1815.i

371. Thoen C.O. Patogénesis of Mycobacterium bovis infection / C.O. Thoen, E.M. Himes // Prog. Vet. Microbiol. Immun., 1986.- V.2.-p.l98-214.

372. Towbin H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacryla-mide gels to nitrocellulose sheets: Prosedure and some applications/ H.Towbin, T.Staechelin, J.Gordon //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979.-V.76.-P.4350-4354.

373. Tsai C.M. The analysis of lipopolysaccharido in meningococci polysaccharide vaccines by silver staining following SDS polyacrylamidegel electrophoreats / C.M.Tsai //J. Biological Standartisation, 1986.-V.14-P.25-33.

374. Ungar-Waron H. Circulating immune complexes in bovine leukemia virus (BLV)-infected cattle/ H.Ungar-Waron, J.Brenner, R.Paz, Z.Trainin// Vet.Immunol.Immunopathol., 1992 Oct: 34 (1-2): 173-9.

375. Van Weemen B.K. Immunoassay using antigen-enzyme conjugate / B.K. Van Weemen, A.N. Schuurs // FEBS Letters. 1971. - V. 15. -P.232-236.

376. Waters W.R. Early antibody responses to experimental Mycobacterium bo vis infection of cattle/ W.R, Waters, M.V.Palmer, T.C.Thacker, J.P.Bannantine// Clin Vaccine Immunol. 2006 Jun;13(6):648-54.

377. Wilcke I. Clinical evaluation of MPT-64 and MPT-59, two proteins secreted from M.tuberculosis, for skin test reagents / Wilcke I., Jensen B., Ravn P// Tuber/Lung Dis., 1996.-V.77.-P.250-256.

378. Wood R.R. Productional and Characterization of Monoclonal antibodies Specific for M.bovis / R.R. Wood // J.Microbiol.-1988.-V.134. № 9.- P.1599-1604.

379. Vosloo W. Characterisation of a lipoprotein in Mycobacterium bovis (BCG) with sequence similarity to the secreted protein MPB70 /

380. W.Vosloo, P.Tippoo, J.Hughes, N.Harriman, M.Emms //Gene. 1997. Vol.l88.-P.-123-128.

381. WorsaaeA. Monoclonal Antibodies produced in BAL/O. Mice Define New Antigenic Determinants in Culture Filtrate Preparations of M.tuberculosis / A. Worsaae, L. Heronlver // J.Clin.Microbiol. -1988.-V.26.-№12.-P. 2608-2616.

382. Wu D. In vivo transcription of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency-like virus/ D.Wu, K.Murakami. H.Jin, Y.Inoshima//Virus Research 2003.-V.7.-P.81.

383. Yo Komiso Y. A method for avoiding false-positive reactions in an enzyme-linked Immunosorbent assay for the diagnosis of bovine paratu-berculosis / Y. Yo Komiso, H. Yugi, H.S. Mercal // Jap.J. Vet.Sci. 1985. — V47. - № 1. -P.lll.

384. Zieba M. Chemical structure of Mycobacterium tuberculosis/ M. Zieba, M. Krawczyk, I.Grzelewska-Rzymowska// Pol Merkur Lekarski. 2006.- Sep;21(123):262-5.