Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к росту при щелочных условиях pH внешней среды

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к росту при щелочных условиях pH внешней среды"

005002663

Гусева Марина Александровна

Исследование механизмов адаптации дрожжей Уаггота Иро1уйса к росту при щелочных условиях рН внешней среды

03.01.04- Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 НОЯ 2011

У (Р

Москва-2011 ' Л/еДи

&

005002663

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») г. Казань

Научный руководитель

доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Шевелев Алексей Борисович

Топунов Алексей Федорович

кандидат химических наук кандидат биологических наук

Ведущая организация

Куликов Евгений Евгеньевич

Учреждение Российской академии наук институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля

Защита состоится « 2011 года в ^мин на

заседании диссертационного совета Д 212.154.17 при Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129164, г. Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корп.5, ауд. 506

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу: г. Москва, ул. М. Пироговская д. 1

Автореферат разослан «

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Холмогорова Н.В.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время экстремофильные дрожжи Yarrowia lipolytica рассматриваются в качестве одного из наиболее перспективных биотехнологических объектов. Они выступают и в качестве удобной клеточной модели при исследованиях механизмов апоптоза и клеточной дифференцировки. Y. lipolytica устойчива ко многим агрессивным органическим соединениям, способна быстро расти на органических субстратах самого различного биогенного и абиогенного происхождения, включая сточные воды, нефтяные парафины и ксенобиотики; обладает способностью к высокоэффективной секреции белков во внешнюю среду (до 10 г/л), что приближается к секреторному потенциалу метилотрофных дрожжей родов Pichia и Hansenula, она используется в качестве генетически исследованного и легко культивируемого аналога дрожжевого патогена человека и животных Candida albicans Перечисленные особенности привели к решению о необходимости расшифровки полной геномной последовательности Y. lipolytica. Эта работа была выполнена независимо двумя исследовательскими группами во Франции и США. Наличие доступной для анализа последовательности позволило использовать мощный и быстрый в использовании инструмент протеомики в качестве универсального средства для первичной идентификации белков, задействованных в реализации перечисленных важных особенностей Y. lipolytica. В частности, в 2007 г этим методом были идентифицированы некоторые белки Y. lipolytica. принимающие участие в диморфическом переходе. Однако, до настоящего времени эти исследования носят фрагментарный характер. Так в указанной работе 2007 г для облегчения выполнения эксперимента анализировались только водорастворимые клеточные белки, хотя важность компонентов мембран и клеточной стенки в процессе морфогенеза не вызывает сомнений.

Важной особенностью Y. lipolytica является уникальная для дрожжей способность не только без потерь выдерживать кратковременный щелочной стресс, но и эффективно расти на средах со щелочными значениями рН - вплоть до 10.5. Механизмы рН-адаптации Y. lipolytica начали активно изучать с 1997 года, когда был открыт многофункциональный регулятор транскрипции Rim 101. Гомолог RimlOlp

- белок РасС из нескольких видов мицелиальных аскомицетов, в частности, из Aspergillus nidulans обусловливает рН-зависимое переключение экспрессии генов щелочной и кислой протеаз, не оказывая влияния на рН-зависимую адаптацию роста гриба в целом. В качестве маркера адаптации секреторной системы Y. lipolytica к изменению рН внешней среды традиционно рассматривается ген XPR2 и его продукт АЕР

- субтилизиноподобная сериновая протеаза, обеспечивающая неспецифический протеолиз внеклеточных источников белка. АЕР является наиболее массовым секретируемым белком большинства штаммов Y. lipolytica, её ген послужил источником эндогенных элементов секреторного сортинга рекомбинатных белков.

Существует также гипотеза о том, что адаптация У. Иро1уНса к щелочным значениям рН обусловлена наличием двух независимых систем транспорта метаболитов через плазматическую мембрану. При этом при низких значениях рН работает преимущественно протон-зависимая система, характерная для большинства аскомицетов. При повышении рН среды до величин, превышающих рН цитоплазмы, рН которой «7.3, работа этого механизма становится невозможной из-за деполяризации мембраны. Однако, в случае У. Нро1уНса происходит его смена на Ыа+-зависимый симпорт.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение изменений протеома У. Иро1уНса, обусловливающих способность этого дрожжеподобного аскомицета к росту при щелочных значениях рН внешней среды.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи:

1. С использованием методов обратной генетики изучить влияние рН в сочетании с другими физиологическими факторами на регуляцию экспрессии наиболее существенной части секретома У. Иро1уИса -комплекса щелочных протеаз ХРЯ.

2. С использованием методов протеомики идентифицировать наиболее массовые белки У. \ipolytica, накапливающиеся в культуре при росте на средах со щелочным значением рН.

3. С использованием метода ПЦР в реальном времени исследовать физиологические факторы, влияющие на экспрессию кандидатных генов рН-адаптации.

Научная новизна работы. Впервые получены данные о регуляции экспрессии ранее не изученных генов щелочной протеазы У. Нро1уНса помимо ХРИ2, в том числе, в ответ на изменения рН. На этом примере высказано предположение, что повышение рН снижает физиологическую чувствительность У. Иро1увса к ионам фосфата во внешней среде.

Идентифицировано 7 белков, содержание которых в клетках У. Иро1уНса существенно возрастает относительно других при увеличении рН внешней среды с 4.0 до 8.5. Все они представляют собой компоненты митохондрий: ферменты матрикса, порины внешней мембраны, компоненты дыхательной цепи, белки защиты от окислительного стресса и шапероны. Таким образом, можно говорить о том, что адаптация У. Иро1уНса к высоким значения рН внешней среды опосредуется интенсификацией работы митохондрий.

Практическая значимость работы. Биотехнологическая значимость работы обусловлена возможностью использования обнаруженных сильных индуцибельных промоторов У. Иро1уНса для конструирования универсальных экспрессионных систем.

Идентифицированный нами промотор гена а-кетоглутаратдегидрогеназы, по-видимому, является одним из самых сильных в клетках У. Иро1уИса, растущих при высоких значениях рН среды. Это делает его перспективным элементом для разработки системы экспрессии гетерологичных генов в У. \ipdlytica. Природная

-4-

суперпродукция а-кетоглутаратдегидрогеназы может быть использована для получения а-кетоглутарата, промышленной очистки самого фермента, при разработке штаммов-продуцентов различных метаболитов, имеющих в качестве исходного соединения а-кетоглутарат или глутамат.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на следующих научных конференциях: Всероссийская конференция молодых учёных и II школа им. H. М. Эммануэля. Москва, 2006; IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008; Конференция, посвященная 90-летию Московской академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина. Москва 2009.

Диссертационная работа была доложена на заседании отдела нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» 15 июня 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных издания, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включая 23 рисунка и 10 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 191 источник.

