Молекулярная генодиагностика лейкоза крупного рогатого скота

Зиннатов, Фарит Фатихович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная генодиагностика лейкоза крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная генодиагностика лейкоза крупного рогатого скота"

На правахрукописи

ЗИННАТОВ ФАРИТ ФАТИХОВНГЧ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНОДИАГНОСТИКА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2008

003452763

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории и на кафедре биологической и неорганической химии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им Н.Э. Баумана».

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РТ и РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор Хазипов Нариман Залилович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Шарипова Маргарита Рашидовиа

(профессор кафедры микробиологии КГУ, г. Казань)

Заслуженный деятель науки РТ и РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Гаффаров Харис Зарипович (зав. лабораторией вирусологии отдела биозащиты, ФГОУ «ФЦГРБ -ВНИВИ», г. Казань)

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН г. Казань.

Защита состоится "27" ноября 2008 г. В_13 ч. на заседанйи

Диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: г. Казань, ул. Кремлевская 18, главное здание КГУ, аудитория 211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета им.В.И. Ульянова -Ленина

Автореферат разослан « 23 » октября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

1.0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Лейкоз - это злокачественное хроническое заболевание органов кроветворения, вызывается вирусами лейкоза, характеризуется прогрессивным увеличением в крови лейкоцитов с последующим развитием опухоли лейкоза и имеет значительное распространение в РФ в том числе и на территории республики Татарстан. Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота - является РНК-содержащий вирус семейства Retroviridae, ретровирус лейкоза крупного рогатого скота ( М. Licursi et al., 2003; М.И. Гулюкин,2005; А.Н. Шаров, 2006;В.А. Сергеев и др., 2007).

Установлена высокая степень сходства вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЖРС) с вирусом Т - клеточного лейкоза человека (HTLV-1, Human Т- cell leukemia virus), который имеет с ним близкое морфологическое и эволюционное родство, относится также к семейству Retroviridae, что свидетельствует об их общем пути в процессе эволюции (В.Н. Сюрин и др., 2000; Р.И. Ахмедшина., и др., 2006; Д.Е.Белов, 2006). Показана возможность преодоления вирусом лейкоза видовых барьеров (П.В. Филатов и др., 1974; В.П.Шишков, 1979; H.Fechner, 1995). В условиях эксперимента воспроизведена инфекция вирусом лейкоза крупного рогатого скота у овец (М.И. Гулюкин,2005). Имеются данные об экспериментальном заражении обезьян бычьим лейкозом (А.Ф. Валихов, 1992; В.Н.Сюрин,2000; R. Felmer et al, 2005).

Однако, несмотря на многочисленные исследования, проводимые в данном направлении, окончательного ответа на вопрос о возможности взаимосвязи между заболеваниями лейкоза и другими болезнями опухолевой природы у животных и человека нет (M.F. Camargos et al, 2002; G. Monti et al, 2005; R. Felmer et al, 2005).

Несомненно, одной из важнейших проблем онкологии и лейкозологии является возможная связь между заболеваемостью лейкозами и опухолями животных и человека.(И.М. Jacobs et al,1995; C.Kuckleburg et al, 2003). Большой интерес представляют проблемы потенциальной опасности для человека продуктов питания от животных из стад, неблагополучных по лейкозу, влияния вредных метаболитов, накапливающихся в организме больных коров, на организм человека, а также использование животных для получения биопрепаратов. Установлено, что молоко и мясо больных лейкозом животных содержат метаболиты триптофана и других циклических аминокислот, экологически опасные для человека (М.И. Гулюкин, 2005).

Разработка эффективных способов борьбы с лейкозом крупного рогатого скота является одной из важнейших задач не только ветеринарной медицины, животноводства, но и биологии, и экологии в целом, имеющих непосредственное отношение к безопасности здоровья человека.

ВЖРС является одним из наиболее опасных опухолевых болезней и представляет угрозу для генофонда племенного молочного скота, наносит значительный экономический ущерб животноводству республики, в результате падежа и вынужденной выбраковки животных, утилизации туш, нарушения воспроизводительной функции у больных коров и ограничений в связи с неблагополучием хозяйств (И.П.Никитин, Б.В. Камалов, 2005).

В силу особенностей инфекционного процесса лейкоза диагностика его серологическими методами исследования не позволяет одномоментно выявить всех инфицированных животных. В связи с этим стал актуальным поиск высокочувствительных методов для ранней диагностики по выявлению вируса лейкоза крупного рогатого скота не только в крови взрослых животных, но и в крови телят до 6-ти месячного возраста, а также в сборном молоке коров.

Из литературных источников известно, что вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (ВИКРС) часто сопровождает вирус лейкоза КРС (О.Ю. Лиманская и др., 2005; Ю.Н.Федоров, O.A. Верховский, 2006). В связи с этим большой интерес представляет изучение степени коинфицированности КРС в неблагополучных по лейкозу хозяйств вирусом иммунодефицита.

Существующие традиционные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота - реакция иммунной диффузии (РИД), иммуноферментный анализ (ИФА), клинические и патологоанатомические методы, гематологические исследования не обеспечивают полного обнаружения всех инфицированных животных, так как молодняк до б-ти месячного возраста остается вне плановых исследований в связи с тем, что методы РИД и ИФА практически не пригодны для диагностики лейкоза у телят (С.В.Чичинина и др.,2005; G, Monti et al, 2005).

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на обнаружении генома ретровируса, на два порядка чувствительнее и специфичнее иммунологических методов и имеет хорошую перспективу для диагностики лейкоза, так как позволяет определять наличие генов гликопротеина возбудителя лейкоза у телят с 15-дневного возраста, что крайне важно для изоляции зараженных с раннего возраста животных. По данным М.И. Гулюкина (2005); А.Н. Шарова (2006), известно, что метод ПЦР выявляет до 16% животных, зараженных вирусом лейкоза среди РИД-негативных животных, а число зараженных телят достигает до 11,6%. Кроме того, высокая чувствительность метода ПЦР позволяет использовать его для рекогносцировочных исследований путем определения возбудителя в сборном молоке (В.Н.Сюрин и др., 2000; Kuckleburg et al., 2003).

особую актуальность, и поэтому применение ПЦР в диагностике лейкоза имеет важное значение, т.к позволит ускорить сроки оздоровления хозяйств от лейкоза.

Целью исследований являлась оптимизация молекулярной генодиагностики ВЛКРС для оздоровления хозяйств от этой инфекции.

Учитывая вышеизложенное, в настоящей работе поставлены следующие задачи:

> 1. Выяснить эффективность и чувствительность отечественных ПЦР -тест-систем и методику с праймерами на епу-ген, рекомендованной М.Ьекига еС а1., (2003 г.) для диагностики лейкоза КРС.

> 2.0пределить возможность использования цельной крови, сыворотки крови, молока и крови телят с 15-ти дневного возраста для диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР.

> З.Генотипировать ВЛКРС, циркулирующего на территории сельскохозяйственных предприятий РТ с применением ПЦР - ПДРФ анализа.

> 4.Исследовать циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) в сыворотке крови на наличие в них провирусной ДНК ВЛКРС.

> 5.Определить степень коинфицированности ВЛКРС и ВИКРС животных в хозяйствах Республики Татарстан.

Научная новизна. Подобраны видоспецифические праймеры для идентификации ДНК провируса лейкоза и иммунодефицита КРС. Проведена оценка чувствительности и специфичности тест-систем. Проведено исследование крови и молока крупного рогатого скота из нескольких животноводческих хозяйств на содержание провирусной ДНК ВЛКРС и ВИКРС. Произведено впервые типирование вируса лейкоза крупного рогатого скота циркулирующего на территории Республики Татарстан. Установлена циркуляция провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота в составе циркулирующих иммунных комплексов. Впервые показана коинфицированность зараженных лейкозом молочного скота вирусом иммунодефицита крупного рогатого скота на территории Республики Татарстан.

Практическая значимость Результаты научных исследований были использованы при разработке целевой программы по оздоровлению хозяйств РТ от лейкоза крупного рогатого скота на 2006-2010 гг.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Сравнительный анализ специфичности праймеров, рекомендованных М.ГЛсига « а1., (2003), с отечественными тест - системами («Ыокош», и «АмплиСенс») и оптимизация метода ПЦР.

2.Данные исследования проб крови и молока крупного рогатого скота и телят из различных хозяйств РТ на содержание провирусной ДНК ВЛКРС.

3.Типирование вируса лейкоза крупного рогатого скота, циркулирующего на территории Республики.

4.0бнаружение провирусной ДНК ВЛКРС в циркулирующих иммунных комплексах сыворотки крови инфицированных вирусом лейкоза коров. 5.Идентификация коинфицированности крупного рогатого скота ВЛКРС и ВИКРС.

Апробация результатов исследования. Результаты работы доложены и опубликованы в материалах на Международного симпозиума «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» г. Казань, ФГУ «ФЦТРБ- ВНИВИ», ноябрь 2005; Всероссийской научно - практической конференции «Молодые ученые в реализации национальных проектов» г. Ижевск,2006; Всероссийской научно- производственной конференции, г.Казань,2006; Публикации в Ученых записках ФГОУ ВПО КГАВМ им Н.Э.Баумана- г.Казань 2006-2008гг,182 ,189, 192 тома; в журнале «Ветеринарный врач» №2 2008г, в сборнике трудов юбилейной - научно-практической конференции, посвященной 135 летию КГАВМ. г.Казань-2008г; в методических пособиях «Лейкоз крупного рогатого скота», г.Казань 2005 и 2006г; в материалах Всероссийской научно-исследовательской конференции, г.Казань,2007; на международной студенческой научной конференции «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки», Троицк-2007г; Всероссийской научно - практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» посвященная 20-ти летию Кировской государственной медицинской академии- г. Киров, 2007; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика» г.Москва 2007; Конференции «IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» г.Новосибирск-2008г;

Публикации. По материалам диссертации доложено и опубликовано 18 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 120 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 17 рисунками. Список использованной литературы включает 182 источника, в том числе 89 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 2005-2008 г в научно-исследовательской лаборатории и на кафедре биологической и неорганической химии ФГОУ ВПО КГАВМ им Н.Э. Баумана и апробирована в неблагополучных по лейкозу районах РТ.

Объект исследования - крупный рогатый скот черно-пестрой голштинизированной породы с разной долей голштинизации, принадлежащий сельхозпредприятиям Республики Татарстан.

Предмет исследования - пробы крови и сыворотки крови животных, молоко,а также ДНК, праймеры генов вируса лейкоза крупного рогатого скота env и gag.

Постановку ПНР проводили с использованием тест-систем «Лейкоз-КРС-Провирус» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, ФГУН ЦНИИЭ - фирмы «АмплиСенс», Gene Pak (фирмы «Biokom»): Экстракцию генетического материала, постановку ПЦР-амплификации участка провирусной ДНК и электрофоретический анализ продуктов ПЦР проводили согласно предложенным методикам и инструкции тест-систем.

ПНР с использованием методики, рекомендованной М. Licursi et al., (2003*), проводили согласно описанию автора, после предварительной экстракции генетического материала с применением Тест-системы для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР): «Лейкоз-КРС-Провирус» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, ФГУН ЦНИИЭ - фирмы «АмплиСенс».

Структура олигонуклеотидных праймеров для изучения области gp51 гена env ВЛКРС взята из статьи М. Licursi et al. (2003). Внешние праймеры (фрагмент 598 п.н.): env5032 (5 '-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA-3') env5099 (5 '-CCCACAAGGGCGGCGCCGGTTT-3') Внутренние праймеры (фрагмент 444 п.н.): env552i (5 '-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG-3') env5608 (5 '-AACAACAACCTCTGGGAAGGGT-3') Амплифицированную провирусную ДНК длиной 444 п.н. разделяли методом горизонтального электрофореза в 1,5-2%-ном агарозном геле с трис-боратным буфером в присутствии бромида этидия (результаты регистрировали с помощью видеосистемы «Gel Imager 2» в компьютер), а также методом вертикального электрофореза в 6%- ном полиакриламидном геле, с последующим окрашиванием геля нитратом серебра.

ПЦР для детекции фрагмента гена pol провирусной ДНК вируса иммунодефицита КРС с использованием методического приема рекомендованного А.П.Лиманским др.,(2005), производили согласно описанию автора. Структура олигонуклеотидных праймеров для изучения гена pol ВИКРС взята из данной статьи: BIV1 - BIV2, который дает при амплификации продукт с молекулярной массой 101 п.н.: BIV1 (2343-2366) 5'gAATgTgAACACTTACTgCААТА-31 BIV2 (2442-2422) 5'АATCTCggACTACAgAgATCCgAC-3' Праймеры синтезированы фирмой «Литех»(Россия).

Типирование изолятов ВЛКРС, геном которого составляет около 9000 пар нуклеотидов (п.н.), было проведено на основе небольшого локуса епу-гена длиной 444 п.н. посредством анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализа).

Для определения подвидовой принадлежности изолятов ВЛКРС 10 мкл продукта амплификации env-гена длиной 444 п.н., ограниченного внутренними праймерами ENV3-ENV4, после проведении гнездовой ПЦР непосредственно подвергали гидролизу с 5 ед. ферментов рестрикции Bgll, PvuII и BamHI («СибЭнзим»), Рестрикцию проводили согласно указаниям производителя.

Ампликон длиной 444 п.н. подвергали гидролизу с рестриктазами Bgll, PvuII и BamHI. Ранее было показано (D. Beier et al, 2001; М. Licursi et al., 2002; А. П. Лиманский и др., 2005), что рестрикционные образцы для ПЦР-продукта с праймерами ENV1-ENV4 различаются для бельгийского, австралийского и японского изолятов провирусной ДНК ВЛКРС. Для бельгийского подвида образуются следующие продукты рестрикции: при обработке Bgll на фрагменты 330 и 115п.н.;при обработке PvuII - 280 и 164 п.н., для BamHI рестрикция не происходит. Для австралийского варианта В Л КРС: при обработке эндонуклеазой Bgll образуются рестршсгы длиной 330 и 115п.н п.н., для PvuII рестрикция не происходит; при обработке BamHI -316 и 128 п.н. Для японского подвида ВЛКРС характерны следующие образцы рестрикции: при обработке Bgll на фрагменты 330 и 115п.н., для PvuII сайты рестрикции не существуют, при обработке BamHI - 316 и 128 п.н.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel 2000.

Эпизоотическая обстановка по лейкозу крупного рогатого скота в отдельных районах изучена на основе данных ветеринарной службы за 5 лет (2001-2006 гг.) ГУВ КМ РТ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

1.Сравнение различных ПЦР Тест-систем для обнаружения провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота

Эффективность разработанных двумя фирмами ПЦР-тест-систем для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, а также методики с использованием праймеров на cnv-ген рекомендованной М. Licursi et al., (2003), изучали в производственных условиях на биоматериале, полученном от животных разных половозрастных групп.

Пробы биоматериала отбирали от животных непосредственно в неблагополучных по лейкозу хозяйствах, учитывая эпизоотологические данные районов.

Исследовались на лейкоз 96 проб крови, из которых 91 проба - кровь дойных коров, и 5 проб крови телят, в том числе 36 проб РИД положительные на лейкоз, 55-РИД отрицательно реагирующие на вирус лейкоза КРС, 5 проб крови телят 15-20 дневного возраста, не исследованные серологически. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Табл. 1.

Результаты сравнения используемых нами ПЦР тест-систем и _праймера для диагностики ВЛКРС_

№ п.п Исследуемый район Кол-во исслед. всего гол. Количество ПЦР положительных проб в результате использования тест-систем:

о с, у о Щ Вт.ч. РИД (+) РИД(-) ОепеРак ОЫА РСЛ (ёщ) «Биоком» 347 п.н. ФГУН ЦНИИЭ- «ДНК-сорб-В» фирмы «АмплиСенс» 294 п.н. Праймеры разработанные МХекига е4 а1., (еда). (2003г) 444 п.н.

1 В-Услонский 12 0 12 2 3 3

2 Высокогорский 34 20 14 20 16 22

3 Зеленодольский 22 0 22 7 5 8

4 Нижнекамский 28 16 12 24 19 24

5 ИТОГО 96 36 60 53 43 58

0,45 ■

сс

О.

0_ <и

ь: ю

с; о

со "

0,4 0,35 ■

0,3 0,25 ■ 0,2 0,15 0,1 0,05 -

йр

"Биоком" "Амплисенс" Праймеры

Используемые тест-системы

Рис. 1. Сравнительные данные различных тест-систем и метода МХесига, основанные на показателях 95% доверительного интервала.

Согласно результатам анализа (рис.1), наименьшей чувствительностью к выявлению ВЖРС обладает набор компании «Амплисенс» (дополнительно выявляется только 7 образцов у РИД-негативных животных). Достоверно большей чувствительностью (р<0,05) обладает тест-система фирмы «Биоком» и метод предложенный М.Ьекига & а!., основанный на использовании праймеров на епу-ген (дополнительно выявляется 17 и 22 образца соответственно), при этом использование праймеров позволяет выявлять большее количество инфицированных животных .

Чувствительность праймеров М. Lekursi et al, в среднем на 26% выше, чем тест- система ФГУН ЦНИИЭ- «ДНК-сорб-В» фирмы «АмплиСенс» и на 9% выше чем тест - система GenePak DNA PCR test (gag) «Биоком».

2. Исследование крови коров и телят с применением метода ПЦР

Материалом для исследований служили пробы крови и молока дойного поголовья, а также крови телят, начиная с 15-дневного возраста (по согласованию с ГУ ветеринарии РТ).

Используя отработанный метод, рекомендованный М. Licursi et al, (2003), нами исследовано 375 голов животных в т.ч. 274 головы коров и 101 теленок.

Результаты проведенных исследований коров, представленных в таблице 2 и рисунке 2, свидетельствуют о том, что среди РИД (+) (232 гол) ПЦР (+) было 203 головы, т.е. 13 % животных не несут в себе провирусную ДНК, а среди РИД (-) (28 гол) у 17 животных (60%) провирусная ДНК выявлена в геноме животного.

Табл.2.

Сравнительные данные исследований проб крови коров на выявление _ ВЛКРС различными методами__

№п.п Исследуемый район Всего гол. РИД(+) РИД(-) ПЦР(+) ПЦР(-) Гем (+) Гем (-)

Дойные коровы

1 Буинский 18 18 — 18 — Li8

2 В-Услонский 15 15 — 15 — 15

3 Зеленодольский 22 22 22 — — 22

4 Нюкнекамский 219 177 28 Г~179 40 14 177

5 Всего 274 232 28 234 1_40_ J4_ 232

Рис.2.Результаты исследования крови коров с применением метода ПЦР, основанные на показателях 95% доверительного интервала.

По результатам исследований видно, что достоверно большей чувствительностью обладает ПЦР метод, основанный на использовании праймеров на епу-ген (р<0,05).

Следовательно, серологические методы исследования не достаточны для характеристики истинной эпизоотической ситуации в животноводческих хозяйствах.

По результатам этих исследований можно заключить, что ПЦР в крови выявляет инфицированных вирусом лейкоза животных, не диагностируемых методом РИД. По нашим данным, дополнительно выявляемых инфицированных вирусом лейкоза животных составляет 6%.

Полученные нами данные о возможности выявления инфицированных животных дополнительно у РИД отрицательных животных совпадают с результатами исследований М.И. Гулюкина (2005); А.Н. Шарова (2006); Е.В. Дробот (2007).

В настоящее время традиционные методы лабораторной диагностики лейкоза крупного рогатого скота в РИД и ИФА для исследования телят до 6 месячного возраста не применимы, так как являются иммунологическими и телята до 6-ти месячного возраста остаются вне плановых исследований. Метод ПЦР позволяет обнаружить наличие генома вируса, а потому позволяет обнаружить инфицированных животных независимо от их возраста. В связи с этим были исследованы пробы крови телят из хозяйств, где доля РИД положительных коров составляет выше 30%.

Результаты этих исследований крови телят до 6-ти месячного возраста представлены в таблице 3, из которой видно, что у 21 % исследованных телят в крови обнаруживается ДНК провируса лейкоза КРС.

Табл. 3.

Результаты исследований проб крови телят методом ПЦР.

Исследуемый район Телята

Всего голов (ПЦР+) (ПЦР-)

Зеленодольский район д. Нурлаты 7 7 —

Нижнекамский район (ООО «Бахетде-Агро») 94 15 79

ИТОГО 101 22 79

Примечание: Все телята рождены от серологически и ПЦР положительных коров.

Как видно из таблицы, из 101 головы исследованных животных 22 теленка показали ПЦР положительную реакцию. Данные результаты были подтверждены исследованиями с применением тест-систем двух фирм -«АмплиСенс» и «Вюкот».

Эти данные согласуются с результатами исследований М.Ысига е1 а1., (2002, 2003), А.Н. Шарова (2006), которые считают, что процент инфицированных телят составляет до 16 %.

З.Исследования проб молока, полученных из неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота хозяйств РТ

Исследовали пробы молока коров на наличие в них провирусной ДНК ВЖРС: СХПК «им. Ленина» (д.Нурлаты Зеленодольского района Республики Татарстан) и ООО «БахетлеАгро» ф-ал «Шингальчи», «Каенлы» (Нижнекамский район Республики Татарстан), где инфицированность взрослого поголовья составляет до 55% (Б.В. Камалов, 2006).

Материалом для анализа служило молоко, отобранное индивидуально от РИД - положительных коров и сборное молоко. Образцы молока отбирали из утреннего удоя по 60-100 мл и в термосе со льдом доставляли в лабораторию. Затем проводили изолирование ДНК методом, рекомендованным производителем тест-системы «Лейкоз КРС-провирус» с дальнейшей постановкой ПДР - метода с праймерами рекомендованными М. Ьекига е! а!., (2003г). Результаты исследований проб молока представлены в таблице 4.

Табл.4.

Результаты исследований проб молока методом ПЦР

№ п.п Исследуемый район Кол-во проб ПЦР(+) ПЦР (-)

1 В-Услонский 12 3 19_

2 Зеленодольский 22 8 14

3 Нижнекамский, ф-ал «Каенлы» ООО «Бахетле Атро» 28 7 21

4 Нижнекамский ф-ал «Шингальчи» ООО «Бахетле Агро» 74 19 55

5 Всего 136 37 99

Как видно из таблицы 4, что из 136 проб исследованных по ПЦР в 37 случаях был обнаружен вирус лейкоза крупного рогатого скота, что составляет 27 %.

лунки

Рис.3. Электрофореграмма результатов ПЦР: 1,2,3,4,5 - пробы крови телят; 6,7,8 -пробы молока; 9-положительный контроль (ДНК вируса лейкоза), 10 -отрицательный контроль (дистиллированная вода).

444 пн.

На электрофореграмме зафиксировано свечение специфической полосы ампликона в пробах 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 (положительный контроль), таким образом, 5 проб крови телят (№ 1,2,3,4,5) и 2 пробы молока (№ 7,8) содержат в себе провирус лейкоза крупного рогатого скота, встроенный в геном лейкоцитов (рис.3). Проба молока №6 свечение не имеет, следовательно, амплификация не прошла из-за отсутствия провируса лейкоза.

По результатам анализа необходимо подчеркнуть, что положительная реакция на ВЛКРС была получена в 5 случаях из 10 проб сборного молока, что составляет 50%. Анализ проб молока представляет интерес для рекогносцировочных исследований, а потому необходимо эту работу продолжать с целью разработки более эффективных приемов подготовки проб и режимов ПЦР. Кроме того, отбор проб молока исключает стресс животных, связанный с взятием крови. Использование образцов молока для проведения молекулярных анализов по выявлению вируса лейкоза крупного рогатого скота является удобным объективным методом для оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах.

С эпизоотической точки зрения важно было определить фактор передачи' вируса от коровы к теленку горизонтальным, либо вертикальным путем. С этой целью было происследовано 89 проб крови и молока, полученного от коров, реагирующих положительно по серологической реакции-РИД, а также телят, рожденных от тех же самых серопозитявных коров-матерей. Для этого исследовали животных на наличие ДНК провируса лейкоза в СХПК «им. Ленина» (д. Нурлаты Зеленодольского района Республики Татарстан) и ООО «БахетлеАгро» ф-ал «Шингальчи», «Каенлы» (Нижнекамский район Республики Татарстан).

По результатам, представленным в таблице 5 (опыт №1) видно, что в 1-2 месячном возрасте исследовано 42 теленка, из них 8 голов дали ПЦР-положительную реакцию. При исследовании проб крови коров-матерей этих телят также оказались ПЦР положительными. В то же время только в 2-х случаях (коровы Т-701 и 573) в молоке была обнаружена провирусная ДНК ВЛКРС.

Табл.5.

Исследования проб ДНК из крови, молока коров-матерей и крови телят

(1-2-х-месячного возраста) (опыт №1)

№ теленка Дата Результат Корова - Результат № молок Результат ПЦР

рождения теленка ПЦР-анадиза мать ПЦР-анализа коровы. анализа

1 1330 15.08.06. отрицательн. 408 положит 14/1 положит

2 1354 06.07.06. отрицательн. 607 положит 15/1 положит

3 1352 02.07.06 отрицательн. Т27 положит 8/1 положит

4 1350 30.06.06. отрицательн. 082 положит 13/1 положит

5 1383 18.06.06. отрицательн 284 положит ---- отрицательн.

6 1345 12.07.06 отрицательн. 596 положит отрицательн.

7 13 98 08.07 06. отрицательн. 621 положит 16/1 положит

8 1376 10.0S.06. отрицательн. 385 положит 1/1 положит

9 1349 03.07.06. отрицателен 73 положит 4/1 положит

10 1377 12 07.06. отрицательн. КЗ 64 положит отрицательн.

11 1373 10.07.06. отрицательн. 0409 положит отрицательн

12 1344 03.08.06. отрицательн. 612 положит — отрицательн

13 1396 10.07.06 отрицательн. 703 положит 2/1 положит

14 1381 15 07 06. отрицательн. 0477 положит отрицательн.

15 1406 03.08.06. отрицательн. 0010 отрицательн отрицательн.

16 1412 15 08.06. отрицательн. 1036 положит — отрицательн.

17 1400 26 07.06. отрицательн. 041 положит 18/1 положит

18 1367 11.07.06. отрицательн. К619 положит отрицательн.

20 1363 06.07.06. положит Т 70] положит 17/1 ПОЛОЖИТ

21 1351 01.07.06. положит Т27 положит отрицательн

22 1389 24 07 06. положит К 587 положит — отрицательн.

23 1359 06.07.06. положит 573 положит 12/1 положит

24 1260 04.05.06. отрицательн. 30 положит ---- отриидтельн

25 1355 04.07.06. отрицательн 963 положит ----- отрицательн.

26 1300 26 05.06. отрицательн. Т 65 положит отрицательн.

27 1401 26.07.06. положит 246 положит ---- отрицательн.

28 1380 15.07.06. отрицательн. К 318 отрицательн 11/1 отрицательн

29 1390 24 07.06. положит 248 положит отрицательн.

30 1365 09.07.06. отрицательн. 617 положит отрицательн.

31 1375 09.07.06. отрицательн. 033 отрицательн 3/1 отрицательн.

32 1301 08.07.06 отрицательн. 801 положит положит

33 1374 10.07.06. отрицательн. 582 положит отрицательн.

34 1346 09.07.06 отрицательн. Т 700 положит 7/1 положит

35 1386 17.07.06. отрицательн. 739 отрицательн 6/1 отрицательн

36 1368 11.07.06. положит 322 положит отрицательн

37 1395 10 07.06. отрицательн. 620 положит ------ отрицательн.

38 1379 18.07.06. положит Т539 положит отрицательн.

39 1397 22.07.06. отрицательн. 704 положит 9/1 положит

40 1370 18.07.06. отрицательн 22 положит отрицательн.

41 1402 31.07.06. отрицательн. 0485 положит ----- отрицательн.

42 1391 26.07.06. отрицательн. 211 положит 5/1 отрицательн.

итого 8 38 14

Табл.6.

Исследования проб ДНК из крови, молока коров-матерей и крови телят _ (2-3-х-месячного возраста) (опыт №2)__

№ Дата Результат №,Ко Результат № Результат

№п.п теленка рождения ПЦР- рова - ПЦР- моло ПЦР-

теленка анализа мать анализа ка коро вы. анализа

1 00583 10.06.06 отрицательн 225 положит 1 положит

2 00584 10.06.06 отрицательн. 226 ПОЛОЖИТ 3 ПОЛОЖИТ

3 00579 10.06.06. отрицательн. 227 положит 2 положит

4 00578 10.06.06 отрицательн. 228 положит 4 положит

5 00598 11.06.06. отрицательн. 229 положит 6 положит

6 00591 09.06.06 отрицательн. 230 положит 7 положит

7 00597 ; 08.06.06. отрицательн. 233 положит 8 положит

8 00603 03.06.06. отрицательн. 234 положит 9 отрицательн

9 00599 08.06.06. положит 235 положит 10 положит

10 00602 03.06.06. положит 237 положит и отрицательн

11 00601 04.06.06. отрицательн. 238 положит 12 отрицательн.

12 4079 15.06.06 отрицательн. 239 положит 13 отрицательн

13 00595 11.06.06. отрицательн 240 положит 15 положит

14 00600 09.06.06. отрицательн. 241 положит 14 отрицательн.

15 00572 10.06.06. отрицательн. 242 отрицательн. 16 отрицательн.

16 00574 10.06.06 отрицательн. 243 положит 17 отрицательн.

17 00580 11.06.06. отрицательн. 245 положит 18 положит

18 00575 09.06.06 ПОЛОЖИТ 246 положит 19 отрицательн.

19 00573 08.06.06. положит 247 положит 20 отрицательн.

20 00576 15.06.06 отрицательн. 248 положит 21 положит

21 00581 11.06.06. отрицательн. 249 положит 22 отрицательн

22 00582 09.06.06. отрицательн. 250 положит 23 отрицательн.

23 00594 10.06.06. отрицательн. 251 положит 24 положит

24 00603 18.06.06. отрицательн 74 положит 25 положит

25 00607 17.06.06. отрицательн 75 положит 26 положит

26 00609 17.06.06. отрицательн. 76 положит 28 положит

27 00607 19.06.06. отрицательн. 77 положит 29 отрицатель«.

28 00606 18.07.06. отрицательн. 78 отрицательн. 27 отрицательн.

29 00617 08.07.06. положит 79 положит 30 положит

30 00612 15.07 06 отрицательн. 80 положит 33 положит

31 00610 11.07.06. отрицательн. 81 отрицательн. 31 отрицательн.

32 00611 09.07.06. положит 82 положит 32 положит

33 00613 10.07.06. отрицательн, 83 положит 34 отрицательн.

34 00615 18.07.06. положит 84 положит 35 положит

35 00618 11.07.06. отрицательн. 85 отрицагельп. 36 отрицательн.

36 00616 12.07.06. отрицательн 86 положит 37 отрицательн.

37 00619 21.07.06 отрицательн. 87 положит 38 отрицательн.

38 00620 07.07.06. отрицательн. 88 положит 5 отрицательн.

39 00622 18.07.06. отрицательн. 89 положит 39 положит

40 00624 08.07.06. положит 90 положит 40 отрицательн.

41 00625 20.07.06 положит 91 положит 41 отрицательн.

42 00626 22.07.06. положит 92 положит 42 отрицательн.

43 00629 18.07.06. отрицательн. 93 положит 44 отрицательн.

44 00627 17.07.06. положит 94 положит 43 полоши

45 00621 17.07.06. положит 95 положит 45 положит

46 00628 19.07.06. отрицательн 96 положит 46 положит

47 00623 18.07.06. отрицательн. 97 положит 47 отрицатель».

ИТОГО 12 43 23

У телят 2-3-х месячного возраста (табл.б) из 47 голов в 12 случаях ПЦР была положительной, коровы-матери этих телят также имеют положительную реакцию, а в молоке этих коров только в 6 случаях обнаружен провирус ВЛКРС. В целом по результатам двух опытов из 89

голов РИД положительных коров в 81 случае в крови обнаружен провирус ВЖРС, в молоке в 37 случаях, у телят, рожденных от этих коров, в 20 случаях ПЦР положительная реакция, свидельствугощая о наличии провирусной ДНК вируса лейкоза КРС в геноме животного, то есть 22 % телят инфицированы вирусом ВЛКРС.

Учитывая, что до 6-ти месяцев у новорожденных телят сохраняется колостральный иммунитет, можно сделать вывод о том , что заражение телят происходит внутриутробно (вертикальный путь передачи).

Известно, что своевременная изоляция инфицированных телят, и изолированное выращивание их, позволяет оздоровить стадо в более короткие сроки. Из представленных данных видно, что в молоке РИД (+) коров не всегда обнаруживается ВЖРС, что вероятно, связано с патогенезом лейкоза, так как известно, что вирус размножается в лимфоцитах медленно и лишь через несколько лет развивается лейкоз (к 4-5 годам), а патологические изменения в тканях - лишь к 6-7 годам (Б.В1ег е1 а!.,2004; М.И. Гулюкин, 2005).

Обобщая результаты исследований проб крови телят до 6 месячного возраста, можно отметить, что методом ПЦР удается диагностировать инфицированность теля г, начиная с 15-ти дневного возраста. Это позволяет изолировать зараженных лейкозом телят в раннем возрасте, что важно для сокращения сроков оздоровления хозяйств от этой инфекции.

4.Типированне вируса лейкоза крупного рогатого скота

Для молекулярно-генетических исследований провирусной ДНК ВЖРС, формировались выборки животных из 5 районов Республики Татарстан.

Постановку ПЦР и генотипирование вируса лейкоза проводили с использованием наиболее информативных, по нашему мнению, биологических жидкостей - пробы крови и сыворотки. Пробы молока отбирали, как альтернативу пробам крови, в диагностике и генотипировании вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Для определения подвидовой принадлежности изолятов ВЛКРС 10 мкл продукта амплификации епу-гена длиной 444 п.н., ограниченного внутренними праймерами Е>ГУЗ-ЕКП/4, после проведения ПЦР непосредственно подвергали гидролизу с 5 ед. ферментов рестрикции Bgll, РуиН и ВатН1 («СибЭнзим»). Рестрикцию проводили согласно указаниям производителя, а определения подтипа циркулирующего в хозяйствах вируса согласно работе А.П.Лиманского и др., (2005).

При проведении ПЦР сегмента гена епу был обнаружен провирус лейкоза крупного рогатого скота в 58 образцах крови. На рисунке 4 приведена типичная картина электрофореза продуктов амплификации (фрагмент гена епу, равный 444 п.н.), свидетельствующая о наличие провирусной ДНК вируса лейкоза КРС в геноме животного, После чего данные пробы были исследованы методом ПДРФ-ПЦР анализа с применением ферментов рестрикции В£11, РуиИ и ВашН1.

1 2 3 4 5 6

Рис.4. Электрофореграмма в 1,5% агарозном геле продуктов амплификации гена

env ВЛКРС; 1-5 - пробы ДНК, 6-я дорожка - маркер

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1Э 14 15 16 17 1S 19

Рис.5.Рестрикционный анализ продуктов амплификации фрагмента гена env провирусной ДНК ВЛКРС длинной 444 п.н. для 5 изолятов ВЛКРС после гнездовой ПЦР с праймерами ENV1-ENV4. Образцы рестрикции получали обработкой ампликонов ферментами рестрикции PvuII, Bgll, Ват Н1

1-Изолят№ 2 обработан PvuII ,2- Изолят № 2 обработан Bgll, 3- Изолят № 2 обработан Ват Н1, 4- Изолят № 4 обработан PvuII, 5- Изолят № 4 обработан Bgll, 61 Изолят № 4 обработан Ват Н1,7- Изолят № 8 обработан PvuII, 8- Изолят № 8 обработан

I Bgll, 9- Изолят № 8 обработан Ваш Н1, 10- Маркер молекулярной массы, 11- Маркер молекулярной массы, 12- Изолят №12 обработан PvuII, 13- Изолят №12 обработан Bgll, 14- Изолят №12 обработан Ват Н1, 15- Изолят №9 обработан PvuII, 16- Изолят №9 обработан Bgll, 17- Изолят №9 обработан ферментом Ват Н1,18- Маркер молекулярной массы, 19- Маркер молекулярной массы.

Анализ представленных на рисунке 5 данных, свидетельствует о том, что образцы полученной рестрикции показывают что: фермент PvuII расщепляет все амплификаты длиной 444 п.н. на два фрагмента -280 и 164 п.н., фермент Bgll на фрагменты 330 и 115п.н., а фермент Ват Н1 фрагментов не образует, что согласно литературным данным характерно для Бельгийского

I подтипа.

1 17

Аналогичная картина рестрикции амплификатов в 444 п.н. этими же рестриктазами получена в работах А.П.Лиманского и др,(2005),что позволяет отнести вирус лейкоза в обследуемых нами хозяйствах к Бельгийскому подтипу.

Ситуация по лейкозу крупного рогатого скота на территории республики Татарстан остается сложной. Появление в оздоровленных хозяйствах серопозитивных животных, по нашему мнению, связана не только с низкой чувствительностью РИД, но и с разнообразием генотипов вируса лейкоза и высокой вариабельностью его генома.

Работа по генотипированию ВЛКРС в Республике Татарстан нами проведена впервые, и можно быть уверенным, что изучение генотипов вируса позволит усовершенствовать методы борьбы с лейкозом и повысит эффективность противолейкозных мероприятий.

5. Исследование сывороток крови серопозитивных коров на обнаружение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) с провирусиой ДНК ВЛКРС

С целью изучения иммунных комплексов в сыворотке крови коров на наличие в них провирусной ДНК было исследовано 38 проб серопозитивных животных.

