Эффективность диагностических тестов в выявлении вируса лейкоза крупного рогатого скота в оздоравливаемых от лейкоза стадах

Петропавловский, Максим Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Эффективность диагностических тестов в выявлении вируса лейкоза крупного рогатого скота в оздоравливаемых от лейкоза стадах
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Эффективность диагностических тестов в выявлении вируса лейкоза крупного рогатого скота в оздоравливаемых от лейкоза стадах"

Петропавловский Максим Валерьевич

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТОВ В ВЫЯВЛЕНИИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ОЗДОРАВЛИВАЕМЫХ ОТ ЛЕЙКОЗА СТАДАХ ~

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

- 2 ПЕН 2010

Екатеринбург - 2010

004615353

Научный руководитель:

академик РАСХН,

доктор биологических наук, профессор Донник Ирина Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ Околелов Владимир Иванович

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный врач РФ Бейкин Яков Борисович

Ведущая организация: ФГУ ВПО Уральская государственная академия ветеринарной медицины (г. Троицк).

Защита состоится^^¿Я^/^Я/ 2010 года в « УХ на заседании диссертационного совета Д 006.099.0lf при 1*1 ГУ Уральском научно-исследовательском ветеринарном институте РАСХН (корпус №2 ул. Главная, 21).

Адрес: Уральский НИВИ 620142 г. Екатеринбург, ул. Белинского 112а, тел/факс (343) 257-64-82,257-82-63. Адрес сайта института: http:// www.urnivi.ru E-mail: info@urnivi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Уральского научно-исследовательского ветеринарного института Россельхозакадемии

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Печура Е.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальности темы. Одним из самых распространенных хронических инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, наносящих значительный экономический ущерб животноводству, является лейкоз крупного рогатого скота (BJ1 КРС). Проблема лейкоза имеет общебиологическое и медицинское значение ввиду близкого морфологического и эволюционного родства вируса лейкоза крупного рогатого скота с вирусами Т-клеточного лейкоза человека и до настоящего времени не потеряла своей актуальности. Наоборот, лейкоз вышел на первое место в ряду хронических инфекций крупного рогатого скота. Болезнь поражает в первую очередь высокопродуктивных коров, что, в свою очередь, является угрозой национальному генофонду крупного рогатого скота страны (Н.И. Петров, 2001; H.A. Мальцева с соавт., 2003; Г.А. Симонян, 2005; П.Н. Смирнов с соавт., 2007; М.И. Гулюкин, 2008, 2009; И.М. Донник с соавт., 2000, 2008, 2010; Л.К. Эрнст, H.A. Зиновьева, 2008).

На сегодняшний день, единственными наиболее эффективными методами борьбы с лейкозом крупного рогатого скота, являются его ранняя диагностика, изоляция и методичная выбраковка больных животных с последующим формированием свободного от вируса лейкоза стада. Поэтому, совершенствование методов его ранней диагностики является актуальной задачей. Одними из основных требований, предъявляемым к диагностическим тестам, являются чувствительность и специфичность (В.П. Федотов, О.В. Иванов, О.Ю. Иванова, 2006; М.И. Гулюкин 2007; И.М. Донник, А.Т. Татарчук, 2008, 2009; A.M. Смирнов 2008; В.В. Субботин, Д.В. Колбасов, 2008).

Установление принадлежности ВЛ КРС к определенному генотипу может служить основанием для расширения исследований в данном направлении, в проведении исследований в выявлении патогенетических особенностей развития лейкозного процесса, как в экспериментальном, так и в спонтанном вариантах (D. Beier, Р. Blankenstein, О. Marquardt, J. Kuzmak, 2001; C.B. Чичинина, 2005; E.B. Дробот, 2007, 2008; Ф.Ф Зинатов, 2008; И.М. Гулюкин, А.И. Клименко, Н.Ф. Ломакина, 2009, 2010; И.М. Донник, 2010, П.Н. Смирнов, Н.В. Грачева, 2009, 2010).

Изучение особенностей строения и функционирования генома вируса/провируса, возможно, позволит в будущем не только понять, но и управлять течением инфекционного процесса (М.И. Гулюкин с соавт., 2009).

Генотипическое разнообразие ВЛ КРС и результаты сравнительного исследования, в контексте их эпизоотической значимости, открывают новые методические подходы в разработке научно-обоснованных схем оздоровления неблагополучных по лейкозу стад.

Цель исследований: определить чувствительность и специфичность используемых современных диагностических тестов в выявлении вирусоносителей лейкоза крупного рогатого скота в оздоравливаемых стадах

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить распространение лейкоза в Уральском регионе.

2. Изучить эффективность современных методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

3. Изучить эффективность комплекса диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) у коров и молодняка в оздоровленных и оздоравливаемых от лейкоза популяциях животных.

4. Изучить генотипическое разнообразие, молекулярно - генетическую структуру и провести филогенетический анализ возбудителя лейкоза крупного рогатого скота, циркулирующего в популяции животных из разных регионов России.

5. Разработать рекомендации для ранней лабораторной диагностики лейкоза.

Научная новизна. Впервые изучена молекулярно-генетическая структура BJI КРС, циркулирующего в популяции животных разных регионов России. Из крови инфицированных BJI КРС животных получены изоляты возбудителя лейкоза, определены их молекулярно - генетические свойства, подтвержденные лабораторными тестами («nested» - ПЦР, ПДРФ анализ (RFLP), ДНК -секвенирование). Нуклеотидные последовательности участка гена env 444bp выделенного возбудителя занесены в международный банк генотипов (GenBank NCBI, 2009, 2010 гг.). На основании филогенетического анализа полученных результатов согласно Международной классификации, определена дендрограмма регионального распределения циркулирующих штаммов BJT КРС.

Практическая значимость и реализация результатов исследований.

Результаты исследований учтены при проведении оздоровительных мероприятий в животноводческих предприятиях Свердловской и Тюменской областей, в которых отмечена положительная динамика сокращения количества неблагополучных по BJI КРС молочно - товарных ферм, и снижения уровня инфицирования животных.

На основании полученных данных подобраны праймеры для ПЦР диагностики, способствующие раннему выделению носителей BJI КРС в оздоравливаемых стадах как среди коров, так и среди молодняка.

На основании данных выполненных исследований по определению чувствительности и специфичности диагностических тестов в оздоравливаемых хозяйствах подготовлены рекомендации - «Способ ранней прижизненной диагностики лейкоза у молодняка крупного рогатого скота», утвержденный НТС МСХиП Свердловской области (2010 г.).

Результаты исследований нашли отражение в научно-практических рекомендациях:

- Методические рекомендации Система мероприятий оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза в Уральском федеральном округе, г. Екатеринбург: Уральское издательство, 2008.- 66 с.

- Научные рекомендации Методология снижения инфицированное™ животных вирусом лейкоза в оздоравливаемых стадах к.р.с., г. Екатеринбург: Уральское издательство, 2009. - 124 с.

- Методические рекомендации Способ ранней диагностики лейкоза у молодняка крупного рогатого скота, г. Екатеринбург: Уральское издательство, 2010. - 32с.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В животноводческих предприятиях Уральского региона лейкоз крупного рогатого скота имеет широкое распространение.

2. Диагностика лейкоза лабораторными методами, в оздоравливаемых и оздоровленных стадах имеет различную эффективность, зависящую от чувствительности и специфичности тест систем.

3. В популяциях крупного рогатого скота в регионах РФ циркулирует возбудитель лейкоза, имеющий различное генотипическое разнообразие и генотипическую структуру, характерную для Австралийского, Бельгийского и смешанных типов.

4. Филогенетический анализ вируса лейкоза, полученный на основе ДНК -секвенирования позволил классифицировать опытные штаммы и сравнить их с мировыми изолятами.

5. Ранняя диагностика BJ1 КРС с использованием комплекса лабораторных методов позволяет выявить инфицированных животных с 15 - ти дневного возраста.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики хронических инфекций и патологии животных» (г. Омск, 2009), международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней животных и птиц» (г. Екатеринбург, 2008), международной научно-практической конференции «Основные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц» (г. Екатеринбург, 2010), молодежных научно -практических конференциях УрНИВИ РАСХН (2008-2009гг.), осенней научно-практической конференции по отбору инновационных проектов молодых ученых «У.М.Н.И.К.» (г. Екатеринбург, 2010), ученом совете ГНУ Уральского научно-исследовательского ветеринарного института Российской академии сельскохозяйственных наук (2008 - 2010 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ (1 - журнал «Ветеринария Кубани», 1 -журнал «Аграрный вестник Урала»), 3 - методические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, анализа полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Материал изложен на 140 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 23 рисунка. Список литературы включает 257 источник, в том числе 87 зарубежных.

Выражаем благодарность за помощь при выполнении работы: директору Польского национального исследовательского ветеринарного института, доктору, профессору Tadeusz Wijaszka, заместителю директора по научной работе, доктору, профессору Jacek Kuzmak, а также всему коллективу отдела биохимии ПНИВИ (г. Пулавы); директору Екатеринбургского научно - исследовательского института вирусных инфекций Роспотребнадзора, доктору медицинских наук, Глинских Нине Поликарповне, и сотрудникам отдела клеточных культур, а также всему коллективу УрНИВИ.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Диссертация выполнена в отделе мониторинга и прогнозирования инфекционных заболеваний животных ГНУ Уральского научно-исследовательского ветеринарного института Российской академии сельскохозяйственных наук в период 2007-2010 г. в соответствии с Программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006 — 2010 гг., тема «Разработать способ ранней прижизненной диагностики лейкоза у молодняка крупного рогатого скота» (№ Государственной регистрации 01.2.006 13098.). Экспериментальные исследования по ДНК - секвенированию образцов, выделенных из крови животных разных регионов России проведены в отделе биохимии Польского национального исследовательского ветеринарного института (г. Пулавы), директор Tadeusz Wijaszka, При участии профессора Jacek Kuzmak.

Для эпизоотологического анализа использованы статистические данные ветеринарной отчетности, результаты диагностических исследований на лейкоз ветеринарных лабораторий Свердловской, Тюменской, Курганской и Челябинской областей, результаты исследований биологического материала, выполненных в Уральском НИВИ, Национальном исследовательском ветеринарном институте Польши.

Объектом исследований был крупный рогатый скот уральского типа черно-пестрого скота, принадлежащий сельскохозяйственным предприятиям Свердловской, Тюменской, Курганской, Челябинской, областяей, а также Краснодарского края.

Предмет исследования - пробы крови, сыворотки крови и лейкоконцентрат из крови животных, а также образцы ДНК - участка гена env, длиной 444Ь вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Диагностические исследования крови, сыворотки крови животных в РИД, ИФА, ПЦР проведены согласно «Методических указаний по диагностике лейкоза крупного рогатого скота», утвержденных Департаментом ветеринарии МСХ РФ от 23.08.2000г.

Сравнительную эффективность различных лабораторных методов диагностики инфицированных ВЛ КРС животных проводили в животноводческих предприятиях Урала.

В неблагополучных и оздоровленных стадах крупного рогатого скота проводили забор крови от коров и телочек разного возраста. В качестве контроля использовали образцы крови, полученной от экспериментально зараженных баранов и кроликов. Затем полученный материал тестировали одновременно различными методами: РИД, ИФА, ПЦР, «Nested» - ПЦР.

Пробы крови для исследований в ПЦР отбирали у животных в вакуумные пробирки с ЭДТА Venosafe - Hematology VF-0539DK (производитель Бельгия). Исследование выполняли с помощью тест-системы «Лейкоз» производитель ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора», г. Москва, по инструкции,

утвержденной Россельхознадзором 29.02.2006г, а также праймерами, изготовленными в ВНИИЖ РАСХН.

Исследования проб в ИФА провели с использованием набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота ВЕРИ-тест, производства НПО «Нарвак» г. Москва по инструкции, утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ РФ от 23.08.2000г. №13-7-2/2130., а также набором SERELISA® BLV Ab Mono Blocking фирмы Synbiotics, Франция.

Для проведения РИД диагностики использован диагностический набор производства Курской биофабрики - фирмы «БИОК». Исследование проводилось согласно инструкции утвержденной Департаментом ветеринарии Минсельхоз России от 23.08.2000г. № 13-7-2/2130.

Геномную ДНК выделяли и очищали от продуктов ПЦР (праймеров, нуклеотидов, полимеразы, dNTP) при помощи комплекта Núcleo Spin Extract® II (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) согласно методу, описанному зарубежными авторами (R.Z. Mamoun et. al., 1990; J. Coulson et. al., 1990; E. Portetelle et. al., 1989; H. Fechner et al., 1997; D. Beieret. al., 1998, 2001; M. Licursiet. al., 2002) и концентрацию ее оценивали спектрофотомерией, для чего использовали прибор GeneQuantH DNA Calculator (Pharmacia Biotech). В качестве H20 использовали свободную от нуклеаз воду класса молекулярной биологии, фильтрованную на 0,22 микром мембране, фирмы Fermentas.

Постановка первичной и «Nested» ПЦР проводилась согласно методам, описанными D. Beier et. al. (1998, 2001).

Env - «Nested» ПЦР была выполнена с парой праймеров env5032 и env5608r (внешние праймеры, заканчивающиеся амплификацией 608 bp фрагментов) и env5099, env552ir (внутренние праймеры, заканчивающиеся амплификацией 444 bp фрагментов).

Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР разрабатывались согласно данным последовательности, изданным Sagata и др.( 1985г.). Праймеры, соответствующие env гену были выбраны потому, что эта область распространена среди различных штаммов BJIКРС провирусов (Rice и др., 1984г.; Sagata и др. 1985г.; Mamoun и др., 1990г.).

Все праймеры, используемые в этом опыте были получены от MWG Биотехнологии (Ebersberg, Германия).

Амплификацию проводили согласно методам, описанным Beier и др., (2001 г). Реакция амплификации выполнялась в ДНК термальном циклере 480 (Perkin - Elmar Cetus, Inc. Weitersladt, Германия) или Трио-термоблоке (Biometra, Uittingen, Германия).

В качестве маркера использовали Gene Ruler (1Кб ДНК) Ladder Plus, Fermentas (0,1 мг/мл), в качестве погрузочного буфера (Loading buffer, Fermentas). Реакцию электрофореза проводили на 1,5% агаровом геле, после окрашивания этидия бромидом и визуализировали в системе Gel Doc (BIORAD).

Исследования по изучению полиморфизма гена env 444bp осуществляли согласно методикам, описанным следующими авторами (R.Z. Mamoun et. al., 1990; J. Coulson et. al., 1990; E. Portetelle et. al., 1989; H. Fechner et al., 1997; D. Beier et. al., 1998,2001).

Последовательность выделенных ПЦР продуктов, при проведении секвенирования участка гена env 444bp вируса лейкоза крупного рогатого скота, определяли с помощью набора флуоресцентного, окрашивающего деокситермирующего цикла для секвенции Terminator v.3.1 (Applied Biosystems -Life Technologies) и анализировали в 3730x1 ДНК - анализаторе (Applied Biosystems - Life Technologies). Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей различных штаммов BJ1 КРС было составлено при помощи пакета программ MEGA 4 (молекулярный анализ эволюционной генетики, версия 4.0. (Tamura К., Dudley J, Nei М, Kumar S. (2007).

Изученные мировые штаммы, для сравнения при филогенетическом анализе были взяты из GenBank (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Всего клинически исследовано 15 212 голов крупного рогатого скота в 64 животноводческих предприятиях. Проведено серологических исследований: РИД -2420 проб, ИФА - 1250 проб, ПЦР - 450 проб.

