Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭКОЛОГИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ ПЕРМСКОГО ПРИКАМЬЯ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ЭКОЛОГИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ ПЕРМСКОГО ПРИКАМЬЯ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ^^ ^/^-^О^/ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

БЕРДИЧЕВСКАЯ Марина Васильевна

УДК 579.26—87:550.72(470.53)

Экология углеводородокисляющих бактерий нефтяных пластов Пермского Прикамья

Специальность 03.00.07— Микробиология

Л лтореферат доссертацаи на соискание ученой ст*п*на кандидата биологических наук

Москва —1983

Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР.

Научный руководитель: член-корреспондент АН СССР профессор С. И. КУЗНЕЦОВ.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л. Г. ЛОГИНОВА,

доктор биологических наук С. В. ЛЕТУНОВА.

Ведущая организация — Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, биологический факультет.

Защита состоится 1983 г

мин. на заседании специализированного совета Д002.64.01 при Институте микробиологии АН СССР по адресу: 111312. г. Москва, В-312, проспект 60-летия Октября, д, 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР. ,_ г^п

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь специализированного совета

Л. Н. Москаленко

ftpgjl^fpira

Акггадьносуь дгоолемы. Конечшвйи етапаюг геохимической деятельности бактерия в разрабатываема! месторождениях нефти являются развитие процессов сульфатредукшга к метанобра з ования (Еазина, Розанова, 1380). Субстратом до вторичных анаэробов служит окисленное органическое вещество , появление которого связано с развитием в нефтяной залежи бактерий, окисляющих нефть, Поетому для разработки конкретных мер борьбы с бактериальное сульфатредукци-ей, а также для выяснения возможности применения микробиологических методов увеличения нефтеотдачи требуется детальное изучение углеводородокнслявдей микрофлоры нефтяных пластов.

Ранее основное внимание исследователей удалялось вопросам экологии к геохимической деятельности в нефтяных пластах сульфатвоо-станавливашшс бактерий (Розанова, Кузнецов, 1974). Показан о, что заводнение залежи пресными водами активизирует процесс биогенной сульфетредукши {Кузнецова, Панщава, 1962). Распространение ме-танобразуших бактерий также связано с заводнением (Вазина, Розанова, 1930). Литературные данные о распространении и видовом составе углеводородокисляших бактерий немногочисленны. Активность и физиолог »-биохимические особенности утдеводородокисаяншос бактерий в сопоставлении с вкодагическими условиями Пластовых вод нефтяных veсторквдений не исследованы. Все это указывает на актуальность изучения вопросов »кологни углеводородоклсляюще й микрофлоры нефтяных пластов.

Цель и вадечи исследования. Основная цель настоящего исследования состояла в том, чтобы изучить влияние экологических условий эавошвяемьа нефтяных пластов на распространение, видовой состав • ■ активность угдеводородокислягаих бактерий для уточнения их Геохимической роли в процессах окисления нефти.

В соответствии с основными принципами изучения геологической

деятельности микроорганизмов, вкшмшутюш С. И. Кузнецовым (1961), били намечены следующие частные задачи нагазго исследования:

1. Проследить изменение экологических условий в залежи - общую соленость, концентрацию в^з, сульфатов, карбонатов, аммония, кальция, значений рН и Ей по мере проникновения в пласт пресных, закачиваемых с поверхности вод.

2. Установить общую численность бактерия, численность бактерий, растущих на МИД, углеводорадокисляшей. сулъфатвосстанавлввавлцеЯ

и «е танобразующей микрофлоры в карбонатных и терригенных нефтяных пластах длительно эксплуатирующейся залехи,

3. Определить активность микрофлоры в пробах пластовых вод, вычислить время генерации и продукции бактериальной биомассы.

4. Изучить видовой состав углеводородокислявшего сообщества

и сопоставить распространение отдельных видов углеводород окисляющих бактерий с изменениями экологических условий в залежи.

5. Определить метаболическую активность отдельных видов углеводород окисляющих бактерий в пластовых вещах разной солености.

в. Изучить влияние солености, рН, температуры и низкой концентрации кислорода на жизнедеятельность чистых культур углевод ор од окислявших бактерий.

Научная новизна работы. Впервые проведено изучение экологии и физиологии углеводородокисляющих бактерий рода КЬоаоеосаил, выделенных из пластовых вод, в частности, нефтяных месторождений Пермского Прикамья.

Впервые выяснено влияние длительного заводнения нефтяной залез: ч пресными водами на метаболическую активность пластовой микрофлоры. Показано,' что низкий окислительно-восстановительный потенциал пластовых вод и высокая соленость илаотовнх рассолов подавляют интенсивность потребления ^^С-ацетата и гетеротрофную

фиксацию1 ^С0-2 . Наибольшая активность потребления меченого сув-

2

страта и наименьшее время генерации бактерий установлены для микрофлора разбавленных терригенных пластовых вся я пластовых рассолов с положительными значениями ЁЬ.

Работа явилась первым специальным исследованием видового состава углеводород окисляющего сообщества заводняемых нефтяных пластов Пермского Прикамья. Установлено, что-распространение отдельных вадов углеводородокисдяюпда: бактерий в разных зонах пласта зависит от степени разбавления пластовых вод пресными. Впервые доказано широкое распространение в пластовых водах грам-иолохителъвых коринеподобных бактерий, отнесенных по новой классификации к роду ньоаососсиэ. Из силъноразбавлэншпс пластовых вод, наряду с родококками, выделена грамотрицателышя углевсдо-родоклслякщая микрофлора родов Рвеш1ошопав, АсЬгошаЬао и

Р1«тоЬас1 «г Установлено, что такое распределение перечис-

ленных бактерий по пласту обусловлено их различным отношением к высокой солености .средн. Верхним пределом развития отдельных представителей грамотрщдательной углеводород окисляющей микрофлоры является концентрация хлористого натрия л кальция в среде 30-100 г/л, при оптимальной концентрации - I г/л. В пластовых рассолах они не активны. Дан углеводородокислягаих родококков предельная концентрация »тих солей в среде - 100-150 г/л, оптимальная - 10-20 г/л. В Пластовых рассолах их метаболическая активность составляет 10-20£ от максимальной. Впервые установлена критическая концентрация ионов кальция,'при которой прекращается гетеротрофная фиксация ^^СО^ при развитии родококков на растворенном в пластовых водах органическом веществе. Она составляет 0,45-0,46 г/ион/л и имеет место в высокоиинералиэованных пластовых рассолах. Высокая галотолерантность родококков имеет адаптационную природу. Показано, что помимо галотолерантности рас-

пространение родококков в вефтяннх пластах объясняется хх способностью к развитии в мшсроаэрофилъных условиях в углеводородной слое.

Впертые выявлены оптимальные значения рН, температуры в низких концентраций кислорода для штаммов рода нЬоаососсив, а также родов ДсЬготоЪа^ег, Ра ейЙотопив И Р1 стоЪас1ег1ит в краткосрочных «пятах с меткой. Иетодиха хх выполнения существенно дополнена.

Практическая ценность работы. Полученные данные могут быть использованы при дальнейшей разработке микробиологических методов увеличения дойти нефти, которые,основаны ва деятельности угле-водородтасисляющих и метанобразующи бактерий, способствующих увеличение подвижности нефти и повышению давления в нефтяных пластах«

Создана коллекция культур углеводородпкисляющих бактерий рода &Ьо2авоови>. Углеводородакиодящяе га»отолерантные бактерия рода виоОососсия . могут найти широкое применение при очистке от нефтяных загрязнений морей и океанов, а также так называемых нефтяных амбарбв, которые образуются при авариях ва нефтепроыыо-лах и представляет собой резервуары пластовой воды с нефгьп.

Приведенное в работе описание морфологических и физиолого-биевзиичееккх признаков углеводородокиедягаих родококков поыо-хет исследователям при идентификации природных изолятов углеводород овяслялщвх корине- и нокавдисшсщобных бактерий. Выявленная способность родококков к автотрофному росту на водороде и активный рост ала бактерий ва метаноле позволит использовать их для нужд микробиологической провдиенностп.

Апробапня работы. Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых и специалистов "Эк Ьлогня, человек и проблемы охраны природы", г.Свермовск, 1963г. и на заседании

4

Пермской секшга Всесоюзного микробиологического общества, г.Перш. 1983г.

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 6 статьях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, основных выводов в списка литературы. Материалы излечены на 177 страницах машинописного текста, включая 12 таблиц в 28 рисунков. В списке литературы - 180 наименованна работ: 129 ва русском и 51 на иностранных языках.

Маето проведения работы. Работа проводилась в Отделе геохимической деятельности микро организмов Института микробиологии АЛ СССР {г.Москва),в Отделе экологии и генетики микроорганизмов Института экологии растений и животных УНЦ АН СССР (Пермь) и в лаборатории микробиологии Института биологии внутренних вод АН СССР (Борон). В ряде случаев полевые и лабораторные исследования проводились совместно сА.А.Оборнным.И.Б.Ившиной. В.Д. Шэховаовым

■ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ - ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования послужила Ярино-Каменодожская нефтеносная площадь, которая эксплуатируется с 1956 года. В 1954 году здесь было начато внутриконтурное заводнение гмлежей пресными водами. Обследован ряд эксплуатационных скважш в терриген-еой яснополянской и в карбонатной башкиро—на морской толщах* пластовые вода которых: характеризуются постененяны снижением " солености. Кроме того проанализированы пробы двух'нагнетательных скважин; пущенных на самоизлич, л закачиваемая в пласты пресная вода. Для-сравнения обследовано несколько сквахин Троельаанско-го и Швметинского.месторождений, эксплуатация которнх начата аначительно поэднее,. соответственно Л:1966 и 1974 годах.

Во время отбора проб-измеряли; рН и БЬ пластовых вед. Ссдер-

змние кислорода, растворенного в воде, измеряли методом Вкшиера; сумму сульфидов в сероводорода определяла иодометрическим титрованием; карбонат и бикарбонат - титрованием пробы о фенолфталеином я метил-оранжем 0,1 Н раствором HCl (Романенко, Кузнецов, 1974).

Общее количество бактерий подсчитывали на мембранных фильтрах, а численность углеводородокиолягашк и сульфатв останавливающих бактерий - методом предельных разведений, посевом в жидкур среду

I

Раймонда с 1% нефти ( Raymond, 1961) и в жидкую среду Постгейта "В" ( Postgate, 1966) соответственно. Метанобразуюте бактерии учитывали на среде ЗеАкуса ( z«imis, IS77) о формиа- ■ том я ацетатом (Беляев, >йшк ель штейн, 1973) в атмосфере Ц^ и COg. Наличие в пробе метанобразутаюх бактерий устанавливали по образованию метана в газовой фазе, который определяли хромат отрафике ски.

Выделение утлеводородокисляхшшх бактерий проведали из накопительных культур ва среде Раймонда с нефтью, на стерильном пластовом рассоле с нефтью и о добавлением источников азота и фосфора, а также на среде Item в атмосфере пентана. Фенотипические признаки выделенных культур изучали при помощи методик (Gordon, Smith, -1953; Hugh, Leifson, 1953; Skeraan» 1967, Практикум по микробиологии под ред. Н.С.Егорова, 1976), идентификацию осуществляли по Берги-7 ( Strgey'a, Малив!, 1957), определителю Н.А.Красиль-нкковэ (1949) к по специальным руководствам, посвященным таксономии Корине- л нокардиоподобных бактерий (Goodfellow, Aldereon, 1977; Вестеренко, 1980, 1982), Антигенный еналив граьшоложитель-кых воркнеподобных культур проводили при помощи реакции тмуно-двффузии в агаровом геле (Ившина есоавт., 1962) с использованием видоспецифических антисывороток, полученных к типовым я коллекционным штаммам бактерий рода Rbodococcue.

Способность культур использовать индивидуальные углеводороды,

6

а также алифатические спирты и жирные кислоты проверяли на жидкой среде Раймонда с витаминами и микроэлементами. При развитии на средах с углеводородами биомассу учитывали весовым методом (Никитина, Гречушкина, 1965). Способность к авготрсфнсму росту на водороде проверяли посевом культур во флаконы со средой Бовелла и Шатца (Романенко, Кузнецов, 1974), которые помещали в атмосферу Щ, СО2 и воздуха, в соотношении 6:1:3. Рост учитывали весовым методе«.

Активность пластовой микрофлоры, а также оптимальные условия развития отдельных штаммов углеводородокислявших бактерий устанавливали по потребление меченого по углероду субстрата (Горленко, Кикина, 1979),

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I. Полевые исследования Гидрохимическая и микробиологическая характеристика заводняемых паяс^ов и активность пластовой микрофлоры В нефтяных коллекторах закачиваемые пресные воды вытесняют пластовые, смешиваются с ними, в результате чего из эксплуатационных скважин, расположенных на разном удалении от зон нагнетения, извлекаются вместе с нефтью воды разной минерализации. Пластовые рассолы нижнекаменноугслъных отложений Пермского Прикамья относятся к хл оркальцжев ому типу и характеризуются высокой минерализацией 250-260 г/л. Вода обогащена иодом, бромом, бором, аммонийным азотом, сульфатами, бикарбонатами; содержит фосфаты; кислород отсутствует. Закачиваемые пресные речные воды относятся к сульфатно-натриевому типу, содержат незначительные количества сульфатов,бикарбонатов, аммонийного азота и нитратов (табл.1). Закачиваемая вода нагнетается в пласты иод давлением около 200 атм, чем объясняется ее высокая насыщенность кислородом (20-30 мг/л). В призабой-ной зоне нагнетательной скважины 230 содержание кислорода -

7

12,2 кг/л, а знача ниеЕЬ составляет -«430 кв. В разбавленных пластовых волах эксплуатационных скважин кислород не ой наружен.

Длительное заводнение пресными водами терригеиного и карбонатного пластов -Ярино-Каыеноложскаго месторождения снижает общую со- . леность вод до 16-22 г/л (табл.I). При этом падает содержание аммония, кальция, натрия, хлора, ацетата, а также микроэлементов -иода, брома и бора. Концентрация' сульфатов и бикарбонатов увеличивается, что согласуется с данными других авторов (Розанова с соавт., 1976; Иванов с соавт., 1982). Слабокислая реакция среды пластовах рассолов в разбавленных заводнением пластовых водах становится нейтральной. 2 терригенном бессероводородном коллекторе заводнение сопровождается появлением сероводорода и снижением окналительно-восстаяовжтельного потенциала среды. В карбонатном коллекторе с высшим содержанием сероводорода в пластовом рассоле бь среда почти не изменяется. В то же время, отмечается прирост сероводорода в наиболее разбавленной воде скважины 753, что указывает на развитие здесь процесса бактериальной сульфатредукции.

Действительно, в разбавленных пластовых водах численность суль-фатвосстававли ваших бактерий растет: в карбонатном коллекторе незначительно, в терригенном - до сотен кд/мл (рис.1). Наблюдается также увеличение числа бактерий, растущих на ША, и углевод о-родокисляхщих бактерий до сотен.я тысяч кд/мл. В Пластове« рассоле та количество составляет единицы и десятки кл/мл. Ыетавобразую-щая микрофлора присутствует только в пластовой воде скважины 785, соленость которой - 16,3 г/л* а низкий окислительн о-в ос станови-тельный потенциал {-300 мв) обусловлен, вероятно, активным развитием процесса сульфатредукции. Общая численность бактерий в Пластовых вццах и рассолах исследуемых месторождений составляет Ю6-107 кл/мл. " '

Для того, чтобы определить, насколько условия в нефтяной эале-8

Таблица I, Изменение экологических условна и активности пластовой микрофлоры при заводнении нефтяных пластов'

Тип коллектора

о,

а) н

1

н я

8|

$

8

&

а>5 ««

А сква-ппш - Общая соленость, г/л НЙ! мг/л 1 го^2 мг/л НСО" Я^ мг/л мг/л Ацетат рН натрия, мг/л ЕЬ, ыа Ассгош мкг С/1 СО, яция, [/сут, ацетата натшя Бремя генерации, час

Яриво-Каменоложское нестор сядение

19 256,0 158,4 595,8 292,8 0 - 6,0 +65 0,013 0,170 70,7

134- 267,4 186,0 634,4 268,4 3,5 21,0 5,6 0 - - -

455 123,0 83,0 1940,9 378,2 9,8 12,0 6,6 -50 0,030 1,440 57,1

788 72,4 63,0 1844,7 390,4 8,7 9,5 6,7 -64 0,024 1,060 57,1

304 34,0 60,2 1866,0 560.0 9,8 8,8 7,0 -75 0,019 0,070 66,6

785 16,3 26,0 2146,6 323,3 55,0 0,7 7,0 -300 0,013 1 0,000 109,0

2301 0,9 1,4 62,5 122,0 0 7,4 7,4 +430 - - -

370 257,4 148,0 673,0 195,2 278,6 7,1 6,2 -340 _ — -

453 60,0 48,0 2185,0 280,2 55,3 7,8 6,6 -300 0,010 0,140 109,0

821 55,3 30,0 2127,7 372,1 66,7 6,0 6,8 -280 0,011 0,090 120,0

753 22,8 14,0 2098,5 305,0 79,2 0,9 '7,0 -290 0,013 0,000 109,0

23х 96)6 48,8 13587,1 195,2 20,8 16,0 6,9 -100 - -

Шеиетинское несторохденве

124 239,2 42,0 542,2 207,4 0 5,9 +175 0,080 - 18,4

224 249,9 42,0 418,8 305,0 0 - .6,0 +115 0,071 - 26,6

1 нагнетательные скважтш

! 1

к

3

3 9

I 1

8

о

в

§

9

-I

230,785,304 , 788,

455,

19 скважина

.0 20 40 60 80 100 150 200 250

Соленость, г/л

4

3

2

I О -I

I 753, 821,453,

370 скважина

О 20 40 €0 80 100 150 200 250

Соленость, г/л

Рис.1. Влияние заводнения на численность бактерий в пластовых

водах яснополянской терригенной толщн (А) в бапкиро-намюрской

(Б) карбонатной толща: I - гетерогро^яне, 2 - углеводородокис-

лягаще, 3 - сульфатвосстанавдгеавщие. 4-мвтанобразуюиие бактерии.

10

xz благоприятны для жизнедеятельности пластовой мжкрофдсры, не обходимо оценить ее рост, например, с точки зрения потребления углерода .в процессе гетеротрофной фиксации ^Qüj или ассимиляции' *^С-ацетата в условиях, приближенных к пластовым.

На примере пластовых вод Ярино-Каыенолохсксго и Шекетинского месторождений установлено (Бердичевская, 1932), что, наряду с высотой общей соленостью пластовых рассолов, развитие пластовой мих-рофлоры подавляет низкий окислительно-восстановительный потенциал среды (таб.1). Наибольшая интенсивность включения в бактериальную биомассу меченого углерода углекислоты, ацетата, а также наименьшее время генерации бактерий выявлены для микрофлоры разбавленных терригенных пластовых вод и пластовых рассолов с положительными значениями Eh.

Видовой состав углеводородокиодяющвго сообщества Изучение видового состава (табл.2) углеводородокисоящего со-

Таблида 2

Распространение углеводородокисляотих бактерий в терригенных пластах Яриво-Каменолокского месторождения

№ сква- Общая соде- Содержаниелрес- Видовой состав

жины ность. г/л ной води. %

19 256,D О E.marie

134 267,4 О R.luteua, R.rhodochroa»

455 123,0 54 R.luteua

788 72,4 73 H.narlB, H.luttne,

R.erythropolie, H.ochra-ceus, Fe.radlobacter

304 34,0 88 B.maria, E.luteua, R.rhodo-

c broue, Pa .mtra, F .pcrlerlmia

785 16,3 91 R.mtirle, B.lut*ua,

X.delnarrae

230 0,9 100 H.erytbropoll*

P».Xluorescene

общества пластовых вод разной солености позволило установить,что основным фактором, определяющим распространение тех или иных видов

II

по плесту, является степень разбавления пластовых вод пресными. Наибольшее распространение-в пластах получали углевод ор од окисляющие бактерии рода Ehodococcus: E.luteus, К.marie, В.rboiocbrона, в. erythropolls • От встречаются в пластовых рассолах и разбавленных пластовых водах. Граыотрицательная углеводородокисляпцая микрофлора родов Paeudomozi&s , Achromobaftter И Pla.vobacteriu3i выявлена лишь в сильноразбавленных пластовых водах и в пресной закачиваемой воде.

2. ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Идентификация и свойства бак^ери^iрода Ehodqnopciia Первоначально коринеподобные углеводородокислявдие бактерии были идентифицированы нами по Берги-7 как представители родов Mycobacterium, Coryii« bacterium И Btfevibacterium (Бердичев-ская, 1982). Сравнительный анализ фекотишпеских признаков (морфология и цикл развития клеток, культуральные и физиолого-биохи-мические свойства) показал, .что коринеподобные бактерии, выделенные нами из пластовых вод нефтяных месторождений, относятся к роду Rhodococcue. Бактерии этого ради различаются морфологически. У них в разной степени выражен цикл развития кокки - палочковидные или ветвящиеся клетки - кокки. Так, R.rbodcehroue на ранних стадиях образует примитивно ветвящийся мицелий, а в старых культурах - типичные кокки. У H.luteus в 6-часовой культуре клетки длинные, слабо ветвящиеся. В 12-24-часовых культурах они фрагмен-тируются. Разъединение клеток, в основном, происходит по типу раскалывания. В результате ряда последовательных делений клетки приобретают вид относительно коротких палочек, длиной 2-6 мкм, расположенных под углом. В новом цикле развития прорастание коротких к »< (овидных палочек в длинные чаще всего происходит путем образования ростовой трубки. 7 к.шагis цикл развития слабо выражен, палочковидная стадия достигает длины всего 2-3 мкм, ветвящи-

12

"Ч

воя форма не образуются.

Вместе с тем, углеводородокисляпцие родококки обладают рядом обошх физиолого-биохиыических признаков. Они имеют 1У тип клеточной стенки, липид ми-а, они каталазоположптельны, галотолерант-ш, не разжижают желатин, не разлагают казеин, не гидролиэугт крахмал, восстанавливают нитраты в нитриты, растут на безазотистой среде Эшби, на иизкомолекулярных спиртах и жирных кислотах. В отличие от описанных ранее (Нестеренко, 1932), родококки, выделенные из пластовых вод, подкисляют среду с инозитом. Родококки пластовых вод растут в автотрофвых условиях за счет окисления водорода, используют в качестве единственного источника углерода ж анергии н-алканы с длиной цепи Cç-Cjg, но не Сд-Сд, накапливая максимальную биомассу 2,0 г/л на Cj5 и Cj6 (табл.3).

Таблица 3. Рост родококков на углеводородах и в авто-трофных условиях на водороде

Источник углерода и анергии

Вес сухой биомассы на 4-е сутки роста, г/л

R.rtodiq

ШТ.304-66

R.luteus E.ervthropolia шт.134-4 шт .2300-2

н—Алканы

Сд с10 сл С12-С13 С14 C£S с16 Вг *-<х>г

0,23 0,00 0,55 0,63

0,55 0,10 0,56 0,90

0,50 0,20 0,46 1,30

0,56 0,50 0,66 I.XO

0,76 0,46 0,96 1,30

1,10 1,25 0,96 0,80

2,00 1,35 1,76 1,53

2,00 1,80 1,95 2,10

0,80 0,70 0,85 0,85

По ряду физиолот о-бн©химических признаков, изученные углеводо-рсшокисляхщие бактерии рода ithodocoocua различаются, что дозволяет дифференцировать их до вида (табл.4). Антигенный анализ,проведенный методом двойной иымунодиффузии s агаровом геле с анти-

13

сыворотками, полученными к типовым и коллекционным штаммам рока KiodgcooouB , подтвердил принадлежность исследуемых иэолятов к висам k.rhodocbrous, K.lut»ua, R.erythropolis л R.maria. Таблица 4. Некоторые физиолсго-биохиыические признаки угле водородоквсляших бактерий рода Rbodococcua

Признаки Число ттаммлв, положительных по данному

H.rhodcch- й.luteue H.er/thro- R. marie roue 2шт. ICtar. polie 5шт. 13шт.

Образование кислоты из:

галактозы 0 10 5 II

КСИЛОЗЫ I 9 5 5

арабиноза 0 10 0 3

рамнозы 2 0 0 0

манаоэы 0 10 5 6

сахарозы 0 10 5 3

глюкозы анаэробно 2 3 2 5

Рост на:

бутаноле 2 0 5 8

изо-бутаноле 2 0 5 9

Разложение тирозина 2 0 5 0

Образование аммиака 2 5 0 2

Наличие уреазн 0 10 5 Ô

Влияние основных экологических Факторов нефтяного пласта

на метаболическую активность углеводоводокислявших бактерий Дня выяснения причины широкого распространении родококков в нефтяной залежи и ограниченного расселения грамотридательной углеводородом! оляицей микрофлоры по пласту были изучены оптимальные условия развитая отдельных штадоов в лабораторных опытах с мечеными по углероду субстратам. Ранее предложенный метод (Горленко, Кикина, 1979), который дает возможность сравнивать потребление субстрата культурой в разных условиях, в период ее наиболее интен-

14

сивного роста, бил доработан и использован при определении оптимальных температур, рН, солености и низких концентраций кислорода в среде.

1) Температурный оптимум культур

Влияние диапазона температур I2-50°Ç изучали по интенсивности гетеротрофной фиксации ^CQg при развитии культур на глюкозе, используя раствор HI4CCg активностью 0,5 мкК. Установлено,* что температурные условия 20-24°С исследуемых нефтяных пластов не ограничивают распространения и развития -выделенных углеводород-окисляидих бактерий. В этом диапазоне температур метаболическая активность у Ehodoooccus rbodocbrous KAchromobeeter delmarrae составляет SO-IOOiî, a y В.lut«us и R.marie 60-7CKE (рис.2).

2) Оптимальные значения рН

Для определения оптимальных- значений рН использовали меченую глюкозу активностью 0,06 мкК. Оптимальные значения рН как для родококков, так и для гремотрицательных углеводородшислнющих культур леаат в пределах 6,0-7,0 и соответствуют активности водородных ионов среды обитания. Кроме того, ряд культур имеет высокий уровень метаболической активнооти в широких границах рН от 4,0 до в,О (рис.3).

3) Оптимальная соленость

Нефтяные воды Пермского Прикамья относятся к хлоркальциевоцу типу и их' соленость обусловлена в большей мере ионами кальция и хлора. Поэтому в опыт вносили растворы солей хлористого кальция и натрия в соотношении 1:1, в диапазоне-концентраций'от I г/л до 300 г/л. Об интенсивности развития культур при заданных значениях солености судили по величине гетеротрофной фиксации ^^СО, при их развитии на глюкозе.

Определение оптимальной концентрации солей в среде позволило

отнести группу грамотрицательных углеводородокисляюших бактерий

15

Интенсивность включения меченого углерода в биомассу, проценты

№ о

en

(Л

о ч

а

В

►з

Í -

S

о

Интенсивность включения меченого углерода в

10-20 г/л, а верхний предел их развития - при 100-150 г/л. Причем 7 штаммов, выделенных из разбавленной пластовой воды, оптимальная концентрация солей составляет 5-10 г/л, а у штаммов из пластовых рассолов - 20 г/л (рис.5). Об адаптация родококков к условиям солености свидетельствуют также данные, полученные при изучении активности развития культур на естественной пластовой воде. На ряс.6.видно, что интенсивность включения меченого ацетата в биомассу пггамма Е.1л^еив 134-4, выделенного цз пластового рассола, значительно выше, чем у штамма К.1игеив Н7В8-3, выделенного из разбавленной пластовой води оквакщш 788, и составляет в пластовом рассоле 20? от максимальной.

При сопоставлении ионного состава естественной шгастовой воды и искусственного солевого раствора хлористого кальция и натрия с интенсивностью потребления меченого субстрата культурами родококков было установлено, что развитие бактерий полностью прекращается при концентрации ионов кальция в среде 0,45-0,46 г/ион/л, что соответствует пластовому рассолу соленостью 256 г/л и 1С$ селевому раствору. ■

Таким образом, бактерии рода аЬоаососсив можно отнести к группе умеренных галофилов, которые способны к росту в интервале солености 0-20Ц (Стейниер, Здельбурт, Ингрэм, 1979).

4) Влияние низких концентраций кислорода на развитие углеводородокисляющих родококков Анаэробные условия в нефтеносных пластах препятствуют активному окислению углеводородов нефти. Однако при заводнении кислород поступает в залежь в.значительных количествах. Содержание кислорода в закачиваемое воде составляет 20-30 мг/л. Через нагнетательную скважину 230, приемистость которой 700 ы3 в сутки, кислорода поступает 14-21 кг ежесуточно. Основная его часть используется углеводородокясляющей микрофлорой в призабойной зоне нагнетатель-

17

ной скважин». Концентра идя кислорода здесь составляет 12 мг/л. Проникая дальше по пласту, этот кислород создает в залежи мик-аэрофилънве зоны.

¡1

»о

ч о оьй

ее^

и а и

ВНЕ о о> а; «

Л я?

К Е

,300 150 * 200 Соленость, г/л

Рис,4. Зависимость гетеротрофной фиксации С0£ А.ае1таг»в® 785-2 (I), у.реПегШит (3) от солености.

304-5 (2) И Рэ.Пиогевовпя 230С-3

в А В "я

ж ■(_»

т

г»

я о а» сцр л о>о

т

а; и &

а} >

1002

50 "

10 20

40 50

100 150 200 Соленость, г/л

Рис.5. Зависимость гетеротрофной фиксации СС^к.1и1вия 304-55 (I)', 370-Сог (2). к.гЬоаоеЛгоиа 304-6 (3), 134-3 ( 4) ОТ солености.

Влияние микр оа эр офилькых условий на рост бактерий выясняли в опытах с меченым ацетатом удельной активностью 1,0 мкК и меченым бикарбонатом активностью 0,56 мкК. Различные широк ондантрации кислорода в опыте создавали, используя методические приемы, при-ме(1яемые при культивировании сульфатвосстанавливающих и метаяоб-разующих бактерий (быстрое охлаждение свежепрокипяченной среды, кипячение среды под струей водорода, внесение в среду 1% раствора сульфида натрия).

Установлено, что К.гЬойосЬгоив 304-6 и к.шгеиа Н78&-3 развиваются в микроаэрофильных условиях при концентрации кислорода около I мг/л на ацетате и за счет автотрофной ассимиляции меченой углекислоты на водороде. Гетеротрофная фиксация 00^ при развитии культур на ацетате составила в этих условиях у обеих культур 5ОД от максимальной (рис.7).

Возможность развития родококков на углеводородах при отсутствии кислорода в пластовой воде проверяли в следующем лабораторном опыте. Стерильную пластовую воду соленостью 34 г/л, с добавлением в качестве индикатора окислительно-восстановительных условий реэазурином, разливали под пробку во флаконы объемом 42 мл, закрытые резиновой пробкой л завинчивающейся крышкой. Шприцем вносили по 0,5 мл раствора Ма^ и.резаэурин обесцвечивался (£ь.-42 ьгв). Затем пол-объема флакона замесали гелием, пропущенным для удаления следов кислорода через раскаленную медь., Иноку-лят и вазелиновое масло вносили шприцем со 0,5 мл. Флаконы вниз пробкой помешли в ванночку с водой для создания:водного затвора: и инкубировали при 30°С.

Анализ газовой фазы, вьшолненный на хроматографе "Поиск-!**, выявил присутствие кислорода, парциальное давление которого было в 10-п25 раз ниже атмосферного давления кислорода воздуха. По закону Генри, при таком давлении кислорода его концентрация в вод-,.

19

ной среде должна составить 0,3-1,5 мг/л. Однако в вешней среде кислород отсутствовал. Повышенная концентрация солей, воо-становвтельные условия, созданные внесением сульфида натрия, и

Соленость, г/л

Рис.в. Влияние солености пластовой воды на потребление ацетата а.1и*«тдв 134-4 (I), Н788-3 (2).

Рис.7. Зависимость автотрсфной (а) и гетеротрофной- (б) фиксации (I) и погребения ацетата (2) от концентрации>кислорода

в среде культурой Н.гЬойосЬгоив 304-6.

20

низкое парциальное давление кислорода затруднили его растворение в пластовой воде, поэтому »окно в ре от; ол шить наличие кислорода лишь в углеводородном слое, где и происходит развитие культур. Бактерии рода вьоаосоооив развивались в углеводородном слое с образованием слегка пишентированноВ бактериальной пленки. Количество биомассы на 60-е сутки роста в этих условиях составило 0,28-0,88 г/л.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Длительная эксплуатация нефтяных месторождений с применением заводнения пресными водами создает условия для развития мшфофло-ры. Разбавление пластовых вод пресными ведет как к повышению активности пластовой микрофлоры, так и к росту численности отдельных физиологических групп бактерий - углеводородокислявдих, суль-фатвосстанавливашкх, штанобразушиз*. Наряду с высокой общей соленостью пластовых рассолов, развитие шшстовой микрофлоры угве^ тает низкий окислительно-восстановительный потенциал среды, повто-му активность и численность бактерий в карбонатном коллектсрре ниже, чем в террягенном.

Видовой состав углеводородом сляющего сообщества в разных зонах пласта определяется степенью разбавления пластовых вод пресными. Наибольшее распространение в пластах получили бактерии рода здодососсиа. Они встречаются как в пластовых рассолах, так и в разбавленных пластовых водах. Углеводородокясдяющие бактерии родов Шогососсив, Рееидотоош, ДсЬготоЬао*«г к ?1агоЬаа1ег1ит распространены только в сильворазбапленных пластовых вещах.

Ранее (Кузнецова, Ли, 1964; Розанова с соавт., 1971;.Розанова, Назина, 1962) углеводородокисляющая, микрофлора выделялась, в основном, из сильноразбавленных пластовых вод эксплуатационных скважин и из приэабойной зоны нагнетательных скважин. Выделение проводилось в парах нефти и углеводородокисляющая микрофлора была

21

представлена бактериями рода íseudomoaaa. Отбор псевдомонад объясняется, по-ввдимому, тем, что они хорошо развиваются на летучих углеводородах алифатического и ароматического рада, а углеводород окисляющие родококки предпочитают жидкие плохopaстворикые в воде н-алканы. Использование параллельно разных методик выделения углеводородокисляющих бактерий позволило определить их видовое разнообразие более достоверно.

Ограниченное расселение грамотрицательной углеводородокисляющей микрофлоры по пласту объясняется ее слабой устойчивостью к высоким концентрациям солей. Шрокое распространение родококков в нефтяной заложи обусловлено их высокой галотолерантностью и адаптацией к конкретным условиям солености.

Принимая во внимание мнение Перта (1978) о том, что растворимость кислорода в нефти в 100 раз выше, чем в воде, мы предполагаем, что кислород, поступающий в залежь с пресными водами, растворяется, в основном, в нефти и поэтому не обнаруживается в пластовой воде методом Винилера. С нефтью кислород проникает в более удаленные от нагнетательных скважин зоны пласта. Становится по- ' нятным, почему на этих участках пласта распространены только так называемые нефтеиодожительные ( Неуег, Schworts, 1970) бактерии рода hhodoooccue, которые в двухфазной системе нефгь-во-да располагаются со стороны углеводородной фазы и способны к развитию за счет углеводородов нефти и кислорода, растворенного в ней. Лабораторный опыт, моделирующий отсутствие кислорода В пластовой воде при его наличии в газовой фазе, указывает на возможность развития родококков в этих условиях в углеводородном слое.

ВЫВОДЫ

I. Выяснено, что ввдовой состав и распределение углеводорол-окислязощей микрофлоры в разных зонах заводняемых пластов Пермского Прикамья обусловливается экологической обстановкой, основным

22

фактором которой является степень разбавления Пластовых рассолов поверхностными пресными водами.

2. Установлено, что экологической нишей углев слород окисляющих. бактерий родов Ряеиймюпа«, Ас&гопоЬасЪсг И Г1«№оЪас4ег1ии являются сяльнорээбавленкые пластовые воды, что объясняется их слабой устойчивость!) к высокой солености среды.

3. Впервые показано, что коринеподобввя утлев од ород окислявшая микрофтора является одним из основных компонентов сообщества угле-, водородокисляющих бактерий, развивающегося в широком диапазоне солености до 250 г/л. Сравнительный анализ фекотилкческих и антигенных ПрИЗНаКОВ ПОЗВОЛИЛ ОТНеСТИ ИХ К НОВОМУ РОДУ ВЬойососсив.

4. Изучены фйэиолого-биохимические особенности бактерий рода ЕЬоаоооссиа, выделенных из пластовых вод. Их отличает: галото-лерантность, способность окислять углеводороды (Сд-С16), метанол и другие низшие спирты, жирные кислоты, рост в амотрофных условиях за счет окисления водорода.

5. Исследовано влияние отдельных факторов среды обитания на жизнедеятельность бактерий, выделенных в чистые культура. По данным гетеротрофной фиксации меченой углекислоты и потребления меченых глюкозы и ацетата установлено, что: а) глубинные температуры нефтяных пластов 20-24°С, а также слабокислые значения рН 6,2-6,8 пластовых вед и рассолов благоприятны для жизнедеятельности распространенных в ШГЙСТаХ бактерий РОДОВ ЬЬоЛосоСоиэ, РгеиДотопаЗ

и АсЬготоЪа^ег; б) рассолы с общей соленостью 250-260 г/л ограничивают развитие углеводородокясляютих бактерий в результате высокого содержания в них ионов кальция - 0,45 г/ион/л; в) способность родококков развиваться в микроаэрофильных условиях, а также в углеводородном слое при низком парциальном давлении кислорода в газовой фазе и его отсутствие в волной среде обусловливает ах развитие на участках,удаленных от зон нагнетания.

23

Полученные данные позволяют заключать,что для развития родококков экологические условия ела б орзз бавлешшх пластовых вод благоприятны.

б. Создана коллекция культур углеводородокислявдих бактерий рода Rhodococcua, выделенных из нефтяных пластов. Обнаружение родоксж-ков в пластах и изучение их физиологии позволяет сделать вывод о их геохимической роли, которая заключается в использовании высокомолекулярных: алифатических углеводородов.Таким образом,развитие родокекков, в отличие от псевдоыояад, не ведет к утяжелению нефти. Этот фактор необходимо учитывать при разработке методов воздействия тта нефтяной пласт,

СПИСОК РАБОТ, ОШГЫИКСВАНШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оборин ¿.А., Ившина И.Б., Бердкчевская Ы.В., Рубинштейн Л.11. Владамирцев Г.И. Некоторые особенности экологии углеводородокис-ляющих бактерий грунтовых и подземных вод района нефтяных месторождений Пермского Прикамья. - Тезисы докладов Л Ue жяунар ода ого -симпозиума "Рост микроорганизмов на С^ соединениях", Пущино-на-Оке, 1377, о.З,

2. Оборин A.A., Королев В.К., Бердичевская И.В., Постаногова

Г.В. Современные задачи нефтяной микробиологии. - в кн.: Геомикробиология поиска и разработки нефтяных месторождений. - Свердловск, Труды ИЭРЖ УНЦ АН СССР, 1979, вып. 124, с.З-П.

3. Оборин A.A., Ившина И.Б., Бердичевская М.В. О природных апологических факторах, влияющих на жизнедеятельность углеводород-окисляодей микрофлоры. - В кн.: Геокикробиологня поиска и разработки нефтяных месторождений. - Свердловск, Труды ИЭР1 УНЦ АЛ СССР, 1979, вып.124, с.30-38.

4. Могилевский Г.А., Оборин A.A., Королев В.К., Ившина И.В., Бердичевская М.В. Микробиологическое воздействие на нефтяной пласт. - И.: ВНИИОЭНГ, 1979. -43с.

5. Бердичевская М.В. Влияние длительного заводнения нефтяной залежи на развитие биоценоза и активность пластовой микрофлоры. -Микробиология, 1982, т.51, вып.1, с.146-151.

6. Бердичевская М.В. Влияние длительного заводнения нефтяной залежи на видовой состав и активность углеводородокисляюцей кикрй-флоры. - Микробиология, 1962, т.51, вып.4, 0.678-6S3.

Вердичевская Марина Васильевна

ЭКОЛОГИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ ПЕРМСКОГО ПРИКАМЬЯ

К печати 22. 07. 83 г. Форм. бум. 60X 84*/!« Печ. л. 1

ЛБ06396 Тираж 100 экз. Заказ 952

Типография ПВВКИКУ