Материалы и методы

В работе использован штамм У. lipolytica P01f(MatA, leu2-270, ura3-302, хрг2-322, ахр-2), полученный из коллекции типовых штаммов CIRM-Levures (Франция), где он депонирован под номером CLIB-724. Фенотипическими проявлениями имеющихся в штамме мутаций (отличающих его от дикого типа) является неспособность расти на средах, не содержащих лейцина и урацила, а также способность утилизировать сахарозу. Поддержание штаммов, отбор трансформантов и физиологические эксперименты выполняли на синтетической среде YNB следующего состава (г/л): MgS04, - 0.5, (NH4)2S04 - 0.3, КН2Р04- 2, К2НР04 - 0.5, NaCl - 0.1, СаС12- 0.05, глюкоза - 20, агар - 20, КОН или H2S04 - по показаниям рН-метра. В среде присутствовали также добавки: микроэлементы (мг/мл): KI 0.2; CuS04x5H20 0.08; MnS040.08; FeCl3x6H20 0.4; Na2Mo04x2H20 0.4; ZnS04x7H20 0.08; H3B03 1; биотин 0.02 мкг/мл; фолиевая кислота 0.02; витамины (мг/мл): пантотенат кальция 0.6; инозит 3; никотиновая кислота 0.6; пара-аминобензойная кислота 0.3; пиридоксин-НС1 0.6; рибофлавин 0.3; тиамин-НС1 0.15; аминокислоты и нуклеотиды (мкг/мл): лейцин 60; урацил 40. Физиологические эксперименты по культивированию и определению протеолитической активности штаммов проводили также на полноценной среде YP состава

-5-

(г/л): протеозный пептон (Б1Гсо) - 20, дрожжевой экстракт (Б1Гсо) - 10. Для поддержания рН и в качестве источника фосфата в части экспериментов вносили дополнительно 10 мМ К-фосфатного буфера, рН 4.0, 6.8 или 8.5, а также экспериментально определяемые количества 1 М серной кислоты или КОН.

В качестве источника углерода и энергии в среды УИВ и УР вносили: глюкозу - 20 г/л или глицерин - 20 г/л. В качестве источника углерода и энергии и буфера для поддержания рН использовался также Тпв-сукцинат (рН 8.5-4.5) в диапазоне концентраций 50-500 мМ.

При проведении физиологических экспериментов засев проводили с использованием свежей посевной культуры (возрастом не более 20 часов), выращенной на среде с тем же рН, что и в основном эксперименте. Для определения протеолитической активности 1 мл культуры У. Нро1уНса немедленно по окончании ферментации осветляли центрифугированием на настольной центрифуге в течение 1 мн при 8000 об/мин. 10 мкл полученного таким образом фильтрата культуральной жидкости вносили в 100 мкл субстратной смеси (1% раствор лизоцима, свежеприготовленного на буферных растворах Трис-НС1 рН 7.5, 8.0 и 9.7). Определение остаточных пептидов в растворе после осаждения трихлоруксусной кислотой проводилось с помощью модифицированного метода Лоури с бицинхониновым реагентом. Единицу протеолитической активности определяли как количество фермента, вызывающего увеличение поглощения при 595 нм на 1 ОЕ в после инкубации с субстратом в течение 1 ч при 37°С.

Основное содержание работы

1. Изучение экспрессии множественных генов щелочной протеазы у Уагго^1а Иро1уНса

Щелочная протеаза АЕР (продукт гена ХРЯ) является наиболее массовым секреторным белком Г. Нро1уИса, продукция которого зависит от рН культивирования. Этот фермент имеет выраженный оптимум рН в щелочной области, поэтому его продукция при кислых рН среды не имеет физиологического смысла. Для утилизации внеклеточного белка при таких условиях У. Нро1уИса располагает геном аспартильной протеазы Ахр.

Экспрессия гена ХРЯ2 детально изучена: она регулируется рН внешней среды при участии многофункцонального транскрипционного активатора Шш101р. Кроме того, она подвержена катаболитной репрессии. Транскрипция гена ХРЯ2 возможна только при культивировании на средах, содержащих азот в форме пептидов, но не аммонийных солей, при оптимальной концентрации в среде глюкозы и минеральных компонентов. В частности, зависимость уровня продукции щелочной протеазы от содержания фосфата имеет характерную колоколообразную форму с выраженным максимумом.

Наряду с геном ХРЯ2, регуляция экспрессии которого тщательно изучалась, анализ недавно определенной последовательности генома типового штамма У. Нро1уНса С1ЛВ122 показывает наличие 11

функциональных копий генов щелочной протеазы (помимо дефектной копии ХРЯ2 в хромосоме Б). Опубликованных экспериментальных данных об их активности нет. Изучение этого вопроса методами энзимологии осложнено ожидаемым сходством ферментативных характеристик продуктов всех генов. Можно предполагать, что часть из них, будучи предназначена для выполнения однотипной функции с геном ХРЛ2, может обладать сходным типом регуляции экспрессии. Гены ХРЯ расположены в геноме У. \ipolytica в следующих локусах: Хр. А (УАЫ0А10208р; УАП0А08360р; УА1Л0А09262р), Хр. В (УАШВ22990р; УА1Л0В22880р; УА1Л0В19316р; Хр. С (УАЫ0С15532р; УАЫ0С20691р; Хр. О (УАЫ0Б02981р); Хр Е (УА1Л0Е28875р); Хромосома Б (УАЫ0П9646р, ДХРК2) (дефектный ген кодирующий продукт без сигнального пептида и части продомена).

Особенностью штамма У. \ipo\ytica РОИ, использованного в нашей работе, является дефект гена ХРЯ2, приводящий к его инактивации и, как следствие, сниженной общей протеазной активности. С целью изучения рН-зависимой регуляции генов щелочных протеаз У. Иро1уНса мы получили рекомбинантное производное штамма РОИ с вновь введенным в хромосому геном ХРК2 под контролем искусственно сконструированного промотора НР4(1. Для этого была использована интегративная конструкция рОЕ-Ш1АЗ-НР4с1-Хрг4ег, несущая маркер прототрофности ШАЗ (Рис. 1). Для введения в геном У. Про1уйса РОИ гена ХРЯ2 по контролем синтетического производного его природного промотора - НР4(1 была получена конструкция рОЕ-1ЖАЗ-НР4(]-ХРЕ (Рис. 1).

Psi (349)

\ ЕссШ (4089) Тхрг

£ccRI (1710)

„ BanHI (2295) Apd (2406)

XPR2

LEU2 fragment

Рисунок 1. Схема конструкции, использованной для введения гена ХРЯ2 под контролем синтетического промотора НР4(1 в штамм У. Нро1уНса РОИ

Для этого в состав вектора рОЕЗО (01а§еп) были введены маркер прототрофности иЯАЗ из У. \ipolytica, промотор НР4с1, ген ХРЯ2 из штамма Г. \ipolytica W29. Промотор НР4(1 был любезно предоставлен Т.Б. Юзбашевым. Для клонирования гена ХРИ2 были использованы специфические праймеры. Рекомбинантные клоны отбирали с помощью троекратного пассирования на минимальной среде, не содержащей урацила, после чего переносили на среду УР. Полученные трансформанты (5 независимых клонов) высевали на полноценные жидкие среды УР со следующими добавками: глюкоза, фосфата калия в концентрации 2, 5, 10, 25 и 50 мМ, рН 4.0, 6.8 и 8.5. После культивирования в течение 36 часов определяли уровень протеолитической активности в фильтрате культуральной среды. Буфер для проведения ферментативной реакции имел рН 8.5. Для увеличения корректности измерения для каждого образца определяли вклад в результат измерения пептидов среды. Для этого проводили полную инактивацию ферментативной активности образца прогреванием культуральной жидкости в течение 20 мин при 100°С, после чего использовали инахтивированный фильтрат культуральной среды в качестве холостой пробы.

Результаты эксперимента (Рис. 2) подтверждают выдвинутое предположение об однотипности механизма регуляции экспрессии гена ХРИ.2 и других наиболее активных генов щелочной протеазы У. Иро1уИса. Соотношение активностей щелочной протеазы при росте обоих штаммов в различных условиях оставалось практически неизменным. При этом общая протеолитическая активность штамма РО1 !"(НР4<3-ХРК.) несколько превышала активность родительского штамма РОИ.

Как и предполагалось, для обоих штаммов зависимость активности щелочной протеазы от концентрации фосфата в среде имела колоколообразный вид. Ожидаемым является и то, что активность щелочной протеазы оказывается низкой при кислых рН внешней среды и дерепрессируется при нейтральных и щелочных рН. Различия в максимальной величине активности при росте на нейтральном и щелочном рН (6.8 и 8.5) оказываются незначительными: 0.33 и 0.39 ед/мл для штамма РоН и 0.49 и 0.41 ед/мл для штамма Р01А(НР4с1-ХР11) соответственно. Однако, неожиданным результатом проведенного эксперимента является то, что при повышении рН среды максимум активности щелочной протеазы смещается в область более высокой концентрации фосфата. Для обоих штаммов он достигается при 2 мМ фосфата при рН 4.0, при 5 мМ фосфата при рН 6.8 и при 10 мМ фосфата при рН 8.5. Кроме того, при повышении концентрации фосфата сверх оптимального уровня наблюдается снижение измеряемого уровня активности протеазы. Это падение ярче выражено при кислых величинах рН внешней среды по сравнению со щелочными. В совокупности это позволяет сделать вывод о снижении чувствительности культуры к фосфату при повышении рН

-8-

внешней среды. Можно предполагать, что этот эффект обусловлен снижением эффективности транспорта фосфата в клетку при щелочных значениях рН. Этот глобальный гипотетический механизм хорошо объясняет параллелизм в регуляции экспрессии всех генов щелочных протеаз, как эндогенных, так и искусственно введенного под контролем полусинтетического промотора НР4ё, хотя эти гены практически не имеют сходства последовательности в промоторной области._

уровв иь продукции щелочной првтвазы штаммом Р01»

урово нь продукции

Уровень продукции щелочной протеазы штаммом РСЩНРДй-ХРГ*)

продукции

концентрация фосфата, мМ

Рисунок 2. Результаты определения протеолитической активности культуральной жидкости штаммов - производных РОИ на полноценных средах с различным содержанием неорганического фосфата при различном рН. Представленные данные получены в результате усреднения результатов пяти независимых экспериментов. Стандартная ошибка определения показана в виде интервала у каждого столбца диаграммы

2. Изучение механизмов адаптации Уаггоша Иро1уИса к росту при щелочных условиях методами протеомики

До начала эксперимента было высказано предположение, что наиболее массовым белком, отвечающим за адаптацию У. Иро1уНса к росту на среде с высоким значением рН, может являться Ыа+-зависимая АТФаза ^АА), обеспечивающая формирование ионного градиента для работы симпортёров. Для экспериментальной проверки этой гипотезы было проведено культивирование штамма Г. Иро1уйса РОИ на средах с различными значениями рН: 4.0, 6.0, 7.6 и 9.7. С целью перевода энергетического обмена У. Иро1уНса на полностью аэробный путь, исключающий брожение, эксперимент проводился на среде УКВ, где единственным источником углерода и энергии служил сукцинат.

Рисунок 3. Общий вид двумерной электрофореграммы, последовательно окрашенной Кумасси-11250 и азотнокислым серебром. Показан спектр белков биомассы

У. Иро1уНса РОИ,

выращенных при рН внешней среды: 4.0 (а), 8.5 (б). Расположение образцов, выбранных для идентификации с

помощью МАЬВ1-ТОР, показано стрелками с номерами. Нумерация белков унифицирована с таблицей и рисунком 2

Биомасса обоих штаммов, выращенная на средах с 6 различными значениями рН, была подвергнута протопластированию с помощью зимолиазы и экстракции денатурирующим буфером, содержащим ББЗ и ¡3-меркаптоэтанол. Экстрагированные белки разделяли с помощью денатурирующего электрофореза в ПААГ и идентифицировали те продукты, накопление которых в биомассе происходило только при кислых или только при щелочных значениях рН внешней среды (Рис. 3, 4). Особое внимание было уделено белам с высокой молекулярной массой (около 100 кДа), так как ожидаемая масса главной субъединицы ЫАА - 95 кДа. В результате был идентифицирован белок с кажущейся молекулярной массой около 100 кДа, продукция которого резко поднималась при рН 9.0 по сравнению с более низкими значениями рН. Масс-спектроскопическое исследование данного продукта (МА1Л31-ТОР) показало, что данный белок является продуктом гена а-кетоглутаратдегидрогеназы (2-оксоглутарат дегидрогеназы, КХЮ) (номер доступа в 8\и88РоЛ ХР_504734.2, расчетная масса 113595 Да). Субъединицы NAA или других АТРаз в числе массовых белков, продукция которых зависит от рН внешней среды, не обнаруживались.

Таким образом, предварительный эксперимент показал целесообразность проведения массового изучения состава белков, содержание которых в клетках 7. Нро1уйса зависит от рН внешней среды. Для этого был применен метод двумерного электрофореза. Использованный метод получения образцов суммарного клеточного белка У. Иро1уНса был применен в сочетании со масс-спектроскопической

Рисунок 4. Фрагменты двумерных электрофореграмм, позволяющих сопоставить содержание отобранных белков в биомассе, полученной в результате

культивирования при рН внешней среды 4.5 (а) и 8.5 (б). Общее содержание белка в двух образцах биомассы

выровнено до начала протопластирования клеток. Расположение белков,

идентифицированных с помощью МАЫЛ-ТОР, обозначено стрелками.

идентификацией белков (МАИЛ-ТОБ).

1 ^;»

2 - * •

3 ё ^ у,-

4 ШЙ®* у мррящд | иянарнр 4 йшиаа

Результаты этого эксперимента представлены на Рис. 3 - общий вид электрофреграммы, и 4 - идентификация рН-индуцибельных белков. Сопоставление экспериментально определенных и расчетных характеристик рН-индуцибельных белков дано в Таблице 1.

Таблица 1. Сопоставление экспериментально определенных и расчетных характеристик белков У. \ipo\ytica РоК, уровень продукции которых изменяется при рН 8.5 по сравнению с рН 4.0.

№ Мэксп» кДа вепе Ьапк т МТСОр, а.ост. Мтеор.,Да. Хромосо ма Описание

1 31 ХР_502909 338 35744 Э Изоформа 1 митохоидриальной и глиоксисомальной малатдегидрогеназы

2 31 ХР_501679 355 35744 О Изоформа 2 митохоидриальной и глиоксисомальной малатдегидрогеназы

3 30 ХМ_500458 291 30115 Р Ингибитор карбоксипептидазы У

4 29 ХР_505530.1 285 29514 Б Порин 3_УБАС; потенциал-зависимый анионный канал внешней мембраны митохондрий

7 75 ХМ_499604 695 76960 V Митохондриальный шаперон Н8Р70

№ Мэксл» кДа Gene bank ID Мтеор» а.ост. Мтеор., Да. Хромосо ма Описание

8 16 ХМ_505084 163 17603 С Неизвестный митохондриальный белок

9 15 ХР_503850 154 15716 Е Си2+-2п2+_зависимая супероксиддисмугаза

10 22 ХМ_501673 194 20957 В Пролиновая цис-транс изомераза

3. Изучение уровня экспрессии генов рН-индуцибельных белков Y. lipolytica с помощью ПЦР в реальном времени

Использование метода двумерного электрофореза позволило идентифицировать наиболее массовые белки Y. lipolytica, концентрация которых в клетке увеличивается при культивировании штамма на среде с рН 8.5 по сравнению со средой с рН 4.0. Однако, остался открытым вопрос у роли транскрипционного контроля в регуляции этого процесса. Кроме того, в силу трудоёмкости метод двумерного электрофореза белков не пригоден для выполнения массовых физиологических экспериментов. Между тем, целью нашей работы является поиск универсальных механизмов адаптации Y. lipolytica к щелочным условиям среды, непосредственно не зависящих от типа используемых питательных субстратов. Наконец, метод двумерного электрофореза не дает возможности точного количественного определения содержания исследуемых белков в клетке. Поэтому мы использовали максимально экспрессный, специфичный и количественный метод ПЦР в реальном времени для исследования динамики синтеза транскриптов генов, продукты которых были идентифицированы на предыдущей стадии исследования (Рис. 5). В таблице 2 приведены последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов Taqman, использованных для решения этой задачи. Для нормирования получаемых сигналов были использованы традиционные «house-keeping» транскрипты дрожжевой клетки - актин и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH). Уровень синтеза которых, как ожидалось, не зависел от рН внешней среды и других физиологических факторов.

Таблица 2. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов Таятап, использованных для исследования динамики накопления транскриптов потенциальных рН-индуцибельных генов У. Иро1уНса.

Белок Ген, номер доступа в Gene Bank Праймеры и зонды

Нормировочные

Белок Ген, номер доступа в Gene Bank Праймеры и зонды

Актин aj250347 yActF 5 ' - gat ctg gca cca cac ctt ct -3' yActR5' - agc cat атс gag tcg cat gat -3' yAactZ5'- fam - atg acc cag атс ttc ttc gag ac bq1

3; геназа ÍGAPDHI хм_501515 yGAPDHFs' - cac atc cag gtc ttc ggt g a - 3' yGAPDHR 5 ' - gcc aga cag ttg gtg gta ca - з ' yGAPDHZ5'- fam-act acg ttg tcg agt cca ccg gt BQ1

Основные

а-Кетоглутарат-дегидрогеназа хм_504734 yE33517F 5' -tga agg ссс agc tgc tgg ttc yE33517R5' -acc aaa aat aac cat cac aag t yE33517Z 5'- rox -ccT cca agt tcc cca acg aca-bhq2-3'

Малатдегидро-геназа хм_502909 yD16753F 5' -сет ttg tcg gag tca ttg ста-з' yD16753R5' - ctg gat tcg gtg gac aag ct-3' yD16753Z 5'-rox cga cgt cat ccg agc cga gcg at-bhq2

Митохондриаль-ный шаперон Н8Р70 хм_499604 yA00132F5' - gac gcc gag aag ttc aag tct -3' yA00132R5' - cag agg cgt cat caa tct caa -3'

Медь-цинковая супероксид-дисмутаза хм_503850 yE12133F5' -tca ctg tca cct acg аса tca -3' yE12133R5' - gag gtc acc aac gtg tcg ct -3' yE12133Z5'-rox- ttc cac gtc cac gag ttt ggt ga-bhq2

Митохондриаль-ный шаперон -гомолог Е>паК хм_501940 yC17347F5' - ggt caa cga tgc cga gaa gt -3' yC17347Rs' - ctc ctg gag agc atc agt ct -3'

Митохондриаль-ный порин хр_505530.1 yF17314F5' - cct cga ctc caa gat tga gat -з' yF17314R5' -gag ttg gtg gcc agg atg ga-3-yF17314Zs'- rox -tca cct ccg acg cca ctc ttg - bhq2

Неизвестный митохондриаль-ный белок хм_505084 yF06534F5' - cgc cag tca gtc gta tct ca -3' yF06534Rs' -лее ttg ста agc gac gac gt-3' yF06534Z5'- rox-tgt gat ttc cat ggc tga cct ga- bhq2

Пролинован цис-транс изомераза хм_501673 yC10230F 5' - cat gct gca ggg tgg aga ct -3' yC10230R5' - gtc cat ac с gtt ggt gac ct -3' yC10230Z5'-rox-acg aga act ttg agg cca agc acabhq2

Ингибитор карбоксипептида -зыУ ХМ_500458 yB03366F5' -cga cgt cat cga cga gtt tga -3' yB03366R5' -gat cga gct cga cag cag ca-3' yB03366Z 5'-r0x-ggt ccg agt act gcc act аса tt-bhq2

Для выделения суммарной РНК использовали культуры клеток штамма РОИ, выращенные на средах УИВ и УР, содержащих в качестве источника

энергии глицерин, глюкозу или Tris-сукцинат в концентрации 50 и 500 мМ. В случае среды YNB с глюкозой параллельно проводили культивирование на агаризованной и жидкой среде для исследования влияния аэрации и накопления катаболитов в среде на наблюдаемый эффект. Каждую среду готовили в щелочном (рН 8.5) и кислом (рН 4.0) варианте. Состав транскриптов исследовали после 24 и 48 часов роста в каждой культуре.

Выделение РНК проводили по стандартной методике. Дрожжи осаждали центрифугированием при 17000 об/мин, суспендировали в физиологическом растворе, забуференном Tris-HCl до рН 6.0, вносили TRI-реагент (Sigma) и проводили гомогенизацию биомассы с помощью стеклянных шариков диаметром 1 мм. Проводили экстракцию TRI-реагент и хлороформом, осаждали изопропанолом, осадок РНК отделяли от супернатанта центрифугированием, промывали этанолом и высушивали в вакууме. Все операции проводили при 0-4°С. Полученный осадок РНК растворяли в ЗОмкл стерильной дистиллированной воды. Очищенную РНК переосаждали 2.5 объемами 100%-ного этанола в присутствии 1/10 объема 3 М ацетата Na (рН 5.2) в течение 12 часов при -20°С, после чего дважды промывали 75%-ным этанолом с последующим 10-мин центрифугированием. После удаления надосадочной жидости высушенный осадок РНК растворяли в 30 мкл стерильной воды. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически («Ultrospec3300pro», «Amersham Biosciences») по поглощению при 260 нм (1 ед. А26о соответствовала 40 мкг РНК), исследуя 2 мкл раствора РНК, разведенные в 98 мкл стерильной воды. Концентрацию образца рассчитывали по следующей формуле: А260 х [фактор разведения] х 40 мкг/мл = [образец] мкг/мл РНК Чистоту образца определяли, исходя из соотношения Azec/Ajso. При отношении AWA280 > 2.0 препарат РНК считали пригодным для использования. Выделенную РНК дополнительно очищали ДНКазой I «TURBODNase (RNase Free)» (Ambion, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Комплементарную ДНК (кДНК) на матрице очищенных образцов РНК синтезировали с использованием 15-нт случайного праймера в концентрации 0.3 пмоль/мкл и обратной транскриптазы Mu-MLV (Promega).

о

га Ф

тз

N СО Ю ^ ГО СМ

ГС

ч

ф

а

и

£ ф

/ стандарт

Ингибитор карбоксипептидазы У Прояиновая транс-цис изомераза Неизвестный митохондриальный белок

/ Митохондриальный порин Митохондриальныи шалерон-гомолог БпаК

Медь-цинковая суперокеиддисмутаза Митохондриальный шаперон ЩР70 Малатдетидрогеназа

И Аяьфакетоглутаратдегидрогеназа

I

стандарт 0>

Ингибитоо карбоксипептидазы У Пролиновал транс-цис изомераза Неизвестный митохондриальный белок

Митохондриальный порин Митохондриальныи шаперон-гомолог ВпаК

Медь-цинковая супероксиддисмутаза Митохондриальный шаперон Н£Р70 Малагдегидрогеназа

Альфакетоглутаратдегвдрогеназа

к

X

Щ

и о о.

ш

I-

л

с, ><

ьй

О

V>.

о см

со

ф се о

X и о

та

х

ч ю а

о

о

(б ф

■о

N. СО Ю СО СМ

А

ч: ф а

о

Ингибитор карбоксипептидазы У Пролиновая транс-цис изомераза / Неизвестный митохондриальный белок

с

Митохондриальный порин

Митохондриальныи шаперон-гомолог ОпаК

Медь-цинковая супероксиддисмутаза ||р / Митохондриальный шаперон Н8Р70 Малатдегидрогеназа Альфакетоглутаратдегидрогеназа

Ё & й £ I 4 £ = I § В" § I 1 ЙО 8" 2 1 1и § §-2 5 - я «

я & ^ V р. * £ о о Э" 5- Ь * * Ё о

1***1=» I | | III"

,, я ы ~ Й 2 я с г^ та ом а

с1 й и о 8" Э- Ь х * Ё О

«за, я Й я & и я £ « и я .. й н

я < н Й & * е я £ я 3 я я ш с „

к р-о-о« ал ой

я ^ ° п- о о- © , х & § 2 5 * Й ,

о Я ¡-О. к Я ^ - Я « 2 ¡0 Э £) « «

л

§ 5 а 8 о I I 2 я о « 3 § I я я а, £ Е Я Й я я ж _ я я?

| ШИ I | | 8 ° | || , | § |

Я

ю о а

Ш

Л

С

>»

а а О

!-

>

о

а. >-

©

ш о

X

и

о «

X

с£ ©

а

о

Ингибитог» каобоксипептилазы У Поолиновая гоанс-иис изомеоаза Неизвестный митохондриальный белок Митохондриальный гторин

Митохондриальный шаперон-гомолог ОпаК

Медь-цинковая супероксиддисмутаза Митохондриальный шаперон Н8Р70 Малатдегидрогеназа Альфакетоглутаратдегидрогеназа

Проведенные измерения показали, что из 9 исследованных потенциальных рН-реактавных генов 7 проявили рН-индуцибельность на уровне транскрипции. Два гена, кодирующие гомолог ингибитора карбоксипептидазы У и пролиновую цис-транс изомеразу, не обнаружили рН-чувствительности на уровне транскрипции: они не отличались по этому показателю от транскриптов актина и ¿АРБН, выбранных для нормировки сигнала. Сопоставление уровня сигнала от актина и ОАРБН и этих двух генов подтверждает незначительный разброс сигнала в эксперименте, что позволяет сделать вывод об адекватности выбора стандартных транскриптов для нормировки сигнала и достаточном уровне достоверности получаемых результатов. Для остальных семи генов: а-кетоглутаратдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, двух больших митохондриальных шаперонов, митохондриального порина и неизвестного митохондриального белка наблюдалась существенная индукция транскрипции при рН 8.5 по сравнению с рН 4.0 на всех использованных средах: как полноценной, так и синтетической при росте на любом источнике углерода и энергии. Величина индукции может быть оценена по параметру АС, (рН 8.5-рН 4.0), который для всех семи рН-индуцибельных генов лежал в диапазоне от 1 до 6. Пренебрегая вариациями эффективности реакции ПЦР, эти цифры соответствуют увеличению содержания транскриптов от 2 до 60 раз.

Обращает на себя внимание, что все без исключения исследованные гены У. Иро1уНса, обладающие рН индуцибельностью, кодируют белки митохондриальной локализации. Напротив, два гена, рН-индуцибельность которых на уровне транскрипции не подтвердилась, кодируют цитоплазматические компоненты. Таким образом, можно делать вывод, что адаптация Г. Иро1уИса к росту при щелочных значениях рН внешней среды связана, в первую очередь, с изменением протеома митохондрий, а не состава цитозольных белков или белков плазматической мембраны. Сопоставляя эти данные с результатами исследования других организмов, прежде всего, пекарских дрожжей 5. сегЫзше, а также растений, можно предположить, что ключевая роль митохондрий при росте К \ipolytica на средах со щелочным значением рН состоит не только в обеспечении энергообмена, но и в инактивации дополнительных количеств активных форм кислорода.

Оценивая влияние физиологических факторов среды, прежде всего, основного источника углерода и энергии на уровень экспрессии кандидатных генов рН-адаптации необходимо отметить, что уровень их рН-зависимой индукции оказывается стабильно выше при росте на синтетической среде УКВ по сравнению с полноценной средой УР. Коэффициент индукции транскрипции для всех генов возрастает в ряду «глюкоза - глицерин - сукцинат» при использовании этих соединений в качестве основного источника энергии. При этом экстремально высокая концентрация сукцината в среде 500 мМ вызывает суперпродукцию гена с наиболее выраженной транскрипционной рН-зависимостью - фермента цикла Кребса а-кетоглутаратдегидрогеназы. Это наблюдение может быть объяснено на основании предположения о том, что при высоких значениях

рН избыток сукуцииата опасен клетке, а гиперфункция аппарата митохондрий, прежде всего, а-кетоглутаратдегидрогеназы, способствует нейтрализации этого эффекта.

Выводы

1. Методом обратной геномики показана однотипность механизмов регуляции экспрессии основного и минорных генов щелочной протеазы на изменение рН внешней среды.

2. На примере регуляции экспрессии генов семейства ХРЯ показано, что повышение уровня рН среды снижает чувствительность клеток У \ipo\ytica к содержанию фосфата.

3. Методами протеомики идентифицировано 9 белков, уровень накопления которых повышается при культивировании при рН 8.5 по сравнению с рН 4.0.

4. Методом ПЦР в реальном времени идентифицировано 7 генов, уровень транскрипции которых повышается при культивировании У. \ipolytica на среде с рН 8.5 вне зависимости от состава питательных компонентов. Все исследованные гены, обладающие этим свойством, кодируют белки митохондриальной локализации.

Список публикаций по теме диссертации

1.Гусева М.А., Белякова А.В., Леонович О.А, Шевелев А.Б., Эпова Е.Ю., Елагина Е.М. К изучению экспрессии множественных генов щелочной протеазы у алкотолерантных дрожжей УАЛИОИУА ЫРОЬУПСА II Известия Смоленского государственного университета. Том 10, №2, 2010 - С. 21-29, 9с.(0,56 пл.- доля личного участия .80%).

2. Гусева М.А., Эпова Е.Ю., Ковалев Л.И., Шевелев А.Б. Изучение механизмов адаптации дрожжей УАЯИО}У1А ЫРОЬ УТ1СА к щелочным условиям среды методами протеомики // Прикладная биохимия и микробиология. Том 46, №3, 2010 - С. 336-341, 6с. (0,375 п.л., доля авторского участия - 80%).

3.Смирнова М.С., Баловнева М.В., Гусева М.А., Леонович О.А., Елагина Е.М., Папуниди Н.Х., Ворович М.Ф., Терехина И.Л., Дзагурова Т.К., Шевелев А.Б. Метод определения остаточной ДНК клеток хозяина в вирусных препаратах вакцинного назначения с помощью ПЦР в реальном времени II Ветеринарный врач, № 5, 2010 - С.45-49,5с. (0,312 п.л., доля авторского участия - 40%).

4. Гусева М.А., Эпова Е.Ю., Осипенкова О.В., Елагина Е.М., Шевелев А.Б. Изучение молекулярного механизма адаптации дрожжей Уаггою'ш Иро1уйса к щелочному стрессу // . Фундаментальные исследования, №3, 2011 - С. 181-190, 10с. (0,625 п.л., доля авторского участия - 80%).

5.Ковалёва М.В., Суханова Е.И., Зылькова М. В., Романовская М.А. (Гусева М.А.) Окислительный стресс и индукция проницаемости

внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica // Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты. Всероссийская конференция молодых учёных и II школа им. Н. М. Эмануэля, Доклады и тезисы - М.: Изд-во РУДН, 2006. - С. 173-1740, 5с. (доля авторского участия не разделяется).

6. Романовская М.А. (Гусева М.А.), Эпова Е.Ю., Звягильская P.A., Шевелев А.Б. Изучение адаптации алкалотолерантных дрожжей Yarrowia lipolytica к росту при высоких значениях pH на уровне транскрипционного контроля / IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск 11-15 мая 2008, ISBN 5-9027-0011-6, С. 259, 0,5с. (доля авторского участия не разделяется)

7. Гусева М.А., Эпова Е.Ю., Ковалев Л.И., Шевелев А.Б. Изучение механизмов адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к росту при щелочных условиях методами протеомики / Актуальные проблемы ветеринарной медицины. Москва 2009 - С.16-21, 6с. (0,375 пл., доля личного участия - 50%).

8.Гусева М.А., Смирнова М.С., Баловнева М.В., Шибаева A.B., Зарипова P.C., Белоусова Ж.В., Валиуллин Л.Ф., Малышева Е.В., Дудорова М.Г., Елагина Е.М., Леонович O.A. Новый продуцент белка-антигена внешней оболочки хантавируса Добрава на основе дрожжей Yarrowia lipolytica / «Молекулярная диагностика», Том V, М.:, 2011 - С. 80-82, Зс. (0,187 пл., доля личного участия - 30%).

9.Маракасова Е.С., Шибаева A.B., Белоусова Ж.В., Валиуллин Л.Ф., Малышева Е.В., Дудорова М.Г., Осипенкова О.В., Гусева М.А., Елагина Е.М. Новый метод одностадийной детекции антиген-антительного связывания / «Молекулярная диагностика», Том V, М. 2011 - С. 141-144, 4с. (0,25 пл., доля личного участия - 30%).

Ю.Смирнова М.С., Баловнева М.В., Шибаева A.B., Зарипова P.C., Белоусова Ж.В., Валиуллин Л.Ф., Малышева Е.В., Дудорова М.Г., Гусева М.А., Елагина Е.М. ПЦР в реальном времени как новый метод детекции остаточной ДНК клеток Vero в препаратах вирусов вакцинного назначения / «Молекулярная диагностика», Том V, М., 2011 - С. 149-151, Зс. (0,187 пл., доля личного участия - 40%).

И.Гусева М.А., Эпова Е.Ю., Осипенкова О.В., Елагина Е.М., Шевелев А.Б. Молекулярные маркеры адаптации к росту при высоких значениях pH у экстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica II Международный журнал экспериментального образования. №3, 2011 - С. 63-64, 2с. (0,125 пл., доля личного участия - 60%).

Подп. кпеч. 27.10.2011 Объем 1.25 п.л. Зак. № 121 Тир. ЮОэкз.

Типография Mill У

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гусева, Марина Александровна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1 Введение.

2.2 Транскрипционный фактор YlRimlOlp и его роль в механизме обеспечения алкалотолерантности дрожжей Y. lipolytica.

2.2.1 Получение мутантов.

2.2.2Фенотипические особенности мутантов.

2.2.3 Отбор плазмид, обеспечивающих комплементацию мутаций PAL.

2.2.4 Анализ последовательности гена Y. lipolytica, гомологичного RIMIOl/pacC.

2.2.5 YIRIM101 не совпадает с генами, несущими мутации PALI, PAL2, PAL3 и PAL

2.2.6 Экспрессия YIRIM101 зависит от рН и необходима для дерепрессии гена щелочной протеазы.

2.2.7 Эффект С-концевой делеции YlRimlOlp на транскрипцию.

2.2.8 Влияние мутаций PAL и YIRIM101 на рост, скрещивание и споруляцию.

Обсуждение.

2.3 Транскрипционный контроль гена щелочной протеазы XPR2 у Y. lipolytica.

2.4 Механизмы адаптации Y. lipolytica к щелочному стрессу на уровне система транспорта метаболитов на уровне плазматической мембраны.

2.5 Протеомный анализ белкового состава дрожжей Y .lipolytica выращенных при щелочных значениях рН.

2.6 Использование методов протеомики для изучения молекулярных основ адаптации S. cerevisiae к солевому стрессу.

2.6.1 Введение.

2.6.2 Идентификация белков, реагирующих на солевой стресс, при повышении концентрации соли в митохондриях.

2.6.3 Активация антиоксидантной защиты митохондрий при солевом стрессе.

2.6.4 Регуляция накопления белков биосинтеза аминокислот при солевом стрессе.

2.6.5 Вклад идентифицированных белков, индуцируемых при солевом стрессе, в механизм защиты клеток от окислительного и солевого стресса.

2.6.6 Регуляция экспрессии генов белков внешней митохондриальной мембраны при солевом стрессе.

2.6.7 Идентификация белков, содержание которых в митохондриях снижается в условиях солевого стресса.

2.6.8 Регуляция синтеза ферментов гликолиза при солевом стрессе.

Обсуждение.

3. Материалы и методы.

3.1 Методы поддержания культуры дрожжей Y. lipolytica.

3.2 Определение протеолитической активности штаммов Y. lipolytica.

3.2.1 Методика колориметрического определения содержания белка по модифицированному методу Лоури с бицинхониновой кислотой.

3.3 Генноинженерное конструирование.

3.3.1 Выделение плазмидной ДНК (вариант минипреп).

3.3.2 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

3.3.3 Осаждение ДНК.

3.3.4 Обработка ДНК рестриктазами.

3.3.5 Постановка ПЦР.

3.3.6 Электрофорез ДНК.

3.3.7 Секвенирование ДНК.

3.3.8 Поддержание штаммов Е. coli.

3.3.9 Трансформация Е. coli плазмидными конструкциями.

3.3.10 Создание конструкции pQE-URA3-HP4d-XPR.

3.3.11 Введение конструкции pQE-URA3-HP4d-XPR в Y. lipolytica.

3.4 Протеомные методы исследования.

3.4.1 Одномерный денатурирующий электрофорез в ПААГ.

3.4.2 Двумерный электрофорез по О'Фарреллу.

3.4.3 Идентификация белков масс-спектрометрией.

3.5 Метод ПЦР в реальном времени.

3.5.1 Оптимизация метода выделения транскриптов из клеток дрожжей.

3.5.2 Получение препаратов суммарной кДНК У. Иро1уНса для использования в ПЦР-РВ.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1 Изучение экспрессии множественных генов щелочной протеазы у У.Иро1уНса.

4.2 Изучение механизмов адаптации У.Нро1уНса к росту при щелочных условиях методами протеомики.

Таблица 8. Первичные данные масс-спектроскопического исследования белков У. Иро1уйса Ро1£, уровень продукции которых изменяется при рН 8.5 по сравнению с рН 4.0.

4.3 Изучение уровня экспрессии генов рН-индуцибельных белков У. Иро1уйса с помощью ПЦР в реальном времени.

4.3.1 Разработка системы праймеров и зондов для определения транскриптов потенциальных рН-реактивных генов У. \ipolytica с помощью ПЦР в реальном времени.

4.3.2 Разработка методики выделения суммарной РНК, получения кДНК и проведения измерений методом ПЦР в реальном времени.

4.3.3 Исследования регуляции транскрипции потенциальных рН-реактивных генов

У. Иро1уйса с помощью ПЦР в реальном времени.

5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизмов адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к росту при щелочных условиях pH внешней среды"

В настоящее время экстремофильные дрожжи Yarrowia lipolytica рассматриваются в качестве одного из наиболее перспективных биотехнологических объектов. Они выступают и в качестве удобной клеточной модели для исследования механизмов апоптоза и клеточной дифференцировки. Это обусловлено сочетанием в этом организме нескольких уникальных особенностей. Во-первых,, это способность быстро расти на органических субстратах самого различного биогенного и абиогенного происхождения, включая сточные воды, нефтяные парафины и ксенобиотики. Эта особенность, обусловленная наличием пероксисом, позволяет использовать Y. lipolytica для создания биологических систем очистки воды, биоремедиации почвы, утилизации ксенобиотиков и для получения кормовой биомассы из малоценного органического сырья. Во вторых, Y. lipolytica устойчива ко многим агрессивным органическим соединениям, что позволяет использовать ее для их получения с хорошими выходами. Наиболее ярким примером такого применения являются созданные на основе Y. lipolytica сверхпродуценты янтарной и лимонной кислот. В третьих, Y. lipolytica является традиционной моделью для исследования клеточной дифференцировки на примере так называемого диморфического перехода, т.е. переключения от дрожжеподобного к истинно мицелиальному росту в зависимости от условий среды. Эта особенность находит практическое применение, позволяя использовать Y. lipolytica в качестве генетически исследованного и легко культивируемого аналога дрожжевого патогена человека и животных Candida albicans. Именно на модели Y. lipolytica были разработаны и испытаны эффективные противогрибковые средства, применяемые для лечения кандидозов. В четвертых, Y. lipolytica обладает способностью к высокоэффективной секреции белков во внешнюю среду (до 10 г/л), что значительно превышает возможности пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae и приближается к секреторному потенциалу метилотрофных дрожжей родов Pichia и Hansenula.

В совокупности перечисленные особенности привели к решению о необходимости расшифровки полной геномной последовательности Y. lipolytica. Эта работа была выполнена независимо двумя исследовательскими группами во Франции и США. Наличие доступной для анализа последовательности позволило использовать мощный и быстрый в использовании инструмент протеомики в качестве универсального средства для первичной идентификации белков, задействованных в реализации перечисленных важных особенностей Y. lipolytica. В частности, в 2007 г этим методом были идентифицированы некоторые белки Y. lipolytica. принимающие участие в диморфическом переходе. Однако, до настоящего времени эти исследования носят фрагментарный характер. Так в указанной работе 2007 г для облегчения выполнения эксперимента анализировались только водорастворимые клеточные белки, хотя важность компонентов мембран и клеточной стенки в процессе морфогенеза не вызывает сомнений.

Наряду с перечисленными, важной особенностью Y. lipolytica, являющейся непосредственным предметом настоящей работы, является уникальная для дрожжей способность не только без потерь выдерживать кратковременный щелочной стресс, но и эффективно расти на средах со щелочными значениями рН — вплоть до 10.5. Механизмы переключения генов Y. lipolytica в ответ на изменение рН внешней среды начали активно изучать с 1997 года, когда появились данные о структуре и функции транскрипционного факторов семейства YRimlOl. Имеются убедительные данные о том, что этот белок является элементом рН-зависимого транскрипционного контроля. Ранее гомолог YRimlOl - Rimlp был обнаружен у пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве фактора, задействованного на начальных стадиях мейоза, обеспечивающего SOS-ответ, и на короткое время продлевающего жизнеспособность культуры в условиях стресса. Другой гомолог YRimlOlp - белок РасС встречается у нескольких видов мицелиальных аскомицетов, в частности, у Aspergillus nidulans. Здесь он обусловливает рН-зависимую индукцию синтеза генов щелочной и кислой протеаз, не оказывая влияния на рН-зависимую адаптацию роста гриба в целом. Нарушение гена расС у A. nidulans приводит к замедлению роста, нарушению образованияj конидий и изменению морфологии мицелия, однако, все эти эффекты проявляются вне зависимости от рН внешней среды. Таким образом, хотя однотипные по составу компонентов RimlOlp-зависимые механизмы реагирования на изменение рН внешней среды найдены у двух групп аскомицетов: S. cerevisiae и С. albicans с одной стороны, A. nudulans, Pénicillium canescens и Neirospora crassa с другой, их физиологическое предназначение в обоих случаях существенно отличается. Можно предполагать, что Y. lipolytica занимающая промежуточное между дрожжами и мицелиальными аскомицетами таксономическое положение, имеет уникальный механизм использования YRimlOlp, отличающийся от известных прототипов. Можно предполагать, что исследование этого механизма методами генетики, молекулярной биологии и биофизики, способно пролить свет на принципы организации сенсорной компоненты системы рН-адаптации у Y. lipolytica.

В качестве примера YRimlOlp-зависимого переключения экспрессии генов у Y. lipolytica в ответ на изменение рН внешней среды традиционно рассматривается ген XPR2. Продукт этого гена - АЕР представляет собой субтилизиноподобную сериновую протеазу, предназначенную для неспецифического протеолиза внеклеточных источников белка. АЕР является наиболее массовым секретируемым белком большинства штаммов У. Иро1уНса, её ген послужил источником эндогенных элементов секреторного сортинга рекомбинатных белков: препропептид Хрг2 успешно применялся для секреции амилазы и других гетерологичных продуктов. Несмотря на значительные усилия и перечисленные выше большие достижения в области изучения работы гена ХРЫ2 У. Иро1уИса, существует целый пласт нерешенных проблем, связанных с явлением множественности генов щелочной протеазы в геноме У. Иро1уйса. Определение последовательности генома У \ipolytica СЫВ122 позволило установить наличие в нём 13 генов субтилизиноподобных протеаз. Измерение уровня активности этих генов при различных условиях, в том числе, при изменении рН внешней среды, может дать ценную информацию о сигнальных механизмах адаптации У. Иро1уНса.

Чуть позже появилась гипотеза о том, что адаптация У. Иро1уНса к щелочным значениям рН; невозможная для других видов дрожжей, обусловлена наличием двух независимых систем транспорта метаболитов через плазматическую мембрану. При этом при низких значениях рН работает преимущественно протон-зависимая система, характерная» для большинства аскомицетов. При повышении рН среды до величин, превышающих рН цитоплазмы, рН которой '«7.3, работа этого механизма1 становится невозможной из-за деполяризации мембраны. Однако, в случае У. Иро1уИса происходит его смена на №+-зависимый симпорт. Эта гипотеза вполне согласуется с известными экспериментальными, фактами, однако, функционирование этого механизма показано лишь применительно к частному случаю транспортеров фосфат-иона. Кроме того, не имеется доказательств того, что перестройка механизмов симпорта фосфата опосредована на уровне регуляции транскрипции (синтеза белка), а не связана с изменением характера работы предсуществующих белков плазматической мембраны. Отсутствуют прямые данные об изменении содержания транскриптов наиболее массовых белков« в клетках У. Нро1уИса при изменении рН внешней среды.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение изменений протеома У. Иро1уНса, обусловливающих способность этого дрожжеподобного аскомицета к росту при щелочных значениях рН внешней среды.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи:

1. С использованием методов обратной генетики'изучить влияние рН в сочетании с другими физиологическими факторами на регуляцию экспрессии наиболее существенной части секретома У. \ipolytica — комплекса щелочных протеаз ХРЯ. 1

2. С использованием методов протеомики идентифицировать наиболее массовые белки V. \ipolytica, накапливающихся в культуре при росте на средах со щелочным значением рН.

3. С использованием метода ПЦР в реальном времени исследовать физиологические факторы, влияющие на экспрессию кандидатных генов рН-адаптации.

2. Обзор литературы

2.1 Введение

Предметом рассмотрения настоящего обзора литературы является уникальная для дрожжей способность не только без потерь выдерживать кратковременный щелочной стресс, но и эффективно расти на средах со щелочными значениями рН — вплоть до 10.5. Механизмы рН-адаптации Y. lipolytica начали активно изучать с 1997 года, когда была продемонстрирована роль глобального регулятора транскрипции RimlOl в индукции адаптационных физиологических реакций. Этот транскрипционный фактор, впервые найденный у пекарских дрожжей (Rimlp) Saccharomyces cerevisiae, необходимый им на начальных стадиях мейоза, обеспечивает SOS-ответ, на короткое время продлевающий жизнеспособность в условиях стресса. Инактивация гена RIM101 у S. cerevisiae приводит к изменению морфологии колоний, нарушению споруляции и повышенной чувствительности к замораживанию. Гомолог RimlOlp — белок РасС из нескольких видов мицелиальных аскомицетов, в частности, из Aspergillus nidulans обусловливает рН-зависимое переключение экспрессии генов щелочной и кислой протеаз, не оказывая влияния на рН-зависимую адаптацию роста гриба в целом. Нарушение гена расС у А. nidulans приводит к замедлению роста, нарушению образования конидий и изменению морфологии колоний вне зависимости от рН. Таким образом, хотя состав факторов,-' задействованных в RimlOlp-зависимых сигнальных путях, может быть сходен для всех имеющих его видов аскомицетов: S. cerevisiae, С. albicans, A. nudulans, Pénicillium canescens, Neirospora crassa, лишь y Y. lipolytica его работа' позволяет организму-хозяину эффективно расти на средах с высоким значением рН. Поэтому можно предполагать, что эффекторные механизмы рН-адаптации Y. lipolytica и таксономически близких к ней видов коренным образом отличаются и нуждаются в идентификации в прямых экспериментах.

В г качестве маркера адаптации секреторной системы Y. lipolytica к изменению рН внешней среды традиционно рассматривается ген XPR2 и его продукт АЕР -субтилизиноподобная сериновая протеаза, обеспечивающая неспецифический протеолиз внеклеточных источников белка. АЕР является наиболее массовым секретируемым белком большинства штаммов Y. lipolytica, её ген послужил источником эндогенных элементов секреторного сортинга рекомбинатных белков: препропептид Хрг2 успешно применялся для секреции амилазы и других гетерологичных продуктов. Несмотря на значительные усилия и перечисленные выше большие достижения в области изучения работы гена XPR2 Y. lipolytica, существует целый пласт нерешенных проблем, связанных с явлением множественности генов щелочной протеазы в геноме Y. lipolytica.

Определение последовательности генома У Иро1уНса СЫВ122 позволило установить наличие в ней 13 генов субтилизиноподобных протеаз. Измерение уровня активности этих генов при различных условиях, в том числе, при изменении рН внешней среды, может дать ценную информацию о сигнальных механизмах адаптации У Нро1уНса.

В 2004 году Звягильской и соавторами была высказана гипотеза о том, что адаптация У. Иро1уИса к щелочным значениям рН, невозможная для других видов дрожжей, обусловлена наличием двух независимых систем транспорта метаболитов через плазматическую мембрану. При этом при низких значениях рН работает преимущественно протон-зависимая система, характерная для большинства аскомицетов. При повышении рН среды до величин, превышающих рН цитоплазмы, работа этого механизма становится невозможной из-за деполяризации мембраны. Однако, в случае У. Иро1уНса происходит его смена на На+-зависимый симпорт. Эта гипотеза вполне согласуется с известными экспериментальными фактами, однако, функционирование этого механизма показано лишь применительно к частному случаю транспортеров фосфат-иона. Кроме того, не имеется доказательств того, что перестройка механизмов симпорта фосфата опосредована на уровне регуляции транскрипции (синтеза белка), а не связана с изменением характера работы предсуществующих белков плазматической мембраны. Отсутствуют прямые данные об изменении содержания транскриптов наиболее массовых белков в клетках У Иро1уНса при изменении рН внешней среды.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гусева, Марина Александровна

5. Выводы

1. Методом обратной геномики показана однотипность механизмов регуляции экспрессии основного и минорных генов щелочной протеазы на изменение рН внешней среды.

2. На примере регуляции экспрессии генов семейства ХРИ. показано, что повышение уровня рН среды снижает чувствительность клеток У. Нро1уйса к содержанию фосфата.

3. Методами протеомики идентифицировано 9 белков, уровень накопления которых повышается при культивировании при рН 8.5 по сравнению с рН 4.0.

4. Методом ПЦР в реальном времени идентифицировано 7 генов, уровень транскрипции которых повышается при культивировании Г. \ipolytica на среде с рН 8.5 вне зависимости от состава питательных компонентов. Все исследованные гены, обладающие этим свойством, кодируют белки митохондриальной локализации