Исследовано 6 образцов коллективных проб (от 80 животных). Исследования методами «Nested» ПЦР, ПДРФ и ДНК - секвенированию проведены в Польском национальном исследовательском ветеринарном институте (г. Пулавы).

Статистическая обработка цифровых данных была проведена с использованием стандартных программ Microsoft Office 2003 на персональном компьютере.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Распространение лейкоза крупного рогатого скота в Уральском регионе.

Лейкоз крупного рогатого скота в Уральском регионе остается актуальной проблемой инфекционной патологии сельскохозяйственных животных (Татарчук А.Т., Донник И.М. и др., 2000 - 2010гг.).

Нами проведена ретроспективная оценка эпизоотической ситуации в отдельных субъектах УрФО.

Установлено, что в Челябинской, Курганской и Тюменской областях сохраняется высокий уровень инфицированности вирусом лейкоза коров и телок, выделяется значительное количество больного лейкозом скота. Число неблагополучных по лейкозу пунктов сохраняется на высоком уровне.

В Курганской области, количество неблагополучных пунктов в последние годы поддерживается практически на одном уровне: 2007г. - 112; 2008г. - 118; 2009г. - 115. Инфицированность коров BJI КРС высокая с медленной тенденцией снижения: 2007г. - 27,7%; 2008г. - 20,2%; 2009г. - 12,4%. В области сохраняется высокий уровень инфицированности скота в индивидуальном секторе.

В Свердловской области в 1992 - 2010 гг. выполнена программа оздоровительных противолейкозных мероприятий. В результате реализации все животноводческие предприятия оздоровлены от инфекции (рис. 1). В настоящее время осталось 4 фермы в 2-х районах, в которых сосредоточено 680 РИД (+) коров, замена которых здоровым поголовьем должна завершиться в 2011 году. Ликвидирован лейкоз в личных подворьях - в 1200 населенных пунктах. В настоящее время все поголовье в общественном и индивидуальных секторах

подвергается серологическому контролю два раза в год (весной и осенью). Случаев выявления положительно реагирующих животных в течение 5 лет не отмечено, что подтверждает качество проведенных оздоровительных мероприятий.

Рисунок 1 - Динамика оздоровления МТФ от лейкоза крупного рогатого скота в Свердловской области (1992- 2010 гг.).

■ Всего МТФ ПБыло неблагополучных ■ Осталось неблагополучных

В Тюменской области противолейкозные мероприятия реализуются в соответствии с утвержденной Губернатором комплексной программе. За последние 3 года сокращено число неблагополучных пунктов на 16,5%, снижен уровень инфицированное™ ВЛ КРС коров с 11% до 7%, телок с 10% до 8%. Количество неблагополучных пунктов уменьшилось с 182 в 2007 году, до 132 в 2009 году (рис. 2).

Рисунок 2 - Динамика количества оздоровленных от лейкоза МТФ в Тюменской области (из 212 имеющихся).

В животноводческих предприятиях Курганской и Челябинской областей сохраняется высокий уровень выделения положительно реагирующих при серологических исследованиях телок, особенно младшего (6-8 мес.) возраста. Это связано с недостаточной эффективностью диагностических исследований, при которых не происходит полного выявления всех инфицированных животных и т.о.

источник инфекции всегда присутствует в группах, что способствует перезаражению животных.

В связи с этим нами были проведены исследования по определению эффективности диагностических тестов, в том числе и при раннем выявлении носителей ВЛ КРС.

2.2.2. Сравнительная оценка тестов РИД, ИФА, ПЦР при диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

Существуют различные данные по чувствительности и специфичности этих реакций при проведении диагностических исследований.

В связи с этим, одной из задач являлось проведение исследований, эффективности РИД, ИФА и ПЦР при диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

Опыт проводили Зори Урала, где РИД - положительные животные располагались в одном корпусе с РИД - отрицательными. Отбор проб крови был произведен у коров 3-х летнего возраста. Из них 10 животных были ранее исследованы в РИД и реагировали положительно (РИД (+) - группа №1) и 10 животных были условно здоровыми (РИД (-) - группа №2).

Пробы сыворотки и цельной крови, отобранные от коров в этих группах были исследованы в РИД, ИФА и ПЦР. (табл. 1).

Таблица 1 - Схема проведенного опыта.*

Группы исследуемых животных Количество проб крови взятых на исследование(п) Исследовано проб

РИД ИФА ПЦР

Группа № 1 РИД(+) 10 10 10 10

группа № 2 РИД(-) 10 10 10 10

* - исследования проб проведено в двух повторностях.

Все исследования выполнены в двукратной повторное™ с целью подтверждения совпадения результатов исследования и выявления возможных ошибок. Полученные результаты представлены в таблице 2 и 3.

Таблица 2 - Чувствительность диагностических реакций методами РИД, ИФА и ПЦР при выявлении ВЛ КРС.

Группа животных РИД Выявлено животных (%) ИФА Выявлено животных (%) ПЦР Выявлено животных (%)

№1 РИД(+) 100 60 50

№2 РИД(-) 100 100 100

Таблица 3 - Результаты диагностических исследований в серо-негативной и серо-позитивной группе

Группа исследуемых животных РИД-ИФА в % ИФА-ПЦР в %

№ 1 РИД(+) 60 50

№ 2 РИД(-) 100 100

По результатам проведенного опыта, из трех диагностических методов наиболее эффективно себя проявил метод РИД (100%), остальные диагностические методы (ИФА и ПЦР) показали себя менее эффективно, их чувствительность составила в среднем 80 и 75% соответственно.

Из результатов видно, что в группе серонегативных животных результат совпал по всем трем реакциям, и чувствительность методов составила 100%. Что подтверждает обоснованность применения теста РИД для контроля эпизоотической ситуации в оздоровленных от лейкоза стадах.

Полученные нами данные в серопозитивной группе также выявили высокую чувствительность РИД. Анализируя представленные результаты, можно сделать вывод о неоднозначности современных диагностических тестов (ИФА, ПЦР) в выявлении носителей ВЛ КРС при реальном течений эпизоотического процесса. О чувствительности и специфичности лабораторных диагностических тестов на лейкоз существуют разноречивые данные.

Н.Г. Двоеглазов (2009) в своих исследованиях, при сравнительном анализе на репрезентативном поголовье эффективности методов РИД, ИФА, ПЦР при диагностике ВЛ КРС - инфекции отмечает, что ни один из этих методов не позволяет полностью выявить всех животных-вирусоносителей. Так, эффективность РИД составила 76,1%, ИФА - 83,3%, ПЦР - от 58,3 до 72,6%, и что для достижения наилучшего диагностического эффекта необходимо комбинированное использование серологических и генно-молекулярных методов. Процент случаев несовпадений данных ПЦР с результатами серологических исследований может свидетельствовать о низком уровне провирусной ДНК, находящейся ниже предела чувствительности ПЦР, т.е. животные могут находиться либо в стойкой алимфатической стадии, либо в начальной стадии персистирующего лимфоцитоза. Также нельзя исключить и возможность региональной вариабельности провирусной ДНК в исследуемых нами образцах в месте посадки праймеров. Возможно, существуют и другие, еще не до конца изученные факторы.

Можно также предположить, что несоответствие полученных результатов с литературными свидетельствует о недостаточной эффективности современных коммерческих диагностических тест - систем для диагностики ВЛ КРС методом ИФА и ПЦР (Зинатов Ф.Ф., 2008; Н.Г. Двоеглазов, 2009; Л.К. Эрнст, 2009 и др.).

С учетом этого, мы решили определить эффективность диагностических тестов в комплексе (РИД, ИФА, ПЦР) среди оздоровленного и оздоравливаемого поголовья крупного рогатого скота, а также изучить возможности применения комплексной диагностики в выявлении носителей ВЛ КРС у животных в раннем возрасте.

2.23. Результаты определения чувствительности комплекса диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) в оздоровленных от лейкоза фермах.

По данным многочисленных авторов, серологическая диагностика не обеспечивает полного выявления носителей BJI КРС (С.И. Джупина, 2008; М.И. Гулюкин, 2008; П.Н. Смирнов 2008; И.М. Донник с соавт., 2009).

В связи с этим нами была поставлена задача по определению возможности выявления носителей ВЛ КРС на оздоровленной от лейкоза ферме при исследовании комплексом диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР).

Исследования выполнены на животных СПК «Дымковский» и «Энергия» Свердловской области.

СПК «Дымковский» длительный период (более 15 лет) было неблагополучно по лейкозу. Благодаря реализации комплекса оздоровительных мероприятий в 2006 г. все поголовье крупного рогатого скота в общественном и личном секторах было оздоровлено от лейкоза.

Благополучие животных по лейкозу ежегодно подтверждалось двукратными диагностическими исследованиями (РИД). Для подтверждения полноты оздоровления от лейкоза, нами проведены комплексные диагностические исследования (РИД, ИФА, ПЦР) оздоровленного поголовья коров.

От 100 коров фермы пробы нативной крови и сыворотки крови исследовали одновременно в РИД, ИФА и ПЦР в трех повторностях с интервалом в 1 месяц. Во всех исследованиях получены отрицательные результаты, что подтверждает факт элиминации возбудителя лейкоза.

2.2.4. Определение чувствительности и специфичности комплекса диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) у коров оздоравливаемой фермы.

На заключительных этапах оздоровления, при низком проценте инфицированности BJ1 КРС (до 10%), существующими правилами предусматриваются ежемесячные серологические (РИД) исследования, до получения двух отрицательных результатов и последующий вывод РИД положительных животных, без передержки из стада. Многими исследователями указывается на дополнительное выявление инфицированных животных среди РИД негативного поголовья при помощи ИФА и ПЦР (до 20%) (Ф.Ф.Зинатов 2008; Н.Г. Двоеглазов, 2009; Eaves et al., 1994; М.И. Гулюкин, 2005; А.Н. Шаров, 2006; П.Н. Смирнов, 2002; В.Г. Арутюнян, 1992; Fechner H, Kurg A., Blankenstein P., Mewes G., Geue L., Albrecht С, Ebner D., 1996; И.М. Донник с соавт., 2005; А.Б. Прохватилова с соавт., 1998; D. Bier et. al., 1992; E.J. Kelly et. al.,1998; Martin et al., 2001; Zaghawa et al., 2002; В.И. Глазко, Е. В., 2001.; H.A. Мальцева с соавт., 2003; Е.А. Гладырь, 2006, И.С. Пономарева, 2008; Е.В. Дробот, 2007 и др.). Такие животные, скрытые носители BJI КРС, при недовыявлении в РИД остаются в стаде, и могут подвергать риску заражения здоровое поголовье а также приносить экономические потери хозяйству, создавая препятствие для завершения оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота. При этом регламент проведения диагностических исследований в ИФА и ПЦР в региональных программах не разработан. Именно поэтому, в настоящее время,

актуальной задачей является изучение эффективности современных диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) в комплексе исследований на оздоравливаемом поголовье крупного рогатого скота для дополнения и оптимизации существующих региональных программ оздоровительных мероприятий при лейкозе.

Нами был поставлен опыт на коровах МТФ «Бушланово» Свердловской области.

Данная ферма длительное время неблагополучна по лейкозу. Для предприятия учеными Уральского НИВИ был разработан комплексный план оздоровительных мероприятий.

И в настоящее время инфицированность коров в нем составляет 1%. Исследования в ИФА проводились «групповым методом», то есть для диагностических исследований были подготовлены сборные пробы сыворотки крови из расчета 10:1 (на одну пробу по 0,5 мл сыворотки из десяти пробирок). В дальнейшем в позитивных пробах дополнительному ИФА - исследованию подвергался каждый образец в сборной пробе индивидуально. Таким образом, определялись реагирующие животные в каждом положительном десятке проб. Положительно реагирующие животные были выведены из стада в 10 дневный срок после лабораторного подтверждения инфицирования (табл. 4).

Полимеразная цепная реакция, как наиболее чувствительный, по мнению многих авторов метод, была включена в комплекс диагностических тестов на завершающем этапе опыта (конец мая). Смысл использования молекулярно -генетических методов диагностики (ПЦР) в опыте заключался в подтверждении и контроле результатов серологических исследований.

Таблица - 4 Результаты диагностических исследований (РИД, ИФА, ПЦР) на лейкоз оздоравливаемой МТФ («Бушланово», Свердловской области).

Результат предыдущего исследования РИД Март Май Сентябрь

Результаты исследования Результаты исследования Результаты исследования

Кол-во иссл. животных Результат иссл. РИД ИФА РИД ИФА ПЦР РИД ИФА

217 отр пол отр пол отр пол отр пол отр пол отр пол отр пол отр пол

215 2 215 2 18 3 217 0 18 3 217 0 217 0 21 0

Из предоставленных данных видно, что комплексные (РИД, ИФА, ПЦР) диагностические исследования наиболее полно выявляют инфицированных ВЛ КРС животных. Исследованиями выявлено 2 положительно реагирующие в РИД коровы и 3 (сборные) пробы, положительно реагирующие в ИФА. Исследования через 2 месяца выявили дополнительно еще 3 (сборные) пробы в ИФА, реагирующие положительно. Но, в РИД, положительно реагирующих голов не выявлено. В связи с этим были проведены дополнительные исследования методом ИФА.

При помощи дополнительных исследований, нами были выявлены положительно реагирующие животные в каждом десятке. В марте было выявлено 3

положительно реагирующие в ИФА головы, причем 2 из них совпали с результатами РИД (№83 и 131), и лишь одна голова из сборных проб с 11 по 20 (№16) была выявлена в ИФА дополнительно. Проведенными в мае исследованиями было вновь выявлено дополнительно 3 положительно реагирующие в ИФА головы. При помощи РИД в данном случае, как менее чувствительного метода, носителей BJ1 КРС не выявлено. Положительно реагирующие животные в десятидневный срок выводились из стада. Дальнейшими серологическими (РИД, ИФА) и молекулярно - генетическими исследованиями (ПЦР) в конце мая и в сентябре скрытых носителей ВЛ КРС выявлено не было, что подтверждает эффективность использования диагностических тестов в комплексе (серологических и молекулярно - генетических) на завершающем этапе оздоровительных противолейкозных мероприятий в оздоровленной ферме.

Также в ходе наших исследований была доказана эффективность применения ИФА на оздоравливаемом поголовье «групповым методом». Возможность исследовать сборные пробы от животных позволяет снизить затраты на покупку диагностических наборов, а также время лабораторного диагностического исследования, что очень важно, так как передержка инфицированных голов в стаде приводит к перезаражению здорового поголовья.

В ходе наших опытов подтверждена практическая польза комплексных диагностических исследований (РИД, ИФА, ПЦР) на оздоравливаемом поголовье крупного рогатого скота. На заключительном этапе оздоровления, применяя предлагаемую методику возможно уже в трех месячный период полностью выявить всех скрытых носителей ВЛ КРС, и освободить поголовье от источника инфекции. Данную методику можно включать в региональные программы оздоровительных мероприятий от лейкоза крупного рогатого скота.

2.2.5. Чувствительность и специфичность диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) в выявлении носителей ВЛКРС среди молодняка крупного рогатого скота.

В эффективности оздоровительных мероприятий особую роль приобретает раннее выявление в оздоравливаемых группах инфицированных ВЛ КРС телок среди народившегося молодняка, их своевременное удаление из групп с целью предотвращения перезаражения вирусом лейкоза здорового поголовья.