Иммунные комплексы из сыворотки крови осаждали ПЭГ-6000. Затем проводили изолирование ДНК методом, рекомендованным производителем тест-системы «Лейкоз КРС-провирус», с дальнейшей постановкой ПЦР -метода с праймерами рекомендованными М.Ьекига ег а1, (2003г).

1 2 3 4 5 6

Рис.6. Электрофореграмма в 1,5% агарозном геле продуктов амплификации гена епу ВЛКРС; 1-5 - пробы ДНК выделенные из иммунных комплексов, 6-я дорожка -маркер

На рисунке 6 приведена типичная картина электрофореза продуктов амплификации (фрагмент гена епу, равный 444 п.н.), свидетельствующая о наличие провирусной ДНК ВЛКРС в ЦИК.

В результате исследований циркулирующих иммунных комплексов получены данные, что в 24 (63%) случаях из 38 проб сыворотки, иммунные комплексы содержат провирусную ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Полученные результаты, свидетельствуют о том, что кроме основного способа распространения вируса лейкоза в организме- путем митоза инфицированных клеток (клональная экспансия), и перезаражения (виремия) существует, вероятно, еще один возможный механизм заражения -внеклеточными провирусными ДНК в составе иммунных комплексов, которые, циркулируя в крови и обладая инфекционностью, проникают в клетки, встраиваются в их геном и запускают репродукцию вируса, что вынуждает организм поддерживать активность иммунного ответа против этого вируса.

Какую еще роль играет внеклеточная провирусная ДНК в виде циркулирующих иммунных комплексов в патогенезе лейкоза крупного рогатого скота - предстоит выяснить.

6. Выявление вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (ВИКРС) среди больных и инфицированных лейкозом коров

Целью исследований является выявление возможной связи между болезнями — иммунодефицитом и лейкозом КРС, а также роли вируса иммунодефицита в патогенезе лейкоза крупного рогатого скота.

Выделенные из цельной крови КРС образцы четырех скотоводческих хозяйств четырех районов РТ, СХПК «Каргуза» (В-Услонский район)-12 образцов, СХПК «Правда» (Высокогорский район)-34 образца, СХПК «им. Ленина» (д.Нурлаты, Зеленодольского района)-22 образца, ООО «БахетлеАгро» ф-ал «Шингальчи», (Нижнекамский район)- 28 образцов были исследованы в ПЦР с использованием праймера на env -ген рекомендованной M.Lekursi et al., (2003 г.) для выявления ВЛКРС.

Всего исследовано 96 проб крови, из которых 91 проба -кровь коров, и 5 проб крови телят, в том числе 36 проб РИД положительные на лейкоз, 55-РИД отрицательно реагирующие на вирус лейкоза КРС, 5 проб крови телят 15-20 дневного возраста, не исследованные серологически (табл.7).

Эти пробы исследовали на наличие провирусной ДНК вируса иммунодефицита КРС, пользуясь методическим приемом О.Ю. Лиманской и др.,(2005), применяя праймер BIV1 - BIV2 для детекции фрагмента гена pol провирусной ДНК ВИКРС, который дает при амплификации продукт с молекулярной массой 101 п.н. (рис.7).: BIV1 (2343-2366) 5'gAATgTgAACACTTACTgCAATA-3' BIV2 (2442-2422) 5'AATCTCggACTACAgAgATCCgAC-3' Праймеры синтезированы фирмой «Литех»(Россия).

101 п.н.

Рис.7. Электрофореграмма образцов ДНК в 1,5 % агарозном геле: 1-5 - пробы ДНК; 6 - маркер.

Табл.7.

Выявление вируса иммунодефицита крупного рогатого скота у больных __лейкозом коров в республике Татарстан____

№ Исследуемый Кол-во Результаты Результаты Частота

п.п район проб ПЦР (+) ПЦР(+) коинфицирован-

ВЛКРС ВИКРС ности (ВЛКРС и

ВИКРС), %.

1 В-Услонский 12 3 (25 %) 0 (0 %) 0

2. Высокогорский 34 22 (64 %) 2 (5 %) 9

3. Зеленодольский 22 8 (36 %) 0 (0 %) 0

4. Нижнекамский 28 24 (85 %) 18(64%) 75

5 ИТОГО 96 58 (60 %) 20 (20 %) 34

Примечание: ВЖРС -ВИКРС -

вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус иммунодефицита крупного рогатого скота.

0,9 -0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

В.-Услон

8. Гора

Н-камск

Всего

□ ВЛКРС ш ВИКРС

Примечание: Пробы В-Услонского и Зеленодольского районов ПЦР (-) на ВИКРС Ряс.8,. Результаты исследований проб крови на ВИКРС методом ПЦР, основанные на показателях 95% доверительного интервала.

По результатам исследований из таблицы 7 и рисунка 8, видно, что в Нижнекамском районе в 75% случаях ВИКРС выявляется у животных инфицированных лейкозом КРС. А частота встречаемости ВИКРС на фоне ВЛКРС в Высокогорском районе 9%. В среднем частота встречаемости вируса иммунодефицита на фоне лейкоза составляет 34%.

Как видно по результатам опытов (рис.8) (Высокогорский и Нижнекамский районы) в двух хозяйствах выявлены животные коинфицированные ВИКРС и ВЛКРС. Были обнаружены животные, зараженные обоими вирусами, или одним из них, или свободные от инфекции обоими вирусами. В двух хозяйствах выявлен высокий процент инфицированных ВЛКРС животных (64 и 85%), в одном хозяйстве провирус ВИКРС обнаружен у 64% исследованных животных. С применением метода ПЦР провирусная ДНК вируса лейкоза КРС обнаружена в 58 из 96 исследованных проб, включая и пробы крови телят (5 проб), и в 20-ти пробах, включая две пробы крови телят из этих 96, обнаружена провирусная ДНК вируса иммунодефицита КРС (что составляет 20%). Следует отметить, что ПЦР отрицательные на ВЛКРС пробы крови, также отрицательно реагировали на ВИКРС, а также пробы двух исследуемых районов (В-Услонский и Зеленодольский районы) оказались свободными от иммунодефицита крупного рогатого скота.

Проведенные исследования позволили впервые в России выявить вирус иммунодефицита крупного рогатого скота в хозяйствах республики Татарстан и предположить, что эти инфекции сопутствуют друг другу.

Наши данные получили подтверждение в исследованиях В.В. Колотвина (2007), который показал, что в хозяйствах Московской области распространен вирус иммунодефицита крупного рогатого скота.

Необходимы дополнительные исследования с использованием вирусологических, иммунологических и молекулярно - генетических методов для определения роли вируса иммунодефицита в патогенезе лейкоза крупного рогатого скота.

Заключение.

В заключении следует отметить, что для выявления истинной картины эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах, недостаточно использование только серологических и гематологических методов исследований, необходимо также применение полимеразной цепной реакции, которая позволяет обнаруживать вирус у РИД - отрицательных животных и что особенно ценно - определять инфицированность телят с 15-ти дневного возраста.

здорового стада. На практике эти условия не всегда выполнимы, допускается передержка инфицированных животных, нарушения правил оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота, что ведет к увеличению сроков ликвидации этой инфекции.

Требует дальнейшего изучения природа возбудителя. Молекулярно -генетические исследования последних лет показали, что ВЛКРС подвергается мутациям и в настоящее время определено 6 генотипов этого вируса (А. П. Лиманский и др., 2005; Е.В. Дробот, 2007). Нашими исследованиями показано, что в хозяйствах Республики Татарстан циркулирует Бельгийский подтип вируса. Знание особенностей этих подтипов позволят организовать более эффективные меры борьбы с лейкозом крупного рогатого скота.

Нами впервые выявлена провирусная ДНК ВЖРС в циркулирующих иммунных комплексах сыворотки крови, что ставит новые вопросы о механизме передачи вируса.

Необходимо учесть, что наши знания о природе болезни, о патогенезе лейкоза недостаточны. Так, работами последних лет установлено, что вирусу лейкоза сопутствует вирус иммунодефицита (ВИКРС). Циркуляция вируса иммунодефицита у крупного рогатого скота, инфицированных лейкозом в нашей стране впервые установлена нами (2006) и это подтверждено работами В.В. Колотвина (2007). Изучение роли ВИКРС в патогенезе лейкоза требует дальнейших исследований.

Благодаря применению молекулярно - генетических методов в изучении ВЛКРС стало возможным значительно углубить и расширить наши знания о природе возбудителя, усовершенствовать методы диагностики, что безусловно позволит более успешно вести противолейкозные мероприятия и сократить сроки оздоровления хозяйств от этой инфекции.

Наши исследования по ПЦР -диагностике выполнялись по согласованию с ГУВ КМ РТ в хозяйствах, оздоравливаемых в соответствии с целевой программой по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота, и результаты использовались в оперативной работе ветеринарной службы Республики Татарстан.

ВЫВОДЫ

> 1.Подобраны видоспецифические праймеры на env-gen для ПЦР диагностики лейкоза крупного рогатого скота (Внешние праймеры (фрагмент 598 п.н.): env5032 (5 '-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA-3'), env5099(5 '-СССАС AAGGGCGGCGCCGGTTT-3 ');Внутренние праймеры (фрагмент 444 п.н.): env5521 (5 '-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG-3'), env5608(5 '-ААС AAC AACCTCTGGGAAGGGT-3')), для изолятов выделенных на территории Республики Татарстан, чувствительность которых, в среднем на 26% выше, чем тест - система фирмы «АмплиСенс» и на 9 % выше чем тест - система (gag) «Биоком».

У 2. Показано что для диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота может быть использована цельная кровь, сыворотка крови,

молоко, а так же пробы крови телят с 15-ти дневного возраста. Установлено, что ПЦР анализ обеспечивает более полное выявление зараженных животных.

> 3. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ анализ) изолятов из неблагополучных по лейкозу хозяйств показал, что в хозяйствах Республики Татарстан циркулирует Бельгийский подтип вируса лейкоза КРС.

> 4.Установлено, что в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), выделенных из сыворотки крови инфицированных лейкозом животных обнаружена провирусная ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота.

> 5.Выявлено наличие провирусной ДНК вируса иммунодефицита крупного рогатого скота в крови у инфицированных лейкозом животных, где среднем частота встречаемости вируса иммунодефицита на фоне BJIKPC составляет 34%.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты исследований по диагностике лейкоза крупного рогатого скота использованы при составлении целевой программы по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота в Республике Татарстан на 2006-2010 годы, где предложен ПЦР метод диагностики инфекции и типизация вируса.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Камалов Б.В. Лейкоз крупного рогатого скота / Б.В. Камалов, Ф.Ф. Зиннатов, Н.З. Хазипов, А.Х. Волков // Методическое пособие. -Казань, 2005. - 47 с.

2.3иннатов Ф.Ф. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / Ф.Ф. Зиннатов// материалы симпозиума ФГОУ «ФЦТРБ - ВНИВИ». -Казань,2005. -С. 149-151.

3.Хазипов Н.З. Обнаружение вируса иммунодефицита крупного рогатого скота у больных лейкозом коров в республике Татарстан. / Н.З.Хазипов, Г.Ф. Кабиров, Ф.Ф. Зиннатов, Р.П. Тюрикова // Материалы Всероссийской научно — исследовательской конференции. -Казань, 2006. -С. 59-61.

4.3иннатов Ф.Ф. Детеция провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота посредством полимеразной цепной реакции /Ф.Ф. Зиннатов// -Ижевск, 2006,- С. 42-46.

5.Хазипов Н.З. Генодиагностика лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)/ Н.З. Хазипов, Г.Ф. Кабиров, Ф.Ф. Зиннатов, Р.П. Тюрикова// Материалы Всероссийской научно -исследовательской конференции, «КГАВМ». -Казань, 2006.-С. 61-62.

6.Хазипов Н.З.Обнаружение вируса иммунодефицита крупного рогатого скота у больных лейкозом коров в республике Татарстан/ Н.З.Хазипов, Г.Ф.

Кабиров, Ф.Ф. Зиннатов, Р.П. Тюрикова// Ученые записки КГАВМ.-2006.-Т. 182.-С. 335-339.

7.Гибадулина И.Р.Обнаружение провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота в молоке методом ПЦР / И.Р. Гибадулина, Ф.Ф. Зиннатов// Материалы Всероссийской научно - исследовательской конференции, -Ижевск ,2006. -С. 31-35.

8.Камалов Б.В. Лейкоз крупного рогатого скота /Б.В. Камалов, Ф.Ф. Зиннатов, Н.З. Хазипов, А.Х. Волков, И.Н. Никитин, С.П. Сыромолот // Методическое пособие -Казань, 2006. - 94 с.

9.3иннатов Ф.Ф.Типирование вируса лейкоза крупного рогатого скота / Ф.Ф. Зиннатов, И.Р. Гибадулина, Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, Б.В. Камалов//Ученые записки КГАВМ.-2006.-Т.189.-С. 71-78.

Ю.Гибадулина И.Р. Использование метода полимеразной цепной реакции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота/ И.Р. Гибадулина, Ф.Ф. Зиннатов// Материалы международной студенческой научной конференции, «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки».-Троицк,2007.- С. 5357.

11. Хазипов Н.З. Выявление провируса лейкоза крупного рогатого скота в крови и молоке методом ПЦР / Н.З. Хазипов, Ф.Ф. Зиннатов, И.Р. Гибадулина, Р.П. Тюрикова// Материалы Всероссийской научно исследовательской конференции, -Оренбург,2007. -С. 78-79.

12.Зиннатов Ф.Ф. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота»/ Ф.Ф. Зиннатов, И.Р. Гибадулина, Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, Б.В. Камалов// Материалы Всероссийской научно - исследовательской конференции, «КГАВМ». -Казань,2007.-С. 17-19.

13.Якупов Т.Р. Метод ИФА в диагностике лейкоза крупного рогатого скота/ Т.Р. Якупов, В.А. Кокорев, Ф.Ф. Зиннатов, А.Х. Волков// Материалы международной студенческой научной конференции «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки». -Троицк,2007. - С. 255-258.

14.3иннатов Ф.Ф. Детекция и типизация вируса лейкоза крупного рогатого скота/ Ф.Ф. Зиннатов, И.Р. Гибадулина, Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, Б.В. Камалов.//Специальный выпуск, материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии», посвященной 20-летию Кировской государственной медицинской академии, -Киров,2007. - С. 48-50.

15.Зиннатов Ф.Ф. Молекулярная диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота./ Ф.Ф. Зиннатов, И.Р. Гибадулина, Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, Б.В. Камалов // Материалы Всероссийская научно-практической конференции с международным участием. -Москва,2007.- С. 81-82.

16.Хазипов Н.З.Внеклеточная провирусная ДНК лейкоза крупного рогатого скота в патогенезе этой инфекции / Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова, Т.Р.Якупов, Ф.Ф. Зиннатов, Б.В. Камалов// Материалы Конференции «IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов».-Новосибирск,2008,- С. 505.

17.3иннатов Ф.Ф.Индикация провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота посредством полимеразной цепной реакции /Ф.Ф.Зиннатов// Ветеринарный врач. - 2008.-№2.-С. 16-18.

18.Хазипов Н.З. Внеклеточная провирусная ДНК лейкоза крупного рогатого скота и ее роль в патогенезе этой инфекции /Н.З.Хазипов, Ф.Ф.Зиннатов, Т.Р.Якупов, Б.В. Камалов, Р.П. Тюрикова// Ученые записки КГАВМ.-2008. -Т. 192. - С. 161-164.

Контакт:

E-mail: ffzirmatov@mail ,ru

Подписано в печать 21.10.2008 г. Формат 60x84/16

Заказ № Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,0

Бумага офсетная

Центр информационных технологий ФГОУ ВПО КГАВМ 420074, Казань, Сибирский тракт, 35.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зиннатов, Фарит Фатихович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Лейкоз крупного рогатого скота.

1.2.Возбудитель болезни лейкоза крупного рогатого скота.

1.2.1 .Химический состав и геном вириона.

1.2.2.Устойчивость вируса.

1.2.3 .Антигенная структура.

1.2.4. Патогенез лейкоза крупного рогатого скота.

1.3. Эпизоотическое состояние по лейкозу в Российской Федерации.

1.4. Эпизоотическое состояние по лейкозу в Республике Татарстан.

1.5. Вирус иммунодефицита на фоне лейкоза крупного рогатого скота

1.6. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота.

1.6.1. Выявление больных коров гематологическим методом.

1.6.2.Патоморфологический метод исследования при лейкозе крупного рогатого скота.

1.6.3. Полимеразная цепная реакция.

1.6.4. Полимеразная цепная реакция в диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1.Материалы исследования.

2.2.Реактивы и оборудование.

2.3. Полимеразная цепная реакция.

2.4. Методы исследования.

2.5. Рестрикционный анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3Л.Сравнение различных ПЦР Тест - систем для обнаружения провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота.^

3.2. Исследование крови коров и телят с применением метода ПЦР.

3.3.Исследования проб молока, полученных из неблагополучных по 69 лейкозу крупного рогатого скота хозяйств РТ.

3.4.Типирование вируса лейкоза крупного рогатого скота.

3.5.Исследование сывороток крови серопозитивных коров на обнаружение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) с провирусной ДНК ВЛКРС.

3.6. Выявление вируса иммунодефицита крупного рогатого скота

ВИКРС) среди больных и инфицированных лейкозом коров.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная генодиагностика лейкоза крупного рогатого скота"

Лейкоз - это злокачественное хроническое заболевание органов кроветворения, вызывается вирусами лейкоза, характеризуется прогрессивным увеличением в крови лейкоцитов с последующим развитием опухоли лейкоза и имеет значительное распространение в РФ в том числе и на территории республики Татарстан. Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота - является РНК-содержащий вирус семейства Retroviridae, ретровирус лейкоза крупного рогатого скота (М. Licursi et al., 2003; М.И. Гулюкин,2005; А.Н. Шаров, 2006; В.А. Сергеев и др., 2007).

Установлена высокая степень сходства вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) с вирусом Т - клеточного лейкоза человека (HTLV-1, Human Т- cell leukemia virus), который имеет с ним близкое морфологическое и эволюционное родство, относится также к семейству Retroviridae, что свидетельствует об их общем пути в процессе эволюции (В.Н Сюрин и др., 2000; Р.И. Ахмедшина и др., 2006; Д.Е. Белов, 2006). Показана возможность преодоления вирусом лейкоза видовых барьеров (П.В. Филатов и др., 1974; В.П.Шишков, 1979; H.Fechner, 1995). В условиях эксперимента воспроизведена инфекция вирусом лейкоза крупного рогатого скота у овец (М.И. Гулюкин,2005). Имеются данные об экспериментальном заражении обезьян бычьим лейкозом (А.Ф. Валихов, 1992; В.Н. Сюрин и др., 2000; R. Felmer et al., 2005).

Однако, несмотря на многочисленные исследования, проводимые в данном направлении, окончательного ответа на вопрос о возможности взаимосвязи между заболеваниями лейкоза и другими болезнями опухолевой природы у животных и человека нет (M.F. Camargos et al., 2002; G. Monti et al., 2005; R. Felmer et al., 2005).

Несомненно, одной из важнейших проблем онкологии и лейкозологии является возможная связь между заболеваемостью лейкозами и опухолями животных и человека (R.M. Jacobs et al.,1995; C.ICuckleburg et al., 2003). Большой интерес представляют проблемы потенциальной опасности для человека продуктов питания от животных из стад, неблагополучных по лейкозу, влияния вредных метаболитов, накапливающихся в организме больных коров, на организм человека, а также использование животных для получения биопрепаратов. Установлено, что молоко и мясо больных лейкозом животных содержат метаболиты триптофана и других циклических аминокислот, экологически опасные для человека (М.И. Гулюкин, 2005).

BJIKPC является одним из наиболее опасных опухолевых болезней и представляет угрозу для генофонда племенного молочного скота, наносит значительный экономический ущерб животноводству республики, в результате падежа и вынужденной выбраковки животных, утилизации туш, нарушения воспроизводительной функции у больных коров и ограничений в связи с неблагополучием хозяйств (И.Н. Никитин, Б.В. Камалов, 2005).

Из литературных источников известно, что вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (ВИКРС) часто сопровождает вирус лейкоза КРС (О.Ю. Лиманская и др., 2005; Ю.Н.Федоров, О.А. Верховский, 2006). В связи с этим большой интерес представляет изучение степени коинфицированности КРС в неблагополучных по лейкозу хозяйств вирусом иммунодефицита.

Существующие традиционные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота - реакция иммунной диффузии (РИД), иммуноферментный анализ (ИФА), клинические и патологоанатомические методы, гематологические исследования не обеспечивают полного обнаружения всех инфицированных животных, так как молодняк до 6-ти месячного возраста остается вне плановых исследований в связи с тем, что методы РИД и ИФА практически не пригодны для диагностики лейкоза у телят (С.В.Чичинина и др., 2005; G. Monti et al., 2005).

Метод полимеразной цепной реакции (ПНР), основанный на обнаружении генома ретровируса, на два порядка чувствительнее и специфичнее иммунологических методов и имеет хорошую перспективу для диагностики лейкоза, так как позволяет определять наличие генов гликопротеина возбудителя лейкоза у телят с 15-дневного возраста, что крайне важно для изоляции зараженных с раннего возраста животных. По данным М.И. Гулюкина (2005); А.Н. Шарова (2006), известно, что метод ПЦР выявляет до 16% животных, зараженных вирусом лейкоза среди РИД-негативных животных, а число зараженных телят достигает до 11,6%. Кроме того, высокая чувствительность метода ПЦР позволяет использовать его для рекогносцировочных исследований путем определения возбудителя в сборном молоке (В.Н. Сюрин и др., 2000; С. Kuckleburg et al., 2003).

По принятой системе мероприятий по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота предусматриваются многократные исследования животных в неблагополучных хозяйствах с удалением зараженных животных. В связи с этим выявление зараженных животных в наиболее ранние сроки приобретает особую актуальность, и поэтому применение ПЦР в диагностике лейкоза имеет важное значение, т.к позволит ускорить сроки оздоровления хозяйств от лейкоза.

Учитывая вышеизложенное, в настоящей работе поставлены следующие задачи:

1. Выяснить эффективность и чувствительность отечественных ПЦР J тест-систем и методику с праймерами на епу-ген, рекомендованной М. Глсиш е! а1., (2003 г.) для диагностики лейкоза КРС.

2.Определить возможность использования цельной крови, сыворотки крови, молока и крови телят с 15-тн дневного возраста для диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР.

З.Генотипировать ВЛКРС, циркулирующего па территории сельскохозяйственных предприятий РТ с применением ПЦР — ПДРФ анализа.

4.Исследовать циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) в сыворотке крови на наличие в них провирусной ДНК ВЛКРС.

5.Определить степень коинфицированности ВЛКРС и ВИКРС животных в хозяйствах Республики Татарстан.

Научная новизна. Подобраны видоспецифические праймеры для идентификации ДНК провируса лейкоза и иммунодефицита КРС. Проведена оценка чувствительности и специфичности тест-систем. Проведено исследование крови и молока крупного рогатого скота из нескольких животноводческих хозяйств на содержание провирусной ДНК ВЛКРС и ВИКРС. Произведено впервые типировапие вируса лейкоза крупного рогатого скота циркулирующего на территории Республики Татарстан. Установлена циркуляция провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота в составе циркулирующих иммунных комплексов. Впервые показана коинфицированность зараженных лейкозом молочного скота вирусом иммунодефицита крупного рогатого скота на территории Республики Татарстан.

Основные положения, выносимые на защиту: ¡.Сравнительный анализ специфичности праймеров, рекомендованных М.1лсига е1 а1., (2003), с отечественными тест - системами («Ыокот», и «АмплиСенс») и оптимизация метода ПЦР.

3.Типирование вируса лейкоза крупного рогатого скота, циркулирующего на территории Республики.

4.Обнаружение провирусной ДНК ВЛКРС в циркулирующих иммунных комплексах сыворотки крови инфицированных вирусом лейкоза коров. 5.Идентификация коинфицированности крупного рогатого скота ВЛКРС и ВИКРС.

Апробация результатов исследования. Результаты работы доложены и опубликованы в материалах на Международного симпозиума «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» г. Казань, ФГУ «ФЦТРБ- ВНИВИ», ноябрь 2005; Всероссийской научно - практической конференции «Молодые ученые в реализации национальных проектов» г. Ижевск,2006; Всероссийской научно- производственной конференции, г.Казань,2006; Публикации в Ученых записках ФГОУ ВПО КГАВМ им Н.Э.Баумана- г.Казань 2006-2008гг,182 ,189, 192 тома; в журнале «Ветеринарный врач» №2 2008г, в сборнике трудов юбилейной - научно-практической конференции, посвященной 135 летию КГАВМ. г.Казань-2008г; в методических пособиях «Лейкоз крупного рогатого скота», г.Казань 2005 и 2006г; в материалах Всероссийской научно-исследовательской конференции, г.Казань,2007; на международной студенческой научной конференции «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки», Троицк-2007г; Всероссийской научно — практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» посвященная 20-ти летию Кировской государственной медицинской академии- г. Киров, 2007; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика» г.Москва 2007; Конференции «IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» г.Новосибирск-2008г;

Публикации. По материалам диссертации доложено и опубликовано 18 научных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Зиннатов, Фарит Фатихович

выводы

1.Подобраны видоспецифическне праймеры на env-gen для ПЦР диагностики лейкоза крупного рогатого скота (Внешние праймеры (фрагмент 598 п.н.): env5032 (5 '-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA-3'), env5099(5'-CCCACAAGGGCGGCGCCGGTTT-3 ');Внутренние праймеры (фрагмент 444 п.н.): env552i (5'-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG-3'), env560s(5 '-AACAACAACCTCTGGGAAGGGT-3')), для изолятов выделенных на территории Республики Татарстан, чувствительность которых, в среднем на 26% выше, чем тест - система фирмы «АмплиСенс» п на 9 % выше чем тест - система (gag) «Биоком».

2. Показано что для диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота может быть использована цельная кровь, сыворотка крови, молоко, а так же пробы крови телят с 15-ти дневного возраста. Установлено, что ПЦР анализ обеспечивает более полное выявление зараженных животных.

3. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ анализ) изолятов из неблагополучных по лейкозу хозяйств показал, что в хозяйствах Республики Татарстан циркулирует Бельгийский подтип вируса лейкоза КРС.

4.Установлено, что в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), выделенных из сыворотки крови инфицированных лейкозом животных обнаружена провирусная ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота.

5.Выявлено наличие провирусной ДНК вируса иммунодефицита крупного рогатого скота в крови у инфицированных лейкозом животных, где среднем частота встречаемости вируса иммунодефицита на фоне BJIKPC составляет 34%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты исследований по диагностике лейкоза крупного рогатого скота использованы при составлении целевой программы по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота в Республике Татарстан на 2006-2010 годы, где предложен ПНР метод диагностики инфекции и типизация вируса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В заключении следует отметить, что для выявления истинной картины эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах, недостаточно использование только серологических и гематологических методов исследований, необходимо так же применение полимеразной цепной реакции, которая позволяет обнаруживать вирус у РИД — отрицательных животных и что особенно ценно — определять инфицированность телят с 15-ти дневного возраста.

Следует подчеркнуть, что проблема лейкоза крупного рогатого скота остается сложной из-за особенностей этой инфекции. Она развивается медленно, и основной метод в борьбе с ней — ранняя диагностика и изолированное содержание инфицированных животных, изолированное выращивание инфицированного молодняка и своевременное изъятие их из здорового стада. На практике эти условия не всегда выполнимы, допускается передержка инфицированных животных, нарушения правил оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота, что ведет к увеличению сроков ликвидации этой инфекции.

Требует дальнейшего изучения природа возбудителя. Молекулярно — генетические исследования последних лет показали, что ВЛКРС подвергается мутациям и в настоящее время определено 6 генотипов этого вируса (А. П. Лиманский и др., 2005; Е.В. Дробот, 2007). Нашими исследованиями показано, что в хозяйствах Республики Татарстан циркулирует Бельгийский подтип вируса. Знание особенностей этих подтипов позволят организовать более эффективные меры борьбы с лейкозом крупного рогатого скота.

Нами впервые выявлена провирусная ДНК ВЛКРС в циркулирующих иммунных комплексах сыворотки крови, что ставит новые вопросы о механизме передачи вируса.

Необходимо учесть, что наши знания о природе болезни, о патогенезе лейкоза недостаточны. Так, работами последних лет установлено, что вирусу лейкоза сопутствует вирус иммунодефицита (ВИКРС) Циркуляция вируса иммунодефицита у крупного рогатого скота, инфицированных лейкозом в нашей стране впервые установлено нами (2006) и это подтверждено работами В.В. Колотвина (2007). Изучение роли ВИКРС в патогенезе лейкоза требует дальнейших исследований.

Благодаря применению молекулярно — генетических методов в изучении ВЛКРС стало возможным значительно углубить и расширить наши знания о природе возбудителя, усовершенствовать методы диагностики, что безусловно позволит более успешно вести противолейкозные мероприятия и сократить сроки оздоровления хозяйств от этой инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зиннатов, Фарит Фатихович, Казань

1. Арак А.П., Гольдман И.Л. Морфологические тесты ранней диагностики лимфолейкоза крупного рогатого скота. // Докл. ВАСХНИЛ, - №9 -1977 -С. 21-22.

2. Архипов Н.И. Особенности патогенеза вирусных инфекций. // Ветеринария. №9. - 1983. - С. 26-28.

3. Ахмедшина Р.И., Скворцов Е.В. Алиева 3.3., Фаизов Т.Х., Юсупов Р.Х. Разработка тест — системы для обнаружения участка гена tax провирусной ДНК лейкоза рогатого скота. Ученые записки КГАВМ.,-Казань,2006. -Т. 186. -С 3-10.

4. Белов Д.Е. Совершенствование биотехнологических и молекулярно-генетических методов при изучении генов, определяющих устойчивость к заболеваниям и молочную продуктивность// Дисс.канд.биол.наук-Ставрополь, 2006.

5. Бергольц В.М., Кисляк Н.С., Еремеев B.C. Иммунология и иммунотерапия лейкоза. -М.:Медицина, 1978.-404 с.

6. Берзеня Д.Е. Гистологическая диагностика лейкоза при экспертизе крупного рогатого скота на мясокомбинате. Ветеринария №5 — 1982 — С. 22-23.

7. Берзяк А.Г., Ковалючко B.C., Гротевич B.C., Киричук Л.И. Опыт ускоренного оздоровления племенного хозяйства от лейкоза. Ветеринария -№12 1990. - С. 13-15.

8. Бурба Л.Г. Лейкозы и злокачественные опухоли животных. Под ред. Шишкова В.П., Бурбы Л.Г. (2-е изд. перераб. и дополн.) М. Агропромиздат,1988. - С.5971.

9. Бурба Л.Г. Лейкозы и опухоли животных./ Труды ВИЭВ. М.,1981. -т.54.-с. 11-17.

10. Бурба Л.Г. Современные принципы профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота // Научн.-техн.бюл. СО ВАСХНИЛ. 1985. -№25. -С.8-13.

11. Бурба Л.Г. Экспериментальное воспроизведение лейкозов у сельскохозяйственных животных. В кн.: Проблемы экспериментальной онкологии и лейкозов человека и животных. М.: - колос, 1979. - с.229 -232.

12. Бурба Л.Г., Валихов А.Ф. Временные методические рекомендации по постановке реакции иммунодиффузии для выявления антител к антигену р24 онкорновируса в сыворотках крови крупного рогатого скота при диагностике на лейкозы. -М., 1976. 7 с.

13. Бурба Л.Г., Нахмансон В.М., Валихов А.Ф. Научные основы программы профилактики и борьбы с лейкозами животных. // Тр. ВИЭВ. 1982. Т.55. -С 16-20.

14. Бусол В.А., Лиманская ОЛО.,Лиманский А.П., Цымбал В.И. Тест-система для выявления ВЛКРС полимеразной цепной реакцией/Ветеринария.-1999-№6-С40-50

15. Бусол В.А., Доронин H.H., Субаев Г.Х. О генетической предрасположенности к лейкозу, внутриутробной и горизонтальной передаче его крупному, рогатому скоту. -В кн.: Лейкоз крупного рогатого скота.- Рига:3инатне,1973- С.32-33.

16. Валихов А.Ф. Биологические свойства вируса лейкоза крупного рогатого скота: диагностика и профилактика инфекции // Автореф. дисс. докт. биол. наук. М.,1992. 46 с.

17. Валихов А.Ф., Бурба Л.Г., Нахмансон В.М. Распространение онкорновируса крупного рогатого скота в неблагоприятных по лейкозу хозяйствах//Ветеринария . 1977. - №3. - С.40-43.

18. Валихов А.Ф., Надточей Г.А., Ваганова Н.Г., Бурба Л.Г., Симонян Г.А., Сурин Б.И. Вирус типа С в культуре лимфоцитов крови коров, больных лейкозом. Ветеринария.- №4. - 1974.- С. 43-45.

19. Васильев Н.Т. Лейкоз крупного рогатого скота //Ветеринария. 1960. -№12.- С.61-63.

20. Васильев Н.Т., Румянцев Н.В., Черняк В.З. Лейкозы сельскохозяйственных животных. М. - Колос, 1966. - 143.с.

21. Васин A.B. Термоустойчивость ретровируса лейкоза крупного рогатого скота в молоке. // Тез. докл. Всесоюзн. Конф. "Распознавание и меры борьбы с лейкозами человека и животных". -М.,1982. 196 с.

22. Вертинский К.И., Шишков В.П. Некоторые данные о лейкозе крупного рогатого скота //Тр. Всесоюз. межвуз. конф. по патологической анатомии сельскохозяйственных животных. 1961. - С.31-36.

23. Галеев Р.Ф. Принципы оздоровления стад крупного рогатого скота с высоким процентом инфицированности вирусом лейкоза. // В сб.: Состояние и пути развития животноводства в Республике Башкортостан. Тез. докл. Уфа, 1994. - С. 17-18

24. Галеев Р.Ф. Характеристика гематологических показателей и серологических реакций у коров, спонтанно инфицированных вирусом лейкоза. //11 съезд гематологов и патоморфологов. Тез. докл. М., 1985. 335с.

25. Горегляд Х.С., Лемеш В.М. некоторые данные о распространении лейкоза крупного рогатого скота в Белоруссии // Матер. Докл. Науч. конф., поев. 50-летию Донского сельскохозяйственного института. -Персиановка, 1966. С.81-83.

26. Грек К.П. Состояние диагностических исследований на лейкоз в центральном федеральном округе РФ за 2004 год // Матер. Научн.-произ. конф. Екатеринбург, 2005.

27. Гулюкин М.И. Исключить крайности в проведении противоэпизоотических мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота // Матер. Научн.-произ. конф. — Екатеринбург, 2005.

28. Гулюкин М.И., Васин A.B., Замараева Н.В. Пути передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота //Ветеринария. 1990. -№1. - С.27-30.

29. Гулюкин М.И., Нахмансон В.М., Дун Е.А. Серологический метод диагностики в системе противолейкозных мероприятий. // Ветеринария,№7. 1997 - С.12-14

30. Гулюкин М.И., Симонян Г.А., Ажиркова H.A. Обзор эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота // газета «Ветеринарная жизнь», № 6, март 2005г.

31. Двойников В.К., Смирнов П.Н. Система борьбы с эпизоотологии лейкоза крупного рогатого скота и результаты её реализации в районе // Ветеринария, 1994, №12, -С. 6-9.

32. Дробот Е.В. Результаты изучения генотипического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота и особенности эпизоотологического и гематологического проявления лейкоза// Дисс.канд.биол.наук-Новосибирск, 2007.

33. Дун Е.А. Сравнительное изучение лейкоцитарного профиля (абсолютного лимфоцитоза) у крупного рогатого скота до и после оздоровления. // Тр.ВИЭВ, М., 1991. - Т. 70.- 26с.

34. Ермолаев Б.Б. К вопросу о дифференциальной гематологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота // Сб. научн. Тр. Донского сельскохозяйственного института. 1962. - Т.2 - Вып.2. - С. 50-57.

35. Жданов В.М., Парфанович М.М. Выделение лейковируса из линий клеток лимфатического узла теленка // Ветерианрия, 1974. - №4. - С. 45-46.

36. Камалов Б.В. Лейкоз крупного рогатого скота в Республике Татарстан и меры борьбы с ним// Дисс.канд.вет.наук Казань, 2006.

37. Камалов Б.В., Зиннатов Ф.Ф., Хазипов Н.З., Волков А.Х., Никитин H.H. Сыромолот С.П., Лейкоз крупного рогатого скота //Методическое пособие, Казань, 2006г. 94 с.

38. Колотвин В.В. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота: индикация инфекции и распространенность в хозяйствах Российской Федерации. // Дисс.канд.биол.наук Москва, 2007.

39. Колчин П.Ф., Симонян Г.А. О путях передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота //Бюлл. ВИЭВ. 1988. - Вып.67. - С. 105-108.

40. Коромыслов Г.Ф. Лейкозы и опухолевые болезни сельскохозяйственных животных. // Тр. ВИЭВ М. 1991. - Т. 70. - 377 с.

41. Косенко М.В., Соколов P.C., Ткачук А.П. Опыт работы по борьбе с лейкозом в хозяйствах Московской области. // Ветеринария. №1 — 1991 . -13с.

42. Крикун В.А. Бюллютень ВИЭВБ 1996 Б77Б49Ю

43. Крикун В.А. Гулюкин М.И. Научно-практическое значение вирусо-иммуногенетической теории В.П. Шишкова в изучении лейкоза крупного рогатого скота (к 70-летию со дня рождения) / В.А. Крикун, М.И. Гулюкин // Тр. ВИЭВ. 1999. Т. 72.С. 12-15.

44. Крикун В.А., Куликов В.Г., Нагаева Л.И. Эффективность РИД с двойным антигеном онкорнавируса типа С при оценке эпизоотического состояния хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота. — Рига: Зинатне, 1979.-С. 130-140

45. Кудрявцев A.A., Кудрявцева Л.А. Клиническая гематология животных. --М.:Колос,1974. 322с.

46. Кудрявцева Т.П. Лейкоз животных. — М.:Россельхозиздат,1980- 158с.

47. Кузин А.И. , Закрепина E.H. Влияние лейкоза на продуктивность коров и качество молока. Ветеринария. №2. 1997. - 19с.

48. Кузнецов А.П., Маринин Е.А. Прогнозирование течений эпизоотического прогресса при лейкозе крупного рогатого скота .Ветеринария. №2 — 1995. 15с.

49. Кузнецов А.П., Смирнов В.П. Проблемы лейкоза сельскохозяйственных животных. Ветеринария. №3 1998 —С.32-33.

50. Кузьмичев B.C. Гематологические и серологические исследования при лейкозе. Ветеринария. №3 .- 1981 - С.63-65

51. Кукайн P.A., Нагаева Л.И. Вирус лейкоза крупного рогатого скота . -Рига: Зинатне, 1982.

52. Лактионов A.M. Современное состояние научных исследований лейкозов крупного рогатого скота. В кн.: Лейкозы сельскохозяйственных животных. -М.:Колос, 1975. С.3-16

53. Лиманский А.П., Лиманская О.Ю. Молекулярно-генетические методы — основа программ по искоренению лейкоза крупного рогатого скота/ А.П. Лиманский, О.Ю. Лиманская//Биотехнология.-2001.-№3-С 40-50.

54. Лиманская О.Ю.До1а M.,Bicka L.Kuzmak J., Лиманский А. Детекция провирусной ДНК вируса иммунодефицита крупного рогатого скота посредством полимеразной цепной реакции.// ж-л Вопросы вирусологии №2.2005.С 38-43.

55. Лиманский А. П., Geue L., Лиманская О. Ю., Beier D. Типирование вируса лейкоза крупного рогатого скота, циркулирующего в Украине.// ж-л Вопросы вирусологии №2.2005.С 39-44.

56. Малоголовкин С.А. Роль моноклопальных антител в диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Ветеринария. №4.- 1997. - 16с.

57. Маринин Е.А., Кузнецов А.П. Прогнозирование сроков оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота. Ветеринария. -№6 — 1996 -С.31-33

58. Нахмансон В.М. Лейкоз крупного рогатого скота.-М.:Агропромиздат, 1986.-221 с.

59. Нахмансон В.М. Тез.докл. научн.-произв. Конф. ВНИИЗЖ, 1995. —172с.

60. Никитин И.Н., Камалов Б.В. Экономическое обоснование целевых программ профилактики и ликвидации особо опасных болезней животных в Республике Татарстан // Мат. научн.-произв. конф. ВНИВИМ, г. Покров, 2005.

61. Паракин В.К. О горизонтальных путях передачи лейкозов крупного рогатого скота. В кн.: Проблемы экспериментальной онкологии и лейкозов человека и животных. М.: Колос, 1979. С.238-240

62. Петров И.Н. Обнаруживающие результаты есть, возвращаясь к теме лейкозов КРС. Ветеринарная газета. №1 — 1998. 5с.

63. Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота от 23.02.99 г. и от 11.05.99 г. утвержденные Министерством сельского хозяйства и продовольствия РФ.

64. Румянцев H.B. Лейкоз (лейкемия) крупного рогатого скота //Ветеринария. -1959. №8. С. 41-43.

65. Румянцев Н.В. О лейкозе крупного рогатого скота // //Ветеринария. -1963.-№4. -С. 20-24.

66. Румянцев Н.В., Шаберникова Т.М. Современные данные по лейкозу крупного рогатого скота //Ветеринария. 1963,-№4. С. 20-24.

67. Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г.Структура и биология вирусов животных М, 1983.

68. Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.Н., Вирусы и вирусные вакцины. М,2007.

69. Симоварт Ю.А., Бурба Л.Г., Лакт Т.Н., Валихов А.Ф. Инфицированность коров вирусом лейкоза крупного рогатого скота. // Тр. ВИЭВ Лейкозы с-х.животных. -М.,1983. -Т.59.- С.87-91

70. Симонян Г.А., Абрамян А.Т. Внутриматочный pH лимфоцитов крови у здоровых и больных лейкозом коров. Ветеринария. №3 - 1990.- С.25-26

71. Симонян Г.А., Хисамутдинов Ф.Ф. Ветеринарная гематология. —М.: Колос, 1995.-С. 99-104.

72. Синев A.B. К вопросу о лейкозах у млекопитающих //Сборник работ ЛВИ. Л, 1975. Т.16. - С. 61-64.

73. Смирнов П.Н. Практические аспекты лейкоза крупного рогатого скота .Ветеринарная газета .-№13. —1998. 4с.

74. Смирнов П.Н., Белявская В.А., Дробот Е.В. Особенности патогенеза гемабластозов крупного рогатого скота и перспективы научных исследований в области вирусного лейкоза // Матер, научн.-произ. конф. — Екатеринбург, 2005.

75. Смирнов П.Н., Киселев A.B., Левашов А.Т. и др. О путях передачи лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринария. 1988. - №12. - С. 2831.

76. Стельмах A.A. О лимфаденозе сельскохозяйственных животных // Ветеринария. 1960. - №12. - С. 35-37.

77. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных, Москва,ВНИТИБМ,1998. С 98-106.

78. Сюрин В.Н. Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология ,2000.С 134-163.

79. Сюрин В.Н. Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Вирус лейкоза крупного рогатого скота. -М.:МВА. 1986.- С.76-85

80. Сюрин В.Н., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных. М.:Агропромиздат, 1991. С.38-50

81. Федоров Ю.Н., Верховский O.A. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота// Ветеринария №10. 2006.С 17-19.

82. Филатов П.В., Бурба Л.Г., Князева Л.А., Баранов В.Г. Экспериментальное воспроизведение лейкоза крупного рогатого скота на телятах и ягнятах // Бюлл. ВИЭВ 1974,- 17. - С. 14-15.

83. Хазипов Н.З., Аскарова А.Н. Молекулярная генодиагностика в ветеринарии.-Казань, 2002-100с

84. Хисамутдинов Ф.Ф., Никитин H.H. Система противоэпизоотических мероприятий в скотоводстве. Казань, 1996. -304 с.

85. Хисамутдинов Ф.Ф., Никитин И.Н. Экономический ущерб от лейкоза крупного рогатого скота в Татарии. Ветеринария. №10 — 1996.- 12с.

86. Черняк В.З. Материалы по лейкозам млекопитающих // Сборник работ ЛВИ. Л., 1957. - Вып. 16. - С. 112-115.

87. Чичинина С.В., Храмцов В.В., Смирнов П.Н. Возможности и ограничения использования ПЦР в диагностике BJIKPC // Матер. Научн.-произ. конф. Екатеринбург, 2005.

88. Шаров А.Н. Тест-системы ПЦР при диагностике лейкоза КРС// Ветеринарный консультант №5.2006.С 5-9.

89. Шишков В.П., Бурба Л.Г., Валихов А.Ф. и др. Выявление онкорновируса в сперме быков-производителей //Сборник статей Донского СХИ. -Пермановка, 1980.- Т. 15. Вып.44. - С. 6-9.

90. Шишков В.П., Валихов А.В. Серологические методы выявления животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота. В кн.: Лейкозы и злокачественные опухоли животных, по ред. Шишкова В.П., Бурбы Л.Г. -М.: Агропромиздат, 1998.- СЛ73-194

91. Шишков В.П., Кукайн Р.А., Кумков В.Т. и др. Иммунология лейкозов крупного рогатого скота. -В кн.: Проблемы экспериментальной онкологии и лейкозов человека и животных. М.:Колос,1979. — С.261-264.

92. Baumgartener, L.E. and C. Olson (1982): Host range of bovine leukosis virus: preliminary report. Curr. Top. Vet. Med. Sci., 15, 338-347

93. Bederke C., Tolle A. Zur Bertragbaukeit der Rinberleukose durch das Bildanda der Kontakt mit experimentelle behandelten tieren // Zbl.Vet. Med. Reine. 1969. B.ll - №5. - P. 101-109ro

94. Beier D., Blankenstein P., Marquardt O., Kuzmak J. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RELPA and DNA sequencing // Berl. Munch. Tierarztl. Wschr. 2001. Bd 114.-S. 252-256

95. Beier, D., E. Starick, W. Wittmann und B. Nitschke (1987): Blutserologische, pathologischhistologische und hämatologische Untersuchungen an mit bovinem Leukosevirus infizierten tumorösen Rindern.Arch. Exper. Vet. Med., 41,763-766.

96. Bendixen N. Metoden und Ergebnisse der Systematischen Bekampfund der Rinderleukose in Danemark // Dt.tierarztl.Wschr. 1961. - V.63. - P.4.

97. Bendixen N.J. Stadies of leukosis enzootic bovis with special regard to diagnosis epidemiology and eradication. In: Leukosis Ensootica Bovis. Diagnostic,Epidemiologi, Bekamples// Carl Er.Mortensen, Copenhagen.-1963.

98. Bier, D., Riebe, R., Blankenstein, P., Starick, E., Bondzio, A.,Marquardt, O. Establishment of a new bovine leukosis virus producing cell line. Journal of Virological Methods 121 (2004) 239-246.

99. Bicka L., Kuzmak J., Rola M. Beier D. Detection of genetic diversity among bovine leukemia virus population by single-strand conformational polymorphism analysis Bull. Vet. Inst. Pulawy 46, 205-212, 2002.

100. Bottger T. Ezmittlungen zur Frage der Vorursachung der tumorsen Form der Rinderlenkose //Dt.tierarztl. Wschr. 1956. - V.63. - P.23-24.

101. Bruck, C., D. Porteteile, A. Burny and J. Zavada (1982): Topographical analysis by monoclonal antibodies of BLV-gp51 epitopes involved in viral functions. Virology, 122, 353-362

102. Camargos, M.F., Stancek, D., Rocha, M.A., Lessa, L.M., Reis, J.K., Leite, R.C., (2002) Partial sequencing of env gene of bovine leukaemia virus from Brazilian samples and phylogenetic analysis. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 49: 325-331.

103. Dube, S., Dolcini, G., Abbott, L., Mehta, S., Dube, D., Gutierrez, S., Ceriani, C., Esteban, E., Ferrer, J., Poiesz, B. (2000) The complete genomic sequence of a BLV strain from a Holstein cow from Argentina. Virology 277: 379-386.

104. Egenhoy J. Limphozytomatosis (Knuth n. Volkmann) bie Dnischer Rindern // Dt.Tierztl. Wschr. 1942. - V.50 - S.45-46.

105. Fechner, H., Blankenstain, P., Looman, A., Elwert, J., Geue, L., Albrecht, C.,

106. Kurg, A., Beier, D., Marquardt ,0., Ebner, D.: Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle. Virology, 1997,237,261-269.

107. Ferrer J.F., Avila L., Stock N.D. Recent electron microscopic and immunologic studies on bovine cell cultures containing c type viruses //Bibl. Haemotol. - 1973. - V.39. - P.206 - 214.

108. Ferrer J.F. Bovine leukosis: Natural transmission and principles of control // J.A.V.M.A. 1979. - V.175. - P.1281 - 1286

109. Ferrer J.F. // Abv veterinary Scince and comp medicine. 1980. - V.24. - P.l.

110. Ferrer J.F., Kenyon S.J., Gupta P. Milk of dairy cows frequently contains a leukemogenic virus. Scince, 1981. v 213. №4511.-P. 1014-1016

111. Forther J. Untersuchengen der Rinderleukose //Lschr.Infkrkh. Haustiere. -1944. -V.60.-S. 215-233.

112. Grundboeck M., J. Kuzmak and E. Buzala (1994): Syncytial testing in the diagnosis of bovine leukemia-possibilities and limitationes. Medycyna Wet., 50, 205-207.

113. Jazvey K. Mansky, L., Temin, H.Bovine leukemia virus Virol, 1990,175,10.

114. Johnston, E.R., Albritton, L.M., Radke, K. (2002) Envelope proteins containing single amino acid substitutions support a structural model of the receptor-binding domain of bovine leukemia virus surface protein. J Vim. 76: 10861-10872.

115. Kabeya, H., Ohashi, K., Onuma, M. 2001: Host immune responses in the course of bovine leukemia virus infection. J. Vet. Med. Sci.63,703-708.

116. Kalvatchev, Z., Walder, R., Garzaro, D., Barrios, M.: Detection of geneticdiversity among bovine immunodeficiency virus population by singlestrand conformational polymorphism analysis. Viral Immunol., 2000, 13, 373-381.

117. Kono, Y., Hatakeyema, H., Lshikawa, H., Sentsu, H. Titrs of antibodies in cattle clinically and subclinically infected by bovine leukemia virus. — Vet. Microbiology, 1981. v. 6.-P. 167-170

118. Krollpfeiffer H. Beobachtungen bei der Auswertung von Schadenfallen infolge tumoroaen leukose //Berl. Und Munch. Tierarztl. Wsch. 1965. -V.78. - S. 7- 10.

119. Kuckleburg,C., Chase,C., Nelson,E., Marras,S.,Dammen,M.,Christopher-Hennings,J.,2003. Detection of bovine leukemia virus in blood and milk by nested and real-time polymerase chain reactions. J.Vet.Diagn.Invest. 15,7276.

120. Kuzmak, J., A. Skorupska, A. Moussa and J. Grandboeck (1993): Application ofnonradioactive method of DNA detection in the diagnosis of bovine leukemia virus infection.Bul. Vet. Inst. Pulway, 37, 3-8.

121. Kumar, S., Tamura, K., Jakobsen, I.B., Nei, M. (2001) MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software. Arizona State University, Tempe, Arizona, USA.

122. Licursi.M.,Inoshima Y.,Wu, D.,Yolcoyama,T., Gonzalez,E.,Sentsui,H.,2002. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts.Virus.Res. 86 101-110

123. Licursi.M.,Inoshima Y.,Wu, D.,Yokoyama,T., Gonzalez,E.,Sentsui,H.,2003. Provirus variants of bovine leukemia virus in naturalli infected cattle from Argentina and Japan. Vet.Microbiol. 96, 17-23

124. Limansky A., Limanskaya O. Comparison of primer sets for detection of bovine leukemia virus by polymerase chain reaction //Bull.Vet. Inst, in Pulawy-2002- Vol. 46. P. 27-36

125. Mammerikcx M. La race rage et le pourcenragage d'infection des bovines leucemiques dans les foers decouverts en Belgegue // Ann. Med. Veter. -1974.-V.116.-S.575 580.

126. Mammerikcx M. La transmission vortiale ot horisontale de la leucose bovine enzootigue. Premiere reclcultats apres cing annecs d'experimentation // Ann. Med. Veter. 1972. - V.l 16. - N.7. - P.647-659.

127. Mammerickx, M., D. Portetelle and A. Burny (1981): Experimental cross-transmissions of bovine leukemia virus (BLV) between several animal species. Zbl. Vet. Med. (B), 28, 69-81.i

128. Mansky, L., Temin, H.: Lower mutation rate of bovine leukemia virus relative to that of spleen necrosis virus. J. Virol., 1994, 68, 494-499.

129. Marsolais, G., Dubuc, R., Bergeron, T, Morrcy, .I.D., Kelly. E.T. Jackson, M.K., 1994. Importance of primer selection in the application of PCR technology to the diagnosis of bovine leukemia virus. .1. Vet. Diagn. Invest. 6,297-301.

130. Martin, D., Arjona, A., Soto, 1., Barquero, N., Viana, M., Gomez-Lucia, E., 2001. Comparative study of PCR as a direct assay and ELISA and AGID as indirect assays for the detection of bovine leukaemia virus. J. Vet. Med. B 48, 97-106.

131. McGiiT, K. M. and Buehring, G. C. tax and rex Sequences of Bovine Leukaemia Virus from Globally Diverse Isolates: Rex Amino Acid Sequence more Variable than Tax. J. Vet.Med. B52, 8-162005).

132. Meas, S., Ohashi, K., Sugimoto. C., Onuma, M. 2001. Phylogcnetic relationships of bovine immunodeficiency virus in cattle and buffaloes based on surface envelope gene sequences. Brief report. Arch. Viral. 146, 1037 1045.

133. Meas, S., Usui, T., Ohashi, K., Sugimoto, C., Onuma, M. 2002. Vertical transmission of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency virus in dairy cattle herds. Vet. Microbiol. 84, 275- 282.

134. Meas, S., Nakayama, M., Usui, T., Nakazato, Y., Yasuda, J., Ohashi, K., Onuma, M. Evidence for bovine immunodeficiency virus infection in cattle in Zambiajpn J Vet Res. 2004 May;52(l):3-8:

135. Meas, S., Yilmaz, Z., Usui T., Torun, S., Yesilbag, K., Ohashi, K., Onuma, M. Evidence of bovine immunodeficiency virus in cattle in Turkey .Jpn J Vet Res. 2003 May;51(l):3-8.

136. Meyer, A. Zur Probleme der leulcose der Rinders //Mh.Veter. Med. 1961. -V. 16.-S. 201 -205.

137. Miller J.M., Miller L.D., Olson C., Gillette K.G. Virus like particles in phytohemagglutinin stimulated lymphocyte cultures //Wint reference to bovine lymphosarcoma/J.Nat. Career. Inst. - 1969. - V.43. - P. 1297 - 1305.

138. Miller J.M., Miller L.D., Olson C., Inoculation of calves with particles resembling C type vims from cultures of bovine lymphosarcoma //J.Nat. Career. Inst. - 1972. - V.48. - №2. - P. 423-428.

139. Miller J.M., van der Maaten M.J. Serogical Detection of bovine leukemia virus infection. -Vet. Microbiology 1976. 1. P. 195-202

140. Miller, J.M., Miller, L.D., Olson, C. J.Nat. Cancer Inst. - 1969. - V.43 -P. 1297- 1305.

141. Molteni, E., Agresti, A., Meneveri, A., Marozzi, A., Malcovati, M., Bonizzi, L., Poli, G., Ginelli, E.: Molecular characterization of a variant of proviral bovine leukemia virus (BLV). J. Vet. Med. B, 1996, 43, 201211.

142. Monti G, Schijver R, and Bier D. Genetic diversity and spread of Bovine leukaemie virus isolates in Argentine dairy cattle.Arch Virol (2005) 150' : 443-458.

143. Orr, K.A., O'Reilly, K.L. Scholl. D.T., 2003. Estimation of sensitivity and specificity of two diagnostic tests for bovine immunodeficiency virus using Bayesian techniques. Prev. Vet. Med. 61. 79-89.

144. Oshima K., Okada K., Numakunai S., Yoheyama Y., Sato S., Takahaski K.Evidence on Horisontal Transmission of Bovine Leukemia Virus due to Bloodsucking Tabanid flies. Jap.J. Vet.Sci., 1981. v. 43. -P.70-80.

145. Pamba, R., Jeronimo. C., Archambault, D., 1999. Detection of bovine retrospumavirus by the polymerase chain reaction.J Virol. Meth. 78, 199208.

146. Patil, S ., Pattnaik, B., Mishra, N., Banumathi, N., Pradhan, H. K.: Detection of proviral genomic sequence of bovine immunodeficiency virus in Indian cattle.Current Science,vol.84,No 4,25. February 2003.

147. Piper, C.E., J.F. Ferrer, D.A. Abt and R.R. Marshak (1979): Postnatal and prenatal transmission of the bovine leukemia virus under natural conditions. J. Natl. Cancer Inst., 62, 165-168.

148. Reichert, M.: Characterization of the genetic variants of bovine leukemia provirus isolated in Poland. Ann. Univ. Maria Curie-Sklodowska, Sectio1. DD, 2000, 55, 93-106.

149. Reimer H. Die Leukemie das Rindes // Mitt. Deutsch. Landw. Ges. 1933. -№48. - S. 974.

150. Rice, N.R., R.M. Stephens, D. Couez, J. Deschamps, R. Kettmann, A. Burny and R.V. Gilden (1984): The nucleotide sequence of the env gene and post-env region of bovine leukemia virus. Virology, 138, 82-93.

151. Rola, M., Kuzmak, J. The detection of bovine leukemia virus proviral DNA by PCR- ELISA. Journal Virological Methods, v. 99, n. 1-2, p. 33-40, 2002.

152. Sagata, N., J. Tsuzuku-Kawamura, M. Nagyoshi-Aida, F. Shimizu, K.I. Imagawa and Y. Ikawa (1985a): Identification an some biochemical properties of the major XBL gene product of bovine leukemia virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7879-7883

153. Sagata, N., T. Yasunaga, J. Tsuzuku-Kawamura, K. Ohishi, Y. Ogawa and Y. Ikawa (1985b): Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: Its evolutionary relationship to other retroviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 677-681.

154. Sagata, N., T. Yasunaga and Y. Ikawa (1985c): Two distinct polypeptides may be translated from a single spliced mRNA of the X genes of human T cell leukemia and bovine leukemia viruses. FEBS Letters, 192, 37-42.

155. Salmon, M.A., Vendrame, M., Kummert, J., Lepoivre, P., 2002. Detection of apple chlorotic leaf spot virus usins a 5' nuclease assay with a fluorescent 31 minor groove binder-DNA probe. J. Virol. Meth. 104, 99-106.

156. Scobie, L., Venables, C., Sayers, A., Weightman, S., Jarrett, O., 2001. Prevalence of bovine immunodeficiency virus infection in cattle in Great Britain. Vet. Rec. 149, 459-460.

157. Suarez,D.L., Van Der Maaten, M.J., Whetstone, C.A., 1995. Improved early and long-term detection of bovine lentivirus by a nested polymerase chain reaction test in experimentally infected calves. Am. J. Vet. Res. 56, 579-586.

158. Suarez, D.L., Whetstone, C.A., 1998. PCR diagnosis of the bovine immunodeficiency-like virus. In: Meltzer S.J. (Ed.), Methods in Molecular biology, vol. 92. PCR in Bioanalysis, Human Press, Totowa, NJ, pp. 67-79.

159. Schwartz, I. and D. Levy (1994): Pathobiology of bovine leukemia-virus.Vet. Res., 25, 521-536.

160. Tajima, S. and Y. Aida, 2000: The region between amino acids 245 and 265 of the bovine leukemia virus (BLV) Tax protein restricts transactivation not only via the BLV enhancer but also via other retrovirus enhancers. J. Virol. 74, 10939-10949.

161. Usui, T., Konnai, S., Tajima, S., Watari, S., Aida, Y., Ohashi, K., Onuma, M. 2003: Protective effects of vaccination with bovine leukemia virus (BLV) tax DNA against BLV infection in sheep. J. Vet. Med. Sci. 65, 12021205.

162. Wand, E., Vartanian, J., Pannetier, C., Wain-Hobson, S.: Clonal expansion of human T-cell leukemia virus type 1-infected cells in asymptomatic and symptomatic carriers without malignancy. J. Virol., 1995, 69, 2863-2868.

163. Willems, L., Thienpont, E., Kerkhofs, P., Burny, A., Mammerickx, M., Kettmann, R.: Bovine leukemia virus, an animal model for the study of intrastrain variability. J. Virol., 1993, 67, 1086-1089.

164. Weisner E. Beitrag zur Etiology des Rinderleukose // Baden Rosse, Alter. / Mh.Veter. - Med. - 1959. - V.14. - P.19.

165. Willems, L., P. Kerkhofs, M. Mammerickx and R. Kettmann (1995): Lack of LTR and env genetic variation during bovine leukemia virus induced leukemogenesis.Virology, 206, 769-772.

166. Yakobson, B., Brenner, J., Ungar-Waron, H., Trainin, Z., 1998. Short-termed expression of interleukin-12 during experimental BLV infection may direct disease progression to persistent lymphocytosis. Vet. Immunol. Immunopathol. 64, 207-218.

167. Zaghawa, A., Beier, D., Abd El-Rahim H. et al. An outbreak of enzootic bovine leukosis in Upper Egypt: clinical, laboratory and molecular-epidemiological studies // J. Vet. Med. — 2002.- Vol. B49. P. 123-129.1. ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ

168. ВЕТЕРИНАРИИ КАБИНЕТА МИНИСТРОВ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН420073 , г. Казань, ул. Шуртыгина, 4 Тел. 295-08-49,299-72-18, 299-70-83 Факс 295-08-291. E-mail: guv.km.rt@mail.ru

169. Ф.Ф. Зиннатова в производство.

170. Начальник Главного управления ветерин Кабинета Министре Республики Татарст

171. Хабибуллина Л.Р. /295-08-49/1. Б.В. Камалов

Информация о работе

Зиннатов, Фарит Фатихович
кандидата биологических наук
Казань, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Молекулярная генодиагностика лейкоза крупного рогатого скота - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы