Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экзо-инулиназа из Aspergillus awamori 2250

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экзо-инулиназа из Aspergillus awamori 2250"

На правах рукописи

Кульминская Анна Алексеевна

ЭКЗО-ИНУЛИНАЗА ИЗ ASPERGILL USA WAMORI2250: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004 г.

Работа выполнена в Петербургском институте ядерной физики им. Б.П.Константинова Российской академии наук.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Неустроев Кирилл Николаевич

Научный консультант: доктор медицинских наук

Шавловский Михаил Михайлович. Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Комов Вадим Петрович, доктор химических наук, профессор Невинский Георгий Александрович.

Ведущая организация: Тихоокеанский институт биоорганической

химии Дальневосточного отделения Российской академии наук.

Защита состоится «_»_2005 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.022.03 при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН.по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71 (конференц-зал НИИЭМ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, С.-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12.

Автореферат разослан «___»_2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д001.022.03 доктор биологических наук, профессор

Л. В. Пучкова

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. В современной промышленности используются разнообразные ферменты, в том числе гидролазы, обеспечивающие реакции расщепления различных субстратов до мономеров. Среди гидролаз гликозидгидролазы (гликозидазы, К.Ф. 3.2.1.-) являются одной из самых широко применяемых и изучаемых групп ферментов. Эти ферменты катализируют расщепление гликозидных связей между двумя сахаридными остатками или гликоновым и агликоновым компонентами. Одной из причин пристального внимания к этой группе ферментов является то, что гликозидазы оказались чрезвычайно эффективным инструментом энзиматического синтеза многих биологически значимых гликозидов, олигосахаридов и гликоконьюгатов. Такое их применение основано на том факте, что некоторые гидролазы способны обращать при определенных условиях реакции гидролиза с формированием новых гликозидных связей. На сегодняшний день описано более сотни различных экзо-гликозидаз (действующих на концевые углеводные остатки олиго- и полисахаридов), выделенных из широкого круга организмов и успешно примененных в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ. Ферментативный синтез имеет значительные преимущества перед традиционными методами органического синтеза, так как позволяет получать необходимые соединения практически в одну стадию и без проведения реакций блокирования и деблокирования реакционно-способных групп. Кроме того, при использовании реакций ферментативного синтеза удается получать строго определенные стереоизомеры с высоким выходом продуктов. Новые сведения о взаимосвязи строения активных центров этих ферментов и их способности к проведению трансгликозилирующей реакции, несомненно, важны и актуальны, т.к. не только дают возможность эффективно использовать траснгликозидазы в энзиматическом синтезе, но и объясняют механизмы действия карбогидраз в целом. Эффективное применение гликозидаз требует тщательного изучения их свойств и как белков, и как ферментов, а также знания их первичной структуры и строения соответствующих генов. Полная совокупность фундаментальных знаний о каждом конкретном ферменте позволяет целенаправленно изменять его структуру и свойства в соответствии с производственными задачами. Среди гликозидаз выделяется группа микробных инулиназ (карбогидраз, гидролизующих полисахарид инулин), которые являются важными промышленными ферментами. Среди многочисленных известных источников-микроорганизмов наибольшее предпочтение в настоящее время отдается мицелиальным грибам рода Aspergillus, Pénicillium и дрожжам Kluyveromyces. Но, несмотря на то, что микробные инулиназы довольно подробно охарактеризованы, до сих пор не была установлена трехмерная структура этих ферментов и субсайтная организация их активных центров. До настоящего времени не были описаны реакции обращения гидролиза (трансгликозилирования) инулиназами, выделяемыми из грибных источников. В данной работе мы подробно охарактеризовали ферментативные свойства экзо-инулиназы, выделенной нами из Aspergillus awamori вар. 2250, а также установили взаимосвязь между ее структурными особенностями и каталитическими свойствами.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании взаимосвязи между структурной организацией и каталитическими свойствами экзо-инулиназы Aspergillus awamori вар. 2250.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи.

1. Выделить и очистить до гомогенности инулиназу из мицелиального гриба Aspergillus awamori вар. 2250.

2. Изучить физико-химические свойства очищенного фермента.

3. Исследовать ферментативные активность и субстратную специфичность экзо-инулиназы, а также оценить возможность обращения гидролитической реакции.

4. На основании анализа ферментативной кинетики построить модель субсайтной организации активного центра.

5. Выявить аминокислотные остатки, обеспечивающие катализ.

6. Сопоставить результаты исследования ферментативной активности и данные по структурной организации фермента.

Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервые показано, что инулиназа Aspergillus awamori является экзо-действующим ферментом, сохраняющим в продуктах аномерную конфигурацию субстрата и способным расщеплять как инулин и инулоолигосахариды (Р-2,1-фруктаны), так и леван и леваноолигосахариды ф-2,6-фруктаны). Инулиназа классифицирована как представитель 32 семейства гликозидгидролаз. В исследованных экспериментальных условиях инулиназа не обладает трансгликозилирующей активностью. На основе кинетического анализа гидролиза инулоолигосахаридов различной длины впервые установлено наличие пяти субсайтов связывания с субстратом. По данным рентгеноструктурного анализа молекула белка состоит из двух доменов: N-концевого каталитического домена, который имеет укладку пяти-лопастного -пропеллера, и С-концевого домена со структурой « -сэндвич». Рентгеновские данные о структуре комплекса фермента с фруктозой дали возможность локализовать положение каталитически важных аминокислотных остатков. Впервые для инулиназ из грибных источников были идентифицированы сайты гликозилирования и показана значимость степени их гликозилирования для кристаллизации белка.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание механизма действия представителей 32 семейства гликозидгидролаз. Выяснение структурно-функциональных взаимосвязей для экзо-инулиназы имеет большое значение для дальнейшей структурной модификации с целью получения рекомбинантных ферментов с заданными каталитическими свойствами. Предполагается использование природной инулиназы и рекомбинантных аналогов для производства фруктозы и коротких фруктанов, имеющих важное значение в качестве пищевых добавок. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Инулиназа из Aspergillus awamori вар. 2250 является ферментом экзо-действия.

2. Экзо-инулиназа Aspergillus awamori - представитель 32 семейства гликозидгидролаз.

3. Активный центр фермента включает не менее пяти субсайтов связывания с субстратом.

4. Экзо-инулиназа- гликопротеин с пятью сайтами N-гликозилирования.

5. Молекула белка представляет собой двухдоменную структуру. Asp 41 и Glu 241 - аминокислотные остатки, участвующие в акте катализа по механизму двойного замещения.

Личный вклад соискателя. Соискателем были выполнены работы по оптимизации культивирования микроорганизма, выделению и очистке белка до гомогенного состояния, осуществлены физико-химическая и биохимическая характеристика фермента, определение кинетических параметров гидролитических реакций экзо-инулиназы различными методами, ингибиторный анализ и построение субсайтной модели активного центра белка. Автор провел исследования трансгликозилирующей активности фермента и роли гликозилирования.

Апробация работы. Материалы работы представлены на 2-ом немецко-польско-российском Симпозиуме по бактериальным карбогидратам (Москва, сентябрь 10-12, 2002) и на V Иберо-Американском Конгрессе по биофизике и XXVIII Конгрессе Бразильского биофизического общества (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 15 октября 2003 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 16 рисунками.

Основное содержаниеработы 1. ОБЗОРЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре представлена характеристика фруктанов, перечислены их природные источники, функции и строение, а также их применение. Проанализированы известные ферменты микробного происхождения, способные утилизировать инулин и леван. Дана сравнительная характеристика физико-химических свойств инулиназ различного происхождения. Представлены данные по современной классификации гликозидгидролаз на основе гомологии их аминокислотных последовательностей и общего механизма действия. Даны характеристики некоторых представителей 32 семейства гликозидгидролаз и представлена информация об аминокислотных остатках, участвующих в катализе. Рассматриваются вопросы структурной организации активного центра гликозидгидролаз и механизма их каталитического действия. Описаны методы, используемые в современной гликобиологии для получения на основе известных гликозидгидролаз новых ферментов с измененными свойствами. Экспериментальная част ь

2. МАТЕРИАЛЫИМЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ

Условия роста культуры и выделение экзо-инулиназы. Штамм мицелиального гриба Aspergillus awamon вар 2250, использованный в работе, был любезно предоставлен д.б.н, проф Корнеевой О С. (Воронежская государственная технологическая академия, Воронеж, Россия) Культуры A. awamori выращивали поверхностным способом в течение 96 ч при температуре 32 ± 2°С.

Инулиназу экстрагировали с поверхности роста гриба водой и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин Супернатант концентрировали в 10 раз ультрафильтрацией на полых волокнах (Кириши, Россия) Для получения высокоочищенного препарата инулиназы нами была разработана схема, включающая хроматографию на Сефадексе G-50 и DEAE-Сефадексе А-50 (Fine) фирмы "Pharmacia" (Швеция), ионообменную хроматографию на колонках DEAE-5PW и Mono S HR5/5 (Pharmacia Biotech), а также хроматографию на Phenyl-Superose (Pharmacia Biotech) Фракции с инулиназной активностью диализовали и высушивали лиофильно Гомогенность полученных фракций фермента определяли методами денатурирующего электрофореза в 10 % полиакриламидном геле, электрофореза в неденатурирующих условиях и аналитической ВЭЖХ

Получение субстратов. В работе были использованы инулин (Merck, Дармштадт, Германия), леван из Microbacterium levaniformans, любезно предоставленный доктором А Мясниковым (Danisco Global Innovation, Финляндия), l-кестоза, полученная с помощью фруктозилтрансферазы из A. foetidus по процедуре, описанной Rehm с соавт (Rehm et al, 1998), инулоолигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 7, леваноолигосахариды с с п 2-7, стахиоза, сахароза и раффиноза (Sigma Chemical Co, США) Инулоолигосахариды со с п 2-4 получали обработкой инулина эндо-инулиназой из A ficuum, которая была любезно предоставлена проф Чаэе К С (prof Chae К S, Национальный университет Чонбука, Корея) Леваноолигосахариды получали обработкой левана леваназой, любезно предоставленной доктором А Мясниковым (Danisco Global Innovation, Финляндия) Полноту гидролиза и чистоту полученных фруктоолигосахаридов проверяли методами ТСХ на пластинах Kieselgel 60 (Merck, Германия), используя в качестве подвижной фазы смесь бутанол-уксусная кислота-вода (3 11, по об), ВЭЖХ на колонке Dextra-Pak и методом Н ЯМР спектроскопии с использованием ранее описанных данных по фрукто-олигосахаридам Чистота полученных соединений была не менее 95%

Общие методы. Молекулярную массу белка устанавливали методом денатурирующего электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле согласно процедуре Лаэммли с использованием набора маркерных белков с молекулярными массами 14400 - 94000 Да (LMW, Pharmacia Biotech, Швеция) Определение молекулярной массы белка в неденатурирующих условиях осуществляли методом аналитической хроматографии на колонке Superose 12 (Pharmacia), предварительно откалиброванной набором белков с молекулярными массами в диапазоне 12000 -200000 Да (kit MW-GF-200, Sigma, США) Электрофорез в неденатурирующих условиях был выполнен в соответствии с процедурой, описанной Ohta с соавт (Ohta, 1993), с использованием MW-ND-500 kit с молекулярными массами 14000 - 500000 (Sigma, США) Изоэлектрическое фокусирование было выполнено на пластинках Servaht 3-10 (Serva Feinbiochemica, Хейдельберг, Германия) Концентрацию белка измеряли по методу Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта Чтобы получить дегликозилированные формы экзо-инулиназы, нативный белок обрабатывали эндо-р^-ацетилглюкозаминидазой Н (Endo Н) из Streptomyces griseus, а-галактозидазой из Tnchoderma reesei, а-глюкозидазой из Saccharomyces cerevisiae и а-маннозидазой из бобов (Canavalia ensiformis)

Анализ N-концевого и внутренних фрагментов аминокислотной

последовательности Электроблоттинг белка выполняли на поливинилиден дифторидных мембранах (Sequi-Blot PVDF membrane, Bio-Rad, Ричмонд, США) с использованием 25 мМ Трис/192 мМ глицин/0,1% SDS в качестве катодного буфера и 25 мМ Трис/192 мМ глицин/20% метанол в качестве анодного буфера

Аминокислотную последовательность фрагментов на вырезанных полосах PVDF мембран определяли методом автоматической деградацией по Эдману на установке Beckman LF3400D, оборудованной микроградиентной системой ВЭЖХ (model 126 Gold system microgradient HPLC) и диодным детектором (model 168 diode array detector; Beckman Instruments). Для получения пептидов инулиназу обрабатывали CNBr, полученные пептиды очищали методом обращенно-фазной ВЭЖХ. Измерение активности экзо-инулиназы. Экзо-инулиназную активность определяли методом Сомоджи-Нельсона по количеству редуцирующих Сахаров, высвобождаемых из инулина, которое определяли спектрофотометрически при X = 506 нм. Одна единица ферментативной активности экзо-инулиназы была определена как активность, необходимая для получения 1 мкмоль фруктозы из инулина (при начальной концентрации 2.5 мг/мл) в 1 минуту при рН 4.5 и температуре 37 °С. Активность экзо-инулиназы по отношению к стахиозе, раффинозе и левану определяли тем же способом. В качестве альтернативы активность экзо-инулиназы оценивали в реакции гидролиза фруктоолигосахаридов, анализируя продукты реакции методом ВЭЖХ на колонке Dextra-Pak™ с рефрактометрическим детектированием. Активность ферм'ента по отношению к сахарозе оценивали по количеству образующейся глюкозы, которую определяли глюкозоксидазным методом. Примесные экзо-гликозидазные активности в очищенном образце экзо-инулиназы измеряли с использованием соответствующих иора-нитрофенил а/р-гликозидов в качестве субстратов. Примесные эндо-гликозидазные активности измеряли методом Сомоджи-Нельсона с использованием целлюлозы, ксилана, ячменного глюкана, ламинарина и галактоманнана в качестве субстратов.

Методы анализа каталитических свойств инулиназы. Влияние рН на активность и стабильность экзо-инулиназы измеряли при темп. 37°С в течение 10 мин в диапазоне рН 3 - 9 в 100 мМ натрий-цитратных буферных растворах. Влияние температуры на активность и стабильность фермента измеряли при рН 4.5 в 20 мМ натрий-ацетатном буфере при температурах от 30 до 80°С, используя 0.02 ед. экзо-инулиназы и 2 мМ инулина.

Методы анализа кинетических параметров реакций гидролиза экзо-инулиназой.

Кинетические характеристики ферментативного гидролиза каждого из субстратов определяли при 6-15 концентрациях субстрата, соответствующих от»0.1 КМ до 4 - 8 Км, с помощью нелинейного регрессионного анализа уравнений Михаэлиса-Ментен. Методы определения аффинностей субсайтов активного центра фермента. Число сайтов связывания с субстратом в активном центре фермента оценивали на основе системы уравнений, разработанных для экзо-действующих ферментов (Hiromi, 1970), и номенклатуры Дэвиса с соавт. (Davies et al., 1997), а также методом анализа констант ингибирования реакции гидролиза сахарозы фруктоолигосахаридами. Методы исследования трансгликозилирующей активности экзо-инулиназы. Реакцию трансгликозилирования исследовали в 50 мМ натрий-ацетатных буферах (рН 4 5 и 5.0) и натрий-фосфатных буферных растворах (рН 6.0 и 7.0) при 37 °С, вводя в реакционную смесь 0 01 ед. фермента и до 100 мМ соответствующего субстрата (сахарозу, инулотриозу, инулотетраозу и леванотетраозу). Аликвоты реакционных смесей отбирались через различные промежутки времени и реакцию останавливали замораживанием с последующим лиофильным высушиванием. Образцы анализировали методом ТСХ в системе ацетон/вода (87:13 по об.) или ВЭЖХ на колонке Dextro-Pak. Продукты гидролиза инулина исследовали методом 'Н ЯМР спектроскопии. Спектры снимали на спектрометре АМХ-500 Bruker. Выделение нуклеиновых кислот и клонирование инулиназного гена и кДНК. Эксперименты по определению нуклеотидной последовательности гена экзо-

инулиназы были проведены в лаборатории проф М Аранда (институт фармакологии и токсикологии университета г Вёрсбурга, Германия) РНК выделяли по методу Хромзински и Сакчи (Chromczynski and Sacchi, 1986) Выделение ДНК осуществляли по методу Рэдера и Брода (Raeder and Broda, 1985) с изменениями кЦНК A awamori получали методом обратной транскрипции с использованием набора реактивов (Ready-To-Go first-strand synthesis kit) фирмы Amersham Bioscience и олигонуклеотидов 5'-CCCCAGAAGAACTGGATGAA-3' и 5-TCACCTTGGCCTCCGAATACCTCGAC-31, выбранных исходя из из N-концевой аминокислотной последовательности белка экзо-инулиназы A awamori и его внутренней аминокислотной последовательности VEVFGGQGE ПЦР с использованием кЦНК и геномной ДНК проводили при помощи ДНК-полимеразы turbo-PfU (Stratagene) в условиях, рекомендованных фирмой-изготовителем, и с использованием тех же олигонуклеотидов Полученные фрагменты клонировали в векторе pCR4-TOPO с использованием соответствующего набора реактивов (Invitrogen) ОТ-ПЦР (обратная транскрипция, сопряженная с ПЦР) проводили по методу Аранда с соавт (Arand et al, 1999) Для реакции лигирования использовали Т4-ДНК-лигазу (Life Technologies) ПЦР проводили в течение 30 циклов (1 мин при 94оС, 1 мин при 60оС, 3 мин при 72оС) с помощью ДНК-полимеразы turbo-Pfu (Stratagene) в условиях, рекомендованных фирмой-изготовителем Для амплификации 5'- и 3'-фланговых областей гена использовали следующие пары праймеров 5'-GTGGCATCGAGTGGGGAACA-3'/5'-GGAAGAACAGATGGTAGGT-3' и 5'-CGCCAACTTCACCGAGCAGAC-3'/5'-TCCGGTTGTGGTTGTGTTGGTG-3', соответственно Продукты ПЦР секвенировали в обоих направлениях для контроля правильности полученной последовательности В случаях несоответствия, амплифицировали третий независимый фрагмент Анализ последовательности ДНК выполняли с использованием пакета компьютерных программ LaserGene компании DNAStar

Кристаллизация белка н сбор рентгеноструктурных данных. Рентгеноструктурный анализ выполнялся в лаборатории белковой кристаллографии (Laboratorio Nacional de Luz Sincrotron, LNLS, protein crystallography beam line, Бразилия) Данные рентгеноструктурного анализа любезно предоставлены д-ром Р Наженом (the Laboratorio Nacional de Luz Sincrotron, LNLS, protein crystallography beam line, Бразилия) Кристаллизацию белка выполняли методом диффузии в парах. Для сбора данных кристаллы замораживали в потоке газообразного азота при темп 100 К (Oxford Cryosystems) Данные для орторомбической формы собирали осцилляционным методом на двумерном детекторе (345 MAR Research image-plate detector) в лаборатории белковой кристаллографии (Laboratorio Nacional de Luz Sincrotron, LNLS, protein crystallography beam line, Бразилия) Длину волны синхротронного рентгеновского излучения установили равной 1 54 А для оптимизации соотношения сигнал/шум и скорости сбора данных Рентгеновские данные для моноклинной формы были получены на рентгеновском источнике RIGAKU ultra X 18 с вращающимся анодом, оборудованном рентгеновской оптической системой Данные были получены осцилляционным методом на двумерном детекторе (345 MAR Research image-plate detector) на длине волны CuK а (I 5418 А) Дифракционные данные обрабатывались с помощью программ MOSFLM (Leslie, 1992) и SCALA (Evans, 1997) Йодную производную получали методом quick cryo-soaking denvatization (Leslie, 1992, Dauter et al, 2000) Фазовая проблема была разрешена с помощью метода SIRAS (Single Isomorphic Replacement with Anomalous Signal) с использованием собранных данных для нативного белка и одной йодной производной Положения и заселенности атомов йода определяли прямыми методами с помощью программ DREAR и SnB (Blessing and Smith, 1999, Weeks and Miller, 1999) Позиции тяжелых атомов были использованы в

программе SHARP (La Fortelle E. and de Bricogne G., 1997) для расчета фаз. Предварительно полученные экспериментальные фазы уточняли методом модификации электронной плотности, реализованным в программе SOLOMON (Abrahams and Leslie, 1996). Качество карты электронной плотности позволило автоматическое построение кристаллографической модели экзо-инулиназы с использованием программы ARP/wARP (Perrakis et al., 1999). Последующее построение модели и уточнение боковых цепей выполняли с помощью пакета графических программ О (Jones et al., 1991) и XtalView (McRee, 1999). После тщательного визуального анализа структуры геометрические параметры модели (валентные и торсионные углы, длины связей) были уточнены с помощью программы REFMAC (Murshudov et al., 1997). Добавление молекул кристаллизационной воды осуществляли с помощью программного пакета ARP-WATERS из пакета программ ССР4 (Collaborative Computational Project). N-олигосахарцды были введены программой Xfit из XtalView.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Выделение и физико-химические характеристики экзо-инулиназы. Протокол выделения инулиназы представлен в табл. 1. На конечной стадии очистки получен гомогенный по данным электрофореза фермент, очищенный в 38 раз по сравнению с удельной активностью исходного экстракта. Выход конечного очищенного продукта составил 10% по активности. Изначально определялась общая инулиназная активность, состоящая из активности эндо-инулиназы и экзо-инулиназы. Так как целевым продуктом служила экзо-инулиназа, предполагалось, что ее вклад в суммарную активность до отделения от эндо-инулиназы составляет 50%. Очистка экзо-инулиназы от эндо-фермента была осуществлена на четвертой стадии. Удельная активность экзо-инулиназы после последней хроматографической стадии очистки составляла 75 ед./мг белка. Согласно данным электрофореза в присутствии ДСН, белок мигрировал в виде единичной зоны, молекулярная масса фермента соответствовала 72 ± 1 кДа (Рис.1). Аналитическая гель-фильтрация на колонке Superose 12 также выявила единственный симметричный пик, соответствующий по активности экзо-инулиназе с молекулярной массой 70 ± 5 кДа, что указывает на то, что фермент состоит из одной полипептидной цепи. Данные электрофореза в неденатурирующих условиях также показали высокую гомогенность выделенного фермента.

Высокоочищенную фракцию белка обрабатывали бромоцианом. В результате химической деградации были получены N-концевой фрагмент и три внутренних пептида. После их анализа на белково-пептидном микросеквенаторе Beckman LF3400D получили следующие последовательности: N-концевая последовательность: F NYDQPYRGQY HFSPQKNWMN DPNGL; пептид 1: N DPNGLLYHNG TYHLFFQYN; пептид 2: YTS YYPVAQTLP. При секвенировании концевого фрагмента и исходного белка определялась единичная последовательность, что подтверждает гомогенность выделенной инулиназы.

Изоэлектрическая точка экзо-инулиназы была определена методом изоэлектрофокусирования на пластинках Servalit 3-10 и оказалась равной 4.4. Максимальная активность фермента была обнаружена при рН 4.5 и 60°С. Более

чем 80% от максимальной активности сохранялось при значениях рН от 3 5 до 5 0, при значениях рН ниже 3 0 и выше 6 0 она значительно снижалась Фермент сохранял примерно 90% активности при инкубации его при температуре 50°С в течение 8 ч, в то время как при температурах 60° - 70°С активность сохранялась лишь в течение 1 - 2 часов

Присутствие ЭДТА и катионов Са2+, Mg2+, 2п2+, №2+, Бе2+ в концентрации 10 мМ незначительно влияло на ферментативную активность экзо-инулиназы Катионы Мп2+ и Си2+ в этой же концентрации ингибировали фермент на 40 -50% Ионы и ПХМБ не оказывали эффекта на экзо-инулиназную

активность, что дает возможность предположить, что белок не имеет каталитически значимых сульфгидрильных групп в активном центре

Таблица 1. Стадии выделения экзо-инулиназы

Стадия очистки Объем, мл Общее к-во белка, мг Общая активность ед Удельная активность, ед/мг Степень очистки Выход, %

Экстракт после ультрафильтрации 200 2410 1952 16 1 100

Хроматография на колонке Sephadex G-50 300 1605 1659 20 13 85

Хроматография на колонке DEAE-Sephadex 40 450 976 43 2 1 50

Хроматография на колонке DEAE 5 PW 8 36 585 16 1 80 30

Хроматография на колонке Mono S 4 8 390 50 25 0 20

Хроматография на колонке Phenyl Superose 6 27 193 75 38 10

Рис. 1. ДСН-электрофорез экзо-инулиназы из Aspergillus awamori вар.

2250.

Линия 1 очищенная экзо-инулиназа Aspergillus

awamori, линия 2 белковые маркеры - фосфорилаза b из кролика (94 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (43 кДа), бычья эритроцитная

карбоновая ангидраза (30 кДа)

2. Характер действия экзо-инулиназы.

Характер действия фермента на инулин исследовали, прежде всего, с помощью метода ВЭЖХ. Данные по временной зависимости гидролиза инулина показали высвобождение в процессе реакции фруктозы и глюкозы (рис. 2). Отсутствие каких-либо иных фруктоолигосахаридов среди продуктов реакции указывает на то, что рассматриваемый фермент

Рис. 2. Временная зависимость гидролиза инулина, катализируемогоэкзо-инулиназой из А. акатоп 2250.

Верхняя кривая (■). образование фруктозы в процессе гидролиза инулина; нижняя кривая (•): образование глюкозы во время реакции. Инулин (3 мг) инкубировали с 2 ед экзо-инулиназы в 20 мМ растворе натрий-ацетатного буфера, рН 4.5, при 37°С. Продукты разделяли на колонке Бех&а-Рак™.

Помимо ВЭЖХ, мы исследовали характер действия экзо-инулиназы на инулин с помощью 1Н ЯМР спектроскопии. Результаты этих исследований приведены на рисунке 3, где показаны 'Н ЯМР-спектры реакционной смеси в начальный момент времени (0 мин., рис. 3А), на промежуточном этапе гидролиза (через 5 мин, рис. 3В) и в момент, когда гидролиз был практически завершен (через 20 мин, рис. 3С). Слабый

Рис. 3. "Н ЯМР спектры гидролиза инулина на начальной (А), промежуточной (В) и конечной (С) стадиях реакции. Внутри: Временная зависимость гидролиза инулина: ■ -деградация инулина; • - образование фруктозы в процессе реакции.

является экзо-действующей инулиназой.

Время, мин

сигнал с химическим сдвигом в районе 5 = 5.23 ррт соответствует аномерному протону а-глюкозы. На рисунке также показана временная зависимость гидролиза инулина под воздействием экзо-инулиназы. Видно, что уменьшение концентрации инулина коррелирует с увеличением концентрации фруктозы (рассчитано по формуле [Фруктоза]/с.п. - 1), это означает, что именно фруктоза - главный продукт гидролиза. Более того, отсутствие сигналов в области хим. сдвигов 4.3 - 4.1 ррт, которые являются характеристическими для фруктоолигосахаридов (ВаишЬайпег й а1., 2000), подтверждает это предположение.

3. Кинетические параметры гидролиза различных субстратов экзо-инулиназой.

Кинетические параметры реакций гидролиза, катализируемых экзо-инулиназой, были рассчитаны методом начальных скоростей (табл. 2).

Таблица 2. Кинетические параметры реакций гидролиза фруктанов и фруктоолигосахаридов, катализируемых экзо-инулиназой из Aspergillus awamori вар. 2250 (рН 4.5,37'С)___

Субстрат К„мМ сек' kj К (сек -мМ)-1

Инулин 0 050+ 0 00! 204 ±5 4083 ±275

Левам 2 08+ 0.04 mg/mL 1.40 ±0.02 н о

Стахиоза 10 l±0l 93 3 ±0 8 924 ±0 55

Раффиноза 8 0 ± 0.2 140 ±4 17.5 ±0.74

Сахароза 40 ±2 1150± 10 28.75 ±1.2

Инулобиоза 3 72±0 19 5060 ±250 1360 ±250

Инулотриоза 1.63 ±0 07 6210±279 3810 ±279

Инулотетраоза 0.94 ± 0.04 6240 ±275 6640 ± 275

Инулопентаоза 1.08 ±0.02 7670 ±153 7100 ±153

Инулогексаоза 1.02 ±0.01 6900±69 6760±69

Инулогептаоза 1.10 ± 0.01 6670 ± 33 6060 ± 33

Леванотриоза 2.14 ±0.01 1840 ±92 860 ±17

Леванотетраоза 1.74 ±0.14 1990±89 1143 ±23

Леванопентаоза 1.02 ±0.31 575 ±18 564 ± 62

Леваногексаоза 1.01 ±0.02 570 ±6 564 ± 63

При этом были использованы 12 - 16 концентраций субстратов в диапазоне от 0.1 х Км до 4 х Км. Начальные скорости гидролиза инуло-(с.п. 2 - 7) и левано-олигосахаридов (с.п. 3 - 6) были определены из графиков зависимостей скоростей гидролиза от концентраций субстрата, которые были линейны на начальных стадиях гидролиза и следовали кинетике Михаэлиса-Ментен. Кинетический анализ реакций гидролиза, катализируемых экзо-инулиназой, показал, что скорость расщепления инулоолигосахаридов находится в прямой линейной зависимости от длины цепи соответствующих субстратов. Фактор каталитической эффективности, к„/Кш также уменьшается по мере снижения с.п. субстрата. Поскольку экзо-инулиназа расщепляет длинные (3-2,1-

фруктоолигосахариды более эффективно, мы предположили, что фермент имеет достаточно протяженный субстрат- связывающий центр. Это предположение было подтверждено расчетом свободных энергий связывания, который был выполнен на основе кинетических данных в соответствии с подходом, описанным Хироми с соавт. Результаты представлены на рис. 4. Данные показывают, что экзо-инулиназа, действительно, имеет протяженный активный центр, содержащий не менее пяти фруктозил-связывающих субсайтов.

Рис 4. А. Субсайтная структура активного центра экзо-инулиназы. Субсайтные аффинности А, представлены на гистограмме Б. Схематическое представление продуктивного способа связывания инулоолигосахаридов с активным центром экзо-инулиназы: • - невосстанавливающий конец фруктозного остатка, о -фруктозные остатки, вертикальная стрелка соответствует положению каталитического участка Лунки схематически представляют субсайты связывания субстрата в активном центре фермента Субсайты пронумерованы от -1 до +4, где субсайт -1 связывает невосстанавливающий фруктозный остаток, а +4 - восстанавливающий

4. Определение констант ингибирования реакции гидролиза сахарозы фруктоолигосахаридами.

Для того чтобы оценить число фруктозил-связывающих сайтов в активном центре экзо-инулиназы, был применен анализ конкурентного ингибирования фермента. С этой целью были измерены константы ингибирования (К1( ^ реакции гидролиза сахарозы, катализируемой экзо-инулиназой, в присутствии инулоолигосахаридов (с.п. 2 - 7) и леваноолигосахаридов (с.п. 3 - 6) в качестве ингибиторов. Графики зависимостей у0/у, - 1 от концентраций леваноолигосахаридов представлены на рис. 5. Мы показали, что все фруктоолигосахариды и фруктоза являются конкурентными ингибиторами гидролитической реакции сахарозы, хотя значение константы ингибирования К1( , для фруктозы было значительно выше, чем константы ингибирования для фруктоолигосахаридов, и равно 100 мМ. Значения констант ингибирования для фруктоолигосахаридов были в обратной зависимости от их длины (рис. 6, гистограмма измеренных значений К1( г

Рис 6. Измеренные значения

КЧт) для

фруктоолигосахаридов: 12 -

инулобиоза, 13 - инулотриоза, 14 -инулотетраоза, 15 -инулопентаоза, 16 -инулогексаоза, 17 -инулогептаоза, Ь3 - леванотриоза, Ь4 - леванотетраоза, Ь5 -леванопентаоза, Ь6 -леваногексаоза.

Рис 5. График зависимости у0/у - 1 от концентраций леваноолигосахаридов в реакции гидролиза

сахарозы: леванотриоза ( А) леванотетраоза (о),

леванопентаоза (•), и леваногексаоза

5. Исследование трансгликозилирующей активности экзо-инулиназы.

Наличие или отсутствие трансгликозилирующей активности сохраняющей аномерную конфигурацию экзо-гликозидгидролазы (экзо-инулиназы) можно оценить, анализируя продукты гидролиза субстрата (инулина). Наиболее вероятно, что трансгликозилирование будет происходить при высоких концентрациях субстрата к концу реакции гидролиза по мере роста концентрации потенциального акцептора в реакционной смеси. Продукты, указывающие, в нашем случае, на наличие такой реакции, должны быть короткими олигофруктозидами. Их присутствие в реакционной смеси можно регистрировать с помощью анализа разностного спектра ЯМР реакции в момент времени ^ и начальный момент, /0- При этом следует учитывать степень конверсии субстрата. При концентрации инулина 20 мМ на начальной стадии реакции, и при 80%-ной конверсии субстрата мы не наблюдали накопления сигналов в области 4.3 - 4.1 ррт, характерных для фруктобиозы и фруктоолигосахаридов с более высокой степенью полимеризации. Вместо этого, дифференциальные Н ЯМР-спектры реакционной смеси на промежуточной стадии (1 мин, рис. 7А) и на почти финальной стадии гидролиза (20 мин, рис. 7В) были практически одинаковыми со спектром фруктозы (рис. 7С). Таким образом, только фруктоза и глюкоза - единственные конечные продукты гидролитической

реакции инулина. Следует отметить, что анализ реакционной смеси с помощью 'Н ЯМР спектроскопии позволяет регистрировать в процессе реакции концентрации олигосахаридов менее чем 40 - 60 мкмоль, что соответствует менее чем 0.3% начальной концентрации инулина.

Рис. 7.

Разностный

'Н-ЯМР

спектр

реакционной

смеси

гидролиза

инулина: А -

промежуточная

стадия, В -

конец

гидролиза, С -

спектр

фруктозы

6. Анализ гена и кДНК экзо-инулиназы.

В результате проведенных экспериментов была определена нуклеотидная последовательность гена экзо-инулиназы из А. а-н/ашоп и зарегистрирована в базе данных ЕМВЬ под номером АД315793 (Агапё й а1., 2002).

В ходе реакции обратной транскрипции с мРНК экзо-инулиназы, с использованием праймеров 5'-ССССАОААОААСТООАТОАА-3' и 5'-ТСАССТТООССТССОААТАССТСОАС-З', был получен фрагмент кДНК данного гена. Его размер составлял 1.4 кЬ. Праймеры были выбраны исходя из М-концевой аминокислотной последовательности белка и внутренней согласованной аминокислотной последовательности VEVFGGQGE, которая оказалась общей для фруктозилтрансферазы из А. /овйёш и двух инулиназ, А и В, из А. niger и очень близкой к С-концу этих ферментов. При анализе методом агарозного гель-электрофореза ПЦР-продуктов геномной ДНК А. анашоп, полученных с использованием тех же праймеров, был обнаружен фрагмент с пониженной электрофоретической подвижностью, что означает присутствие интрона/интронов в гене. Фланговые последовательности, несущие недостающие части кодирующей области, были получены методом инверсной ПЦР после рестрикции геномной ДНК с ЫЬо! и последующей реакцией лигирования. Для амплификации 5'- и 3'-фланговых областей были использованы пары праймеров 5'-GTGGCATCGAGTGGGGAACA-375'-GGAAGAACAGATGGTAGGT-3' и 5'-

СОССААСТТСАССОАОСАОАС-3'/5'-ТССООТТОТООТТОТОТТООТО-3', полученные на основе определенной последовательности фрагмента кДНК. Оба получившихся фрагмента в 480 Ьр (5'-фрагмент) и 650 Ьр (3'-фрагмент) содержали ожидаемый сайт рестрикции ЫЬоХ. Все ПЦР-фрагменты были секвенированы и полученные последовательности

проанализированы с использованием пакета компьютерных программ LaserGene компании DNAStar. Установленная нуклеотидная последовательность ДНК содержит открытую рамку считывания (1611 bp), TATA box (75 bp) выше сайта начала трансляции и сайт полиаденилирования (112 bp) ниже стоп-кодона. Данная последовательность ДНК содержит один интрон. Белок, кодируемый геном экзо-инулиназы, состоит из 537 аминокислотных остатков. В результате пост-трансляционной модификации, как показал проведенный анализ, он превращается в гликозилированный белок, содержащий 518 аминокислотных остатков.

7. Исследование углеводного компонента экзо-инулиназы.

Как мы выяснили, экзо-инулиназа из A. awamori является гликопротеином. Обработка фермента эндо-глюкозаминидазой Endo H привела к снижению молекулярной массы белка с 72 до 63 ± 1кДа (определено методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле), что было обусловлено отщеплением N-связанных олигосахаридов. Дополнительная обработка экзо-инулиназы другими гликозидазами, как описано в Материалах и методах, не уменьшила молекулярную массу, что может быть объяснено отсутствием 0-связанных олигосахаридов.

8. Построение исходной модели и уточнение трехмерной структуры экзо-инулиназы.

Две разные кристаллические формы, а именно, орторомбическая форма белка, принадлежащая к пространственной группе Р2,2121 с параметрами кристаллической ячейки а = 64.726 Ä, b = 82.041 А, с -136.045 А (1 А =0.1 нм), и кристаллическая форма, принадлежащая к моноклинной пространственной группе P2t с параметрами ячейки а = 49.96 A, b = 93.35 А, с = 67.83 А, ß = 106.92°, были получены в одинаковых кристаллизационных условиях. Оба типа кристаллов дифрагировали до разрешения 1.54 А. Расчет коэффициентов Мэттьюса предполагал наличие мономеров в асимметрической части ячейки для обеих кристаллических форм.

Как известно, все аминокислоты, встречающиеся в природе, являются L-изомерами. Из дифракционных данных невозможно различить энантиоморфы, т.е. структуры, состоящие из L- или D-аминокислот. В нашей работе использование одного тяжелоатомного производного и наличие статистических ошибок рентгеновских данных не позволили определить правильный энантиоморф из карты электронной плотности визуально (не удалось достоверно идентифицировать направление закручивания а-спирали). Поэтому для построения модели использовали электронные карты для обоих вариантов. На первом этапе структуру белка моделировали путем построения поли-аланиновой пептидной цепи в имеющейся карте электронной плотности с помощью программы ARP/wARP (Perrakis et al., 1999), после чего был выбран правильный энантиоморф и построены боковые цепи аминокислотных остатков. В

результате была получена модель, содержащая около 90% всех аминокислотных остатков.

Анализ разностных карт электронной плотности комплекса «экзо-инулиназа-фруктоза» и нативного белка выявил положение связанной фруктозы в активном центре фермента. Структуру комплекса «фермент-фруктоза» уточняли с использованием тех же протоколов, что и для нативного белка.

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате пяти последовательных хроматографических стадий экзо-инулиназа их мицелиального гриба Aspergillus awamori вар.2250 была очищена до гомогенного состояния, что было подтверждено данными электрофореза в денатурирующих и неденатурирующих условиях и данными аналитической гель-фильтрации. Молекулярная масса белка была установлена равной 70 ± 5 кДа. Анализ аминокислотной последовательности экзо-инулиназы показал, что пептидная часть зрелого белка имела молекулярную массу 57149 Да и pl 4.89, что соответствовало полученным физико-химическим характеристикам. Нами было показано, что оптимальными условиями гидролиза инулина экзо-инулиназой были рН 4.5 и 60°С. Подобные характеристики были описаны для инулиназы из Penicillium sp. TN-88 (рН 4.0 и 55°С) и для некоторых экзо-инулиназ из видов Streptococcus. Экзо-инулиназа Aspergillus awamori, как оказалось, является довольно стабильным белком, т.к. остается активной около 8 часов при 50"С и диапазоне рН от 3.5 до 6.5. Эти свойства позволяют эффективно использовать описанную экзо-инулиназу в промышленных целях.

Специфичность и характер действия экзо-инулиназы из A. awamori были исследованы в реакциях гидролиза различных фруктозо-содержащих поли- и олигосахаридов. Было показано, что фермент гидролизует стахиозу, раффинозу, сахарозу, инулин и инулоолигосахариды (ß-2,1-фруктоолигосахариды), высвобождая фруктозу. Двумя независимыми экспериментами было доказано, что фермент является экзо-действующей гликозидгидролазой. Анализ продуктов гидролиза инулина методом ВЭЖХ не выявил каких-либо фруктоолигосахаридов в реакционной смеси. Кроме того, разработанный нами метод отслеживания гидролитической реакции инулиназы посредством ЯМР спектроскопии без прерывания реакции и выделения промежуточных и конечных продуктов также показал, что инулиназа Aspergillus awamori отщепляет только концевые фруктозильные остатки от инулина и инулоолигосахаридов. Чувствительность анализа посредством ЯМР дает неоспоримое преимущество перед методами ТСХ, ВЭТСХ и ВЭЖХ, поскольку ЯМР-исследование позволяет выявить присутствие, начиная от 1 %, примесных активнрстей в препарате.

Помимо ß-2,1-фруктоолигосахаридов и инулина, фермент оказался активен по отношению к левану и -2,6-фруктоолигосахаридам со с.п. 3 -6. Значения констант скоростей гидролиза раффинозы и стахиозы были сравнимы со значением константы скорости гидролиза инулина в отличие от значений констант Михаэлиса (Км), которые оказались на несколько

порядков выше константы Михаэлиса для инулина. Активность фермента по отношению к левану кажется несколько удивительной, поскольку инулиназа из A. niger, имеющая высокую гомологию описываемой в данной работе экзо-инулиназе, не обладала сколько-нибудь заметной леван-гидролизуюшей активностью. Анализ продуктов гидролиза левана экзо-инулиназой из A. awamori методом ВЭЖХ показал, что основным продуктом этой реакции является фруктоза. Экзо-инулиназа гидролизует левано- и инулоолигосахариды со сравнимыми значениями констант скоростей, что может означать, что структура фермента позволяет ему действовать по отношению к ß-2,6- и р-2,1-фруктозильным связям одинаково эффективно. Однако скорость гидролиза левана существенно ниже, чем скорость гидролиза инулина, что объясняется различиями в пространственной структуре этих фруктанов (Baumgartner et al., 2000). Другим объяснением может служить взаимодействие между поверхностью фермента и полисахаридами, как это было описано для -1,3-экзо-глюкозидазы из Candida albicans в гидролизе ламинарина. Следует заметить, что значение Км в реакции гидролиза инулина несколько меньше, чем константы Михаэлиса для инулоолигосахаридов со с.п. 2-7 (табл. 2).

Для оценки числа субсайтов связывания субстрата в активном центре экзо-инулиназы были использованы два различных подхода. Во-первых, прямая зависимость скоростей гидролиза фруктоолигосахаридов от их длины позволила применить теорию Хироми и номенклатуру Дэвиса, разработанные для экзо-действующих гликозидаз. Этим методом удалось показать, что экзо-инулиназа имеет пять фруктозил-связывающих субсайтов. Самые высокие значения свободных энергий связывания были обнаружены в субсайтах -1 и +1 (рис. 4А), а это значит, что взаимодействие дифруктозида с активным центром инулиназы характеризуется весьма высоким сродством. Следовательно, инулобиозид взаимодействует с субсайтами -1 и +1 продуктивно, и инулиназа, действительно, является экзо-действующей гликозидазой. Подобные высокие значения аффинностей для субсайтов -1 и +1 (-0.85 и -0.5 ккал/моль, соответственно) были описаны для «сохраняющей» ß-D-глкжозидазы/(1,4)- ß-D-глюкан экзо-гидролазы, выделенной из ячменя и относящейся к гликозидгидролазному семейству 3, и «инвертирующей» экзо-р-1,3-глюканазы из Trichoderma viride, а также для «сохраняющих» -глюкозидазы из семейства 13 и ß-глюкозидазы из семейства 1. К сожалению, эти данные не позволяют сделать какие-нибудь заключения о связи между механизмом действия экзо-инулиназы из Aspergilus awamori 2250 (сохранение/инверсия аномерной конфигурации углеродного атома фруктозы) и энергиями связывания фруктозного остатка в отдельном субсайте активного центра фермента. Тем не менее, кинетические данные, а также данные анализа субсайтной структуры активного центра подтверждают наше предположение, что фермент может быть классифицирован как экзо-действующая инулиназа, а не фруктофуранозидаза.

С другой стороны, анализ констант ингибирования для инулоолигосахаридов в гидролизе сахарозы, которые практически не

различались для инулоолигосахаридов со с.п. больше 5, также позволил предположить, что активный центр экзо-инулиназы имеет пять основных субсайтов связывания фруктозильных единиц инулина. Эти результаты соответствуют субсайтной схеме экзо-инулиназы, полученной с помощью теории Хироми. Простота и чувствительность описываемого в этом разделе метода анализа конкурентного ингибирования сделали возможным измерить ингибиторный эффект как для инуло-, так и для леваноолигосахаридов, а следовательно, оценить число фруктозил-связывающих субсайтов в активном центре экзо-инулиназы, поскольку зависимость констант конкурентного ингибирования гидролиза сахарозы от длины цепи фруктоолигосахаридов коррелирует с зависимостью KM от степени полимеризации субстрата. Ранее метод анализа конкурентного ингибирования был успешно применен для определения числа субсайтов связывания субстрата в активном центре ксиланазы из Pseudomonas fluorescens. Таким образом, число участков связывания мономерных единиц субстрата в активном центре инулиназы было охарактеризовано двумя независимыми методами, показавшими совпадение результатов.

Как известно, обращением реакции гидролиза гликозидгидролазами является реакция трансгликозилирования. Трансгликозилирующее действие гликозидаз можно объяснить в рамках универсального механизма, который состоит из: а) образования комплекса Михаэлиса, б) расщепления гликозидной связи донора с последующем высвобождением агликоновой части и образованием комплекса «гликозил-фермент», в) переноса гликозильного остатка на акцептор внутри этого комплекса и г) регенерации молекулы фермента и образования продукта. Роль акцептора может играть вода, приводя к осуществлению гидролиза. Если другие соединения, содержащие гидроксильную группу, например, простые спирты, сами продукты гидролиза субстратов, углеводы или их производные выступают в роли акцептора гликозильного остатка, мы наблюдаем реакцию трансгликозилирования. В последнем случае можно предполагать, что образуется тройной комплекс, ФП' П, который включает в себя фермент (Ф), гликозидный остаток в качестве донора (П') и акцептор (П), вторая молекула субстрата или другое соединение. Образование такого комплекса и, следовательно, эффективность трансгликозилирования зависит от сродства активного центра к акцептору или от наличия акцептор-связывающих сайтов в активном центре фермента.

Поскольку инулиназа из Aspergillus awamori является экзо-гликозидгидролазой, действующей по механизму двойного замещения (прежде всего, исходя из гомологии представителей 32 семейства гликозидгидролаз, для которых был показан этот механизм), мы предположили, что фермент может иметь траснгликозилирующую способность. Это предположение было проверено в условиях насыщающих концентраций субстрата (инулина) на разных стадиях конверсии. Метод отслеживания хода реакции непосредственно в смеси посредством ЯМР спектроскопии дает уникальную возможность достоверно показать образование продуктов реакций, катализируемых экзо-инулиназой. Тем не менее, нам не удалось при описанных

экспериментальных условиях зарегистрировать образование олигофруктозидов со степенью полимеризации > 2.

Дополнительно возможную трансгликозилирующую активность экзо-инулиназы мы исследовали в реакции гидролиза сахарозы в концентрациях от 40 до 200 мМ и диапазоне рН от 3.5 до 7.0. Несмотря на то, что сравнительный анализ аминокислотных последовательностей представителей 32 семейства показал почти 91%-ное сходство экзо-инулиназы из A. awamori с фруктозилтрансферазой из A. foetidus, экзо-инулиназа A. awamori не образовывала 1-кестозу, наиболее вероятный продукт фруктозилтрансферазной реакции. Кроме того, было проверено действие фермента на инулотриозу, инулотетраозу и леванотриозу в концентрациях до 50 мМ и в диапазоне рН от 3.5 до 7.0. Анализ продуктов этих реакций также не выявил ожидаемых фруктоолигосахаридов, а именно, инулотетраозу, инулопентаозу и леванотетраозу. Во всех случаях степень гидролиза субстрата была не менее 20 - 25%. При инкубировании фермента с фруктозой в концентрациях 50 - 200 мМ мы не наблюдали образования дифруктозидов. Таким образом, все вышеописанные эксперименты подтверждают отсутствие трансгликозилирующей активности у экзо-инулиназы из A. awamori 2250 в данных условиях. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей некоторых членов этого семейства, осуществленный с помощью программы CLUSTAL W, выявил не менее десяти консервативных участков последовательностей и показал остатки, участвующие в катализе. Результаты сайт-направленного мутагенеза инвертазы из Saccharomyces cerevisiae SUC2, левансахаразы из Bacillus subtilis показали, что общий механизм катализа для всех представителей 32 семейства предполагает участие остатка аспарагиновой кислоты в качестве нуклеофила и глутаминовой в качестве кислотно- основного катализатора. На основании этого анализа было предположено, что ферментативная реакция экзо-инулиназы A. awamori также идет по механизму двойного замещения, причем нуклеофилом является Asp41, а кислотно-основным катализатором

- Glu241. В данной работе локализация каталитически важных аминокислотных остатков и механизм реакции были подтверждены рентгеноструктурными данными.

Трехмерная модель показала, что молекула фермента состоит из двух доменов. N-концевой домен, содержащий каталитический сайт, включает 353 аминокислотных остатка (Phe 20 - Gin 372) и принадлежит к типу укладки «5-лопастной ß-пропеллер». Каждая ß-лопасть содержит четыре антипараллельных ß-структуры. С-концевой домен экзо-инулиназы, состоящий из 155 аминокислотных остатков (остатки Arg 382

- Тгр 536), содержит два ß -слоя, каждый из которых имеет 6 ß--структур, организованных в виде сэндвича. Оба домена соединены между собой коротким полипептидным линкером. Относительные позиции и ориентация доменов стабилизированы многочисленными водородными связями и гидрофобными взаимодействиями.

Данные анализа аминокислотной последовательности, установленной на основании исследования ДНК, показали, что экзо-инулиназа имеет пять потенциальных N-сайтов связывания

олигосахаридов. Рентгеноструктурный анализ фермента подтвердил это предположение. В процессе кристаллизации экзо-инулиназы в одинаковых условиях были получены две формы кристаллов, примитивная моноклинная (Р21) и орторомбическая различающиеся степенью гликозилирования. Качество рентгеновских данных позволило локализовать ^связанные сахара на модели фермента. Пять сайтов гликозилирования в обеих формах расположены на аспарагиновых остатках Asn 67, Asn 111, Asn 300, Asn 398 и Asn 430. Различия заключались в длине сахарной цепочки. В природе все пять сайтов ^гликозилирования могут содержать длинные антенно-подобные манносахариды. Отсутствие манноолигосахаридов в кристаллах может быть объяснено наличием собственных С1-маннозидаз А. акатоп, которые ответственны за отщепление этих сахаридов во время роста культуры. Подобный механизм был показан нами ранее для ТпсИоёегта гееяег. Дальнейший отбор менее гликозилированных молекул может также происходить во время кристаллизации вследствие различий в растворимости гликопротеина с разным содержанием гликозильных компонент. Известно также, что манноолигосахариды, присоединенные к другим гликозидгидролазам в процессе пост-трансляционной модификации, способствуют самоассоциации в тетрамеры, гексамеры и другие олигомерные комплексы. Поэтому, неудивительно, что гликозилирование белка влияет на процесс его кристаллизации и рост кристаллов.

Построение трехмерной модели комплекса экзо-инулиназы с фруктозой дало возможность исследовать организацию активного центра белка. Анализ разностных карт электронной плотности комплекса «экзо-инулиназа-фруктоза» и нативного белка был использован для локализации молекулы фруктозы в комплексе «фермент-ингибитор». Единственная молекула фруктозы связана между лопастями -пропеллера почти у центральной оси ^концевого домена. Длины водородных связей гидроксилов фруктозы с ферментом и молекулами воды представлены в табл. 3.

Таблица 3. Близкие взаимодействия мзжду экзо-инулиназой и неуглеродными агамами фруктозы. Предел расстояния был 3 3 А_

Прямая водородная связь

Гндроксильные группы фруктозы Атом аминокислотного остатка белка Расстояние (A)

ОН-1 Asp 41 Osi 2.49

Тгр 335 Nc| 295

ОН-2 Glu 241 Od 2.7

Вода 2 72

ОН-3 Asp 189 052 2.58

Arg 188 Nt 2.99

Glu 241 Oö 3 05

ЭН-4 Ser 103 N 3 16

Asp 189 05i 261

ОН-5 Gin57 Na 2.59

Trp 65 N52 Asn 40 N52 2.96 2.97

На основе анализа совмещенных трехмерных моделей экзо-инулиназы и комплекса фермента с фруктозой мы идентифицировали два каталитических остатка Asp 41 и Glu 241, причем первый является нуклеофилом, а второй - донором протона. Определение каталитически важных аминокислот экзо-инулиназы на основе рентгеноструктурного анализа согласуется с исследованиями по сайт-направленному мутагенезу другого члена 32 семейства гликозидгидролаз, дрожжевой инвертазы.

Как известно, ферментативный гидролиз под воздействием гликозидгидролаз проходит по одному из двух основных механизмов, приводящих либо к сохранению, либо обращению аномерной конфигурации субстрата. Как у «сохраняющих», так и «инвертирующих» гликозидаз донор протона находится на расстоянии водородной связи от кислорода гидроксильного остатка при аномерном углероде гликозида. У «сохраняющих» ферментов нуклеофил-основание находится в непосредственной близости аномерного углерода сахара. Однако у «инвертирующих» гликозидаз нуклеофил расположен на большем расстоянии, что позволяет молекуле воды внедриться между каталитическим основанием и сахаром. Как следствие, было показано, что расстояния между каталитическими остатками в «сохраняющей» и «инвертирующей» гликозидгидролазе должны быть 5.5 и 10 Â, соответственно. Несмотря на то, что экзо-инулиназа принадлежит к «сохраняющим» гликозидгидролазам, расстояния между первого

остатка и О52 второго до Cl атома фруктозы несколько больше (3.19 и 3.26 А, соответственно), чем для обычных «сохраняющих» гликозидаз (приблизительно 3.0 А). Возможным объяснением этому может быть то, что положение и ориентация самой фруктозы, которая является конкурентным ингибитором и продуктом реакции экзо-инулиназы, может несколько отличаться от ориентации естественного субстрата инулиназы (полифруктана или сахарозы).

выводы

• Инулиназа, выделенная нами из мицелиального гриба A. awamori, является экзо-действующей гликозидгидролазой, способной расщеплять как Р-2,1-, так и Р-2,6-фруктозильные связи поли- и олигофруктанов. Фермент состоит из единичной полипептидной цепи и имеет мол.м. 72 ± 1 кДа.

• Анализ значений каталитической эффективности (к,1/Км) гидролиза инулоолигосахаридов (с.п. 2 - 7), катализируемого экзо-инулиназой, и констант ингибирования фруктоолигосахаридами гидролиза сахарозы показал наличие пяти субсайтов связывания мономерных единиц субстрата в активном центре фермента.

• Экзо-инулиназа не обладает трансгликозилирующей способностью в условиях максимально достижимых концентраций субстрата.

• На основании анализа аминокислотной последовательности экзо-инулиназы и трехмерной структуры комплекса экзо-инулиназы с фруктозой фермент классифицирован как представитель 32 семейства

гликозидгидролаз, содержащий каталитически важные остатки: Asp 41 (нуклеофил) и Glu 241 (кислотно-основной катализатор).

Молекула белка состоит из двух доменов, представляющих собой N-концевой каталитический домен в форме пятилопастного 3-пропеллера и С-концевой домен в форме Р-сэндвича. Расстояние между гидроксильными группами каталитических остатков Asp 41 и Glu 241 характерно для «сохраняющих конфигурацию при аномерном углероде» гликозидаз.

• Пять сайтов N-гликозилирования соответствуют аспарагиновым остаткам Asn67, Asn 111, Asn300, Asn398 и Asn 430.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. М Arand, AM Goiubev, JR Brandao Neto, I Polikarpov, R Wattiez, OS Koineeva, E V Eneyskaya, A.A. Kulminskaya, К A Shabalin, S M Shishliannikov, О V Chepurnaya and KN Neustroev (2002) Purification, characterisation, gene cloning, and preliminary X-ray data of the exo-inulinase from Aspergillus awamon, Biochem J 362(1) 131-135

2 Kulminskaya, AA, Arand, M , Eneyskaya, E V , Ivanen, D R, Shabalin, К А, Shishlyannikov, S M , Saveliev, A N , Korneeva, О S, and Neustroev, К N (2003) Hydrolytic activity and substrate binding characteristics of Aspergillus awamon exoinulinase Biochim Biophys Acta, 1650 22-29

3 Nagem RAP, Rojas AL, Goiubev AM, Korneeva OS, Eneyskaya EV, Kulminskaya A.A , Neustroev К N and Pohkarpov I 2004 Crystal Structure of exoinulinase from Aspergillus awamon The Enzyme Fold and Structural Determinants of Substrate Recognition J Mol Biol 344 471-480

Благодарность. Я хочу выразить особую признательность и огромную благодарность своему научному руководителю, к.б.н. Кириллу Николаевичу Неустроеву за бесценный опыт, переданный мне в процессе научных исследований, и чуткое наставничество.

Я выражаю благодарность всем сотрудникам лаборатории энзимологии отделения молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ РАН за поддержку, помощь в работе над диссертацией и полезное обсуждение результатов. Особенно хочу поблагодарить к.б.н. Савельева А Н. за критический анализ подготовленной диссертации и ценные замечания.

Я приношу благодарность нашим заграничным коллегам д-ру М. Аранду (М. Arand), Германия, и И. Поликарпову (I. Polikarpov), Бразилия, за плодотворное сотрудничество по теме данной работы, полезное обсуждение результатов и содействие в подготовке публикаций.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 03-04-48756,03-04-49741).

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 438, тир. 70, уч-изд. л. 1,3; 7.12.2004 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кульминская, Анна Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Основные положения, выносимые на защиту

1.4. Научная новизна полученных результатов

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Фруктаны.

2.1.1. Природные источники, функции и строение фруктанов.

2.1.2. Инулин - распространение в природе, строение, свойства, 15 биологическая роль и применение.

2.2. Микробные инулиназы.

2.3. Современные представления о классификации 19 гликозидгидролаз.

2.4. Каталитические механизмы действия гликозидгидролаз.

2.5. Построение субсайтной модели активного центра экзо- 27 действующих гликозидгидролаз.

2.6. Микробные экзо-инулиназы: исследования механизма реакции

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Условия роста культуры и выделение экзо-инулиназы.

3.2. Субстраты.

3.3. Общие методы.

3.4. Анализ N-концевой и внутренних фрагментов аминокислотной 36 последовательности.

3.5. Измерение активности экзо-инулиназы.

3.6. Методы анализа каталитических свойств инулиназы.

3.7. Методы анализа кинетических параметров реакций гидролиза 39 экзо-инулиназой.

3.8. Методы определения аффинностей субсайтов активного центра 40 фермента.

3.9. Определение констант ингибирования фруктоолигосахаридами 41 реакции гидролиза сахарозы.

3.10. Методы исследования трансгликозилирующей активности экзо- 42 инулиназы.

3.11. 'Н-ЯМР-спектроскопия продуктов гидролиза инулина.

3.12. Выделение нуклеиновых кислот и клонирование инулиназного 44 гена и кДНК методом ПЦР.

3.12.1. Выделение РНК из A. awamori

3.12.2. Выделение ДНК A. awamori

3.12.3. Получение кДНК гена A. awamori

3.12.4. ПЦР

3.12.5. Обратная ПЦР

3.13. Кристаллизация белка и сбор рентгеноструктурных данных 47 4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Выделение и физико-химические характеристики экзо- 51 инулиназы.

4.2. Характер действия экзо-инулиназы.

4.3. Кинетические параметры гидролиза различных субстратов экзо- 57 инулиназой.

4.4. Определение констант ингибирования реакции гидролиза 61 сахарозы фруктоолигосахаридами.

4.5. Исследование трансгликозилирующей активности экзо- 63 инулиназы.

4.6. Анализ гена и кДНК экзо-инулиназы.

4.7. Исследование углеводного компонента экзо-инулиназы и его 66 влияние на кристаллизацию.

4.8. Построение исходной модели и уточнение трехмерной 66 структуры экзо-инулиназы

5. ОБСУЖДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экзо-инулиназа из Aspergillus awamori 2250"

Одним из наиболее перспективных направлений развития биотехнологии является использование биологических катализаторов химических реакций - ферментов. Это направление предполагает применение как очищенных природных ферментов, так и их рекомбинантных аналогов, свойства которых в настоящее время могут быть модифицированы в нужном направлении при помощи генноинженерных подходов, В современной промышленности используются различные ферменты, в том числе гидролазы, обеспечивающие реакции расщепления различных субстратов до мономеров. Среди гидролаз гликозидгидролазы (гликозидазы, К.Ф. 3.2.1.-) являются одной из самых широко применяемых и изучаемых групп ферментов. Эти ферменты катализируют расщепление гликозидных связей между двумя сахаридными остатками или углеводным и агликоновым компонентами. Одной из причин пристального внимания к этой группе ферментов является то, что гликозидазы оказались чрезвычайно эффективным инструментом энзиматического синтеза многих биологически значимых гликозидов, олигосахаридов и гликоконьюгатов. Такое их применение основано на том факте, что некоторые гидролазы способны обращать при определенных условиях реакции гидролиза в направлении формирования новых гликозидных связей. На сегодняшний день описано более сотни различных экзогликозидаз (действующих на концевые углеводные остатки олиго- и полисахаридов), выделенных из широкого круга организмов и успешно примененных в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ. Ферментативный синтез имеет значительные преимущества перед традиционными методами органического синтеза, так как позволяет получать необходимые соединения практически в одну стадию и без проведения реакций блокирования и деблокирования реакционноспособных групп. Кроме того, при использовании реакций ферментативного синтеза удается получать строго определенные стереоизомеры с высоким выходом продуктов. Поэтому получение данных о взаимосвязи строения активных центров этих ферментов и их способности к проведению трансгликозилирующей реакции, несомненно, важно, т.к. не только дает возможность эффективно использовать траснгликозидазы в энзиматическом синтезе, но и позволяет получить новую информацию о механизме действия карбогидраз в целом.

Эффективное применение гликозидаз требует тщательного изучения их свойств и как белков, и как ферментов, а также знаний первичной структуры и строения соответствующих генов. Полная совокупность фундаментальных знаний о каждом конкретном ферменте позволяет целенаправленно изменять его структуру и свойства в соответствие с производственными задачами. Среди гликозидаз выделяется группа микробных инулиназ, которые являются важными промышленными ферментами. Среди многочисленных известных источников8 микроорганизмов наибольшее предпочтение в настоящее время отдается мицелиальным грибам рода Aspergillus, Penicillium и дрожжам Kluyveromyces. Но несмотря на то, что микробные инулиназы довольно подробно охарактеризованы, до сих пор не была установлена трехмерная структура этих ферментов и субсайтная организация их активных центров. До настоящего времени не была описаны реакции обращения гидролиза (трансгликозилирования) инулиназами, выделяемыми из грибных источников. В данной работе мы подробно охарактеризовали ферментативные свойства экзо-инулиназы из Aspergillus awamori вар. 2250, показали и установили взаимосвязь между ее структурными особенностями и каталитическими свойствами.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кульминская, Анна Алексеевна

7. ВЫВОДЫ

• Инулиназа, выделенная нами из мицелиального гриба A. awamori, является экзо-действующей гликозидгидролазой, способной расщеплять как (5-2,1-, так и [3-2,6-фруктозильные связи поли- и олигофруктанов. Фермент состоит из единичной полипептидной цепи и имеет мол.м. 72 ± 1 кДа.

• Анализ значений каталитической эффективности (кса1/Км) гидролиза инулоолигосахаридов (с.п. 2 — 7), катализируемого экзо-инулиназой, и констант ингибирования фруктоолигосахаридами гидролиза сахарозы показал наличие пяти субсайтов связывания мономерных единиц субстрата в активном центре фермента.

• Экзо-инулиназа не обладает трансгликозилирующей способностью в условиях максимально достижимых концентраций субстрата.

• На основании анализа аминокислотной последовательности экзо-инулиназы и трехмерной структуры комплекса экзо-инулиназы с фруктозой фермент классифицирован как представитель 32 семейства гликозидгидролаз, содержащий каталитически важные остатки: Asp 41 (нуклеофил) и Glu 241 (кислотно-основной катализатор).

• Молекула белка состоит из двух доменов, представляющих собой N-концевой каталитический домен в форме пятилопастного р-пропеллера и С-концевой домен в форме Р-сэндвича. Расстояние между гидроксильными группами каталитических остатков Asp 41 и Glu 241 характерно для «сохраняющих конфигурацию при аномерном углероде» гликозидаз.

• Пять сайтов N-гликозилирования соответствуют аспарагиновым остаткам Asn 67, Asn 111, Asn 300, Asn 398 и Asn 430.

8. Список опубликованных по теме работ

1. М. Arand, A.M. Golubev, J.R. Brandao Ncto, I. Polikarpov, R. Wattiez, O.S. Korneeva, E.V. Eneyskaya, A.A. Kulminskaya, K.A. Shabalin, S.M. Shishliannikov, O.V. Chepurnaya and K.N. Neustroev (2002) Purification, characterisation, gene cloning, and preliminary X-ray data of the exo-inulinase from Aspergillus awamori, Biochem J. 362( 1): 131-135.

2. Kulminskaya, A.A., Arand, M., Eneyskaya, E.V., Ivanen, D.R., Shabalin, K.A., Shishlyannikov, S.M., Saveliev, A.N., Korneeva, O.S., and Neustroev, K.N. (2003) Hydrolytic activity and substrate binding characteristics of Aspergillus awamori exoinulinase. Biochim. Biophys. Acta, 1650: 22-29.

3. Nagem R.A.P., Rojas A.L., Golubev A.M., Korneeva O.S., Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A., Neustroev K.N. and Polikarpov 1.2004. Crystal Structure of exo-Inulinase from Aspergillus awamori: The Enzyme Fold and Structural Determinants of Substrate Recognition. J. Mol. Biol. 344: 471480. Ф

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе была выделена и очищена до гомогенного состояния секретируемая экзо-инулиназа из мицелиального гриба Aspergillus awamori вар. 2250. Были изучены физико-химические и биохимические характеристики фермента, катализирующего гидролиз полимерных и олигомерных фруктанов, фруктозильные остатки которых связаны как Р-2,1 -, так и р-2,6-связями. Двумя независимыми экспериментами, а именно с использованием анализа продуктов реакции методом ВЭЖХ и прямым наблюдением за ходом реакции методом ЯМР спектроскопией, показано, что инулиназа является экзо-действующей гликозидгидролазой. Анализ аминокислотной последовательности экзо-инулиназы из Aspergillus awsmori выявил почти 91%-ную гомологию белка с фруктозилтрансферазой из Aspergillus foetidus и позволил отнести ее к 32 семейству гликозидгилдролаз по классификации Хенрисата. Представители этого семейства проводят катализ по механизму двойного замещения и, следовательно, могут обладать трансгликозилирующими свойствами. Однако для экзо-инулиназы из Aspergilus awamori продукты реакции трансгликозилирования не были обнаружены ни одним из методов в условиях насыщающей концентрации субстрата. Возможно, это связано с недостаточной растворимостью субстратов для инициирования реакции трансгликозилирования.

В данной работе впервые для гликозидгидролаз из 32 семейства было оценено количество фруктозил-связывающих субсайтов в активном центре фермента и рассчитаны свободные энергии связывания в каждом субсайте с использованием каталитических эффективностей по методу Хироми. Наличие пяти субстрат-связывающих субсайтов в активном центре экзо-инулиназы было подтверждено данными анализа конкурентного ингибирования гидролиза сахарозы инуло- и леваноолигосахаридами.

В ряде экспериментов было показано, что экзо-инулиназа из Aspergillus awamori является N-гликопротеином. Пять сайтов гликозилирования в обеих кристаллических формах фермента расположены на аспарагиновых остатках Asn 67, Asn 111, Asn 300, Asn 398 и Asn 430 и отличаются длиной и разветвленностью олигосахаридных структур на поверхности белка, что влияет на его кристаллизацию. Впервые полученная кристаллографическая трехмерная модель экзо-инулиназы показала, что молекула белка состоит из двух доменов: N-концевого каталитического домена, который имеет укладку пятилопастного p-пропеллера, и С-концевого домена со структурой <ф-сэндвич». Данные рентгеноструктурного анализа позволили локализовать каталитические аминокислотные остатки (Asp 41 и Glu 241). Расстояние между гидроксильными группами каталитических остатков оказалось характерным для гликозидаз, сохраняющих аномерную конфигурацию связи.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кульминская, Анна Алексеевна, Санкт-Петербург

1. Abrahams J.P., Leslie A.G.W. 1996. Methods used in the structure determination of bovine mitochondrial F-l ATPase. Acta Cryst. D52: 30-42.

2. Albreht G., Mustroph A., Fox T.C. 2004. Sugar and fructan accumulation during metabolic adjustment between respiration and fermentation under low oxygen conditions in wheat roots. Physiol. Plant. 120: 93-105.

3. Allard G., Nelson С J. 1991. Photosynthate partitioning in bazal zones of tallfescue leaf blades. Plant Physiology. 95: 663-668.к

4. Bagiyan F.G., Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A., Savel'ev A.N., Shabalin K.A., Neustroev K.N. 1997. The action of a-mannosidase from Oerskovia sp.on the mannose-rich 0-Iinked sugar chains of glycoproteins. Eur.J.Biochem. 249: 286-292.

5. Batista F.R., Hernandez L., Fernandez J.R., Arrieta J., Menendez C., Gomez

6. R., Tambara Y., Pons, T. 1999. Substitution of Asp-309 by Asn in the Arg-Asp-Pro (RDP) motif of Acetobacter diazotrophicus levansucrase affects sucrose hydrolysis, but not enzyme specificity. Biochem. J. 337: 503-506.

7. Baumgartner S., Praznik W. 1995. Purification of exo- and endoinulinase from crude inulinase extract for the analysis of fructans. Int. J. Biol. Macromol. 17:247-250.

8. Baumgartner S., Dax, T.G., Praznik, W., Falk, H. 2000. Characterization of the high-molecular weight fructan isolated from garlic {Allium sativum L) carbohydr. Res. 328: 177-312.

9. Blessing R.H., Smith, G.D. 1999. Difference structure-factor normalization for heavy-atom or anomalous-scattering substructure determinations. J. Appl. Cryst. 32: 664-670.

10. Bruss M.L., Black, A.L. 1978. Enzymatic microdetermination of glycogen. Anal. Biochem. 84: 309-312.

11. Burne R.A., Penders J.E.C. 1992. Characterization of Streptococcus mutans GS-5 fruA gene encoding exo-p-fructosidase. Infect. Immun. 60: 4621-4632.

12. Cairns A.J., Nash R., Machado de Carvalho M.A., Sims I.M. 1999. Characterization of the enzymatic polymerization of 2,6-linked fructan byleaf exracts from timothy grass (Phleum pratense). New Physiologist. 142: 79-91.

13. Chavez F. P., Pons Т., Delgado J. M., Rodriguez L. 1998. Isolation and sequence analysis of the orotidine-5'-phosphate decarboxylase gene (URA3) of Candida utilis. Comparison with the OMP decarboxylase gene family. Yeast. 14: 1223-1232.

14. Chomczynski P., Sacchi, N. 1986. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159.

15. Collaborative Computational Project, Number 4. 1994. "The CCP4 Suite: Programms for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50: 760-763.

16. Coutinho P.M., Henrissat B. 2000. Carbohydrate-Active Enzymes server. (http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/db.html).

17. Crowe J.H., Oliver A.E., Hoekstra F.A., Crowe L.M. 1997. Stabilization of dry membranes by mixtures of hydroxyethyl starch and glucose: the role of vitrification. Cryobiology. 35: 20-30.

18. Dauter Z., Dauter, M., Rajashankar, K.R. 2000. Novel approach to phasing proteins: derivatization by short cryo-soaking with halides. Acta. Cryst. D56: 232-237.

19. Davidson M.H., Maki K.C. 1999. Effects of dietary inulin on serum lipids. 129: 1474-1477.

20. Davies G.J., Henrissat B. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3: 853-859.

21. Davies G.J., Wilson K.S., Henrissat B. 1997. Nomenclature for sugar-binding subsites in glycoside hydrolases, Biochem. J. 321: 557-559.

22. Delzenne N.M., Kok N. 2001. Effects of fructans-type prebiotics on lipid metabolism. Am J Clin Nutr. 73: 456S-458S.

23. Edelman J., Jefford T.G. 1964. The metabolism of fructose polymers in plants. 4. Beta-fructofuranosidases of tubers of Helianthus tuberosus L. Biochem J. 93: 148.

24. Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A., Savel'ev A.N., Shabalin K.A., Golubev A.M., Neustroev K.N. 1998. a-Mannosidase from Trichoderma reesei participates in the postsecretory deglycosylation of glycoproteins. Biochem. Biophys. Res. Comm. 245: 43-49.

25. Enzyme Nomenclature. Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of Enzymes. San Diego: Academic Press; 1992. 862 p.

26. Evans, P.R. 1997. Scaling of MAD Data in Proceedings of CCP4 Study Weekend on Recent Advances in Phasing (Wilson, K.S., Davies, G., Ashton, A.W., Bailey, S. eds), pp. 97-102, CCLRC Daresbury Laboratory, Warrington.

27. Granger C. 2000. A sweeter deal that expected from transgenic sugar beets. Plant Res. News. ISB News Report. Feb. 2000.

28. Grizard D., Barthomeuf C. 1999. Non-digestible oligosaccharides used as prebiotic agents: mode of production and beneficial effects on animal and human health. Reprod. Nutr. Dev. 39: 563-588.

29. Gunasekaran P., Karunakaran Т., Cami В., Mukundan A.G., Preziosi L., Baratti J. 1990. Cloning and sequencing of the sacA gene: characterization of a sucrase from Zymomonas mobilis. J. Bacteriol. 172: 6727-35.

30. Gupta A.K., Singh D.P., Kaur N., Singh, R. 1994. Production, purification and immobilization of inulinases from Kluyveromyces fragilis. J. Chem. Technol. Biotechnol. 59: 377-385.

31. Han Y.W. 1990. Microbial levan. Adv. Appl. Microbiol. 35: 171-194.

32. Hammer H., Morgenlie S. 1990. Classification of grass fructans by 13C NMR spectroscopy. Acta Chcrn. Scand. 44: 158-160.

33. Henikoff S., Henikoff J.G. 1991. Automated assembly of protein blocks for database searching. Nucleic. Acids. Res. 19: 6565-6572.

34. Henry G. 1993. Evolutionary origins and natural functions of fructans: climatological, biogeoegraohic and mechanistic appraisal. New Phytol. 123: 3-14.

35. Henrissat B. 1991. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280: 309-316.

36. Hincha D.K., Zuther E., Hellwege E.M., Heyer A.G. 2002. Specific effects of fructo- and gluco-oligosaccharides in the preservation of liposomes during drying. Glycobiology. 12: 103-110.

37. Hiromi, K. 1970. Interpretation of dependency of rate parameters on the degree of polymerization of substrate in enzyme-catalyzed reactions. Evaluation of subsite affinities of exo-enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 40: 1-6.

38. Hiromi K., Nitta Y., Numata C., Ono S. 1973. Subsite affinities of glucoamylase: examination of the validity of the subsite theory. Biochim. Biophys. Acta. 302: 362-375.

39. Jacobson R.H., Kuroki R., Weaver L.H., Zhang X.-J., Matthews B.W. In: Saddler J.N., Penner M.H. (Eds.), Enzymatic degradation of insoluble carbohydrates, ACS Symposium Series, Vol. 618, American Chemical Society, Washington, 1995, p. 38.

40. Jacobson R.H., Zhang X.-J., DuBose R.F., Matthews B.W. 1994. Three-dimensional structure of P-galactosidase from E. coli. Nature. 369: 761-766.

41. Jones T.A., Zou J.Y., Cowan S.W., Kjeldgaard M. 1991. Improved methods for building protein models in electron-density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst. A47: 110-119.

42. Kimura A., Takewaki S., Matsui H., Kubota M., Chiba S. 1990. Allosteric properties, substrate specificity, and subsite affinities of honeybee a-glucosidase I. J. Biochem. 107: 762-768.

43. Koshland D.E. 1953. Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions. Biol. Revs. Cambridge. Phil. Soc. 28: 416-436.

44. Krusse H.P., Kleessen В., Blaut M. 1999. Effects of inulin on faecal bifidobacteria in human subjects. Br. J. Nutr. 82: 375-382.

45. Kulminskaya, A.A., Eneyskaya, E.V., Isaeva-Ivanova, L.S., Shabalin, K.A., SavePev, A.N., Backinowsky, L.V., Abronina, P.I., and Neustroev, K.N. 1998. Enzymatic properties of a-mannosidase from Trichoderma reesei.

46. Protein and Peptide Lett. 5: 163-170.97

47. Kwon H.J., Jeon S.J., You D.J., Kim K.H., Kim Y.M., Kim B.W. 2003. Cloning and characterization of an exoinulinase from Bacillus polymyxa. Biotechnol. Lett. 25: 155-159.

48. Laemmli U.K. 1970. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

49. La Fortelle E., de Bricogne G. 1997. Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods. Enzymol. 276: 472-494.

50. Laloux О., Cassart J.P., Delcour J., van Beeumen J., Vandenhaute J. 1991. Clonine and seauencina of the inulinase sene of Kluweromvces marxianus1. W A K^r W * „var. marxianus ATCC 12424. FEBS Lett. 289: 64-68.

51. Leslie, A.G.W. 1992. Recent changes to the MOSFLM package for processing film and image plate data. Joint CCP4 and ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography (SERC Laboratory, Daresbury, Warrington WA 4AD), N.26, England.

52. Loesche W.J. 1986. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol. Rev. 50: 353-380.

53. Lo Leggio L., Pickersgill R.W. 1999. Xylanase-oligosaccharide interactions studied by a competitive enzyme assay. Enzyme Microbiol. Technol. 25: 701-709.

54. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. 1951. Protein measurements with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.

55. Ly H.D., Withers S.G. 1999. Mutagenesis of glycosidases. Annu. Rev. Biochem. 68: 487-522.

56. Matthews B.W. 1968. Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol. 33: 491-497.

57. McCarter J.D., Withers S.G. 1994. Mechanisms of enzymatic glycosidase hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 885-892.

58. Meng G., Futterer K. 2003. Structural framework of fructosyl transfer in Bacillus subtilis levansucrase. Nat. Struct. Biol. 10: 935-941.

59. Menne E., Guggenbuhl N., Roberfroid M. 2000. Fn-type chicory inulin hydrolysate has a prebiotic effect in humans. J. Nutr. 130: 1197-1199.

60. Murshudov G.N., Vagin A. A., Dodson, E.J. 1997. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Cryst. D53: 240-255.

61. Nagem R.A.P., Dauter Z., Polikarpov, I. 2001. Protein crystal structure solution by fast incorporation of negatively and positively charged anomalous scatterers. Acta. Cryst. D57: 996-1002.

62. Nagem R.A.P., Polikarpov I., Dauter, Z. 2003. Phasing on rapidly soaked ions. Methods. Enzymol. 374: 120-137.

63. Pandey A., Soccol C.R., Selvakumar P., Soccol V.T., Krieger N., Fontana J.D. 1999. Recent developments in microbial inulinases. Its production, properties, and industrial applications. Appl. Biochem. Biotechnol. 81: 3552.

64. Pavis N., Boucand J., Prud'homme M.P. 2001. Fructans and fructan-metabolizing enzymes in leaves of Lolium perenne. New Physiol. 150: 97109.

65. Perrakis A., Morris R., Lamzin V.S. 1999. Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nat. Struct. Biol. 6: 458-463.

66. Pessoni R.A.B., Figueredo-Ribeiro R.C.L., Braga M.R. 1999. Extracellular inulinase from Penicillum ianczemskii, fungus isolated from the rhizosphere of Vernonia herbaceae. J. Appl. Microbiol. 87:141-147.

67. Polikarpov I., Teplyakov A., Oliva, G. 1997. The ultimate wavelength for protein crystallography. Acta Cryst. D. 53: 734-737.

68. PoIikarpov I., Oliva G., Castellano E.E., Garratt R.C., Arruda P., Leite A., Graievich A. 1998. Protein crystallography station at LNLS, The Brazilian National Synchrotron Light Source. Nucl. Instrum. Meth. A 405: 159-164.

69. Pollock C.J., Cairns A.J. 1991. Fructan metabolism in grasses and cereals. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 77-101.

70. Pons Т., Hernandez L., Batista F.R., Chinea G. 2000. Prediction of a common beta-propeller catalytic domain for fructosyltransferases of different origin and substrate specificity. Protein Sci. 9: 2285-2291.

71. Raeder U., Broda, P. 1985 Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett. Appl. Microbiol. 1: 17-20.

72. Reddy V.A., Maley F. 1990. Identification of an active-site residue in yeast invertase by affinity labeling and site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem. 265: 10817-10820.

73. Reddy A., MacColl R., Maley F. 1990. Effect of oligosaccharides and chloride on the oligomeric structures of external, internal, and deglycosylated invertase. Biochemistry. 29: 2482-2487.

74. Reddy A., Maley F. 1996. Studies on identifying the catalytic role of Glu204 in the active site of yeast invertase. J. Biol. Chem. 271: 13953-13957.

75. Rehm J., Willmitzer L., Heyer A.G. 1998. Production of 1-kestose in transgenic yeast expressing a fructosyltransferase from Aspergillus foetidus. J. Bacteriol. 180: 1305-1310.

76. Roberfroid MB. 2000. Chicory fructooligosaccharides and the gastrointestinal tract. Nutrition. 16: 677-679.

77. Rutherford P.P., Deacon A.C. 1972. P-Fructofuranosidases from roots of dandelion (Taraxacum officinale Weber). 126: 569-573.

78. Rye C.S., Withers S.G. 2000. Glycosidase mechanisms. Curr. Opin. Chem Biol. 4: 573-580.

79. Savel'ev A.N., Eneyskaya E.V., Isaeva-Ivanova L.S., Shabalin K.A., Golubev A.M., Neustroev K.N. 1997. The carbohydrate moiety of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Glyconj. J. 14: 897-905.

80. Sinnott M.L. 1990. Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer. Chem. Rev. 90: 1171-1202.

81. Shabalin K.A., Kulminskaya A.A., Savel'ev A.N., Shishlyannikov S.M., Neustroev K.N. 2002. Enzymatic properties of a-galactosidase from Trichoderma reesei in the hydrolysis of galactooligosaccharides. Enzyme and Microb. Technol. 30: 231-239.

82. Somogyi M. 1952 Notes on sugar determination. J. Biol. Chem. 195: 19-23.

83. Song D.D., Jacques N.A. 1999. Mutation of aspartic acid residues in the fructosyltransferase of Streptococcus salivarius ATCC 25975. Biochem. J. 344: 259-264.

84. Sprenger N., Bortlik K., Brandt A., Boiler Т., Wiemken A. 1995. Purification, cloning, and functional expression of sucrose: fructan 6-fructosyltransferase, a key enzyme of fructan synthesis in barley. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 11652-11656.

85. Subbs H.J., Brasch D.J., Emerson G.W., Sullivan P.A. 1999. Hydrolase and transferase activities of the P-l,3-exoglucanase of Candida albicans, Eur. J. Biochem. 263: 889-895.

86. Szambelan K., Nowak J., Czarnecki Z. 2004. Use of Zymomonas mobilis and Saccharamyces cerevisiae mixed with Kluyveromyces fragilis for improved ethanol production from Jerusalem artichoke tubers. Biotechnol. Lett. 26: 845-848.

87. Takahashi N., Mizuno F., Takamori K. 1985. Purification and preliminary characterization of exo-P-D-fructosidase in Streptococcus salivarius KTA-19. Infect. Immun. 47: 271-276.

88. Taper H.S., Roberfroid M. 1999. Influence of inulin and oligofructose on breast cancer and tumor growth. J.Nutr. 129: 1488-1491.

89. Taper H.S., Roberfroid M. 2000. Nontoxic potentiation of cancer chemotherapy by dietary oligofructose or inulin. Nutr. Cancer. 38: 1-5.

90. Tarentino A.L., Maley, F. 1974. Purification and properties of an endo-P-N-acetylglucosaminidase from Streptomyces griseus. J. Biol. Chem. 249:811-817.

91. Tsujimoto Y., Watanabe A., Nakano K., Watanabe K., Matsui H.,

92. Tsuji K., Tsukihara Т., Suzuki Y. 2003. Gene cloning, expression, and104crystallization of a thermostable exo-inulinase from geobacillus stearothermophilus KP1289. Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 180-185.

93. Uhm T.B., Chae K.-S., Lee D.W., Kim H.-S., Cassart J.-P., Vandenhaute J. 1998. Cloning and nucleotide sequence of the endoinulinase-encoding gene, inu2, from Aspergillus ficuum. Biotechnol. Lett. 20: 809-812.

94. Uhm T.B.,Chung M.S., Lee S.H., Gourrong F., Housen I., Kim J.H., van Beeumen J., Haye В., Vandenhaute J. 1999. Purification and characterization of Aspergillus ficuum endoinulinase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63: 146-151.

95. Vandamme E.J., Derycke D.G. 1983. Microbial inulinases: fermentation process, properties, and applications. Adv. Appl. Microbiol. 29: 139-176.

96. Vergauwen R., Van den Ende W, Van Laere A. 2000. The role of fructans in flowering of Campanula rapunculoides. J. Exp. Bot. 51: 12611266.

97. Wang Q., Trimbur D., Graham R., Warren R.A., Withers S.G. 1995. Identification of the acid/base catalyst in Agrobacterium faecalis beta-glucosidase by kinetic analysis of mutants. Biochemistry. 34: 14554-14562.

98. Warchol M., Perrin S., Grill, J.P., Schneider F. 2002. Characterization of a purified beta-fructofuranosidase from Bifidobacterium infantis ATCC 15697, Lett. Appl. Microbiol., 35: 462-467.

99. Waterhouse A.L., Calub T.M., French A.D. 1991.Conformational analysis of 1-kestose by molecular mechanics and by n.m.r. spectroscopy. Carbohydr Res. 217: 29-42.

100. Wattiez R., Hermans C., Cruyt C., Bernard A., Falmagne P. 2000. Human bronchoalveolar lavage fluid protein two-dimensional database:. study of interstitial lung diseases. Electrophoresis 21: 2703-2712.

101. Weeks C.M., Miller, R. 1999. The design and implementation of SnB version 2.0. J. Appl. Cryst 32: 120-124.

102. Wiemken A., Frencher M., Keller F., Wagner W. 1986. Fructan metabolism, enzymology and compartmentation. Curr. Top Plant Biochem. Physiol. 5: 17-37.

103. Williams R.S., Trumbly R.J., MacColl R., Trimble R.B., Maley F. 198. Comparative properties of amplified external and internal invertase from the yeast SUC2 gene. J. Biol. Chem. 260: 13334-13341.

104. Withers S.G., in S.B.Petersen, B. Svensson, S. Petersen (Eds.), Carbohydrate Bioengineering, Progress in Biotechnology, vol. 10, Elsevier, Amsterdam, 1995, p.9.

105. Yang J., Zhang J., Wang Z., Zhu Q., Liu L. 2004. Activities of fructan- and sucrose-metabolizing enzymes in wheat stems subjected to water stress during grain filling. Planta.29: электронная публикация.

106. Yazaki Т., Ohnishi M., Rokushika S., Okada G. 1997. Subsite structure of the P-glucosidase from Aspergillus niger, evaluated by steadystate kinetics with cello-oligosaccharides as substrates, Carbohydr. Res. 298: 51-57.

107. Zechel D.L., Withers S.G. 2000. Glycosidase mechanimsms: anatomy of a finely tuned catalysis. Acc. Chem. Res. 33: 11-18.

108. Zittan L. 1981. Enzymatic hydrolysis of inulin — an alternative way to fructose production. Starch. 33: 373-377.

109. Zhang L., Zhao C., Zhu D., Ohta Y., Wang Y. 2004. urification and characterization of inulinase from Aspergillus niger AF10 expressed in Pichiapastoris. Protein Expr. Purif. 35: 272-275.