Согласно действующих «Правил по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота» первые диагностические серологические (РИД) исследования молодняка на лейкоз должны проводиться в шестимесячном возрасте. До этого времени инфицированные ВЛ КРС и здоровые животные содержатся совместно.

В последние годы появились данные о возможности более раннего выявления в оздоравливаемых стадах носителей ВЛКРС у животных с помощью молекулярно - генетического метода исследования на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Е.А Гладырь, 2006 г., Ф.Ф. Зинатов, 2009 и др.). Внедрение ранней диагностики вирусоносителей в комплексе оздоровительных мероприятий при лейкозе позволило бы ускорить процесс ликвидации инфекции в стадах и контролировать качество проведенных оздоровительных мероприятий.

Определение чувствительности и специфичности комплекса диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) у молодняка крупного рогатого скота

проводили в оздоравливаемом от лейкоза предприятии «ЗАО РНП Энергия» Туринского района Свердловской области. Было отобрано 2 группы телочек, рожденных от РИД (+) и РИД (-) коров. Перед началом опыта коров - матерей исследовали в РИД на лейкоз.

Животных отбирали по мере растела коров, из них сформировали 2 группы. В последующем группы телят содержали в изолированных условиях и ежемесячно в течение 6 месяцев исследовали на лейкоз в РИД, ИФА, ПЦР. Начинали исследовать в ПЦР с 15 дневного возраста, в ИФА и РИД - с 2х месячного. Контрольная группа телочек от РИД (-) коров исследованы в те же сроки. Результаты исследований показали, что первые положительно реагирующие в ПЦР телочки от РИД (+) коров, были выявлены уже в возрасте 15-20 дней (март 2009 г.). Данных животных оставляли в группе в течение всего опыта (6 мес.). По достижении двухмесячного возраста всех животных опытной и контрольной групп исследовали на лейкоз ежемесячно комплексом диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) на протяжении шести месяцев.

Анализ полученных результатов показал, что с увеличением срока совместного содержания носителей ВЛ КРС и здоровых телят, в опытной группе количество реагирующих положительно животных увеличивается. Так, если в начале опыта (март 2009 г.) с помощью ПЦР было выявлено три положительно реагирующих телочки, то через 6 месяцев в опытной группе комплексом диагностических тестов их было выявлено уже 17 (из 22).

Чувствительность и специфичность диагностических тестов в течение опыта проявлялась неоднозначно: при полимеразной цепной реакции (ПЦР) выявлены носители ВЛ КРС на ранней (с 15 дневного возраста) стадии; реакция у животных сохранялась весь период (бмес.) наблюдения, однако, у некоторых животных положительный результат выпадал на 2-3 мес., затем вновь появлялся. Реакция ИФА была более чувствительная, чем РИД: выявление антител к ВЛ КРС возможно с двух месячного возраста; в трех месячном возрасте выявляется дополнительное число животных с антителами к ВЛ КРС в опытной группе, однако, также отмечено выпадение реакции у части животных в течение периода наблюдения (шесть месяцев). Реакцией иммунной диффузии выявлены антитела к ВЛ КРС у телят с 3 - х месячного возраста в меньшем количестве (у 4 из 22 животных), с положительной ПЦР совпала реакция только у одной телочки, а в 6 -ти месячном возрасте - у трех положительно реагирующих в ПЦР телочек, т.е. в зависимости от возраста телочек чувствительность РИД возрастала. Аналогичные данные нами были получены и в Челябинской области.

В ходе проведенных исследований выявлена эффективность применения диагностических тестов РИД, ИФА ПЦР применяемых в комплексе для раннего выявления вирусоносителей среди молодняка в оздоравливаемых от лейкоза стадах. Ранняя диагностика возбудителя лейкоза на основе ПЦР позволяет определить вирусоносителей у молодняка крупного рогатого скота уже в возрасте 15-20 дней. Использование для этих целей ИФА и РИД позволяет диагностировать вирусоносителей лейкоза не ранее 2-4 месяцев. Эти данные позволяют по новому оценить требования инструкции по борьбе с лейкозом о начале исследования молодняка в оздоравливаемых хозяйствах с 6 -ти мес. возраста.

2.2.6. Характеристика молекулярно- генетической структуры вируса лейкоза, циркулирующего в популяции крупного рогатого скота разных регионов РФ.

В организме хозяина хронически персистирующий вирус может претерпевать мутационные изменения, направленные на увеличение патогенности, на преодоление более эффективных защитных механизмов хозяина. Поэтому наряду с генетическим статусом макроорганизма, во внимание необходимо принимать генетическую изменчивость самого патогена, который возможно в процессе длительной персистенции способен изменять свою патогенность, как в сторону комменсализма, так и усиления патогенных свойств (Е.В. Дробот , 2007; Н.В. Грачева, 2010).

У ретровирусов высокой вариабельностью отличаются поверхностные белки. Наиболее изучен у BJ1 КРС полиморфизм гена env-gp51. Gp51 - главный оболочечный гликопротеид, который играет решающую роль в жизненном цикле вириона и является важной детерминантой вирусной инфекционное™, содержит эпитопы связывания с клеточными рецепторами, индукции образования синцития, сигналов трансактивации слияния мембраны клеток и поэтому его нуклеотидная последовательность является хорошим геномным маркером в изучении особенностей географического распределения генотипов ВЛ КРС (Johnston et al., 2002; Tajima and Aida, 2000; B.H. Сюрин и соавт., 1998; R. Kettmann et. al., 1994; R. Kettman et. al., 1981; R.Z. Mamoun et. al., 1990; J. Coulston et. al., 1990; H. Fechner et al., 1997; D. Beier et. al., 2001; Asfaw Y. et al.,2005; M.A. Sommerfelt, 1999; E.R. Johnston et. al., 2002; M. Licursi et. al., 2002, Е.В. Дробот, 2007, Н.В. Грачева, 2010).

На основании метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и ДНК секвенирования вируса лейкоза крупного рогатого скота классифицировано три подгруппы вируса - Бельгийская, Австралийская и Японская (R.Z. Mamoun et. al., 1990, D. Beier et. al., 2001, E. Molteni et. al., 1996). Проведенные ранее исследования по генетической изменчивости гена env ВЛ КРС показали, что существующие различия между отдельными изолятами в мире не столь велики (J. Coulson et. al., 1990; E. Portetelle et. al., 1989). Такое низкое генетическое разнообразие может быть связано с относительно невысокой изменчивостью вируса (L. Willems et. al., 1993). Однако, исследования, основанные на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) позволили классифицировать среди штаммов ВЛ КРС до семи различных генотипов, предполагая, что вирус лейкоза более разнообразнее, чем ожидалось ранее (Asfaw Y. et. al., 2005; H. Fechner et. al., 1997; M. Licursi et. al., 2002). На основе анализа полученных данных недавно была предложена новая классификация штаммов ВЛ КРС на семь различных генотипов (S. Rodriguez et. al., 2009, G. Moratorio et. al., 2010).

Данные о функциональной значимости полиморфизмов, патогенных свойствах генотипов, их способности избегать иммунного надзора со стороны организма хозяина, остаются не до конца изученными (Н.В. Грачева, 2009).

J. Kuzmak (2008) в своих трудах указывает на то, что генетические варианты ВЛ КРС с определенными аминокислотными заменами в эпитопах белка gp51 были найдены у 7,5% ВЛ КРС - инфицированных, но серонегативных животных,

такие варианты могут избегать выявления антител и будут значительно мешать серологической диагностики инфекции BJI КРС.

Такие исследования необходимы, чтобы в дальнейшем выявить молекулярную основу для определения различий в инфекционности, антигенных свойств, патогенеза и туморогенеза различных генетических вариантов BJI КРС. (Dagmar Beier, Petra Blankenstein, О. Marquardt, J. Kuzmak (2001)).

Исходя из этого, нами были подготовлены к исследованиям методами «Nested» ПЦР, ПДРФ (RFLP), ДНК - секвенирования, пробы лейкоцитов (PBL) от инфицированных (РИД (+) BJI КРС телок и коров из Свердловской, Курганской, Тюменской, Челябинской областей и Краснодарского края, а также экспериментально инфицированных баранов и кроликов.

Все пробы были отобраны от положительно реагировавших по последним исследованиям в РИД коров 3-4 летнего возраста и телят 3,5 - 4 месячного возраста. Кроме того, в Туринском районе Свердловской области были выделены три изолята от телят, положительно ревгирующих в РИД, ИФА, ПЦР и один образец от 6 летней коровы, положительно реагирующей в РИД.

Всего было получено 32 изолята из разных регионов для исследований в «Nested» ПЦР, ПДРФ.

Кроме того, были получены 2 пробы от кроликов, экспериментально зараженных кровью от инфицированных коров Туринского района Свердловской области и 2 пробы от опытных баранов, экспериментально зараженных сборными пробами крови от импортного поголовья коров (завоз 2006 - 2007 г. из Германии), реагирующих положительно в РИД (+) (Тюменская область).

Для определения принадлежности к тому или иному типу вируса лейкоза крупного рогатого скота, циркулирующего в Уральском регионе и Краснодарском крае, все пробы на начальном этапе были исследованы в «Nested» ПЦР. Этот метод является наиболее чувствительным и специфичным при диагностике ВЛ КРС, так как выполняется по двум парам праймеров, внутренним и внешним, что позволяет с высокой точностью определить наличие провирусной ДНК в исследуемых образцах и свести к минимуму получение недостоверных результатов.

Таким образом, положительный результат в «Nested» ПЦР был получен практически во всех исследуемых образцах, т.е. данный метод исследования подтверждает наличие провируса в ДНК тестируемых животных. У кроликов, подвергнутых экспериментальному заражению инфицированным материалом, реакции ПЦР и «Nested» ПЦР были отрицательными (рис. 3).

Рисунок 3 - Результаты исследования в ПЦР изолятов ВЛ КРС, полученных от животных Тюменской и Челябинской областей, а также экспериментально инфицированных животных.

йШйВйй

. ; м| §;

атт щштшт»ш

12 5 6 7 8 9

отр. контр. 3 4

10 11 12 13 14

Дорожки: М - маркер молекулярного веса 100 bp; 1 - 14 - образцы ДНК (1-2 бараны; 3 - 4 кролики; 5-9 - образцы от крупного рогатого скота из Тюменской области; 10 - 14 - образцы крупного рогатого скота из Челябинской области).

Для определения подгруппы ВЛ КРС, на следующем этапе нами проведены исследования по изучению полиморфизма гена env-gp 51. Очищенные продукты ПЦР расщеплялись тремя энзимами. В качестве рестриктаз, нами были использованы ферменты Bell, PvuII и BamHI, фирмы Fermentas. были определены распределения ферментов рестриктаз в каждом из исследованных образцов.

На рисунке 4 представлена типичная электрофореграмма распределения фрагментов рестриктаз, полученная при ПДРФ анализе 4 образцов из Туринского района Свердловской области.

Рисунок 4 - Электрофореграмма распределения сайтов рестрикции при ПДРФ анализе гена env ВЛ КРС с 3-мя рестриктазами (BamHI, PvuII, и Bell) в опытных образцах ДНК (из Свердловской области).

Ват Hl Bell PvuII

316 Ьр *#—- - « » •

128 bp - • ™

*"•■** шт щш

- ft:

Дорожки: М - маркер молекулярного веса 100 Ьр; 1 - 4 - опытные образцы ДНК из Туринского района Свердловской области.

Анализируя данные распределения сайтов рестрикции по каждому из ферментов рестриктаз видно, что фермент Ват HI расщепляет все ампликоны длиной 444 Ьр на два фрагмента - 316 и 128bp, Bell на фрагменты - 225 и 219Ьр, а энзим PvuII фрагментов не образует, что характерно для Австралийской подгруппы BJ1 КРС. Таким образом все опытные образцы ДНК из Туринского ! района Свердловской области в ПДРФ анализе реагируют характерно для Австралийской подгруппы BJ1 КРС.

Несколько иная картина наблюдалась в образцах ДНК, полученных от животных из других областей (Тюменская, Челябинская область) (рис. 5).

Рисунок 5 - Электрофореграмма распределения сайтов рестрикции при ПДРФ анализе гена env BJ1 КРС с 3-мя рестриктазами (BamHI, PvuII, и Bell) в опытных образцах ДНК животных из разных регионов Урала.

Bam HI

1 г is ь Зъ 43 5а 1с ?с 8с sc юс

128 Ьр Ч- " ^ " '" Belgian typo

Australian or Japaneesa В

Bell

2 1S 2s 3s 4s 5s

ИНЩЦПЯИВЩ, zX™ bp

Australian or Belgian type

PvuII

1 2 Ь 2s 3s 4s 444 bp .4-_...... ш w M «ам»

5s 1c '/с fie 9c 10c

гао bp

-ta.28

—fr-ie

Дорожки: М - маркер молекулярного веса 100 Ьр; 1,2 - образцы ДНК от баранов; ls, 2s, 3s, 4s, 5s - образцы ДНК от коров Тюменской области; 1с, 7с, 8с, 9с, 10с - образцы ДНК от коров Челябинской области.

Полученные данные позволяют отнести изоляты BJ1 КРС Челябинской области к Бельгийскому типу В, так как при анализе рестрикционных фрагментов по каждому из энзимов реагировали характерно для В подгруппы провируса (Ват HI фрагментов не образовывал, Bell расщеплял на участки, длиной 225 и 219 Ьр, а PvuII на участки 280 и 164 Ьр). Образцы ДНК импортных коров из Ялуторовского района Тюменской области показали различные результаты в ПДРФ анализе: Так, фермент Ват HI расщеплял все ампликоны на фрагменты, длиной 316 и 128 pb; Bell на отрезки 225 - 219 Ьр; PvuII в образцах №ls, 2s, 4s фрагментов не образовывал, что характерно для Австралийской или Японской подгруппы, поэтому данные образцы были отнесены к Австралийской подгруппе (при анализе в каждом из энзимов), а в образцах №3s и 5s образовывались фрагменты, длиной

280 и 164 bp, что характерно для Бельгийской подгруппы провируса, поэтому эти образцы при совокупном анализе могут быть отнесены к Австралийской или Бельгийской подгруппе (А/В).

При анализе образцов ДНК от экспериментально инфицированных животных также получены разноречивые данные. При расщеплении ампликонов PvuII рестриктазой были получены фрагменты, длиной 280, 164 и 128 Ьр, что указывает на одновременное присутствие нескольких типов вируса. Эти данные полностью согласованы, так как подопытные животные были инфицированы сборной кровью от нескольких животных Ялуторовского района Тюменской области.

Всего было исследовано 30 образцов ДНК, выделенных от животных из Уральского региона и Краснодарского края и проведен анализ распределения рестрикционных фрагментов по каждому из ферментов (Ваш HI, Pvu II, Bell). Результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты генотипирования BJIКРС из изолятов, полученных в различных регионах РФ.

№ образца Выявлен

Регнон РФ, в котором отобраны нзоляты ВЛ КРС тип вируса лейкоза

Краснодарский край

1. Краснодарский край, Красноармейский район Ь

2. Краснодарский край, Красноармейский район b

3. Краснодарский край, Красноармейский район а

4. Краснодарский край, Красноармейский район b

5. Краснодарский край, Красноармейский район b

Тюменская область

ЗТ. Тюменская область, Ишимский район а

4 Т. Тюменская область, Заводоуковский район а

5 Т. Тюменская область, Ялуторовский район а

6T. Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) b

ls Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) а

2s Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) а

3s Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) а/Ь

4s Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) а

5s Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) а/Ь

Челябинская область

4Z. Челябинская область, Каслинский район b

5Z. Челябинская область, Каслинский район b

Ic Челябинская область, Коелгинский район b

7c Челябинская область, Коелгинский район b

8c Челябинская область, Коелгинский район b

9c Челябинская область, Коелгинский район b

10c Челябинская область, Коелгинский район b

Курганская область

2K. Курганская область, Кетовский район a/b

ЗК. Курганская область, Кетовский район b

4К. Курганская область, Кетовский район а

Свердловская область

2 Свердловская область, Туринский район а

3 Свердловская область, Туринский район а

4 Свердловская область, Туринский район а

5 Свердловская область, Туринский район а

^Примечание: а - Австралийская подгруппа ВЛ КРС; Ь - Бельгийская подгруппа ВЛ КРС, а/Ь - смешанный тпп ВЛ КРС (Австралийская или Бельгийская подгруппа).

Проведенными исследованиями генотипирования по участку гена епу 444Ьр определен тип вируса, циркулирующий в том или ином регионе РФ. На основании полученных данных составлены сводные диаграммы распределения типов ВЛ КРС в областях РФ (рис. 6).

Рисунок - 6 Распределение структуры генотипов ВЛ КРС по гену епу в опытных образцах ДНК из различных регионов РФ(%).

□тип А Ятип В

□тип А ЩтипВ Итип А/В

А. Краснодарский край ^ = 5)

В. Тюменская область ^ = 9)

Штип В

ЕЭтип А Щтип В Итип А/В

Нтип А

Е. Свердловская область ^ = 4)

Таким образом, в опытных образцах, нами преимущественно определены образцы из Бельгийской подгруппы ВЛ КРС (тип В) и Австралийской подгруппы (тип А). Примерно 10% проб ДНК по распределению рестрикционных фрагментов во всех эндонуклеазах можно было отнести как к подгруппе А, так и к В (тип АЛЗ).

Территориальное распространения различных штаммов ВЛ КРС имеет особенности. Присутствие смешанных типов ВЛ КРС в пределах одной фермы или района (Ялуторовский район Тюменской области, Курганская область,

Краснодарский край) могут указывать на единовременное их сосуществование и на возможный завоз одного из типов BJI КРС с импортным поголовьем, в следствие недостаточности официально рекомендуемых серологических диагностических методов при осуществлении международной и внутренней торговли крупным рогатым скотом.

Всего, при помощи ДНК - секвенирования участка гена env, длиной 444Ьр, было исследовано 18 проб, из них: пять из Краснодарского края (Красноармейский район); четыре из Свердловской области (Туринский район); три из Курганской области (Кетовский район); две из Челябинской области (Каслинский район); четыре из Тюменской области (Ишимский, Заводоуковский, Ялуторовский районы). В результате исследований, нами были получены нуклеотидные последовательности ДНК гена env 444bp BJI КРС, проведен их филогенетический анализ, который позволил классифицировать опытные штаммы в пределах группы и подгруппы, определить географическое их распределение, а также сравнить их между собой и с 62 известными мировыми изолятами BJI КРС, взятыми из международного банка генотипов (GenBank, NCBI).

В первой группе, вместе с изолятами из Чили, Польши и Украины располагались все образцы из Свердловской области (2,3,4,5), один из Краснодарского края (3.), один из Курганской области (4К), и три образца из Тюменской (Ялуторовский район (5Т.), Ишимский (ЗТ.), Заводоуковский (4Т.)). В III - группе вместе с образцами из Польши, Бельгии, Украины, Германии, Чили, располагались четыре изолята из Краснодарского края (1.,2.,4.,5.), два из Челябинской области (4Z, 5Z), один образец из Курганской области (ЗК) и один из Тюменской области (Ялуторовский район (6Т.)). Один изолят из Курганской области был расположен несколько отдельно от остальных, на границе II и III группы, по результату ПДРФ он был отнесен к типу А/В.

При определении различия между отдельными группами, и дистанции между известными генотипами вируса выявлено следующее: в мире дистанция между генотипами небольшая, основные мутационные изменения расположены в эпитопах 2 ND и CD8+ (подгруппа цитотоксических лимфоцитов), у таких животных в крови циркулирует большое количество провируса, наблюдается лейкоцитоз, иммунологический ответ подавлен.

Такой «агрессивный» тип вируса нами преимущественно определен в группе III (В подгруппа) и существование его объясняется эволюционным этапом приспособления вируса в организме хозяина при территориальном перемещении.

Рисунок 7 - Филогенетическое дерево штаммов ВЛ КРС, выделенных различных странах мира, в том числе в Уральском регионе РФ.

3. выводы

1. Выявлено распространение лейкоза в Уральском регионе. Установлено, что в животноводческих предприятиях Уральского региона. В Уровень инфицированности ВЛ КРС коров и молодняка составляет соответственно: в Тюменской области - 7% и 8%, в Челябинской области - 16%, в Курганской области - 12,4%, в Свердловской области - 0,001%.

2. Оздоровительные противолейкозные мероприятия интенсивно проводятся животноводческих предприятиях Тюменской области, что подтверждается снижением количества неблагополучных ферм с 212 в 2004 г. до 132 в 2009 г. В Челябинской и Курганской областях оздоровительные мероприятия проводят эпизодически. Количество неблагополучных ферм за последние годы в Курганской области поддерживается на одном уровне в 2007г. - 112, в 2008г. -118, в 2009г. - 115, в Челябинской области увеличивается с 60 в 2001г. до 194 - в 2010 г. Практически все поголовье крупного рогатого скота общественного и индивидуальных секторов животноводства Свердловской области оздоровлено от лейкоза (осталось 4 неблагополучные фермы с поголовьем 658 положительно при серологической диагностике коров из 812 ферм с поголовьем 86 тыс. коров).

3. При изучении эффективности современных диагностических методов (РИД, ИФА, ПЦР) при выявлении носителей ВЛ КРС при реальном течений эпизоотического процесса определена диагностическая ценность РИД, и выявлена неоднозначность методов ПЦР и ИФА, что может быть связано с недостаточной чувствительностью и специфичностью диагностических тест - систем.

3. Изучена эффективность комплексного исследования лабораторными методами РИД, ИФА, ПЦР в оздоравливаемой ферме, и определено отсутствие в условиях оздоровленной фермы циркуляция вируса лейкоза крупного рогатого, что подтверждает эффективность проведенных оздоровительных мероприятий в хозяйстве. Установлена возможность ранней диагностики инфицированного вирусом лейкоза молодняка крупного рогатого скота (с 15 дневного возраста) в оздоравливаемых стадах.

4. Впервые изучена молекулярно-генетическая структура ВЛ КРС, циркулирующего в популяции животных разных регионов России. Определено, что в популяциях крупного рогатого скота регионов РФ циркулирует возбудитель лейкоза, имеющий различное генотипическое разнообразие и генотипическую структуру, характерную для Австралийского, Бельгийского и смешанных типов, присутствие которых в хозяйствах может свидетельствовать о завозе одного из типов с импортным поголовьем.

5. Филогенетический анализ вируса лейкоза, полученный на основе ДНК - секвенирования позволил классифицировать опытные штаммы в пределах группы и подгруппы, а также сравнить с известными мировыми изолятами. При данном анализе были определены различия между группами, и дистанция между известными генотипами вируса.

6. На основании полученных данных подобраны праймеры для ПЦР диагностики, способствующие раннему выделению носителей ВЛ КРС в оздоравливаемых стадах как среди коров, так и среди молодняка.

7. На основании данных выполненных исследований по определению чувствительности и специфичности диагностических тестов в оздоравливаемых хозяйствах подготовлены рекомендации - «Способ ранней прижизненной диагностики лейкоза у молодняка крупного рогатого скота», утвержденный НТС МСХиП Свердловской области (2010 г.).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Первое диагностическое исследование нарождающегося молодняка оздоравливаемых гуртов крупного рогатого скота проводить в ПЦР в возрасте 15дн. - 1мес., так как только ПЦР в этот период выявляет вирусоносителей, инфицированных в период внутриутробного развития плода. Второе исследование - в ИФА, в возрасте 3 мес. с учетом ее более высокой чувствительности по выявлению вирусоносителей при низком уровне антител. С 6 месячного возраста все телочки исследуются в РИД ежеквартально до получения отрицательного результата. Положительно реагирующие животные во все периоды исследований выводятся из групп на откорм. Из оставшегося поголовья формируют отдельные группы для изолированного содержания, из них выращивают здоровых нетелей, которыми поэтапно заменяют инфицированное поголовье коров неблагополучных ферм.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Петропавловский, М.В. Оздоровление молочно - товарных ферм от лейкоза крупного рогатого скота / М.В. Петропавловский, А.Т. Татарчук, Б.М. Коритняк, М.Ю. Кадочников, М.П. Михеев // Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц: Сборник научных трудов ведущих ученых России, СНГ и др. стран. Вып. 2. - Екатеринбург, Уральское издательство, 2008,-С. 482-487.

2. Петропавловский, М.В. Эффективная работа по оздоровлению скота на фоне сложной эпизоотической обстановки по лейкозу в сельскохозяйственных организациях Уральского федерального округа / М.В. Петропавловский, C.B. Деркач, О.П. Гордеев, А.Т. Татарчук, Б.М. Коритняк, М.Ю. Кадочников, М.А. Исаев, М.П. Михеев // Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц: Сборник научных трудов ведущих ученых России, СНГ и др. стран. Вып. 2. - Екатеринбург, Уральское издательство, 2008,-С 122- 128.

3. Петропавловский, М.В. Сравнительная оценка методов диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота / М.В. Петропавловский, И.М. Донник, М.А. Исаев, М.П. Михеев // Материалы 8-й межрегиональной научно - практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики хронических инфекций и патологии животных», Омск, 2009. - С. 58 - 63.

4. Петропавловский, M.B. Эффективность методологической системы построения оздоровительных противолейкозных мероприятий на Среднем Урале / М.В. Петропавловский, И.М. Донник, А.Т Татарчук, A.B. Лысов, М.П. Михеев, H.A. Корнилов, Т.И. Мальцева // Сборник научных статей, вып. 10 №4, Львов, Украина, 2009. - С. 262 - 268.

5. Петропавловский, М.В. Региональная молекулярно - генетическая структура вируса лейкоза крупного рогатого скота / М.В. Петропавловский, И.М. Донник, А.Т. Татарчук, A.B. Лысов, C.B. Садчикова, М.П. Михеев // Жури. Ветеринария Кубани, Краснодар, 2010. - №3. - С. 12 - 13.

6. Петропавловский, М.В. Чувствительность и специфичность диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) в выявлении вирусоносителей ВЛ КРС среди оздоравливаемого от лейкоза поголовья крупного рогатого скота / М.В. Петропавловский, И.М. Донник, А.Т. Татарчук, A.B. Лысов, C.B. Садчикова, М.П. Михеев // Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц: Сборник научных трудов ведущих ученых России и Зарубежья. Вып. 3. - Уральское издательство, Екатеринбург, 2010. С 113-118.

7. Петропавловский, М.В. Особенности течения и распространения лейкоза крупного рогатого скота в Челябинской области / М.В. Петропавловский, И.М. Донник, А.Т. Татарчук, A.B. Лысов, Ю.Ф. Водиченков, М.П. Михеев // Журн. Аграрный вестник Урала, Екатеринбург, 2010. - №10

8. Петропавловский, М.В. Система мероприятий оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза в Уральском федеральном округе / М.В. Петропавловский, М.И. Гулюкин, И.М. Донник, П.Н. Смирнов, Г.С. Сивков, В.Н. Шевкопляс, И.А. Шкуратова, А.Т. Татарчук, C.B. Деркач, В.А. Красноперов, М.А. Исаев, А.Г. Исаева, Б.М. Коритняк, М.П. Михеев // Научные рекомендации, г. Екатеринбург: Уральское издательство, 2008.- 66 с.

9. Петропавловский, М.В. Методология снижения инфицированносп животных вирусом лейкоза в оздоравливаемых стадах крупного рогатого. скота М.В. Петропавловский, И.М. Донник, А.Т. Татарчук, A.B. Лысов, М.П. Михеев / Научно - практические рекомендации, г. Екатеринбург: Уральское издательство, 2009.- 124 с.

10. Петропавловский, М.В. Способ ранней диагностики лейкоза у молодняк! крупного рогатого скота / М.В. Петропавловский, И.М. Донник, А.Т. Татарчук, A.B. Лысов, А.Г. Исаева, Е.В. Печура, М.П. Михеев // Методические рекомендации, г. Екатеринбург: Уральское издательство, 2010. - 32с.

На правах рукописи

Петропавловский Максим Валерьевич

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТОВ В ВЫЯВЛЕНИИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ОЗДОРАВЛИВАЕМЫХ ОТ ЛЕЙКОЗА СТАДАХ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Подписано в печать 27.10.2010г. Формат 60x84 1/16 Усл. печ.л. 1,0 Бумага для множительных аппаратов. Печать офсетная. Гарнитура Times New Roman. Объем 1 п.л. Заказ № 495/2 Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ООО «Таймер» 620219, Екатеринбург, ул. Луначарского, 136

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Петропавловский, Максим Валерьевич

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в субъектах Российской Федерации и зарубежом.

1.2 Современные диагностические тесты.

1.2.1 Реакция иммунной диффузии (РИД).

1.2.2 Иммуноферментный анализ (ИФА).

1.2.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

1.3 Генотипическое разнообразие В Л КРС.

2. Собственные исследования.

2.1 Материалы и методы исследований.

2.2 Результаты исследований.

2.2.1 Распространение лейкоза крупного рогатого скота в Уральском регионе.

2.2.1.1 Характеристика эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Челябинской области.

2.2.1.2 Характеристика эпизоотической*ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Тюменской области.

2.2.1.3 Характеристика эпизоотической-ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Курганской области.

2.2.1.4 Характеристика эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Свердловской области.58'

2.2.2 Сравнительная оценка тестов РИД, ИФА, ПЦР при диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

2.2.3 Результаты определения чувствительности комплекса диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) вюздоровленных от лейкоза фермах.

2.2.4 Определение чувствительности и специфичности комплекса диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) у коров оздоравливаемой фермы.

2.2.5 Чувствительность и специфичность диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) в выявлении носителей ВЛ КРС среди молодняка-крупного рогатого скота.

2.2.6 Характеристика молекулярно - генетической структуры вируса лейкоза, циркулирующего в популяции крупного рогатого скота разных регионов

3. Обсуждение результатов исследований.

4. Выводы.

5. Практические предложения.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Эффективность диагностических тестов в выявлении вируса лейкоза крупного рогатого скота в оздоравливаемых от лейкоза стадах"

Актуальность проблемы. Одним из самых распространенных хронических инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, наносящих значительный экономический ущерб животноводству, является лейкоз крупного рогатого скота (В Л КРС). Проблема лейкоза имеет общебиологическое и медицинское значение ввиду близкого морфологического и эволюционного родства вируса лейкоза крупного рогатого скота с вирусами Т-клеточного лейкоза человека и до настоящего времени не потеряла своей актуальности. Наоборот, лейкоз вышел на первое место в ряду хронических инфекций крупного- рогатого скота. Болезнь поражает в первую очередь высокопродуктивных коров; что, в свою очередь, является;угрозой национальному генофонду крупного рогатого скота страны (Н.И. Петров, 2001; H.A., Мальцева с соавт., 2003;: F.A. Симонян, 2005; П.Н. Смирнов с соавт., 2007; М.И. Гулюкин, 2008; 2009; И.М. Донник с. соавт;, 2000, 2008, 2010; Л.К.Эрнст,Н.А. Зиновьева; 2008):

Заболевание наносит экономический ущерб; который; слагается из недополученного молока; приплода;, ограничений в реализации молока- и племенного молодняка, преждевременной; выбраковки коров и быков — производителей, утилизации туш, расходов на проведение оздоровительных мероприятий. Кроме того;, установлено? достоверное снижение* питательной ценности молока инфицированных В Л КРС коров из-за уменьшения содержания в нем общего белка и большинства аминокислот, в том числе пяти незаменимых (П.Н. Смирнов; 2007; М;И: Гулюкин, А.Ф:. Валихов, В.М. Нахмансон, 'JEÄL Иванова; К.П. Грек, С.В; ЛЪпунов; 2008; Т.А. Гаврилова, 2009).

Уже многие годы, проводимый; в хозяйствах Российской. Федерации, контроль над эпизоотическим процессом лейкоза: КРС, не эффективен. Громаднейший расход сил и средств на борьбу с . этой факторной инфекционной болезнью приводит к тому, что уже десятилетия во многих субъектах Российской Федерации эпизоотическая ситуация не только не улучшается, но ухудшается, даже на фоне снижения численности КРС (С.И. Джупина, 2008).

Масштабность распространения эпизоотии лейкоза свидетельствует о том, что традиционная система оздоровительных мероприятий не позволяет в должной мере контролировать и управлять эпизоотическим процессом. В неблагополучных по лейкозу стадах есть все основания считать, что практически все животные в той или иной степени инфицированы BJI КРС (А.Ф. Лебедев, 2009).

На сегодняшний день, единственными наиболее эффективными методами борьбы с лейкозом крупного рогатого скота, являются его ранняя диагностика, изоляция и методичная выбраковка больных животных с последующим формированием свободного от вируса лейкоза стада. Поэтому, совершенствование методов его ранней диагностики является актуальной задачей. Одними из основных требований, предъявляемым к диагностическим тестам, являются чувствительность и специфичность (В.П.Федотов, О.В. Иванов, О.Ю. Иванова, 2006; М.И. Гулюкин 2007; И.М. Донник, А.Т. Татарчук, 2008, 2009; A.M. Смирнов 2008; В.В. Субботин, Д.В. Колбасов, 2008).

В существующих правилах и. методических указаниях по лейкозу наряду с РИД, упоминаются такие диагностические методы, как иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако, в отличие от реакции иммунодиффузии. (РИД), которая получила широкое распространение при диагностике инфекции вируса лейкоза, региональный регламент их применения для оздоровления хозяйств не разработан. В этой связи разработка экономически рационального регламента диагностики инфекции ВЛ КРС является актуальной проблемой, требующей решения (В.В. Храмцов, Н.Г. Двоеглазов, Т.А. Агаркова, H.A. Осипова, 2010).

Проведение мероприятий по ликвидации лейкоза должно опираться на исследование методом РИД, но и необходимо осуществление иммунологического и молекулярно - генетического контроля по выявлению животных носителей BJI КРС, что служит одним из наиболее важных моментов в общем комплексе профилактических мер при лейкозе крупного рогатого скота, а также будет способствовать и профилактике возникновения незаразной патологии у животных (Х.Б. Баймишев, 2009).

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на обнаружении генома ретровируса, на два порядка чувствительнее и специфичнее иммунологических методов и имеет хорошую перспективу для диагностики лейкоза, так как позволяет определять наличие генов гликопротеина возбудителя лейкоза у телят с 15-дневного возраста, что крайне важно для изоляции зараженных с раннего возраста животных (Ф.Ф. Зинатов, 2008).

Частая повторная встречаемость энзоотического лейкоза в стадах крупного рогатого скота, которые свободны от BJI КРС в течение многих лет, указывает на то, что BJI КРС может сохраняться в стаде, не вызывая симптоматических признаков и сероконверсии (появление в сыворотке крови или исчезновение из нее специфических антител) (R. Lorenz, J. Straub, 1994)). Это доказывает то, что тот или иной официально предписанный метод обнаружения антител не достаточен, для окончательной оценки оздоровленных от лейкоза стад. Для этого необходимы более углубленные исследования региональных генетических особенностей циркулирующих штаммов В Л КРС (Fechner и другие., 1997; Elwert, 1997; Mewes, 1997).

Установление принадлежности BJT КРС к определенному генотипу может служить основанием для расширения исследований в данном направлении, в проведении исследований в выявлении патогенетических особенностей развития лейкозного процесса, как в экспериментальном, так и в спонтанном вариантах (D. Beier, Р. Blankenstein, О. Marquardt, J. Kuzmak, 2001; C.B. Чичинина, 2005; E.B. Дробот, 2007, 2008; Ф.Ф Зинатов, 2008; И.М. Гулюкин, А.И. Клименко, Н.Ф. Ломакина, 2009, 2010; И.М. Донник, 2010, П.Н. Смирнов, Н.В. Грачева, 2009, 2010).

Генотипическое разнообразие BJI КРС и результаты сравнительного исследования, в контексте их эпизоотической значимости, открывают новые методические подходы в разработке научно-обоснованных схем оздоровления неблагополучных по лейкозу стад.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить распространение лейкоза в Уральском регионе.

2. Изучить эффективность современных методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

4. Изучить генотипическое разнообразие, молекулярно -генетическую структуру и провести филогенетический анализ возбудителя лейкоза крупного рогатого скота, циркулирующего в популяции животных из разных регионов России.

5. Разработать рекомендации для ранней лабораторной диагностики лейкоза.

Научная новизна. Впервые изучена молекулярно-генетическая структура BJI КРС, циркулирующего в популяции животных разных регионов Урала и России. Из крови инфицированных BJI КРС животных получены изоляты возбудителя лейкоза, определены их молекулярно -генетические свойства, подтвержденные лабораторными тестами («nested» -ПЦР, ПДРФ анализ (RFLP), ДНК - секвенирование). Нуклеотидные последовательности участка гена env 444bp выделенного возбудителя занесены в международный банк генотипов (СепВапк ИСВГ, 2009, 2010 гг.). На основании филогенетического анализа полученных результатов согласно Международной классификации, определена дендрограмма регионального распределения циркулирующих штаммов ВЛ КРС.

Проведены исследования сравнительной эффективности лабораторных (РИД, ИФА, ПЦР) методов диагностики лейкоза у коров и молодняка в оздоровленных и оздоравливаемых стадах. Установлена эффективность оздоровительных мероприятий, внедряемая в отдельных субъектах УрФО.

Практическая значимость и реализация результатов исследований.

Результаты исследований учтены при проведении оздоровительных мероприятий в животноводческих предприятиях Свердловской и Тюменской областей, в которых отмечена положительная динамика сокращения количества неблагополучных по ВЛ КРС молочно - товарных ферм, и снижения уровня инфицирования животных.

На основании полученных данных подобраны праймеры для ПЦР -диагностики, способствующие раннему выделению носителей ВЛ КРС в оздоравливаемых стадах как среди коров, так и среди молодняка и тем самым-ускоряющие сроки оздоровления.

На основании данных выполненных исследований в оздоравливаемых хозяйствах подготовлены рекомендации - «Способ ранней прижизненной диагностики лейкоза у молодняка крупного рогатого скота», утвержденные НТС МСХиП Свердловской области (2010 г.).

По результатам исследований подготовлены научно - практические рекомендации, утвержденные ИТС МСХиП Свердловской области (2008 -2010гг.).

Научные рекомендации Методология снижения инфицированности животных вирусом лейкоза в оздоравливаемых стадах к.р.с., г. Екатеринбург: Уральское издательство, 2009. — 124 с.

Методические рекомендации Способ ранней диагностики лейкоза у молодняка крупного рогатого скота, г. Екатеринбург: Уральское издательство, 2010. - 32с.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В животноводческих предприятиях Уральского региона лейкоз крупного рогатого скота имеет широкое распространение. Эффективность проводимых оздоровительных мероприятий в субъектах различна.

4. Филогенетический анализ вируса лейкоза, полученный на основе-ДНК - секвенирования позволил классифицировать опытные штаммы и сравнить их с мировыми изолятами.

5. Ранняя- диагностика В Л КРС с использованием комплекса лабораторных методов позволяет выявить инфицированных животных с 15 -ти дневного возраста.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики хронических инфекций и патологии животных» (г. Омск, 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней животных и птиц» (г. Екатеринбург, 2008, 2010 гг.), молодежных научно - практических конференциях УрНИВИ РАСХН (2008

2009 гг.), осенней научно-практической конференции по отбору инновационных проектов молодых ученых «У.М.Н.И.К.» (г. Екатеринбург,

2010 г.), ученом совете ГНУ Уральского научно-исследовательского ветеринарного института Российской академии сельскохозяйственных наук (2008-2010 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ (1 - журнал «Ветеринария Кубани», 1 - журнал «Аграрный вестник Урала»), 3 — методические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований,- анализа полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Материал изложен на 143 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 24 рисунка. Список литературы включает 267 источника, в том числе 102 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Петропавловский, Максим Валерьевич

4. ВЫВОДЫ

1. Выявлено распространение лейкоза в Уральском регионе. Установлено, что в животноводческих предприятиях Уральского региона средний уровень инфицированности BJI КРС коров и молодняка составляет соответственно: в Тюменской области - 7% и 8%, в Челябинской области - 16%, в Курганской области - 12,4%, в Свердловской области — 0,001%.

2. Оздоровительные противолейкозные мероприятия интенсивно проводятся в животноводческих предприятиях Тюменской области, что подтверждается снижением количества неблагополучных ферм с 212 в 2004 г. до 132 в 2009 г. В Челябинской и Курганской областях оздоровительные мероприятия проводят эпизодически. Количество неблагополучных ферм за последние годы в Курганской области поддерживается на одном уровне в 2007г. -112, в 2008г. - 118, в 2009г. - 115, в Челябинской области увеличивается с 60 в 2001г. до 194 - в 2010 г. В Свердловской области, практически все поголовье крупного рогатого скота общественного и индивидуальных секторов животноводства оздоровлено от лейкоза (осталось 4 неблагополучные фермы с поголовьем 658 положительно реагирующих при серологической диагностике коров из 812 ферм с поголовьем 86 тыс. коров).

3. Определена диагностическая ценность РИД, и неоднозначность методов ПЦР и ИФА при реальном течении эпизоотического процесса, что может быть связано с недостаточной чувствительностью и специфичностью диагностических тест - систем.

4. В оздоравливаемых фермах, комплексное исследование крупного рогатого скота лабораторными методами РИД, ИФА, ПЦР и своевременное выведение положительно реагирующих животных, приводило к полной элиминации возбудителя из стада, что подтвердилось впоследствии многократными диагностическими исследованиями и отсутствием положительно реагирующих на лейкоз особей. Установлена возможность ранней диагностики в оздоравливаемых стадах инфицированного вирусом лейкоза молодняка крупного рогатого скота, позволившая выявить 8 - 15% инфицированных животных с 15 — ти дневного возраста.

5. Впервые изучена молекулярно-генетическая структура BJI КРС, циркулирующего в популяции животных разных регионов Урала и России. Определено, что в популяциях крупного рогатого скота регионов РФ циркулирует возбудитель лейкоза, имеющий различное генотипическое разнообразие и генотипическую структуру, характерную для Австралийского, Бельгийского и смешанных типов, присутствие которых в животноводческих предприятиях может свидетельствовать о проникновении одного из типов с импортным поголовьем.

6. Филогенетический анализ вируса лейкоза, полученный на основе ДНК - секвенирования позволил классифицировать опытные штаммы в пределах группы и подгруппы, а также сравнить с известными мировыми изолятами. При данном анализе были определены различия между группами, и дистанция между известными генотипами вируса. Полученные штаммы возбудителя лейкоза крупного рогатого скота из регионов Урала и Краснодарского края внесены в международный банк генотипов Gen Bank (NCBI) (2009, 2010гг.).

7. На основании полученных данных подобраны праймеры для ПЦР диагностики, способствующие раннему и эффективному выделению носителей BJI КРС в оздоравливаемых стадах как среди коров, так и среди молодняка.

8. На основании данных выполненных исследований в оздоравливаемых хозяйствах подготовлены рекомендации - «Способ ранней прижизненной диагностики лейкоза у молодняка крупного рогатого скота», утвержденные НТС МСХиП Свердловской области (2010 г.).

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Первое диагностическое исследование нарождающегося молодняка оздоравливаемых гуртов крупного рогатого скота проводить в ПЦР в возрасте 15дн. - 1мес., так как только ПЦР в этот период выявляет вирусоносителей, инфицированных в период внутриутробного развития плода. Второе исследование проводить — в ИФА, в возрасте 3 мес. с учетом ее более высокой чувствительности по выявлению вирусоносителей при низком уровне антител. С 6 месячного возраста всех телок исследовать в РИД ежеквартально до получения отрицательного результата. Положительно реагирующие животные во все периоды исследований необходимо выводить из групп (на откорм). Из оставшегося поголовья формировать отдельные группы для изолированного содержания и выращивания здоровых нетелей, которыми поэтапно заменять инфицированное поголовье коров неблагополучных ферм.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Петропавловский, Максим Валерьевич, Екатеринбург

1. Абакин, С.С. Фундаментальные исследования в ветеринарии / С.С. Абакин, C.B. Криворучко, Д.Г. Пономаренко, Е.А. Борщев // Ветеринарная патология. — 2010. -№ 1. С. 6 — 9.

2. Авилов, В.М. Эпизоотическое состояние по лейкозу крупного рогатого скота в РСФСР / В.М. Авилов // Проблема оздоровления хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота: Тез. докл. Всесоюзн. научно-произв. конференции. — Новосибирск, 1990.-С. 13-14.

3. Агол,. В.И. Генетически запрограммированная смерть клеток / В.И. Агол. — 1996.-N 6.-С. 20-24. .

4. Альберте, Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альберте, Б. Брей, Дж. Льюис.-М., 1994. Т. 3 . - С. 36.

5. Арутюнян, В.Г. Сравнительная характеристика серологических методов диагностики РИД и ИФА в системе оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота / В;Г. Арутюнян // Автореф. дис. канд. вет. наук. М.,1992.-С. 24.

6. Ачайте, Ю.Ю. Фагоцитарная активность воспалительного экссудата при хроническом лимфолейкозе / Ю.Ю. Ачайте, Л.П. Лукшис, В.Б. Добкавичюс // Тез. Всесоюзн. конференции. Ташкент, 1990. - С. 37.

7. Баркова, Н.В. Иммунологический контроль как основа повышения эффективности мероприятий по борьбе с лейкозом КРС / Н.В. Баркова // Автореф. дисс. канд. наук. -М., 1998. С. 24.

8. Белова, Л.Г. Ретроспективный взгляд на борьбу с лейкозом КРС / Л.Г. Белова^ В.Л. Никифорова // Ветеринарный консультант. 2006. - №15. - С. 4 -5. .

9. Бергольц, В.М. Сравнительная патология и этиология лейкозов человека и животных / В.М. Бергольц, Н.В. Румянцев. М., 1966. - 366 с.

10. Бурба, Л.Г. Основные результаты научных исследований по проблеме лейкозов сельскохозяйственных животных и птиц, проводимых странами-членами СЭВ /Л.Г. Бурба//Бюл. ВИЭВ. -М., 1977. -№30. -С. 14-12.

11. Бурба, Л.Г. Лейкозы и злокачественные опухоли животных / Л.Г. Бурба, А.Ф. Валихов, В.А.Горбатов. М., 1988. - 400 с.

12. Бурба, Л.Г. Диагностика лейкозов сельскохозяйственных животных / Л.Г. Бурба, А.А. Кунаков. M., 1983. - С. 31 - 103.

13. Бусол, В.А. Тест-система для выявления BJIKPC полимеразной цепной реакцией / В.А. Бусол, О.Ю. Лиманская, А.П. Лиманский // Ветеринария. — 1999. — № 6. С. 27 - 30.

14. Валихов, А.Ф. Лейкоз крупного рогатого скота (вирусологические аспекты) / А.Ф. Валихов, В.П. Шишков, Л.Г. Бурба. Москва, 1977. - С. 23.

15. Васильев, Н.Т. Лейкоз крупного рогатого скота / Н.Т. Васильев-Волгоград, 1962. — 149 с.

16. Вейсман, И.Л. Введение в иммунологию / И.Л. Вейсман, Л.Е. Худ, У.Б. Вуд // Учебн. Пособие: перевод с англ. Е.В. Тархановой. М., 1983. - 160 с.

17. Верховский, O.A. Иммуноферментный анализ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / O.A. Верховский, В.В. Цибезов, М.В. Баландина, И.В. Непоклонова // Ветеринария. 2002. - №12. - С. 5 - 6.

18. Виттман, П. Исследование морфологии и ревертазной активности онкорнавирусов, выделенных от крупного рогатого скота, больного энзоотическим лейкозом / П. Виттман, П. Венкер // Бюлл. ВИЭВ. М.,1977. -№30.-С. 13-14.

19. Гаврилова, Г.А. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота / Г.А. Гаврилова, Ю.А. Макаров, C.B. Бахметьева // Ветеринария. 2009. - № 1. -С. 20-23.

20. Галлеев, Р.Ф. Трансплацентная передача ретровируса лейкоза (BLV) от инфицированных коров потомству / Р.Ф. Галлеев, А.Ф. Валихов, С.А. Мурватуллоев // Распознование и меры борьбы с лейкозами человека и животных. Москва, 1982. - С. 196 - 197.

21. Гладырь, Е.А. Создана и экспериментально апробирована высокочувствительная тест-система диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Е.А. Гладырь // Ветеринарный консультант. № 5. - 2006. - С. 7 - 8.

22. Глазко, В.И. ДНК-технологии и биоинформатика в решении проблем биотехнологий млекопитающих / В.И. Глазко, Е.В. Шульга, Т.Н. Дымань, Г.В. Глазко. Белая Церковь, 2001. — С. 34.

23. Горбунов, А.П. Лейкоз крупного рогатого скота в Вологодской области / А.П. Горбунов, А.П. Кузнецов. Вологда-Молочное: ИЦ ВГМХА, 2004. - 70 с.

24. Грачева, Н.В. Генотипическое разнообразие BLV на территории Краснодарского края / Н.В. Грачева, П.Н. Смирнов, В.А. Рябинина, Т.А. Каширских // Материалы международной научно-практической конференции. Екатеринбург, 2010.

25. Грачева, Н.В. Генотипическое разнообразие BLV по gag и env генам разных пород / Н.В. Грачева // Дис. канд. биол. наук. Новосибирск, 2010.-100 с.

26. Гулюкин, М.И. Разработка эффективных мероприятий против лейкоза крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин, JI.A. Иванова, Н.В. Замараева, Н.В. Баркова, Г.П. Грек, В.А. Храмцов И Ветеринария. — № 12. —2002. — С. 3.

27. Гулюкин, М. И. Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота / М. И. Гулюкин, Н.В. Замораева, Л.А. Иванова, К.П. Грек, A.B. Симонов, Н.В; Баркова//Ветеринар. 2001 .-№ 12. - Р; 1 - 2.

28. Гулюкин, М.И. Итоги и перспективы научных исследований по проблеме лейкоза КРС / М.И. Гулюкин, Г.А. Симонян, Н.В: Замараева, Л.А. Макарова // Труды ВИЭВ, Т.71. -М., 1999. -С. 15-236.

29. Гулюкин, М.И. Обзор эпизоотической ситуации по лейкозу в РФ' / М.И. Гулюкин // Доклад на координационном совещании ВИЭВ: М., 2005. -17 с.

30. Гулюкин, М.И. Противоэпизоотические мероприятия при лейкозе крупного рогатого скота в фермерских и личных подсобных хозяйствах граждан / М.И. Гулюкин с соавт. // Методические рекомендации. Москва, 2007. — 14 с.

31. Гулюкин, М.И. Эпизоотологическая оценка методов прижизненной диагностики лейкоза КРС / М.И. Гулюкин, Е.А. Дун, Н.В. Замараева // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. — 2000. — Т.З. — С. 60 — 62.

32. Джапаралиев, Н.Т. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР-ИФА. / Н.Т.Джапаралиев, Н.Ф. Ломакина, Л.Б. Прохватилова, А.И. Ломакин //Вет, и мед. аспекты зооантропонозов. Покров, 2003. - № 2. - С. 414 - 418.

33. Джупина, С.И. Теория эпизоотического процесса / С.И. Джупина. М., 2004.-С. 123.

34. Джупина, С.И. О проблемах контроля эпизоотического процесса лейкоза крупного рогатого скота Электронный ресурс. Режим доступа: http://dzhupina.narod.ru/article.htm.

35. Донник, И.М. Изучение роли иксодовых клещей в передаче вируса лейкоза крупного рогатого скота / И.М. Донник с соавт. // Ветеринария. 2009. - № 12. -5 -6 с.

36. Донник, И.М. Региональная молекулярно генетическая структура вируса лейкоза крупного рогатого скота / И.М. Донник, А.Т. Татарчук, A.B. Лысов, М.П. Михеев // Ветеринария Кубани. - Краснодар, 2010. - №3. - С. 5 - 6.

37. Желтиков, А.И. Химическое разведение и селекция сельскохозяйственных животных / А.И. Желтиков, Н.С. Уфимцева, Т.В. Макеева, В.И. Устинова / Учебное пособие для практических занятий. Новосибирск, 2002. - С. 25 — 27.

38. Зильбер, JI.A. Эволюция вирусно-генетической теории возникновения опухолей / JI.A. Зильбер, И.С. Ирлин, Ф.Л. Киселев. М., 1975. -С. 7 - 33.

39. Зинатов, Ф.Ф. Молекулярная генодиагностика лейкоза крупного рогатого скота / Ф.Ф. Зинатов // Автореф. дис. канд. биол. наук. Казань, 2008. - 25 с.

40. Иванов, А.Г. Особенности взаимосвязи проявления туберкулеза, бруцеллеза, лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Курганской области / А.Г. Иванов //Автореф. дис. канд. вет. наук. Новосибирск, 2000. -21 с.~

41. Иванов, О.В. Эффективность серологических методов исследования при лейкозе крупного рогатого скота / О.В. Иванов, О.Ю. Иванова, В.П. Федотов, Т.И. Брезгинова,-О.А Верховский // Ветеринария. -2008. № 7. - С. 6 - 8.

42. Камалова, Б.В. Племпродажа источник заноса нераспространения лейкоза КРС / Б.В. Камалова // Ветеринарный консультант. - 2006. - № 15. - С. 5 - 6.

43. Колина, C.B. Трансплацентарная передача вируса лейкоза крупного рогатого скота / C.B. Колина // Проблема оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота: Тез. докл. Всесоюзн. научно-произв. конференции. -Новосибирск, 1990.-С. 61 -62.

44. Колина, C.B. Трансплацентарная передача вируса лейкоза крупного рогатого скота / C.B. Колина // Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1993. -18 с.

45. Крикун, В.А. Слизистая носа — наиболее вероятный путь заражения животных вирусом лейкоза крупного рогатого скота / В.А. Крикун // Лейкозы крупного рогатого скота: Сб. научн. трудов. М., 1979. - С. 5.

46. Крикун, В.А. Лейкоз крупного рогатого скота и иммунологическая толерантность / В.А. Крикун // Ветеринария. 2002. - № 6. - С. 7 - 9.

47. Критский, Г.А. Аномалия первичной структуры ДНК при лейкозах и лучевом поражении животных / Г.А. Критский, Г.Ф. Коромыслов // Тез. докл. III Всесоюзн. конференции по эпизоотологии. Новосибирск, 1991. - С. 74 - 77.

48. Кузнецова, Н.В. Использование полимеразной цепной реакции для выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота / Н.В. Кузнецова, Н.В. Кузнецов, Г.А. Симонян // Ветеринария. 1997. - № 5. — С. 12-15.

49. Кукаин, P.A. Вирусы группы HTLV В кн: Ретровирусы и их роль в патологии человека и животных / P.A. Кукаин. — Рига, 1989. — С. 6 11.

50. Кукайн, Д.В. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / Д.В. Кукайн, Л.И. Нагаева, В.П. Ложа. Рига, 1982. - 129 с.

51. Кустикова, О.В. Лейкоз крупного рогатого скота в Самарской области /' О.В. Кустикова, K.M. Садов, A.C. Алексеев // Сб. научн. статей по материалам международной научно-практической конференции 80 лет Самарской НИВС. — Самара, 2009. С. 250 - 253.

52. Лебедев, А.Ф. Управление инфекционными и эпизоотическими процессами при лейкозе КРС / А.Ф. Лебедев // Ветеринарная жизнь. 2009. - № 20. - С. 14.

53. Лемеш, В.М. О мерах борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Белоруссии / В.М. Лемеш // Прионные и ретровирусные инфекции животных: Тр. ВНИИЭВ. 1996.- Т. 77. - С. 96 - 97.

54. Лемеш, В.М. Эпизоотические особенности лейкоза крупного рогатого скота в Калининградской области / В.М. Лемеш, В.Г. Минасян // Тез. докл. Всесоюзн. конференции Новосибирск, 1990. - С.44 - 45.

55. Лиманская, О. Ю. Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота посредством полимеразной цепной реакции / О.Ю. Лиманская, А.П. Лиманский, В.И. Цымбал // Ветеринарная медецина. 1998. - №74. - С. 35 - 44.

56. Лиманский, А. П. Молекулярно-генетические методы основа программ по искоренению лейкоза крупного рогатого скота / А. П. Лиманский, О. Ю. Лиманская // Биотехнология. - 2001. - №3. - С. 40 - 50.

57. Лиманский, А.П. Типирование вируса лейкоза крупного рогатого скота циркулирующего на территории Украины / А.П. Лиманский // Вопросы вирусологии, 2004. №49. - С. 39 - 44.

58. Логановский, С.Я. Распространение инфекции онковируса в неблагополучных по лейкозу стадах крупного рогатого скота /

59. С.Я. Логановский, O.K. Приедниекс, В.Я. Мозгис // Этиология, диагностика и эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота. — Рига, 1982. — С. 106 — 112.

60. Логинов, С.И. Системный эколого-эпизоотологический анализ совокупного риска развития лейкоза КРС / С.И. Логинов И Автореф. дисс. докт. наук. — Новосибирск, 2005. — 21 с.

61. Лопунов, С.В. Эпизоотологический и экономический мониторинг туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота на территории Центрального Федералтного округа РФ / С.В. Лопунов // Автореф. дис. канд. вет. наук. — Барнаул, 2009. 19 с.

62. Магер, С.Н. Лейкоз крупного рогатого скота: Учеб. Пособие / С.Н. Магер, В.В. Храмцов, П.Н. Смирнов, В.В. Смирнова, В.В. Разумовская, О.Н. Паршина. -НГАУ. ГНУ ИЭВСиДВ. Новосибирск, 2005. - 160 с.

63. Макаров, В.В. ПЦР в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота / В.В. Макаров, Д.П. Гришанин // Ветеринария. 2005. - №4. - С. 9 - 11.

64. Мальцева, H.A. ПЦР — диагностика лейкоза крупного рогатого скота / H.A. Мальцева, Г.О. Шайхаев, А.Г. Ирский, С.Г. Постовой, A.A. Животов, Е.Е. Шлычков, В.Ф. Ерёмин // Ветеринарная патология. №1. - 2003. С. 129 -131.

65. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М., 1984. - С. 157 - 186.

66. Мате, Д. Гистологическая и цитологическая классификация опухолевых болезней кроветворной и лимфоидной тканей / Д. Мате. Женева, 1981. - 47 с.

67. Методические рекомендации «Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции». Новосибирск, 2004.-16 с.

68. Микалаускане, Г. Ю. Получение моноклональных антител к gp51 антигену и их применение для ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Г. Ю. Микалаускане, В. В. Вайчюнене // Укр. биохим. журн. 1996. - 68. - Р. 89 - 94.

69. Мищенко, В.А. Особенности иммунодефицитов у крупного рогатого скота / В.А. Мищенко с соавт. // Ветеринария. 2006. - №12. - С. 17.

70. Москалик, P.C. Ускоренный метод ликвидации лейкоза крупного рогатого скота на племпредприятиях / P.C. Москалик // Прионные и ретровирусные инфекции животных: Бюлл. ВНИИЭВ. М., 1996. - № 77. - С. 15 - 18.

71. Москалик, P.C. Лейкоз крупного рогатого скота. Меры профилактики и борьбы в Молдове // P.C. Москалик, Е.В. Реница. Кишинев, 2003. - С. 1 - 48.

72. Москалик, P.C. Механизм передачи ВЛКРС и контагиозность лейкоза крупного рогатого скота / P.C. Москалик // Эпизоотология и профилилактикаинфекционных болезней КРС: Сборник международной научно-практической конференции. Киев, 2006. — С. 59-61.

73. Мурватуллоев, С.А. Влияние природно-хозяйственных и техногенных факторов на эпизоотологию и характер проявления лейкоза КРС / С.А. Мурватуллоев // Автореф. дисс. докт. наук. — М., 1981. 49 с.

74. Нахмансон, В.М. Генетический аспект лейкоза крупного рогатого скота / В.М. Нахмансон, Л.Г. Бурба, Е.А. Дун // Всесоюзн. НИИ информатики и технико-экономических исследований по сельскому хозяйству. Москва, 1975. -С.47-58.

75. Нахмансон, В.М. Лейкоз крупного рогатого скота / В.М. Нахмансон. М., 1986.-175 с.

76. Незавитин, А.Г. Селекционно-генетические и организационные основы борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Новосибирской области / А.Г. Незавитин // Тез. докл. Всесоюз. научно-производ. конференции СО ВАСХНИЛ. Новосибирск, 1990. - С. 37 - 38.

77. Облап, Р. В. Вирус бычьего лейкоза и диагностика инфицированных животных / Р. В. Облап, В. И. Глазко, А. А. Созинов //Цитология и генетика. — 1997.-31.-С.41 -43.

78. Опанасюк, А. С. Функциональная активность лимфойдной системы плодов крупного рогатого скота, боьного лейкозом / А. С. Опанасюк // Автореф. дис. канд. Ветеринарных наук. Новосибирск, 1991. - 24 с.

79. Орлянкин, Б.Г. Классификация ретровирусов и характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота / Б.Г. Орлянкин, М.И. Гулюкин, Н.В. Замараева // Ветеринария. 2000. - № 5. - С. 17-19.

80. Островская, В.Ф. Сравнительная оценка продуктивности и состава молока у здоровых и больных лимфолейкозом коров / В.Ф. Островская, Т.Н. Бабкина // Изучение лейкоза крупного рогатого скота: Сб. науч. тр. Т. 25. - 1980. - №4. -83 с.

81. Паракин, В.К. Экспериментальный лейкоз овец / В.К. Паракин, Л.Ф. Силкин, H.H. Котлярова // ТР. ВИЭВ. М., 1981. - Т. 54. - С. 19 - 22.

82. Парфанович, М.И Обнаружение онкорнавируса в культурах клеток тканей больных лейкозом коров / М.И. Парфанович // Ветеринария. 1974. -№4. - С.47 -49.

83. Паршина, О.Н. Результаты сравнительного изучения интерьерных показателей крупного рогатого скота при лейкозе и экономическая оценка оздоровительных мероприятий / О.Н. Паршина // Автореф. дис. канд. ветеринарных наук. Новосибирск, 2002. - 26 с.

84. Петров Н.И. Лейкоз крупного рогатого скота. Насколько он опасен? / Н.И. Петров // Зооиндустрия. 2001. - № 3. - С. 6 - 7.

85. Петров, Н.И. Лейкоз крупного рогатого скота / Н.И. Петров, В.А. Апалькин, М.И. Гулюкин. — Санкт-Петербург, 1998.

86. Петров, Н.И. Эпизоотический процесс и система оздоровительных мероприятий при лейкозе КРС / Н.И. Петров // Автореф. дисс. докт. наук. — М., 1999.-48 с.

87. Петухов, В.Л. Ветеринарная генетика и селекция сельскохозяйственных животных / В.Л. Петухов, А.Г. Незавитин, С.Г. Куликов, С.П. Князев. -Новосибирск, 1994. 116 с.

88. Пономарева, И.С. Полимеразная цепная реакция в диагностике лейкоза КРС при оздоровлении хозяйств Оренбуржья / И.С. Пономарева, М.В. Сычева, М.А.Поляков, О.П. Лысенкова // Ветеринарная патология 2009. - Вып. 1. -С. 60-62.

89. Прохватилова, Л.Б. Диагностика лейкоза КРС методом полимеразной цепной реакции / Л.Б. Прохватилова, А.И. Ломакин, С.Н. Колосов, В.В.,Дрыгин, С.С. Рыбаков, A.A. Гусев // Вестник РАСХН. -1998. №5. - С. 65 - 68.

90. Родыгина, В.В. Некоторые показатели иммунобиологического состояния организма у крупного рогатого скота с положительной РИД на лейкоз // Материалы XIX научно-практической конференции. Ижевск, 1999. - С. 26 - 29.

91. Рождественский, И.К. Эпизоотическая ситуация по заразным болезням Электронный ресурс. Режим доступа: www.tsenovik.ru.

92. Румянцев, H.B. Производственный вывод на основании обследования хозяйств на лейкоз крупного рогатого скота / Н.В. Румянцев // Тр. MB А. — Т. 37. -М., 1961.-С.21 -24.

93. Русинович, А.А Особенности эпизоотического процесса лейкоза крупного рогатого скота в разные сезоны года. / A.A. Русинович // Вести Академии аграрных наук Беларуси Минск, 1995. - №4. - С. 99 —101.

94. Самуйленко, А.Я. Иммуноферментный анализ в ветеринарной медецине / А.Я. Самуйленко, Д.П. Кузнецов, С.В. Кузнецова // Ветеринария. —2001. -№12. -С. 20-23.

95. Смирнов, П.Н. Лейкоз крупного рогатого скота: научно обоснованные подходы к эффективному оздоровлению / П.Н. Смирнов // Ветеринария Сибири. -2002.-№7-8.-С 21-24.

96. Смирнов, П.Н. Научное образование и реализация в условиях производства комплексной системы противолейкозных мероприятий в Сибири / П.Н. Смирнов, В.В. Храмцов, В.В. Смирнова // Ветеринария Сибири. 2001. — №5.-С. 47-50.

97. Смирнов, П.Н. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота / П.Н. Смирнов, В.В. Смирнова, А.Т. Левашев / Методические рекомендации. -Новосибирск, 1990. 46 с.

98. Смирнов, Ю. П. Зависимость частоты лейкоза от некоторых факторов среды обитания крупного рогатого скота Профилактика и лечение заболеваний крупного рогатого скота в условиях Нечерноземья / Ю. П. Смирнов. Горький, 1993.-С. 12-18.

99. Смирнов, Ю.П. Развитие лейкозного процесса у инфицированных ВЛКРС коров в зависимости от их возраста / Ю.П. Смирнов // Ветеринария. -1999. -№12.-С. 15-17.

100. Смирнов, П.Н. Болезнь века — лейкоз крупного рогатого скота // П.Н. Смирнов. — Новосибирск. — 2007. 301 с.

101. Смирнов, П.Н. Проблемы лейкоза животных / П.Н. Смирнов, A.F. Незавитин, BiB. Смирнова, В.В. Храмцов // ИПП Советская Сибирь. — Новосибирск, 1992. 478 с. . '

102. Смит, К. Анализ генома / К. Смит, Ф: Коллинз, Ч. Кантор. М.,1990. - 58 с.

103. Снарските, А.В. Эпизоотические особенности, диагностика и иммунопрофилактика лейкоза крупного рогатого скота, в Литве / А.В- Снарските //Дис. канд. вет. наук.-Рига, 1992". — 168 с.

104. Сусова,. О.Ю. Область рХ HTLV-1 в жизненном цикле вируса и карценогенезе/ О.Ю Сусова, В.Э. Гурцевич //Молекулярная биология^-2003. -Т.37. -№3. С. 392- 403.

105. Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. М., 1998. - 928 с.

106. Таубеков, Г.К. Эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота в Казахстане / Г.К. Таубеков, А.И. Испуллаев // Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных в Сибири. — Новосибирск, 1995. — С. 52—56.

107. Федоров, Ю.Н. Иммунодефициты крупного рогатого скота / Ю.Н. Федоров // Ветеринария. 2006. - №12. - С. 3.

108. Федотов, В.П. Лейкоз крупного рогатого скота в Ивановской области / В.П. Федотов, О.В. Иванов, О.Ю. Иванова // Ветеринария. 2006. - №3. - С. 23 -25.

109. Хисамутдинов, Ф.Ф. Эпизоотическая ситуация* и перспективы осуществления противолейкозных мероприятий в республике Татарстан / Ф.Ф: Хисамутдинов //. Прионные и ретровирусные инфекции животных: Тр. ВНИИЭВ. 1996. - Т. 77. - С. 82.

110. Храмцов, В.В; Распространение, патогенетическая характеристика лейкоза крупного рогатого скота, и система противолейкозных мероприятий в Сибири / В.В. Храмцов // Дисс. докт. вет. наук. Новосибирск, 1995. - О. 284. .

111. Храмцов, В.В. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в некоторых областях Сибири / В.В. Храмцов, Т.А. Агаркова // Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных в Сибири. Новосибирск, 1995. - С. 57-62.

112. Цонев, П.И Взаимосвязь между заболеваемостью лейкозом; и молочной продуктивностью коров основных пород, разводимых в Болгарии / П.И. Цонев, Д. Кирчев, К. Анатасов // Животн. науки. 1987. - Т. 24. - №3. - С. 23 - 27.

113. Чичинина, C.B. Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу / C.B. Чичинина// Автореф. дисс. канд. биол. наук. Новосибирск, 2005.-24 с.

114. Чичинина, C.B. Возможности и ограничения использования полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) Эл. Ресурс. Режим доступа: http://vetfac.nsau.edu.ru/new /confer/t04/149. htm.

115. Шапот, B.C. Еще раз об онкогене / B.C. Шапот, М.А. Шлянкевич, Р.В. Лобаненков // Вопросы онкологии. 1983. - Т. 29. - №5. - С. 76 - 86.

116. Шатько, П.Д. Итоги изучения эпизоотологии лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах НСО / П.Д. Шатько, А.Л. Корнилова, Л.Н. Гейль // Сборник научных работ Алтайской НИВС. Барнаул, 1972. - №3. - С. 134 - 136.

117. Шишков, В. П. Лейкозы и злокачественные опухоли животных / В.П. Шишков, Л.Г. Бурба М.,1988. - 301с.

118. Шишков, В.П. Иммунологические аспекты ветеринарной лейкозологии / В.П. Шишков // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных: Тез. Всесоюзн. конференции. — Ташкент, 1984. — С. 3 — 5.

119. Шишков, В.П. Опухоли и лейкозы животных (биологические, экономические и , ветеринарно-медицинские аспекты) // Проблемы экспериментальной онкологии и лейкозов^человека и животных.- М., 1973. С. 11 - 22.

120. Шишков, В.П. Основные итоги научных исследований по проблеме лейкоза с.-х. животных за 10 пятилетку и задачи на 1981-1985гг. / В.П. Шишков, Г.Ф. Коромыслов, Л.Г. Бурба // Тр. ВИЭВ. М., 1981. - С. 3 - 10.

121. Шишков, В.П. Туберкулез животных, методы диагностики и профилактики / В.П. Шишков, A.B. Ткачев-Кузьмин, С.П. Кочанова. М.: ВНИИИТЭИ по сельскому хозяйству, 1986. - 43 с.

122. Шишков, В.П. Лейкозы животных общебиологическая и социальная проблема / Актуальные проблемы ветеринарной медицины в России // Сб. науч. трудов, посвящ. 100-летию вет. науки в России РАСХН. - Сиб. отд-ние, Новосибирск, 1998.- 72-82.

123. Шукель, A.A. Сравнительная характеристика иммунологических методов диагностики инфекции ВЛКРС в системе противолейкозных мероприятий / A.A. Шукель // Автореф. дис. канд. вет. наук. Барнаул, 1998. -18с.

124. Шукель, A.A. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Мирнинском улусе Республики Саха (Якутия) / A.A. Шукель // Сб. науч. тр. РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. Новосибирск, 1996. - С. 42 -45.

125. Эрнст, Jl.К. Особенности распространения антигенов BOLA-A и аллелей гена BOLA- DRB3 у черно-пестрого скота в связи с ассоциацией с лейкозом / Л.К. Эрнст, Г.Е. Сулимова, А.Р. Орлова, И.Г. Удина, С.П. Павленко // Генетика. -2008.-Т. 33. -№1. -С. 87-95.

126. Яунслейнис, Э.Я. . Связь между заболеваемостью лейкозом и продуктивностью коров бурой латвийской породы в стадах Валмиерского района Латвийской ССР / Э.Я. Яунслейнис, P.O. Гринберг // Лейкоз крупного рогатого скота. Рига, 1974. — С. 94 — 98.

127. Asfaw, Y. Distribution and superinfection of bovine leukaemia virus genotypes in Japan / Y. Asfaw, S. Tsuduku, M. Konishi, K. Murakami, T. Tsuboi // Arch Virol. -2004.-201 p.

128. Asfaw, Y. Distribution and superinfection of bovine leukemia virus genotypes in Japan / Y. Asfaw, S. Tsuduku, M. Konishi, K. Murakami, T. Tsuboi, D. Wu, H. S'entsui // Arch Virol. 2005. - P. 493 - 505.

129. Azuba, R.B. A prevalence study of bovine leukemia virus infection in slaugtered cattle in selected areas in Uganda / R.B. Azuba, U. Zieger, F.W. Schmidt // Bull. Anim. Prod. Afr. 1994. - v. 42. -№1. - P. 13 - 17.

130. Ballagi-Pordany, A. Direct detection of bovine leukemia virus infection: Practical applicability of a double polymerase chain reaction / A. Ballagi-Pordany, K. Klintevall, M. Merza, B. Klingeborn, S. Belak // J. Vet. Med. 1992. - 39 B. - P. 69 - 77.

131. Behrens, F. Tier-arztl / F. Behrens, R. Ziegelmaier, Т. Toth, M. Keyserlingk, E. Forschner // Wschr. 1979. - 429 p.

132. Beier, D. Establishment of a new bovine leucosis virus producing cell line / D. Beier, R. Riebe, P. Blankenstein, E. Starick, A. Bondzio. // J. of Virological Metods V.121 Issue 2. 2004. - P. 239 - 246.

133. Beier, D., Siakkou H. A Comparison of Serological Tests for the Diagnosis of Enzootic Bovine Leukosis and Eradication of Infection from a Large Herd / D. Beier, H. A. Siakkou // Tierarztliche umschau.- 1994.- Vol.49, N.6. P. 356 - 360.

134. Beier, D. Identification of different BLV proviruses isolates by PCR, RFLP, and DNA sequencing / D. Beier, P. Blankestein, O. Marquardt, J. Kuzmak // Berl Munch Tieraztl Wschr. 2001. - P. 252. - 256.

135. Belak, S. Application of tlie polymerase chain reaction (PCK) in veterinary diagnostic virology / S. Belak, A. Ballaagi Porrdany // Vet. Res. Commun. - 1993. -V. 17.-P. 55-72.

136. Blankenstein, P. Polymerase chain reaction (PCR) for detection of BLV provirus — a practical complement for BLV diagnosis / P. Blankenstein, D. Beier, O. Marquardt, D. Ebner//Berl. Munch.- 1998. 111. -P.180 - 186.

137. Burridge, M. Fall in antibody titer to bovine leukemia virus in the periparyturient period / Can. J. Comp. Med. 1982. - V. 46. - P. 270-271.

138. Burridge, M. Prevalence of leukomia Virus Infection in Florida / M. Burridge, M. Puhr, B. Hennemann // Javma, 1981. V. 179. - № 7. - P. 704 - 707.

139. Buzala, E. Comparison of PLA with AGID and ELISA results in serology diagnosis of bovine leucosis / E. Buzala, W. Deren // Pol J Vet Sei. 6. 2003. - P. 9 -11.

140. Camargos, M. F. Partial sequencing of env gene of bovine leukaemia virus from Brazilian samples and phylogenetic analysis / M. F. Camargos, D. Stancek, M. A. Rocha, L.M. Lessa // J Vet Med В Infect Dis Vet Public Health. -2002. P. 325 -331.

141. Carli, K.T. Comparison of Serum, Milk and Urine as Samples in an Enzyme-Immunoassay for Bovine Leukemia Virus Infection / K.T. Carli, H. Batmaz, A. Sen, A. Minbay //Res.Vet.Sci .-1993.-Vol.55.-N.3.-P. 394-395.

142. Carli, K.T. Detection of IgG antibody to bovine leukaemia virus in urine and serum by two enzyme immunoassays / K.T. Carli, A. Sen, H. Batmaz, E. Kennerman // Lett. Appl. Micro biol. 1999. - 28. - P. 416 - 418.

143. Coulson, J. Molecular cloning and sequencing of an Australian isolate of proviral bovine leukaemia virus DNA: comparison with other isolates / J. Coulson, H. Naif, R. Brandon, S. Kumar, S. Khan, R. Daniel // J Gen Virol. 1990. - P. 1737 - 1746.

144. Devare, S. Gold spring harbor couf / S. Devare // Cell Prolif. 1988. - V.7. - P. 943 - 952.

145. Devare, S. Bovine lymphosarkoma Development of aettiologic agent. Sciens. -1978.-V.194.-P. 1428- 1430.

146. Dolz, G. Comparison of agar gel immunodiffusion test, enzyme-linked immunosorbent assay and western blotting for the detection of BLV antibodies / G. Dolz, E. Moreno // Zentralbl. Veterinär med. 1999. - 46 В. - P. 551 - 558.

147. Domenech, A. Comparison of four tests to evaluate the reactivity of rabbit sera against envelope or Gag related proteins of bovine leukemia virus (BLV) / A.

148. Domenech, L. Llames, J. Goyache, G. Suarez, E. Gomez — Lucia // Vet. Microbiol. — 1998.-60.-P. 13-25.

149. Eaves F.W., Molloy B., Dimmock C.K., Eaves L.E. Afield evaluation of the polymerase chain reaction procedure for the detection of bovine leukemia virus proviral DNA in cattle//Vet. Microbiol. — 1994. — 39. — P. 313—321.

150. Everman, J. Prevalence of bovine leukemia virus antibody in seven herds of Holstein-Friesian cattle / J. Everman, R. DiGiacomo, N. Huber // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1980. -V. 177,- P. 549-550.

151. Fechner, H. Direct use of cell lysates in PCR-based diagnosis of bovine leukemia virus infection / H. Fechner, A. Kurg, P. Blankenstein, G. Mewes, L. Geue // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 1996. - 109. - P. 446 - 450.

152. Gielkens, A.L.J. Quak / A.L.J. Gielkens, A.A. Ressang, J. Ijzerviann Quak //Vet. Quart. 1981. - 34 p.

153. Gillet, N. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human / N. Gillet // Retrovirology. -2007.-V16.-P.4-18.

154. Grundboeck, J J. Comparison of different ELISA kits for the diagnosis of bovine leukosis / J.J. Grundboeck, J. Stec, B. Kozaczynska // Bull. vet. Inst. Pulawy, vol. 30 -31, no. 1 4, 1987 - 1988. - P.26 - 30.

155. Grundboeck," M. Rozpoznawanie i zwalczanie enzootycznej bialaczki bydla / M. Grundboeck // PWRiL. Warszawa, 1980. - 12 p.

156. Gruniboerk, M. Med. Wet / M. Gruniboerk. 1977. - 527 p.

157. Gutierrez, S.E. Development and evaluation of a highly sensitive and specific blocking enzyme linked immunosorbent assay and polymerase chain reaction assay for diagnosis of bovine leukemia virus infection in cattle / S.E. Gutierrez, G.L. Dolcini,

158. G.H. Arroyo, C. Rodriguez Dubra, J.F. Ferrer, E.N. Esteban // Amer. J. Vet. Res. -2001.-62.-P. 1571-1577.

159. Hoff-Jorgensen, R. An international comparison of different laboratory tests for the diagnosis of bovine leukosis: suggestion for international standardization / R. HoffJorgensen // Vet. Immunol, and Immunopathol. 1989. - 22. - P. 293 - 297.

160. Jacobs, R.M. Production and Related Variables in Bovine Leukemia Virus-Infected Cows / R.M. Jacobs, J.L. Heeney, M.A. Godkin, K.E. Leslie, J.A. Taylor // Vet.Res.Com. 1991.- Vol. 15. -N.6. - P.463 - 474.

161. Jacobs, R.M. Proviral detection and serology in bovine leukemia virus exposed normal cattle and cattle with lymphoma / R.M. Jacobs, Z. Song, H. Poon, J.L. Heeney, J.A. Taylor, B. Jefferson, W. Vernau // Can. J. Vet. Res. - 1992. - 56. - P. 339 - 348.

162. Kelly, E. J. Early detection of bovine leukaemia virus in cattle by use of the polymerase chane reaction./ E. J. Kelly, M. K. Jackson, G. Marsolais, J.D. Morrey, R. J. Callan.// Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1998.V.105(11). - P. 408.

163. Kintevall, KA. Bovine leukemia virus: rapid detection of proviral DNA by nested PCR in blood and organs of experimentally infected calves / K.A. Kintevall, A. Ballagi Pordany, K. Naslund // Vet. Microbiol. - 1994. - 42. - P. 191 - 201.

164. Klintevall, K. Evaluation of an Indirect ELISA for the Detection of Antibodies to Bovine Leukemia-Virus in Milk and Serum / K. Klintevall, K. Naslund, G. Svedlund, L. Hajdu, N. Linde, B. Klingeborn // J. Vir.Meth. 1991.- Vol.33, N.3.-P. 319-333.

165. Klintevall, K. Bovine Leukemia Virus: rapid detection of proviral DNA by nested PCR in blood and organs of experimentally infected calves / K. Klintevall, A. Ballagy-Pordany, K. Naslund, S. Belac // Vet Microbiol., 1994,42. P. 191 -204.

166. Kurdi, A. Serologic and virologic investigations on the presence of BLV infections in a dairy herd in Syria// A. Kurdi, P. Blankenstein //Berl Munch. Tierarztl Wochenschr.-1999. Jan;l 12(1). P. 18-23.

167. Kurdi, A. Scrologische und virologischc Untersuchungen Obcr das Vorkommcn dcr BLV-Infektion in eincr Milchvichherde in Syricn / A. Kurdi, P. Blankenstein,

168. О. Marquardt, D. Ebner // Berl. Milnch. Tierarzll. Wochcnschr. 2000. - 112. - P. 20 -23.

169. Kuzmak, J. Characteristic of the genetic mutants of bovine leukaemia virus and their role in serodiagnosing BLV infections / J. Kuzmak, L. Bicka, M. Rola, B. Kozaczynska, J Stec // Medycyna Weterynaryjna 2005. - 61(6). - P. 699-702.

170. Kuzmak, J. Reactivity of serum from cattle suspected of bovine leukaemia virus infection to peptides representing mutated epitopes on envelope glycoprotein gp51 / J. Kuzmak, M. Rola, M. Materniak // Bull. Vet. Inst. Pul. 2008. - 52. - P. 325 - 329.

171. Lewin, H.A. Comparative organization and function of the major histocompatibility complex of domesticated cattle / H.A. Lewin, G.C. Rüssel, E.J. Glass //Immunol.- 1999.-Rev. 167.-P. 145-58.

172. Licursi, M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, T. Yokoyama, E.T. Gonzalez, H. Sentsui // Virus Res. 2002. - P. 101 - 110.

173. Lorenz, R.J. Das Problem des Wiedcrauflictcns der Rinderleukose in zuvor sanierten BestSnden / R.J. Lorenz, O.C. Straub // Dtsch. Ticrarztl. Wschr. 1994. -101.-P. 158-162.

174. Mammerickx, М. Rapid Detection of Bovine Leukemia Virus Infection in large Cattle Population with an ELISA performed on Pooled Sera Grouped by Herd / M. Mammerickx, D. Porteteile, I. Nys, A. Burni // J. Vet. Med. 1987. B. 32. - P 601 -608.

175. Mamoun, R.Z. Sequence variability of bovine leukemia virus env gene and its relevance to the structure and antigenicity of glycoproteins / R.Z. Mamoun // J Virol. -1990. V.64. - №9. - P: 4180 - 4188.

176. Marsolais, G. Importance of primer selection in the application of PCR technology to the diagnosis of bovine leukemia virus / G. Marsolais, R. Dubuc // J. Vet. Diagn. Invest. 1994. - №6: - P. 297 - 301.

177. Martin, D. Comparative study of PCR as a direct assay and ELISA and AGID as indirect assays for the detection of bovine leukaemia virus III. / D. Martin, A. Arjona,

178. N. Barquero, M. Viana, E. Gomez Lucia // Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Publ Health. -2001.-48.-P. 97-106.

179. Meas, S. Evidens for BLV unfection in cattle in Zambia// S. Meas, M. Nakayama, Usui T., Nakazato Y., Yasuda J., Ohashi K.,Onuma M.//Jpn J Vet Res. -2004.-№52(1).-P. 3-8.

180. Miller J. M. Comparison of four serological tests for the detection of antibodies to bovine leukemia virus / J. M. Miller, M. J. F. Schmerr, M. J. Van Der Maaten // Amer. J. Vet. Res. 1981. - 42. - P. 5 - 8.

181. Miller, J.M. Precipitating anntibodddi to an internal antigen of the C-type virus associated with bovine lymphosarcoma / J.M. Miller, C. Olson // J. Nat. Cancel Jnst. -1972. V. 49. - P. 1459 - 1462.

182. Molteni, E. Molecular characterization of a variant of proviral bovine leukaemia virus (BLV) / E. Molteni, A. Agresti, R. Meneveri, A. Marozzi, M. Malcovati, L. Bonizzi, G. Poli, E. Ginelli //Zentralbl Veterinarmed. 1996. - P. 201 - 211.

183. Monke, D.R. Estimation of the sensitivity and specificity of the agar-gel immunodiffusion test for bovine leukemia-virus 1,296 cases (1982-1989) / D.R. Monke, R.F. Rohde // J. Amer. Vet. Med: Ass. - 1992. - Vol.200, N.12.- P. 2001 -2004.

184. Monti, G. Genetic diversity and spread of Bovine leukaemia virus isolates in Argentine dairy cattle / G. Monti, R. Schrijver, D. Beier // Arch Virol. 2005-. - P. 443 -458.

185. Motton, D.D. and G.C. Buehring 2003 Bovine leukemia virus alters growth properties and casein syntesis in mammary epithelial cells // J. Dairy Sci 2003 86:2826-2838.

186. Muller, M. Cost benefit analysis of the control and cure of enzootic bovine leukosis, described in the example of a selected territory / M. Muller, W. Wittmann // Arch. Exp. Veterinarmed. - 1989. - 43. - P. 933 - 942.

187. Nagy, D.W. Use of a polymerase chain reaction assay to detect bovine leucosis virus in dairy cattle // D.W. Nagy, J.W. Tyler / J.Am Vet Med Assoc. 2003 Apr 1; 222(7). - 983 p.

188. Naif, H. Bovine leukemia proviral DNA detection in cattle using the polymerase chane reaction / H. Naif, R. Brandon, R. Daniel // Vet. Microbiol. 1990. - №25. - P. 117-129.

189. Nguyen, V. K. Evaluation of an enzyme linked immunosorbent assay for detection of antibodies to bovine leukemia virus in serum and milk / V. K. Nguyen, R. F. Maes//Clin. Microbiol. - 1993. -31. -P. 979-981.

190. Nuotio, L. Eradication of enzootic bovine leucosis from Finland / L. Nuotio, H. Rusanen // Prev.Vet. Med. 2003. -№30;59(l-2). - 43 p.

191. Porteteile, E. Use of two monoclonal antibodies in an ELISA test for the detection of antibodies to bovine leukaemia virus envelope protein / E. Porteteile, M. Mammerickx, A. Burny // J Virol Meth. 1989. - P. 211 - 222.

192. Rice, N.R. The nucleotide sequence of the env gene and the post-em> region of bovine leukemia virus / N.R Rice, R.M. Stephens, D. Couez, J. Deschamps, R. Keitmann, A. Burny, R.V. Gilden // Virology. 1984. - 138. - P. 82-93.

193. Rodriguez, S.M. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two new clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba, R.H. Campos, K. Trono, L.R. Jones // J Gen Virol. 2009. - P. 791 - 793.

194. Rovnak, J. Assessment of bovine leukemia virus Franscrippts" in vivo / J. Rovnak, J.W. Caseeey // J.of Virol. 1999. - V. 73. - №. 10. - P. 8890 - 8897.

195. Rulka, J. Evaluation of the nested-PCR method for the diagnosis of bovine leukaemia virus infection //Bull.Vet.Inst.Pulawy 45. 2001. - P. 11-19.

196. Sagata, N.T. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: It's evolutionary relationship to other retro-viruses / N.T. Sagata, K. Ohishi. Y. Ogawa, Y. Ikawa // Proc. Natl. Acnd. Sei. USA. 1985. - 82. - P. 677 - 681.

197. Sargeant, J.M. Evaluation of a bulk-milk ELISA test for the classification of herd-level bovine leukemia virus status / J.M. Sargeant, D.F. Kelton, S.W. Martin, E.D. Mann // Prev. Vet. Med. 1997. - 31. - P. 223 - 230.

198. Sommerfeit, M.A. Retrovirus receptors. I M.A. Sommerfelt. // J. Gen. Virol. -1999. -V. 80. P. 3049 - 3064.

199. Tajima, S. The region between amino acids 245 and 265 of the bovine leukemia virus (BLV) Tax proteinrestricts transctivation not only via the BLV enhancer but also via other retrovirus enhancers / S. Tajima // J. Virol. №74(23). - 10939 - 10949.

200. Thurmond, M. Economics of enzootic bovine Leukosis / Enzootic bovine leukosis and Bovine Leukemia virus. 1987.- V. 4. - P. 192.

201. Todd, D. Vet. Ree / D. Todd, B.M. Adair. 1980. - P. 107 - 124.

202. Trono, К. G. Seroprevalens of BLV in dairy cattle in Argentina comparison of sensitivity and specificity of different detection methods // K. G. Trono, D.M. Perez-Filgueira // Vet.Microbiol. 2001. - №26. - 235 p.

203. Vidziunaite, R. Chemiluminescence ELISA for the detection of antibodies to bovine leukaemia virus antigens / R. Vidziunaite, N. Dikiniene, V. Miliukiene, P. Mikulskis, J. Kulys // J. Biolumin and Chemilumin. 1995. - 10. - P. 193 - 181.

204. Willems, L. Phosphorylation of bovine leukemia virus Tax protein is required for in vitrj transformation but not for transactivation Oncogene / L. Willems, C. Grimonpont, P. Kerkhofs. 1995 Apr 30;16(17):2165 - 2176.

205. Willems, L|. Bovine leukaemia virus, an animal model for the study of intrastrain variability / L. Willems, E. Thienpont, P. Kerkhofs, A. Burny, M. Mamerickx, R. Kettmann // J Virol. 1993. - P. 1086 - 1089.

206. Xie, B. Detection a proviral DNA of bovine leukemia virus in cattle by a combination of in situ hybridization and the polymerase chane reaction / B-. Xie, T. Oyamada // J.comp Path., 1997. №116. - P. 87 - 96.

207. Yang, D.1993 Milk and Fat Yields decline in bovine leukemia virus-infected Holsten cattle with persistant lymphocytosis .PNAS / D. Yang, R. Snanks. 1993. -№90.-P. 6538-6541.

208. Zabeau, M. Selective restriction fragment amplificanion: a general method for DNA fingerprinting // European Patent Application 924026297( Publication number:053458 At).

209. Zaghawa, A. An outbreak of bovine leucosis in upper Egypt: clinical, laboratory and molecular-epidemiological studies / A. Zaghawa, D. Beier // J. Vet. Med. B. Infected Dis. Vet. Public Healf. 2002 Apr, 49(3) . - P. 123.

210. Zhao, X. Natural genetic variations in bovine leukemia virus envelope genes: possible effects of selection and escape / X. Zhao, G.C. Buehring // Virology. 2007. -P. 150-165.

211. Бусол В. О. Ветеринарно-саштарш проблемы молока i м'яса лейкозних KOpiB / В. О. Бусол // Вет. мед. Украши, 2002. С. 4 -5.

212. Шульга, П.Г. Роль абютичных i бютичных фактор}в у виникненш i ноширенш лейкозу велико! poraToi худоби / П.Г. Шульга // Автореф. дис. кандидата вет. наук. Харыав , 1996. - 15 с.

Информация о работе

Петропавловский, Максим Валерьевич
кандидата ветеринарных наук
Екатеринбург, 2010
ВАК 06.02.02

Диссертация

Эффективность диагностических тестов в выявлении вируса лейкоза крупного рогатого скота в оздоравливаемых от лейкоза стадах - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Эффективность диагностических тестов в выявлении вируса лейкоза крупного рогатого скота в оздоравливаемых от лейкоза стадах - тема автореферата по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы